JP2022044600A - ペプチドタグおよびそれを含むタグ付加タンパク質 - Google Patents
ペプチドタグおよびそれを含むタグ付加タンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022044600A JP2022044600A JP2021209816A JP2021209816A JP2022044600A JP 2022044600 A JP2022044600 A JP 2022044600A JP 2021209816 A JP2021209816 A JP 2021209816A JP 2021209816 A JP2021209816 A JP 2021209816A JP 2022044600 A JP2022044600 A JP 2022044600A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- tagged
- peptide
- added
- producing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 170
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 152
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 92
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 108
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 90
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 100
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 40
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 39
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 241000555281 Brevibacillus Species 0.000 claims description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 23
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 18
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 18
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 claims description 17
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 13
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 4
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 3
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 46
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 43
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 32
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 26
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 14
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 14
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 14
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 14
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 10
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 10
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 8
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 6
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 5
- 241000208838 Asteraceae Species 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 5
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 5
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 5
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000007567 Arabis caucasica Nutrition 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 3
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 3
- 241000220222 Rosaceae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 2
- 241000219317 Amaranthaceae Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 2
- 241000534630 Brevibacillus choshinensis Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 2
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000269851 Sarda sarda Species 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 2
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 2
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010078554 Aromatase Proteins 0.000 description 1
- 102000014654 Aromatase Human genes 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101100007857 Bacillus subtilis (strain 168) cspB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 101150085381 CDC19 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 241000235646 Cyberlindnera jadinii Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Diphosphoinositol tetrakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000801742 Homo sapiens Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 238000003820 Medium-pressure liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100234604 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ace-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 1
- 101150093629 PYK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 101150001810 TEAD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- -1 alanine (A) Chemical class 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002942 anti-growth Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 108090001015 cancer procoagulant Proteins 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 101150110403 cspA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150068339 cspLA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N hexahydrofarnesyl acetone Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)=O WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229960003161 interferon beta-1b Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K4/00—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
- C12N9/248—Xylanases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
、並びに該DNAを含む形質転換体に関する。
具体的には、ペプチド中のセリン(S)、グリシン(G)をリジン(K)、アルギニン(R)等の塩基性アミノ酸や、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)等の酸性アミノ酸、さらにはアラニン(A)、トレオニン(T)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)等の立体性や極性が異なる側鎖に電荷を持たないアミノ酸に置換したペプチドタグを用意し、これらを目的タンパク質に融合させることで、目的タンパク質の発現向上を試みた。その結果、PG12やPG17においてPとPの間に存在するSとGをK、L、N、QまたはRに置換したペプチドを目的タンパク質に付加することで、目的タンパク質の発現量が向上することを見出した。本発明は、このような知見に基づいてなされたものである。
[1]下記の配列を有するペプチド。
Xm(PYn)qPZr
ここで、X、YおよびZはそれぞれアルギニン(R)、グリシン(G)、セリン(S)、リジン(K)、トレオニン(T)、ロイシン(L)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、ヒスチジン(H)から独立して選択されるアミノ酸残基であって、Yのうち少なくとも1つはK、L、N、Q、HまたはRを含む。
mは0~5の整数であり、nは1、2または3(好ましくはnは2または3)であり、qは1~10の整数であり、r=0~10の整数である。
[2]GとSの含有率が60%未満である、[1]に記載のペプチド。
[3]長さが6~50アミノ酸である、[1]または[2]に記載のペプチド。
[4]配列番号25,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,58,60,64,66,92,94,96,98,100,
102,104,106,108,110,112,114,116,118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,140,142,143,145,147,149,151,153,155,または157のアミノ酸列を有する、[1]~[3]のいずれかに記載のペプチド。
[5][1]~[4]のいずれかに記載のペプチドと、有用タンパク質と、を含むタグ付加タンパク質。
[6]有用タンパク質がヒト成長ホルモン、インターフェロンβ、キシラナーゼ、エステラーゼ、または緑色蛍光タンパク質(GFP)である、である、[5]に記載のタグ付加タ
ンパク質。
[7]前記ペプチドと、前記有用タンパク質がプロテアーゼ認識配列を介して連結されている、[5]または[6]に記載のタグ付加タンパク質。
[8]分泌シグナルを含む、[5]~[7]のいずれかに記載のタグ付加タンパク質。
[9][5]~[8]のいずれかに記載のタグ付加タンパク質をコードするDNA。
[10][9]に記載のDNAを含む組換えベクター。
[11][9]に記載のDNAまたは[10]に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
[12]形質転換体が、酵母、大腸菌、ブレビバチルス、昆虫細胞または哺乳動物細胞(ヒト培養細胞を含むがヒト個体は含まない)である、[11]に記載の形質転換体。
[13][11]または[12]に記載の形質転換体を培養してタグ付加タンパク質を蓄積させ、タグ付加タンパク質を回収することを特徴とする、タグ付加タンパク質の製造方法。
変有用である。本発明のペプチドタグは、アミノ酸10~30程度の小さなものであり、該ペプチドタグが付加された目的タンパク質の構造や機能に影響を与える可能性は低い。したがって、発現後の切断処理は省略できる可能性が高いが、ペプチドタグの除去が必要な場合はプロテアーゼ認識配列の挿入も可能である。
Xm(PYn)qPZr
L、N、Q、Hから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよい。mは0~5の整数であるが、好ましくは1~5の整数、より好ましくは1~3の整数である。
YYがq回連続することを意味する(Pはプロリンを示す)。PY、PYYとPYYYが
合計でq回連続していればよい。
ここで、それぞれのYはR、G、S、K、T、L、N、Qから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよいが、q回連続するPYnに含ま
れるYのうち、少なくとも1つはK、L、N、Q、HまたはRである。q回連続するPYnに含まれるYのうち、2つ以上がK、L、N、Q、HまたはRであることがより好ましい。qは1~10の整数であり、好ましくは2~10の整数、より好ましくは2~5の整数、さらに好ましくは2~3の整数である。
、K、T、L、N、Qから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよい。rは0~10の整数であるが、好ましくは1~10の整数、より好ましくは1~5の整数である。
4,116,118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,140,142,143,145,147,149,151,153,155,または157で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
端にペプチドタグが結合してもよいし、目的タンパク質のC末端にペプチドタグが結合し
てもよいし、目的タンパク質のN末端とC末端の両方にペプチドタグが結合してもよい。目的タンパク質のN末端および/またはC末端にペプチドタグが直接結合してもよいし、1~数アミノ酸(例えば、1~5アミノ酸)の配列を介して結合してもよい。1~数アミノ酸の配列はタグ付加タンパク質の機能や発現量に悪影響を及ぼさない配列であれば任意の配列でよいが、プロテアーゼ認識配列とすることにより、発現し、精製した後にペプチドタグを有用タンパク質から切り離すことができる。プロテアーゼ認識配列としてはファクターXa認識配列(IEGR:配列番号10)が例示される。また、本発明のタグ付加タンパク質は、Hisタグ、HNタグ(例えば、配列番号6)、FLAGタグなど、検出や精製などに
必要な他のタグ配列を含むものでもよい。
ファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、血小板由来成長因子(PDGF)、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、肝細胞増殖因子(HGF)が挙げられる。
主とする場合、ナス科(Solanaceae)、バラ科(Rosaceae)、アブラナ科(Brassicaceae)、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属(Nicotiana)、シロ
イヌナズナ属(Arabidopsis)、オランダイチゴ属(Fragaria)、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、好ましくはタバコ(Nicotianatabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis
thaliana)、オランダイチゴ(Fragaria×ananassa)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する分泌シグナルが挙げられる。
。すなわち、本発明のDNAは、有用タンパク質をコードするDNA、及びペプチドタグをコードするDNAを含む。有用タンパク質をコードするDNA、及びペプチドタグをコードするDNA
は読み枠を合わせて連結される。
伝子工学的な手法により得ることができる。
また、本発明のタグ付加タンパク質をコードするDNAは、該タンパク質を生産させる宿
主細胞に応じて、ハイブリッドタンパク質の翻訳量が増大するように、タグ付加タンパク質を構成するアミノ酸を示すコドンが適宜改変されていることも好ましい。コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (2004)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
るエンハンサー配列等を含むものであってもよい。エンハンサーとしては、Kozak配列や
植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’-非翻訳領域が挙げられる。
明のペプチドタグをコードするDNA、及び有用タンパク質をコードするDNA等をPCRやDNAリガーゼ等を用いて連結することで構築することができる。
導入される宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されているものであればよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドDNA、ウイルスDNA等が挙げられる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。具体的なプラスミドベクターとして、例えば、pTrcHis2ベクター、pUC119、pBR322、pBluescript II KS+、pYES2、pAUR123、pQE-Tri、pET、pGEM-3Z、pGEX、pMAL、pRI909、pRI910、pBI221、pBI121、pBI101、pIG121Hm、pTrc99A、 pKK223、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNA I/Neo、p3×FLAG-CMV-14、pCAT3、pcDNA3.1、pCMV等が例示される。
ーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター、レタスのユビキチンプロモーターなどが使用可能である。大腸菌で発現させる場合、T7プロモーターなどが挙げられ、ブレビバチルスで発現させる場合、P2プロモーターやP22プロモー
ターなどが挙げられる。誘導可能なプロモーターであってもよく、例えば、IPTGにより誘導可能なプロモーターであるlac、tac、trcの他、IAAで誘導可能なtrp、L-アラビノース
で誘導可能なara、テトラサイクリンを用いて誘導可能なPzt-1、高温(42℃)で誘導可能なPLプロモーター、コールドショック遺伝子の一つであるcspA遺伝子のプロモーターなどが使用できる。
また、必要に応じ、ターミネーター配列も宿主細胞に応じて含めることができる。
ることを特徴とする。形質転換に用いられる宿主細胞は真核細胞及び原核細胞の何れでもよいが、真核細胞が好ましい。
真核細胞としては、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが好ましく用いられる。酵母としては、Saccharomyces cerevisiaeやCandida utilisやSchizosaccharomyces pombe、Pichia pastorisなどが挙げられる。さらに、麹菌(Aspergillus)等の微生
物を用いることもできる。原核細胞としては、大腸菌(Escherichia coli)、乳酸菌(Lactobacillus)、枯草菌(Bacillus)、ブレビバチルス(Brevibacillus)、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)、放線菌などが挙げられる。植物細胞としては、
アキノノゲシ属(Lactuca)などのキク科(Astaraceae)、ナス科(Solanaceae)、アブ
ラナ科(Brassicaceae)、バラ科(Rosaceae)、アカザ科(Chenopodiaceae)に属する植物の細胞などが挙げられる。
ガン法(Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci.tech. 5:27)、ポリカチオン法(Ohtsuki, et al., FEBS Lett. 1998 May 29;428(3):235-40.)などの方法を用いることが可能
である。なお、遺伝子発現は一過的発現でもよく、染色体に組み込まれる安定的発現でもよい。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記タグ付加タンパク質を蓄積させることができる。
ペプチドタグを付加するタンパク質として、1)ヒト成長ホルモン(hGH、配列番号1)
、2)ヒトインターフェロンβ-1b(IFNβ、配列番号2)を用いた。hGHをコードする人工
合成DNA(配列番号3)をpUC19改変プラスミドpTRU5(ファスマック)のEcoRV認識部位に挿入し、プラスミド1を得た。IFNβをコードする人工合成DNA(配列番号4)をpUC19改変プラスミドpTRU5のEcoRV認識部位に挿入しプラスミド2を得た。
ルチクローニングサイトの5’末端にSUC2SPおよび6×HNタグをコードするDNA配列を付加
した人工合成DNA(配列番号7)を、pYES2(Invitrogen)のHindIII-XbaIサイトに挿入し酵母発現用プラスミド3を作成した。
まず、hGHまたはIFNβのNまたはC末端またはN、C両末端に各種タグを付加するために、表2に示した鋳型プラスミド、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせによるPCRを実施した。各プライマーの5’末端にはプラスミド3との相同配列を付加した
。PCRはKOD-PLUS-Ver.2(東洋紡)を用い、2 pg/μl 鋳型プラスミド、0.3 μM フォワードプライマー、0.3 μM リバースプライマー、0.2 mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5 mM MgSO4、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2 となるように50 μl反応液を調製し、94℃、5分間加熱した後、98℃、10秒間、60℃、 30秒間、68℃, 40秒間の加熱処理を25サイクル行い、最後に68℃で5分間加熱した。得られた増幅断片はQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製した。プラスミド3はNotI、AscIで消化後、0.8% SeaKem GTG Agarose(Lonza)を用いた電気泳動により分離し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いゲルから抽出した。約50 ng分の抽出したプラスミド3と精製PCR産物2 μlを混合し液量を5 μlに調整後、Gene Art Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit(Applied Biosystem)添付の2×Enzyme Mix 5 μlと混合し、室温で30分間静置、その後5分間氷上に
静置した。反応液5 μlを上記キット添付のコンピテントセルDH10B T1 SAと混合し氷上で30分間静置後、37℃で10分間加温し、氷上で2分間静置後、SOCを250 μl添加し、37℃、200 rpmで1時間振盪した。その後、振盪物の50μlを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT寒
天培地(16 g/l Bacto tryptone、10 g/l Bacto Yeast Extract、5 g/l NaCl、15 g/l Bacto Agar)に塗布後、37℃で一晩静置培養し、形質転換コロニーを得た。コロニーを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT液体培地(16 g/l Bacto tryptone、10 g/l Bacto Yeast Extract、5 g/l NaCl)に移植し、37℃、200 rpmで一晩振盪培養後、プラスミドを抽出し
、塩基配列を確認後、酵母の形質転換に用いた。
酵母(Saccharomyces cerevisiaeINVSc1、Invitrogen)をYPD培地(1% yeast extract,
2% peptone, 2% dextrose (D-glucose))で30℃、200rpmで一晩振盪培養した。10 mlのYPD 中に波長600 nmでの濁度(OD600)が0.2-0.4になるように希釈した後、OD600が0.6-1.0になるまで30℃、200 rpmで振盪培養した。500 x g、室温で5 分間遠心し、細胞をペレ
ットにし、上清を捨てた。次にペレットを10 ml のSolution I(S. c. EasyComp Transformation Kit、Invitrogen)に懸濁した。さらに、500 x g、室温で5 分間遠心し、細胞をペレットにし、上清を捨てた。次にペレットを1 mlのSolutionII(S. c. EasyComp Transformation Kit、Invitrogen)に懸濁し、50 μl ずつ分注し、コンピテントセルとした。使用するまで-80℃のディープフリーザーに保管した。
得られたコンピテントセルを融解して室温に戻し、上記で作製したペプチドタグ付加タンパク質発現用プラスミドを1 μg添加した後、500 μlのSolutionIII(室温)を添加し
ボルテックスした後、30℃にて1時間静置した(15分ごとにボルテックスを行った)。さ
らに上記静置物50μlを、2% glucoseおよび2% Bacto Agar を含むSC-Ura培地 (6.7 g/L yeast nitrogen base, 0.1 g/L adenine, 0.1 g/L arginine, 0.1 g/L cysteine, 0.1 g/L
leucine, 0.1 g/L lysine, 0.1 g/L threonine, 0.1 g/L tryptophan, 0.05 g/L aspartic acid, 0.05 g/L histidine, 0.05 g/L isoleucine, 0.05 g/L methionine, 0.05 g/L phenylalanine, 0.05 g/L proline, 0.05 g/L serine, 0.05 g/L tyrosine, 0.05 g/L valine)に塗布後、30℃で2-3日静置培養し、形質転換コロニーを得た。
形質転換後のシングルコロニーをプレート培地(SC-Ura, 2% dextrose)に塗株し、30℃、24時間インキュベーター中に静置し培養を行った。次に、培養後のプレート培地より1μl滅菌ディスポループで菌体をかきとり、3ml前培養培地(SC-Ura, 2% galactose)を
分注した滅菌ポリスチレン製14mlチューブに植菌し、30℃、200rpm、16時間振盪培養を行った。培養終了後、分光光度計600nmにて濁度を測定し、3ml培地に再懸濁した場合に濁度が0.4になる必要量の培養物を滅菌済1.5mlエッペンドルフチューブに分取後、3,000×g、4℃、5分間遠心分離を行い、上清を除去後、沈殿を1ml誘導培地(SC-Ura, 1% galactose,
1% raffinose)に懸濁し、予め2mlの誘導培地を分注した滅菌ポリスチレン製14mlチューブと合せ、30℃、200rpm、24時間振盪培養を行った。培養終了後、培養液400μlを1.5ml エッペンドルフチューブに分取し、3,000×g、4℃、5分間遠心後、上清を除去した後、液体窒素中で凍結後、ディープフリーザー中-80℃で保存した。
タンパク質抽出はAkira Hosomi らの方法(Akira Hosomi, et al,: J Biol Chem, 285,(32), 24324-24334, 2010)に従い、液体窒素凍結後、-80℃で保存した遺伝子導入酵母菌体を用いて行った。保存サンプルに720μlの蒸留水を加えボルテックスミキサーにて撹拌後、80μlの1.0N NaOHを加え、再度ボルテックスミキサーにて撹拌後、氷冷化10分静置した。次に、4℃、15,000g、5分間遠心分離を行い、上清を棄てた後、沈殿を回収した。
沈殿に100μlのサンプルバッファー(EZ Apply、ATTO製)を加え、ボルテックスミキサーにて撹拌後、沸騰水中で10分間加温し、サンプルのSDS化を行った。
人工合成DNA(配列番号78)を調製し、pET-15b(Novagen)のXbaI-BlpIサイトに挿入し大腸菌発現用プラスミド4を作成した。人工合成DNA(配列番号78)は、pET-22b(+)(Novagen)のXbaI-BlpI間の遺伝子発現カセットのうち、大腸菌PelBシグナルぺプチド(PelBSP)直後から終始コドンまでの領域を、検出・精製用の6×HNタグ(配列番号6)に続くNotI、SalI、SfiI、XhoI、AscI認識配列からなるマルチクローニングサイトに置き換えたものである。
下記手順でNまたはC末端あるいはN、C両末端に各種タグを付加したhGHまたはIFNβを大腸菌で発現させるためのプラスミドを構築した(図2)。
まず、hGHまたはIFNβのNまたはC末端またはN、C両末端に各種タグを付加するために、表3に示した鋳型プラスミド、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせによるPCRを実施した。各プライマーの5’末端にはプラスミド4との相同配列を付加した
。PCRはKOD-PLUS-Ver.2(東洋紡)を用い、2 pg/μl 鋳型プラスミド、0.3 μM フォワードプライマー、0.3 μM リバースプライマー、0.2 mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5 mM MgSO4、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2 となるように50 μl反応液を調製し、94℃、5分間加熱した後、98℃、10秒間、60℃、 30秒間、68℃, 40秒間の加熱処理を25サイクル行い、最後に68℃で5分間加熱した。得られた増幅断片はQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製した。プラスミド4はNotI、AscIで消化後、0.8% SeaKem GTG Agarose(Lonza)を用いた電気泳動により分離し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いゲルから抽出した。約50 ng分の抽出したプラスミド4と精製PCR産物2 μlを混合し液量を5 μlに調整後、Gene Art Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit(Applied Biosystem)添付の2×Enzyme Mix 5 μlと混合し、室温で30分間静置、その後5分間氷上に
静置した。反応液5 μlを上記キット添付のコンピテントセル大腸菌DH10B T1 SAと混合し氷上で30分間静置後、37℃で10分間加温し、氷上で2分間静置後、SOCを250 μl添加し、37℃、200 rpmで1時間振盪した。その後、振盪物の50μlを100 mg/lアンピシリンを含む2
×YT寒天培地(16 g/l Bacto tryptone、10 g/l Bacto Yeast Extract、5 g/l NaCl、15 g/l Bacto Agar)に塗布後、37℃で一晩静置培養し、形質転換コロニーを得た。コロニー
を100 mg/lアンピシリンを含む2×YT液体培地(16 g/l Bacto tryptone、10 g/l Bacto Yeast Extract、5 g/l NaCl)に移植し、37℃、200 rpmで一晩振盪培養後、プラスミドを
抽出し、塩基配列を確認後、タンパク質発現用大腸菌の形質転換に用いた。
大腸菌BL21 (DE3)(Novagen)のグリセロールストックを3 ml SOB培地(20 g/l Bacto tryptone、5 g/l Bacto Yeast Extract、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgSO4、10 mM MgCl2)の入った滅菌ポリスチレン製14mlチューブに植菌し、37℃、200rpmで一晩振盪培
養した。100 ml SOB培地の入った滅菌三角フラスコに上記前培養液を0.2 ml植菌後、30℃、200rpmで振盪培養した。波長600 nmでの濁度(OD600)が0.4-0.6になったら10-30分間
氷冷し培養を止めた。培養液を50 ml コニカルチューブに移し2,500×g、4℃、10 分間遠心分離した(×2本)。上清を捨て、ペレットを氷冷した15 ml TB(10 mM PIPES-KOH、pH6.7、15 mM CaCl2、0.25 M KCl、55 mM MnCl2)を加え穏やかに懸濁した(×2本)。2本
分の懸濁液を1本にまとめ、2,500×g、4℃、10 分間遠心分離した。上清を捨て、ペレッ
トを氷冷した10ml TBを加え穏やかに懸濁した。DMSOを700 μl加え、氷冷しながら懸濁した。1.5 mlマイクロチューブに50μlずつ分注しコンピテントセルとした。液体窒素で凍
結後、使用するまで‐80℃保存した。
得られたコンピテントセルを氷上で融解して、上記で作製した大腸菌用ペプチドタグ付加タンパク質発現プラスミドを1 ng添加後、穏やかに混合し氷上で30 分間静置した。42
℃、30-45秒処理(ヒートショック)した後、氷上で2 min静置した。250 μlのSOCを添加後、チューブを水平にし、37℃、200 rpmで1 時間振盪した。振盪物50μlを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT寒天培地に塗布後、37℃で一晩静置培養し、形質転換コロニーを得
た。
形質転換後のシングルコロニーをプレート培地(2×YT、100ppm Ampicillin)に塗株し、37℃、一晩インキュベーター中に静置し培養を行った。次に、培養後のプレート培地より滅菌ディスポループで菌体をかきとり、2 ml前培養培地(LB, 100ppm Ampicillin)を
分注した滅菌ポリスチレン製14 mlチューブに植菌し、37℃、200 rpm、OD600値が0.6~1.0に達するまで振盪培養を行った。これら培養物の遠心上清を除いた沈殿物に1.0ml LB培
地(100ppm Ampicillin)を添加した際に、OD600値が0.3になるのに必要な量の培養物を
、1.5ml エッペンドルフチューブに分取し、4℃(冷蔵庫内)で一晩静置保管した。翌日
、前記サンプルを2,000 rpm、4℃、30 min遠心後、上清を除去し、新しいLB培地(100ppm
Ampicillin)1 mlを加え、沈殿を懸濁した。更に、OD600値が0.03となる様に、2.7 mlのLB培地(100 ppm Ampicillin)に上記サンプル1 mlのうちの300μlを植菌し、OD600値が0.4~1.0に達するまで、37℃、200 rpmで振盪培養した。 次に、1M IPTG(誘導剤)を3μl(終濃度1mM)加え、37℃、200 rpmで3時間振盪培養を行った。培養終了後、サンプルの
入った試験管を氷上で5分間冷却し、大腸菌の増殖をストップさせた後、培養液200μlを
新しい1.5 mlのエッペンドルフチューブに分取し、5,000rpm、4℃、5min遠心分離を行っ
た。次に、上清を除き、菌体を液体窒素で凍結後、‐80℃で凍結保存した。
凍結保存サンプルに100μlのサンプルバッファー(EZ Apply、ATTO製)を加え、ボルテックスミキサーにて撹拌後、沸騰水中で10分間加熱し、サンプルのSDS化を行った。
プラスミド構築およびブレビバチルスの形質転換はBrevibacillus Expression System -BIC System-(タカラバイオ)を用い行った(図3)。
まず、hGHのNまたはC末端またはN、C両末端に各種タグを付加するために、表3に示し
た鋳型プラスミド、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせによるPCR
を実施した。各プライマーの5’末端にはpBIC3の挿入箇所と相同な配列を付加した。PCR
はKOD-PLUS-Ver.2(東洋紡)を用い、2 pg/μl 鋳型プラスミド、0.3 μM フォワードプ
ライマー、0.3 μM リバースプライマー、0.2 mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5 mM MgSO4、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2 となるように50 μl反応液を調製し、94℃、5分間加熱した後、98℃、10秒間、60℃、 30秒間、68℃, 40秒間の加熱処理を25サイクル行い、最後に68℃で5分間加熱した。得られた増幅断片はQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製した。
相同組換えによるプラスミドの構築及び形質転換は以下のように行った。100 ngのブレビバチルス発現用プラスミドpBIC3(キットに添付)と精製したPCR産物をモル比で約1:2
になるように混合し、滅菌水で5 μlになるように調整した。Brevibacillus choshinensis SP3 コンピテントセル(タカラバイオ)を37℃ヒートブロックで30秒間静置して急速解凍し、遠心分離(12,000 rpm、室温、1分間)後上清を除去後、上記5 μl DNA溶液と50
μl Solution A(キットに添付)を混合したものを全量添加しボルテックスによりコンピテントセルのペレットを完全に懸濁し、5分間静置した。150 μlのSolution B(PEG溶液
)を加え、ボルテックスで10秒間混和し、遠心分離(5,000 rpm、室温、5分間)後上清を除去、再度遠心分離(5,000 rpm、室温、30秒間)し完全に上清を除去した。これに1 ml MT培地を加え、マイクロピペットを使って完全に懸濁後、37 ℃ 200 rpmで1時間振盪培養した。培養液はMTNmプレート(10 g/Lグルコース、10 g/Lファイトンペプトン、5 g/Lエ
ルリッヒカツオエキス、2 g/L粉末酵母エキスS、10 mg/L FeSO4・7H2O、10 mg/L MnSO4・4H2O、1 mg/L ZnSO4・7H2O、20 mM MgCl2、1.5% Bacto Agar、50 μg/mLネオマイシン、pH 7.0)にプレーティングし、37 ℃で1晩静置培養した。得られたクローンはコロニーの
ウエスタン解析により目的タンパク質の発現を確認し、発現が確認できたクローンについては、コロニーをTMNm培地(10 g/Lグルコース、10 g/Lファイトンペプトン、5 g/Lエル
リッヒカツオエキス、2 g/L粉末酵母エキスS、10 mg/L FeSO4・7H2O、10 mg/L MnSO4・4H2O、1 mg/L ZnSO4・7H2O、50 μg/mLネオマイシン、pH 7.0)に植菌し、30℃、200 rpmで一晩培養し、プラスミドを抽出し、塩基配列を確認した。
Bacillus subtilis由来キシラナーゼ(XynA、配列番号159)をコードする人工合成DNA
(配列番号160)をpUC19改変プラスミドpUCFa(ファスマック)のEcoRV認識部位に挿入しプラスミド5を得た。また、Bacillus subtilis由来のエステラーゼ(EstA、配列番号185
)をコードする人工合成DNA(配列番号186)をpUC19改変プラスミドpUCFa(ファスマック)のEcoRV認識部位に挿入してプラスミド6を得た。
検出・精製用のHAタグ(配列番号161)および6×Hisタグ(配列番号162)が発現タンパク質のC末端に付加されるように、HAタグ、6×Hisタグおよび終始コドンをコードする人
工合成DNA(配列番号163)を、pNCMO2(タカラバイオ)のNcoI-HindIIIサイトに挿入し
、ブレビバチルス発現用プラスミド7を作製した。
下記手順でNまたはC末端あるいはN、C両末端にPX12-20タグを付加したキシラナーゼま
たはエステラーゼをブレビバチルスで発現させるためのプラスミドを構築した(図9,10)。
まず、キシラナーゼまたはエステラーゼのNまたはC末端あるいはN、C両末端に各種タグを付加するために、表3に示した鋳型プラスミド、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせによるPCRを実施した。各プライマーの5’末端にはプラスミド7との
相同配列を付加した。また、フォワードプライマーは、シグナルペプチドに続き、2個の
アミノ酸残基ADが付加されるように設計した。PCRはKOD-PLUS-Ver.2(東洋紡)を用い、2
pg/μl 鋳型プラスミド、0.3 μM フォワードプライマー、0.3 μM リバースプライマー、0.2 mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5 mM MgSO4、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2 となるように50 μl反応液を調製し、94℃、5分間加熱した後、98℃、10秒間、60
℃、 30秒間、68℃, 40秒間の加熱処理を25サイクル行い、最後に68℃で5分間加熱した。得られた増幅断片はQIAquick PCR Purification Kitで精製した。プラスミド7はNcoI、NdeIで消化後、0.8% SeaKem GTG Agaroseを用いた電気泳動により分離し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いゲルから抽出した。約50 ng分の抽出したプラスミド7と精製PCR産物2
μlを混合し液量を5 μlに調整後、Gene Art Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit添付の2×Enzyme Mix 5 μlと混合し、室温で30分間静置、その後5分間氷上に静置した。反応液5 μlをコンピテントセルDH10B T1 SAと混合し氷上で30分間静置後、37℃で10分間加温し、氷上で2分間静置後、SOCを250 μl添加し、37℃、200 rpmで1時間振盪した。そ
の後、振盪物の50μlを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT寒天培地に塗布後、37℃で一晩静置培養し、形質転換コロニーを得た。コロニーを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT液
体培地に移植し、37℃、200 rpmで一晩振盪培養後、プラスミドを抽出し、塩基配列を確
認後、ブレビバチルスの形質転換に用いた。
Brevibacillus choshinensis SP3 コンピテントセルを37℃ヒートブロックで30秒間静
置して急速解凍し、遠心分離(12,000 rpm、室温、1分間)後上清を除去後、上記プラス
ミド溶液1 μlと50 μl Solution Aを混合したものを全量添加しボルテックスによりコンピテントセルのペレットを完全に懸濁し、5分間静置した。150 μlのSolution Bを加え、ボルテックスで10秒間混和し、遠心分離(5,000 rpm、室温、5分間)後上清を除去、再度遠心分離(5,000 rpm、室温、30秒間)し完全に上清を除去した。これに1 ml MT培地を加え、マイクロピペットを使って完全に懸濁後、37 ℃、200 rpmで1時間振盪培養した。培
養液はMTNmプレートにプレーティングし、37 ℃で1晩静置培養し、形質転換ブレビバチルスを得た。
形質転換ブレビバチルスのシングルコロニーをMTNmプレートに塗株し、30℃、一晩静置し培養を行った。培養後のプレート培地より1μl滅菌ディスポループで菌体をかきとり、滅菌ポリスチレン製14 mlチューブに入った3 ml TMNm培地に植菌し、30℃、200rpmで一晩前培養した。hGH発現の場合、前培養液200μlを3 ml TMNm培地に植菌し30℃、200rpmで振盪培養し、48時間後に菌体を含む培養液をサンプリングした。キシラナーゼおよびエステラーゼの発現の場合、前培養液200μlを3 ml TMNm培地に植菌し30℃、120rpmで振盪培養
し、48時間後に菌体を含む培養液をサンプリングした。培養液は100 μlずつ小分けし、
遠心分離(20,000×g、4℃、10分間)により培養上清と菌体とに分け、培養上清50μlと
菌体全量を-80 ℃で保存した。
凍結保存した培養上清50μlに対し、2×サンプルバッファー(EZ Apply、ATTO製)50μlを加え、ボルテックスミキサーにて撹拌後、沸騰水中で10分間加熱しSDS化を行った。菌体に関しては、1×サンプルバッファー(EZ Applyを2倍希釈したもの)100μlを加え、同様の工程でSDS化を行った。
よび形質転換
コザック配列の下流にSaccharomycescerevisiae由来ファクターαの細胞外分泌シグナ
ルペプチド(AFSP、配列番号168)コード配列および終始コドン配列を配した人工合成DNA(配列番号169)を、pJ902-15(Invivogen)のBsaI-BsaIサイトに挿入しピキア酵
母発現用プラスミド8を作成した。
下記手順でNまたはC末端あるいはN、C両末端に各種タグを付加したhGHをピキア酵母で
発現させるためのプラスミドを構築した(図11)。
まず、hGHのNまたはC末端あるいはN、C両末端にタグを付加するために、表3に示した
鋳型プラスミド、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせによるPCRを
実施した。各プライマーの5’末端にはプラスミド8との相同配列を付加した。PCRはKOD-P
LUS-Ver.2(東洋紡)を用い、2 pg/μl 鋳型プラスミド、0.3 μM フォワードプライマー、0.3 μM リバースプライマー、0.2 mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5 mM
MgSO4、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2 となるように50 μl反応液を調製し、94℃、5分間
加熱した後、98℃、10秒間、60℃、 30秒間、68℃, 40秒間の加熱処理を25サイクル行い
、最後に68℃で5分間加熱した。得られた増幅断片はQIAquick PCR Purification Kitで精製した。プラスミド8はXhoI、NotIで消化後、0.8% SeaKem GTG Agaroseを用いた電気泳動により分離し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いゲルから抽出した。約50 ng分の抽出したプラスミド8と精製PCR産物2 μlを混合し液量を5 μlに調整後、Gene Art Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit添付の2×Enzyme Mix 5 μlと混合し、室温で30分間静置、その後5分間氷上に静置した。反応液5 μlをコンピテントセルDH10B T1 SAと混合し氷
上で30分間静置後、37℃で10分間加温し、氷上で2分間静置後、SOCを250 μl添加し、37
℃、200 rpmで1時間振盪した。その後、振盪物の50μlを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT寒天培地に塗布後、37℃で一晩静置培養し、形質転換コロニーを得た。コロニーを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT液体培地に移植し、37℃、200 rpmで一晩振盪培養後、プラスミドを抽出し、塩基配列を確認した。プラスミドはSacI切断により直鎖化し、フェノール・クロロホルム抽出によりタンパク質を除き、エタノール沈殿後、乾燥し、TEバッファーに溶解し、ピキア酵母の形質転換に用いた。
ピキア酵母(Pichia pastoris PPS-9010)をYPD培地で30℃、200rpmにて一晩振盪培養
した。100 mlのYPD 培地が入った三角フラスコにOD600が0.2-0.4になるように上記培養液を添加し、30℃、200 rpmにてOD600が0.8-1.0になるまで振盪培養した。500 x g、室温で5 分間遠心し、上清を捨て細胞ペレットを得た。ペレットに氷冷した18 mlのBEDS solution(10 mM Bicine、3% (v/v) Ethylene glycol、5% (v/v) Dimethyl sulfoxide、1 M Sorbitol)と氷冷した2 mlの1 M Dithiothreitolを添加し、懸濁後、30℃、100 rpmにて5分間インキュベートした。さらに、500 x g、室温で5 分間遠心し、上清を捨て細胞ペレッ
トを得た。ペレットに2 mlのBEDS solutionを添加し、懸濁後、40 μl ずつ分注し、コ
ンピテントセルとした。使用するまで-80℃のディープフリーザーで保管した。
直鎖化した約100 ng分の上記プラスミド溶液を、氷上で融解したコンピテントセルと混合し、エレクトロポレーション用キュベット(電極間距離0.2 cm、BIO-RAD)に添加し2分間氷上で静置した。キュベットをエレクトロポレーション用装置(MicroPulser、BIO-RAD)にセットし、プログラムされた条件(Pic、10μF、600Ω、2.0 kV、1 pulse)にてエレクトロポレーションを実施した。直後に1 M Sorbitolを含むYPD培地を1 ml添加し、全量
をマイクロチューブに移し、30℃、200 rpmで1時間振盪した。振盪後、500μlを、1 M Sorbitol、2% Bacto Agar および100 mg/L Zeocine (invivogen)を含むYPDプレート培地に
塗布後、30℃で2-3日静置培養し、形質転換コロニーを得た。
形質転換後のシングルコロニーを1 M Sorbitol、2% Bacto Agar および100 mg/L Zeocineを含むYPDプレート培地に塗布し、30℃、24時間、静置培養を行った。次に、培養後の
プレート培地より1μl滅菌ディスポループで菌体をかきとり、滅菌14mlチューブに添加した3 ml BMGY培地(1% Bacto Yeast Extract、2% Bacto peptone、0.1 M potassium phosphate buffer (pH6.0)、1.34% Yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino acids、0.4 mg/L Biotin、1% Glycerol)に植菌し、30℃、200rpmにてOD600が2-6になるまで振盪培養した。3ml培地に再懸濁した場合にOD600が1になる必要量の培養物を滅菌
済1.5mlエッペンドルフチューブに分取後、3,000×g、20℃、5分間遠心分離を行い、上清を除去後、沈殿を1ml BMMY培地(1% Bacto Yeast Extract、2% Bacto peptone、0.1 M potassium phosphate buffer (pH6.0)、1.34% Yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino acids、0.4 mg/L Biotin、0.5% Methanol)に懸濁し、全量を予め滅菌14 mlチューブに用意しておいた2 mlのBMMY培地と混合し、30℃、200rpm、72時間振盪培養を行った。培養終了後、培養液100 μlをマイクロチューブに分取し、15,000×g、4℃、10分間遠心後、上清50 μlを新しいマイクロチューブに分取し培養上清を得、残った上清
を除去し、菌体ペレットを得た。培養上清、菌体ペレットは液体窒素中で凍結後、ディープフリーザー中-80℃で保存した。
凍結保存した培養上清50μlに対し、2×サンプルバッファー(EZ Apply、ATTO製)50μlを加え、ボルテックスミキサーにて撹拌後、沸騰水中で10分間加熱しSDS化を行った。
菌体ペレットは、氷冷した懸濁バッファー(1X PBS (BIO-RAD)、1XcOmplete-EDTA free(ロシュ))100μlに懸濁し、全量を80 μl ガラスビーズ(直径0.5 mm、酸処理済み、Sigma)が入ったマイクロチューブに添加し、TissueLyzerII(QIAGEN)を用い、30 Hz、4
分間振盪し破砕した。破砕液を30μl分取し、2×サンプルバッファー(EZ Apply、ATTO製)30μlを加え、ボルテックスミキサーにて撹拌後、沸騰水中で10分間加熱しSDS化を行った。
タンパク質定量時の標準物質にはhGHおよびIFNβの標品を用いた。また、キシラナーゼの定量の際は、HA配列を付加したStx2eBを標品として用いた。これをサンプルバッファー(EZ Apply、ATTO製)で2倍希釈を繰り返すことにより希釈系列を作成し、これらをスタ
ンダードとして用いた。
タンパク質の電気泳動(SDS-PAGE)は、電気泳動槽(Criterion cell、BIO RAD)およ
びCriterion TGX-ゲル(BIO RAD)を用いた。電気泳動槽に泳動バッファー(Tris/Glycine/SDS Buffer、BIO RAD)を入れ、ウェルにSDS化したサンプルを4 μlアプライし、200 V定電圧で40分間泳動した。
電気泳動後のゲルは、トランスブロット転写パック(BIO RAD)を用い、トランスブロ
ットTurbo(BIO RAD)でブロッティングを行った。
ブロッティング後のメンブレンはブロッキング溶液(TBS系, pH7.2、ナカライテスク)に浸し、室温で1時間振盪または4℃で16時間静置後、TBS-T(137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1% ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、25 mM Tris-HCl、pH 7.4)中で室温、5分間の振盪を3回行い洗浄した。hGHの検出には、抗血清Rabbit-monoclonal Anti-Growth Hormone antibody[EPR11047(B)](abcam) をTBS-Tで3,000倍希
釈して使用した。IFNβの検出には、抗血清Mouse-monoclonal Anti-HumanIFNβantibody
(R&D Systems) をTBS-Tで1,000倍希釈して使用した。また、キシラナーゼおよびエステラーゼの検出には、抗血清Rat-monoclonal Anti-HA antibody(Roche)をTBS-Tで6,000倍希釈して使用した。抗体希釈液中にメンブレンを浸し、室温で1時間振盪することにより抗
原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振盪を3回行い洗浄した。二次抗体には、hGH検出の場合は、TBS-Tで2,000倍希釈したAnti-Rabbit IgG, AP-linked Antibody(Cell Signaling TECHNOLOGY)を、IFNβの検出の場合は、Anti-Mouse IgG, AP-linked Antibody
(Cell Signaling TECHNOLOGY)を使用した。また、キシラナーゼおよびエステラーゼの
検出の場合は、TBS-Tで6,000倍希釈したAnti-Rat IgG, AP-linked Antibody(EDM Millipore Corp.)を使用した。
二次抗体希釈液中にメンブレンを浸し、室温で1時間振盪することにより抗原抗体反応
を行い、TBS-T中で室温、5分間の振盪を3回行い洗浄した。アルカリホスファターゼによ
る発色反応は、発色液(0.1 M 塩化ナトリウム、5 mM 塩化マグネシウム、0.33 mg/mlニ
トロブルーテトラゾリウム、0.33 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸、0.1 M Tris-HCl、pH9.5、)中にメンブレンを浸し、室温で15分間振盪することにより行い、
メンブレンを蒸留水で洗浄した後、常温で乾燥した。
発色したメンブレンはスキャナー(PM-A900、エプソン)により解像度600 dpiで画像化し、画像解析ソフト(CS Analyzer ver. 3.0、アトー)を用い、hGHまたはIFNβタンパク質の定量を行った。
ペプチドタグを付加するタンパク質としてオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質(GFP、アミノ酸配列:配列番号175、DNA塩基配列:配列番号176)を用いた。GFPタン
パク質のN末端側に各種ペプチドタグ、C末端側にFlagタグが配置されるようなフォワードプライマー(pENTR1A-1(配列番号177)・・・タグなし用、pENTR1A-2(配列番号178)・・・PG12タグ用、pENTR1A-3(配列番号179)・・・PX12-20タグ用、pENTR1A-4
(配列番号180)・・・PX12-20v7タグ用)と、リバースプライマー(pENTR1A-Flag-GFP(配列番号181))のセットでPCR反応を行い、クローニング用DNA断片を調整した。
調整したDNA断片をpENTR 1A(ThermoFisher Scientific)へクローニングして各種ペプチドタグ-GFP-FlagタグをコードするDNA断片を持つプラスミドを構築した。このプラスミドをもとにLR反応を用いてドナーベクターであるpFastbac(ThermoFisher Scientific)へ
各種ペプチドタグ-GFP-FlagタグをコードするDNAを挿入した。これらの各種ドナーベクターを大腸菌DH10bac(ThermoFisher Scientific)へ導入してバクミドベクターのlacZ領域にトランスポジションさせて組換えバクミドを作成した。各種ペプチドタグ-GFP-Flagタ
グをコードするDNAを含む組換えバクミドDNAをカイコ由来BmN細胞へ導入して各種バキュ
ロウイルスを作成した。得られた各種バキュロウイルス溶液をBmN細胞用培地へ添加して
再度バキュロウイルス溶液を得る作業を3回繰り返し、十分にバキュロウイルス濃度が高
まった各種バキュロウイルス溶液を調整した。このバキュロウイルス溶液200 μlを5.0
×105のBmN細胞を含む1.8 mlのIPL41-10%FCS培地に添加し、36時間後にピペッティングして細胞を剥がし、培養液を回収して細胞数を計測したのち、培養上清と細胞画分に遠心操作で分離した。回収した細胞画分は200 μlの20 mM Tris-HCl(pH7.4)、20 mM NaCl、3
mM MgCl2溶液に懸濁して超音波処理したのち遠心操作で上清を回収した。回収した細胞
破砕上清は培養上清に加えて解析用サンプルとした。各種ペプチドタグ-GFP-Flagタグを
含む解析用サンプル9 μl分をSDS-PAGEにかけ、1次抗体にanti-Flag抗体(Sigma Aldrich)、2次抗体にanti-mouse IgG HRP標識抗体(GE healthcare)を用いて、ImmunoStar Zeta(和光純薬)を用いて各種ペプチドタグ-GFP-Flagタグタンパク質を検出した。各種ペ
プチドタグ-GFP-Flagタグタンパク質のバンド強度を細胞数で除した数値を比較して各種
ペプチドタグのタンパク質発現量向上効果とした。
ペプチドタグを付加するタンパク質としてオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質(GFP、アミノ酸配列:配列番号175、DNA塩基配列:配列番号176)を用いた。GFPタン
パク質のN末端側に各種ペプチドタグ、C末端側にFlagタグが配置されるようなフォワードプライマー(pENTR1A-1(配列番号177)・・・タグなし用、pENTR1A-2(配列番号178)・・・PG12タグ用、pENTR1A-3(配列番号179)・・・PX12-20タグ用)と、リバースプライマー(pENTR1A-Flag-GFP(配列番号181))のセットでPCR反応を行い、クロ
ーニング用DNA断片を調整した。調整したDNA断片をpENTR 1A(ThermoFisher Scientific
)へクローニングして各種ペプチドタグ-GFP-FlagタグをコードするDNA断片を持つプラスミドを構築した。このプラスミドをもとにLR反応を用いてpAd/CMV/v5-DESTアデノウイル
スベクター(ThermoFisher Scientific)へ各種ペプチドタグ-GFP-FlagタグをコードするDNAを挿入した。これらの各種ベクターをHEK293A細胞へ導入して各種アデノウイルス溶液を作成した。得られた各種アデノウイルス溶液をHEK293A細胞へ接種して再度アデノウイ
ルス溶液を得る作業を4回繰り返し、十分にアデノウイルス濃度が高まった各種アデノウ
イルス溶液を調整した。このアデノウイルス溶液200 μlを2.5×105のA549細胞へ1.2 mlのDMEM high glucose-10%FCS培地中に添加し、84時間後にトリプシン処理(37℃、10分間)して細胞を剥がし、培養液を回収して細胞数を計測したのち、培養上清と細胞画分に遠心操作で分離した。回収した細胞画分は200 μlの20 mM Tris-HCl(pH7.4)、20 mM NaCl、3 mM MgCl2溶液に懸濁して超音波処理したのち遠心操作で上清を回収し、培養上清に
加えた。励起波長395 nm、測定波長509 nmで蛍光強度を測定した。各種ペプチドタグ-GFP-Flagタグタンパク質の蛍光強度を細胞数で除した数値を比較して各種ペプチドタグのタ
ンパク質発現量向上効果とした。
(1) 各種ペプチドタグ付加による酵母におけるタンパク質の発現量向上
作出した遺伝子組換え酵母を所定の条件で培養し、所定の条件にてhGHもしくはIFNβを抽出し、ウエスタン解析によりそれらの目的タンパク質の発現量を測定した。その結果、図4より、PG12の配列(配列番号22)において、3つのSをKに変えたPX12-20(配列
番号25)をIFNβに付加したとき、PG12を付加したIFNβよりもタンパク質の発現量が増加した。また、PX12-20タグの効果はN末よりもC末に付加したときの方が大きく、N末と
C末の両方に付加したときの方がさらに大きかった。
また、図5では、PG12およびPG17の配列に対して様々な改変を行ってペプチドタグを作製し、hGHの発現に対する影響を調べたところ、PG12のSやGを置換するアミノ酸はK以外
に、L、N、QまたはRでも高発現効果があることが分かった。また、アミノ酸配列を改変したタグに、プロテアーゼ認識配列を付加した場合も高発現効果を維持していた。
作出した遺伝子組換え大腸菌を所定の条件で培養し、所定の条件にてhGHもしくはIFNβを抽出し、ウエスタン解析によりそれらの目的タンパク質の発現量を測定した。その結果、図6より、PX12-20(配列番号25)およびPX12-20v7(配列番号38)をそれぞれIFN
βに付加したとき、PG12を付加したIFNβよりもタンパク質の発現量が増加した。また、PX12-20およびPX12-20v7の効果はN末のみよりも、N末とC末の両方に付加したときの方がさらに大きかった。また、図7より、PX12-20の効果はhGHに対しても発揮された。
作出した遺伝子組換えブレビバチルスを所定の条件で培養し、所定の条件にてhGHを抽
出し、ウエスタン解析によりそれらの目的タンパク質の発現量を測定した。その結果、図8より、PX12-20(配列番号25)、PX12-38(配列番号52)およびPX12-20v7(配列番
号38)をそれぞれhGHに付加したとき、hGHの発現量が増加した。
また、作出した遺伝子組換えブレビバチルスを所定の条件で培養し、所定の条件にてキシラナーゼを抽出し、ウエスタン解析によりそれらの目的タンパク質の発現量を測定した。その結果、図12より、PX12-20(配列番号25)をC末もしくはN末とC末の両方に付加したとき、キシラナーゼの発現量が増加した。
さらに、作出した遺伝子組換えブレビバチルスを所定の条件で培養し、所定の条件にてエステラーゼを抽出し、ウエスタン解析によりそれらの目的タンパク質の発現量を測定した。その結果、図13より、PX12-20(配列番号25)をN末に付加したとき、エステラーゼの発現量が増加した。
作出した遺伝子組換えピキア酵母を所定の条件で培養し、所定の条件にてhGHを抽出し
、ウエスタン解析によりそれらの目的タンパク質の発現量を測定した。その結果、図14より、PX12-20(配列番号25)およびPX12-20v7(配列番号38)をそれぞれhGHに付加
したとき、hGHの発現量が増加した。
向上
作出した遺伝子組換え昆虫細胞および哺乳動物細胞を所定の条件で培養し、所定の条件にてGFPの蛍光を測定した。
その結果、図15に示す通り、昆虫細胞で各種ペプチドタグが付加されたGFPを発現さ
せた場合、PX12-20タグやPX12-20v7タグが付加されたタンパク質はタグを付けない場合より発現量が増強された。
その結果、図16に示す通り、ほ乳類細胞で各種ペプチドタグが付加されたGFPを発現
させた場合、PX12-20タグが付加されたタンパク質はタグを付けない場合より発現量が増
強された。
Claims (26)
- 下記の配列を有するペプチドと有用タンパク質とを含む、タグ付加タンパク質。
Xm(PYn)qPZr
ここで、X、YおよびZはそれぞれアルギニン(R)、グリシン(G)、セリン(S)、リジン(K)、トレオニン(T)、ロイシン(L)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、ヒスチジン(H)から独立して選択されるアミノ酸残基であって、繰り返し単位PYnにおけるYのうち少なくとも1つはK、L、N、Q、HまたはRを含む。
mは0~5の整数であり、nは1、2または3であり、qは1~10の整数であり、r=0~10の整数である。 - 前記ペプチドはGとSの含有率が60%未満である、請求項1に記載のタグ付加タンパク質。
- 前記ペプチドは長さが8~40アミノ酸である、請求項1または2に記載のタグ付加タンパク質。
- 前記ペプチドは長さが8~22アミノ酸である、請求項1または2に記載のタグ付加タンパク質。
- 前記ペプチドにおいて、繰り返し単位PYnにおけるYのうち少なくとも1つはKまたは
Rを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のタグ付加タンパク質。 - 有用タンパク質がヒト成長ホルモン、インターフェロンβ、キシラナーゼ、エステラーゼ、または緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項1~5のいずれか一項に記載のタグ
付加タンパク質。 - 前記ペプチドと、前記有用タンパク質がプロテアーゼ認識配列を介して連結されている、請求項1~6のいずれか一項に記載のタグ付加タンパク質。
- 分泌シグナルを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載のタグ付加タンパク質。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載のタグ付加タンパク質をコードするDNA。
- 請求項9に記載のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項9に記載のDNAまたは請求項10に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
- 形質転換体が、酵母、大腸菌、ブレビバチルス、昆虫細胞または哺乳動物細胞(ヒト培養細胞を含むがヒト個体は含まない)である、請求項11に記載の形質転換体。
- 請求項11または12に記載の形質転換体を培養してタグ付加タンパク質を蓄積させ、タグ付加タンパク質を回収することを特徴とする、タグ付加タンパク質の製造方法。
- 下記の配列を有するペプチドと有用タンパク質を結合する工程を含む、タグ付加タンパク質の製造方法。
Xm(PYn)qPZr
ここで、X、YおよびZはそれぞれアルギニン(R)、グリシン(G)、セリン(S)、リジン(K)、トレオニン(T)、ロイシン(L)、アスパラギン(N)、グルタミン(
Q)、ヒスチジン(H)から独立して選択されるアミノ酸残基であって、繰り返し単位P
YnにおけるYのうち少なくとも1つはK、L、N、Q、HまたはRを含む。
mは0~5の整数であり、nは1、2または3であり、qは1~10の整数であり、r=0~10の整数である。 - 前記ペプチドはGとSの含有率が60%未満である、請求項14に記載のタグ付加タンパク質の製造方法。
- 前記ペプチドは長さが6~50アミノ酸である、請求項14または15に記載のタグ付加タンパク質の製造方法。
- 前記ペプチドは長さが8~40アミノ酸である、請求項14または15に記載のタグ付加タンパク質の製造方法。
- 前記ペプチドは長さが8~22アミノ酸である、請求項14または15に記載のタグ付加タンパク質の製造方法。
- 前記ペプチドにおいて、繰り返し単位PYnにおけるYのうち少なくとも1つはKまたは
Rを含む、請求項14~18のいずれか一項に記載のタグ付加タンパク質の製造方法。 - 前記ペプチドは配列番号25,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,58,60,64,66,92,94,96,98,
100,102,104,106,108,110,112,114,116,118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,140,142,143,145,147,149,151,153,155,または157のアミノ酸配列を有する、請求項14~19のいずれか一項に記載のタグ付加タンパク質の製造方法。 - 前記有用タンパク質がヒト成長ホルモン、インターフェロンβ、キシラナーゼ、エステラーゼ、または緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項14~20のいずれか一項に記
載のタグ付加タンパク質の製造方法。 - 前記ペプチドと、前記有用タンパク質がプロテアーゼ認識配列を介して連結される、請求項14~21のいずれか一項に記載のタグ付加タンパク質の製造方法。
- 前記タグ付加タンパク質は分泌シグナルを含む、請求項14~22のいずれか一項に記載のタグ付加タンパク質の製造方法。
- 有用タンパク質をコードするDNAと前記ペプチドタグをコードするDNAとを読み枠を合わせて連結して前記タグ付加タンパク質をコードするDNAを得る工程、得られたDNAまたは該DNAを含む組換えベクターで形質転換された形質転換体を得る工程、当該形質転換体培養して前記タグ付加タンパク質を蓄積させる工程、および該タグ付加タンパク質を回収する工程を含む、請求項14~23のいずれか一項に記載のタグ付加タンパク質の製造方法。
- 形質転換体が、酵母、大腸菌、ブレビバチルス、昆虫細胞または哺乳動物細胞(ヒト培養細胞を含むがヒト個体は含まない)である、請求項24に記載のタグ付加タンパク質の製造方法。
- 下記の配列を有するペプチドと有用タンパク質を結合する工程を含む有用タンパク質の発
現量を増加させる方法。
Xm(PYn)qPZr
ここで、X、YおよびZはそれぞれアルギニン(R)、グリシン(G)、セリン(S)、リジン(K)、トレオニン(T)、ロイシン(L)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、ヒスチジン(H)から独立して選択されるアミノ酸残基であって、繰り返し単位P
YnにおけるYのうち少なくとも1つはK、L、N、Q、HまたはRを含む。
mは0~5の整数であり、nは1、2または3であり、qは1~10の整数であり、r=0~10の整数である。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015256396 | 2015-12-28 | ||
JP2015256396 | 2015-12-28 | ||
JP2016153265 | 2016-08-03 | ||
JP2016153265 | 2016-08-03 | ||
PCT/JP2016/089139 WO2017115853A1 (ja) | 2015-12-28 | 2016-12-28 | ペプチドタグおよびそれを含むタグ付加タンパク質 |
JP2017559238A JP7027168B2 (ja) | 2015-12-28 | 2016-12-28 | ペプチドタグおよびそれを含むタグ付加タンパク質 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017559238A Division JP7027168B2 (ja) | 2015-12-28 | 2016-12-28 | ペプチドタグおよびそれを含むタグ付加タンパク質 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022044600A true JP2022044600A (ja) | 2022-03-17 |
Family
ID=59225307
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017559238A Active JP7027168B2 (ja) | 2015-12-28 | 2016-12-28 | ペプチドタグおよびそれを含むタグ付加タンパク質 |
JP2021209816A Pending JP2022044600A (ja) | 2015-12-28 | 2021-12-23 | ペプチドタグおよびそれを含むタグ付加タンパク質 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017559238A Active JP7027168B2 (ja) | 2015-12-28 | 2016-12-28 | ペプチドタグおよびそれを含むタグ付加タンパク質 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10808253B2 (ja) |
EP (1) | EP3399033A4 (ja) |
JP (2) | JP7027168B2 (ja) |
KR (1) | KR20180091098A (ja) |
CN (1) | CN108473979B (ja) |
AU (1) | AU2016382134B2 (ja) |
BR (1) | BR112018013246A2 (ja) |
CA (1) | CA3009880A1 (ja) |
MX (1) | MX2018008019A (ja) |
TW (1) | TW201726706A (ja) |
WO (1) | WO2017115853A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017217460A1 (ja) * | 2016-06-15 | 2017-12-21 | 出光興産株式会社 | ペプチドリンカーで連結された2以上のタンパク質を含む融合タンパク質 |
JP2019146524A (ja) * | 2018-02-27 | 2019-09-05 | 出光興産株式会社 | 高発現かつ高機能な二重特異性抗体 |
CN112639103A (zh) * | 2018-08-31 | 2021-04-09 | 出光兴产株式会社 | 利用肽标签的蛋白质可溶性表达 |
CN109182299B (zh) * | 2018-10-30 | 2021-12-31 | 福建师范大学 | 耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体及其制备方法 |
JP2021052728A (ja) * | 2019-10-02 | 2021-04-08 | 出光興産株式会社 | 高機能酵素複合体の高生産技術 |
US20240002896A1 (en) * | 2020-10-27 | 2024-01-04 | Idemitsu Kosan Co.,Ltd. | Peptide tag and tagged protein containing same |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009133882A1 (ja) * | 2008-05-02 | 2009-11-05 | 出光興産株式会社 | 細菌毒素ワクチン |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5273438A (en) | 1975-12-15 | 1977-06-20 | Tomita Takahashi | Folding structure of truck handle |
JPS5818558B2 (ja) | 1976-11-13 | 1983-04-13 | 株式会社クボタ | 流量圧力制御方法 |
US6686333B1 (en) * | 1996-10-04 | 2004-02-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Resources | Inhibition of HIV replication using soluble Tat peptide analogs |
EP1360500B1 (en) * | 2000-04-14 | 2010-01-13 | Genencor International, Inc. | Methods for selective targeting |
US7205387B2 (en) * | 2003-08-28 | 2007-04-17 | Agency For Science, Technology And Research | Recombinant polypeptide useful for neurotrophin receptor mediated gene delivery and as neurotrophin agonist |
US20100234568A1 (en) * | 2006-10-19 | 2010-09-16 | Linda Jane Decarolis | Identification of peptide tags for the production of insoluble peptides by sequence scanning |
US20090137004A1 (en) * | 2007-11-15 | 2009-05-28 | Molecular Kinetics Incorporated | Artificial entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production |
JP5273438B2 (ja) | 2007-11-22 | 2013-08-28 | 国立大学法人東京農工大学 | ペプチド付加生体分子の溶解度計算方法、及びそれを用いたペプチドタグの設計方法と封入体形成防止方法 |
JP2009201437A (ja) | 2008-02-28 | 2009-09-10 | Toyota Motor Corp | 種子内の油脂含量を調節する変異遺伝子、種子内油脂含量の調節方法 |
JP5626717B2 (ja) * | 2009-03-26 | 2014-11-19 | 学校法人日本大学 | レチノイン酸受容体αを含む融合タンパク質 |
US20110033389A1 (en) * | 2009-04-29 | 2011-02-10 | Zhifeng Chen | Modified antibodies for passive immunotherapy |
WO2013091661A2 (en) * | 2011-12-23 | 2013-06-27 | Aarhus Universitet | Proteolytic resistant protein affinity tag |
CN107496932A (zh) * | 2012-02-27 | 2017-12-22 | 阿穆尼克斯运营公司 | Xten缀合组合物和制造其的方法 |
CA2883569A1 (en) * | 2012-08-31 | 2014-03-06 | University Of Virginia Patent Foundation | Target peptides for immunotherapy and diagnostics |
CN105263957A (zh) * | 2013-05-02 | 2016-01-20 | 葛兰素史克知识产权开发有限公司 | 治疗肽 |
-
2016
- 2016-12-28 TW TW105143577A patent/TW201726706A/zh unknown
- 2016-12-28 WO PCT/JP2016/089139 patent/WO2017115853A1/ja active Application Filing
- 2016-12-28 CN CN201680076564.0A patent/CN108473979B/zh active Active
- 2016-12-28 AU AU2016382134A patent/AU2016382134B2/en active Active
- 2016-12-28 BR BR112018013246-2A patent/BR112018013246A2/ja active Search and Examination
- 2016-12-28 KR KR1020187020935A patent/KR20180091098A/ko unknown
- 2016-12-28 EP EP16881827.6A patent/EP3399033A4/en active Pending
- 2016-12-28 JP JP2017559238A patent/JP7027168B2/ja active Active
- 2016-12-28 MX MX2018008019A patent/MX2018008019A/es unknown
- 2016-12-28 CA CA3009880A patent/CA3009880A1/en active Pending
- 2016-12-28 US US16/066,468 patent/US10808253B2/en active Active
-
2020
- 2020-09-11 US US17/018,751 patent/US20210130404A1/en active Pending
-
2021
- 2021-12-23 JP JP2021209816A patent/JP2022044600A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009133882A1 (ja) * | 2008-05-02 | 2009-11-05 | 出光興産株式会社 | 細菌毒素ワクチン |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
WU D. ET AL., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 91 (2013), JPN6020031998, pages 49 - 53, ISSN: 0005092383 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7027168B2 (ja) | 2022-03-01 |
KR20180091098A (ko) | 2018-08-14 |
CA3009880A1 (en) | 2017-07-06 |
MX2018008019A (es) | 2018-11-09 |
CN108473979A (zh) | 2018-08-31 |
US20210130404A1 (en) | 2021-05-06 |
JPWO2017115853A1 (ja) | 2018-10-18 |
BR112018013246A2 (ja) | 2018-12-04 |
US20190024094A1 (en) | 2019-01-24 |
EP3399033A1 (en) | 2018-11-07 |
WO2017115853A1 (ja) | 2017-07-06 |
CN108473979B (zh) | 2022-08-19 |
US10808253B2 (en) | 2020-10-20 |
EP3399033A4 (en) | 2019-06-19 |
AU2016382134B2 (en) | 2022-09-22 |
TW201726706A (zh) | 2017-08-01 |
AU2016382134A1 (en) | 2018-07-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7027168B2 (ja) | ペプチドタグおよびそれを含むタグ付加タンパク質 | |
US10981968B2 (en) | Fusion partners for peptide production | |
KR101183720B1 (ko) | 슈도모나스 플루오레센스에서의 포유류 단백질의 발현 | |
US20210269811A1 (en) | Means and methods for increased protein expression by use of transcription factors | |
WO2017217460A1 (ja) | ペプチドリンカーで連結された2以上のタンパク質を含む融合タンパク質 | |
Li et al. | Optimized expression of classical swine fever virus E2 protein via combined strategy in Pichia pastoris | |
JP7477450B2 (ja) | ペプチドタグを利用したタンパク質の可溶性発現 | |
Schuster et al. | Protein expression in yeast; comparison of two expression strategies regarding protein maturation | |
WO2022092132A1 (ja) | ペプチドタグおよびそれを含むタグ付加タンパク質 | |
WO2022071291A1 (ja) | ペプチドタグおよびそれを含むタグ付加タンパク質 | |
US20240141363A1 (en) | Signal peptides for increased protein secretion | |
JP6188574B2 (ja) | 発現プロセス | |
JP2022109230A (ja) | ペプチドタグおよびそれを含むタグ付加タンパク質 | |
US20110281300A1 (en) | Preparation method of recombinant protein by use of a fusion expression partner |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220124 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230117 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230317 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230627 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230927 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20231003 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20231208 |