JP2022037160A - 水溶性膜貫通タンパク質ならびにその調製および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、どちらも2015年3月26日に出願された米国特許出願第14/669,753号および国際出願PCT/US第2015/022780号の優先権を主張するものであり、その両方が35U.S.C.119(e)の下で、2015年2月18日に出願された米国仮出願第62/117,550号、2014年5月15日に出願された米国仮出願第61/993,783号および2014年3月27日に出願された米国仮出願第61/971,388号の出願日の利益を主張する。
182からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む。これは、配列番号127、136、145、154、163、172、174および183からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、当該水溶性変異体はCCR3リガンドに結合する。
(1)分析のために当該膜タンパク質(例えば、GPCR)の配列を入力する工程と、
(2)当該膜タンパク質(例えば、GPCR)の膜貫通(TM)ドメインαヘリックスセグメント(「TM領域」)内の複数の疎水性アミノ酸が置換されている当該膜タンパク質(例えば、GPCR)の変異体を得る工程であって、
(a)前記疎水性アミノ酸は、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)およびフェニルアラニン(F)からなる群から選択され、
(b)前記ロイシン(L)はそれぞれ独立して、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換され、
(c)前記イソロイシン(I)および前記バリン(V)はそれぞれ独立して、トレオニン(T)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換され、かつ
(d)前記フェニルアラニンはそれぞれチロシン(Y)で置換される
ことを特徴とする工程と、その後に
(3)当該変異体のためにαヘリックス二次構造結果を得て、当該変異体内のαヘリックス二次構造の維持を確認する工程と、
(4)当該変異体のために膜貫通領域結果を得て、当該変異体の水溶性を確認する工程と
を含み、それにより当該膜タンパク質(例えば、GPCR)の水溶性変異体を選択することを特徴とする方法を提供する。
(1)必要であれば当該タンパク質(例えば、GPCR)のαヘリックス構造を予測して、膜(貫通)タンパク質の第1の膜貫通領域を同定する工程、
(2)本明細書に定義されているQTYコードにより複数の疎水性アミノ酸を修飾して、修飾された第1の膜貫通配列を得る工程、
(3)(2)の第1の修飾された膜貫通配列のαヘリックス構造の傾向を(例えば、第1の修飾された膜貫通配列を有する修飾された膜(貫通)タンパク質との関連において)スコア化して構造スコアを得る工程、
(4)(2)の第1の修飾された膜貫通配列の水溶性予測を(例えば、第1の修飾された膜貫通配列を有する修飾された膜(貫通)タンパク質との関連において)スコア化して溶解性スコアを得る工程、
(5)(2)~(4)を繰り返して推定上水溶性である第1の修飾された膜貫通変異体の第1のライブラリーを得る工程、
(6)第1のライブラリー内の推定上水溶性である第1の修飾された膜貫通変異体のそれぞれの構造スコアおよび溶解性スコアを比較し、好ましくは前記構造スコアおよび溶解性スコアを用いて推定上水溶性である第1の修飾された膜貫通変異体をランク付けする工程、
(7)複数の推定上水溶性である第1の修飾された膜貫通変異体(ここで、複数とは整数Hまたは好ましくは10、9、8、7、6、5または4未満である)を選択して、推定上水溶性である第1の修飾された膜貫通変異体の第2のライブラリーを得る工程、
(8)当該タンパク質の第2、第3、第4、第5、第6、第7または好ましくは全ての膜貫通領域のために工程(1)~(7)を繰り返す工程(本方法によって修飾された膜貫通領域の合計は整数nである)、
(9)工程(1)~(8)において修飾されたいずれかの膜貫通領域に含まれておらず、かつ当該タンパク質の任意の細胞外または細胞内ドメインを含むタンパク質のアミノ酸配列を同定する工程、
(10)推定上水溶性である修飾された膜貫通タンパク質の組み合わせ変異体を産生する工程(上記参照)、および
(11)任意に、推定上水溶性である修飾された膜貫通変異体のそれぞれの核酸配列を同定する工程
のうちの全てまたは実質的に全てを含む。
(a)タンパク質産生に適した条件下で増殖培地において細菌を培養する工程と、
(b)この細菌の溶解物を画分に分けて可溶性画分および不溶性ペレット画分を生成する工程と、
(c)当該タンパク質を可溶性画分から単離する工程であって、
(1)当該タンパク質は本発明の主題の変異体タンパク質(例えば、Gタンパク質共役受容体(GPCR))であり、かつ
(2)当該タンパク質の収率は増殖培地の少なくとも20mg/L(例えば、30mg/L、40mg/L、50mg/Lまたはそれ以上)である
ことを特徴とする工程と
を含む、細菌(例えば大腸菌)においてタンパク質を産生する方法を提供する。
本発明の特定の方法は、GPCRなどのタンパク質の膜貫通領域を予測する工程を含む。TM領域に関する当該技術分野で知られている多くのプログラムおよびソフトウェアがあり、そのうちのいずれかをTM領域予測工程を必要とする本発明の方法において個々にまたは組み合わせて使用してもよい。これらのプログラムは通常、典型的に指定される形式(FASTAまたはテキスト形式など)の入力配列を提供することをユーザに要求する非常に単純なユーザインタフェースを有し、かつテキストまたはグラフィックスあるいはその両方を用いて予測結果を与える。また、ユーザに特定のパラメータを指定させて予測結果を微調整するなどのより高度な機能を提供するプログラムもある。本発明の方法において全てのそのようなプログラムを使用することができる。
本発明の特定の方法は、GPCRなどのタンパク質のαへリックス二次構造を予測する工程を含む。多くのそのようなプログラムやソフトウェアが当該技術分野で知られており、それらのうちのいずれかをαへリックス二次構造予測工程を必要とする本発明の方法において個々にまたは組み合わせて使用してもよい。本発明の方法において全てのそのようなプログラムを使用することができる。
(ここで、
との角度は70°未満である)、空白(すなわちスペース)は他の規則が適用されない場合に使用され、ループを指す。これらの8種類は通常、3つのより大きなクラスすなわちヘリックス(G、HおよびI)、ストランド(EおよびB)ならびにループ(それ以外の全て)にグループ化される。
上に概略が記載されている本発明を用いて、特定の非限定的であるが例示的な実施形態について、図の中の代表的なフローチャートを参照しながら以下に説明する。
本明細書に記載されている各種態様および機能は、1つ以上のコンピュータシステムにおいて実行される専用ハードウェアまたはソフトウェア構成要素として実装してもよい。現在使用されているコンピュータシステムの多くの例がある。これらの例としては、とりわけ、ネットアプライアンス、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、メインフレーム、ネットワーク化されたクライアント、サーバ、メディアサーバ、アプリケーションサーバ、データベースサーバおよびウェブサーバが挙げられる。コンピュータシステムの他の例としては、携帯電話および携帯情報端末などのモバイルコンピューティングデバイス、ロードバランサー、ルータおよびスイッチなどのネットワーク機器を挙げることができる。さらに、態様は、単一のコンピュータシステム上に位置していてもよく、あるいは1つ以上の通信ネットワークによって接続された複数のコンピュータシステム間に分散されていてもよい。
CXCR4は356アミノ酸長のケモカイン受容体である。これは約8.61のpIおよび40221.19Daの分子量を有する。文献に発表されているCXCR4の配列は、
MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNK (配列番号3; EC1)
TM1変異体:
IFLPTTYSTTFQTGTTGNGQVTQVM (配列番号4)
IFQPTTYSTTFQTGTTGNGQVTQVM (配列番号5)
IFQPTTYSTTFQTGTTGNGQVTQTM (配列番号6)
IFQPTTYSTTYQTGTTGNGQVTQTM (配列番号7)
IFQPTTYSTTYQTGTTGNGQTTQVM (配列番号8)
IFQPTTYSTTYQTGTTGNGQTIQTM (配列番号9)
IFQPTTYSTTYQTGTTGNGQTTQTM (配列番号10)
TYQPTTYSTTYQTGTTGNGQTTQTM (配列番号11)
GYQKKLRSMTDKYR (配列番号12; IC1)
TM2変異体:
LHLSTADQQFTTTQPFWAVDAV (配列番号13)
LHLSVADQQYTTTQPFWATDAV (配列番号14)
LHQSVADQQYVTTQPFWATDAT (配列番号15)
QHQSVADQQFTTTQPFWATDAT (配列番号16)
LHQSVADQQYTITQPYWATDAT (配列番号17)
QHLSVADQQYTITQPYWATDAT (配列番号18)
QHLSTADQQYVTTQPYWATDAT (配列番号19)
QHQSTADQQYTTTQPYWATDAT (配列番号20)
ANWYFGNFLCK (配列番号21; EC2)
TM3変異体:
AVHVTYTVNQYSSVQIQAFT (配列番号22)
AVHTTYTVNQYSSVQIQAFT (配列番号23)
AVHTTYTVNQYSSVQTQAFT (配列番号24)
ATHTTYTVNQYSSVQTQAFT (配列番号25)
ATHTIYTTNQYSSVQTQAFT (配列番号26)
AVHTTYTTNQYSSVQTQAFT (配列番号27)
ATHTTYTTNQYSSVQTQAFT (配列番号28)
ATHTTYTTNQYSSTQTQAYT (配列番号29)
SLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEK (配列番号30; IC2)
TM4変異体:
VTYTGVWTPAQQQTIPDFIF (配列番号31)
TTYTGTWIPAQQQTIPDFIF (配列番号32)
TTYTGTWTPAQQQTIPDFIF (配列番号33)
TTYTGTWTPAQQQTIPDFIY (配列番号34)
TTYVGTWTPAQQQTTPDYIF (配列番号35)
TTYVGTWTPAQQQTTPDFIY (配列番号36)
TTYTGVWTPAQQQTTPDYTF (配列番号37)
TTYTGTWTPAQQQTTPDYTY (配列番号38)
ANVSEADDRYICDRFYPNDLW (配列番号39; EC3)
TM5変異体:
VVVFQFQHTMVGQTQPGTTTQ (配列番号40)
VVVFQFQHTMTGQTQPGTTTQ (配列番号41)
VVVFQYQHTMTGQTQPGTTTQ (配列番号42)
VVVYQYQHTMTGQTQPGTTTQ (配列番号43)
TVVFQYQHTMTGQTQPGTTTQ (配列番号44)
VVTFQYQHTMTGQTQPGTTTQ (配列番号45)
TVVYQYQHTMTGQTQPGTTTQ (配列番号46)
TTTYQYQHTMTGQTQPGTTTQ (配列番号47)
SCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTT (配列番号48; IC3)
TM6変異体:
VTQIQAFFACWQPYYTGTST (配列番号49)
VIQIQAYFACWQPYYTGTST (配列番号50)
VIQIQAYYACWQPYYTGTST (配列番号51)
VIQTQAFYACWQPYYTGTST (配列番号52)
VIQTQAYFACWQPYYTGTST (配列番号53)
VTQIQAFYACWQPYYTGTST (配列番号54)
VIQTQAYYACWQPYYTGTST (配列番号55)
TTQTQAYYACWQPYYTGTST (配列番号56)
DSFILLEIIKQGCEFENTVHK (配列番号57; EC4)
TM7変異体
WISITEAQAFFHCCLNPIQY (配列番号58)
WISITEAQAFYHCCLNPIQY (配列番号59)
WISITEAQAYFHCCQNPTLY (配列番号60)
WISTTEALAFYHCCQNPTQY (配列番号61)
WISTTEALAYFHCCQNPTQY (配列番号62)
WISITEALAYYHCCQNPTQY (配列番号63)
WISTTEALAYYHCCQNPTQY (配列番号64)
WTSTTEAQAYYHCCQNPTQY
AFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS (配列番号65; IC4)
CX3CR1は355アミノ酸長のケモカイン受容体である。これは約6.74のpIおよび40396.4Daの分子量を有する。この配列をTMHMMに供してその膜貫通ドメインを同定する。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFの全てまたは実質的に全てをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線)に整列させた以下の配列(下側の線)を得る。
MDQFPESVTENFEYDDLAEACYIGDIVVFGT (配列番号68)
TM1変異体:
TYQSTYYSTTFATGQVGNQQVVFALTNS (配列番号69)
TYQSTYYSTTYATGQVGNQQVVFALTNS (配列番号70)
TYQSTYYSTTYATGQVGNQQVVFAQTNS (配列番号71)
TYQSTYYSTTYATGQTGNLQVTFAQTNS (配列番号72)
TYQSTYYSTTYATGQTGNQLVTFAQTNS (配列番号73)
TYQSTYYSTTYATGQTGNQQVVFAQTNS (配列番号74)
TYQSTYYSTTYATGQTGNLQVTYAQTNS (配列番号75)
TYQSTYYSTTYATGQTGNQQTTYAQTNS (配列番号76)
KKPKSVTDIY (配列番号77)
TM2変異体
LLNQAQSDQLFVATQPFWTHY (配列番号78)
LLNQAQSDQQFVATQPFWTHY (配列番号79)
QQNLAQSDQQFVATQPFWTHY (配列番号80)
LQNLAQSDQQYTATQPFWTHY (配列番号81)
QLNLAQSDQQYTATQPFWTHY (配列番号82)
LLNQAQSDQQFTATQPYWTHY (配列番号83)
QQNLAQSDQQFTATQPYWTHY (配列番号84)
QQNQAQSDQQYTATQPYWTHY (配列番号85)
LINEKGLHNAMCK (配列番号86)
TM3変異体:
YTTAYYYTGYYGSTYYTTTTST (配列番号87)
DRYLAIVLAANSMNNRT (配列番号88)
TM4変異体:
VQHGTTTSQGTWAAATQVAAPQFMF (配列番号89)
VQHGVTTSQGTWAAATQTAAPQFMF (配列番号90)
VQHGTTTSQGVWAAATQTAAPQFMY (配列番号91)
VQHGTTTSQGTWAAAIQTAAPQFMY (配列番号92)
VQHGTTTSQGTWAAATQTAAPQFMF (配列番号93)
VQHGTTISQGTWAAATQTAAPQYMF (配列番号94)
VQHGTTTSQGTWAAATQTAAPQFMY (配列番号95)
TQHGTTTSQGTWAAATQTAAPQYMY (配列番号96)
TKQKENECLGDYPEVLQEIWPVLRNVET (配列番号97)
TM5変異体:
NFLGFQQPQQIMSYCYFRIT (配列番号98)
NFQGFLQPQQTMSYCYFRIT (配列番号99)
NFQGFLQPQQTMSYCYFRTT (配列番号100)
NFQGFQQPQQTMSYCYYRIT (配列番号101)
NFQGFLQPQQTMSYCYYRTT (配列番号102)
NFQGYLQPQQTMSYCYFRTT (配列番号103)
NYQGFQQPQQTMSYCYFRTT (配列番号104)
NYQGYQQPQQTMSYCYYRTT (配列番号105)
QTLFSCKNHKKAKAIK (配列番号106)
TM6変異体:
LIQQTTTTFYQFWTPYNTMTFQETL (配列番号107)
LIQQTTTTFYQYWTPYNVMTFQETQ (配列番号108)
LIQQTTTTYYQFWTPYNTMTFQETQ (配列番号109)
QIQQTTTTFYQYWTPYNTMTFQETQ (配列番号110)
LTQQTTTTYYQFWTPYNTMTFQETQ (配列番号111)
QIQQTTTTFFQYWTPYNTMTYQETQ (配列番号112)
QIQQTTTTFYQYWTPYNTMTYQETQ (配列番号113)
QTQQTTTTYYQYWTPYNTMTYQETQ (配列番号114)
KLYDFFPSCDMRKDLRL (配列番号115)
TM7変異体:
ALSVTETVAFSHCCQNPQIYAFAG (配列番号116)
AQSVTETTAFSHCCQNPLIYAFAG (配列番号117)
ALSVTETVAFSHCCQNPQTYAYAG (配列番号118)
AQSVTETTAFSHCCQNPQIYAYAG (配列番号119)
ALSVTETTAFSHCCQNPQTYAYAG (配列番号120)
ALSTTETTAYSHCCQNPQIYAFAG (配列番号121)
ALSVTETTAYSHCCQNPQTYAYAG (配列番号122)
AQSTTETTAYSHCCQNPQTYAYAG (配列番号123)
EKFRRYLYHLYGKCLAVLCGRSVHVDFSSSESQRSRHGSVLSSNFTYHTSDGDALLLL (配列番号124)
MTTSLDTVETFGTTSYYDDVGLLCEKADTRALMA (配列番号127)
TM1変異体:
QFVPPQYSQTFTTGQQGNVTVTMTQIKY (配列番号128)
QFVPPQYSQTFTTGQQGNTTVTMTQIKY (配列番号129)
QFVPPQYSQTYTTGQQGNTTVTMTQIKY (配列番号130)
QFTPPQYSQTYTTGQQGNVTTTMTQIKY (配列番号131)
QFTPPQYSQTYTTGQQGNTVTTMTQIKY (配列番号132)
QFTPPQYSQTYTTGQQGNTTVTMTQIKY (配列番号133)
QFTPPQYSQTYTTGQQGNTTTTMTQIKY (配列番号134)
QYTPPQYSQTYTTGQQGNTTTTMTQTKY (配列番号135)
RRLRIMTNIY (配列番号136)
TM2変異体:
LLNQATSDQQFQVTQPFWIHY (配列番号137)
LQNQAISDQLFQTTQPFWTHY (配列番号138)
QQNLAISDQQFQTTQPFWTHY (配列番号139)
QLNQAISDQQFQTTQPYWTHY (配列番号140)
QQNLAISDQQYQVTQPYWTHY (配列番号141)
LQNQATSDQLFQTTQPYWTHY (配列番号142)
QQNQAISDQQYQVTQPYWTHY (配列番号143)
QQNQATSDQQYQTTQPYWTHY (配列番号144)
VRGHNWVFGHGMCK (配列番号145)
TM3変異体:
LQSGFYHTGQYSETFFTTQQTT (配列番号146)
QLSGFYHTGQYSETFFTTQQTT (配列番号147)
QLSGFYHTGQYSETFYTTQQTT (配列番号148)
QLSGFYHTGQYSETYFTTQQTT (配列番号149)
QLSGYYHTGQYSETFFTTQQTT (配列番号150)
QQSGFYHTGQYSETFFTTQQTT (配列番号151)
QQSGFYHTGQYSETFYTTQQTT (配列番号152)
QQSGYYHTGQYSETYYTTQQTT (配列番号153)
DRYLAIVHAVFALRART (配列番号154)
TM4変異体:
TTFGTTTSTVTWGQAVQAAQPEFIF (配列番号155)
TTFGTTTSTTTWGQAVQAAQPEFIF (配列番号156)
TTYGTTTSTTTWGQAVQAAQPEFIF (配列番号157)
TTYGTTTSTTTWGQAVQAAQPEFTF (配列番号158)
TTYGTTTSTTTWGQATQAAQPEFIF (配列番号159)
TTFGTTTSTTTWGQATQAAQPEFIY (配列番号160)
TTYGTTTSTTTWGQATQAAQPEFIY (配列番号161)
TTYGTTTSTTTWGQATQAAQPEYTY (配列番号162)
YETEELFEETLCSALYPEDTVYSWRHFHTLRM (配列番号163)
TM5変異体:
TIFCQVQPQQTMATCYTGTT (配列番号164)
TIFCQTQPQQVMATCYTGTT (配列番号165)
TIFCQTQPQQTMATCYTGIT (配列番号166)
TIFCQTQPQQTMATCYTGTI (配列番号167)
TTFCQVQPQQVMATCYTGTT (配列番号168)
TIYCQVQPQQVMATCYTGTT (配列番号169)
TIFCQTQPQQTMATCYTGTT (配列番号170)
TTYCQTQPQQTMATCYTGTT (配列番号171)
KTLLRCPSKKKYKAIR (配列番号172)
TM6変異体:
QTYTTMATYYTYWTPYNTATQQSSY (配列番号173)
QSILFGNDCERSKHLDL (配列番号174)
TM7変異体:
VMQVTEVTAYSHCCMNPVTYAFTG (配列番号175)
VMQVTEVTAYSHCCMNPTTYAYVG (配列番号176)
VMLTTEVTAYSHCCMNPTTYAFTG (配列番号177)
VMQVTETTAYSHCCMNPVTYAYTG (配列番号178)
TMQVTETIAYSHCCMNPTTYAFTG (配列番号179)
TMQVTETTAYSHCCMNPTTYAFVG (配列番号180)
VMQTTETIAYSHCCMNPTTYAYTG (配列番号181)
TMQTTETTAYSHCCMNPTTYAYTG (配列番号182)
ERFRKYLRHFFHRHLLMHLGRYIPFLPSEKLERTSSVSPSTAEPELSIVF (配列番号183)
MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAA (配列番号186)
TM1変異体:
RLQPPQYSQTFTFGFTGNMQVTQTQINC (配列番号187)
RLQPPQYSQTFTFGYTGNMQVTQTQINC (配列番号188)
RQQPPQYSQTFTFGFTGNMQTTQTQINC (配列番号189)
RQQPPQYSQTFTYGFTGNMQTTQTQINC (配列番号190)
RQQPPQYSQTYTFGFTGNMQTTQTQINC (配列番号191)
RQQPPQYSQTFTFGYTGNMQTTQTQINC (配列番号192)
RQQPPQYSQTYTFGYTGNMQTTQTQINC (配列番号193)
RQQPPQYSQTYTYGYTGNMQTTQTQTNC (配列番号194)
KRLKSMTDIY (配列番号195)
TM2変異体:
LQNQAISDQFFQQTVPFWAHY (配列番号196)
LQNQAISDQFFQQTTPFWAHY (配列番号197)
LQNQAISDQFFQQTTPYWAHY (配列番号198)
LQNQAISDQFYQQTTPYWAHY (配列番号199)
LQNQAISDQYFQQTTPYWAHY (配列番号200)
LQNQATSDQFFQQTTPYWAHY (配列番号201)
LQNQAISDQYYQQTTPYWAHY (配列番号202)
QQNQATSDQYYQQTTPYWAHY (配列番号203)
AAAQWDFGNTMCQ (配列番号204)
TM3変異体:
QQTGQYFTGYYSGTYYTTQQTT (配列番号205)
QQTGQYYTGYYSGTYYTTQQTT (配列番号206)
DRYLAVVHAVFALKART (配列番号207)
TM4変異体:
TTYGTTTSTTTWTTATYASQPGTTY (配列番号208)
TRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLKI (配列番号209)
TM5変異体:
VIQGQVQPQQVMVTCYSGIQ (配列番号210)
VIQGQVQPQQVMTTCYSGIQ (配列番号211)
VIQGQVQPQQTMTTCYSGIQ (配列番号212)
VTQGQVQPQQTMVTCYSGTQ (配列番号213)
TIQGQVQPQQVMTTCYSGTQ (配列番号214)
TIQGQVQPQQTMVTCYSGTQ (配列番号215)
TTQGQVQPQQVMTTCYSGTQ (配列番号216)
TTQGQTQPQQTMTTCYSGTQ (配列番号217)
KTLLRCRNEKKRHRAVR (配列番号218)
TM6変異体:
QTFTTMTTYYQFWAPYNIVQQLNTF (配列番号219)
QTFTTMTTYYQFWAPYNTVQQLNTF (配列番号220)
QTFTTMTTYYQYWAPYNTVQQLNTF (配列番号221)
QTFTTMTTYYQYWAPYNTVQQQNTF (配列番号222)
QTYTTMTTYYQYWAPYNTVQQLNTF (配列番号223)
QTFTTMTTYYQYWAPYNTTQQLNTF (配列番号224)
QTYTTMTTYYQYWAPYNTVQQQNTF (配列番号225)
QTYTTMTTYYQYWAPYNTTQQQNTY (配列番号225)
QEFFGLNNCSSSNRLDQ (配列番号226)
TM7変異体:
AMQVTETQGMTHCCINPIIYAFVG (配列番号227)
AMQVTETLGMTHCCTNPIIYAFTG (配列番号228)
AMQVTETQGMTHCCINPTIYAYVG (配列番号229)
AMQTTETQGMTHCCINPITYAFTG (配列番号230)
AMQTTETQGMTHCCINPTIYAFTG (配列番号231)
AMQVTETQGMTHCCTNPTIYAYVG (配列番号232)
AMQTTETQGMTHCCINPTTYAYVG (配列番号233)
AMQTTETQGMTHCCTNPTTYAYTG (配列番号234)
EKFRNYLLVFFQKHIAKRFCKCCSIFQQEAPERASSVYTRSTGEQEISVGL (配列番号235)
実施例1の方法をCXCケモカイン受容体タイプ3イソ型2のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFの全てまたは実質的に全てをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(配列番号324、上側の線)に整列させた以下の配列(配列番号325、下側の線)を得る。
MVLEVSDHQVLNDAEVAALLENFSSSYDYGENESDSCCTSPPCPQDFSLNFDR (配列番号235)
TM1変異体:
AFLPALYSQQFQQGQQGNGAVAATQLS (配列番号236)
AFQPALYSQQFQQGQQGNGAVAAVQQS (配列番号237)
AFQPAQYSQQFLQGQQGNGAVAATQQS (配列番号238)
AYQPALYSLQYQQGQQGNGATAAVQQS (配列番号239)
AYQPALYSQLFQQGQQGNGATAATQQS (配列番号240)
AFQPALYSLQYQQGQQGNGATAATQQS (配列番号241)
AYQPAQYSLQYQQGQQGNGATAAVQQS (配列番号242)
AYQPAQYSQQYQQGQQGNGATAATQQS (配列番号243)
RRTALSSTD (配列番号244)
TM2変異体:
TFLQHLAVADTQQVQTLPQWA (配列番号245)
TFLQHQAVADTQLVQTQPQWA (配列番号246)
TFQQHLAVADTQQVQTQPQWA (配列番号247)
TYLQHQAVADTQQVQTQPQWA (配列番号248)
TYQLHQAVADTQQVQTQPQWA (配列番号249)
TYQQHLAVADTQQVQTQPQWA (配列番号250)
TYQQHQAVADTQQVQTQPQWA (配列番号251)
TYQQHQATADTQQTQTQPQWA (配列番号252)
VDAAVQWVFGSGLCK (配列番号253)
TM3変異体:
TAGAQYNTNFYAGAQQQACISF (配列番号254)
TAGAQYNTNFYAGAQLQACTSF (配列番号255)
TAGAQYNTNFYAGAQQLACTSF (配列番号256)
TAGAQFNTNYYAGAQQQACISF (配列番号257)
TAGAQYNTNYYAGAQQQACISF (配列番号258)
TAGAQYNTNYYAGAQLQACTSF (配列番号259)
TAGAQYNTNYYAGAQQLACTSF (配列番号260)
TAGAQYNTNYYAGAQQQACTSY (配列番号261)
DRYLNIVHATQLYRRGPPARVT (配列番号262)
TM4変異体:
LTCQAVWGQCQQFAQPDFIF (配列番号263)
QTCQAVWGQCQQFAQPDFIF (配列番号264)
QTCQATWGQCQQFAQPDFIF (配列番号265)
QTCQATWGQCQQYAQPDFIF (配列番号266)
QTCQATWGQCQQFAQPDFTF (配列番号267)
QTCQATWGQCQQFAQPDYIF (配列番号268)
QTCQATWGQCQQYAQPDYIF (配列番号269)
QTCQATWGQCQQYAQPDYTY (配列番号270)
LSAHHDERLNATHCQYNFPQVGR (配列番号271)
TM5変異体:
TAQRTQQQTAGYQQPQQTMAY (配列番号272)
CYAHILAVLLVSRGQRRLRAMR (配列番号273)
TM6変異体:
QVTTTTVAFAQCWTPYHQVVQV (配列番号274)
QVTTTTVAFAQCWTPYHQTVQV (配列番号275)
QVTTTTTAFAQCWTPYHQTVQV (配列番号276)
QVTTTTTAYAQCWTPYHQTVQV (配列番号277)
QVTTTTTAFAQCWTPYHQTTQV (配列番号278)
QTTTTTVAFAQCWTPYHQTTQV (配列番号279)
QVTTTTTAYAQCWTPYHQTTQV (配列番号280)
QTTTTTTAYAQCWTPYHQTTQT (配列番号281)
DILMDLGALARNCGRESRVDV (配列番号282)
TM7変異体:
AKSVTSGQGYMHCCLNPLQYAFV (配列番号283)
AKSVTSGQGYMHCCLNPQLYAFT (配列番号284)
AKSVTSGQGYMHCCLNPLQYAFT (配列番号285)
AKSTTSGQGYMHCCLNPQQYAFV (配列番号286)
AKSTTSGQGYMHCCQNPLQYAFV (配列番号287)
AKSTTSGQGYMHCCQNPQLYAFV (配列番号288)
AKSTTSGQGYMHCCQNPLQYAFT (配列番号289)
AKSTTSGQGYMHCCQNPQQYAYT (配列番号290)
GVKFRERMWMLLLRLGCPNQRGLQRQPSSSRRDSSWSETSEASYSGL (配列番号291)
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFのそれぞれをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号294)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号295)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFの全てまたは実質的に全てをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号296)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号297)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFの全てまたは実質的に全てをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号298)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号299)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFの全てまたは実質的に全てをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号300)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号301)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFの全てまたは実質的に全てをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号302)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号303)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFの全てまたは実質的に全てをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号304)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号305)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFのそれぞれをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号306)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号307)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFの全てまたは実質的に全てをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号308)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号309)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFのそれぞれをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号310)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号311)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFの全てまたは実質的に全てをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号312)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号313)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFのそれぞれをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号314)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号315)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFのそれぞれをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号316)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号317)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFの全てまたは実質的に全てをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号318)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号319)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFの全てまたは実質的に全てをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号320)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号321)を得る。
実施例1を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸L、I、VおよびFのそれぞれをQ、TおよびYで(それぞれ)置換して、野生型(上側の線、配列番号322)に整列させた以下の配列(下側の線、配列番号323)を得る。
CD81はリンパ腫細胞増殖の制御において重要な役割を担う場合があり、16kDaのLeu-13タンパク質と相互作用して場合によりシグナル伝達に関与する複合体を形成する。CD81はHCVのウイルス受容体として機能する場合がある。
日常的に使用されるLB培地1リットル当たり約20mgの精製されたタンパク質であると推定される収率で、水溶性GPCR CXCR4を大腸菌において産生した。推定される産生コストは1ミリグラム当たり約$0.25である。この手法を使用してグラム量の水溶性GPCRを容易に得ることができ、次いでこれによりそれらの構造的決定を容易にすることができると有利である。
水溶性CXCR4-QTYをpETベクターにクローン化した。本発明らは最初に小規模の大腸菌培養研究を行って、産生されるCXCR4-QTYタンパク質(150mlの培養物)の位置を評価した。IPTGを用いて24℃で4時間誘導された細胞を培養した後、本発明らはこれらの細胞を回収および超音波処理し、14,637×g(12,000rmp)の遠心分離により2つの画分に分けた。次いで、本発明らは特異的抗rhoタグモノクローナル抗体のウエスタンブロット分析を使用してCXCR4-QTYタンパク質の位置を検出した。本発明らはCXCR4-QTYタンパク質が上澄み画分中にあり、タンパク質がペレット画分中にないことを観察し、従って、当該タンパク質が完全に水溶性であることが示唆された。
次いで、本発明らは別に150mlの培養を行い、約6mgの1D4モノクローナル抗体で精製されたCXCR4-QTYを得た。本発明らは、その収率を過小に推定したため(本発明らは驚くべき程に高い収率を予期していていなかった)、本発明らは、産生されたCXCR4-QTYを捕捉するために十分な親和性rho-1D4タグモノクローナル抗体ビーズを使用しなかった。従って、精製中に十分なビーズが添加されず、当該タンパク質が流出レーン中にあり、さらに洗い流されたことにより、有意な量のCXCR4-QTYタンパク質がビーズに結合しなかった。有意な損失にも関わらず、本発明らは、レーン8~10(溶離画分)から分かるように、150mlの培養物に対してなお約6mgを得ることができる。
ほとんどの場合、構造によりタンパク質における機能が決まる。従って、大腸菌で産生された精製されたCXCR4-QTYタンパク質が約50%のαヘリックスを有する典型的なαへリックス構造になお正確に折り畳まれているか否かを知ることは重要である。本発明らは円偏光二色性(CD)を用いて二次構造測定を行った。本発明らは、各種温度で精製されたCXCR4-QTYタンパク質のCDスペクトルを観察した。本発明らは、精製されたCXCR4-QTYタンパク質の熱安定性を測定した。本発明らは、精製されたCXCR4-QTYタンパク質が55℃まで比較的安定であり、当該タンパク質が部分的にのみ徐々に変性し、CDシグナル減少が約15%であることを観察した。55℃~65℃で、その変性は65℃に向かって増加し、65℃~75℃で変性転移が生じ、75℃で当該タンパク質はほぼ完全に変性した。
本発明らは、10種のGタンパク質共役受容体(GPCR)を選択して、Zhangらの「Water Soluble Membrane Proteins and Methods for the Preparation and Use Thereof(水溶性膜タンパク質およびその調製および使用方法)」という発明の名称の米国特許公開第2012/0252719A号(「Zhang」)に記載されているQTY方法を用いてその水溶性形態を設計した。あるいは、本明細書に記載されているタンパク質を選択することができる。
本発明らは無細胞タンパク質発現プラスミドベクターpIVex2.3dおよび大腸菌pET28aおよびpET-duet-1プラスミドベクターにおけるGPCRの天然およびQTY遺伝子の確認に成功した。
本発明らは、いくつかの天然およびQTYタンパク質を産生した。無細胞系において天然GPCRを産生した場合、界面活性剤Brij35が必要であり、界面活性剤を使用しない場合、当該タンパク質は産生されるとすぐに沈殿する。他方、本発明らは、界面活性剤の存在および非存在下でQTY変異体を試験した。界面活性剤を使用しない場合、無細胞系は可溶性タンパク質を産生した。
本発明らは、GPCR CCR5eの水溶性QTY変異体を得た。次いで本発明らは、Avivモデル410円偏光二色性装置を用いて二次構造分析を行い、GPCR QTY CCR5-e変異体が典型的なαヘリックス構造を有することを確認した。本発明らは、各種温度で実験を行ってCCR5e変異体のTmすなわち水溶性CCR5e変異体の熱安定性も決定した。これらの実験から、本発明らはCCR5e変異体のTmは約46℃であると決定した。このTmは結晶スクリーニング実験にとって良好である。
設計された水溶性QTY GPCRがそれらの生物学的機能をなお維持している、すなわちそれらの天然リガンドを確実に認識して結合するようにするために、本発明らは最初にELISA測定を使用して、水溶性CXCR4をその天然リガンドCCL12(SDF1aともいう)を用いて研究した。アッセイ濃度は50nM~10μMの範囲である。測定されたKdは約80nMである。天然膜結合CXCR4のSDF1aとのKdは約100nMである。そのため、水溶性CXCR4のKdは許容される範囲内である。より感受性の高いSPRを用いるさらなる実験または他の測定を行って、より正確なKdを生成してもよい。
(1)
Gタンパク質共役受容体(GPCR)の水溶性変異体を選択する手順を実行するためのコンピュータ実装方法であって、
分析のために前記GPCRの配列を入力する工程と、
前記GPCRの膜貫通(TM)ドメインαヘリックスセグメント(「TM領域」)内の複数の疎水性アミノ酸が置換されている前記GPCRの変異体を得る工程であって、
(a)前記疎水性アミノ酸は、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)およびフェニルアラニン(F)からなる群から選択され、
(b)前記ロイシン(L)はそれぞれ独立して、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換されており、
(c)前記イソロイシン(I)および前記バリン(V)はそれぞれ独立してトレオニン(T)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換されており、かつ
(d)前記フェニルアラニンはそれぞれチロシン(Y)で置換されている
ことを特徴とする工程と、その後に
前記変異体のためにαヘリックス二次構造結果を得て、前記変異体内のαヘリックス二次構造の維持を確認する工程と、
前記変異体のために膜貫通領域結果を得て前記変異体の水溶性を確認する工程と
を含み、それにより前記GPCRの水溶性変異体を選択することを特徴とする方法。
(2)
工程(3)を工程(4)の前、それと同時またはその後に行う、請求項(1)に記載の方法。
(3)
工程(2)において、前記GPCRの1つの同じTM領域内の前記複数の疎水性アミノ酸の1つのサブセットを置換して変異体候補ライブラリーの1種のメンバーを作製し、かつ前記複数の疎水性アミノ酸の1つ以上の異なるサブセットを置換して前記ライブラリーのさらなるメンバーを作製する、請求項(1)または(2)に記載の方法。
(4)
前記ライブラリー全てのメンバーを組み合わせスコアに基づいてランク付けする工程をさらに含み、前記組み合わせスコアは、前記αヘリックス二次構造予測結果および前記膜貫通領域予測結果の重み付けされた組み合わせである、請求項(3)に記載の方法。
(5)
ランク付け関数を用いて前記変異体をランク付けする工程をさらに含む、請求項(1)に記載の方法。
(6)
データプロセッサを用いて前記方法を行う工程をさらに含む、請求項(1)に記載の方法。
(7)
前記データプロセッサに接続されているメモリをさらに含む、請求項(6)に記載の方法。
(8)
前記ランク付け関数は二次構造成分および水溶性成分を含む、請求項(5)に記載の方法。
(9)
前記ランク付け関数は、前記二次構造成分および/または前記水溶性成分の重み付け値を含む、請求項(8)に記載の方法。
(10)
最も高い組み合わせスコアを有するN種のメンバーを選択して前記TM領域のための変異体候補の第1のライブラリーを形成する工程をさらに含み、ここで、Nは所定の整数(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上)である、請求項(4)に記載の方法。
(11)
前記GPCRの1、2、3、4、5または6つ全ての他のTM領域のための変異体候補の1つのライブラリーを作製する工程をさらに含む、請求項(10)に記載の方法。
(12)
前記GPCRの2つ以上のTM領域を前記変異体候補ライブラリー内の対応するTM領域で置換して組み合わせ変異体ライブラリーを作製する工程をさらに含む、請求項(11)に記載の方法。
(13)
前記ロイシンの実質的に全て(例えば全て)はグルタミンで置換される、請求項(1)~(12)のいずれか1項に記載の方法。
(14)
前記イソロイシンの実質的に全て(例えば全て)はトレオニンで置換される、請求項(1)~(13)のいずれか1項に記載の方法。
(15)
前記バリンの実質的に全て(例えば全て)はトレオニンで置換される、請求項(1)~(14)のいずれか1項に記載の方法。
(16)
前記フェニルアラニンの実質的に全て(例えば全て)はチロシンで置換される、請求項(1)~(15)のいずれか1項に記載の方法。
(17)
1つ以上(例えば、1、2または3つ)の前記ロイシンは置換されていない、請求項(1)~(16)のいずれか1項に記載の方法。
(18)
1つ以上(例えば、1、2または3つ)の前記イソロイシンは置換されていない、請求項(1)~(17)のいずれか1項に記載の方法。
(19)
1つ以上(例えば、1、2または3つ)の前記バリンは置換されていない、請求項(1)~(18)のいずれか1項に記載の方法。
(20)
1つ以上(例えば、1、2または3つ)の前記フェニルアラニンは置換されていない、請求項(1)~(19)のいずれか1項に記載の方法。
(21)
前記組み合わせ変異体を産生/発現させる工程をさらに含む、請求項(1)~(20)のいずれか1項に記載の方法。
(22)
前記組み合わせ変異体をリガンド結合について(例えば、酵母ツーハイブリッド法で)試験する工程をさらに含み、ここでは、GPCRと比較して実質的に同じリガンド結合を有するものを選択する、請求項(1)~(21)のいずれか1項に記載の方法。
(23)
前記組み合わせ変異体を前記GPCRの生物学的機能について試験する工程をさらに含み、ここでは、前記GPCRと比較して実質的に同じ生物学的機能を有するものを選択する、請求項(1)~(22)のいずれか1項に記載の方法。
(24)
前記組み合わせ変異体ライブラリーは約2百万未満のメンバーを含む、請求項(1)~(23)のいずれか1項に記載の方法。
(25)
前記GPCRの前記配列は前記GPCRのTM領域に関する情報を含む、請求項(1)~(24)のいずれか1項に記載の方法。
(26)
前記GPCRの前記配列はタンパク質構造データベース(例えば、PDB、UniProt)から得られる、請求項(1)~(25)のいずれか1項に記載の方法。
(27)
前記GPCRのTM領域を前記GPCRの前記配列に基づいて予測する、請求項(1)~(26)のいずれか1項に記載の方法。
(28)
前記GPCRのTM領域をTMHMM2.0(隠れマルコフモデルを用いる膜貫通予測)ソフトウェアモジュールを用いて予測する、請求項(27)に記載の方法。
(29)
前記TMHMM2.0ソフトウェアモジュールはピーク探索のために動的ベースラインを利用する、請求項(28)に記載の方法。
(30)
前記GPCRの各変異体のポリヌクレオチド配列を提供する工程をさらに含む、請求項(1)~(29)のいずれか1項に記載の方法。
(31)
前記ポリヌクレオチド配列は、宿主(例えば、大腸菌などの細菌、出芽酵母または分裂酵母などの酵母、Sf9細胞などの昆虫細胞、非ヒト哺乳類細胞またはヒト細胞)における発現のために最適化されたコドンである、請求項(30)に記載の方法。
(32)
本スクリプト化手順はVBAスクリプトを含む、請求項(1)~(31)のいずれか1項に記載の方法。
(33)
本スクリプト化手順は、Linux(登録商標)システム(例えば、Ubuntu 12.04 LTS)、Unix(登録商標)システム、Microsoft Windowsオペレーティングシステム、AndroidオペレーティングシステムまたはApple iOSオペレーティングシステムにより動作可能である、請求項(1)~(32)のいずれか1項に記載の方法。
(34)
GPCRの膜貫通(TM)ドメインαヘリックスセグメント(「TM領域」)内の複数の疎水性アミノ酸が置換されているGタンパク質共役受容体(GPCR)の水溶性変異体であって、
(a)前記疎水性アミノ酸は、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)およびフェニルアラニン(F)からなる群から選択され、
(b)前記ロイシン(L)はそれぞれ独立して、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換され、
(c)前記イソロイシン(I)および前記バリン(V)はそれぞれ独立してトレオニン(T)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換され、かつ
(d)前記フェニルアラニンはそれぞれチロシン(Y)で置換され、その後に
前記変異体の7つ全てのTM領域によりαヘリックスの二次構造が維持されており、かつ
予測される膜貫通領域が存在しない
ことを特徴とする水溶性変異体。
(35)
配列番号4~11、13~20、22~29、31~38、40~47、49~56および58~64からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項(34)に記載の水溶性変異体。
(36)
配列番号3、12、21、30、39、48および57からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列をさらに含む、請求項(35)に記載の水溶性変異体。
(37)
CXCR4リガンドに結合する、請求項(35)または(36)に記載の水溶性変異体。
(38)
配列番号69~76、78~85、87、89~96、98~105、107~114および116~123からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項(34)に記載の水溶性変異体。
(39)
配列番号68、77、86、88、97、106、115および124からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列をさらに含む、請求項(38)に記載の水溶性変異体。
(40)
CX3CR1リガンドに結合する、請求項(38)または(40)に記載の水溶性変異体。
(41)
配列番号128~135、137~144、146~153、155~162、164~171、173および175~182からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項(34)に記載の水溶性変異体。
(42)
配列番号127、136、145、154、163、172、174および183からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列をさらに含む、請求項(41)に記載の水溶性変異体。
(43)
CCR3リガンドに結合する、請求項(41)または(42)に記載の水溶性変異体。
(44)
配列番号187~194、196~203、205~206、208、210~217、219~225、227~234からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項(34)に記載の水溶性変異体。
(45)
配列番号186、195、204、207、209、218、226および235からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列をさらに含む、請求項(44)に記載の水溶性変異体。
(46)
CCR5リガンドに結合する、請求項(44)または(45)に記載の水溶性変異体。
(47)
配列番号236~243、245~252、254~261、263~270、272、274~281および283~290からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項(34)に記載の水溶性変異体。
(48)
配列番号235、244、253、262、271、273、282および291からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列をさらに含む、請求項(47)に記載の水溶性変異体。
(49)
CXCR3リガンドに結合する、請求項(47)または(48)に記載の水溶性変異体。
(50)
配列番号2、67、126、185、327、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323または325のいずれか1つに記載されている1つ以上の膜貫通ドメインを含む、請求項(34)に記載の水溶性変異体。
(51)
前記水溶性変異体は水溶性であり、かつ相同な天然膜貫通タンパク質のリガンドに結合する、請求項(50)に記載の水溶性変異体。
(52)
(a)タンパク質産生に適した条件下で増殖培地において細菌を培養する工程と、
(b)前記細菌の溶解物を画分に分けて可溶性画分および不溶性ペレット画分を生成する工程と、
(c)前記タンパク質を前記可溶性画分から単離する工程と
を含み、
(1)前記タンパク質は請求項29~46のいずれか1項に記載のGタンパク質共役受容体(GPCR)の変異体であり、
(2)前記タンパク質の収率は増殖培地の少なくとも20mg/L(例えば、30mg/L、40mg/L、50mg/Lまたはそれ以上)である
ことを特徴とする、細菌(例えば大腸菌)においてタンパク質を産生する方法。
(53)
前記細菌は大腸菌BL21であり、かつ前記増殖培地はLB媒体である、請求項(47)に記載の方法。
(54)
前記タンパク質は前記細菌内のプラスミドによってコードされる、請求項(47)または(48)に記載の方法。
(55)
前記タンパク質の発現は誘導プロモーターの制御下にある、請求項(47)~(49)のいずれか1項に記載の方法。
(56)
前記誘導プロモーターはIPTGによって誘導可能である、請求項(50)に記載の方法。
(57)
前記溶解物を超音波処理によって生成する、請求項(47)~(51)のいずれか1項に記載の方法。
(58)
前記溶解物を14,500×g以上で遠心分離して前記可溶性画分を生成する、請求項(47)~(52)のいずれか1項に記載の方法。
(59)
請求項(1)~(33)のいずれかに記載の方法を行うための一連の命令が記憶された非一時的コンピュータ可読媒体。
(60)
膜タンパク質の水溶性変異体を選択するように動作するデータ処理システムであって、アミノ酸の置換を実行するように動作するデータプロセッサを備え、二次構造成分および水溶性成分を含むランク付け関数によりタンパク質変異体をランク付けするシステム。
(61)
前記システムによる処理のための膜タンパク質のライブラリーをさらに含む、請求項(60)に記載のシステム。
(62)
置換プロセッサを実行するためのコード化された命令を記憶する前記データプロセッサに接続されたメモリをさらに備える、請求項(60)に記載のシステム。
(63)
請求項1に記載の方法の工程(a)、(b)、(c)および(d)に対して動作する、請求項(60)に記載のシステム。
(64)
前記二次構造成分に基づく重み付けされた組み合わせであるランク付け関数をさらに含む、請求項(60)に記載のシステム。
(65)
ネットワークを介して外部プログラムと通信する、請求項(60)に記載のシステム。
(66)
水溶性変異体を記憶するためのデータベースをさらに含む、請求項(60)に記載のシステム。
(67)
動的ベースライン処理を行うための命令をさらに含む、請求項(60)に記載のシステム。
(68)
方法のパラメータを選択するためのインタフェースをさらに含む、請求項(60)に記載のシステム。
(69)
請求項35~50に記載されている配列を入力する工程をさらに含む、請求項(60)に記載のシステム。
(70)
水溶性変異体を選択するための手順を実行するためのコンピュータ実装方法であって、
データ処理を行って分析のために膜タンパク質の配列を同定する工程と、
前記膜タンパク質の前記膜貫通(TM)ドメインαヘリックスセグメント(「TM領域」)の複数の疎水性アミノ酸が置換されている前記膜タンパク質の変異体を得る工程と
を含み、
当該データプロセッサは、
前記変異体のαヘリックスの二次構造結果を決定して前記変異体におけるαヘリックスの二次構造の維持を確認し、
前記変異体の膜貫通領域結果を決定して前記変異体の水溶性を確認し、かつ
前記膜タンパク質の水溶性変異体を選択する
ことを特徴とする方法。
(71)
前記置換は、
(a)疎水性アミノ酸をロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)およびフェニルアラニン(F)からなる群から選択すること、
(b)ロイシン(L)をそれぞれ独立してグルタミン(Q)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換すること、
(c)イソロイシン(I)および前記バリン(V)をそれぞれ独立してトレオニン(T)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換すること、および
(d)前記フェニルアラニンをそれぞれチロシン(Y)で置換すること
を含む、請求項(70)に記載の方法。
(72)
GPCRの1つの同じTM領域の前記複数の疎水性アミノ酸の1つのサブセットを置換して変異体候補ライブラリーの1種のメンバーを作製し、かつ前記複数の疎水性アミノ酸の1つ以上の異なるサブセットを置換して前記ライブラリーのさらなるメンバーを作製する、請求項(71)に記載の方法。
(73)
前記ライブラリー全てのメンバーを組み合わせスコアに基づいてランク付けする工程をさらに含み、前記組み合わせスコアは、前記αヘリックス二次構造予測結果および前記膜貫通領域予測結果の重み付けされた組み合わせである、請求項(70)に記載の方法。
(74)
ランク付け関数を用いて前記変異体をランク付けする工程をさらに含む、請求項(70)に記載の方法。
(75)
前記データプロセッサに接続されたメモリをさらに備える、請求項(70)に記載の方法。
(76)
前記ランク付け関数は二次構造成分および水溶性成分を含む、請求項(74)に記載の方法。
(77)
前記ランク付け関数は前記二次構造成分および/または前記水溶性成分の重み付け値を含む、請求項(76)に記載の方法。
(78)
最も高い組み合わせスコアを有するN種のメンバーを選択して前記TM領域のための変異体候補の第1のライブラリーを形成する工程をさらに含み、ここで、Nは所定の整数(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上)である、請求項(73)に記載の方法。
(79)
GPCRの1、2、3、4、5または6つ全ての他のTM領域のために変異体候補の1つのライブラリーを作製する工程をさらに含む、請求項(78)に記載の方法。
(80)
前記GPCRの2つ以上のTM領域を前記変異体候補ライブラリー内の対応するTM領域で置換して組み合わせ変異体ライブラリーを作製する工程をさらに含む、請求項(79)に記載の方法。
Claims (80)
- Gタンパク質共役受容体(GPCR)の水溶性変異体を選択する手順を実行するためのコンピュータ実装方法であって、
分析のために前記GPCRの配列を入力する工程と、
前記GPCRの膜貫通(TM)ドメインαヘリックスセグメント(「TM領域」)内の複数の疎水性アミノ酸が置換されている前記GPCRの変異体を得る工程であって、
(a)前記疎水性アミノ酸は、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)およびフェニルアラニン(F)からなる群から選択され、
(b)前記ロイシン(L)はそれぞれ独立して、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換されており、
(c)前記イソロイシン(I)および前記バリン(V)はそれぞれ独立してトレオニン(T)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換されており、かつ
(d)前記フェニルアラニンはそれぞれチロシン(Y)で置換されている
ことを特徴とする工程と、その後に
前記変異体のためにαヘリックス二次構造結果を得て、前記変異体内のαヘリックス二次構造の維持を確認する工程と、
前記変異体のために膜貫通領域結果を得て前記変異体の水溶性を確認する工程と
を含み、それにより前記GPCRの水溶性変異体を選択することを特徴とする方法。 - 工程(3)を工程(4)の前、それと同時またはその後に行う、請求項1に記載の方法。
- 工程(2)において、前記GPCRの1つの同じTM領域内の前記複数の疎水性アミノ酸の1つのサブセットを置換して変異体候補ライブラリーの1種のメンバーを作製し、かつ前記複数の疎水性アミノ酸の1つ以上の異なるサブセットを置換して前記ライブラリーのさらなるメンバーを作製する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ライブラリー全てのメンバーを組み合わせスコアに基づいてランク付けする工程をさらに含み、前記組み合わせスコアは、前記αヘリックス二次構造予測結果および前記膜貫通領域予測結果の重み付けされた組み合わせである、請求項3に記載の方法。
- ランク付け関数を用いて前記変異体をランク付けする工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- データプロセッサを用いて前記方法を行う工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記データプロセッサに接続されているメモリをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 前記ランク付け関数は二次構造成分および水溶性成分を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記ランク付け関数は、前記二次構造成分および/または前記水溶性成分の重み付け値を含む、請求項8に記載の方法。
- 最も高い組み合わせスコアを有するN種のメンバーを選択して前記TM領域のための変異体候補の第1のライブラリーを形成する工程をさらに含み、ここで、Nは所定の整数(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上)である、請求項4に記載の方法。
- 前記GPCRの1、2、3、4、5または6つ全ての他のTM領域のための変異体候補の1つのライブラリーを作製する工程をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記GPCRの2つ以上のTM領域を前記変異体候補ライブラリー内の対応するTM領域で置換して組み合わせ変異体ライブラリーを作製する工程をさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記ロイシンの実質的に全て(例えば全て)はグルタミンで置換される、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記イソロイシンの実質的に全て(例えば全て)はトレオニンで置換される、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記バリンの実質的に全て(例えば全て)はトレオニンで置換される、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記フェニルアラニンの実質的に全て(例えば全て)はチロシンで置換される、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上(例えば、1、2または3つ)の前記ロイシンは置換されていない、請求項1~16のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上(例えば、1、2または3つ)の前記イソロイシンは置換されていない、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上(例えば、1、2または3つ)の前記バリンは置換されていない、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上(例えば、1、2または3つ)の前記フェニルアラニンは置換されていない、請求項1~19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組み合わせ変異体を産生/発現させる工程をさらに含む、請求項1~20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組み合わせ変異体をリガンド結合について(例えば、酵母ツーハイブリッド法で)試験する工程をさらに含み、ここでは、GPCRと比較して実質的に同じリガンド結合を有するものを選択する、請求項1~21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組み合わせ変異体を前記GPCRの生物学的機能について試験する工程をさらに含み、ここでは、前記GPCRと比較して実質的に同じ生物学的機能を有するものを選択する、請求項1~22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組み合わせ変異体ライブラリーは約2百万未満のメンバーを含む、請求項1~23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記GPCRの前記配列は前記GPCRのTM領域に関する情報を含む、請求項1~24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記GPCRの前記配列はタンパク質構造データベース(例えば、PDB、UniProt)から得られる、請求項1~25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記GPCRのTM領域を前記GPCRの前記配列に基づいて予測する、請求項1~26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記GPCRのTM領域をTMHMM2.0(隠れマルコフモデルを用いる膜貫通予測)ソフトウェアモジュールを用いて予測する、請求項27に記載の方法。
- 前記TMHMM2.0ソフトウェアモジュールはピーク探索のために動的ベースラインを利用する、請求項28に記載の方法。
- 前記GPCRの各変異体のポリヌクレオチド配列を提供する工程をさらに含む、請求項1~29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド配列は、宿主(例えば、大腸菌などの細菌、出芽酵母または分裂酵母などの酵母、Sf9細胞などの昆虫細胞、非ヒト哺乳類細胞またはヒト細胞)における発現のために最適化されたコドンである、請求項30に記載の方法。
- 本スクリプト化手順はVBAスクリプトを含む、請求項1~31のいずれか1項に記載の方法。
- 本スクリプト化手順は、Linux(登録商標)システム(例えば、Ubuntu 12.04 LTS)、Unix(登録商標)システム、Microsoft Windowsオペレーティングシステム、AndroidオペレーティングシステムまたはApple iOSオペレーティングシステムにより動作可能である、請求項1~32のいずれか1項に記載の方法。
- GPCRの膜貫通(TM)ドメインαヘリックスセグメント(「TM領域」)内の複数の疎水性アミノ酸が置換されているGタンパク質共役受容体(GPCR)の水溶性変異体であって、
(a)前記疎水性アミノ酸は、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)およびフェニルアラニン(F)からなる群から選択され、
(b)前記ロイシン(L)はそれぞれ独立して、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換され、
(c)前記イソロイシン(I)および前記バリン(V)はそれぞれ独立してトレオニン(T)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換され、かつ
(d)前記フェニルアラニンはそれぞれチロシン(Y)で置換され、その後に
前記変異体の7つ全てのTM領域によりαヘリックスの二次構造が維持されており、かつ
予測される膜貫通領域が存在しない
ことを特徴とする水溶性変異体。 - 配列番号4~11、13~20、22~29、31~38、40~47、49~56および58~64からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項34に記載の水溶性変異体。
- 配列番号3、12、21、30、39、48および57からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列をさらに含む、請求項35に記載の水溶性変異体。
- CXCR4リガンドに結合する、請求項35または36に記載の水溶性変異体。
- 配列番号69~76、78~85、87、89~96、98~105、107~114および116~123からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項34に記載の水溶性変異体。
- 配列番号68、77、86、88、97、106、115および124からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列をさらに含む、請求項38に記載の水溶性変異体。
- CX3CR1リガンドに結合する、請求項38または40に記載の水溶性変異体。
- 配列番号128~135、137~144、146~153、155~162、164~171、173および175~182からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項34に記載の水溶性変異体。
- 配列番号127、136、145、154、163、172、174および183からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列をさらに含む、請求項41に記載の水溶性変異体。
- CCR3リガンドに結合する、請求項41または42に記載の水溶性変異体。
- 配列番号187~194、196~203、205~206、208、210~217、219~225、227~234からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項34に記載の水溶性変異体。
- 配列番号186、195、204、207、209、218、226および235からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列をさらに含む、請求項44に記載の水溶性変異体。
- CCR5リガンドに結合する、請求項44または45に記載の水溶性変異体。
- 配列番号236~243、245~252、254~261、263~270、272、274~281および283~290からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項34に記載の水溶性変異体。
- 配列番号235、244、253、262、271、273、282および291からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸配列をさらに含む、請求項47に記載の水溶性変異体。
- CXCR3リガンドに結合する、請求項47または48に記載の水溶性変異体。
- 配列番号2、67、126、185、327、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323または325のいずれか1つに記載されている1つ以上の膜貫通ドメインを含む、請求項34に記載の水溶性変異体。
- 前記水溶性変異体は水溶性であり、かつ相同な天然膜貫通タンパク質のリガンドに結合する、請求項50に記載の水溶性変異体。
- (a)タンパク質産生に適した条件下で増殖培地において細菌を培養する工程と、
(b)前記細菌の溶解物を画分に分けて可溶性画分および不溶性ペレット画分を生成する工程と、
(c)前記タンパク質を前記可溶性画分から単離する工程と
を含み、
(1)前記タンパク質は請求項29~46のいずれか1項に記載のGタンパク質共役受容体(GPCR)の変異体であり、
(2)前記タンパク質の収率は増殖培地の少なくとも20mg/L(例えば、30mg/L、40mg/L、50mg/Lまたはそれ以上)である
ことを特徴とする、細菌(例えば大腸菌)においてタンパク質を産生する方法。 - 前記細菌は大腸菌BL21であり、かつ前記増殖培地はLB媒体である、請求項47に記載の方法。
- 前記タンパク質は前記細菌内のプラスミドによってコードされる、請求項47または48に記載の方法。
- 前記タンパク質の発現は誘導プロモーターの制御下にある、請求項47~49のいずれか1項に記載の方法。
- 前記誘導プロモーターはIPTGによって誘導可能である、請求項50に記載の方法。
- 前記溶解物を超音波処理によって生成する、請求項47~51のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶解物を14,500×g以上で遠心分離して前記可溶性画分を生成する、請求項47~52のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1~33のいずれかに記載の方法を行うための一連の命令が記憶された非一時的コンピュータ可読媒体。
- 膜タンパク質の水溶性変異体を選択するように動作するデータ処理システムであって、アミノ酸の置換を実行するように動作するデータプロセッサを備え、二次構造成分および水溶性成分を含むランク付け関数によりタンパク質変異体をランク付けするシステム。
- 前記システムによる処理のための膜タンパク質のライブラリーをさらに含む、請求項60に記載のシステム。
- 置換プロセッサを実行するためのコード化された命令を記憶する前記データプロセッサに接続されたメモリをさらに備える、請求項60に記載のシステム。
- 請求項1に記載の方法の工程(a)、(b)、(c)および(d)に対して動作する、請求項60に記載のシステム。
- 前記二次構造成分に基づく重み付けされた組み合わせであるランク付け関数をさらに含む、請求項60に記載のシステム。
- ネットワークを介して外部プログラムと通信する、請求項60に記載のシステム。
- 水溶性変異体を記憶するためのデータベースをさらに含む、請求項60に記載のシステム。
- 動的ベースライン処理を行うための命令をさらに含む、請求項60に記載のシステム。
- 方法のパラメータを選択するためのインタフェースをさらに含む、請求項60に記載のシステム。
- 請求項35~50に記載されている配列を入力する工程をさらに含む、請求項60に記載のシステム。
- 水溶性変異体を選択するための手順を実行するためのコンピュータ実装方法であって、
データ処理を行って分析のために膜タンパク質の配列を同定する工程と、
前記膜タンパク質の前記膜貫通(TM)ドメインαヘリックスセグメント(「TM領域」)の複数の疎水性アミノ酸が置換されている前記膜タンパク質の変異体を得る工程と
を含み、
当該データプロセッサは、
前記変異体のαヘリックスの二次構造結果を決定して前記変異体におけるαヘリックスの二次構造の維持を確認し、
前記変異体の膜貫通領域結果を決定して前記変異体の水溶性を確認し、かつ
前記膜タンパク質の水溶性変異体を選択する
ことを特徴とする方法。 - 前記置換は、
(a)疎水性アミノ酸をロイシン(L)、イソロイシン(I)、バリン(V)およびフェニルアラニン(F)からなる群から選択すること、
(b)ロイシン(L)をそれぞれ独立してグルタミン(Q)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換すること、
(c)イソロイシン(I)および前記バリン(V)をそれぞれ独立してトレオニン(T)、アスパラギン(N)またはセリン(S)で置換すること、および
(d)前記フェニルアラニンをそれぞれチロシン(Y)で置換すること
を含む、請求項70に記載の方法。 - GPCRの1つの同じTM領域の前記複数の疎水性アミノ酸の1つのサブセットを置換して変異体候補ライブラリーの1種のメンバーを作製し、かつ前記複数の疎水性アミノ酸の1つ以上の異なるサブセットを置換して前記ライブラリーのさらなるメンバーを作製する、請求項71に記載の方法。
- 前記ライブラリー全てのメンバーを組み合わせスコアに基づいてランク付けする工程をさらに含み、前記組み合わせスコアは、前記αヘリックス二次構造予測結果および前記膜貫通領域予測結果の重み付けされた組み合わせである、請求項70に記載の方法。
- ランク付け関数を用いて前記変異体をランク付けする工程をさらに含む、請求項70に記載の方法。
- 前記データプロセッサに接続されたメモリをさらに備える、請求項70に記載の方法。
- 前記ランク付け関数は二次構造成分および水溶性成分を含む、請求項74に記載の方法。
- 前記ランク付け関数は前記二次構造成分および/または前記水溶性成分の重み付け値を含む、請求項76に記載の方法。
- 最も高い組み合わせスコアを有するN種のメンバーを選択して前記TM領域のための変異体候補の第1のライブラリーを形成する工程をさらに含み、ここで、Nは所定の整数(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上)である、請求項73に記載の方法。
- GPCRの1、2、3、4、5または6つ全ての他のTM領域のために変異体候補の1つのライブラリーを作製する工程をさらに含む、請求項78に記載の方法。
- 前記GPCRの2つ以上のTM領域を前記変異体候補ライブラリー内の対応するTM領域で置換して組み合わせ変異体ライブラリーを作製する工程をさらに含む、請求項79に記載の方法。
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