JP2022028645A - Ｃｄ３に結合する抗体 - Google Patents

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Abstract

【課題】インビトロ及びインビボの両方で十分に安定な、最適化された特性を有するＣＤ３抗体を提供する。【解決手段】ＣＤ３に結合する抗体であって、前記抗体が、特定の配列の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、別の特定の配列の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、さらに、当該抗体を産生するための方法、及び当該抗体を疾患の治療に使用する方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、全般的に、例えば、Ｔ細胞を活性化するための多重特異性抗体を含む、ＣＤ３に結合する抗体に関する。加えて、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、当該抗体を産生するための方法、及び当該抗体を疾患の治療に使用する方法に関する。
ＣＤ３（分化抗原群３）は、４つのサブユニット、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖からなるタンパク質複合体である。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体及びζ鎖と会合し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。
ＣＤ３は、薬剤標的として広範に調査されてきた。ＣＤ３を標的とするモノクローナル抗体は、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患又は移植拒絶反応の治療における免疫抑制治療として使用されてきた。ＣＤ３抗体ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）は、１９８５年にヒトでの臨床使用がこれまで認可された最初のモノクローナル抗体であった。
ＣＤ３抗体のより最新の適用は、一方でＣＤ３に結合し、他方で腫瘍細胞抗原に結合する二重特異性抗体の形態のものである。そのような抗体がその標的の両方に同時に結合することで、標的細胞とＴ細胞との間の一時的相互作用を強め、任意の細胞傷害性Ｔ細胞の活性化及びそれに続く標的細胞の溶解を引き起こす。
治療目的のために、抗体が実現すべき重要な要件は、インビトロ（薬剤の保管のため）及びインビボ（患者への投与後）の両方で十分に安定であることである。
アスパラギン脱アミド化のような改変は、組換え抗体について一般的な分解であり、インビトロ安定性及びインビボ生物学的機能の両方に影響する恐れがある。
抗体、特にＴ細胞を活性化するための二重特異性抗体の驚異的な治療可能性を考慮すると、最適化された特性を有するＣＤ３抗体が必要とされている。
本発明は、ＣＤ３に結合し、例えば、アスパラギン脱アミド化による分解に耐性であり、したがって、治療目的に必要な特に安定な多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を含む、抗体を提供する。提供される（多重特異性）抗体はさらに、良好な有効性及び生産可能性と、低毒性及び好ましい薬物動態特性とを兼ね備えている。
本明細書に示すように、本発明により提供される、ＣＤ３に結合する多重特異性抗体を含む抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定されるように、ｐＨ６、－８０°Ｃで２週間後の結合活性と比較して、ｐＨ７．４、３７°Ｃで２週間後にＣＤ３への結合活性を約９０％超維持する。
一態様では、本発明は、ＣＤ３に結合する抗体であって、当該抗体が、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体、を提供する。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む、及び／又は、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ３に結合する抗体であって、配列番号７のＶＨ配列及び配列番号１１のＶＬ配列を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体、を提供する。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。
一態様では、抗体は、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
一態様では、抗体は、第２の抗原結合ドメインと、任意選択的に、第２の抗原に結合する第３の抗原結合ドメインと、を含む。
一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び／又は、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換わっているＦａｂ分子である。
一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合されている。
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、のいずれか一方である。
一態様では、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、抗体は、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含み、（ｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、のいずれか一方であり、かつ、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、特に、ＩｇＧ１のＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を低下させる、及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
一態様では、第２の抗原は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原である。
一態様では、第２の抗原は、ＴＹＲＰ－１である。一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、配列番号１５のＨＣＤＲ１、配列番号１６のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１９のＬＣＤＲ１、配列番号２０のＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のＬＣＤＲ３を含むＶＬと、を含む。一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
一態様では、第２の抗原は、ＥＧＦＲｖＩＩＩである。一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、配列番号８５のＨＣＤＲ１、配列番号８６のＨＣＤＲ２、及び配列番号８７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号８９のＬＣＤＲ１、配列番号９０のＬＣＤＲ２、及び配列番号９１のＬＣＤＲ３を含むＶＬと、を含む。一態様では、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、配列番号８８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は、配列番号９２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明の抗体をコードする単離ポリヌクレオチドと、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞と、が提供される。
別の態様では、（ａ）抗体の発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程と、任意選択的に、（ｂ）抗体を回収する工程と、を含む、ＣＤ３に結合する抗体を産生する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって産生された、ＣＤ３に結合する抗体も包含する。
本発明は、本発明の抗体及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
本発明の抗体及び医薬組成物を使用する方法もまた本発明に包含される。一態様では、本発明は、医薬として使用するための、本発明による抗体又は医薬組成物を提供する。一態様では、疾患の治療に使用するための、本発明による抗体又は医薬組成物が提供される。具体的な態様では、疾患は、がんである。
また、医薬の製造における本発明の抗体又は医薬組成物の使用、疾患、特にがんの治療のための医薬の製造における本発明の抗体又は医薬組成物の使用も提供される。本発明はまた、個体において疾患を治療する方法であって、当該個体に有効量の本発明による抗体又は医薬組成物を投与することを含む、方法、を提供する。
本発明の（多重特異性）抗体の例示的な構造である。（図１Ａ、図１Ｄ）「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図である。（図１Ｂ、図１Ｅ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分及びＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｃ、図１Ｆ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｇ、図１Ｋ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分及びＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｈ、図１Ｌ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｉ、図１Ｍ）２個のＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｊ、図１Ｎ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分及びＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）２個のＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｏ、図１Ｓ）「Ｆａｂ－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｐ、図１Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－Ｆａｂ」分子の図である。（図１Ｑ、図１Ｕ）「（Ｆａｂ）２－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（図１Ｒ、図１Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－（Ｆａｂ）２」分子の図である。（図１Ｗ、図１Ｙ）「Ｆａｂ－（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図である。（図１Ｘ、図１Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２－Ｆａｂ」分子の図である。黒点：ヘテロ二量化を促進する、Ｆｃドメインにおける任意の改変。＋＋、－－：ＣＨ１及びＣＬドメインにおいて任意選択で導入される反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域との交換を含むものとして示されるが、特に、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷改変（ｃｈａｒｇｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が導入されていない態様では、これに代えて、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの交換を含んでいてもよい。 非ストレス条件下、４０°Ｃ、ｐＨ６で１４日後、又は３７°Ｃ、ｐＨ７．４で１４日後にＳＰＲで測定した、元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ及び最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔの組換えＣＤ３に対する相対結合活性である（ＩｇＧフォーマット）。 フローサイトメトリーで測定した、元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ及び最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に対する結合である（ＩｇＧフォーマット）。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に対する抗体結合は、蛍光標識された抗ヒトＦｃ特異的二次抗体を用いて検出された。 実施例３で使用されたＣＤ３活性化アッセイの概略図である。 元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ及び最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔによるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞活性化である（ＩｇＧフォーマット）。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞は、ＣＤ３ｏｒｉｇ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ若しくはＣＤ３ｏｐｔ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ、又は陰性対照としてのＣＤ３ｏｐｔ ＩｇＧ ｗｔの存在下、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ（ＣＨＯ－ＰＧＬＡＬＡ）細胞と共に共インキュベートされた。ＣＤ３活性化は、２４時間後に発光を測定することで定量化された。 実施例において調製されたＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）分子の概略図である。試験されたすべてのＴＣＢ抗体は、電荷改変（ＣＤ３バインダにおけるＶＨ／ＶＬ交換、標的抗原バインダにおける電荷改変、ＥＥ＝１４７Ｅ，２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ，１２４Ｋ）を有する「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ、「反転型」」として作製された。 非ストレス条件下、４０°Ｃ、ｐＨ６で１４日後、又は３７°Ｃ、ｐＨ７．４で１４日後にＳＰＲで測定した、元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ又は最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢの組換えＣＤ３に対する相対結合活性である。 非ストレス条件下、４０°Ｃ、ｐＨ６で１４日後、又は３７°Ｃ、ｐＨ７．４で１４日後にＳＰＲで測定した、元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ若しくは最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔ、又は対応するＴＹＲＰ１ ＩｇＧを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢの組換えＴＹＲＰ１に対する相対結合活性である。 フローサイトメトリーで測定した、元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ又は最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に対する結合である。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に対するＴＣＢ結合は、蛍光標識された抗ヒトＦｃ特異的二次抗体を用いて検出された。 元々のＣＤ３バインダ又は最適化ＣＤ３バインダを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞活性化である。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞レポーター細胞は、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ又はＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔの存在下、黒色腫細胞株Ｍ１５０５４３と共に共インキュベートした。ＴＣＢの存在下でのＣＤ３活性化は、２４時間後に発光を測定することで定量化された。 元々のＣＤ３バインダ又は最適化ＣＤ３バインダを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢによる腫瘍細胞殺傷及びＴ細胞活性化である。３名の異なる健康ドナー由来のＰＢＭＣによる、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔを用いた処理時の黒色腫細胞株Ｍ１５０５４３の殺傷（図１１Ａ～図１１Ｆ：ドナー１、図１１Ｇ～図１１Ｌ：ドナー２、図１１Ｍ～図１１Ｒ：ドナー３）は、２４時間後（図１１Ａ、図１１Ｇ、図１１Ｍ）及び４８時間後（図１１Ｂ、図１１Ｈ、図１１Ｎ）にＬＤＨ放出により決定された。同時に、ＰＢＭＣ内のＣＤ８ Ｔ細胞（図１１Ｅ、図１１Ｆ、図１１Ｋ、図１１Ｌ、図１１Ｑ、図１１Ｒ）及びＣＤ４ Ｔ細胞（図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｉ、図１１Ｊ、図１１Ｏ、図１１Ｐ）上でのＣＤ２５上方制御（図１１Ｃ、図１１Ｅ、図１１Ｉ、図１１Ｋ、図１１Ｏ、図１１Ｑ）及びＣＤ６９上方制御（図１１Ｄ、図１１Ｆ、図１１Ｊ、図１１Ｌ、図１１Ｐ、図１１Ｒ）は、４８時間後にＴ細胞活性化に対するマーカーとしてフローサイトメトリーにより測定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡの特異的結合である。ＥＧＦＲｗｔに対する交差反応性がない、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ抗体の特異的結合は、ＣＨＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ（図１２Ａ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ（図１２Ｂ）、及びＥＧＦＲｗｔ発現ＭＫＮ－４５（図１２Ｃ）についてフローサイトメトリーにより試験された。セツキシマブは、ＥＧＦＲｗｔ発現の陽性対照として含めた。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡによるＣＡＲ Ｊ活性化である。抗ＰＧＬＡＬＡ ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞は、陰性対照としてＥＧＦＲｖＩＩＩ発現ＤＫ－ＭＧ細胞及びＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ抗体又はＤＰ４７ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡと共に共インキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞の活性化は、２２時間後に発光を測定することで定量化された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ及び対応するＴＣＢのＥＧＦＲｖＩＩＩに対する結合である。ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡとしてのＥＧＦＲｖＩＩＩバインダ及びＴＣＢに転換されたＥＧＦＲｖＩＩＩバインダのＣＨＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞（図１４Ａ）及びＭＫＮ－４５細胞（図１４Ｂ）に対する特異的結合は、フローサイトメトリーにより測定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化である。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞の存在下、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢとのＣＤ３関与に対するマーカーとして決定された。ＤＰ４７ ＴＣＢは、陰性対照として含めた。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞溶解である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる特異的腫瘍細胞溶解の誘導は、単離直後のＰＢＭＣと、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞（図１６Ａ、図１６Ｂ）又はＥＧＦＲｗｔ陽性ＭＫＮ－４５細胞（図１６Ｃ、図１６Ｄ）のいずれかとの２４時間（図１６Ａ、図１６Ｃ）又は４８時間（図１６Ｂ、図１６Ｄ）の共培養において決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞活性化である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞活性化の誘導は、単離直後のＰＢＭＣと、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞（図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｅ、図１７Ｆ）又はＥＧＦＲｗｔ陽性ＭＫＮ－４５細胞（図１７Ｃ、図１７Ｄ、図１７Ｇ、図１７Ｈ）のいずれかとの共培養において、ＣＤ４ Ｔ細胞（図１７Ａ～図１７Ｄ）又はＣＤ８ Ｔ細胞（図１７Ｅ～図１７Ｈ）上の活性化マーカーＣＤ２５（図１７Ａ、図１７Ｃ、図１７Ｅ、図１７Ｇ）又はＣＤ６９（図１７Ｂ、図１７Ｄ、図１７Ｆ、図１７Ｈ）を使用して決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるサイトカイン放出である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＩＮＦγ（図１８Ａ、図１８Ｄ）、ＴＮＦα（図１８Ｂ、図１８Ｅ）、及びグランザイムＢ（図１８Ｃ、図１８Ｆ）の放出の誘導は、単離直後のＰＢＭＣと、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞（図１８Ａ～図１８Ｃ）又はＥＧＦＲｗｔ陽性ＭＫＮ－４５細胞（図１８Ｄ～図１８Ｆ）のいずれかとの共培養において決定された。 親和性成熟したＥＧＦＲｖＩＩＩ ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡの特異的結合である。親和性成熟したＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のＥＧＦＲｖＩＩＩに対する特異的結合は、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞（図１９Ａ）及びＥＧＦＲｗｔ陽性細胞株ＭＫＮ－４５（図１９Ｂ）上の親ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダと比較された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化である。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞（図２０Ａ）、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞（図２０Ｂ）、及びＭＫＮ－４５（図２０Ｃ）の存在下、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢとのＣＤ３関与に対するマーカーとして決定された。ＤＰ４７ ＴＣＢは、陰性対照として含めた。 非ストレス条件下、４０°Ｃ、ｐＨ６で１４日後、又は３７°Ｃ、ｐＨ７．４で１４日後にＳＰＲで測定した、元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ又は最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの組換えＣＤ３に対する相対結合活性である。 非ストレス条件下、４０°Ｃ、ｐＨ６で１４日後、又は３７°Ｃ、ｐＨ７．４で１４日後にＳＰＲで測定した、元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ又は最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの組換えＣＤ３に対する相対結合活性である。 フローサイトメトリーで測定した、元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ又は最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に対する結合である。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に対するＴＣＢ結合は、蛍光標識された抗ヒトＦｃ特異的二次抗体を用いて検出された。 フローサイトメトリーにより測定された、Ｐ０６３．０５６ ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダ又はＰ０５６．０２１ ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢのＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に対する結合である。Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に対するＴＣＢ結合は、蛍光標識された抗ヒトＦｃ特異的二次抗体を用いて検出された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞溶解及びＴ細胞活性化である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる特異的腫瘍細胞溶解（図２５Ａ、図２５Ｂ）及びＴ細胞活性化（図２５Ｃ、図２５Ｄ）の誘導は、単離直後のＰＢＭＣ及びＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞との共培養において、２４時間（図２５Ａ、図２５Ｃ）又は４８時間（図２５Ｂ、図２５Ｄ）の時点で決定された。ＤＰ４７ ＴＣＢは、陰性対照として含めた。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの２＋１フォーマット及び１＋１フォーマットを比較するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化である。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の存在下、２＋１反転フォーマット及び１＋１ ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌフォーマットのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢとのＣＤ３関与に対するマーカーとして決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの２＋１フォーマット及び１＋１フォーマットを比較する腫瘍細胞溶解及びＴ細胞活性化である。２＋１反転フォーマット及び１＋１ ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌフォーマットのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる特異的腫瘍細胞溶解（図２７Ａ、図２７Ｂ）及びＴ細胞活性化（図２７Ｃ、図２７Ｄ）の誘導は、単離直後のＰＢＭＣ及びＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞との共培養において、２４時間（図２７Ａ、図２７Ｃ）又は４８時間（図２７Ｂ、図２７Ｄ）の時点で決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞活性化及び増殖である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＣＤ４ Ｔ細胞（図２８Ａ、図２８Ｂ）及びＣＤ８ Ｔ細胞（図２８Ｃ、図２８Ｄ）のＴ細胞増殖（図２８Ａ、図２８Ｃ）及びＴ細胞活性化の誘導は、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩと健康なドナーから単離されたＰＢＭＣとの共培養において決定された。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞溶解、Ｔ細胞活性化、及びサイトカイン放出である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞溶解（図２９Ａ、図２９Ｂ）、Ｔ細胞活性化（図２９Ｃ、図２９Ｄ）、並びにＩＦＮγ及びＴＮＦα（図２９Ｅ、図２９Ｆ）の放出の誘導は、ＰＢＭＣとのＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の共培養において決定された。腫瘍細胞溶解は、処理の２４時間後及び４８時間後に測定され、Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出は、４８時間後に測定された。 ＴＹＲＰ－１ ＴＣＢによる腫瘍細胞溶解、Ｔ細胞活性化、及びサイトカイン放出である。ＴＹＲＰ－１ ＴＣＢによる腫瘍細胞溶解（図３０Ａ、図３０Ｂ）、Ｔ細胞活性化（図３０Ｃ、図３０Ｄ）、並びにＩＦＮγ及びＴＮＦα（図３０Ｅ、図３０Ｆ）の放出の誘導は、ＰＢＭＣとの患者由来黒色腫細胞株Ｍ１５０５４３の共培養において決定された。腫瘍細胞溶解は、処理の２４時間後及び４８時間後に測定され、Ｔ細胞活性化及びサイトカイン放出は、４８時間後に測定された。 ＴＹＲＰ－１ ＴＣＢのインビボ有効性である。ＩＧＲ－１ヒト黒色腫細胞株をヒト化ＮＳＧマウスに皮下注射し、黒色腫皮下異種移植片モデルにおける腫瘍増殖抑制を研究した。ビヒクル群と比較してＴＹＲＰ－１ ＴＣＢ群において顕著な腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ）が観察された（６８％ＴＧＩ、ｐ＝０．００５８＊）。 ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢのインビボ有効性である。Ｕ８７－ｈｕＥＧＦＲｖＩＩＩヒト膠芽腫細胞株をヒト化ＮＳＧマウスに皮下注射し、膠芽腫皮下異種移植片モデルにおける腫瘍増殖抑制を研究した。顕著な腫瘍制御がＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ群において観察され、すべてのマウスが完全寛解を達成した。
Ｉ．定義
用語は、以下に他の意味であると定義されていない限り、当該技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。
本明細書で使用される場合、抗原結合ドメインなどに関する用語「第１の」、「第２の」、及び「第３の」とは、それぞれの種類の部分が２つ以上存在する場合に、区別を簡便にするために使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、抗体の特定の順序又は配向を与えることを意図していない。
用語「抗ＣＤ３抗体」及び「ＣＤ３に結合する抗体」とは、抗体がＣＤ３の標的化において診断剤及び／又は治療薬剤として有用であるような充分な親和性を有して、ＣＤ３に結合可能である抗体を指す。一態様では、無関係な非ＣＤ３タンパク質に対する抗ＣＤ３抗体の結合度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるように、ＣＤ３に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の態様では、ＣＤ３に結合する抗体は、≦１μＭ、≦５００ｎＭ、≦２００ｎＭ、又は≦１００ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）を有する。例えば、ＳＰＲにより測定して、抗体が１μＭ以下のＫＤを有する場合、抗体は、ＣＤ３に「特異的に結合する」と称する。特定の態様では、抗ＣＤ３抗体は、異なる種由来のＣＤ３の間で保存されているＣＤ３のエピトープに結合する。
用語「抗体」とは、本明細書では最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」とは、インタクト抗体が結合する抗原に結合する、インタクト抗体の一部分を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ）、単一ドメイン抗体、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」とは、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指す。すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一である、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体は除く。このようなバリアントは、一般的に、少量存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾詞「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法、例えば、本明細書に記載のモノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法を含むが、これらに限定されない、多様な技法によって作製されてもよい。
「単離抗体」は、その天然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相のＨＰＬＣ、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）方法によって決定される場合、純度が９５％より高くなるまで、又は９９％より高くなるまで精製される。抗体精製の試験方法の総説としては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。いくつかの態様では、本発明により提供される抗体は、単離抗体である。
用語「キメラ」抗体とは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる源又は種に由来する抗体を指す。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、非ヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのＣＤＲ、及びヒト抗体の可変ドメインに対応する全て又はほぼ全てのＦＲにおける、ほぼ全ての少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインを含む。このような可変ドメインは、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。いくつかの態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生された抗体、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。特定の態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えば、マウス、ラット、又はウサギに由来する。特定の態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体断片もまた、本発明のヒト抗体又はヒト抗体断片であると考えられる。
用語「抗原結合ドメイン」とは、ある抗原の一部又は全てに結合し、ある抗原の一部又は全てに対して相補的な領域を含む抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。好ましい態様では、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、を含む。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖又は抗体軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に、同様の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と、を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインで十分な場合がある。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。可変領域配列と組み合わせて本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって記載されるナンバリングシステムを指す。
本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されるＫａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」又は「Ｋａｂａｔナンバリング」と呼ばれる。特定的には、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ、ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）の６４７－６６０ページを参照）を、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１－７２３ページを参照）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用し、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング」又は「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング」と言及することによってさらに明確にしている。
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）のそれぞれを意味する。一般に、抗体は、６つのＣＤＲを含み、３つがＶＨ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）にあり、３つがＶＬ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）にある。本明細書における例示的なＣＤＲには、
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））が挙げられる。
別途指示されない限り、ＣＤＲは、上記のＫａｂａｔらに従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の順序で現れる。すなわち、ＦＲ１－ＨＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）－ＦＲ４である。
本明細書で別途指示されない限り、可変ドメイン中のＣＤＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）に従って本明細書においてナンバリングされる。
本明細書の目的のための「アクセプター（ａｃｃｅｐｔｏｒ）ヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよいか、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様では、アミノ酸変更の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して、配列が同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３に記載のようなサブグループである。
用語「免疫グロブリン分子」とは、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）と、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）と、を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）と、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインと、を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのさらなるサブタイプに分けられてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続する、２つのＦａｂ分子とＦｃドメインとから実質的になる。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５種類の主要なクラスがあり、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「Ｆａｂ分子」とは、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、免疫グロブリンの軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬドメイン及びＣＬドメインと、からなるタンパク質を指す。
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）とは、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインが交換された（すなわち、互いに置き換えられた）Ｆａｂ分子を意味する。すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）で構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）で構成されるペプチド鎖と、を含む。明確性のために、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
これとは対照的に、「従来の」Ｆａｂ分子は、その天然のフォーマットでのＦａｂ分子を意味し、すなわち、重鎖可変ドメイン及び定常ドメインで構成される重鎖（ＶＨ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメインで構成される軽鎖（ＶＬ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、を含む。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。本用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域と可変Ｆｃ領域とを含む。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、完全長重鎖を含んでいてもよい、又は完全長重鎖の開裂したバリアントを含んでいてもよい。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよい、又は存在していなくてもよい。Ｆｃ領域（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に示されていない場合には、本明細書では、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチドを含まずに示される。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書で明記したＦｃ領域（サブユニット）を含む重鎖は、さらなるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書で明記したＦｃ領域（サブユニット）を含む重鎖は、さらなるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上も参照）に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインの「サブユニット」とは、二量体のＦｃドメインを形成する２つのポリペプチドの１つ、すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定した自己会合が可能なポリペプチドを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「融合した」が意味するのは、構成要素（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合によって直接的に又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介してのいずれかにより連結されていることである。
「多重特異性」という用語は、抗体が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。多重特異性抗体は、例えば、二重特異性抗体であり得る。典型的には、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の態様では、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体は、２つの抗原決定基、特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
「価数」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合分子内の特定数の抗原結合部位の存在を示す。この場合、「抗原に対する一価の結合」という用語は、抗原結合分子内の抗原に特異的な１つの（かつ１つを超えない）抗原結合部位の存在を示す。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を与える抗原結合分子の部位、すなわち、１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。ネイティブ免疫グロブリン分子は、典型的には、２つの抗原結合部位を含み、Ｆａｂ分子は、典型的には、１つの抗原結合部位を有する。
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」又は「抗原」という用語は、抗原結合ドメイン－抗原複合体を形成する、抗原結合ドメインが結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の罹患した細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に認めることができる。好ましい態様では、抗原は、ヒトタンパク質である。
「ＣＤ３」は、別途指示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＣＤ３を指す。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＣＤ３、及び細胞におけるプロセシングから生じるＣＤ３の任意の形態を包含する。この用語は、ＣＤ３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又はアレルバリアントも包含する。一態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、配列番号１１２（シグナルペプチドを有しない）に示される。また、ＵｎｉＰｒｏｔ（www.uniprot.org）寄託番号Ｐ０７７６６（バージョン１８９）、又はＮＣＢＩ（www.ncbi.nlm.nih.gov/）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１を参照されたい。別の態様では、ＣＤ３は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εである。カニクイザルＣＤ３εのアミノ酸配列は、配列番号１１３（シグナルペプチドを有しない）に示される。また、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１を参照されたい。ある特定の態様では、本発明の抗体は、異なる種由来のＣＤ３抗原、特にヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３の中に保存されているＣＤ３のエピトープに結合する。好ましい態様では、抗体は、ヒトＣＤ３に結合する。
「標的細胞抗原」とは、本明細書で使用される場合、標的細胞、例えば、がん細胞又は（「腫瘍細胞抗原」の場合）腫瘍間質細胞などの腫瘍内の細胞の表面に提示された抗原決定基を意味する。好ましくは、標的細胞抗原は、ＣＤ３ではない、及び／又は異なる細胞上に発現されたＣＤ３以外である。好ましい態様では、標的細胞抗原は、ＴＹＲＰ－１、特にヒトＴＹＲＰ－１である。別の態様では、標的細胞抗原は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、特にヒトＥＧＦＲｖＩＩＩである。
「ＴＹＲＰ１」又は「ＴＹＲＰ－１」は、メラニン合成において関与する酵素であるチロシン関連タンパク質１の略である。当初はｇｐ７５とも称したＴＹＲＰ１の成熟形態は、７５ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である。ヒトＴＹＲＰ１の配列は、配列番号１１４（シグナルペプチドを有しない）に示される。また、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ１７６４３（バージョン１８５）を参照されたい。「ＴＹＲＰ１」とは、本明細書で用いる場合、別途指示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＴＹＲＰ１を指す。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＴＹＲＰ１、及び細胞におけるプロセシングから生じるＴＹＲＰ１の任意の形態を包含する。この用語は、ＴＹＲＰ１の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又はアレルバリアントも包含する。一態様では、ＴＹＲＰ１は、ヒトＴＹＲＰ１である。
「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、上皮内成長因子受容体バリアントＩＩＩ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｖａｒｉａｎｔ ＩＩＩ）の略であり、ジャンクションにおけるグリシン置換を有する２６７個のアミノ酸の欠失をもたらす、エクソン２～７のインフレームの欠失によって形成された、ＥＧＦＲの変異体である。ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩの配列は、配列番号１１５（シグナルペプチドを有しない）に示される。野生型ヒトＥＧＦＲの配列は、配列番号１１６（シグナルペプチドを有しない）に示される。また、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ００５３３（バージョン２５８）を参照されたい。「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」とは、本明細書で用いる場合、別途指示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＥＧＦＲｖＩＩＩを指す。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＥＧＦＲｖＩＩＩ（ただし野生型ＥＧＦＲではない）、及び細胞におけるプロセシングから生じるＥＧＦＲｖＩＩＩ（例えば、シグナルペプチドを有しないＥＧＦＲｖＩＩＩ）の任意の形態を包含する。一態様では、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩである。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば、抗原）との間の、合計の非共有性相互作用の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する特異的結合親和性を指す。分子Ｘの、その相手Ｙに対する親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に説明するものを含め、当技術分野で公知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較して、１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）において１つ又は複数の変化を有し、かかる改変によって抗原に対する抗体の親和性を改善する、抗体を指す。
「結合の低減」、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減は、例えば、ＳＰＲによって測定される場合、それぞれの相互作用についての親和性の低下を指す。明確性のために、この用語は、親和性がゼロまで低下する（又は分析方法の検出限界未満になる）こと、すなわち、相互作用が完全に失われることも含む。逆に、「結合上昇」は、個々の相互作用に対する結合親和性における上昇を指す。
本明細書で使用する場合の「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１つ又は複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を判定するのに適したアッセイは、当技術分野で公知であり、本明細書で説明されている。
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変」は、ホモ二量体を形成するためのＦｃドメインサブユニットを含むペプチドと同一のポリペプチドとの会合を減らすか又は防ぐ、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。会合を促進する改変は、本明細書で使用される場合、好ましくは、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）それぞれに対し、別個の改変を含み、改変は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように、互いに相補性である。例えば、会合を促進する改変は、それぞれ立体的又は静電的に望ましい会合を行うように、Ｆｃドメインサブユニットの片方又は両方の構造又は電荷を変えてもよい。したがって、（ヘテロ）二量化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、それぞれのサブユニットに融合するさらなる構成要素（例えば、抗原結合ドメイン）が同じではないという意味で、同一ではなくてもよい。いくつかの態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。好ましい態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれにおける別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指し、抗体のアイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる。Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる会合の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による、抗体で被覆された標的細胞の溶解を引き起こす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、一般的にＦｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を介して、特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＣの低減」という用語は、所与の時間で、標的細胞の周囲の培地中、所与の抗体濃度で溶解する標的細胞の数の減少、上に定義されるＡＤＣＣの機構によって、及び／又は所与の時間に、ＡＤＣＣの機構によって所与の数の標的細胞の溶解を達成するのに必要な、標的細胞の周囲にある培地中の抗体濃度の増加として定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な産生、精製、配合及び保存方法を用い（当業者には既知）、同じ種類の宿主細胞によって作られるが、操作されない同じ抗体が媒介するＡＤＣＣに対するものである。例えば、そのＦｃドメインを含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下である、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換は、Ｆｃドメイン中にこのアミノ酸置換を含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「操作する、操作される、操作すること」という用語は、天然に存在するか、又は組換えポリペプチド又はこれらの断片のペプチド骨格の任意の操作又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作することは、アミノ酸配列の改変、グリコシル化パターンの改変、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、及びこれらのアプローチの組合せを含む。
「アミノ酸変異」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び改変を包含することを意図している。置換、欠失、挿入及び改変の任意の組み合わせは、最終構築物が、所望の特徴、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増加を有する限り、最終構築物に到達するように行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸の欠失及び挿入を含む。好ましいアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特徴を変える目的のために、非保存的アミノ酸置換（すなわち、１つのアミノ酸を、構造特性及び／又は化学特性が異なる別のアミノ酸と置き換えること）が特に好ましい。アミノ酸置換として、天然に存在しないアミノ酸による置き換え、又は２０種類の標準的なアミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えが挙げられる。アミノ酸変異は、当技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用いて生じさせることができる。遺伝学的手法には、特定部位の変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを挙げることができる。遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変える方法、例えば、化学修飾も有用な場合があることが想定される。同じアミノ酸変異を示すために、本明細書で様々な名称を使用してもよい。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示すことができる。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性率（％）」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性率を達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントさせるのに適切なパラメータを決定することができる。あるいは、同一性率の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７の下に登録されており、かつ、国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。
しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用するか、又はその後にＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，ＰＮＡＳ ８５（１９８８）：２４４４－２４４８）、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ （“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ” Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６（１９９６）：２２７－２５８）、及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ． ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６（１９９７）２４－３６）により作成され、www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml又はwww.ebi.ac.uk/Tools/sss/fastaから公開されて利用可能である。これに代えて、fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgiでアクセス可能な公的なサーバーを使用して、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用い、ローカルではなくグローバルのアラインメントを確実に行い、配列を比較することができる。アミノ酸同一性率は、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。それぞれのヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、当該塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例としては、改変されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子はまた、例えば、宿主又は患者において、インビトロ及び／又はインビボで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして好適なＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。このようなＤＮＡベクター（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡベクター（例えば、ｍＲＮＡ）は、改変されていなくてもよく、又は改変されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、インビボで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３：８１５－８１７又は欧州特許第２１０１８２３（Ｂ１）号を参照されたい）。
「単離された」核酸分子とは、核酸分子がその自然環境の構成要素から分離されたものを指す。単離核酸分子には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が、染色体外に存在するか、又はその本来の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が含まれる。
「抗体をコードする単離ポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド分子を指し、単一のベクター又は別個のベクターにおいて、このようなポリヌクレオチド分子（複数可）が宿主細胞の１つ又は複数の位置に存在するこのようなポリヌクレオチド分子（複数可）を含む。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。本用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は、相互に置き換え可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、初代の形質転換された細胞、及び初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよいが、変異を含有していてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか又は選択されるのと同じ機能又は生物活性を有する変異体の子孫は、本発明に含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一態様では、本発明の宿主細胞は、真核細胞、特に哺乳動物細胞である。一態様では、宿主細胞は、ヒト身体中の細胞ではない。
「医薬組成物」又は「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される有効成分の生物活性が有効になるような形態であり、組成物が投与されるであろう対象にとって許容できないほど有毒である追加の成分を何ら含有しない、調製物を指す。
「医薬的に許容される担体」は、有効成分以外の医薬組成物又は製剤中の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。医薬的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、又は防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「治療（ｔｒｅａｔ）する」又は「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）すること」）は、治療される個体において疾患の本来の経過を変える試行における臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の態様では、個体又は対象は、ヒトである。
薬剤、例えば、医薬組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び所要期間で有効な量を指す。
用語「パッケージ添付文書」とは、そのような治療製品の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症、及び／又はその使用に関する警告についての情報を含有する、治療製品の商業用パッケージに通例含まれる指示書を指すために使用される。
ＩＩ．組成物及び方法
本発明は、ＣＤ３及び第２の抗原に結合する多重特異性抗体を含む、ＣＤ３に結合する抗体を提供する。抗体は、例えば、有効性及び安全性、薬物動態、並びに再現性に関連する治療用途に有益な他の特性と組み合わせて、優れた安定性を示す。本発明の抗体は、例えば、がんなどの疾患の治療に有用である。
Ａ．抗ＣＤ３抗体
一態様では、本発明は、ＣＤ３に結合する抗体を提供する。一態様では、ＣＤ３に結合する単離抗体が提供される。一態様では、本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体を提供する。ある特定の態様では、抗ＣＤ３抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定されるように、ｐＨ６、－８０°Ｃで２週間後の結合活性と比較して、ｐＨ７．４、３７°Ｃで２週間後にＣＤ３への結合活性を約９０％超維持する。
一態様では、本発明は、ＣＤ３に結合する抗体であって、当該抗体が、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体、を提供する。
一態様では、抗体は、ヒト化抗体である。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（すなわち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬは、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７の重鎖可変領域配列の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比較して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体は、ＣＤ３に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号７のアミノ酸配列において、置換されている、挿入されている、及び／又は欠失している。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。任意選択で、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、ＶＬは、配列番号１１の軽鎖可変領域配列の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比較して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体は、ＣＤ３に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号１１のアミノ酸配列において、置換されている、挿入されている、及び／又は欠失している。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。任意選択で、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ３に結合する抗体であって、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体、を提供する。
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ３に結合する抗体であって、配列番号７のＶＨ配列及び配列番号１１のＶＬ配列を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体、を提供する。
別の態様では、本発明は、ＣＤ３に結合する抗体であって、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨ及び配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬを含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体、を提供する。
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号１１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のあるフレームワークと、を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のあるフレームワークと、を含む。一態様では、ＶＨは、配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７のＶＨのフレームワーク配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のあるフレームワークと、を含む。
一態様では、ＶＬは、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１１のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のあるフレームワークと、を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１１のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９５％の配列同一性のあるフレームワークと、を含む。一態様では、ＶＬは、配列番号１１のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１１のＶＬのフレームワーク配列に対して少なくとも９８％の配列同一性のあるフレームワークと、を含む。
一態様では、本発明は、ＣＤ３に結合する抗体であって、上記に提供した態様のいずれかのＶＨ配列及び上記に提供した態様のいずれかのＶＬ配列を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体、を提供する。
一態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む。一態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むＩｇＧクラス免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号１２０及び１２１（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号１２２（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。一態様では、抗体は、配列番号１２０又は配列番号１２１のアミノ酸配列、特に配列番号１２０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。一態様では、抗体は、配列番号１２２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載されたようなＦｃドメインにおけるアミノ酸変異を含んでもよい。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域を含む。一態様では、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特に、ヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２０又は配列番号１２１のアミノ酸配列、特に配列番号１２０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷改変」の状態で本明細書に記載するアミノ酸変異を含んでいてもよい、及び／又は、クロスオーバーＦａｂ分子での場合、１つ又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、「電荷改変」状態で本明細書に記載のアミノ酸変異を含んでもよい。
一態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。
一態様では、抗体は、ＩｇＧ、特に、ＩｇＧ１抗体である。一態様では、抗体は、完全長抗体である。
別の態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片、特に、Ｆａｂ分子である。別の態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。好ましい態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の、可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換わっているＦａｂ分子である（すなわち、第１の抗原結合ドメインは、クロスオーバーＦａｂ分子である）。
さらなる態様では、上記態様のうちのいずれかによる抗体は、以下のセクションＩＩ．Ａ．１．～８．に記載される特徴のうちのいずれかを単独で、又は組み合わせて、組み込んでもよい。
好ましい態様では、抗体は、Ｆｃドメイン、特に、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、より好ましくは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインは、第１及び第２のサブユニットからなり、Ｆｃドメインバリアントに関連して本明細書の以下に記載される特徴のうちのいずれかを単独で、又は組み合わせて、組み込んでもよい（セクションＩＩ．Ａ．８．）。
別の好ましい態様では、抗体は、第２の抗原結合ドメインと、任意選択で、第２の抗原に結合する第３の抗原結合ドメインを含む（すなわち、抗体は、本明細書の以下にさらに記載される多重特異性抗体である（セクションＩＩ．Ａ．７．）。
１．抗体断片
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。
一態様では、抗体断片は、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆａｂ’－ＳＨ分子、又はＦ（ａｂ’）２分子であり、特に、本明細書に記載のＦａｂ分子である。「Ｆａｂ’分子」は、抗体ヒンジ領域から１つ又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における残基の付加だけ、Ｆａｂ分子とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を保持するＦａｂ’分子である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ分子）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２分子が得られる。
別の態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。「ダイアボディ」は、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）にも記載される。
さらなる態様では、抗体断片は、一本鎖Ｆａｂ分子である。「一本鎖Ｆａｂ分子」又は「ｓｃＦａｂ」とは、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及びリンカーからなるポリペプチドであり、当該抗体ドメイン及び当該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向において、以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有する。特に、当該リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。当該一本鎖Ｆａｂ分子は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。加えて、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるだろう。
別の態様では、抗体断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、リンカーにより接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは、１０～２５個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、かつ、溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、又はこの逆のいずれかで、接続させることができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたく、また、国際公開第９３／１６１８５号並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号を参照されたい。
別の態様では、抗体断片は、単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。ある特定の態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６（Ｂ１）号を参照されたい）。
抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌）による組換え産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
２．ヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減する一方で、親非ヒト抗体の特異性及び親和性は保持するようにヒト化される。通常、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来する１つ又は複数の可変ドメインを含み、ＦＲ（又はその一部）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。いくつかの態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
ヒト化された抗体及びその作製方法については、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）でレビューされ、さらに以下に記載されている：Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトの記述）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（リサーフェシングについての記述）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０ （２００５）（ＦＲシャッフルについての記述）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフルの「ガイド付き選択アプローチの記述）。
ヒト化に用い得るヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を用いて選択したフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）；重鎖又は軽鎖可変領域の特定の亜型のヒト抗体コンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）；並びにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照されたい）。
３．グリコシル化バリアント
ある特定の態様では、本明細書において提供する抗体を変えて、抗体のグリコシル化の程度を増減させる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。
抗体がＦｃ領域を含む場合、抗体に付着しているオリゴ糖を変化させてもよい。哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、典型的には、一般にＮ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様では、本発明の抗体中のオリゴ糖の改変は、ある特定の改良された特性を有する抗体バリアントを作成するために行われてもよい。
一態様では、非フコシル化オリゴ糖、すなわち、Ｆｃ領域へのフコース結合（直接又は間接）が欠落した、オリゴ糖構造を有する抗体バリアントを提供する。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分岐オリゴ糖構造の幹に第１のＧｌｃＮＡｃが結合したフコース残基を欠く、Ｎ結合オリゴ糖である。一態様では、ネイティブ抗体又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した抗体バリアントを提供する。例えば、非フコシル化オリゴ糖の比率は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又はさらに約１００％（すなわち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定した、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の位置約２９７（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）に位置するアスパラギン残基を指す。しかし、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における小規模な配列変異に起因して、位置２９７から約±３アミノ酸の上流又は下流、すなわち、位置２９４～３００の間に位置してもよい。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した、このような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合、及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照されたい。
フコシル化が低下した抗体を産生可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化で欠失したＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及び、ノックアウト細胞株、例えば、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）、又は、ＧＤＰ－フコース合成若しくはトランスポータータンパク質の活性が低下した若しくは消滅した細胞（例えば、米国特許出願公開第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号を参照されたい）が挙げられる。
さらなる態様では、抗体バリアントは、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されているバイセクトオリゴ糖と共に提供される。そのような抗体バリアントは、上述のとおり、低下したフコシル化、及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有してもよい。そのような抗体バリアントの例は、例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，１７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号；同第２００４／０６５５４０号、同第２００３／０１１８７８号に記載されている。
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号、同第１９９８／５８９６４号、及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
４．システイン操作抗体バリアント
ある特定の態様では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）を作成することが望ましい場合がある。好ましい態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれにより抗体のアクセス可能な部位に位置付けられ、それを使用して、薬物部分又はリンカー－薬物部分などの他の部分に抗体を複合体化して、本明細書にさらに記載されるように、免疫複合体を作製することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、同第８，３０，９３０号、同第７，８５５，２７５号、同第９，０００，１３０号、又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載されているとおりに作製することができる。
５．抗体誘導体
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な、さらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに改変されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分としては、限定するものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。このポリマーは、任意の分子量を有していてもよい、分岐していてもよい、又は分岐していなくてもよい。抗体に結合したポリマーの数は異なってもよく、１つより多くのポリマーが結合している場合、それらのポリマーは、同じ分子又は異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善される抗体の具体的な特性又は機能、抗体の誘導体が規定の状態下である療法で使用されるかなどを含むが、これらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。
６．免疫複合体
本発明はまた、細胞傷害性薬剤、化学療法剤若しくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位体などの１つ又は複数の治療薬剤と複合された本明細書における抗ＣＤ３抗体を含む、免疫複合体を提供する。
一態様では、免疫複合体は、抗体が前述の治療薬剤の１つ又は複数に複合体化された、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）である。抗体は典型的には、リンカーを使用して、治療薬剤の１つ又は複数に接続される。治療薬剤及び薬物及びリンカーの例を含む、ＡＤＣ技術の総説は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に記載されている。
別の態様では、免疫複合体は、酵素活性毒素又はこれらの断片に複合体化された本発明の抗体を含み、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌からのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリのタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、並びにトリコテセンが挙げられるが、これらに限定されない。
別の態様では、免疫複合体は、放射性原子に複合体化されて放射性複合体を形成する、本発明の本明細書に記載される抗体を含む。放射性複合体の産生には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性複合体が検出のために使用される場合、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、Ｔｃ９９ｍ若しくはＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（別名、磁気共鳴画像法、ＭＲＩ）のための、Ｉ１２３、Ｉ１３１、Ｉｎ１１１、Ｆ１９、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１７、ガドリニウム、マンガン、若しくは鉄などのスピン標識を含んでもよい。
抗体及び細胞傷害性薬剤の複合体は、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、及びビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などの多様な二官能性タンパク質結合剤を使用して作製され得る。 例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素－１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に複合化するための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内において細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
本明細書の免疫複合体又はＡＤＣは、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、並びに（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されているＳＶＳＢ（（４－ビニルスルホン）安息香酸スクシンイミジル）を含むが、これらに限定されない架橋剤試薬で調製されるそのような複合体を明示的に企図するが、これらに限定されない。
７．多重特異性抗体
ある特定の態様において、本明細書に提供される抗体は多重特異性抗体、特に、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原決定基（例えば、２つの異なるタンパク質又は同じタンパク質における２つの異なるエピトープ）に結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の態様において、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。ある特定の態様において、結合特異性の一方はＣＤ３へのものであり、他方は任意の他の抗原へのものである。ある特定の態様において、多重特異性抗体は、ＣＤ３の２つ（またはそれ以上）の異なるエピトープに結合し得る。多重特異性（例えば、二重特異性）抗体は、細胞傷害性薬剤又は細胞を、ＣＤ３を発現する細胞に局在化するために使用することもできる。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製する技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照されたい）及び「ノブ・イン・ホール（ｋｏｎｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号及びＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、また、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照されたい）；２つ以上の抗体若しくは断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）；ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）及び国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照されたい）；軽鎖の誤対合問題を回避するための一般的な軽鎖技術の使用（例えば、国際公開第９８／５０４３１号を参照されたい）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）；並びに例えばＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異性抗体の調製によって作製することができる。
例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号及び国際公開第２００８／０２４７１５号を参照されたい）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ３に、同様に別の異なる抗原に、又はＣＤ３の２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照されたい）。
多重特異性抗体は、同じ抗原特異性の１つ又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称形態により、すなわち、ＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照されたい）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号を参照されたい）又は完全なＦａｂアーム（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照されたい、またＳｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１及びＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０も参照されたい）を交換すること（いわゆる、「クロスマブ（ＣｒｏｓｓＭａｂ）」技術）によっても提供され得る。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメイン界面に導入して、正しいＦａｂ対合を方向づけることによっても操作され得る。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照されたい。
多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当該技術分野に知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照されたい）。
本明細書に同様に含まれる特定のタイプの多重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞の表面抗原と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化不変構成要素、例えば、Ｔ細胞を再標的化して標的細胞を殺すためのＣＤ３に、同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。したがって、好ましい態様において、本明細書に提供される抗体は、結合特異性のうちの一方がＣＤ３へのものであり、他方が標的細胞抗原へのものである多重特異性抗体、特に二重特異性抗体である。
この目的に有用であり得る二重特異性抗体フォーマットの例には、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されている、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ））分子（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、国際公開第２００５／０６１５４７号、国際公開第２００７／０４２２６１号及び国際公開第２００８／１１９５６７号、Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）を参照されたい）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，２９９－３０５（１９９６））及びその誘導体、例えば、タンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくが、さらなる安定化のためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、並びに全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子、いわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６，４５８－４６７（２０１０）に概説されている）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に含まれる特定のＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、国際公開第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
本発明の多重特異性抗体の好ましい態様が以下に記載される。
一態様において、本発明は、本明細書に記載されているＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含み、かつ第２の抗原に結合する第２及び任意選択で第３の抗原結合ドメインを含む、ＣＤ３に結合する抗体を提供する。
本発明の好ましい態様によると、抗体に含まれる抗原結合ドメインはＦａｂ分子である（すなわち、重鎖及び軽鎖から構成される抗原結合ドメインであり、それぞれ可変ドメイン及び定常ドメインを含む）。一態様において、第１、第２及び／又は存在する場合は第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。一態様において、前記Ｆａｂ分子は、ヒトのものである。好ましい態様において、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。なお別の態様において、前記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
好ましくは、抗原結合ドメインの少なくとも１つは、クロスオーバーＦａｂ分子である。このような改変は、異なるＦａｂ分子の重鎖と軽鎖の誤対合を低減し、それによって、組換え産生における本発明の（多重特異性）抗体の収率及び純度を改善する。本発明の（多重特異性）抗体に有用な好ましいクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＬ及びＶＨ）が交換されている。しかし、このドメイン交換によっても、（多重特異性）抗体の調製は、誤対合重鎖及び軽鎖の間の、いわゆる、ベンス・ジョーンズ型相互作用に起因して、ある特定の副生成物を含むことがある（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１１８７－１１１９１を参照されたい）。異なるＦａｂ分子の重鎖及び軽鎖の誤対合をさらに減少し、これにより望ましい（多重特異性）抗体の純度及び収率を増加するため、反対の電荷を有する荷電アミノ酸を、第１の抗原（ＣＤ３）に結合するＦａｂ分子又は第２の抗原（例えば、標的細胞抗原、例えばＴＹＲＰ－１若しくはＥＧＦＲｖＩＩＩ）に結合するＦａｂ分子のいずれかのＣＨ１及びＣＬドメインにおける特定のアミノ酸位置に導入することができ、本明細書にさらに記載される。電荷改変は、（多重特異性）抗体に含まれる従来のＦａｂ分子（例えば、図１Ａ～Ｃ、Ｇ～Ｊに示されている）、又は（多重特異性）抗体に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（例えば、図１Ｄ～Ｆ、Ｋ～Ｎに示されている）のいずれかにおいて行われる（しかし、両方ではない）。好ましい態様において、電荷改変は、（多重特異性）抗体に含まれる（好ましい態様では、第２の抗原、例えば標的細胞抗原、例えばＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する）従来のＦａｂ分子において行われる。
本発明による好ましい態様において、（多重特異性）抗体は、第１の抗原（すなわち、ＣＤ３）及び第２の抗原（例えば、標的抗原、例えば、ＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩ）に同時に結合することができる。一態様において、（多重特異性）抗体は、ＣＤ３及び標的細胞抗原に同時に結合することにより、Ｔ細胞及び標的細胞を架橋することができる。さらにより好ましい態様において、そのような同時結合は、標的細胞、特に標的細胞抗原（例えば、ＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩ）発現腫瘍細胞の溶解を生じる。一態様において、そのような同時結合はＴ細胞の活性化を生じる。別の態様において、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性及び活性化マーカーの発現の群から選択されるＴリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を生じる。一態様において、標的細胞抗原への同時結合を伴わないＣＤ３への（多重特異性）抗体の結合は、Ｔ細胞活性化を生じない。
一態様において、（多重特異性）抗体は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞に向け直すことができる。好ましい態様において、この向け直しは、標的細胞によるＭＨＣ媒介ペプチド抗原提示及び／又はＴ細胞の特異性と無関係である。
好ましくは、本発明のいずれかの態様によるＴ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。一部の態様において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞である。
ａ）第１の抗原結合ドメイン
本発明の（多重特異性）抗体は、ＣＤ３に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（第１の抗原結合ドメイン）を含む。好ましい態様において、ＣＤ３はヒトＣＤ３（配列番号１１２）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号１１３）、とりわけヒトＣＤ３である。一態様において、第１の抗原結合ドメインは、ヒト及びカニクイザルＣＤ３と交差反応性がある（すなわち、それらに特異的に結合する）。一部の態様において、ＣＤ３はＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３イプシロン）である。
好ましい態様において、（多重特異性）抗体は、ＣＤ３に結合する１つを超えない抗原結合ドメインを含む。一態様において、（多重特異性）抗体は、ＣＤ３に対する一価の結合を提供する。
一態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。好ましい態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
好ましい態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換されている／置き換わっているＦａｂ分子である。そのような態様において、第２の抗原（例えば、標的細胞抗原、例えば、ＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩ）に結合する抗原結合ドメインは、好ましくは従来のＦａｂ分子である。（多重特異性）抗体に含まれる第２の抗原に結合する１を超える抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子がある態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
代替的な態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。そのような態様において、第２の抗原（例えば、標的細胞抗原、例えば、ＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩ）に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換されている／置き換わっているＦａｂ分子である。（多重特異性）抗体に含まれるＣＤ３に結合する１つを超える抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子がある態様において、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインは、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
好ましい態様において、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨは、互いに置き換わっているＦａｂ分子である（すなわち、そのような態様によると、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。１つのそのような態様において、第２の（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
一態様において、ＣＤ３に結合する１つを超えない抗原結合ドメインは、（多重特異性）抗体に存在する（すなわち、この抗体はＣＤ３に対する一価の結合を提供する）。
ｂ）第２（及び第３）の抗原結合ドメイン
ある特定の態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、第２の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。第２の抗原は、好ましくはＣＤ３でなく、すなわち、ＣＤ３と異なっている。一態様において、第２の抗原は、ＣＤ３と異なる細胞に発現する（例えば、Ｔ細胞以外の細胞に発現する）抗原である。一態様では、第２の抗原は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原である。具体的な態様において、第２の抗原はＴＹＲＰ－１である。別の具体的な態様において、第２の抗原はＥＧＦＲｖＩＩＩである。第２の抗原結合ドメインは、（多重特異性）抗体を標的部位へ、例えば、第２の抗原を発現する特定のタイプの腫瘍細胞へ向かわせることができる。
一態様において、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。好ましい態様において、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
ある特定の態様において、（多重特異性）抗体は、第２の抗原に結合する２つの抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。好ましいそのような態様において、これらの抗原結合ドメインのそれぞれは、同じ抗原決定基に結合する。さらにより好ましい態様において、これらの抗原結合ドメインの全ては、同一であり、すなわち、同じ分子フォーマット（例えば、従来又はクロスオーバーＦａｂ分子）を有し、（存在する場合）本明細書に記載されるＣＨ１及びＣＬドメインに同じアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。一態様において、（多重特異性）抗体は、第２の抗原に結合する２つを超えない抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。
好ましい態様において、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。そのような態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換されている／置き換わっているＦａｂ分子である。
代替的な態様において、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換されている／置き換わっているＦａｂ分子である。そのような態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域を含む。一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号１２０及び１２１（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号１２２（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１２０又は配列番号１２１のアミノ酸配列、特に配列番号１２０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷改変」の状態で本明細書に記載するアミノ酸変異を含んでいてもよい、及び／又は、クロスオーバーＦａｂ分子での場合、１つ又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。一部の態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、「電荷改変」状態において本明細書に記載されるアミノ酸変異を含んでいてもよい。
ＴＹＲＰ－１
好ましい態様において、第２の抗原はＴＹＲＰ－１、特にヒトＴＹＲＰ－１（配列番号１１４）である。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６のＨＣＤＲ２及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２０のＬＣＤＲ２及び配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗体である（に由来する）。一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（すなわち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＴＹＲＰ－１に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号１８のアミノ酸配列において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。一態様において、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。任意選択で、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列に少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＴＹＲＰ－１に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号２２のアミノ酸配列において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。一態様において、ＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。任意選択で、ＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは配列番号１８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１８の配列を含むＶＨ及び配列番号２２の配列を含むＶＬを含む。
さらなる態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１８のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。
別の態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨ及び配列番号２２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬを含む。
さらなる態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号１８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列、並びに配列番号２２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号１８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号１８のＶＨのフレームワーク配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のあるフレームワークを含む。一態様において、ＶＨは、配列番号１８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号１８のＶＨのフレームワーク配列に少なくとも９５％の配列同一性のあるフレームワークを含む。別の態様において、ＶＨは、配列番号１８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号１８のＶＨのフレームワーク配列に少なくとも９８％の配列同一性のあるフレームワークを含む。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号２２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号２２のＶＬのフレームワーク配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のあるフレームワークを含む。一態様において、ＶＬは、配列番号２２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号２２のＶＬのフレームワーク配列に少なくとも９５％の配列同一性のあるフレームワークを含む。別の態様において、ＶＬは、配列番号２２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号２２のＶＬのフレームワーク配列に少なくとも９８％の配列同一性のあるフレームワークを含む。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ
好ましい態様において、第２の抗原はＥＧＦＲｖＩＩＩ、特にヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号１１５）である。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号８５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８６のＨＣＤＲ２及び配列番号８７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９０のＬＣＤＲ２及び配列番号９１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗体である（に由来する）。一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（すなわち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号８８の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号８８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号８８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号８８のアミノ酸配列に少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含む抗体はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号８８のアミノ酸配列において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。一態様において、ＶＨは、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。任意選択で、ＶＨは、配列番号８８のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号９２の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号９２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号９２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号９２のアミノ酸配列に少なくとも約９８％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含む抗体はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する能力を保持する。ある特定の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号９２のアミノ酸配列において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。一態様において、ＶＬは、配列番号９２のアミノ酸配列を含む。任意選択で、ＶＬは、配列番号９２のアミノ酸配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号８８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号９２のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは配列番号８８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号９２のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番８８の配列を含むＶＨ及び配列番号９２の配列を含むＶＬを含む。
さらなる態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号８８のＶＨ配列及び配列番号９２のＶＬ配列を含む。
別の態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号８８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨ及び配列番号９２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬを含む。
さらなる態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号８８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列、並びに配列番号９２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号８８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号８８のＶＨのフレームワーク配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のあるフレームワークを含む。一態様において、ＶＨは、配列番号８８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号８８のＶＨのフレームワーク配列に少なくとも９５％の配列同一性のあるフレームワークを含む。別の態様において、ＶＨは、配列番号８８のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号８８のＶＨのフレームワーク配列に少なくとも９８％の配列同一性のあるフレームワークを含む。
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号９２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号９２のＶＬのフレームワーク配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のあるフレームワークを含む。一態様において、ＶＬは、配列番号９２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号９２のＶＬのフレームワーク配列に少なくとも９５％の配列同一性のあるフレームワークを含む。別の態様において、ＶＬは、配列番号９２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号９２のＶＬのフレームワーク配列に少なくとも９８％の配列同一性のあるフレームワークを含む。
代替的な態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに関して、このセクション上記に提供された態様のいずれかのＶＨ配列、及びＥＧＦＲｖＩＩＩに関して、このセクション上記に提供された態様のいずれかのＶＬの配列を含むが、配列番号８５（ＨＣＤＲ１）、８６（ＨＣＤＲ２）、８７（ＨＣＤＲ３）、８８（ＶＨ）、８９（ＬＣＤＲ１）、９０（ＬＣＤＲ２）、９１（ＬＣＤＲ３）及び９２（ＶＬ）の代わりに、以下の配列（列の順）に基づいている。
Figure 2022028645000001
一態様において、第２（及び存在する場合、第３）抗原結合ドメインは、このセクション上記に提供された態様のいずれかのＶＨ配列及びこのセクション上記に提供された態様のいずれかのＶＬ配列を含む。
抗ＴＹＲＰ－１及び抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体
本発明は、また、ＴＹＲＰ－１に関して、このセクション上記に提供された態様のいずれかのＶＨ配列、及びＴＹＲＰ－１に関して、このセクション上記に提供された態様のいずれかのＶＬ配列を含む、ＴＹＲＰ－１に結合する抗体（例えば、配列番号１５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６のＨＣＤＲ２及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２０のＬＣＤＲ２及び配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＴＹＲＰ－１に結合する抗体、又は配列番号１８の配列を含むＶＨ及び配列番号２２の配列を含むＶＬを含む、ＴＹＲＰ－１に結合する抗体）も提供する。
本発明は、また、ＥＧＦＲｖＩＩＩに関して、このセクション上記に提供された態様のいずれかのＶＨ配列、及びＥＧＦＲｖＩＩＩに関して、このセクション上記に提供された態様のいずれかのＶＬ配列を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗体（例えば、配列番号８５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８６のＨＣＤＲ２及び配列番号８７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９０のＬＣＤＲ２及び配列番号９１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗体、又は配列番号８８の配列を含むＶＨ及び配列番号９２の配列を含むＶＬを含む、ＴＹＲＰ－１に結合する抗体）も提供する。
さらなる態様において、上記の態様のいずれかによるＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗体は、ＣＤ３に結合する抗体に関して記載された特徴のいずれかを、単特で又は組み合わせて組み込むことができる（抗ＣＤ３抗体、例えば、結合配列を明確に特定しない限り）。
ｃ）電荷改変
本発明の（多重特異性）抗体は、それに含まれるＦａｂ分子に、１つ（又は２つより多い抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合には、さらに多くの）結合アーム中にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベース多重特異性抗体の産生により生じ得る、適合しない重鎖との軽鎖の誤対合（ベンス・ジョーンズ型副生成物）を低減するのに特に効率的であるアミノ酸置換を含んでいてもよい（その全体が本明細書に参照により組み込まれるＰＣＴ出願国際公開第２０１５／１５０４４７号、特にその中の実施例も参照されたい）。所望ではない副生成物、特に、結合アームの１つの中にＶＨ／ＶＬドメインの交換を有する多重特異性抗体に生じるベンス・ジョーンズ型副生成物と比較した所望の（多重特異性）抗体の比を、ＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することによって改善することができる（本明細書において、「電荷改変」と呼ばれることがある）。
したがって、（多重特異性）抗体の第１及び第２の（及び存在する場合、第３の）抗原結合ドメインが両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合ドメインの１つ（特に、第１の抗原結合ドメイン）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、一部の態様では、
ｉ）第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸で置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、あるいは
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸で置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
（多重特異性）抗体は、ｉ）及びｉｉ）に記述されている改変を両方とも含むことはない。ＶＨ／ＶＬ交換を有する抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換えられていない（すなわち、交換されていないままである）。
より具体的な態様では、
ｉ）第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、あるいは
ｉｉ）第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
１つのこのような態様では、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
さらなる態様では、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
好ましい態様では、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
より好ましい態様では、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
さらにより好ましい態様では、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
好ましい態様において、上記の態様によるアミノ酸置換が、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１に行われる場合、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
あるいは、上記の態様によるアミノ酸置換は、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。好ましいこのような態様において、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
したがって、一態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
なお別の態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
別の態様では、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）により置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
好ましい態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、
（ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、この第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられており、かつ配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｆａｂ分子である、第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）第２の抗原に結合する第２及び任意選択的な第３の抗原結合ドメインであって、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい態様では、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい態様では、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、第２の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインと、を含む。
ｄ）多重特異性抗体フォーマット
本発明による（多重特異性）抗体は、様々な構造を有することができる。例示的な構造が図１に描写されている。
好ましい態様において、（多重特異性）抗体に含まれる抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。このような態様において、第１、第２、第３などの抗原結合ドメインは、それぞれ本明細書において第１、第２、第３などのＦａｂ分子と呼ばれることがある。
一態様において、（多重特異性）抗体の第１及び第２の抗原結合ドメインは、任意選択でペプチドリンカーを介して互いに融合している。好ましい態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子である。１つのそのような態様において、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別のそのような態様において、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。（ｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、又は（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している態様において、追加的に、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合ドメインのＦａｂ軽鎖は、任意選択でペプチドリンカーを介して互いに融合していてもよい。
第２の抗原、例えば、標的細胞抗原、例えばＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合することができる単一の抗原結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ分子）を有する（多重特異性）抗体（例えば、図１Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌに示されている）は、第２の抗原の内部移行が高親和性抗原結合ドメインの結合の後で予測される場合に特に有用である。そのような場合、第２の抗原に特異的な１つを超える抗原結合ドメインの存在は、第２の抗原の内部移行を増強し、それによって第２の抗原の利用能を低減し得る。
しかし他の場合において、第２の抗原、例えば、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ分子）を、例えば、標的部位への標的化を最適化するため又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために含む（多重特異性）抗体（例えば、図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ，１Ｍ又は１Ｎに示されているものを参照されたい）を有することが有利である。
したがって、好ましい態様において、本発明の（多重特異性）抗体は第３の抗原結合ドメインを含む。
一態様において、第３の抗原結合ドメインは第２の抗原、例えば、標的細胞抗原、例えばＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。一態様において、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
一態様において、第３の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインと同一である。
一部の態様において、第３及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、第３の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインと同一である。故に、これらの態様において、第２及び第３の抗原結合ドメインは、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、同じドメイン配置（すなわち、従来又はクロスオーバー）を有する。さらに、これらの態様において、第３の抗原結合ドメインは、存在する場合、第２の抗原結合ドメインと同じアミノ酸置換を含む。例えば、本明細書において「電荷改変」と記載されるアミノ酸置換は、第２の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインのそれぞれの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。あるいは、前記アミノ酸置換は、第１の抗原結合ドメイン（好ましい態様において、これはＦａｂ分子でもある）の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われ得るが、第２の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１では行われない。
第２の抗原結合ドメインと同様に、第３の抗原結合ドメインは、好ましくは従来のＦａｂ分子である。しかし、第２及び第３の抗原結合ドメインがクロスオーバーＦａｂ分子である（並びに、第１の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である）態様も考慮される。故に、好ましい態様において、第２及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれ従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている／置き換わっているＦａｂ分子である。他の態様において、第２及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
第３の抗原結合ドメインが存在する場合、好ましい態様において、第１の抗原結合ドメインはＣＤ３に結合し、第２及び第３の抗原結合ドメインは、第２の抗原、特に標的細胞抗原、例えばＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。
好ましい態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットは、安定な会合が可能である。
本発明の（多重特異性）抗体は、異なる構造を有することができ、すなわち、第１、第２（及び任意選択で、第３）の抗原結合ドメインは互いに、また異なる様式でＦｃドメインに融合していてもよい。構成要素は、直接的に又は好ましくは１つ又は複数の適切なペプチドリンカーを介して互いに融合していてもよい。Ｆａｂ分子の融合が、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端へのものである場合、それは典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介するものである。
一部の態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような態様において、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端又はＦｃドメインの他方のサブユニットのＮ末端に融合していてもよい。好ましいそのような態様において、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている／置き換わっているＦａｂ分子である。他のそのような態様において、第２の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
一態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｇ及び１Ｋに概略的に描写されている（これらの例における第１の抗原結合ドメインは、ＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。任意選択で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
別の態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第１及び第２のＦａｂ分子は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ａ及び１Ｄに概略的に描写されている（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。第１及び第２のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。好ましい態様において、第１及び第２のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、それぞれＦｃドメインに融合している。具体的な態様において、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域であり、特に、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
一部の態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような態様において、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端又は（上記に記載されたように）Ｆｃドメインの他方のサブユニットのＮ末端に融合していてもよい。好ましいそのような態様において、前記第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている／置き換わっているＦａｂ分子である。他のそのような態様において、前記第２の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
一態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｈ及び１Ｌに概略的に描写されている（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。任意選択で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
一部の態様において、第３の抗原結合ドメイン、特に第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。好ましいそのような態様において、前記第２及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれ従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている／置き換わっているＦａｂ分子である。他のそのような態様において、前記第２及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
好ましいそのような態様において、第１及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｂ及び１Ｅ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）、並びに図１Ｊ及び１Ｎ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。第１及び第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。好ましい態様において、第１及び第３のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、それぞれＦｃドメインに融合している。具体的な態様において、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域であり、特に、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。任意選択で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
別のそのような態様において、第２及び第３の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｃ及び１Ｆ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）、並びに図１Ｉ及び１Ｍ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。第２及び第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。好ましい態様において、第２及び第３のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、それぞれＦｃドメインに融合している。具体的な態様において、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域であり、特に、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。任意選択で、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
Ｆａｂ分子が、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのそれぞれのサブユニットのＮ末端に融合している（多重特異性）抗体の構造において、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子を実質的に形成する。好ましい態様において、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラス免疫グロブリンである。さらにより好ましい形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。別の態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラス免疫グロブリンである。さらに好ましい態様において、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。他の態様において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一態様において、免疫グロブリンは、ヒト定常領域、特にヒトＦｃ領域を含む。
本発明の（多重特異性）抗体の一部において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、任意選択でペプチドリンカーを介して互いに融合している。第１及び第２のＦａｂ分子の構造に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、Ｃ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよく、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、Ｃ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよい。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は、適合しないＦａｂ重鎖及び軽鎖の誤対合をさらに低減し、一部の本発明の（多重特異性）抗体の発現に必要なプラスミドの数も低減する。
抗原結合ドメインは、Ｆｃドメインに又は互いに、直接的に又は１個又は複数個のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合していてもよい。ペプチドリンカーは、当技術分野に知られており、本明細書に説明されている。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４の整数である。一態様において、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸長さ、一態様において５～１００個、さらなる態様において１０～５０個のアミノ酸長さを有する。一態様において、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）であり、一態様において、ｘ＝４及びｎ＝２又は３であり、さらなる態様において、ｘ＝４及びｎ＝２である。一態様において、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合するのに特に適したペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖を接続するのに適した例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）－（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１１８及び１１９）を含む。別の適切なそのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでいてもよい。特に、Ｆａｂ分子がＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、さらなるペプチドリンカーを伴い又は伴うことなく融合していてもよい。
ある特定の態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチド、並びに第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合的に連結している。
ある特定の形態において、本発明の（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチド、並びに第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。ある特定の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合的に連結している。
一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチドを含む。他の態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチドを含む。これらの態様の一部において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する第１のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。これらの態様の他において、適切であれば、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有する（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＬ（２）－ＣＬ（２））ポリペプチド、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（ＶＬ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１））ポリペプチドをさらに含む。これらの態様による（多重特異性）抗体は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含むことができる。ある特定の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合的に連結している。
一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有する（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチドを含む。他の態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニット（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と共有するポリペプチドを含む。これらの態様の一部において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する第１のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。これらの態様の他において、適切であれば、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有する（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＬ（２））ポリペプチド、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（ＶＬ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１））ポリペプチドをさらに含む。これらの態様による（多重特異性）抗体は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含むことができる。ある特定の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合的に連結している。
ある特定の態様において、（多重特異性）抗体はＦｃドメインを含まない。好ましいそのような態様において、前記第２及び存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、それぞれ従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換されている／置き換わっているＦａｂ分子である。他のそのような態様において、前記第２及び存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、それぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
１つのそのような態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２の抗原結合ドメイン、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第１及び第２の抗原結合ドメインは、両方ともＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｏ及び１Ｓに概略的に描写されている（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。
別のそのような態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２の抗原結合ドメイン、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第１及び第２の抗原結合ドメインは、両方ともＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｐ及び１Ｔに概略的に描写されている（これらの例において、モミ抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。
一部の態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、（多重特異性）抗体は、第３の抗原結合ドメイン、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。ある特定のそのような態様において、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｑ及び１Ｕ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ従来のＦａｂ分子である）、又は図１Ｘ及び１Ｚ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。
一部の態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、（多重特異性）抗体は、第３の抗原結合ドメイン、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。ある特定のそのような態様において、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、並びに任意選択で１つ又は複数のペプチドリンカーから実質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｒ及び１Ｖ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ従来のＦａｂ分子である）、又は図１Ｗ及び１Ｙ（これらの例において、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域に置き換えられている）（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域に置き換えられている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有する（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域に置き換えられている）（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域に置き換えられている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有する（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域に置き換えられている）（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（すなわち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域に置き換えられている）（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有する（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有する（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域に置き換えられている）（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽定常領域と置き換わっている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（すなわち、第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域に置き換えられている）（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（３）－ＣＬ（３））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域に置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有する（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
ある特定の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域に置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有する（ＶＨ（３）－ＣＬ（３）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））ポリペプチドを含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。一部の態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））をさらに含む。
一態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的にはＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原結合ドメインは（従来の）Ｆａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
好ましい態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的にはＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
別の態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的にはＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原結合ドメインは（従来の）Ｆａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
本発明による（多重特異性）抗体の異なる構造の全てにおいて、本明細書に記載されるアミノ酸置換（「電荷改変」）は、存在する場合、第２及び（存在する場合）第３の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン、又は第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１又はＣＬドメインのいずれかにおけるものであってもよい。好ましくは、これらは第２及び（存在する場合）第３の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおけるものである。本発明の概念によると、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、このようなアミノ酸置換は、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、このようなアミノ酸置換は、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われない。アミノ酸置換は、好ましくは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ１が互いに置き換わっているＦａｂ分子を含む（多重特異性）抗体において行われる。
本発明による（多重特異性）抗体の好ましい態様において、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、第２（及び存在する場合、第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。本発明による（多重特異性）抗体の他の態様において、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。一部の態様において、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬ、並びに第１の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。
一態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的にはＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原結合ドメインは（従来の）Ｆａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
好ましい態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的にはＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子である、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
ここで、
（ｉ）ａ）の第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、又は
（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
別の態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）第２の抗原、特に標的細胞抗原、より具体的にはＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する第２の抗原結合ドメインであって、第２の抗原結合ドメインは（従来の）Ｆａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ｂ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
上記の態様のいずれかによると、（多重特異性）抗体の構成要素（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）は、直接的に又は様々なリンカーを介して、特に本明細書に記載される又は当該技術において知られている、１個又は複数個のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合されていてもよい。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられ、「ｎ」は一般に１～１０、典型的には２～４の整数である。
好ましい態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＴＹＲＰ－１に結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号１５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１６のＨＣＤＲ２及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号１９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２０のＬＣＤＲ２及び配列番号２１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、
ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
さらに、
ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
さらに好ましい態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＴＹＲＰ－１に結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、
ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
さらに、
ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
好ましい態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号８５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８６のＨＣＤＲ２及び配列番号８７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号８９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９０のＬＣＤＲ２及び配列番号９１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、
ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
さらに、
ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
さらに好ましい態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第１の抗原結合ドメインと、
ｂ）ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する第２及び第３の抗原結合ドメインであって、第２及び第３の抗原結合ドメインはそれぞれ（従来の）Ｆａｂ分子であり、配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第２及び第３の抗原結合ドメインと、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む（多重特異性）抗体であって、
ここで、
ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ｂ）の第２及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
さらに、
ｂ）の第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、ａ）の第１の抗原結合ドメイン及びｂ）の第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している、（多重特異性）抗体を提供する。
本発明のこれらの態様の一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基がトリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基がバリン残基と置き換わっており（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択で位置３６６のトレオニン残基がセリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明のこれらの態様のさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっている（Ｓ３５４Ｃ）又は位置３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、位置３４９のチロシン残基がシステイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明のこれらの態様のなおさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットのそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基がアラニン残基（Ｌ２３４Ａ）と置き換わっており、位置２３５のロイシン残基がアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基がグリシン残基と置き換わっている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明のこれらの態様のなおさらなる態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
好ましい具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、配列番号２３の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２４の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号２７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、を含む。さらに好ましい具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一態様において、本発明は、配列番号２３の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２４の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２５の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号２７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＣＤ３及びＴＹＲＰ－１に結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＣＤ３及びＴＹＲＰ－１に結合する（多重特異性）抗体を提供する。
さらなる好ましい具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、配列番号１０９の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１０の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１１の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号２７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、を含む。さらに特定の具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、配列番号１０９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一態様において、本発明は、配列番号１０９の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１０の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１１の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号２７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＣＤ３及びＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号１０９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＣＤ３及びＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する（多重特異性）抗体を提供する。
８．Ｆｃドメインバリアント
好ましい態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、二量体であり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一態様において、本発明の（多重特異性）抗体は１つを超えるＦｃドメインを含まない。
一態様において、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。好ましい態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）。このアミノ酸置換は、インビボでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を低減する（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照されたい）。さらに好ましい態様において、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。さらにより好ましい態様において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号１１７で与えられる。
ａ）ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン改変
本発明の（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又はもう一方に融合し得る異なる抗原結合ドメインを含み、故にＦｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量体化が、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせをもたらす。組換え産生における（多重特異性）抗体の収率及び純度を改善するため、（多重特異性）抗体のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利である。
したがって、好ましい態様において、本発明による（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。故に、一態様において前記改変はＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
ヘテロ二量体化を強化するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中の改変にいくつかの手法が存在し、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に十分に記載されている。典型的には、全てのこのような手法において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは、両方とも、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）がそれ自体とホモ二量体化することがなく、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化するように仕向けられる相補的な様式で操作されている（それによって、第１及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、２つの第１又は２つの第２のＣＨ３ドメインの間にホモ二量体が形成されない）。改善された重鎖ヘテロ二量体化のためのこれらの異なる手法は、重鎖／軽鎖の誤対合及びベンス・ジョーンズ型副生成物を低減する、（多重特異性）抗体における重鎖－軽鎖改変との組み合わせにおける異なる代替例として考慮される（例えば、１つの結合アームにおけるＶＨ及びＶＬの交換／置き換え、並びにＣＨ１／ＣＬ界面における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）。
具体的な態様において、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」改変であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ（ｋｎｏｂ）」改変及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール（ｈｏｌｅ）」改変を含む。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）の導入を伴い、これにより突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置き換えることによって構築される。突起と同一又は同様のサイズの代償的空洞が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、好ましい態様では、（多重特異性）抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置することが可能な突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置することが可能である。
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異誘発によって又はペプチド合成によって作り出すことができる。
具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、位置３６６のトレオニン残基がトリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基がバリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、位置３６６のトレオニン残基がセリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
なおさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）又は位置３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に位置３４９のチロシン残基がシステイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間にジスルフィド架橋の形成を生じ、二量体をさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
好ましい態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
好ましい態様において、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、（任意選択で、第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメイン及び／又はペプチドリンカーを介して）Ｆｃドメインの（「ノブ」改変を含む）第１のサブユニットに融合する。理論に束縛されるものではないが、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインの、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は、ＣＤ３に結合する２つの抗原結合ドメインを含む抗体の生成（２つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突（ｓｔｅｒｉｃ ｃｌａｓｈ））を（さらに）最小化する。
ヘテロ二量体化を強化するＣＨ３改変についての他の技術が本発明の代替例として考慮され、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
一態様では、欧州特許第１８７０４５９号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置への反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づく。本発明の（多重特異性）抗体の特定の態様は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの一方におけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
別の態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
別の態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含む、又は前記（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる態様において、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（特に、Ｌ３６８Ｅ）から選択されるアミノ酸変異をさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様において、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０又はＫ３９２に、例えば、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅから選択されるさらなるアミノ酸変異を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様において、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒをさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されているヘテロ二量化手法が代替的に使用され、例えば、３６８及び４０９からなる群から選択される位置にアミノ酸改変を有する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、上記に記載されたノブ・イントゥ・ホール技術も使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されているヘテロ二量化手法が代替的に使用される。一態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様において、（多重特異性）抗体又はそのＦｃドメインは、ＩｇＧ２サブクラスのものであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。
代替的な態様において、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０８９００４号に記載されている静電ステアリング効果を媒介する改変を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましくなるように、荷電アミノ酸残基による２つのＦｃドメインサブユニットの界面での１個又は複数個のアミノ酸残基の置き換えを伴う。１つのこのような態様において、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸によるＫ３９２又はＮ３９２のアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）による、特にＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正に帯電したアミノ酸によるＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７のアミノ酸置換（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による、特にＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、より具体的にはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸によるＫ４０９又はＲ４０９のアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）による、特にＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）をさらに含む。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））によるＫ４３９及び／又はＫ３７０のアミノ酸置換をさらに又は代替的に含む（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
なおさらなる態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
なお別の態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用され得る。
一態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
ｂ）Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減するＦｃドメイン改変
Ｆｃドメインは、（多重特異性）抗体に、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態特性及び好ましい組織血液分布比を付与する。しかし同時に、好ましい抗原担持細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への（多重特異性）抗体の望ましくない標的化をもたらすことがある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出をもたらすことがあり、Ｔ細胞活性化特性及び（多重特異性）抗体の長い半減期と組み合わさって、全身投与するとサイトカイン受容体の過剰な活性化及び重篤な副作用を生じる。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体担持）免疫細胞の活性化は、例えば、ＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性によって、（多重特異性）抗体の有効性さえも低減し得る。
したがって、好ましい態様において、本発明による（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示す。１つのこのような態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）は、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）と比較して、５０％未満、特に２０％未満、より具体的には１０％未満、とりわけ５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に示す、及び／又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）と比較して、５０％未満、特に２０％未満、より具体的には１０％未満、とりわけ５％未満のエフェクター機能を示す。一態様において、Ｆｃドメインドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクター機能を誘導しない。好ましい態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、とりわけヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様において、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ又は複数である。好ましい態様において、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一態様において、Ｆｃドメインドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）が、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）の約７０％超、特に約８０％超、より具体的には約９０％超の結合親和性をＦｃＲｎに示す場合に達成される。
ある特定の態様において、Ｆｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性が低減される及び／又はエフェクター機能が低減されるように操作される。好ましい態様において、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減する１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ１つ又は複数のアミノ酸変異が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに存在する。一態様において、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低減する。一態様において、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１に低減する。Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低減する１つを超えるアミノ酸変異が存在する態様において、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１又はさらには少なくとも５０分の１にまで低減し得る。一態様において、操作Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体は、非操作Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体と比較して、２０％未満、特に１０％未満、より具体的には５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に示す。好ましい態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一部の態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一部の態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、とりわけヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体のそれぞれへの結合が低減される。一部の態様において、補体構成要素への結合親和性、具体的にはＣ１ｑへの結合親和性も低減される。一態様において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性は低減されない。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体へのＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）が、Ｆｃドメインの非操作形態（又は前記Ｆｃドメインの非操作形態を含む（多重特異性）抗体）の約７０％超の結合親和性をＦｃＲｎに示す場合に達成される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の（多重特異性）抗体は、そのような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を示すことができる。ある特定の態様において、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、エフェクター機能が低減されるように操作される。エフェクター機能の低減には、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単球への結合の低減、多形核細胞への結合の低減、直接的なシグナル伝達誘導性アポトーシスの低減、標的結合抗体との架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減の１つ又は複数が挙げられ得るが、これらに限定されない。一態様において、エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減及びサイトカイン分泌の低減の群から選択される１つ又は複数である。好ましい態様において、エフェクター機能の低減は、ＡＤＣＣの低減である。一態様において、ＡＤＣＣの低減は、非操作Ｆｃドメイン（又は非操作Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
一態様において、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減するアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一態様において、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様において、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。一部の態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。１つのこのような態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様において、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。一態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な態様において、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。好ましい態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より好ましい態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、好ましい態様において、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）、すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットのそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基はアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３４Ａ）、位置２３５のロイシン残基はアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基はグリシン残基と置き換わっている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
１つのこのような態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（同様に、補体）結合をほとんど完全に消滅させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号は、このような変異Ｆｃドメインの調製方法及びその特性、例えばＦｃ受容体結合又はエフェクター機能の決定方法も記載する。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及びエフェクター機能の低減を示す。したがって、一部の態様において、本発明の（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能をさらに低減させるため、一態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５にアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。別の態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。好ましい態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９にアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。このようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン変異体及びこれらのＦｃγ受容体結合特性は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
好ましい態様において、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択でＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択でＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
ある特定の態様では、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化が排除されている。１つのこのような態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｎ２９７にアミノ酸変異を含み、特にアスパラギンをアラニンに置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本明細書上記及びＰＣＴ出願国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているＦｃドメインに加え、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減されたＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数の置換を有するものも挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。そのようなＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
変異体Ｆｃドメインは、当該技術分野に周知の遺伝子的又は化学的方法を使用して、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製され得る。遺伝子的方法には、コードＤＮＡ配列の部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを挙げることができる。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定により確証され得る。
Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は標準的な機器、例えばＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び例えば組換え発現により得られ得るＦｃ受容体を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。あるいは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価してもよい。
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体のエフェクター機能は、当該技術分野に既知の方法によって測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイを用いることができる（例えば、ＡＣＴＩ（商標）フローサイトメトリー用非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば動物モデル、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されているものにおいてインビボで評価されてもよい。
一部の態様では、補体構成要素、具体的にはＣ１ｑへのＦｃドメインの結合が低減される。したがって、エフェクター機能が低下するようにＦｃドメインが操作されている一部の態様において、エフェクター機能の前記低減にはＣＤＣの低減が挙げられる。Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するため、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２，１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１，１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３，２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。
ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野に既知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照されたい）。
Ｂ．ポリヌクレオチド
本発明は、本発明の抗体をコードする単離ポリヌクレオチドをさらに提供する。上記単離ポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチドか複数のポリヌクレオチドであってもよい。
本発明の（多重特異性）抗体をコードするポリヌクレオチドは、完全な抗体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。同時発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗体を形成してもよい。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖を含む抗体の一部に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する際、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、抗体を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットのうち１つと、任意選択的に１つ又は複数のＦａｂ分子（の一部）と、を含む抗体の一部は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方と、任意選択的にＦａｂ分子（の一部）と、を含む抗体の一部に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する際、Ｆｃドメインサブユニットが会合して、Ｆｃドメインを形成する。
いくつかの態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る抗体分子全体をコードする。他の態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
Ｃ．組換え方法
本発明の抗体は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得られてもよい。組換え産生について、抗体をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、例えば、上述のものは、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞での発現のために、単離され、１つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。一態様では、ベクター、特に本発明のポリヌクレオチド（とりわけ単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含む発現ベクターが、提供される。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、抗体のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であることができ、又は核酸フラグメントであってもよい。発現ベクターは、抗体をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写要素又は翻訳制御要素と共に操作可能に会合してクローン化される発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、存在する場合、コード領域の一部であると考えられてもよいが、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に例えば、単一のベクター上に存在することができ、又は別個のポリヌクレオチド構築物中に例えば、別個の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。これに加え、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、異種コード領域をコードし、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント若しくは誘導体に融合するか、又は融合しなくてもよい。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１つ又は複数の制御配列と会合する。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現制御配列の能力を妨害せず、かつＤＮＡテンプレートを転写する能力を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合しているのであり得る。プロモーターは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば最初期プロモーター、イントロン－Ａと組み合わせる）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及び誘発性プロモーター（例えばテトラサイクリン誘発性プロモーター）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）などの他の特徴も含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する。例えば、抗体の分泌が望ましい場合、シグナル配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体又はその断片をコードする核酸の上流に置かれていてもよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質からは開裂する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成するために、翻訳されたポリペプチドから開裂することを知っている。特定の態様では、ネイティブシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製を容易にするために使用可能な（例えば、ヒスチジンタグ）、又は抗体を標識するのに役立つ短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、ポリヌクレオチドをコードする抗体（フラグメント）の中に、又はその末端に含まれていてもよい。
さらなる態様では、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含む宿主細胞が、提供される。特定の態様において本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。１つのこのような態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む１つ又は複数のベクターを、含む（例えば、それらで形質転換されているか、又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の抗体又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗体を複製し、抗体の発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。このような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗体を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などが挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、可溶性のフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、結果として、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照されたい。また、（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組み合わせて使用してもよい。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用されてもよい。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６，５９（１９７７）に、記載されるような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３、２４３－２５１（１９８０）に、記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３，４４－６８（１９８２）に、記載されるもの）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織に含まれる細胞も含まれる。一態様では、宿主細胞は、真核細胞であり、特に、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一態様では、宿主細胞は、ヒト身体中の細胞ではない。
これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で既知である。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞を操作して、他方の抗体鎖も発現して、発現した生成物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体となるようにすることができる。
一態様では、本発明に係る抗体を産生する方法が提供され、この方法は、本明細書に提供されるように、抗体の発現に好適な条件下で、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することとを含む。
本発明の（多重特異性）抗体の構成要素は、遺伝学的に互いに融合されてもよい。（多重特異性）抗体は、その構成要素が、互いに直接、又はリンカー配列を通して間接的に融合されるように設計されることができる。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定されてもよく、有効性について試験されてもよい。（多重特異性）抗体の異なる構成要素の間のリンカー配列の例が、本明細書で提供される。また、望ましい場合、さらなる配列が、開裂部位を組み込み、融合の個々の構成要素を分離するために含まれていてもよい（例えば、エンドペプチダーゼ認識配列）。
本明細書で記載するように調製される抗体は、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの当該技術分野で既知の技術によって精製されてもよい。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には、正味の電荷、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者には明らかである。親和性クロマトグラフィー精製について、抗体が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用してもよい。例えば、本発明の抗体の親和性クロマトグラフィー精製のために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインＡ又はＧの親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、実施例にて本質的に記載しているように、抗体を単離することができる。抗体の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどの任意の種々の周知の分析方法によって決定することができる。
Ｄ．アッセイ
本明細書に提供される抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、同定され、スクリーニングされ、または特徴付けられてもよい。
１．結合アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対する抗体の結合（親和性）は例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計装、及び、例えば組み換え発現により入手可能である、受容体又は標的タンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。あるいは、異なる受容体又は標的抗原に対する抗体の結合が、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価されてもよい。ＣＤ３に対する結合活性を測定するための特定の説明的かつ例示的な態様が、以下に記載される。
一態様では、ＣＤ３に対する結合活性は、以下のようにＳＰＲによって決定される。
ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行われる。抗Ｆａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃２８９５８３２５）は、標準的なアミンカップリングケミストリーを用いて、４０００～６０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度でＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化される。ランニング及び希釈緩衝液として、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４，０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を使用する。２μｇ／ｍｌの濃度（２０ｍＭ Ｈｉｓ，１４０ｍＭ ＮａＣｌ中，ｐＨ６．０）のＣＤ３抗体を、５μｌ／分の流量で約６０秒間注入する。使用されるＣＤ３抗原は、ノブ・イントゥ・ホール改変及びＣ末端Ａｖｉ－ｔａｇを伴うヒトＦｃドメインに融合された、ＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロン外部ドメインのヘテロ二量体である（配列番号２８及び２９を参照されたい）。ＣＤ３抗原は、１０μｇ／ｍｌの濃度で１２０秒間注入され、解離は、５μｌ／分の流量で約１２０秒間監視される。チップ表面は、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１のそれぞれ約６０秒間の２つの連続した注入によって再生される。容積屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、及びブランク制御フローセルから得られる応答を差し引くことによって訂正される。評価のために、結合反応は、注入終了から５秒後に取られる。結合シグナルを正規化するために、ＣＤ３結合は、抗Ｆａｂ応答（固定化された抗Ｆａｂ抗体上でのＣＤ３抗体の捕捉の際に得られるシグナル（ＲＵ））によって分けられる。特定の処置の後の抗体のＣＤ３に対する結合活性であって、異なる処置の後の抗体のＣＤ３に対する結合活性に対して相対的なもの（相対活性濃度（ＲＡＣ）とも呼ばれる）は、異なる処置の後の対応する抗体の試料の結合活性に対して、特定の処置の後の抗体のサンプルの結合活性を基準とすることにより計算される。
２．活性アッセイ
本発明の（多重特異性）抗体の生物活性は、実施例にて記載しているように、様々なアッセイによって測定されることができる。生物活性には、例えばＴ細胞の増殖の誘発、Ｔ細胞内のシグナル伝達の誘発、Ｔ細胞内の活性化マーカーの発現の誘発、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘発、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘発、並びに腫瘍退縮及び／又は生存の向上の誘発が含まれてもよい。
Ｅ．組成物、製剤及び投与経路
さらなる態様において、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供される抗体のうちのいずれかを含む、医薬組成物を提供する。一態様では、医薬組成物は、本発明に係る抗体と、医薬的に許容される担体とを含む。別の態様では、医薬組成物は、本発明に係る抗体と、少なくとも１つのさらなる治療薬剤（例えば、以下に記載するもの）とを含む。
さらに提供されるのは、インビボで投与に適した形態で本発明の抗体を産生する方法であって、方法は、（ａ）本発明に係る抗体を得ることと、（ｂ）抗体と、少なくとも１つの医薬的に許容される担体とを配合し、それによって、抗体の製剤を、インビボでの投与のために配合することとを含む、方法である。
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体に溶解又は分散した有効量の抗体を含む。「医薬的に許容される」との句は、一般的に、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、すなわち、適切に、動物（例えばヒト）に投与したときに、有害な反応、アレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子要素及び組成物を指す。抗体と、任意選択的にさらなる有効成分とを含む医薬組成物の調製は、本明細書に参照により組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に例示されるように、本開示の観点で、当業者に既知である。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、製剤が、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する機関によって必要とされるような滅菌性、発熱原性、一般的安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解されるであろう。好ましい組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」は、当業者には知られているように（例えば、本明細書に参照により組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照されたい）、任意及びすべての溶媒、緩衝液、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、バインダ、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料、このような類似の材料及びこれらの組み合わせを含む。いずれかの従来の担体が、有効成分と不適合である限りにおける場合を除き、医薬組成物における使用が想定される。
本発明の抗体（及び任意のさらなる治療薬剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所処置で所望の場合、病変内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短時間であるか、又は慢性的であるかに部分的に応じて、例えば、任意の好適な経路によるもの、例えば、静脈内注射又は皮下注射などの注射によるものであり得る。
非経口組成物としては、注射による（例えば、皮下、皮内、病変内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射による）投与のために設計されたものが挙げられる。注射のために、本発明の抗体は、水溶液中で配合されてもよく、特に、生理学的に適合する緩衝液、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液又は生理食塩緩衝液中で配合されてもよい。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤を含有していてもよい。あるいは、抗体は、適切なビヒクル、例えば、滅菌した発熱性物質除去水と共に使用前に構成するための、粉末形態であってもよい。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の抗体を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又はエマルションを調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる、減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。内毒素の混入は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解されるであろう。適切な医薬的に許容される担体としては、限定されないが、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を高める化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなど）を含んでいてもよい。任意選択的に、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。
有効成分はまた、例えばコアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）マイクロカプセル、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）、又はマクロエマルションにも取り込まれ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの成型物品の形態である。特定の態様では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。
既に記載した組成物に加え、抗体はまた、デポー製剤として配合されてもよい。このような長く作用する製剤は、植込み（例えば、皮下若しくは筋肉内）によって、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、抗体は、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）若しくはイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えばやや難溶性の塩として配合されてもよい。
本発明の抗体を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。医薬組成物は、１つ又は複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を医薬として使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。
抗体は、遊離酸若しくは遊離塩基、中性又は塩形態で組成物に配合されてもよい。医薬的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸などの有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第二鉄などの無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
Ｆ．治療方法及び組成物
本明細書で提供されるいずれの抗体を治療方法に使用してもよい。本発明の抗体は、例えば、がんの治療において、免疫治療薬剤として使用されてもよい。
治療方法で使用するために、本発明の抗体は、良質の医療のための原則に一致した様式で配合され、用量に分けられ、投与される。本文脈で考慮すべき因子としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の因子が挙げられる。
一態様では、医薬として使用するための本発明の抗体が提供される。さらなる態様では、疾患の治療に使用するための本発明の抗体が提供される。特定の態様では、治療方法に使用するための本発明の抗体が提供される。一態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体に、疾患の治療に使用するための本発明の抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、個体に有効量の抗体を投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法で使用するための抗体を提供する。特定の態様では、治療される疾患は、増殖性障害である。好ましい態様では、疾患は、がんである。特定の態様では、この方法は、さらに、個体に、有効量の少なくとも１つのさらなる治療薬剤（例えば、治療される疾患ががんである場合、抗癌剤）を投与することを含む。さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘発することに使用するための本発明の抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、標的細胞の溶解を誘発するために個体に有効量の抗体を投与することを含む、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘発する方法に使用するための本発明の抗体を提供する。上記のいずれかの態様に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の抗体の使用を提供する。一態様では、医薬は、疾患の治療を必要とする個体における、疾患の治療のためのものである。さらなる態様では、医薬は、疾患を有する個体に、有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。特定の態様では、治療される疾患は、増殖性障害である。好ましい態様では、疾患は、がんである。一態様では、この方法は、さらに、個体に、有効量の少なくとも１つのさらなる治療薬剤（例えば、治療される疾患ががんである場合、抗癌剤）を投与することを含む。さらなる態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘発するためのものである。なおもさらなる態様では、医薬は、標的細胞の溶解を誘発するために個体に有効量の医薬を投与することを含む、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘発する方法に使用するためのものである。上記のいずれかの態様に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。
さらなる態様において、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、この方法は、このような疾患を有する個体に、有効量の本発明の抗体を投与することを含む。一態様では、組成物は、上記個体に投与され、本発明の抗体を医薬的に許容される形態で含んでいる。特定の態様では、治療される疾患は、増殖性障害である。好ましい態様では、疾患は、がんである。特定の態様では、この方法は、さらに、個体に、有効量の少なくとも１つのさらなる治療薬剤（例えば、治療される疾患ががんである場合、抗癌剤）を投与することを含む。上記のいずれかの態様に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘発するための方法を提供する。一態様では、この方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下にて、標的細胞を本発明の抗体と接触させることを含む。さらなる態様では、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘発するための方法が、提供される。１つのこのような態様では、方法は、標的細胞の溶解を誘発するために個体に有効量の本発明の抗体を投与することを含む。一態様では、「個体」は、ヒトである。
特定の態様では、治療される疾患は、増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例としては、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前立腺癌、血液癌、皮膚癌、扁平細胞癌腫、骨癌及び腎臓癌が挙げられる。本発明の抗体を用いて治療され得る他の細胞増殖障害としては、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられる。前癌状態又は病変及び癌転移も含まれる。特定の態様では、がんは、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、脳腫瘍、頭頸部癌及び前立腺癌からなる群から選択される。特に抗体が、第２の抗原としてのＴＹＲＰ－１に結合する多重特異性抗体である一態様では、がんは、ＴＹＲＰ－１を発現するがんである。特に抗体が、第２の抗原としてのＴＹＲＰ－１に結合する多重特異性抗体である一態様では、がんは、皮膚癌、特に黒色腫である。特に抗体が、第２の抗原としてのＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する多重特異性抗体である一態様では、がんは、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するがんである。特に抗体が、第２の抗原としてのＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する多重特異性抗体である一態様では、がんは、脳腫瘍、特に膠芽腫である。当業者は、多くの場合に、抗体が、治癒を与えないが、部分的な利益のみを与える場合があることを容易に認識する。いくつかの態様では、いくらかの効果を有する生理学的変化もまた、治療上有益であるとみなされる。したがって、いくつかの態様では、生理学的変化を与える抗体の量は、「有効量」と考えられる。治療が必要な対象、患者又は個体は、典型的には、哺乳動物であり、より具体的には、ヒトである。
いくつかの態様では、有効量の本発明の抗体が、疾患を治療するために個体に投与される。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の適切な投薬量（単独で使用される場合、又は１つ又は複数の他のさらなる治療薬剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、抗体の種類、疾患の重篤度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前又は現在の治療介入、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存する。投与の責任を担う医師は、いずれにしても、組成物中の有効成分の濃度、個々の対象に適切な用量を決定する。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
抗体は、一度に、又は一連の治療にわたって患者に好適に投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１回又は複数回の別個の投与によるか、又は連続的な注入によるかによらず、患者に投与するための初期の候補投薬量であってもよい。１つの典型的な日用量は、上で言及した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、治療は、概して、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であろう。他の非限定的な例では、用量はまた、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重までを含んでいてもよく、又は投与あたりさらに多くてもよく、これらから誘導される任意の範囲であってもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重～約５００ｍｇ／ｋｇ体重などの範囲が、上述の数に基づいて投与されてもよい。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の１回又は複数回の用量を患者に投与してもよい。かかる用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。初期の多めの用量、それに続く１回又は複数回の量の少ない用量を投与してよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であり得る。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
本発明の抗体は、一般的に、意図した目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明の抗体、又はその医薬組成物が、有効量で投与されるか、又は塗布される。
全身投与の場合、有効な用量は、インビトロアッセイ、例えば、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞培養物で決定されるようなＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで配合してもよい。このような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。
初期投薬量も、インビボデータから、例えば、動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて概算することができる。
治療効果を維持するのに十分な抗体の血漿濃度を与えるように、投薬量及び投薬間隔は、個々に調節されてもよい。注射による投与のための通常の患者投薬量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿濃度は、各日に複数回用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中の濃度は、例えば、ＨＰＬＣによって測定されてもよい。
本発明の抗体の有効な用量は、実質的な毒性を引き起こすことなく、一般的に治療利益を与える。抗体の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ５０（集団の５０％が致死に至る用量）及びＥＤ５０（集団の５０％が治療に有効である用量）を決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指数を示す抗体が好ましい。一態様では、本発明に係る抗体は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投薬範囲を決定する際に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、全くない状態で、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、例えば、使用される剤形、利用される投与経路、対象の状態などの種々の因子に依存して、この範囲内で変動してもよい。正確な製剤、投与経路及び投薬量は、患者の状態という観点で個々の医師によって選択されてもよい（例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照されたい）。
本発明の抗体で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに起因して、どのように、いつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っているであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分ではない場合（毒性を生じずに）、治療をもっと高レベルにするように調整することも知っているであろう。関心のある障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重篤度、投与経路などに伴って変動する。状態の重篤度は、例えば、部分的には、標準的な予後評価方法によって評価されてもよい。さらに、用量と、おそらく投薬頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答によっても変わる。
本発明の抗体は、治療において、１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療薬剤と同時投与され得る。「治療薬剤」との用語は、このような治療が必要な個体において、症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このようなさらなる治療薬剤は、治療される特定の疾患に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の態様では、さらなる治療薬剤は、免疫制御剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性薬剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感度を高める薬剤である。好ましい態様では、さらなる治療薬剤は、抗癌剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。
このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わされて存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される抗体の量、障害又は治療の種類、上述の他の因子に依存する。抗体は、一般的に、同じ投薬量で、本明細書に記載の投与経路で使用されるか、又は約１～９９％の本明細書に記載の投薬量で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
上述のこのような併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療薬剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、本発明の抗体の投与は、さらなる治療薬剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に行われてもよい。本発明の抗体はまた、放射線療法と組み合わせて使用されてもよい。
Ｇ．製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器上の又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋などが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から作られてもよい。容器は、それ自体で、又は別の組成物との組み合わせで、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静注溶液袋又は皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ添付文書は、組成物が、選択される状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造物品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を内部に収容した第１の容器と、（ｂ）さらなる細胞傷害性薬剤、又はさもなければ治療薬剤を含む組成物を内部に収容した第２の容器とを含み得る。本発明のこの態様における製造物品は、組成物が特定の状態を治療するために使用され得ることを示すパッケージ添付文書をさらに含んでいてもよい。あるいは、又は加えて、製造物品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含んでいてもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、ニードル、及びシリンジを含め、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
Ｈ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の態様において、本明細書に提供される抗体のいずれも、生体試料中のその標的（例えば、ＣＤ３、ＴＹＲＰ－１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）の存在の検出に有用である。「検出する」との用語は、本明細書で使用される場合、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の態様において、生体試料は、細胞又は組織、例えば前立腺組織を含む。
一態様において、診断又は検出方法において使用するための、本発明に係る抗体が提供される。さらなる態様において、生体試料中のＣＤ３、ＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩの存在を検出する方法が提供される。特定の態様において、方法は、生体試料と、本発明の抗体とを、ＣＤ３、ＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩに抗体が結合することを許容する条件下で接触させることと、複合体が、抗体とＣＤ３、ＴＹＲＰ－１又はＥＧＦＲｖＩＩＩとの間で形成されるかどうかを検出することと、を含む。このような方法は、インビトロ法又はインビボ法であってもよい。一態様において、本発明の抗体は、ＣＤ３、ＴＹＲＰ－１及び／又はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗体を用いた治療に適格な対象を選択するために使用され、例えば、ＣＤ３、ＴＹＲＰ－１及び／又はＥＧＦＲｖＩＩＩは、患者の選択のためのバイオマーカーとなる。
本発明の抗体を使用して診断され得る例示的な障害としては、がん、特に皮膚癌又は脳腫瘍が挙げられる。
特定の態様において、本発明に係る抗体であって、その抗体が標識されているものが提供される。標識としては、限定されないが、直接的に検出される標識又は部分（例えば、蛍光、色素体、電子密度の高い、化学発光及び放射性標識）、及び例えば酵素反応又は分子相互作用によって、間接的に検出される部分（例えば、酵素又はリガンド）が挙げられる。例示的な標識としては、限定されないが、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅｓ）、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘテロ環オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及び過酸化水素を使用する酵素と連結し、染料前駆体を酸化するキサンチンオキシダーゼ、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定な遊離ラジカルなどが挙げられる。
ＩＩＩ．配列
Figure 2022028645000002
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Figure 2022028645000004
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Figure 2022028645000018
Figure 2022028645000019
ＩＶ．
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。先に与えた一般的な説明を考慮すると、種々の他の態様が実施されてもよいことが理解される。
実施例１－最適化ＣＤ３バインダの生成
既に記載した（例えば、本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第２０１４／１３１７１２号を参照されたい）、本明細書で「ＣＤ３ｏｒｉｇ」と呼ばれ、かつそれぞれ配列番号６及び１１のＶＨ及びＶＬ配列を含むＣＤ３バインダから開始して、本発明者らは、重鎖ＣＤＲ３のＫａｂａｔ位置９７及び１００における２つのアスパラギン脱アミド配列モチーフを除去することによって、このバインダの特性を最適化することを目指した。
この目標に対して、本発明者らは、ファージディスプレイに適した、Ｋａｂａｔ位置９７と１００の両方のアスパラギンが除去された重鎖の抗体ライブラリを生成し、さらにＡｓｎ９７及びＡｓｎ１００を置き換えることによって引き起こされる親和性の喪失を親和性成熟プロセスを通して補償するためにランダム化されたＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２及びＨ３を生成した。
このライブラリは、マイナーコートタンパク質ｐ３への融合を介して線状ファージに置かれ（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２，５８１－５９７）、組み換えＣＤ３εへの結合のために選択された。
初期のスクリーニングにおいて１０の候補クローンが特定され、ＳＰＲによってＦａｂ断片（大腸菌内で産生された）として測定された、組み換え抗原上の許容可能な結合を示した。
しかしながら、これらクローンのうち１つだけが、ＩｇＧフォーマットへの変換後、フローサイトメトリーによって測定された、ＣＤ３を発現する細胞への許容可能な結合活性を示した。
本明細書で「ＣＤ３ｏｐｔ」と呼ばれ、かつそれぞれ配列番号７及び１１のＶＨ及びＶＬ配列を含む選択されたクローンは、以下で説明されるように、さらに評価され、二重特異性フォーマットに変換された。
実施例２－最適化ＣＤ３バインダのＣＤ３への結合
組み換えＣＤ３への結合
両方ともＦｃ領域内のＰ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（「ＰＧＬＡＬＡ」、ＥＵナンバリング）変異のヒトＩｇＧ１フォーマットである、最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」と元々のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」とについて（配列番号１２及び１４（ＣＤ３ｏｒｉｇ）並びに配列番号１３及び１４（ＣＤ３ｏｐｔ））、組み換えＣＤ３への結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定された。
脱アミド部位除去の効果と抗体の安定性へのその効果とを評価するために、元々のＣＤ３バインダ及び最適化ＣＤ３バインダの組み換えＣＤ３への結合を、３７°Ｃ又は４０°Ｃの１４日間の温度ストレス後に試験した。－８０°Ｃで保存された試料を基準として使用した。基準試料及び４０°Ｃでストレスを加えられた試料は、２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中、ｐＨ６．０であり、３７°Ｃでストレスを加えられた試料は、ＰＢＳ中、ｐＨ７．４であり、すべて濃度１．２～１．３ｍｇ／ｍｌであった。ストレス期間（１４日間）後、さらなる分析のために、ＰＢＳ中の試料を透析して２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に戻した。
試料の相対活性濃度（ＲＡＣ）を、以下の通りＳＰＲにより決定した。
ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行われた。抗Ｆａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃２８９５８３２５）は、標準的なアミンカップリングケミストリーを用いて、結果として４０００～６０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度で、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化された。ランニング及び希釈緩衝液として、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ ７．４，０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を使用した。２μｇ／ｍｌの濃度のＣＤ３抗体を、５μｌ／分の流量で６０秒間注入した。ＣＤ３抗原（以下を参照されたい）は、１０μｇ／ｍｌの濃度で１２０秒間注入され、解離は、５μｌ／分の流量で１２０秒間監視された。チップ表面は、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１のそれぞれ６０秒間の２つの連続した注入によって再生された。容積屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、及びブランク制御フローセルから得られる応答を差し引くことによって訂正された。評価のために、結合反応は、注入終了から５秒後に取られた。結合シグナルを正規化するために、ＣＤ３結合は、抗Ｆａｂ応答（固定化された抗Ｆａｂ抗体上でのＣＤ３抗体の捕捉の際に得られるシグナル（ＲＵ））によって分けられた。相対活性濃度は、各温度ストレスを加えられた試料を、対応するストレスを加えられていない試料に対して参照することにより計算した。
使用された抗原は、ノブ・イントゥ・ホール改変及びＣ末端Ａｖｉ－ｔａｇを伴うヒトＦｃドメインに融合された、ＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロン外部ドメインのヘテロ二量体であった（配列番号２８及び２９を参照されたい）。
この実験の結果を図２に示す。見ることができるように、最適化ＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｐｔは、元々のＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｒｉｇと比較して、温度ストレス（３７°Ｃ、ｐＨ７．４で２週間）後、ＣＤ３への強く改善された結合を示した。この結果は、インビボ半減期とともに中性ｐＨでの抗体の製剤に関連して、脱アミド部位除去が成功であったことと、脱アミド部位除去によって優れた安定性特性を有する抗体が得られたことを示している。
Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３への結合
両方ともＦｃ領域内のＰ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（「ＰＧＬＡＬＡ」、ＥＵナンバリング）変異のヒトＩｇＧ１フォーマットである、最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」と元々のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」とについて（配列番号１２及び１４（ＣＤ３ｏｒｉｇ）並びに配列番号１３及び１４（ＣＤ３ｏｐｔ））、ヒトレポーターＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ上のＣＤ３への結合は、ＦＡＣＳによって決定された。
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ；Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）は、ＮＦＡＴプロモーターを伴うヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株であり、ヒトＣＤ３を発現する。細胞を、ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｘ ＮＥＡＡ、１ｘ ピルビン酸ナトリウム中、１ｍｌあたり０．１～０．５ｍｉｏ細胞で培養した。最終濃度であるハイグロマイシンＢ １ｍｌあたり２００μｇを、細胞を継代するときにはいつでも添加した。
結合アッセイのために、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。抗体染色を、９６ウェル丸底プレート内で行った。したがって、１ウェルあたり１００，０００～２００，０００細胞が、播種された。プレートを４分間４００ｘｇで遠心分離し、上清を取り除いた。試験抗体をＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、抗体溶液２０μｌを４°Ｃで３０分間、細胞に添加した。未結合の抗体を除去するため、希釈された二次抗体（ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－１１６－１７０）の添加前に細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。４°Ｃで３０分のインキュベーションの後、未結合の二次抗体を洗い流した。測定の前に、細胞を２００μｌ ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、次いでＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ装置を使用してフローサイトメトリーによって分析した。
図３に示すように、最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」と元々のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」とは、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３に比較的良く結合した。
実施例３－最適化ＣＤ３バインダの機能活性
最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」の機能活性を、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞アッセイで試験し、元々のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」の活性と比較した。ＩｇＧの機能活性を試験するために、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞を、増加する濃度のＣＤ３ｏｐｔヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ又はＣＤ３ｏｒｉｇヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡの存在下で、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞と共インキュベートした。Ｔ細胞架橋のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞上のＣＤ３の活性化は、ルシフェラーゼの産生を誘発するのであり、活性化マーカーとして発光を測定することができる。ＣＤ３ｏｒｉｇヒトＩｇＧ１ ｗｔが、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞に結合できず、したがってＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に架橋されることができない、陰性対照として含まれていた。アッセイの概略図を図４で提供する。
抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＧＬＡＬＡ）に特異的に結合する抗体を、その表面上に発現するように操作されているＣＨＯ－Ｋ１細胞である（本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第２０１７／０７２２１０号を参照されたい）。これらの細胞は、５％ＦＣＳ＋１％ＧｌｕＭａｘを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養された。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞は、実施例２で説明されている通りである。
ＣＤ３ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡが、ＣＨＯ上に発現された抗ＰＧＬＡＬＡ及びＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞上に発現されたＣＤ３に同時に結合する際、ＮＦＡＴプロモーターが、活性化されて、活性ホタルルシフェラーゼの発現を引き起こす。（ルシフェラーゼ基質の添加の際に得られる）発光シグナルの強度は、ＣＤ３活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞は、懸濁物中で成長するのであり、ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎ、１ｘ ＮＥＡＡ、１ｘ ピルビン酸ナトリウム中、１ｍｌあたり０．１～０．５ｍｉｏ細胞、ハイグロマイシン１ｍｌあたり２００μｇで培養された。アッセイのために、ＣＨＯ細胞を採取し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存度を決定した。平底、白壁の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ＃６５５０９８）内で、１００μｌ培地に３００００標的細胞／ウェルをプレートし、５０μｌ／ウェルの希釈された抗体又は培地（対照のため）を、ＣＨＯ細胞に添加した。続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を採取し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存度を評価した。細胞を、１．２ｍｉｏ細胞／ｍｌで細胞培地内でハイグロマイシンＢなしで再懸濁し、６００００細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）でＣＨＯ細胞に添加し、最終エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比２：１、及び１ウェルあたり最終体積２００μｌを得た。次いで、４μｌのＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｅ１２９１）を、各ウェルに添加した（最終体積の２％）。細胞を、加湿したインキュベータ内において３７°Ｃで２４時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを使用して発光を検出した。
図５に示すように、最適化ＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｐｔは、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞上で、ＣＤ３ｏｒｉｇとしての架橋の際に類似の活性を有していた。
実施例４－最適化ＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体の生成
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ
実施例１で同定された最適化ＣＤ３バインダ（「ＣＤ３ｏｐｔ」、配列番号７（ＶＨ）及び１１（ＶＬ））を使用して、ＣＤ３及びＴＹＲＰ１を標的とするＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）を生成した（「ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ」）。
このＴＣＢに含まれるＴＹＲＰ１バインダは、ＴＹＲＰ１バインダのヒト化「ＴＡ９９」によって生成され（重鎖及び軽鎖について、それぞれＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＸＱ５７８１１及びＡＸＱ５７８１３を参照されたい）、それぞれ配列番号１８及び２２に示される重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む。
ＴＣＢ分子の概略図は、図６で提供され、その全配列は、配列番号２３、２４、２５及び２７で与えられる。
元々のＣＤ３結合配列との類似分子も調製した（配列番号２３、２４、２５及び２６）。
二重特異性分子を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクションによって生成した。細胞は、対応する発現ベクターによって１：２：１：１（「ベクター重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ－ＣＬ）」）の比でトランスフェクトされた 細胞を遠心分離にかけて、培地を、予め暖めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，＃１０７４３０２９）に交換した。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃２３９６６－１）を添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２ｍｉｏ／ｍｌ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％ ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベータ内で、３時間３７°Ｃでインキュベートした。インキュベーションの後、補充液（全体積の８０％）を伴うＥｘｃｅｌｌ培地を添加した。トランスフェクションの１日後に、補充液（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を添加した。７日後、遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）によって細胞上清を採取した。
タンパク質は、標準的な方法によって、濾過した細胞培養物上清から精製した。手短に述べれば、Ｆｃ含有タンパク質は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって細胞培養物上清から精製した（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：平衡化緩衝液：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム，２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出緩衝液：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭ グリシン ｐＨ３．０）。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて試料をすぐにｐＨ中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（＃ＵＦＣ９０３０９６））によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、単量体タンパク質から分離した。
Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４，２４１１－２３に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下、及び不存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した（表１）。ランニング緩衝液（それぞれ、２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４，１２５ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ｌ－アルギニンモノヒドロクロリド，ｐＨ６．７、又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，２５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ６．２）中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより２５°Ｃにて、凝集内容物の決定を行った（表２）。
Figure 2022028645000020
Figure 2022028645000021
実施例５－最適化ＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体のＣＤ３及びＴＹＲＰ１への結合
組み換えＣＤ３への結合
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢの組み換えＣＤ３への結合を、最適化された（ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔ）又は元々の（ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ）ＣＤ３結合配列のいずれかを有するＴＣＢを使用してＳＰＲにより評価した。
ＳＰＲ実験は、ランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢを、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＧＬＡＬＡ）（本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第２０１７／０７２２１０号を参照されたい）を特異的に結合する固定化された抗体とともに、ＣＭ５センサーチップ表面上に捕捉した。捕捉抗体を、標準的なアミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ｐＨ５．０で約８７００共鳴単位（ＲＵ）の直接固定化によりセンサーチップ表面にカップリングした。ＴＣＢ分子を、３０秒間、５ｎＭで、１０μｌ／分の流れで捕捉した。
ヒト及びカニクイザル抗原（以下を参照されたい）を、１２．３５～３０００ｎＭの濃度、３０μｌ／分の流れで、フローセルを通して、２４０秒にわたって通した。解離相は、２４０秒間監視され、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰへのスイッチングによってトリガされた。チップ表面を、１０ｍＭグリシンｐＨ２．０の３０秒間の１回の注射を使用して、毎サイクル後に再生した。
使用された抗原は、ノブ・イントゥ・ホール改変及びＣ末端Ａｖｉ－ｔａｇを伴うヒトＦｃドメインに融合された、ヒト又はカニクイザルのいずれかのＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロン外部ドメインのヘテロ二量体であった（配列番号２８及び２９（ヒトＣＤ３）及び配列番号３０及び３１（カニクイザルＣＤ３）を参照されたい）。
容積屈折率の差は、基準フローセル（ＴＣＢは全く捕捉されなかった）から得られる応答を差し引くことによって訂正された。親和性定数を、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１：１ラングミュア結合へのフィッティングにより、動態速度定数から導出した。
ヒト及びカニクイザルＣＤ３への結合についてのＫＤ値は、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔについてそれぞれ５０ｎＭ及び２０ｎＭとして決定され、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇのものに類似していた（それぞれ５０ｎＭ及び４０ｎＭ）。
これは、非ストレス条件下、ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＴＣＢの両方が、組み換えＣＤ３に比較的良く結合されることを示している。
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢの組み換えヒトＣＤ３への結合はまた、最適化された又は元々のＣＤ３結合配列のいずれかを有するＴＣＢを使用して、３７°Ｃ又は４０°Ｃの１４日間の温度ストレス後に評価された。実験は、ＩｇＧ分子の代わりにＴＣＢを使用して、上記実施例２で説明した通りに行われた。
この実験の結果を図７に示す。
図７で見ることができるように、最適化ＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｐｔを含むＴＣＢは、元々のＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｒｉｇを含むＴＣＢと比較して、ストレス（３７°Ｃ、ｐＨ７．４で２週間）後、ＣＤ３への強く改善された結合を示した。この結果は、最適化ＣＤ３バインダの改善された特性（実施例２を参照されたい）が、ＴＣＢレベルで維持されることを裏付ける。
組み換えＴＹＲＰ１への結合
組み換えＴＹＲＰ１への結合を、対応する抗体のプラスミン消化によって調製したＴＹＲＰ１ Ｆａｂ断片を使用して、ＳＰＲにより評価した。
ＳＰＲ実験は、ランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。
ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＧＬＡＬＡ）（本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第２０１７／０７２２１０号を参照されたい）を特異的に結合する抗体を、ｐＨ５．０で、標準的なアミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＣＭ５センサーチップ上に直接カップリングした。抗原（以下を参照されたい）を、１０μｌ／分の流量で３０秒間捕捉した。ＴＹＲＰ１ Ｆａｂ断片の３倍希釈系列を、３０μｌ／分で１８０秒間フローセルに通し、会合相を記録した。解離相は、１８０秒又は１２００秒間監視され、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰへのスイッチングによってトリガされた。チップ表面を、１０ｍＭグリシンｐＨ２の３０秒間の３０μｌ／分の１回の注射を使用して、毎サイクル後に再生した。
使用された抗原は、ノブ・イントゥ・ホール（及びＰＧ ＬＡＬＡ）改変並びにＣ末端Ａｖｉ－ｔａｇを伴うヒトＦｃドメインへの、ヒト、カニクイザル又はマウスＴＹＲＰ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の単量体融合であった（配列番号３２及び３５（ヒトＴＹＲＰ１）、配列番号３３及び３５（カニクイザルＴＹＲＰ１）、又は配列番号３４及び３５（マウスＴＹＲＰ１）を参照されたい）。
容積屈折率の差は、基準フローセル（抗原は全く捕捉されなかった）から得られる応答を差し引くことによって訂正された。親和性定数（ＫＤ）を、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１：１ラングミュア結合へのフィッティングにより、動態速度定数から導出した。
ヒト、カニクイザル又はマウスＴＹＲＰ１への結合についてのＫＤ値は、それぞれ１３０ｐＭ、１８０ｐＭ及び５３０ｐＭとして決定され、親ＴＡ９９抗体のものに類似していた（それぞれ９０ｐＭ、１２０ｐＭ及び３１０ｐＭ）。
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢの組み換えＴＹＲＰ１への結合はまた、最適化された又は元々のＣＤ３結合配列のいずれかを有するＴＣＢを使用して、３７°Ｃ又は４０°Ｃの１４日間の温度ストレス後に評価された。
実験は、抗原として組み換えＴＹＲＰ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用して、ＣＤ３への結合について上記で説明した通りに行われた。
この実験の結果を図８に示す。これらは、両方のＴＣＢについて（さらにはＩｇＧフォーマットの対応するＴＹＲＰ１バインダについて）のヒトＴＹＲＰ１への結合が、ストレス条件による影響を受けないことを裏付ける。
Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３への結合
上記実施例２で説明した通りの、最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」又は元々のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」を含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢについて、ヒトレポーターＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ上のＣＤ３への結合は、ＦＡＣＳによって決定された。
図９に示されるように、最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」を含むＴＣＢは、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３に、元々のＣＤ３バインダである「ＣＤ３ｏｒｉｇ」を含むＴＣＢに対して少なくとも比較的良く結合する。
実施例６－最適化ＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体の機能活性
ＣＤ３活性化
最適化ＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｐｔ又は元々のＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＴＹＲＰ１ ＴＣＢ（実施例４）を、ＴＹＲＰ１陽性黒色腫細胞Ｍ１５０５４３（原発性黒色腫細胞株、チューリッヒ大学のｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ｃｅｌｌ ｂａｎｋから入手した）の存在下で、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイ（実施例３を参照されたい）で試験した。
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢが、ＴＹＲＰ１陽性標的細胞及びＣＤ３抗原（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞上に発現された）に同時に結合する際、ＮＦＡＴプロモーターが、活性化されて、活性ホタルルシフェラーゼの発現を引き起こす。（ルシフェラーゼ基質の添加の際に得られる）発光シグナルの強度は、ＣＤ３活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。アッセイは、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞の代わりにＭ１５０５４３を使用して、実施例３で説明した通りに行われた。
ＩｇＧ（実施例３）の場合に見られるように、ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＴＣＢの両方が、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞上で類似の機能活性を有しており、濃度に依存する態様でＣＤ３活性化を誘発した（図１０）。
標的細胞殺傷
次ステップで、両方のＴＣＢ分子を、ヒト黒色腫細胞株Ｍ１５０５４３と共に共インキュベートされた、３つの異なるドナーからの新たに単離したヒトＰＢＭＣを用いて、腫瘍細胞殺傷アッセイで試験した。腫瘍細胞溶解を、２４時間及び４８時間後のＬＤＨ放出により測定した。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を、４８時間後の両方の細胞サブセット上のＣＤ６９及びＣＤ２５のアップレギュレーションにより分析した。
手短に述べれば、標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて採取し、洗浄し、３００００細胞／ウェルの密度で平底９６ウェルプレートを使用してプレートした。細胞を、一晩付着したままにしておいた。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健康なヒトドナーからの新鮮血のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ＃Ｈ８８８９）上で積層した。遠心分離（４５０ｘｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相より上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいＦａｌｃｏｎチューブに移し、続いてＰＢＳ ５０ｍｌで満たした。混合物を遠心分離（４００ｘｇ，１０分，室温）し、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離ステップ３５０ｘｇ，１０分）。結果として得られたＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、１０％ＦＣＳ及び１％Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ＃Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に３７°Ｃ、５％ＣＯ２で、細胞インキュベータ内で、さらに使用するまで保存した（２４時間より長くはない）。殺傷アッセイのために、抗体を、示される濃度で３連で添加した。ＰＢＭＣを、最終エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１０：１で標的細胞に添加した。標的細胞殺傷を、３７°Ｃ、５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーション後に、アポトーシス／ネクローシス細胞によって細胞上清内に放出されたＬＤＨの定量化により評価した（ＬＤＨ検出キット，Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ＃１１ ６４４ ７９３ ００１）。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００での標的細胞のインキュベーションによって達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性構築物を有しないエフェクター細胞と共インキュベートした標的細胞を基準とする。
ＴＣＢが媒介する標的細胞のＴ細胞殺傷の際のＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）及びＣＤ６９（早期活性化マーカー）を認識する抗体を使用してフローサイトメトリーによって評価した。４８時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０ｘｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＣＤ４ ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３００５１４）、ＣＤ８ ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３４４７０４）、ＣＤ２５ ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３０２６３０）及びＣＤ６９ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３１０９０６）についての表面染色を、供給元の指示に従って行った。細胞を、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（ＢＤ＃５５４６５５）を使用して４°Ｃで１５分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。試料を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。
３つのドナーすべてにおいて、最適化された又は元々のＣＤ３バインダのいずれかを含むＴＣＢの両方が、比較可能な態様でＴ細胞活性化及び腫瘍細胞溶解を誘導した（図１１）。３つのドナーすべてについての４８時間後の腫瘍細胞溶解のＥＣ５０値を、表３に要約する。
Figure 2022028645000022
実施例７－マウスにおけるＴ細胞二重特異性抗体でのＰＫ研究
それぞれ異なるＣＤ３バインダ（ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＣＤ３ｏｐｔ）でのＴＹＲＰ１ ＴＣＢの薬物動態（ＰＫ）を、ヒトＦｃＲｎトランスジェニック（ｌｉｎｅ３２，ホモ）及びＦｃＲｎノックアウトマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｒａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ ００３９８２及び０１４５６５）への１ｍｇ／ｋｇでの静脈内ボーラス投与を追って研究した（ｎ＝３／株／試験化合物）。一連の血液マイクロサンプルを、ヒトＦｃＲｎトランスジェニック（ｔｇ）マウスから６７２時間まで（投薬後５分から６７２時間までマウス１匹あたり９つの試料）、ＦｃＲｎノックアウト（ｋｏ）マウスにおいて９６時間まで（投薬後５分から９６時間までマウス１匹あたり８つの試料）取った。血清を調製し、分析まで冷凍保存した。マウス血清試料を、ｎｏｎ－ＧＬＰ条件の下で、ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ４１１（Ｒｏｃｈｅ）機器を使用して、ヒトＩｇ／Ｆａｂ ＣＨ１／カッパドメインに対して特異的なｇｅｎｅｒｉｃ ＥＣＬＩＡ法で分析した。薬物動態評価を、標準的な非区画分析を使用して行った。
この研究の結果を表４に示す。これは、ＣＤＲの操作が、抗体クリアランスに影響するであろう、他の配列ライアビリティ（ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）を引き起こさなかったことを示している。ＣＤ３ｏｐｔは、血清半減期に関してＣＤ３ｏｒｉｇにおけるのと同じように良好である一方、ＣＤＲ安定性の増加というさらなる利点を有している。
Figure 2022028645000023
実施例８－最適化ＣＤ３バインダを含むさらなるＴ細胞二重特異性抗体の生成
実施例１で同定された最適化ＣＤ３バインダ（「ＣＤ３ｏｐｔ」、配列番号７（ＶＨ）及び１１（ＶＬ））を使用して、ＣＤ３及びＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）を生成した（「ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ」）。
このＴＣＢに含まれるＥＧＦＲｖＩＩＩバインダ（Ｐ０６３．０５６）は、親和性成熟（以下を参照されたい）が後に続くファージディスプレイから、誘導されたのであり、それぞれ配列番号８８及び９２に示される重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む。
ＴＣＢ分子の概略図は、図６で提供され、その全配列は、配列番号１０９、１１０、１１１及び２７で与えられる。
元々のＣＤ３結合配列との類似分子も調製した（配列番号１０９、１１０、１１１及び２６）。
二重特異性分子を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクションによって生成し、上記実施例４で説明した通りに精製及び分析した。
さらに、ファージディスプレイ由来のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、以下で説明する使用のために、ヒトＩｇＧ１フォーマットで類似の態様（ＩｇＧ重鎖及び軽鎖について、１：１比で、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞を発現ベクターでトランスフェクトする）で産生された。
すべてのＩｇＧ及びＴＣＢ構築物は、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されたモノマー含有量９５％以上で、比較可能な品質で精製された。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の選択
ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ファージディスプレイ由来であり、かつ親和性成熟したものであった。ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｐ０５６．０２１（配列番号４０及び４４）、Ｐ０５６．０５２（配列番号４８及び５２）、Ｐ０４７．０１９（配列番号５６及び６０）、Ｐ０５７．０１２（配列番号６４及び６８）、Ｐ０５７．０１１（配列番号７２及び７６）、Ｐ０５６．０２７（配列番号８０及び８４））について高い親和性結合及び特異性を示す抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを安定して発現するＣＨＯ細胞及びＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ヒト膠芽腫細胞株ＤＫ－ＭＧを使用して、細胞表面に発現されるＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合について試験された。特異性を裏付けるため、及び野生型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｗｔ）に対する交差反応性を排除するため、選択された抗体を、ＥＧＦＲｗｔ陽性ヒト腫瘍細胞株ＭＫＮ－４５への結合について試験した（図１２）。ＥＧＦＲｗｔへの結合についてセツキシマブが陽性対照として、及び非標的ＤＰ４７ ＩｇＧが陰性対照として含まれた。すべての選択された抗体は、ＥＧＦＲｗｔへの交差反応性なしにＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、さらなる特徴付けが考慮された。
次ステップで、ＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（Ｆｃ領域内のＰ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（「ＰＧＬＡＬＡ」、ＥＵナンバリング）変異のヒトＩｇＧ１フォーマット）としてのこれらのＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の機能活性が、抗ＰＧＬＡＬＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞と共インキュベートしたＤＫ－ＭＧ細胞上で、発光を測定する（ＣＡＲ Ｊアッセイ、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６０３８号を参照されたい）ことによって評価された。ＤＰ４７ ＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡが、陰性対照として含まれた。すべての試験されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が、ＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞の強い活性化を誘導した（図１３）。最も弱い結合及び活性化を示したＰ０４７．０１９を除く、すべての試験されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が、ＴＣＢフォーマットへの変換（ＣＤ３バインダとしてＣＤｏｒｉｇを伴う）のために選択された。
ＴＣＢフォーマットへの変換がＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の結合能力に影響しないことを裏付けるために、選択されてＴＣＢフォーマットへ変換されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のＣＨＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞への結合は、対応するＩｇＧの結合と比較された（図１４）。試験されたＥＧＦＲｖＩＩＩクローンのほとんどが、ＴＣＢフォーマットに変換した場合、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合するというその能力を保持し、クローンＰ０５７．０１１だけが、ＴＣＢフォーマットにおいて対応するＩｇＧの結合と比較してわずかに低減したＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合を示した（表５）。
Figure 2022028645000024
続いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの機能活性を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＤＫ－ＭＧ細胞のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイにおいて試験した（図１５）。すべての試験されたＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢが、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイにおいて活性を有していたのであり、Ｐ０５６．０２１が最も有力なもので、類似の活性を有していたＰ０５６．０２７、Ｐ０５６．０５２及びＰ０５７．０１２、並びに最も低い活性を有していたＰ０５７．０１１が続いた。次に、ＥＧＦＲｗｔに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの交差反応性を排除するために、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢを、ＤＫ－ＭＧ又はＭＫＮ－４５細胞のいずれかと共培養されたＰＢＭＣで、腫瘍細胞溶解アッセイにおいて試験した（図１６）。このアッセイにおいて、腫瘍細胞溶解とは別に、追加の読み出しとしてＴ細胞活性化（図１７）及びサイトカイン放出（図１８）を測定した。レポーター細胞アッセイにおいて既に見られたように、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０５６．０２１は、ＥＧＦＲｗｔ陽性細胞上でいかなる活性も有することなく、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞上で最も高い活性を有していた。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０５７．０１１は、ＥＧＦＲｗｔ細胞上で非特異的な活性を示し、したがって除外された。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０５６．０２７、Ｐ０５６．０５２及びＰ０５７．０１２は、比較可能な活性を有していた。これらの結果に基づき、ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０５６．０２１及びＰ０５７．０１２が、親和性成熟のさらなるラウンドのために選択された。
Ｐ０５７．０１２から良好なバインダを何も誘導することができなかった（結果を示していない）。Ｐ０５６．０２１から誘導された、選択されたＥＧＦＲｖＩＩＩバインダの、ＳＰＲにより測定されたＥＧＦＲｖＩＩＩに対する親和性及び特異性を、表６に示す。
Figure 2022028645000025
親和性成熟されたＥＧＦＲｖＩＩＩバインダ（Ｐ０６３．０５６（配列番号８８及び９２）、Ｐ０６４．０７８（配列番号９６及び１００）、Ｐ０６５．０３６（配列番号１０４及び１０８））をまた、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＭＫＮ－４５細胞上のＥＧＦＲｖＩＩＩへの特異的結合について、親バインダと比較した（図１９）。ＥＧＦＲｖＩＩＩへの親和性及び特異性に関して最も良好なＥＧＦＲｖＩＩＩバインダ、Ｐ０６３．０５６が、ＣＤ３バインダとしてＣＤ３ｏｒｉｇ又はＣＤ３ｏｐｔのいずれかを伴うＴＣＢフォーマットへの変換のために選択された。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０６３．０５６（ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇを伴う）の機能活性を、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＤＫ－ＭＧ及びＭＫＮ－４５細胞のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイにおいて親ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０５６．０２１と比較した（図２０）。３つすべてのＴＣＢが、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞の存在下でのみ、特異的なＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を誘導する。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０６３．０５６は、親ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ Ｐ０５６．０２１よりもわずかに高い活性を有していた。
（方法）
表面プラズモン共鳴
ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のＥＧＦＲｖＩＩＩに対する親和性を、ランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、２５°Ｃで、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で表面プラズモン共鳴によって測定した。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧを、ＣＭ５チップに固定化されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＧＬＡＬＡ）（本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第２０１７／０７２２１０号を参照されたい）を特異的に結合する抗体で、２５ｎＭで３０秒間捕捉した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥＣＤ ａｖｉ ｈｉｓ抗原（以下の実施例９を参照されたい）を、１２．４～１０００ｎＭの濃度、３０μｌ／分の流れで、すべてのフローセルを通して２００秒にわたって通した。解離相は、３００秒間監視され、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰへのスイッチングによってトリガされた。チップ表面を、１０ｍＭグリシンｐＨ２．０の３０秒間の２回の注射を使用して、毎サイクル後に再生した。容積屈折率の差は、基準フローセルから得られる応答を差し引くことによって訂正された。親和性定数を、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１：１ラングミュア結合へのフィッティングにより、動態速度定数から導出した。
特異性の決定のために、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＥＧＦＲｗｔ ＥＣＤ抗原を、ＣＭ５チップに固定化された抗ｈｉｓ（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、１００ｎＭで４０秒間捕捉した。６０秒間の１０ｍＭグリシンｐＨ２．０での再生の前に、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の５００ｎＭの６０秒間の単回注射を行った。５０を超える反応単位が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合について観察された。５反応単位（ＲＵ）を超える反応が、ＥＧＦＲｗｔ結合について陽性と考えられ、ＩｇＧは、ＥＧＦＲｗｔについて５ＲＵ未満の反応で特異的と分類された。
細胞株
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ；Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）は、ＮＦＡＴプロモーターを伴うヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株であり、ヒトＣＤ３を発現する。細胞を、ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌ グルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１ｘ ＮＥＡＡ、１ｘ ピルビン酸ナトリウム中、１ｍｌあたり０．１～０．５ｍｉｏ細胞で培養した。最終濃度であるハイグロマイシンＢ １ｍｌあたり２００μｇを、細胞を継代するときにはいつでも添加した。
ＰＧＬＡＬＡ ＣＡＲを有するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞を、インハウスで生成した。元々の細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ，Ｓｉｇｎｏｓｉｓ）は、ＮＦＡＴプロモーターを伴うヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株であり、ヒトＣＤ３を介した活性化の際にルシフェラーゼ発現を引き起こす。それらは、Ｐ２９３Ｇ ＬＡＬＡ変異を認識することができるキメラ抗原受容体を発現するように操作されていた。培養される時、細胞は、１０％ＦＣＳ及び１％グルタミンが補充されかつ１ｍｌあたり０．４～１．５ｍｉｏ細胞で維持されるＲＰＭＩ１６４０中で、懸濁物中で成長する。
ＣＨＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を、インハウスで生成した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩで安定して形質導入された。細胞を、５％ＦＣＳ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ及び６μｇ／ｍｌ ピューロマイシンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。
ＤＫ－ＭＧ（ＤＳＭＺ＃ＡＣＣ ２７７）は、ヒト膠芽腫細胞株である。ＤＫ－ＭＧ細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現のために細胞ソーティングによって富まされた。細胞を、ＲＰＭＩ１８６０、１０％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸで培養した。
Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１４）は、ＥＧＦＲｖＩＩＩで安定して形質導入されたヒト膠芽腫細胞株である。細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸで培養した。
ＭＫＮ－４５（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４０９）は、高レベルのＥＧＦＲｗｔを発現する、ヒト胃腺癌細胞である。細胞を、２％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸを含有する高度ＲＰＭＩ１６４０で培養した。
フローサイトメトリーによる標的結合
結合実験に使用した細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。抗体染色を、９６ウェル丸底プレート内で行った。細胞を採取し、カウントし、１ウェルあたり１０００００～２０００００細胞を播種した。プレートを４分間４００ｘｇで遠心分離し、上清を取り除いた。試験抗体をＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、抗体溶液２０μｌを４°Ｃで３０分間、細胞に添加した。未結合の抗体を除去するため、希釈された二次抗体ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９－１１６－１７０又は＃１０９－１１６－０９８）の添加前に細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。４°Ｃで３０分のインキュベーションの後、未結合の二次抗体を洗い流した。測定の前に、細胞を２００μｌ ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ又はＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用してフローサイトメトリーによって分析した。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧを用いたＣＡＲ Ｊ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイ
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＰＧＬＡＬＡ ＩｇＧのＴ細胞活性化を誘導する有効性を、ＣＡＲ Ｊ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイを使用して評価した。アッセイの原理は、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ操作されたエフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）を、腫瘍抗原を発現する癌細胞と共培養することである。ＩｇＧが、ＰＧＬＡＬＡ変異を介したＣＡＲと標的抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩとに同時に結合する際にのみ、ＮＦＡＴプロモーターは、活性化されて、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞内のルシフェラーゼ発現の増大を引き起こす。十分な基質が添加されると、活性ホタルルシフェラーゼは、ＣＡＲ媒介活性化のシグナルとして測定されることができる、発光の放出を引き起こす。手短に述べれば、標的細胞を、採取し、生存度を決定した。アッセイの開始の前日に、平底、白壁の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ，＃６５５０９８）内で、１００μｌ培地に３００００標的細胞／ウェルをプレートした。次の日に、培地を取り除き、２５μｌ／ウェルの希釈した抗体又は培地（対照のため）を、標的細胞に添加した。続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を採取し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存度を評価した。細胞を、１．５ｍｉｏ細胞／ｍｌで細胞培地内で再懸濁し、７５０００細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）で腫瘍細胞に添加し、最終エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比２．５：１、及び１ウェルあたり最終体積７５μｌを得た。次いで、４μｌのＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｅ１２９１）を、各ウェルに添加した（終了体積の２％）。細胞を、加湿したインキュベータ内において３７°Ｃで２４時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、プレートを室温に適合させた（約１５分）。次いで、２５μｌ／ウェルのＯｎｅ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｅ６１２０）を添加し、ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋを使用して発光を検出する前に、プレートを１５分間暗闇でインキュベートした。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢを用いたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイ
改良されたＣＤ３又は元々のＣＤ３バインダのいずれかを伴うＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの、Ｔ細胞架橋及び続いてＴ細胞活性化を誘導する能力を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞及びＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を使用して評価した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢが、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性標的細胞及びＣＤ３抗原（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞上に発現された）に同時に結合する際、ＮＦＡＴプロモーターが、活性化されて、活性ホタルルシフェラーゼの発現を引き起こす。（ルシフェラーゼ基質の添加の際に得られる）発光シグナルの強度は、ＣＤ３活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。アッセイのために、標的細胞を採取し、生存度を決定した。平底、白壁の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ，＃６５５０９８）内で、１００μｌ培地に３００００標的細胞／ウェルをプレートし、５０μｌ／ウェルの希釈された抗体又は培地（対照のため）を、標的細胞に添加した。続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を採取し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存度を評価した。細胞を、１．２ｍｉｏ細胞／ｍｌで細胞培地内でハイグロマイシンＢなしで再懸濁し、６００００細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）で腫瘍細胞に添加し、最終エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比２：１、及び１ウェルあたり最終体積２００μｌを得た。次いで、４μｌのＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｅ１２９１）を、各ウェルに添加した（終了体積の２％）。細胞を、加湿したインキュベータ内において３７°Ｃで２４時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋを使用して発光を検出した。
Ｔ細胞媒介腫瘍細胞殺傷
標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて採取し、洗浄し、３００００細胞／ウェルの密度で平底９６ウェルプレートを使用してプレートした。細胞を、一晩付着したままにしておいた。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健康なヒトドナーからの新鮮血のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ８８８９）上で積層した。遠心分離（４５０ｘｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相より上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、続いてＰＢＳ ５０ｍｌで満たした。混合物を遠心分離（４００ｘｇ，１０分，室温）し、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離ステップ３５０ｘｇ，１０分）。結果として得られたＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、１０％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に３７°Ｃ、５％ＣＯ２で、細胞インキュベータ内で、さらに使用するまで保存した（２４時間より長くはない）。殺傷アッセイのために、抗体を、示される濃度で３連で添加した。ＰＢＭＣを、最終エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１０：１で標的細胞に添加した。標的細胞殺傷を、３７°Ｃ、５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーション後に、アポトーシス／ネクローシス細胞によって細胞上清内に放出されたＬＤＨの定量化により評価した（ＬＤＨ検出キット，Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，＃１１ ６４４ ７９３ ００１）。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００での標的細胞のインキュベーションによって達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性構築物を有しないエフェクター細胞と共インキュベートした標的細胞を基準とする。
ＴＣＢが媒介する標的細胞のＴ細胞殺傷の際のＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）及びＣＤ６９（早期活性化マーカー）を認識する抗体を使用してフローサイトメトリーによって評価した。４８時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０ｘｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＣＤ４ ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃３００５１４）、ＣＤ８ ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃３４４７０４）、ＣＤ２５ ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃３０２６３０）及びＣＤ６９ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃３１０９０６）についての表面染色を、供給元の指示に従って行った。細胞を、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（ＢＤ，＃５５４６５５）を使用して４°Ｃで１５分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。試料を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。
上清内のサイトカイン分泌を、製造元の指示に従ってサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）を使用して、フローサイトメトリーによって測定したが、５０μｌビーズ及び試料の代わりに２５μｌの上清及びビーズだけが使用された。以下のＣＢＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。ＣＢＡ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ（ＩＦＮγ）Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ、ＣＢＡ ｈｕｍａｎ Ｇｒａｎｚｙｍｅ ｓｓ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ及びＣＢＡ ｈｕｍａｎ ＴＮＦ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ。試料を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ又はＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して測定し、分析を、Ｄｉｖａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。
実施例９－最適化ＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体のＣＤ３及びＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合
組み換えＣＤ３への結合
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの組み換えＣＤ３への結合を、最適化された（ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔ）又は元々の（ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇ）ＣＤ３結合配列のいずれかを有するＴＣＢを使用してＳＰＲにより、上記でＴＹＲＰ１ ＴＣＢについて実施例５において説明した通りに評価した。捕捉抗体を、標準的なアミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ｐＨ５．０で約５２００共鳴単位（ＲＵ）の直接固定化によりセンサーチップ表面にカップリングし、ＴＣＢ分子を、３０秒間、２０ｎＭで、１０μｌ／分の流れで捕捉した。
ヒト及びカニクイザルＣＤ３への結合についてのＫＤ値は、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｐｔについてそれぞれ３０ｎＭ及び２０ｎＭとして決定され、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ ＣＤ３ｏｒｉｇのものに類似していた（それぞれ４０ｎＭ及び３０ｎＭ）。
これは、非ストレス条件下、ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＴＣＢの両方が、組み換えＣＤ３に比較的良く結合されることを示している。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの組み換えヒトＣＤ３への結合はまた、最適化された又は元々のＣＤ３結合配列のいずれかを有するＴＣＢを使用して、３７°Ｃ又は４０°Ｃの１４日間の温度ストレス後に評価された。実験は、ＩｇＧ分子の代わりにＴＣＢを使用して、上記実施例２で説明した通りに行われた。
この実験の結果を図２１に示す。
図２１で見ることができるように、最適化ＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｐｔを含むＴＣＢは、元々のＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｒｉｇを含むＴＣＢと比較して、ストレス（３７°Ｃ、ｐＨ７．４で２週間）後、ＣＤ３への強く改善された結合を示した。この結果は、最適化ＣＤ３バインダの改善された特性（実施例２を参照されたい）が、ＴＣＢレベルで維持されることを再び裏付ける。
組み換えＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの組み換えＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合を、ＳＰＲにより評価した。
ＳＰＲ実験は、ランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。
抗Ｆｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ｐＨ５．０で、標準的なアミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＣＭ５センサーチップ上に直接カップリングした。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ（５ｎＭ）を、１０μｌ／分の流量で３０秒間捕捉した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原の３倍希釈系列を、３０μｌ／分で２００秒間フローセルに通し、会合相を記録した。解離相は、３００秒間監視され、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰへのスイッチングによってトリガされた。チップ表面を、３Ｍ ＭｇＣＬ２の３０秒間の２０μｌ／分の１回の注射を使用して、毎サイクル後に再生した。
使用された抗原は、Ｃ末端のＡｖｉ－ｔａｇ及びＨｉｓ－ｔａｇに融合された、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩの細胞外ドメインを含む（ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥＣＤ ａｖｉ ｈｉｓ；配列番号３６）。
容積屈折率の差は、基準フローセル（ＴＣＢは全く捕捉されなかった）から得られる応答を差し引くことによって訂正された。親和性定数（ＫＤ）を、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１：１ラングミュア結合へのフィッティングにより、動態速度定数から導出した。見かけ上の結合力定数（ａｖｉｄｉｔｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）ＫＤを、この２：１相互作用への１：１結合フィッティングを使用して、速度定数を介して、動態分析によって近似的に求めた。
ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合のＫＤ値（親和性）を、ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの両方について６ｎＭと決定した。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの組み換えＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合はまた、最適化された又は元々のＣＤ３結合配列のいずれかを有するＴＣＢを使用して、３７°Ｃ又は４０°Ｃの１４日間の温度ストレス後に評価された。実験は、抗原としてＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＥＣＤ ａｖｉ ｈｉｓを使用して、上記実施例５で説明した通りに行われた。
この実験の結果を図２２に示す。これらは、両方のＴＣＢについてのヒトＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合が、ストレス条件による影響を受けないことを裏付ける。
Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３への結合
上記実施例２で説明した通りの、最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」又は元々のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢについて、ヒトレポーターＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ上のＣＤ３への結合は、ＦＡＣＳによって決定された。
図２３に示すように、最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」又は元々のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」のいずれかを含むＴＣＢは、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３に比較的良く結合した。
Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞上のＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合
ＣＤ３ｏｐｔ若しくはＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを伴うＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０６３．０５６又はＣＤ３ｏｒｉｇを伴うＥＧＦＲｖＩＩＩクローンＰ０５６．０２１を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢについて、ヒト膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ上のＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合は、ＦＡＣＳによって測定された。ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０６３．０５６は、ＩｇＧフォーマットにも含まれていた。
図２４に示すように、３つすべてのＴＣＢが、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞上に発現されるＥＧＦＲｖＩＩＩに、高い親和性をもって結合するのであり、結合は、ＴＣＢフォーマットへの変換によって損なわれることはない。
実施例１０－最適化ＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体の機能活性
ＣＤ３活性化
選択されたＥＧＦＲｖＩＩＩバインダ（Ｐ０６３．０５６）及び最適化ＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔ又は元々のＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢを、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性膠芽腫細胞ＤＫ－ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ－ｈｕＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＥＧＦＲｗｔ陽性ＭＫＮ４５細胞の存在下で、上記実施例８で説明した通りにＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイで試験した。
ＩｇＧ（実施例３）の場合に見られるように、ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＴＣＢの両方が、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞上で類似の機能活性を有しており、濃度に依存する態様でＣＤ３活性化を誘発した（図２０）。
標的細胞殺傷
選択されたＥＧＦＲｖＩＩＩバインダ（Ｐ０６３．０５６）及び最適化ＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔ又は元々のＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢを、膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＰＢＭＣの存在下で、上記実施例８で説明した通りに腫瘍細胞殺傷試験で、親ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０５６．０２１及びＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢと比較した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞上で見られるように、ＣＤ３ｏｐｔ又はＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを伴うＴＣＢの機能活性は、ＣＤ６９アップレギュレーションにより測定される腫瘍細胞溶解の誘発並びにＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化に関して類似する（図２５）。
加えて、ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０６３．０５６及び最適化ＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔを「２＋１フォーマット」（図６に示す通り）で伴うＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの機能活性を、同じＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＣＤ３バインダを「１＋１ ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌフォーマット」（図１Ｇに概略的に示す）で伴うＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢと比較した。これら２つのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢを、膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩを用いて、実施例８で説明した通りにＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイで、及び腫瘍細胞殺傷アッセイで試験した。２＋１フォーマットのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢは、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイ（図２６）で測定されたＣＤ３活性化とＰＢＭＣを用いた殺傷アッセイ（図２７）における腫瘍細胞殺傷の誘発及びＴ細胞活性化との両方で優れた機能活性を有していた。
実施例１１－最適化ＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体の機能的特徴付け
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによるＴ細胞増殖及び活性化
選択されたＥＧＦＲバインダ（Ｐ０６３．０５６）及び最適化ＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔ又は元々のＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇのいずれかを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの機能活性を、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞上のＴ細胞増殖アッセイにおいて、親ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０５６．０２１及びＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢと比較した（図２８）。３つすべてのＴＣＢが、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の強力な増殖及び活性化を誘導した。ＣＤ３ｏｐｔを伴うＰ０６３．０５６ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢは、他の２つのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢよりも高い活性を有していた。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢによる腫瘍細胞溶解
次に、選択されたＥＧＦＲバインダ（Ｐ０６３．０５６）及び最適化ＣＤ３バインダＣＤ３ｏｐｔを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ、並びに親ＥＧＦＲｖＩＩＩバインダＰ０５６．０２１及びＣＤ３バインダＣＤ３ｏｒｉｇを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢを、ＤＫ－ＭＧ細胞と共培養されたＰＢＭＣで、腫瘍細胞溶解アッセイにおいて試験した（図２９）。このアッセイにおいて、腫瘍細胞溶解とは別に、追加の読み出しとしてＴ細胞活性化及びサイトカイン放出を測定した。既に見られたように、ＣＤ３ｏｐｔを伴うＰ０６３．０５６ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢは、腫瘍細胞溶解、Ｔ細胞活性化並びにＩＦＮγ及びＴＮＦαの放出に関して、ＣＤ３ｏｒｉｇを伴うＰ０５６．０２１ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢよりも高い活性を有していた。
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢによるＴ細胞活性化及び腫瘍細胞溶解
サイトカイン放出を誘導するＴＹＲＰ１ ＴＣＢの機能特性を、原発性黒色腫細胞株Ｍ１５０５４３と健康なドナーから単離されたＰＢＭＣとの共培養によって試験した。ＴＹＲＰ１ ＴＣＢを介してＴ細胞が媒介する腫瘍細胞溶解を、処理の２４時間及び４８時間後に分析した（図３０）。上清内へのＩＦＮγ及びＴＮＦαの放出、並びにＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞活性化を、処理の４８時間後に分析した。ＴＹＲＰ１ ＴＣＢは、２４時間後に既に、強力な腫瘍細胞溶解を誘導することができた。これには、ＣＤ２５のアップレギュレーション並びにＩＦＮγ及びＴＮＦαの著しい放出によって測定された、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の強力な活性化が伴った。
（方法）
ＰＢＭＣ単離
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健康なヒトドナーからの新鮮血のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ８８８９）上で積層した。遠心分離（４５０ｘｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相より上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、続いてＰＢＳ ５０ｍｌで満たした。混合物を遠心分離（４００ｘｇ，１０分，室温）し、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離ステップ３５０ｘｇ，１０分）。結果として得られたＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、１０％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に３７°Ｃ、５％ＣＯ２で、細胞インキュベータ内で、さらに使用するまで保存し（２４時間より長くはない）、又はさらに使用するまで液体窒素中で冷凍して保存した。使用の前日に、冷凍したＰＢＭＣを解凍し、培地中で３７°Ｃで一晩培養した。
Ｔ細胞増殖
手短に述べれば、標的細胞を採取し、カウントし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中で１ｍｌあたり５ｍｉｏ細胞で再懸濁した。細胞を、細胞増殖染料ｅＦｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，＃６５－０８４０－８５）で、５μＭの最終濃度で１０分間３７°Ｃで染色した。染色反応を停止するために、４ボリュームの冷たい細胞培養完全培地（ｃｏｌｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）を細胞懸濁物に添加し、５分間４°Ｃでインキュベートし、次いで培地で３回洗浄した。標識された標的細胞を、カウントし、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭａｘ中で１ｍｌあたり０．１ｍｉｏ細胞に調節した。１ウェルあたり１０，０００標的細胞を、９６ウェルプレートに播種した。次いで、処置剤を、示される濃度で添加し、終わりに、健康なドナーから単離された１００，０００ＰＢＭＣを、１ウェルあたり添加した。細胞を、３７°Ｃで５日間インキュベートし、次いでＰＢＭＣを、採取し、ＣＤ３ ＢＵＶ３９５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃５６３５４８）、ＣＤ４ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃３００５０８）、ＣＤ８ ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃３４４７２２）、ＣＤ２５ ＰＥ／Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃３０２６１２）で染色した。増殖を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定されたＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞中のｅＦｌｕｏｒ６７０染料の希釈によって決定し、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を、ＣＤ２５アップレギュレーションを測定することにより決定した。
Ｔ細胞媒介腫瘍細胞殺傷
標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて採取し、洗浄し、３００００細胞／ウェルの密度で平底９６ウェルプレートを使用してプレートした。細胞を、一晩付着したままにしておいた。殺傷アッセイのために、抗体を、示される濃度で３連で添加した。ＰＢＭＣを、最終エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１０：１で標的細胞に添加した。標的細胞殺傷を、３７°Ｃ、５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーション後に、アポトーシス／ネクローシス細胞によって細胞上清内に放出されたＬＤＨの定量化により評価した（ＬＤＨ検出キット，Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，＃１１ ６４４ ７９３ ００１）。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００での標的細胞のインキュベーションによって達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性構築物を有しないエフェクター細胞と共インキュベートした標的細胞を基準とする。
Ｔ細胞活性化
ＴＣＢが媒介する標的細胞のＴ細胞殺傷の際のＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）及びＣＤ６９（早期活性化マーカー）を認識する抗体を使用してフローサイトメトリーによって評価した。４８時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０ｘｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＣＤ４ ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃３００５１４）、ＣＤ８ ＦＩＴＣ（＃３４４７０４，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５ ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃３０２６３０）及びＣＤ６９ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃３１０９０６）についての表面染色を、供給元の指示に従って行った。細胞を、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（ＢＤ，＃５５４６５５）を使用して４°Ｃで１５分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。試料を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。
サイトカイン分泌
上清内のサイトカイン分泌を、製造元の指示に従ってサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）を使用して、フローサイトメトリーによって測定したが、５０μｌビーズ及び試料の代わりに２５μｌの上清及びビーズだけが使用された。以下のＣＢＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。ＣＢＡ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ（ＩＦＮγ）Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ及びＣＢＡ ｈｕｍａｎ ＴＮＦ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ。試料を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ又はＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して測定し、分析を、Ｄｉｖａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。
実施例１３－最適化ＣＤ３バインダを含むＴ細胞二重特異性抗体のインビボ有効性
ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ（実施例１で同定された最適化ＣＤ３バインダを含む）を、その抗腫瘍有効性について、ヒト腫瘍細胞株の異種移植マウスモデル、ＩＧＲ－１黒色腫異種移植モデルにおいて試験した。
ＩＧＲ－１細胞（ヒト黒色腫）を、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭ培地で培養した。５％ＣＯ２で、水飽和した雰囲気中、３７°Ｃで細胞を培養した。移植のために継代６を使用した。細胞生存度は、９６．７％であった。１動物あたり２×１０６細胞を、１００μｌのＲＰＭＩ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）内で、マウスの脇腹内へ、１ｍｌツベルクリンシリンジ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して皮下に注入した。
完全にヒト化されたＮＳＧ雌マウス（Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、委ねられたガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間光／１２時間暗闇のデイリーサイクルで、特定病原体除去条件下で維持した。この実験研究プロトコルは、地方政府によって調査され、承認された（ＺＨ２２３／２０１７）。継続的な健康モニタリングは、定期的に行われた。
マウスは、研究において第０日に２×１０６のＩＧＲ－１細胞を皮下に注入され、ランダム化され、重さを量られた。腫瘍細胞注入（腫瘍体積＞２００ｍｍ３）後２０日に、マウスは、毎週２回で５週間、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）ＴＹＲＰ１ ＴＣＢを静脈内に注入された。すべてのマウスは、２００μｌの適切な溶液を静脈内に注入された。ビヒクル群のマウスは、ヒスチジン緩衝液を注入され、処置群のマウスは、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢ構築物を注入された。２００μｌあたり適切な量の抗体を得るために、必要な場合にストック溶液をヒスチジン緩衝液で希釈した。腫瘍サイズを、キャリパーで週に３回測定し、ｍｍ３の体積＋／－ＳＥＭとしてＧｒａｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアでプロットした。ＪＭＰ１２ソフトウェアで統計分析を行った。
図３１は、腫瘍成長抑制に関して、ＴＹＲＰ１ ＴＣＢがビヒクル群と比較して著しい有効性を媒介したことを示す（６８％ＴＧＩ，ｐ＝０．００５８＊）。
ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ（実施例１で同定された最適化ＣＤ３バインダを含む）を、その抗腫瘍有効性について、ヒト腫瘍細胞株の異種移植マウスモデル、Ｕ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩ膠芽腫異種移植モデルにおいて同様に試験した。
Ｕ８７細胞（ヒト膠芽腫）は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＵＳＡ）から最初に得られ、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を発現するように安定してトランスフェクトされた（Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。拡張後、細胞をＲｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｅｌｌ ｂａｎｋに預けた。Ｕ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞株を、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）及び０．５μｇ／ｍｌ ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ培地で培養した。５％ＣＯ２で、水飽和した雰囲気中、３７°Ｃで細胞を培養した。移植のために継代８を使用した。細胞生存度は、９４．７％であった。１動物あたり５×１０５細胞を、１００μｌのＲＰＭＩ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）内で、マウスの脇腹内へ、１ｍｌツベルクリンシリンジ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して皮下に注入した。
完全にヒト化されたＮＳＧ雌マウス（Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、委ねられたガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間光／１２時間暗闇のデイリーサイクルで、特定病原体除去条件下で維持した。この実験研究プロトコルは、地方政府によって調査され、承認された（ＺＨ２２３／２０１７）。継続的な健康モニタリングは、定期的に行われた。
マウスは、研究において第０日に５×１０５のＵ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を皮下に注入され、ランダム化され、重さを量られた。腫瘍細胞注入（腫瘍体積＞２００ｍｍ３）後２週間に、マウスは、毎週２回で３週間、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢを静脈内に注入された。すべてのマウスは、２００μｌの適切な溶液を静脈内に注入された。ビヒクル群のマウスは、ヒスチジン緩衝液を注入され、処置群のマウスは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢ構築物を注入された。２００μｌあたり適切な量の抗体を得るために、必要な場合にストック溶液をヒスチジン緩衝液で希釈した。腫瘍サイズを、キャリパーで週に３回測定し、ｍｍ３の体積＋／－ＳＥＭとしてＧｒａｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアでプロットした。
図３２は、腫瘍成長制御に関して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢが著しい有効性を媒介し、すべてのマウスが完全寛解を達成したことを示す。
実施例１２－マウスにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢでのＰＫ研究
最適化ＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｐｔを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの薬物動態（ＰＫ）を、ヒトＦｃＲｎトランスジェニック（ｌｉｎｅ３２，ホモ）及びＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスへの１ｍｇ／ｋｇでの静脈内ボーラス投与を追って研究した。一連の血液マイクロサンプルを、ヒトＦｃＲｎトランスジェニック（ｔｇ）マウス及びＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスから６７２時間まで（投薬後５分から６７２時間までマウス１匹あたり９つの試料）取った。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢで処置したマウス血清の試料を、ｎｏｎ－ＧＬＰ条件の下で、特異的な酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して分析した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢの捕捉を、ストレプトアビジン－被覆されたマイクロタイタープレート（ＳＡ－ＭＴＰ）上で、ビオチン化ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原（ｈｕＥＧＦＲｖＩＩＩ ｈｉｓ ｂｉｏｔｉｎ）を用いて行った。結合されたＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢを、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＧＬＡＬＡ）（実施例３を参照されたい）に対するジゴキシゲニン標識されたモノクローナル抗体を用いて検出し、続いて抗ジゴキシゲニン－ＰＯＤ二次検出抗体を、添加した。シグナルを、ペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ）の添加により生成した。較正範囲は、２．３５ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌであり、２．５ｎｇ／ｍｌが、定量下限（ＬＬＯＱ）であった。
この研究の結果を表７に示す。ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＴＣＢのＰＫプロファイルは、両方の試験されたマウス株について予想範囲内である。これは、ＣＤ３バインダのＣＤＲの操作が、抗体クリアランスに影響するであろう、他の配列ライアビリティを引き起こさなかったことを示している。
Figure 2022028645000026
＊ ＊ ＊
上述の発明を、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によってある程度詳細に記載してきたが、その記載及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。

Claims (36)

  1. ＣＤ３に結合する抗体であって、前記抗体が、配列番号２の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３のＨＣＤＲ２、及び配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体。
  2. 前記ＶＨが、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む、及び／又は、前記ＶＬが、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. ＣＤ３に結合する抗体であって、配列番号７のＶＨ配列及び配列番号１１のＶＬ配列を含む第１の抗原結合ドメインを含む、抗体。
  4. 前記第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ分子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 第２の抗原結合ドメインと、任意選択的に、第２の抗原に結合する第３の抗原結合ドメインと、を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 前記第２の抗原結合ドメイン及び／又は、存在する場合、前記第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ分子である、請求項６に記載の抗体。
  8. 前記第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換わっているＦａｂ分子である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
  9. 前記第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、前記第３の抗原結合ドメインが、従来のＦａｂ分子である、請求項６～８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 前記第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、前記第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換され（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換され（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換され（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、請求項６～９のいずれか一項に記載の抗体。
  11. 前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインが、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合されている、請求項６～１０のいずれか一項に記載の抗体。
  12. 前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）前記第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、のいずれか一方である、請求項６～１１のいずれか一項に記載の抗体。
  13. 前記第１の抗原結合ドメイン、前記第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、前記第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ分子であり、前記抗体が、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、（ｉ）前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、前記第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）前記第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、のいずれか一方であり、かつ、存在する場合、前記第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、請求項６～１２のいずれか一項に記載の抗体。
  14. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項５～１３のいずれか一項に記載の抗体。
  15. 前記Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、請求項５～１４のいずれか一項に記載の抗体。
  16. 前記Ｆｃドメインが、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニット及び前記第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む、請求項５～１５のいずれか一項に記載の抗体。
  17. 前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合を低下させる、及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項５～１６のいずれか一項に記載の抗体。
  18. 前記第２の抗原が、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原である、請求項６～１７のいずれか一項に記載の抗体。
  19. 前記第２の抗原が、ＴＹＲＰ－１である、請求項６～１８のいずれか一項に記載の抗体。
  20. 前記第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、前記第３の抗原結合ドメインが、配列番号１５のＨＣＤＲ１、配列番号１６のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１９のＬＣＤＲ１、配列番号２０のＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のＬＣＤＲ３を含むＶＬと、を含む、請求項１９に記載の抗体。
  21. 前記第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、前記第３の抗原結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１９又は２０に記載の抗体。
  22. 前記第２の抗原が、ＥＧＦＲｖＩＩＩである、請求項６～１８のいずれか一項に記載の抗体。
  23. 前記第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、前記第３の抗原結合ドメインが、配列番号８５のＨＣＤＲ１、配列番号８６のＨＣＤＲ２、及び配列番号８７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号８９のＬＣＤＲ１、配列番号９０のＬＣＤＲ２、及び配列番号９１のＬＣＤＲ３を含むＶＬと、を含む、請求項２２に記載の抗体。
  24. 前記第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、前記第３の抗原結合ドメインが、配列番号８８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は、配列番号９２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項２２又は２３に記載の抗体。
  25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離ポリヌクレオチド。
  26. 請求項２５に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
  27. ＣＤ３に結合する抗体を産生する方法であって、（ａ）前記抗体の発現に好適な条件下で請求項２６に記載の宿主細胞を培養する工程と、任意選択的に、（ｂ）前記抗体を回収する工程と、を含む、方法。
  28. 請求項２７に記載の方法によって産生された、ＣＤ３に結合する抗体。
  29. 請求項１～２４又は２８のいずれか一項に記載の抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  30. 医薬として使用するための、請求項１～２４若しくは２８のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. がんの治療に使用するための、請求項１～２４若しくは２８のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物。
  32. 医薬の製造における、請求項１～２４若しくは２８のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物の使用。
  33. がんの治療のための医薬の製造における、請求項１～２４若しくは２８のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物の使用。
  34. 個体において疾患を治療する方法であって、前記個体に、有効量の請求項１～２４若しくは２８のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  35. 前記疾患が、がんである、請求項３４に記載の方法。
  36. 上記に記載する通りの発明。
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