JP2021533105A - 5−メチル−4−フルオロ−チアゾール−2−イル化合物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患の治療のための式Iの化合物の使用を提供する。【化1】
Description
本発明は、新規の5−メチル−4−フルオロ−チアゾール−2−イル化合物、この化合物を含む薬学的組成物、この化合物を使用して神経変性障害、例えば、アルツハイマー病(AD)を治療する方法、およびこの化合物の合成に有用な中間体およびプロセスに関する。
本発明は、AD、進行性核上麻痺(PSP)、および総称してタウオパチーとして既知のタウ媒介性神経変性症に関与する他の疾患および障害の治療の分野におけるものである。
ADは、世界中で何百万人もの患者を冒す破壊的な神経変性障害である。患者に一過性の症候的利益のみを提供する、市場で現在認可された薬剤の観点から、ADの治療には重大な対処されていないニーズがある。
神経原線維変化(NFT)および神経絨毛糸(NT)を生じさせる、対のらせん状フィラメント(PHF)および直線状またはねじれ状フィラメントのような、フィラメント状構造への微小管関連タンパク質タウのオリゴマー化は、ADおよび他のタウオパチーの決定的な病理学的特徴の1つである。ADに罹患している個体の脳内のNFTの数は、この疾患の重症度と密接に相関することが認められており、タウがニューロン機能障害および神経変性において重要な役割を担っていることを示唆している(Nelson et al.,J Neuropathol Exp Neurol.,71(5),362−381(2012))。より侵攻性の疾患経過を伴う症例は、進行がより遅い症例よりもより高いタウ負荷を有する点で、タウの病理は、PSPの疾患持続期間と相関することが示されてきた。(Williams et al.,Brain,130,1566−76(2007))。
過去の研究(Yuzwa et al.,Nat Chem Biol,4(8),483−490(2008))は、ADおよび関連するタウ媒介性神経変性障害の治療において、タウ過剰リン酸化および病理学的タウへの凝集を制限するためのO−GlcNAcase(OGA)阻害剤の治療可能性を支持する。より最近では、OGA阻害剤Thiamet−Gは、JNPL3タウマウスモデルにおける運動ニューロンの喪失を遅らせること(Yuzwa et al.,Nat Chem Biol,8,393−399(2012))、およびTg4510タウマウスモデルにおけるタウ病理およびジストロフィ性神経突起の低減(Graham et al.,Neuropharmacology,79,307−313(2014))と関連付けられてきた。したがって、OGA阻害剤は、過剰にリン酸化した病理形態のタウの蓄積を低減するための有効な治療アプローチとして認識されている。
WO2018/109198(A1)およびWO2018/109202(A1)は、ADおよびPSPなどのタウオパチーの治療に有用な特定のOGA阻害剤を開示している。さらに、US2016/0031871は、アルツハイマー病を治療するためのある特定のグリコシダーゼ阻害剤を開示している。
脳浸透性であるOGA阻害剤は、ADおよびPSPなどのタウ媒介性神経変性障害のための治療を提供することが望まれる。本発明は、OGAの強力な阻害剤である、特定の新規な化合物を提供する。さらに、本発明は、ADおよびPSPなどのタウオパチーを効果的に治療するのに十分に脳浸透性である可能性がある、OGAの強力な阻害剤である特定の新規化合物を提供する。
本発明はまた、有効量の式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩を、患者に投与することを含む、そのような治療を必要とするアルツハイマー病の患者を治療する方法を提供する。
本発明は、軽度認知障害からアルツハイマー病への進行を予防することを必要とする患者においてそれを行う方法であって、患者に、有効量の式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法をさらに提供する。
本発明はまた、有効量の式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩を、患者に投与することを含む、そのような治療を必要とする進行性核上麻痺の患者を治療する方法を提供する。本発明はまた、有効量の式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩を、患者に投与することを含む、タウ媒介性神経変性障害の患者を治療する方法を提供する。
さらに、本発明は、療法における使用、特に、アルツハイマー病の治療における使用、または軽度認知障害のアルツハイマー病への進行の予防における使用のための、式Iの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。加えて、本発明は、進行性核上麻痺の治療における使用のための、式Iの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。本発明はまた、タウ媒介性神経変性障害の治療における使用のための式Iの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
またさらに、本発明は、アルツハイマー病の治療のため、または軽度認知障害のアルツハイマー病への進行の予防のための医薬の製造に、式Iの化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。加えて、本発明は、進行性核上麻痺の処置治療のための医薬の製造に、式Iの化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。本発明はまた、タウ媒介性神経変性障害の治療のための医薬の製造に、式Iの化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
本発明はさらに、式Iの化合物、またはその薬学的に許容される塩を、1種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、薬学的組成物を提供する。本発明はさらに、式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩を、1種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、薬学的組成物を調製するためのプロセスを提供する。
軽度認知障害は、経時的に軽度認知障害からアルツハイマー病までを呈する患者の臨床所見および進行に基づき、アルツハイマー病と関連した認知症の潜在的な前駆期として定義されている。「軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を予防する」という用語は、患者における軽度認知障害のアルツハイマー病への進行を抑制すること、遅延させること、停止させること、または回復させることを含む。
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療すること」という用語は、既存の症状または障害の進行または重症度を抑制すること、遅延させること、停止させること、または回復させることを含む。
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、ヒトを指す。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、患者に単回または複数回投与すると、診断中または治療中の患者に所望の効果を提供する、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の量または投与量を指す。
当業者は、公知の技術を用いて、類似の状況下で得られた結果を観察することにより、有効量を決定することができる。患者のための有効量を決定する際には、患者の人種;患者の大きさ、年齢、および健康状態全般;関与する特定の疾患または障害;疾患または障害の関与度または重症度の程度;個々の患者の応答;投与される特定の化合物;投与の様式;投与される調製物の生物学的利用能特性;選択された投薬計画;併用薬の使用;ならびに他の関連する状況を含むがこれらに限定されない、多数の要因が考慮される。本発明の化合物は、体重1kgあたり約0.1〜約15mgの範囲内に入る1日当たりの投薬量で有効である。
本発明の化合物は、本化合物を生物学的に利用可能にする、いずれかの経路によって投与される薬学的組成物として製剤化される。好ましくは、そのような組成物は経口投与用である。このような薬学的組成物およびこれを調製するためのプロセスは、当技術分野で周知である(例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,L.V.Allen,Editor,22nd Edition,Pharmaceutical Press,2012を参照されたい)。
式Iの化合物およびその薬学的に許容される塩は、本発明の治療方法において特に有用であり、特定の配置が好ましい。本発明の化合物の以下のリストは、そのような配置について説明する。これらの選好が、本発明の治療方法および化合物の両方に適用可能であることが理解されるであろう。
ピペリジン環上のメチルおよび酸素置換基がシスまたはトランス立体配置にある式Iの化合物、またはその薬学的に許容される塩は、本発明の範囲内に含まれ、シス立体配置が好ましい。例えば、当業者は、以下のスキームAに示すように、ピペリジン環上の2位のメチルが4位の酸素に対してシス配置にあることを理解するであろう。
本発明は、全ての個々のエナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびにラセミ体を含む上述の化合物のエナンチオマーの混合物を企図するが、式Iaの化合物およびその薬学的に許容される塩が特に好ましい。
当業者は、個々のエナンチオマーを、本発明の化合物の合成における任意の好都合な時点で、選択的結晶化技術、キラルクロマトグラフィ(例えば、J.Jacques,et al.、「Enantiomers,Racemates,and Resolutions」、John Wiley and Sons,Inc.,1981、およびE.L.ElielおよびS.H.Wilen、「Stereochemistry of Organic Compounds」、Wiley−Interscience、1994を参照されたい)、または超臨界流体クロマトグラフィ(SFC)(例えば、T.A.Berger;「Supercritical Fluid Chromatography Primer」、Agilent Technologies、2015年7月を参照されたい)のような方法によって分離または分割し得る。
本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、当技術分野で周知の標準的な条件下で、本発明の化合物の適切な遊離塩基および適切な薬学的に許容される酸の、好適な溶媒中での反応によって形成され得る。例えば、Gould,P.L.,“Salt selection for basic drugs,”International Journal of Pharmaceutics,33:201−217(1986)、Bastin,R.J.,et al.“Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities,”Organic Process Research and Development,4:427−435(2000)、およびBerge,S.M.,et al.,“Pharmaceutical Salts,”Journal of Pharmaceutical Sciences,66:1−19,(1977)を参照されたい。
本発明の化合物またはその塩は、当業者に既知の種々の手順によって調製することができ、そのうちのいくつかを、以下のスキーム、調製物、および実施例で例示する。以下のスキームにおける各ステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィ、濾過、粉砕、および結晶化を含む、当技術分野で周知の従来の方法によって回収することができる。以下のスキームにおいて、すべての置換基は、別途指示のない限り、すでに定義されたとおりである。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。本発明の範囲を限定することなく、以下のスキーム、調製物、および実施例を、本発明をさらに例示するために提供する。さらに、当業者は、当業者が調製することができる、対応する所望の立体化学的配置を有する出発材料または中間体を使用することによって、式Iの化合物を調製し得ることを理解する。
特定の略語は次のように定義される。「ACN」はアセトニトリルを指す。「Ac」はアセチルを指す。「AcOH」は酢酸を指す。「Ac2O」は無水酢酸を指す。「BOC」はtert−ブトキシカルボニルを指す。「CAS番号」はケミカルアブストラクト登録番号を指す。「DCM」は、塩化メチレンまたはジクロロメタンを指す。「DIPEA」はジイソプロピルエチルアミンを指す。「DMEA」はジメチルエチルアミンを指す。「DMF」はN,N−ジメチルホルムアミドを指す。「DMSO」はジメチルスルホキシドを指す。「EDTA」は、エチレンジアミン四酢酸を指す。「ES/MS」はエレクトロスプレー質量分析を指す。「EtOAc」は酢酸エチルを指す。「EtOH」はエタノールまたはエチルアルコールを指す。「h」は時間(複数可)を指す。「IPA」はイソプロパノールまたはイソプロピルアルコールを指す。「IPAm」はイソプロピルアミンを指す。「LiHMDS」はリチウムビス(トリメチルシリル)アミドを指す。「KOtBu」はカリウム−tert−ブトキシドを指す。「Me」はメチルを指す。「MTBE」はメチル−tert−ブチルエーテルを指す。「min」は分(複数可)を指す。「NaOtBu」はナトリウム−tert−ブトキシドを指す。「n−BuLi」はn−ブチルリチウムを指す。「OAc」はアセテートまたはアセトキシを指す。「RT」は室温を指す。「SCX」は選択的カチオン交換を指す。「SFC」は超臨界流体クロマトグラフィを指す。「TEA」はトリエチルアミンを指す。「TFA」はトリフルオロ酢酸を指す。「THF」はテトラヒドロフランを指す。「TMA」はトリメチルアミンを指す。「TMEDA」はテトラメチルエチレンジアミンを指す。「Tris」は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンまたは2−アミノ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジオールを指す。「[α]D 20」は、20℃、589nmでの特定の光学回転を指し、ここで、cはg/mL単位での濃度である。
スキーム1は、5−[[(2S,4S)−2−メチル−4−ピペリジル]オキシ]ピラジン−2−カルボニトリルの合成を示す。求核芳香族置換は文献でよく知られている。したがって、スキーム1、ステップAにおいて、約1当量のtert−ブチル(2S,4S)−4−ヒドロキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラート(CAS番号790667−99−1)および約1.5当量の5−クロロピラジン−2−カルボニトリル(CAS番号36070−75−4)をTHFまたは1,4−ジオキサンなどの適切な有機溶媒に溶解し、これをNaH、NaOtBu、またはKOtBuなどの約2当量の適切な塩基で、約0℃で約60分間、処理してもよい。得られた反応混合物を約3〜12時間撹拌しつつ、RTまで温めてもよい。得られた反応生成物を、抽出、沈殿および濾過などの当技術分野で周知の技術によって単離し得る。例えば、反応混合物は、飽和塩化アンモニウム水溶液と、DCM、MTBE、またはEtOAcなどの好適な有機溶媒で希釈されてもよく、層を分離してもよく、有機抽出物は、飽和NaClで洗浄してもよく、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮してもよい。得られた残渣を約10%MTBE/ヘプタン中で合わせ、約45℃に約30分間加熱し、撹拌しながらRTに冷却してもよい。得られた固体を濾過により収集して、スキーム1、ステップAの生成物であるtert−ブチル(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラートを得てもよい。あるいは、抽出後の粗生成物を、有機溶媒の適切な混合物、例えば1:0から0:1のイソヘキサン:EtOAcを使用して、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィによって単離して、クロマトグラフィ画分の蒸発後、スキーム1、ステップAの生成物を得てもよい。
BOC保護基の除去は、当技術分野で十分に説明されている。したがって、スキーム1のステップAの生成物である約1当量のtert−ブチル(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラートを、DCMなどの適切な有機溶媒に溶解し、極性非プロトン性溶媒(例えば、1,4−ジオキサン、またはTFA)中、無溶媒、または極性有機溶媒中、過剰な酸溶液(例えば、MeOH、EtOH、またはiPrOHなどのアルコール溶媒中のHCl、HClで、約0℃からRTで約0.1〜8時間、処理してもよい。反応生成物を、抽出、沈殿および濾過などの当技術分野で周知の技術によって単離し得る。例えば、反応混合物を、DCM、2−メチルテトラヒドロフラン、MTBE、またはそれらの混合物などの適切な有機溶媒の混合物と水との混合物の間で分配されてもよく、層を分離してもよく、水性抽出物を、例えばNaOH、KOH、またはNa2CO3などの適切な水性塩基で中和してもよい。塩基性水性混合物を、DCMなどの適切な有機溶媒で抽出してもよく、層を分離してもよく、有機抽出物を減圧下で濃縮してもよい。得られた残渣を、約10%シクロペンチルメチルエーテル/ヘプタンの混合物中で加熱し、約45℃に約30分間加熱し、RTで約30分間撹拌してもよい。得られた固体を濾過により収集して、スキーム1、ステップBの生成物である5−[[(2S,4S)−2−メチル−4−ピペリジル]オキシ]ピラジン−2−カルボニトリルを得てもよい。さらに、当業者は、対応するHCl塩を、スキーム1のステップAの生成物であるtert−ブチル(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラートを上述の有機溶媒中のHClで処理することによって得られてもよく、続いて減圧下で溶媒を蒸発させ、5−[[(2S,4S)−2−メチル−4−ピペリジル]オキシ]ピラジン−2−カルボニトリルのHCl塩を得てもよい。
スキーム2は、式1aの化合物の調製を示している。当技術分野でよく理解されているように、置換アミンと芳香族アルデヒドとの間の還元的アミノ化は、様々な条件下で達成され得る。例えば、約1当量のN−(4−フルオロ−5−ホルミル−チアゾール−2−イル)アセトアミドおよび約1当量の5−[[(2S,4S)−2−メチル−4−ピペリジル]オキシ]ピラジン−2−カルボニトリル(または対応するHCl塩)を、EtOAc、EtOHまたはDCMなどの適切な有機溶媒に溶解し、さらに、約3当量の適切な非求核性有機アミン(例えばDIPEAまたはピリジン)を含有するものを、約RTから30℃で約1.5時間〜18時間、約3当量の適切な水素化ホウ素、例えば、Na(OAc)3BHで処理してもよい。反応生成物を、濾過、抽出、クロマトグラフィおよび沈殿/濾過などの当技術分野で周知の技術によって単離し得る。例えば、反応混合物を飽和Na2CO3水溶液でクエンチし、EtOAcなどの適切な極性有機溶媒で抽出してもよく、有機層を分離してもよく、有機抽出物を減圧下で濃縮してもよい。得られた残渣を、約1:0から95:5のiPrOH/DCM、または約1:0から1:1のヘキサン:約10%MeOHを含有するEtOAcで溶出しつつ、シリカゲルでの順相フラッシュクロマトグラフィに供し、溶媒を蒸発した後、残渣を得る。残渣を約1:1のEtOH/ヘプタンに溶解し、約50℃に約30分間加熱し、RTで約10〜30分間撹拌してもよい。得られた固体を濾過により収集して、N−[5−[[(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−1−ピペリジル]メチル]−4−フルオロ−チアゾール−2−イル]アセトアミド(式Ia)を得てもよい。
調製例および実施例
以下の調製例および実施例は、本発明をさらに説明し、本発明の化合物の典型的な合成を表す。試薬および出発材料は、当業者によって容易に入手可能であるか、または容易に合成され得る。調製例および実施例は、限定ではなく例示として示され、当業者により種々の変更が行われ得ることを理解されたい。
以下の調製例および実施例は、本発明をさらに説明し、本発明の化合物の典型的な合成を表す。試薬および出発材料は、当業者によって容易に入手可能であるか、または容易に合成され得る。調製例および実施例は、限定ではなく例示として示され、当業者により種々の変更が行われ得ることを理解されたい。
LC−ES/MSは、AGILENT(登録商標)HP1100液体クロマトグラフィシステムにおいて行われる。エレクトロスプレー質量分析測定(ポジティブおよび/またはネガティブモードで取得される)は、HP1100HPLCとインターフェース接続するMass Selective Detector四重極質量分析計で行われる。LC−MS条件(低pH):カラム:PHENOMENEX(登録商標)GEMINI(登録商標)NX C18 2.1×50mm 3.0μm、勾配:5〜100%Bで3分間、次に100%Bで0.75分間、カラム温度:50℃±10℃、流速:1.2mL/分、溶媒A:0.1%HCOOH含有脱イオン水、溶媒B:0.1%ギ酸含有ACN、波長214nm。代替LC−MS条件(高pH):カラム:XTERRA(登録商標)MS C18カラム2.1×50mm、3.5μm、勾配:5%の溶媒Aで0.25分間、勾配:5%〜100%の溶媒Bで3分間、および100%の溶媒Bで0.5分間、または10%〜100%の溶媒Bで3分間、および100%の溶媒Bで0.75分間、カラム温度:50℃±10℃、流速:1.2mL/分、溶媒A:10mMのNH4HCO3 pH9、溶媒B:ACN、波長:214nm。
調製例1
tert−ブチル(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラート
スキーム1、ステップA:tert−ブチル(2S,4S)−4−ヒドロキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラート(350mg、1.6mmol)およびTHF(10mL)の溶液に、0℃でKOtBu(274mg、2.4mmol)を一度に加え、混合物を45分間撹拌した。5−クロロピラジン−2−カルボニトリル(340mg、2.4mmol)を加え、混合物を、室温で12時間さらに撹拌しながら、45分かけてゆっくりと室温に温める。反応混合物を水(50mL)で希釈し、EtOAc(3mL×50)で抽出する。合わせた有機抽出物をMgSO4上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗油状物を得る。得られた残渣をDCMに溶解し、1:0から0:1のイソヘキサン:EtOAcの勾配で溶出しつつ、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィにより精製し、プールしたクロマトグラフィ画分の溶媒を蒸発させた後、表題化合物(205mg、収率40%)を得る。ES/MS(m/z):263(M+H−C4H9).
tert−ブチル(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラート
調製例1の代替手順
フラスコに、tert−ブチル(2S,4S)−4−ヒドロキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラート(40.1g、186mmol)、5−クロロピラジン−2−カルボニトリル(39.0g、279mmol)およびTHF(401mL)をRTで加える。反応混合物をNaCl/氷水浴(内部温度−5℃)中で撹拌し、添加中は内部温度を10℃未満に維持しつつ、混合物にNaOtBu(36.9g、372mmol)を10分かけて少しずつ加える。反応混合物をNaCl/氷水浴(内部温度−5℃)中で1時間撹拌し、飽和NH4Cl水溶液(300mL)および水(100mL)を5分かけて加える。混合物を分液漏斗に移し、MTBE(2×400mL)で抽出する。合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して残渣を得て、これを10%MTBE/ヘプタン(350mL)と合わせる。得られた混合物を45℃の加熱ブロック内で30分間激しく撹拌し、室温で30分間撹拌し、濾過する。濾過した固体を真空下40℃で乾燥させて、表題化合物を淡褐色の固体として得る(60g、99%を超える収率)。ES/MS(m/z):341(M+Na).
フラスコに、tert−ブチル(2S,4S)−4−ヒドロキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラート(40.1g、186mmol)、5−クロロピラジン−2−カルボニトリル(39.0g、279mmol)およびTHF(401mL)をRTで加える。反応混合物をNaCl/氷水浴(内部温度−5℃)中で撹拌し、添加中は内部温度を10℃未満に維持しつつ、混合物にNaOtBu(36.9g、372mmol)を10分かけて少しずつ加える。反応混合物をNaCl/氷水浴(内部温度−5℃)中で1時間撹拌し、飽和NH4Cl水溶液(300mL)および水(100mL)を5分かけて加える。混合物を分液漏斗に移し、MTBE(2×400mL)で抽出する。合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して残渣を得て、これを10%MTBE/ヘプタン(350mL)と合わせる。得られた混合物を45℃の加熱ブロック内で30分間激しく撹拌し、室温で30分間撹拌し、濾過する。濾過した固体を真空下40℃で乾燥させて、表題化合物を淡褐色の固体として得る(60g、99%を超える収率)。ES/MS(m/z):341(M+Na).
調製例2a
5−[[(2S,4S)−2−メチル−4−ピペリジル]オキシ]ピラジン−2−カルボニトリル塩酸塩
スキーム1、ステップB:tert−ブチル(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラート(205mg、0.6mmol)の溶液に、1,4−ジオキサン中のHClの4M溶液(5mL、20mmol)を加える。得られた混合物をRTで3.5時間撹拌する。得られた懸濁液を減圧下で濃縮し、真空下に6時間置いて、さらなる精製なしでの使用に適した表題化合物(225mg、95%を超える収率)を得る。ES/MS(m/z):219(M+H).
5−[[(2S,4S)−2−メチル−4−ピペリジル]オキシ]ピラジン−2−カルボニトリル塩酸塩
調製例2b
5−[[(2S,4S)−2−メチル−4−ピペリジル]オキシ]ピラジン−2−カルボニトリル
スキーム1、ステップb:フラスコに、tert−ブチル(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラート(60g、188mmol)およびDCM(240mL)をRTで加える。スラリーを氷水浴(内部温度5℃)で撹拌し、TFA(240mL、3174mmol)を、添加中は内部温度を10℃未満に維持しつつ、気体発生を伴って15分かけて滴下する。反応混合物を氷水浴中で10分間(内部温度5℃)撹拌し、減圧下で濃縮する。得られた残渣を氷水浴中で撹拌し、MTBE(200mL)および水(200mL)と合わせる。混合物を分液漏斗に移し、層を分離する。有機層を1%TFA水溶液(2×100mL)で抽出し、さらに0.1M HCl水溶液(2×100mL)で抽出し、有機層を取っておく。合わせた水層を氷水浴中で撹拌し、添加中は内部温度を20℃未満に維持しつつ、50%のNaOH水溶液(42.8mL、754mmol)を5分かけて加える。得られた塩基性混合物をDCM(3×300mL)で抽出し、合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗物質の第1のバッチを得る。後処理の第1の部分からの有機層を、2M HCl水溶液(2×100mL)でさらに抽出する。合わせた水層を氷水浴中で撹拌し、添加中は内部温度を20℃未満に維持しつつ、50%のNaOH水溶液(24.4mL、430mmol)を5分かけて加える。得られた塩基性混合物をDCM(3×100mL)で抽出し、合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗物質の第2のバッチを得る。粗物質の2つのバッチを10%シクロペンチルメチルエーテル/ヘプタン(181mL)と合わせ、混合物を45℃の加熱ブロックで30分間激しく撹拌し、RTに冷却し、30分間撹拌し、得られた沈殿物を濾過により集める。濾過した固体を真空下、40℃で1時間乾燥させて、表題化合物をクリーム色固体として得る(29.2g、収率71%)。ES/MS(m/z):219(M+H).
5−[[(2S,4S)−2−メチル−4−ピペリジル]オキシ]ピラジン−2−カルボニトリル
スキーム1、ステップb:フラスコに、tert−ブチル(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラート(60g、188mmol)およびDCM(240mL)をRTで加える。スラリーを氷水浴(内部温度5℃)で撹拌し、TFA(240mL、3174mmol)を、添加中は内部温度を10℃未満に維持しつつ、気体発生を伴って15分かけて滴下する。反応混合物を氷水浴中で10分間(内部温度5℃)撹拌し、減圧下で濃縮する。得られた残渣を氷水浴中で撹拌し、MTBE(200mL)および水(200mL)と合わせる。混合物を分液漏斗に移し、層を分離する。有機層を1%TFA水溶液(2×100mL)で抽出し、さらに0.1M HCl水溶液(2×100mL)で抽出し、有機層を取っておく。合わせた水層を氷水浴中で撹拌し、添加中は内部温度を20℃未満に維持しつつ、50%のNaOH水溶液(42.8mL、754mmol)を5分かけて加える。得られた塩基性混合物をDCM(3×300mL)で抽出し、合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗物質の第1のバッチを得る。後処理の第1の部分からの有機層を、2M HCl水溶液(2×100mL)でさらに抽出する。合わせた水層を氷水浴中で撹拌し、添加中は内部温度を20℃未満に維持しつつ、50%のNaOH水溶液(24.4mL、430mmol)を5分かけて加える。得られた塩基性混合物をDCM(3×100mL)で抽出し、合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗物質の第2のバッチを得る。粗物質の2つのバッチを10%シクロペンチルメチルエーテル/ヘプタン(181mL)と合わせ、混合物を45℃の加熱ブロックで30分間激しく撹拌し、RTに冷却し、30分間撹拌し、得られた沈殿物を濾過により集める。濾過した固体を真空下、40℃で1時間乾燥させて、表題化合物をクリーム色固体として得る(29.2g、収率71%)。ES/MS(m/z):219(M+H).
調製例2bの代替手順
フラスコに、tert−ブチル(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラート(1.2g、3.6mmol)を加える。フラスコを氷水浴に沈め、5M HClのiPrOH溶液(7.2mL、36.2mmol)を2分かけて加える。反応混合物をRTで1.5時間撹拌し、減圧下で濃縮する。得られた残渣をDCM(10mL)と飽和NaHCO3水溶液(10mL)との間で分配し、層を分離する。水層をDCM(2×10mL)および2−メチルテトラヒドロフラン(4×10mL)で抽出する。併せた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣(804mg、3.7mmol)を、同様の純度の別のロット(76mg、0.3mmol)と合わせる。混合したロットを10%シクロペンチルメチルエーテル/ヘプタン(4.4mL)と合わせ、混合物を45℃の加熱ブロックで20分間激しく撹拌し、RTに温め、5分間撹拌し、得られた沈殿物を濾過により集める。濾過した固体を真空下、40℃で1時間乾燥させて、表題化合物を淡褐色の固体として得た(649mg、2つの合わせたロットから収率74%)。ES/MS(m/z):219(M+H).
フラスコに、tert−ブチル(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−ピペリジン−1−カルボキシラート(1.2g、3.6mmol)を加える。フラスコを氷水浴に沈め、5M HClのiPrOH溶液(7.2mL、36.2mmol)を2分かけて加える。反応混合物をRTで1.5時間撹拌し、減圧下で濃縮する。得られた残渣をDCM(10mL)と飽和NaHCO3水溶液(10mL)との間で分配し、層を分離する。水層をDCM(2×10mL)および2−メチルテトラヒドロフラン(4×10mL)で抽出する。併せた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣(804mg、3.7mmol)を、同様の純度の別のロット(76mg、0.3mmol)と合わせる。混合したロットを10%シクロペンチルメチルエーテル/ヘプタン(4.4mL)と合わせ、混合物を45℃の加熱ブロックで20分間激しく撹拌し、RTに温め、5分間撹拌し、得られた沈殿物を濾過により集める。濾過した固体を真空下、40℃で1時間乾燥させて、表題化合物を淡褐色の固体として得た(649mg、2つの合わせたロットから収率74%)。ES/MS(m/z):219(M+H).
調製例3
tert−ブチル N−(4−フルオロ−5−ホルミル−チアゾール−2−イル)カルバマート
CsF(227g、1480mmol)を、tert−ブチル N−(4−クロロ−5−ホルミル−チアゾール−2−イル)カルバマート(38.8g、148mmol、例えば、N.Masuda,et al.、Bioorg Med Chem、12、6171−6182(2004)を参照)のDMSO(776mL)溶液にRTで加える。反応混合物を145℃のヒートブロック中で、内部温度を133℃に保ちながら48時間撹拌し、混合物を氷水浴中で冷却する。混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(500mL)、飽和NaCl水溶液(500mL)およびEtOAc(500mL)を添加する。混合物をRTで10分間撹拌し、次いで珪藻土で濾過し、EtOAc(500mL)で洗浄する。濾液を分液漏斗に移し、層を分離し、水層をEtOAc(1L)で抽出し、合わせた有機抽出物を飽和NaCl水溶液(1L)で洗浄し、水層をEtOAc(300mL)で抽出する。併せた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して残渣を得る。残渣をDCM(1.5L)中の5%EtOAcで溶出しつつ、シリカゲルパッド(330g)に通し、濾液を濃縮して残渣を得る。得られた残渣をIPA(303mL)に溶解し、濾過し、ICカラム(セルロース多糖誘導体:トリス(3,5−ジクロロフェニルカルバマート、30×250mm、5μ)を使用し、10%IPAで溶出しつつ、180mL/分、3mL注入でSFCにより精製する。生成物含有画分を減圧下で濃縮して、表題化合物(16.1g、収率49%)を得る。ES/MS(m/z):247(M+H).
tert−ブチル N−(4−フルオロ−5−ホルミル−チアゾール−2−イル)カルバマート
調製例4
N−(4−フルオロ−5−ホルミル−チアゾール−2−イル)アセトアミド
ジャケット付き容器中で、ZnBr2(91.9g、408mmol)を、RTで、tert−ブチル N−(4−フルオロ−5−ホルミル−チアゾール−2−イル)カルバマート(33.5g、136mmol)およびDCM(503mL)の混合物に一度に加える。反応混合物を内部温度37℃で一晩撹拌し、次いでジャケット温度を−10℃に設定し、内部温度を6℃未満に維持しつつ、THF(111mL)を15分かけて滴下する。次いでジャケット温度を−30℃に設定し、内部温度を5℃未満に維持しつつ、ピリジン(110mL、1360mmol)を5分かけて滴下する。ジャケット温度を0℃に設定し、Ac2O(116mL、1220mmol)を5分かけて滴下する。反応混合物を内部温度37℃で一晩撹拌し、RTに冷却し、THF(500mL)で溶出しつつ、珪藻土の短いパッドを通過させる。濾液をフラスコに移し、混合物を減圧下で濃縮して残渣を得て、これをトルエン(50mL)から濃縮する。得られた残渣に水(400mL)および2−メチルテトラヒドロフラン(400mL)中のクエン酸一水和物(57.2g、272mmol)の溶液を添加し、混合物を40℃で5分間撹拌し、2−メチルテトラヒドロフラン(100mL)で溶出しつつ、短い珪藻土パッドに通す。濾液を分液漏斗に移し、層を分離する。水層を2−メチルテトラヒドロフラン(2×250mL)で抽出し、合わせた有機物を水(500mL)で希釈する。混合物に、気体の発生が止まるまで、撹拌しつつ、固体NaHCO3を5分間かけて少しずつ添加する。混合物を分液漏斗に移し、層を分離し、水層を2−メチルテトラヒドロフラン(200mLおよび100mL)で抽出する。併せた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して残渣を得る。得られた残渣を2−メチルテトラヒドロフラン(100mL)に溶解し、混合物を2−メチルテトラヒドロフラン(2.5L)で溶出しつつ、短いシリカゲル(250g)パッドに通す。濾液を減圧下で濃縮して残渣を得て、これをDCMとヘプタンの1:1混合物(202mL)中で懸濁する。混合物を室温で30分間撹拌し、得られた固体を濾過により収集し、濾過した固体を真空下、40℃で2時間乾燥させて、表題化合物(18g、収率70%)を得る。ES/MS(m/z):189.0(M+H).
N−(4−フルオロ−5−ホルミル−チアゾール−2−イル)アセトアミド
調製例4の代替手順
不活性雰囲気下で、フッ化テトラメチルアンモニウム四水和物(100kg、605mol)をIPA(453〜459kg)に溶解し、70℃未満の温度で、減圧下、体積が約150〜180Lになるまで濃縮する。IPA(453〜459kg)を加え、減圧下で150〜180Lになるまで濃縮する。混合物のKFが0.2%未満になるまで繰り返す。DMF(546〜552kg)を加え、90℃に加熱し、減圧下で約150Lになるまで濃縮する。再度DMF(453〜459kg)を加え、減圧下で150Lになるまで濃縮する。混合物が60ppm未満の残留IPA限度を有するまで、繰り返す。N−(4−クロロ−5−ホルミルチアゾール−2−イル)アセトアミド(15kg、73.3mol)およびDMF(149kg)を加え、2〜4時間、100℃に加熱する。温度を20〜25℃に調整し、2−メチルテトラヒドロフラン(248kg)を加える。25重量%のNH4Cl水溶液(458kg)を加え、30分間撹拌する。層を分離し、追加の2−メチルテトラヒドロフラン(248kg)で水層を洗浄する。得られた層を分離し、合わせた有機抽出物を25重量%のNH4Cl水溶液(2×458kg)で洗浄し、30分間撹拌する。EtOAc(180kg)を加え、反応混合物を1時間加熱還流して、透明な溶液を得る。混合物を減圧下、55℃未満で体積が約30Lになるまで濃縮する。EtOAc(54kg)を加え、混合物を減圧下、55℃未満で体積が約30Lになるまで濃縮する。混合物を窒素下、20〜25℃で2時間撹拌する。得られた固体を濾過により収集し、真空下、55〜65℃で10〜12時間乾燥させて、表題化合物(4.5kg、純度82.5%)を得る。
不活性雰囲気下で、フッ化テトラメチルアンモニウム四水和物(100kg、605mol)をIPA(453〜459kg)に溶解し、70℃未満の温度で、減圧下、体積が約150〜180Lになるまで濃縮する。IPA(453〜459kg)を加え、減圧下で150〜180Lになるまで濃縮する。混合物のKFが0.2%未満になるまで繰り返す。DMF(546〜552kg)を加え、90℃に加熱し、減圧下で約150Lになるまで濃縮する。再度DMF(453〜459kg)を加え、減圧下で150Lになるまで濃縮する。混合物が60ppm未満の残留IPA限度を有するまで、繰り返す。N−(4−クロロ−5−ホルミルチアゾール−2−イル)アセトアミド(15kg、73.3mol)およびDMF(149kg)を加え、2〜4時間、100℃に加熱する。温度を20〜25℃に調整し、2−メチルテトラヒドロフラン(248kg)を加える。25重量%のNH4Cl水溶液(458kg)を加え、30分間撹拌する。層を分離し、追加の2−メチルテトラヒドロフラン(248kg)で水層を洗浄する。得られた層を分離し、合わせた有機抽出物を25重量%のNH4Cl水溶液(2×458kg)で洗浄し、30分間撹拌する。EtOAc(180kg)を加え、反応混合物を1時間加熱還流して、透明な溶液を得る。混合物を減圧下、55℃未満で体積が約30Lになるまで濃縮する。EtOAc(54kg)を加え、混合物を減圧下、55℃未満で体積が約30Lになるまで濃縮する。混合物を窒素下、20〜25℃で2時間撹拌する。得られた固体を濾過により収集し、真空下、55〜65℃で10〜12時間乾燥させて、表題化合物(4.5kg、純度82.5%)を得る。
実施例1
N−[5−[[(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−1−ピペリジル]メチル]−4−フルオロ−チアゾール−2−イル]アセトアミド
スキーム2:N−(4−フルオロ−5−ホルミル−チアゾール−2−イル)アセトアミド(166mg、0.9mmol)および5−[[(2S,4S)−2−メチル−4−ピペリジル]オキシ]ピラジン−2−カルボニトリル塩酸塩(225mg、0.9mmol)のDCM(10mL)溶液にDIPEA(0.46mL、2.6mmol)を加える。得られた溶液をRTで1.75時間撹拌する。この溶液にNaBH(OAc)3(561mg、2.6mmol)を加える。得られた溶液をRTで16時間撹拌する。反応を飽和NaHCO3水溶液(5mL)でゆっくりとクエンチし、水層をDCM(2×10mL)で抽出する。合わせた有機抽出物をMgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。得られた残渣をDCMに溶解し、1:0から0:1のヘキサン:EtOAcの勾配で溶出し、その後、1:1から0:1のヘキサン:10%MeOHを含有するEtOAcで溶出しつつ、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィにより精製し、表題化合物(52mg、収率15%)を得る。ES/MS(m/z):391(M+H).[α]D 20=+38°(c=1.0,MeOH).
N−[5−[[(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−1−ピペリジル]メチル]−4−フルオロ−チアゾール−2−イル]アセトアミド
実施例1の代替手順
フラスコに、5−[[(2S,4S)−2−メチル−4−ピペリジル]オキシ]ピラジン−2−カルボニトリル(35.6g、163mmol)、EtOAc(768mL)、ピリジン(26.4mL、326mmol)およびNaBH(OAc)3(104g、490.7mmol)をRTで加える。反応混合物を31℃の加熱ブロック(内部温度30℃)中で撹拌し、N−(4−フルオロ−5−ホルミル−チアゾール−2−イル)アセトアミド(30.7g、163mmol)を2分かけて少しずつ加える。反応混合物を31℃の加熱ブロックで一晩(内部温度30℃)撹拌し、撹拌しながら氷水浴で冷却する。得られた混合物に、添加中の内部温度を10℃未満に維持しつつ、NaHCO3の飽和水溶液(500mL)を5分間かけて添加する。得られた混合物をRTで15分間撹拌し、水(100mL)とEtOAc(50mL)との間で分配し、混合物を分液漏斗に移す。得られた層を分離する。水層を2−メチルテトラヒドロフラン(2×300mL)で抽出する。併せた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣を飽和NaHCO3水溶液(300mL)と合わせ、混合物をDCM(3×300mL)で抽出し、茶色のぼろぼろした層を水相に残す。併せた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣を、0〜5%のiPrOH/DCMの勾配で溶出しつつ、シリカでのフラッシュクロマトグラフィによって精製し、生成物を含む画分を合わせ、減圧下で濃縮する。得られた残渣をヘプタン(2×50mL)から濃縮する。得られた固体を50%EtOH/ヘプタン(318mL)と合わせ、混合物を50℃の加熱ブロック内で30分間激しく撹拌し、撹拌しながら10分間かけて室温に冷却する。得られた沈殿物を濾過により収集し、フィルターケーキをヘプタン(25mL)で洗浄する。収集した固体を真空下、RTで5分間乾燥し、真空下、40℃で一晩乾燥して、表題化合物N−[5−[[(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−1−ピペリジル]メチル]−4−フルオロ−チアゾール−2−イル]アセトアミドを淡いクリーム色の結晶性固体として得る(47g、収率72%)。ES/MS(m/z):391(M+H).[α]D 20=+47.2°(c=0.25,MeOH).
フラスコに、5−[[(2S,4S)−2−メチル−4−ピペリジル]オキシ]ピラジン−2−カルボニトリル(35.6g、163mmol)、EtOAc(768mL)、ピリジン(26.4mL、326mmol)およびNaBH(OAc)3(104g、490.7mmol)をRTで加える。反応混合物を31℃の加熱ブロック(内部温度30℃)中で撹拌し、N−(4−フルオロ−5−ホルミル−チアゾール−2−イル)アセトアミド(30.7g、163mmol)を2分かけて少しずつ加える。反応混合物を31℃の加熱ブロックで一晩(内部温度30℃)撹拌し、撹拌しながら氷水浴で冷却する。得られた混合物に、添加中の内部温度を10℃未満に維持しつつ、NaHCO3の飽和水溶液(500mL)を5分間かけて添加する。得られた混合物をRTで15分間撹拌し、水(100mL)とEtOAc(50mL)との間で分配し、混合物を分液漏斗に移す。得られた層を分離する。水層を2−メチルテトラヒドロフラン(2×300mL)で抽出する。併せた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣を飽和NaHCO3水溶液(300mL)と合わせ、混合物をDCM(3×300mL)で抽出し、茶色のぼろぼろした層を水相に残す。併せた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣を、0〜5%のiPrOH/DCMの勾配で溶出しつつ、シリカでのフラッシュクロマトグラフィによって精製し、生成物を含む画分を合わせ、減圧下で濃縮する。得られた残渣をヘプタン(2×50mL)から濃縮する。得られた固体を50%EtOH/ヘプタン(318mL)と合わせ、混合物を50℃の加熱ブロック内で30分間激しく撹拌し、撹拌しながら10分間かけて室温に冷却する。得られた沈殿物を濾過により収集し、フィルターケーキをヘプタン(25mL)で洗浄する。収集した固体を真空下、RTで5分間乾燥し、真空下、40℃で一晩乾燥して、表題化合物N−[5−[[(2S,4S)−4−(5−シアノピラジン−2−イル)オキシ−2−メチル−1−ピペリジル]メチル]−4−フルオロ−チアゾール−2−イル]アセトアミドを淡いクリーム色の結晶性固体として得る(47g、収率72%)。ES/MS(m/z):391(M+H).[α]D 20=+47.2°(c=0.25,MeOH).
X線粉末回折:
結晶性固体のXRDパターンは、CuKα源(λ=1.54060Å)およびVantec検出器を備え、35kVおよび50mAで作動する、Bruker D4 Endeavor X線粉末回折計にて得られる。試料は、2θにおける0.0087°のステップサイズおよび0.5秒/ステップの走査速度で、0.6mmの発散スリット、5.28mmの固定散乱防止スリット、および9.5mm検出スリットを用いて、2θ(2シータ)における4〜40°で走査される。乾燥粉末を石英試料ホルダーに充填し、ガラススライドを使用して滑らかな表面を得る。結晶学の分野において、任意の所与の結晶形に関して、結晶形態および晶癖などの要因から生じる好ましい配向に起因して、回折ピークの相対強度が変化し得ることは周知である。好ましい配向の効果が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特徴的なピーク位置は変化しない。例えば、The U.S.Pharmacopeia 35−National Formulary 30 Chapter<941>Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X−ray powder diffraction(XRPD)Official December 1、2012年5月1日、2013を参照されたい。さらに、所与の任意の結晶形態について、角ピーク位置がわずかに変化し得ることも、結晶学の分野において周知である。例えば、ピーク位置は、サンプルが分析される温度もしくは湿度の変動、サンプルの変位、または内部標準の有無に起因して変動し得る。本発明の場合、2θの±0.2のピーク位置の変動は、示された結晶形の明確な同定を妨げることなくこれらの潜在的な変動を考慮する。結晶形の確認は、特徴的なピーク(2θ度の単位で)、典型的にはより顕著なピークの任意の固有の組み合わせに基づいて行われ得る。周囲温度および相対湿度で集められた結晶形の回析パターンは、8.85および26.77の2−θ度にあるNIST 675基準ピークに基づいて調整する。
結晶性固体のXRDパターンは、CuKα源(λ=1.54060Å)およびVantec検出器を備え、35kVおよび50mAで作動する、Bruker D4 Endeavor X線粉末回折計にて得られる。試料は、2θにおける0.0087°のステップサイズおよび0.5秒/ステップの走査速度で、0.6mmの発散スリット、5.28mmの固定散乱防止スリット、および9.5mm検出スリットを用いて、2θ(2シータ)における4〜40°で走査される。乾燥粉末を石英試料ホルダーに充填し、ガラススライドを使用して滑らかな表面を得る。結晶学の分野において、任意の所与の結晶形に関して、結晶形態および晶癖などの要因から生じる好ましい配向に起因して、回折ピークの相対強度が変化し得ることは周知である。好ましい配向の効果が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特徴的なピーク位置は変化しない。例えば、The U.S.Pharmacopeia 35−National Formulary 30 Chapter<941>Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X−ray powder diffraction(XRPD)Official December 1、2012年5月1日、2013を参照されたい。さらに、所与の任意の結晶形態について、角ピーク位置がわずかに変化し得ることも、結晶学の分野において周知である。例えば、ピーク位置は、サンプルが分析される温度もしくは湿度の変動、サンプルの変位、または内部標準の有無に起因して変動し得る。本発明の場合、2θの±0.2のピーク位置の変動は、示された結晶形の明確な同定を妨げることなくこれらの潜在的な変動を考慮する。結晶形の確認は、特徴的なピーク(2θ度の単位で)、典型的にはより顕著なピークの任意の固有の組み合わせに基づいて行われ得る。周囲温度および相対湿度で集められた結晶形の回析パターンは、8.85および26.77の2−θ度にあるNIST 675基準ピークに基づいて調整する。
したがって、実施例1の結晶性サンプルは、以下の表1に記載の回析ピーク(2θ値)を有するものとして、CuKα放射線を用いるXRDパターンによって特徴付けられる。具体的には、パターンは、0.2度の回折角の許容差を有し、18.5°、13.0°、および16.0°からなる群から選択されるピークの1つ以上とともに、12.1°のピークを含む。
インビトロヒトOGA酵素アッセイ
OGA酵素の生成
全長ヒトO−GlcNAc−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ(NM_012215)をコードするヌクレオチド配列を、N末端ポリヒスチジン(HIS)タグと共にpFastBac1(Invitrogen)ベクターに挿入する。バキュロウイルス生成を、Bac−to−Bac Baculovirus Expression系(Invitrogen)プロトコルに従って行う。Sf9細胞を、培養液1リットル当たり10mLのP1ウイルスを用いて1.5×106個/mLで感染させ、28℃で48時間インキュベートする。細胞を遠心沈降させ、PBSですすぎ、ペレットを−80℃で保存する。
上記OGAタンパク質(His−OGA)を、次のように精製する。4Lの細胞を、50mMのTris、pH8.0、300mMのNaCl、10%のグリセロール、10mMのイミダゾール、1mMのジチオトレイトール(DTT)、0.1%のTriton(商標)X−100、4錠のプロテアーゼ阻害剤(完全EDTA非含有、Roche)を含有する200mLの緩衝液中で、4℃で45分間溶解する。次いで、この細胞溶解物を4℃で、16500rpmで40分間遠心沈降させ、上清を6mLのNi−NTA樹脂(ニッケル−ニトリロ三酢酸)と共に4℃で2時間インキュベートする。
OGA酵素の生成
全長ヒトO−GlcNAc−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ(NM_012215)をコードするヌクレオチド配列を、N末端ポリヒスチジン(HIS)タグと共にpFastBac1(Invitrogen)ベクターに挿入する。バキュロウイルス生成を、Bac−to−Bac Baculovirus Expression系(Invitrogen)プロトコルに従って行う。Sf9細胞を、培養液1リットル当たり10mLのP1ウイルスを用いて1.5×106個/mLで感染させ、28℃で48時間インキュベートする。細胞を遠心沈降させ、PBSですすぎ、ペレットを−80℃で保存する。
上記OGAタンパク質(His−OGA)を、次のように精製する。4Lの細胞を、50mMのTris、pH8.0、300mMのNaCl、10%のグリセロール、10mMのイミダゾール、1mMのジチオトレイトール(DTT)、0.1%のTriton(商標)X−100、4錠のプロテアーゼ阻害剤(完全EDTA非含有、Roche)を含有する200mLの緩衝液中で、4℃で45分間溶解する。次いで、この細胞溶解物を4℃で、16500rpmで40分間遠心沈降させ、上清を6mLのNi−NTA樹脂(ニッケル−ニトリロ三酢酸)と共に4℃で2時間インキュベートする。
次に、樹脂をカラムに充填し、50mMのTris、pH8.0、300mMのNaCl、10%のグリセロール、10mMのイミダゾール、0.1%のTriton(商標)X−100、1mMのDTT、続いて50mMのTris、pH8.0、150mMのNaCl、10mMのイミダゾール、10%のグリセロール、1mMのDTTで洗浄する。タンパク質を50mMのTris、pH8.0、150mMのNaCl、300mMのイミダゾール、10%のグリセロール、1mMのDTTで溶出させる。プールしたHis−OGA含有画分を6mlに濃縮し、Superdex75(16/60)に入れる。タンパク質を50mMのTris、pH8.0、150mMのNaCl、10%のグリセロール、2mMのDTTで溶出させる。His−OGA含有画分をプールし、タンパク質濃度をBCA(Bradford Colorimetric Assay)で測定する。
OGA酵素アッセイ
OGA酵素は、核細胞質タンパク質からのO−GlcNAcの除去を触媒する。この活性を測定するために、フルオロセイン ジ−N−アセチル−β−N−アセチル−D−グルコサミニド(FD−GlcNAc,Kim,Eun Ju;Kang,Dae Ook;Love,Dona C.;Hanover,John A.Carbohydrate Research(2006)、341(8)、971−982)を6.7μMの最終濃度で基質として使用する。この蛍光発生基質は、OGAによる切断の際に蛍光性となるので、酵素活性は、535nm(485nmでの励起)で検出される蛍光の増大によって測定することができる。
OGA酵素は、核細胞質タンパク質からのO−GlcNAcの除去を触媒する。この活性を測定するために、フルオロセイン ジ−N−アセチル−β−N−アセチル−D−グルコサミニド(FD−GlcNAc,Kim,Eun Ju;Kang,Dae Ook;Love,Dona C.;Hanover,John A.Carbohydrate Research(2006)、341(8)、971−982)を6.7μMの最終濃度で基質として使用する。この蛍光発生基質は、OGAによる切断の際に蛍光性となるので、酵素活性は、535nm(485nmでの励起)で検出される蛍光の増大によって測定することができる。
アッセイ緩衝液を調製し、50mMのH2NaPO3−HNa2PO3、0.01%のウシ血清アルブミン、および0.01%のTriton(商標)X−100の水中での最終濃度、pH7を得る。試験すべき化合物を、10点濃度応答曲線を用いて、純粋なジメチルスルホキシド(DMSO)中に希釈する。反応混合物中の最大化合物濃度は、30または1μMである。基質の添加によって反応が始まる前に、適切な濃度の化合物をOGA酵素と共に30分間プレインキュベートする。最終酵素濃度は、最大化合物濃度が30または1μMの場合、それぞれ3.24nMまたは0.5nMである。反応を室温で60分間進行させておく。次いで、反応を停止させることなく蛍光を読み取る。IC50値は、正規化データ対化合物のlogをプロットし、4パラメータロジスティック方程式を用いてデータを当てはめることによって計算する。
実施例1の化合物を本質的に上述の通り試験したところ、0.343+0.141nM(n=3)のIC50を呈した。これらの結果は、実施例1の化合物がOGA酵素活性をインビトロで阻害することを実証している。
Claims (15)
- 結晶性である、請求項4に記載の化合物。
- X線回折スペクトルにおいて0.2度の回折角の許容差を有し、12.1°の回折角2シータでのピークと、18.5°、13.0°、および16.0°からなる群から選択されるピークの1つ以上との組合せにより特徴づけられる、請求項5に記載の化合物。
- 患者におけるアルツハイマー病を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
- 患者における軽度認知障害からアルツハイマー病への進行を予防する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
- 患者における進行性核上麻痺を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法。
- 療法に使用するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
- アルツハイマー病の治療に使用するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
- 軽度認知障害からアルツハイマー病への進行の予防に使用するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
- 進行性核上麻痺の治療に使用するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、1つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、薬学的組成物。
- 薬学的組成物を調製するためのプロセスであって、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、1つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、プロセス。
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