JP2021532735A - がんの非侵襲的検出のためのdnaメチル化マーカーとその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
DNAの低メチル化は患者の血液で検出可能であり(Ramzy、Omran、Hamad、Shaker、&Abboud、2011)、最近ゲノムワイドバイサルファイトシーケンス(bisulfite sequencing)が、HCC患者の血漿中の低メチル化DNAを検出するために適用された(Chan et al.、2013)。ただし、特にがんの初期段階では、この情報源は限られており、DNAメチル化プロファイルは宿主(host)のDNAメチル化プロファイルによって混同されている。ゲノムワイドバイサルファイトシーケンスは比較的費用のかかる手順であり、重要なバイオインフォマティクス分析を必要とするため、スクリーニングツールとしては実行不可能である。したがって、課題は、腫瘍DNAと非腫瘍DNAを確実に区別できる少数のCGを描き、広範で多様な地理的領域の幅広い集団のスクリーニングを可能にする低コストハイスループットアッセイを開発することである。最近、いくつかのグループが、がんと正常なDNAおよび血中DNAのゲノムワイドなDNAメチル化マップの比較分析を実施した(Zhai et al.、2012)。ただし、これらのアプローチの主な課題は、先験的に予期しないさまざまなレベルで血液中に見られる他の組織からの無細胞DNAを考慮に入れていないことである。がん組織と同様のメチル化プロファイルを持つ別の組織からのDNAの混入は、偽陽性を引き起こす可能性がある。さらに、過去のアプローチでは、正常組織とがん組織におけるDNAメチル化を定量的に比較している。この定量的な違いは、腫瘍DNAが他の非形質転換組織からの異なる未知の量のDNAと混合されると希釈され、偽陰性を引き起こす可能性がある。現在の方法におけるこれらの欠陥は、本発明の主題において開示される異なるアプローチを必要とする。
1994年2月25日;22(4):695−6;Martin V、Ribieras S、Song−Wang X、Rio M C、Dante R。ゲノムシーケンスは、pS2遺伝子の5’領域のDNA低メチル化とヒト乳がん細胞株におけるその発現との相関を示す。Gene。1995年5月19日;l57(l−2):26l−4;WO
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DNAと混合した場合、CF腫瘍DNAを検出できない(中山大学がん病院のHCCのctDNAマーカーについては、図2を参照する)。本発明請求の主題の一実施形態は、すべての組織ではメチル化されていないが、特定のがんではメチル化されているユニークなサイトのセットを明らかにしている。別の実施形態は、次世代シーケンシング、MeDIPアレイ、MeDIPシーケンスなどによって得られたゲノムワイドなDNAメチル化データのさまざまなソースを使用して、「バイナリーカテゴリー区別(BCD)法」(binary−categorical differentiation method)と呼ばれるがん、他の組織および他の疾患におけるカテゴリー的に区別されるメチル化サイトを発見する方法を明らかにする。一実施形態は、ゲノムワイドデータの発見セットにおけるa.肝細胞がん(HCC)、b.肺がん、c.前立腺がん、d.乳がん、e.大腸がん、f.頭頸部扁平上皮がん(HNSC)、g.膵臓がん、h.脳がん(膠芽腫)、i.胃がん、j.卵巣がん、k.子宮頸がん、l.食道がん、m.膀胱がん、n.腎臓がん、o.精巣がん、p.一般的な固形腫瘍、q.血液がんのプロファイルの検出のための「カテゴリー」DNAメチル化サイトの組み合わせを明らかにする。別の実施形態はまた、起源の組織によって腫瘍を区別する「カテゴリー」DNAメチル化サイトの組み合わせを明らかにする。この実施形態は、組織特異性が低いメチル化CF DNAを検出するための先行技術の方法とアッセイを区別する。実施形態は高い感度および特異性で、何百人もの患者からのDNAメチル化データならびに腫瘍の起源の組織におけるがんの検出のためのポリジーンDNAメチル化アッセイを検証する。本発明は、ターゲット特異的プライマーとそれに続くバーコードプライマーによる逐次増幅、および単一の次世代Miseqシーケンス反応におけるマルチプレックスシーケンス、血漿、唾液、尿などの少量の体液からのデータ抽出とメチル化の定量化により、何百もの人々のCG IDのポリジーンセットにおけるDNAメチル化を同時に正確に測定する方法を開示する。本発明の主題の別の実施形態はまた、パイロシーケンスアッセイまたはメチル化特異的PCRを使用する、前記DNAメチル化CG IDのメチル化の測定を開示する。別の実施形態は、がんを有する人を健康な人から区別する、「カテゴリー」またはポリジーン加重メチル化スコアのいずれかの計算を開示する。別の実施形態は、血漿、尿、糞便、組織バイオプシーまたは組織スワブからがんの他の臨床的証拠がない人のがんの予測に至る新規プロセスを開示す
る。別の実施形態は、がんならびに、細胞死およびアルツハイマー病およびニューロンの他の神経変性疾患、心筋細胞の心臓病などのCF DNAの放出を含む他の疾患を検出するために当業者によって使用され得る。実施形態に記載されているDNAメチル化マーカー(CG ID)は、下記に利用される。a.定期的な「健康診断」による、すなわち「健康な」人のがんの非侵襲的早期発見。b.HCCのリスクが高い慢性肝炎患者や肺がんのリスクが高い喫煙者などの、「リスクの高い」人の監視。c.がん治療を受けている患者の治療への反応を監視し、再発または転移を検出。
sequencing)、Illumina Epicマイクロアレイ、キャプチャーシーケンス、メチル化DNA免疫沈降(MeDIP)メチル化特異的PCR、および利用可能になるメチル化測定法など、当業者が利用できるメチル化分析の方法を使用することで、当業者によって使用され得る。
第1の態様では、実施形態は、がんの早期検出のために、血漿などの体液中の無細胞DNAにおけるがんのポリジーンDNAメチル化マーカーを提供し、前記ポリジーンDNAメチル化マーカーセットは、本明細書に開示されている「バイナリーカテゴリー区別(BCD)分析」を使用して、Illumina 450KやEPICアレイ、ゲノムワイドバイサルファイトシーケンス、メチル化DNA免疫沈降(MeDIP)シーケンス、またはオリゴヌクレオチドアレイとのハイブリダイゼーションなどのマッピング方法によって得られたゲノム全体のDNAメチル化から得られる。
cg02012576,cg03768777,cg24804544,cg05739190
cg14126493
cg04223424,cg23141355
cg05917732, cg25470077
cg14283569
[上記の表に示された4つの組み合わせのサブセットである]
cg13031251,cg09734791,cg09695735,cg03637878
cg03113878,cg20180843
cg09854653,cg01566242
IDの組み合わせまたは本リストの短いサブセット(表9の下に例として示される)である。
cg25024074,cg15386964,cg16232979
cg01237565,cg08182975,cg20983577,cg25591377
cg19929355
cg05611779,cg09734791,cg15760257
cg0511779,cg19235339
IDの組み合わせまたは本リストの短いサブセット(表14の下に例として示される)である。
cg24339193,cg22694l53,cg11252337,cg21210985
cg07068768,cg19846609
がんを早期に検出するために、ポリジーンDNAメチル化マーカーは、以下のリストのCG IDの組み合わせまたは本リストの短いサブセット(表16の下に例として示される)である。
cg00757182,cg01601746
cg07066594,cg09260640,cg1296l842
cg07900968,cg20334243,cg27420520
cg18006328,cg19287220
IDの組み合わせまたは本リストの短いサブセット(表20の下に例として示される)である。
cg03280624,cg03735888,cg09734791,cg27420520
Cg09556952,cg12473285
IDの組み合わせまたは本リストの短いサブセット(表22の下に例として示される)である。
cg04223424,cg10723962,cg25024074
cg13544006
cg08884571,cg00011225,cg00011225
cg14531093,cg25159927
cg10723962,cg15759056,cg24427504,cg25024074
cg18658397,cg18780412,cg20439288,cg22828045,cg25375340
cg15307891,cg18866529,cg27084903
キットが提供される。
cg02012576
フォワード:
リバース (ビオチン標識された):
配列:
cg03768777(VASH2)
フォワード:
リバース (ビオチン標識された):
配列:
cg05739190(CCNJ)
フォワード:
リバース (ビオチン標識された):
配列:
cg24804544(GRID2IP)
フォワード(ビオチン標識された):
リバース:
配列:
がんの起源の組織の特異性は、以下のCGID cg02012576(HPX)のDNAメチル化を測定することによって決定される。
フォワード(ビオチン標識された):
リバース (ビオチン標識された):
配列:
CGID cg02879662の場合
フォワードプライマー:
リバースプライマー:
CGID cg16232979の場合
フォワードプライマー:
リバースプライマー:
CGID:cg14041701およびcg14498227の場合
フォワードプライマー:
リバースプライマー:
フォワードプライマー:
バーコードプライマー (リバース):
(赤い塩基はインデックスであり、このインデックスの200のバリエーションが使用される)
本明細書で使用されるように、「CG」という用語は、シトシンおよびグアノシン塩基を含むDNA中のジヌクレオチド配列を指す。これらのジヌクレオチドシーケンスは、人間や他の動物のDNAでメチル化される可能性がある。CG IDは、Illumina
450Kマニフェストで定義されているように、ヒトゲノムにおけるその位置を明らかにする(ここにリストされているCGの注釈は、https://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/IlluminaHumanMethylation450k.db.htmlで公開され、RパッケージIlluminaHumanMethylation450k.db IlluminaHumanMethylation450k.db:Illumina Human Methylation 450k注釈データとしてインストールされている。Rパッケージバージョン2.0.9.)。
受信者操作特性(ROC)曲線下の面積の意味と使用」Radiology 143(1):29−36で説明されているように、予測の真の陽性率は、予測因子のさまざまなしきい値設定(すなわち、メチル化の異なる%)での偽陽性率に対してプロットされる。
図面のすべての説明は、選択された実施形態を説明するためのものであり、請求される主題の範囲を限定することを意図するものではない。
はまた、多くのがんにおいて、これらの強力に非メチル化されたサイトががんにおいてメチル化されることに気づいた。したがって、腫瘍DNAと血液中に見つかる可能性のある他のすべてのDNAとの間に質的な「カテゴリー的な違い」を生み出す。深い次世代シーケンスを使用すると、完全にメチル化されていないコピーのバックグラウンドで、わずかなメチル化分子でも簡単に識別できる。
遺伝子発現オムニバス(Gene expression Omnibus)(GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/またはがんゲノムアトラス(The Cancer Genome Atlas)TCGA https://cancergenome.nih.gov/公開データベースのいずれかに寄託された多数の個人からのヒトゲノム全体の〜450,000CGのメチル化の正規化されたベータ値の公開されているデータベースを使用した。次のデータベースを使用して、多くの正常組織および血液DNA:GSE50192、GSE50192、GSE40279にある強力な非メチル化CG IDのリストを取得した。
NmCGIDx=COUNTIF (betaCGIDxn1:ni,“>0.1”)
umCGIDx=IF(NmCGIDx=0, TRUE, FALSE)
NmCGIDx=メチル化されたCGIDxを有する正常な被験者の数。
umCGIDx=すべての被験者における非メチル化CGIDx
betaCGIDx=与えられたCGIDxのメチル化値
x=Illumina 450kアレイ上の任意のCGID
n1=アレイにおける最初のサブジェクト
ni=アレイにおける最後のサブジェクト。
組み合わせを発見した。
ヒトゲノム全体の〜450,000のCG(CG ID)のメチル化の正規化されたベータ値の公開されている以下のデータベースを使用して、がん特有のDNAメチル化マーカーのリストを導き出した。
以下は、異なるがんの早期予測のためのポリジーンDNAメチル化マーカーを発見するために実施形態で使用されるバイナリーカテゴリー区別法(BCD)のステップである。
発見コーホートについては、Microsoft ExcelのCOUNTIFおよびIF関数を使用して、正常な組織で強力にメチル化されていない28,754個のCG IDのリスト内に描いた。該CGIDは特定のがんではカテゴリー的にメチル化され、影響を受けていない組織および正常な組織ではメチル化されない。
NmcCGIDx=COUNTIF (betaCGIDxCancer n1:ni,“>0.2”)
NmnCGIDx=COUNTIF (betaCGIDxNormal n1:ni,“>0.1”)
DMCGIDx= IF((AND(NmcCGIDx>0, NmnCGIDx=0)),”TRUE”,”FALSE”)
DM CGIDxは最も高い番号から最も低い番号へとソートされた。
上位20までのTRUE DM CGIDxの位置が選択された。
NmcCGIDx=メチル化されたCGIDxを有するがん患者の数
Nmn=メチル化されたCGIDxを持つ正常な隣接または類似の組織サンプルの数
betaCGIDx=CGIDxのメチル化のレベル
n=1からiまでの患者
DM=区別的にメチル化されたCGIDx
NunCGIDx=COUNTIF (betaCGIDxNormal n1:ni,“<0.9”)
DHMCGIDx= IF((AND(NucCGIDx>0, NunCGIDx=0)),”TRUE”,”FALSE”)
DHM CGIDの位置が最も高い番号から最も低い番号へとソートされた。
上位20のTRUE DHMのサイトが選択され、罰則付き回帰分析が行われた。
NucCGIDx=非メチル化CGID Xのがん患者の数
NunCGIDx=非メチル化CGID Xの正常な組織サンプルの数
n=1からiまでの患者
DHM=区別的に低メチル化されたCGID
Ms=メチル化スコア、α=切片、βi=CG IDiの係数、CGi=CGあたりのメチル化レベルの組み合わせ。1からi=組み合わせたCGの数。
本発明者らは、GSE61258(正常な肝臓)から、そしてHCC DNAメチル化データのTCGA HCCコレクションからランダムに選択された66個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDxを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性でHCCを検出する(図5B、表1)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、HCCと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図5C、表2)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、加重HCC DNAメチル化スコアが、表1のCGIDの227人のHCC患者のGSE76269からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値を含む「検証コーホート」でHCCを検出したことを実証した。この方法を使用して、95%のHCCサンプルがHCCとして検出された(図6C)。図6Aに示されるROC曲線は、がんを検出するためのこのメチル化スコアの特異性(1)および感度(0.96)を明らかにしている。次に、発明者らは、HCCと他の8種類のがんのGSE75041とTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、HCCの検出およびHCCと他のがんを区別するための、スペックおよび検出のDNAメチル化スコアを組み合わせた有用性を実証した。図7Bに示されるROC曲線は、HCCを他の正常な組織および他のがんと区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.97)および感度(0.95)を明らかにしている。これらのDNAメチル化マーカーと計算されたメチル化スコアは、組織、糞便、唾液、血漿および尿などの人とは異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんのスクリーニングと早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE61258(正常な肺)からの10人の、そして肺がんDNAメチル化データのTCGA肺がんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で肺がん(腺がんおよび扁平上皮がんの両方を含むサンプル)を検出する(図8B、表3)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、肺がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図8C、表4)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態3(検出)で開発された加重肺がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE66836、GSE63704、GSE76269からの、およびTCGAの919人の肺がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で肺がんを検出することを実証した。この方法を使用して、96%の肺がんサンプルが肺がんとして検出された(図9A)。次に、発明者らは、肺がんと他の8種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、肺がんと他のがんを区別するための、スペックおよび検出のDNAメチル化スコアを組み合わせた有用性を実証した(図9A)。図9Bに示されるROC曲線は、肺がんを他の正常な組織および他のがんから検出するための、このメチル化スコアの特異性(0.96)および感度(0.84)を明らかにしている(図9C)。これらのDNAメチル化マーカーと計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE52955(正常な前立腺)からの5人の、そして前立腺がんDNAメチル化データのTCGA前立腺がんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で前立腺がんを検出する(図10B、表5)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、前立腺がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図10C、表6)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態3(検出)で開発された加重前立腺がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE73549、GSE2955からの、およびTCGAの430人の前立腺がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で前立腺がんを検出することを実証した。この方法を使用して、99%の前立腺がんサンプルが前立腺がんとして検出された(図11A)。次に、発明者らは、前立腺がんと他の8種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、前立腺がんと他のがんを区別するための、スペックおよび検出のDNAメチル化スコアを組み合わせた有用性を実証した(図11A)。図11Bに示されるROC曲線は、前立腺がんを他の正常な組織および他のがんから検出するための、このメチル化スコアの特異性(0.99)および感度(0.98)を明らかにしている(図11C)。これらのDNAメチル化マーカーと計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE60185(正常な乳房)からの17人の、そして乳がんDNAメチル化データのTCGA乳がんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で乳がんを検出する(図12B、表7)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、乳がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図12C、表8)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態9(検出)で開発された加重乳がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE60185、GSE75067からの、およびTCGAからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値を使用する891人の乳がん患者が含まれる「検証コーホート」で乳がんを検出することを実証した。この方法を使用して、91%の乳がんサンプルが乳がんとして検出され(図13A)、DCISと浸潤性がんの両方が検出された。次に、発明者らは、乳がんと他の8種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、乳がんと他のがんを区別するための、スペックおよび検出のDNAメチル化スコアを組み合わせた有用性を実証した(図14A)。図14Bに示されるROC曲線は、乳がんを他の正常な組織および他のがんと区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.89)および感度(0.87)を明らかにしている(図14C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある女性や一般的な健康な人における乳がんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE(32146)(正常)からの25人の、そして大腸がんDNAメチル化データのTCGA大腸がんコレクションからランダムに選択された50個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で大腸がんを検出する(図15B、表9)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、大腸がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図15C、表10)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態11(検出)で開発された加重大腸がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE69550からの、およびTCGAの459人の大腸がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で大腸がんを検出することを実証した。この方法を使用して、98%の大腸がんサンプルが大腸がんとして検出された(図16A)。次に、発明者らは、大腸がんと他の8種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、大腸がんと他のがんを区別するための、スペックおよび検出のDNAメチル化スコアを組み合わせた有用性を実証した(図16A)。図16Bに示されるROC曲線は、大腸がんを他の正常な組織および他のがんを区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.96)および感度(0.98)を明らかにしている(図16C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、CRCのリスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE53051(正常)からの12人の、そして膵臓がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された20個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で膵臓がんを検出する(図17B、表11)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、10種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された100個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、膵臓がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図17C、表12)(スペック)。実施
形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態13(検出)で開発された加重膵臓がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、TCGAからの891人の膵臓がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で膵臓がんを検出することを実証した。この方法を使用して、86%の膵臓がんサンプルが膵臓がんとして検出された(図18A)。次に、発明者らは、膵臓がんと他の9種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、膵臓がんと他のがんを区別するための、スペックおよび検出のDNAメチル化スコアを組み合わせた有用性を実証した(図18A)。図18Bに示されるROC曲線は、膵臓がんの検出および膵臓がんを他の正常な組織および他のがんと区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.93)および感度(0.86)を明らかにしている(図18C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE65820(正常)からの10人の、そして脳がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された10個のサンプからルの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で脳がんを検出する(図19B、表13)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、11種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された110個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、検出のCGIDはまた、脳がんと他の腫瘍とを区別することを発見した(図19C、表13)(検出−スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態15(検出)で開発された加重脳がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、TCGAからの689人の脳がん患者、GSE58298からの40人の患者およびGSE36278からの136人の患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で脳がんを検出することを実証した。この方法を使用して、91%〜97%の脳がんサンプルが脳がんとして検出された(図20A)。次に、発明者らは、脳がんと他の9種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、脳がんと他のがんを区別するための、同様のCGIDの有用性を実証した(図20A)。図22Bに示されるROC曲線は、脳がんを他の正常な組織および他のがんから検出するためのこのメチル化スコアの特異性(1)および感度(0.97)を明らかにしている(図20C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE99553(正常)からの18人の、そして胃がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で胃がんを検出する(図21B、表14)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、11種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された100個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、胃がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図21C、表15)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態17(検出)で開発された加重胃がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、TCGAからの397人の胃がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で胃がんを検出することを実証した。この方法を使用して、88%の胃がんサンプルが胃がんとして検出された(図23A)。次に、発明者らは、胃がんと他の10種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、胃がんと他のがんを区別するための、スペックおよび検出のDNAメチル化スコアを組み合わせた有用性を実証した(図23A)。図22Bに示されるROC曲線は、胃がんを他の正常な組織および他のがんから検出するためのこのメチル化スコアの特異性(0.9)および感度(0.9)を明らかにしている(図22C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんのスクリーニングと早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE65820(正常)からの5人の、そして卵巣がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された10個のサンプからルの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で卵巣がんを検出する(図23B、表16)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、10種の異なる腫瘍タイプおよび血液を表すTCGAからランダムに選択された100個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、卵巣がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図2C、表17)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発され
た。
次に、発明者らは、実施形態19(検出)で開発された加重卵巣がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、TCGAからの114人の卵巣がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で卵巣がんを検出することを実証した。この方法を使用して、86%の卵巣がんサンプルが卵巣がんとして検出された(図24A)。次に、発明者らは、卵巣がんと他の9種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、卵巣がんと他のがんを区別するための、スペックDNAメチル化スコアの有用性を実証した(図24A)。図24Bに示されるROC曲線は、卵巣がんを他の正常な組織および他のがんから区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.99)および感度(1)を明らかにしている(図24C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE46306(正常)からの20人の、そして子宮頸がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で子宮頸がんを検出する(図25B、表18)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプおよび血液を表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、子宮頸がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図25C、表19)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態21(検出)で開発された加重子宮頸がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、TCGAからの313人の子宮頸がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で子宮頸がんを検出することを実証した。この方法を使用して、91%の子宮頸がんサンプルが子宮頸がんとして検出された(図26A)。次に、発明者らは、子宮頸がんと他の9種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、子宮頸がんと他のがんを区別するための、スペックDNAメチル化スコアの有用性を実証した(図26A)。図26Bに示されるROC曲線は、子宮頸がんの検出、および子宮頸がんを他の正常な組織および他のがんから区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.9)および感度(0.9)を明らかにしている(図26C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE(52068)(正常)からの10人の、そしてHNSC DNAメチル化データのTCGAがんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルから正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性でHNSCを検出する(図27B、表20)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、12種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、HNSCと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図27C、表21)(スペック)。
次に、発明者らは、実施形態23(検出)で開発された加重HNSC DNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE52068からの正規化されたIllumina 450K
DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」でHNSCを検出することを実証した。この方法を使用して、88%〜96%のHNSCサンプルが検出された(図28A)。次に、発明者らは、HNSCと他の12種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、HNSCと他のがんを区別するための、DNAメチル化検出スコアの有用性を実証した(図28A)。図28Bに示されるROC曲線は、HNSCを他の正常な組織および他のがんから区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.86)および感度(0.88)を明らかにしている(図28C)。マーカーは、他のいくつかのがんも検出する(比較的高感度であるため、これらのがんに対する特異性は限られている)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE(52068)(正常)からの10人の、そして食道がんDNAメチル化データのTCGAがんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で食道がんを検出する(図29B、表22)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、12種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、食道がんと他の腫瘍との間で区別的にメ
チル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図29C、表23)(スペック)。
次に、発明者らは、実施形態25(検出)で開発された加重食道がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE52068からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で食道がんを検出することを実証した。この方法を使用して、88%〜96%の食道がんサンプルが検出された(図30A)。次に、発明者らは、食道がんと他の12種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、食道がんと他のがんを区別するための、検出DNAメチル化スコアの有用性を実証した(図30A)。図30Bに示されるROC曲線は、食道がんを他の正常な組織および他のがんから区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.86)および感度(0.88)を明らかにしている(図30C)。マーカーは、他のいくつかのがんも検出する(比較的高感度であるため、これらのがんに対する特異性は限られている)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE52955(正常)からの5人の、そして膀胱がんDNAメチル化データのTCGAがんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で膀胱がんを検出する(図31B、表24)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、13種の異なる腫瘍タイプおよび正常な血液を表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、膀胱がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図31C、表25)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態27(検出)で開発された加重膀胱がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、TCGAからの439人の膀胱がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で膀胱がんを検出することを実証した。この方法を使用して、96%の膀胱がんサンプルが膀胱がんとして検出された(図32B)。次に、発明者らは、膀胱がんと他の13種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、膀胱がんと他のがんを区別するための、スペックDNAメチル化スコアの有用性を実証した(図32B)。図32Cに示されるROC曲線は、膀胱がんを他の正常な組織および他のがんから区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.86)および感度(0.88)を明らかにしている(図32C)。しかし、かなり高い割合で胃がん、膵臓がん、食道がん、お
よび大腸がんの交差検出がある。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE52955(正常)からの10人の、そしてTCGAデータセットにある13種のがんよりがんごとにランダムに選択された10個のサンプルからの、腎臓がんのための正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用し、そして正常な組織および血液(GSE40279、GSE52955)を使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCDhypo法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で腎臓がんを検出し、そして他のがんに対して腎臓がんに特異的である「検出−スペック」(図33B、表26)(検出−スペック)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。
発明者らは、実施形態27(検出−スペック)で開発された加重腎臓がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、TCGAからの871人の腎臓がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で腎臓がんを検出し、腎臓がんを他のがんから区別することを実証した。この方法を使用して、90%の腎臓がんのサンプルが腎臓がんとして検出された(図34A)。次に、発明者らは、腎臓がんと他の13種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、腎臓がんと他のがんを区別するための、「検出−スペック」DNAメチル化スコアの有用性を実証した(図34A)。図34Bに示されるROC曲線は、腎臓がんを他の正常な組織および他のがんから検出するためのこのメチル化スコアの特異性(0.87)および感度(0.91)を明らかにしている(図34C)(HCC、脳がん、精巣がんとの高い交差)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人における腎臓がんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE46306(正常)からの13人の、そしTCGAデータセットにある13種のがんよりがんごとにランダムに選択された10個のサンプルからの、正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用し、そして正常な組織および血液(GSE40279、GSE61496)を使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCDhypo法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で精巣がんを検出し、そして他のがんに対して精巣がんに特異的である「検出−スペック」(図35B、表27)(検出−スペック)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態31(検出−スペック)で開発された加重精巣がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、TCGAからの156人の精巣がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で精巣がんを検出し、精巣がんを他のがんから区別することを実証した。この方法を使用して、96%の精巣がんサンプルが精巣がんとして検出された(図36A)。次に、発明者らは、精巣がんと他の13種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、精巣がんと他のがんを区別するための、「検出−スペック」DNAメチル化スコアの有用性を実証した(図36A)。図36Bに示されるROC曲線は、精巣がんを他の正常な組織および他のがんから検出するためのこのメチル化スコアの特異性(0.97)および感度(0.96)を明らかにしている(図36C)これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、TCGAデータセットにある13種のがん(膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、食道がん、HNSC、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん)よりがんごとにランダムに選択された10個のサンプルからの、正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用し、そしてTCGAとGEOからの正常な組織および血液を使用した。次に、発明者らは、表x−yにリストされている10種類のがんを検出するCGIDの組み合わせリストおよび10種の一般的ながんのいずれかを高い感度および特異性で検出する候補リストに挙げられたCGIDに対して罰則付き回帰を実行した(図37B、表28)(検出)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態33(「検出」)で開発された加重がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、他の正常な組織によるTCGAからの3644人のがん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で13種の一般的なのがん(膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、食道がん、HNSC、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん)を検出することを実証した。この方法を使用して、90%〜95%のがんサンプルが検出された(図38A)。図38Bに示されるROC曲線は、13種のがんを他の正常な組織から検出するためのこのメチル化スコアの特異性(0.99)および感度(0.95)を明らかにしている(図38C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、TCGAおよびGEOデータセット内のランダムに選択された10個の黒色腫サンプルと他のがん(膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、食道がん、HNSC、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん)および正常血液からの220個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DN
Aメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。次に、発明者らは、黒色腫の検出のためのCGIDの組み合わせリスト、および黒色腫を高い感度および特異性で検出する候補リストに挙げられたCGID対して罰則付き回帰を実行した(図39、表28)(検出−スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよび黒色腫の閾値がCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態35(「検出−スペック」)で開発された加重黒色腫DNAメチル化スコアおよび閾値が、他のがんおよび正常な組織によるTCGAからの475人の黒色腫患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で黒色腫を検出することを実証した。この方法を使用して、98%の黒色腫サンプルが検出された(図40A)。図40Bに示されるROC曲線は、黒色腫を他の正常な組織および他のがんから検出するためのこのメチル化スコアの特異性(0.98)および感度(0.95)を明らかにしている(図40C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人における黒色腫の早期発見に使用できる。
本発明者らは、GEOデータセット内のランダムに選択された10個のAMLサンプルと10個の正常な血液サンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。次に、発明者らは、AMLの検出のためのCGIDの組み合わせリスト、および黒色腫を高い感度および特異性で検出する候補リストに挙げられたCGID対して罰則付き回帰を実行した(図41、表27)(検出−スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよび黒色腫の閾値がCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態37(「検出−スペック」)で開発された加重黒色腫DNAメチル化スコアおよび閾値が、GEOからの79人のAML患者およびTCGAからの140人の患者、そして正常な血液からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」でAMLを検出することを実証した。この方法を使用して、100%のAMLサンプルが検出された(図42A)。図42Bに示されるROC曲線は、血液からのAMLを検出するためのこのメチル化スコアの特異性(1)および感度(1)を明らかにしている(図42C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、血液DNAを使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるAMLの早期発見に使用できる。
血液は、K3−EDTAを含む9mlチューブに収集され、1時間以内に処理された。新鮮な血液サンプルを4℃で1000gで10分間遠心分離した。細胞層を乱すことなく上澄みをファルコンチューブに注意深く移し、残りの細胞を完全に除去するために再度10分間遠心分離し、−80℃で凍結した。血漿サンプルを解凍し、血漿DNA用のQiagenキットやEZ DNA直接抽出法など、血漿DNA抽出用のいくつかの利用可能な方法と市販のキットでDNAを抽出する。AMPure XP磁気ビーズなどの市販の方法を使用してDNAを精製し、精製したDNAを、例えばEZ DNAバイサルファイト
処理キットを使用して亜硫酸水素ナトリウムで処理する。ターゲット配列のライブラリーは、2段階のPCR反応によって生成される(図40)。第一のPCR反応は、表5および表6の特定のCGIDをターゲットにする。PCR1プライマーは、第二のPCR2プライマーと相補的な配列を持っていることに注意する(図40)。本発明者らは、HEK293細胞からのヒトバイサルファイト変換ゲノムDNAを使用して、標準的なTaqポリメラーゼ反応で以下のプライマーを使用したマルチプレックスPCR反応において、HIF3A(232塩基対領域)、TPM4(213塩基対領域)、およびCTTN(199塩基対領域)から前立腺がんを検出するCGIDを含むDNAの3つの配列を同時に増幅した:CGID cg02879662の場合、フォワードプライマー:
およびリバースプライマー:
CGID cg16232979の場合、フォワードプライマー:
およびリバースプライマー:
CGID:cg14041701およびcg14498227の場合、フォワードプライマー:
およびリバースプライマー:
増幅した断片をアガロースゲルで分画した。
フォワードプライマー:
バーコードプライマー(リバース):
(太字の塩基はインデックスである。このインデックスの200のバリエーションが使用される。プライマーの第二のセットは、各患者のインデックスと、リバースおよびフォワードシーケンスプライマーを導入する。前立腺がんHIF3A 232 bp、TPM4
213 bp、およびCTTN 199 bpの3つのマーカーに対するマルチプレックスPCR1反応は、図41に示すように、さまざまなプライマー濃度を使用する右側のパネルに表示される。
方法の有用性、およびがんを予測するためのメチル化スコアの計算。
本発明者らは、実施形態35が、何百人もの患者からの血漿サンプルを使用して、前立腺がんおよび他のがんを同時にハイスループット(high throughput)予測することに使用され得ることを実証する。高度に予測可能なCG IDのインデックス付き増幅と、がんを示すメチル化スコアを計算するための合理化された方法は、前立腺がんと他のがんの早期発見に使用できる。
血漿DNAは、40人の健康な個人から調製された血漿から抽出され、次のがんのがん特異的プライマーによる標的増幅に供された:肝臓がん、前立腺がん、肺がん(図43)および胃がん、汎がんおよびCRC(図44)、その後、実施形態39および実施形態40に記載されているように、第2の増幅セット(PCR2)および次世代シーケンスを使用したバーコード化を行った。すべてのCGは、健康な人々からの血漿において非常に低レベルのメチル化を示した(図43および図44)。
PCR2の産物は、定量化と精製を組み合わせて、Miseq Illuminaシーケンサーで次世代シーケンスにかけられる。シーケンスは、インデックス付きシーケンス用のIlluminaのソフトウェアを使用して逆多重化され(demultiplexed)、各患者に対してFASTQファイルが生成される。Perlテキスト編集スクリプトhttps://www.activestate.com/activeperl/downloadsを使用して、患者ごとのCG IDごとのFASTQファイル内のTとCをカウントし、C/C+Tの数を除算して患者の一つのCG ID内のメチル化したCの割合を定量化する。(図42のスキームを参照)。出力CSVファイルは、方程式を使用して各患者のメチル化スコア(Ms)を計算するために使用される。方程式:
、α=切片、β=CG IDiの係数、CG=1からnまでのCG IDの組み合わせでのCGあたりのメチル化レベル。n=組み合わせたCGの数。MS=メチル化スコア。
本発明の主題の用途は、一般に、分子診断およびがんの早期予測の分野にある。当業者は、本発明の主題を使用して、神経疾患、糖尿病、肝硬変および心血管疾患における心臓組織の損傷などの心臓病など、細胞死および無細胞DNAのシステムへの脱落を伴う他のがんおよび他の疾患の早期予測のための同様の非侵襲性バイオマーカーを導き出すことができる。本発明の主題は、BCDおよびBCDhypo法を使用して、特定の細胞のタイプおよび組織の精巧なメチル化マーカーを見つける方法を提供する。がんを早期に検出し、生存率を劇的に高め、がんから治癒するために当業者が使用することができる広範囲のがんの早期予測のための方法およびバイオマーカーも開示される。本発明により開示された方法は、健康な人々に定期的な毎年のスクリーニングを行い、がんを発症し始めている人々を特定し、直ちに治療し、がんの死亡率と罹患率の悲惨な個人的社会的および経済的影響を防止するため、また、「リスクの高い」人々を監視し、再発または転移を検出するために治療を受けている患者の治療に対する反応を監視するために、当業者により使用され得る。ここに記載された本発明の、医療提供者および健康診断施設による日常の医療管理のための採用は、がんの負担および医療費の削減に大きな影響を与えるであろう。
れらの請求項の組み合わせを使用できないことを意味するものではない。がんを測定し、統計的に分析および予測するために本明細書に開示されている実施形態は、限定的であると考えられるべきではない。Illumina EPICアレイ、キャプチャーアレイシーケンス、次世代シーケンス、メチル化特異的PCR、エピタイパー、制限酵素ベースの分析、そしてパブリックドメインにあるその他の方法など、がん患者のDNAメチル化を測定するためのさまざまな他の変更が当業者には明らかである。同様に、患者サンプル中のがんの予測のために本発明の主題を使用するために、ここに挙げられているものに加えて、パブリックドメインには多数の統計方法がある。
cg08884571,cg00011225,cg23946709
遺伝子発現オムニバス(Gene expression Omnibus)(GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/またはがんゲノムアトラス(The Cancer Genome Atlas)TCGA https://cancergenome.nih.gov/公開データベースのいずれかに寄託された多数の個人からのヒトゲノム全体の〜450,000CGのメチル化の正規化されたベータ値の公開されているデータベースを使用した。次のデータベースを使用して、多くの正常組織および血液DNA:GSE61496、GSE40279にある強力な非メチル化CG IDのリストを取得した。
次に、発明者らは、実施形態5(検出)で開発された加重肺がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE66836、GSE63704、GSE76269からの、およびTCGAの919人の肺がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で肺がんを検出することを実証した。この方法を使用して、96%の肺がんサンプルが肺がんとして検出された(図9A)。次に、発明者らは、肺がんと他の8種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、肺がんと他のがんを区別するための、スペックおよび検出のDNAメチル化スコアを組み合わせた有用性を実証した(図9A)。図9Bに示されるROC曲線は、肺がんを他の正常な組織および他のがんから検出するための、このメチル化スコアの特異性(0.96)および感度(0.84)を明らかにしている(図9C)。これらのDNAメチル化マーカーと計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE52955(正常な前立腺)からの5人の、そして前立腺がんDNAメチル化データのTCGA前立腺がんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で前立腺がんを検出する(図10B、表5)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、前立腺がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図10C、表5)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態7(検出)で開発された加重前立腺がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE73549、GSE2955からの、およびTCGAの430人の前立腺がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で前立腺がんを検出することを実証した。この方法を使用して、99%の前立腺がんサンプルが前立腺がんとして検出された(図11A)。次に、発明者らは、前立腺がんと他の8種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、前立腺がんと他のがんを区別するための、スペックおよび検出のDNAメチル化スコアを組み合わせた有用性を実証した(図11A)。図11Bに示されるROC曲線は、前立腺がんを他の正常な組織および他のがんから検出するための、このメチル化スコアの特異性(0.99)および感度(0.98)を明らかにしている(図11C)。これらのDNAメチル化マーカーと計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE60185(正常な乳房)からの17人の、そして乳がんDNAメチル化データのTCGA乳がんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で乳がんを検出する(図12B、表6)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、乳がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図12C、表7)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE(32146)(正常)からの25人の、そして大腸がんDNAメチル化データのTCGA大腸がんコレクションからランダムに選択された50個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で大腸がんを検出する(図15B、表8)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、大腸がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図15C、表8)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE53051(正常)からの12人の、そして膵臓がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された20個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプ
ル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で膵臓がんを検出する(図17B、表9)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、10種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された100個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、膵臓がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図17C、表10)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE65820(正常)からの10人の、そして脳がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された10個のサンプからルの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で脳がんを検出する(図19B、表11)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、11種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された110個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、検出のCGIDはまた、脳がんと他の腫瘍とを区別することを発見した(図19B、表11)(検出−スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態15(検出)で開発された加重脳がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、TCGAからの689人の脳がん患者、GSE58298からの40人の患者およびGSE36278からの136人の患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で脳がんを検出することを実証した。この方法を使用して、91%〜97%の脳がんサンプルが脳がんとして検出された(図20A)。次に、発明者らは、脳がんと他の9種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、脳がんと他のがんを区別するための、同様のCGIDの有用性を実証した(図20A)。図20Bに示されるROC曲線は、脳がんを他の正常な組織および他のがんから検出するためのこのメチル化
スコアの特異性(1)および感度(0.97)を明らかにしている(図20C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE99553(正常)からの18人の、そして胃がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で胃がんを検出する(図21B、表12)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、11種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された100個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、胃がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図21C、表13)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE65820(正常)からの5人の、そして卵巣がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された10個のサンプからルの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で卵巣がんを検出する(図23B、表14)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、10種の異なる腫瘍タイプおよび血液を表すTCGAからランダムに選択された100個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、卵巣がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図23C、表15)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE46306(正常)からの20人の、そして子宮頸がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で子宮頸がんを検出する(図25B、表16)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプおよび血液を表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、子宮頸がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図25C、表17)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE(52068)(正常)からの10人の、そしてHNSC DNAメチル化データのTCGAがんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルから正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性でHNSCを検出する(図27B、表18)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、12種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、HNSCと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図27C、表19)(スペック)。
次に、発明者らは、実施形態23(検出)で開発された加重HNSC DNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE52068、GSE75537およびGSE79556からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」でHNSCを検出することを実証した。この方法を使用して、88%〜96%のHNSCサンプルが検出された(図28A)。次に、発明者らは、HNSCと他の12種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、HNSCと他のがんを区別するための、DNAメチル化検出スコアの有用性を実証した(図28A)。図28Bに示されるROC曲線は、HNSCを他の正常な組織および他のがんから区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.86)および感度(0.88)を明らかにしている(図28C)。マーカーは、他のいくつかのがんも検出する(比較的高感度であるため、これらのがんに対する特異性は限られている)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE(52068)(正常)からの10人の、そして食道がんDNAメチル化データのTCGAがんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で食道がんを検出する(図29B、表20)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、12種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、食道がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図29C、表21)(スペック)。
次に、発明者らは、実施形態25(検出)で開発された加重食道がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE52068、GSE75537およびGSE79556からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コ
ーホート」で食道がんを検出することを実証した。この方法を使用して、88%〜96%の食道がんサンプルが検出された(図30A)。次に、発明者らは、食道がんと他の12種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、食道がんと他のがんを区別するための、検出DNAメチル化スコアの有用性を実証した(図30A)。図30Bに示されるROC曲線は、食道がんを他の正常な組織および他のがんから区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.86)および感度(0.88)を明らかにしている(図30C)。マーカーは、他のいくつかのがんも検出する(比較的高感度であるため、これらのがんに対する特異性は限られている)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE52955(正常)からの5人の、そして膀胱がんDNAメチル化データのTCGAがんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で膀胱がんを検出する(図31B、表22)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、13種の異なる腫瘍タイプおよび正常な血液を表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、膀胱がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図31C、表23)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE52955(正常)からの10人の、そしてTCGAデータセットにある13種のがんよりがんごとにランダムに選択された10個のサンプルからの、腎臓がんのための正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用し、そして正常な組織および血液(GSE40279、GSE52955)を使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCDhypo法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で腎臓がんを検出し、そして他のがんに対して腎臓がんに特異的
である「検出−スペック」(図33B、表24)(検出−スペック)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。
発明者らは、実施形態29(検出−スペック)で開発された加重腎臓がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、TCGAからの871人の腎臓がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で腎臓がんを検出し、腎臓がんを他のがんから区別することを実証した。この方法を使用して、90%の腎臓がんのサンプルが腎臓がんとして検出された(図34A)。次に、発明者らは、腎臓がんと他の13種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、腎臓がんと他のがんを区別するための、「検出−スペック」DNAメチル化スコアの有用性を実証した(図34A)。図34Bに示されるROC曲線は、腎臓がんを他の正常な組織および他のがんから検出するためのこのメチル化スコアの特異性(0.87)および感度(0.91)を明らかにしている(図34C)(HCC、脳がん、精巣がんとの高い交差)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人における腎臓がんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE46306(正常)からの13人の、そしTCGAデータセットにある13種のがんよりがんごとにランダムに選択された10個のサンプルからの、正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用し、そして正常な組織および血液(GSE40279、GSE61496)を使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCDhypo法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で精巣がんを検出し、そして他のがんに対して精巣がんに特異的である「検出−スペック」(図35B、表25)(検出−スペック)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。
本発明者らは、TCGAデータセットにある13種のがん(膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、食道がん、HNSC、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん)よりがんごとにランダムに選択された10個のサンプルからの、正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用し、そしてTCGAとGEOからの正常な組織および血液を使用した。次に、発明者らは、表x−yにリストされている10種類のがんを検出するCGIDの組み合わせリストおよび10種の一般的ながんのいずれかを高い感度および特異性で検出する候補リストに挙げられたCGIDに対して罰則付き回帰を実行した(図37B、表26)(検出)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。
本発明者らは、GEOデータセット内のランダムに選択された10個のAMLサンプルと10個の正常な血液サンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。次に、発明者らは、AMLの検出のためのCGIDの組み合わせリスト、およびAMLを高い感度および特異性で検出する候補リストに挙げられたCGID対して罰則付き回帰を実行した(図41、表27)(検出−スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびAMLの閾値がCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態37(「検出−スペック」)で開発された加重AML DNAメチル化スコアおよび閾値が、GEOからの79人のAML患者およびTCGAからの140人の患者、そして正常な血液からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」でAMLを検出することを実証した。この方法を使用して、100%のAMLサンプルが検出された(図42A)。図42Bに示されるROC曲線は、血液からのAMLを検出するためのこのメチル化スコアの特異性(1)および感度(1)を明らかにしている(図42C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、血液DNAを使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるAMLの早期発見に使用できる。
血液は、K3−EDTAを含む9mlチューブに収集され、1時間以内に処理された。新鮮な血液サンプルを4℃で1000gで10分間遠心分離した。細胞層を乱すことなく上澄みをファルコンチューブに注意深く移し、残りの細胞を完全に除去するために再度10分間遠心分離し、−80℃で凍結した。血漿サンプルを解凍し、血漿DNA用のQiagenキットやEZ DNA直接抽出法など、血漿DNA抽出用のいくつかの利用可能な方法と市販のキットでDNAを抽出する。AMPure XP磁気ビーズなどの市販の方法を使用してDNAを精製し、精製したDNAを、例えばEZ DNAバイサルファイト処理キットを使用して亜硫酸水素ナトリウムで処理する。ターゲット配列のライブラリーは、2段階のPCR反応によって生成される(図40)。第一のPCR反応は、表5および表6の特定のCGIDをターゲットにする。PCR1プライマーは、第二のPCR2プライマーと相補的な配列を持っていることに注意する(図45)。本発明者らは、HEK293細胞からのヒトバイサルファイト変換ゲノムDNAを使用して、標準的なTaqポリメラーゼ反応で以下のプライマーを使用したマルチプレックスPCR反応において、HIF3A(232塩基対領域)、TPM4(213塩基対領域)、およびCTTN(199塩基対領域)から前立腺がんを検出するCGIDを含むDNAの3つの配列を同時に増幅した:CGID cg02879662の場合、フォワードプライマー:
およびリバースプライマー:
CGID cg16232979の場合、フォワードプライマー:
およびリバースプライマー:
CGID:cg14041701およびcg14498227の場合、フォワードプライマー:
およびリバースプライマー:
増幅した断片をアガロースゲルで分画した。
用する:
フォワードプライマー:
バーコードプライマー(リバース):
(太字の塩基はインデックスである。このインデックスの200のバリエーションが使用される。プライマーの第二のセットは、各患者のインデックスと、リバースおよびフォワードシーケンスプライマーを導入する。前立腺がんHIF3A 232 bp、TPM4
213 bp、およびCTTN 199 bpの3つのマーカーに対するマルチプレックスPCR1反応は、図46に示すように、さまざまなプライマー濃度を使用する右側のパネルに表示される。
本発明者らは、実施形態39が、何百人もの患者からの血漿サンプルを使用して、前立腺がんおよび他のがんを同時にハイスループット(high throughput)予測することに使用され得ることを実証する。高度に予測可能なCG IDのインデックス付き増幅と、がんを示すメチル化スコアを計算するための合理化された方法は、前立腺がんと他のがんの早期発見に使用できる。
cg08884571,cg00011225,cg23946709
遺伝子発現オムニバス(Gene expression Omnibus)(GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/またはがんゲノムアトラス(The Cancer Genome Atlas)TCGA https://cancergenome.nih.gov/公開データベースのいずれかに寄託された多数の個人からのヒトゲノム全体の〜450,000CGのメチル化の正規化されたベータ値の公開されているデータベースを使用した。次のデータベースを使用して、多くの正常組織および血液DNA:GSE61496、GSE40279にある強力な非メチル化CG IDのリストを取得した。
次に、発明者らは、実施形態5(検出)で開発された加重肺がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE66836、GSE63704、GSE76269からの、およびTCGAの919人の肺がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で肺がんを検出することを実証した。この方法を使用して、96%の肺がんサンプルが肺がんとして検出された(図9A)。次に、発明者らは、肺がんと他の8種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、肺がんと他のがんを区別するための、スペックおよび検出のDNAメチル化スコアを組み合わせた有用性を実証した(図9A)。図9Bに示されるROC曲線は、肺がんを他の正常な組織および他のがんから検出するための、このメチル化スコアの特異性(0.96)および感度(0.84)を明らかにしている(図9C)。これらのDNAメチル化マーカーと計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE52955(正常な前立腺)からの5人の、そして前立腺がんDNAメチル化データのTCGA前立腺がんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で前立腺がんを検出する(図10B、表5)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、前立腺がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図10C、表5)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態7(検出)で開発された加重前立腺がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE73549、GSE2955からの、およびTCGAの430人の前立腺がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で前立腺がんを検出することを実証した。この方法を使用して、99%の前立腺がんサンプルが前立腺がんとして検出された(図11A)。次に、発明者らは、前立腺がんと他の8種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、前立腺がんと他のがんを区別するための、スペックおよび検出のDNAメチル化スコアを組み合わせた有用性を実証した(図11A)。図11Bに示されるROC曲線は、前立腺がんを他の正常な組織および他のがんから検出するための、このメチル化スコアの特異性(0.99)および感度(0.98)を明らかにしている(図11C)。これらのDNAメチル化マーカーと計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE60185(正常な乳房)からの17人の、そして乳がんDNAメチル化データのTCGA乳がんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で乳がんを検出する(図12B、表6)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、乳がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図12C、表7)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE(32146)(正常)からの25人の、そして大腸がんDNAメチル化データのTCGA大腸がんコレクションからランダムに選択された50個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で大腸がんを検出する(図15B、表8)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、大腸がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図15C、表8)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE53051(正常)からの12人の、そして膵臓がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された20個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプ
ル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で膵臓がんを検出する(図17B、表9)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、10種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された100個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、膵臓がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図17C、表10)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE65820(正常)からの10人の、そして脳がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された10個のサンプからルの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で脳がんを検出する(図19B、表11)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、11種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された110個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、検出のCGIDはまた、脳がんと他の腫瘍とを区別することを発見した(図19B、表11)(検出−スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態15(検出)で開発された加重脳がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、TCGAからの689人の脳がん患者、GSE58298からの40人の患者およびGSE36278からの136人の患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で脳がんを検出することを実証した。この方法を使用して、91%〜97%の脳がんサンプルが脳がんとして検出された(図20A)。次に、発明者らは、脳がんと他の9種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、脳がんと他のがんを区別するための、同様のCGIDの有用性を実証した(図20A)。図20Bに示されるROC曲線は、脳がんを他の正常な組織および他のがんから検出するためのこのメチル化
スコアの特異性(1)および感度(0.97)を明らかにしている(図20C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE99553(正常)からの18人の、そして胃がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で胃がんを検出する(図21B、表12)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、11種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された100個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、胃がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図21C、表13)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE65820(正常)からの5人の、そして卵巣がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された10個のサンプからルの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で卵巣がんを検出する(図23B、表14)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、10種の異なる腫瘍タイプおよび血液を表すTCGAからランダムに選択された100個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、卵巣がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図23C、表15)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE46306(正常)からの20人の、そして子宮頸がんDNAメチル化データのTCGAコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で子宮頸がんを検出する(図25B、表16)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、8種の異なる腫瘍タイプおよび血液を表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、子宮頸がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図25C、表17)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE(52068)(正常)からの10人の、そしてHNSC DNAメチル化データのTCGAがんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルから正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性でHNSCを検出する(図27B、表18)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、12種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、HNSCと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図27C、表19)(スペック)。
次に、発明者らは、実施形態23(検出)で開発された加重HNSC DNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE52068、GSE75537およびGSE79556からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」でHNSCを検出することを実証した。この方法を使用して、88%〜96%のHNSCサンプルが検出された(図28A)。次に、発明者らは、HNSCと他の12種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、HNSCと他のがんを区別するための、DNAメチル化検出スコアの有用性を実証した(図28A)。図28Bに示されるROC曲線は、HNSCを他の正常な組織および他のがんから区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.86)および感度(0.88)を明らかにしている(図28C)。マーカーは、他のいくつかのがんも検出する(比較的高感度であるため、これらのがんに対する特異性は限られている)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE(52068)(正常)からの10人の、そして食道がんDNAメチル化データのTCGAがんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で食道がんを検出する(図29B、表20)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、12種の異なる腫瘍タイプを表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、食道がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図29C、表21)(スペック)。
次に、発明者らは、実施形態25(検出)で開発された加重食道がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、GSE52068、GSE75537およびGSE79556からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コ
ーホート」で食道がんを検出することを実証した。この方法を使用して、88%〜96%の食道がんサンプルが検出された(図30A)。次に、発明者らは、食道がんと他の12種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、食道がんと他のがんを区別するための、検出DNAメチル化スコアの有用性を実証した(図30A)。図30Bに示されるROC曲線は、食道がんを他の正常な組織および他のがんから区別するためのこのメチル化スコアの特異性(0.86)および感度(0.88)を明らかにしている(図30C)。マーカーは、他のいくつかのがんも検出する(比較的高感度であるため、これらのがんに対する特異性は限られている)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるがんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE52955(正常)からの5人の、そして膀胱がんDNAメチル化データのTCGAがんコレクションからランダムに選択された10個のサンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCD法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で膀胱がんを検出する(図31B、表22)(検出)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。次に、発明者らは、13種の異なる腫瘍タイプおよび正常な血液を表すTCGAからランダムに選択された80個のDNAメチル化サンプルから「トレーニングコーホート」を生成した。本発明者らは、このトレーニングコーホートを使用して、膀胱がんと他の腫瘍との間で区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した(図31C、表23)(スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアがCGIDのために開発された。
本発明者らは、GSE52955(正常)からの10人の、そしてTCGAデータセットにある13種のがんよりがんごとにランダムに選択された10個のサンプルからの、腎臓がんのための正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用し、そして正常な組織および血液(GSE40279、GSE52955)を使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCDhypo法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で腎臓がんを検出し、そして他のがんに対して腎臓がんに特異的
である「検出−スペック」(図33B、表24)(検出−スペック)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。
発明者らは、実施形態29(検出−スペック)で開発された加重腎臓がんDNAメチル化スコアおよび閾値が、TCGAからの871人の腎臓がん患者からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」で腎臓がんを検出し、腎臓がんを他のがんから区別することを実証した。この方法を使用して、90%の腎臓がんのサンプルが腎臓がんとして検出された(図34A)。次に、発明者らは、腎臓がんと他の13種類のがんのGSEとTCGAからのメチル化データと共に「検証コーホート」を使用して、腎臓がんと他のがんを区別するための、「検出−スペック」DNAメチル化スコアの有用性を実証した(図34A)。図34Bに示されるROC曲線は、腎臓がんを他の正常な組織および他のがんから検出するためのこのメチル化スコアの特異性(0.87)および感度(0.91)を明らかにしている(図34C)(HCC、脳がん、精巣がんとの高い交差)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、患者からの組織、糞便、唾液、血漿および尿からの異なる生体材料を使用して、リスクのある人や一般的な健康な人における腎臓がんの早期発見に使用できる。
本発明者らは、GSE46306(正常)からの13人の、そしTCGAデータセットにある13種のがんよりがんごとにランダムに選択された10個のサンプルからの、正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用し、そして正常な組織および血液(GSE40279、GSE61496)を使用した。本発明者らは最初に、実施形態1で正常な組織および血液サンプル全体で強力にメチル化されていないサイトとして発見された、「トレーニングコーホート」データセット28754 CGIDを候補リストに挙げた。次に、発明者らは、実施形態2に記載のBCDhypo法を使用して、トレーニングコーホートにおいて高い感度および特異性で精巣がんを検出し、そして他のがんに対して精巣がんに特異的である「検出−スペック」(図35B、表25)(検出−スペック)、バイナリーカテゴリー区別的にメチル化されたCGIDのポリジーンセットを発見した。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。
本発明者らは、TCGAデータセットにある13種のがん(膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、食道がん、HNSC、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん)よりがんごとにランダムに選択された10個のサンプルからの、正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用し、そしてTCGAとGEOからの正常な組織および血液を使用した。次に、発明者らは、表x−yにリストされている10種類のがんを検出するCGIDの組み合わせリストおよび10種の一般的ながんのいずれかを高い感度および特異性で検出する候補リストに挙げられたCGIDに対して罰則付き回帰を実行した(図37B、表26)(検出)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびがんの閾値がCGIDのために開発された。
本発明者らは、GEOデータセット内のランダムに選択された10個のAMLサンプルと10個の正常な血液サンプルからの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化データを「トレーニング」コーホートとして使用した。次に、発明者らは、AMLの検出のためのCGIDの組み合わせリスト、およびAMLを高い感度および特異性で検出する候補リストに挙げられたCGID対して罰則付き回帰を実行した(図41、表27)(検出−スペック)。実施形態2で説明したように、加重DNAメチル化スコアおよびAMLの閾値がCGIDのために開発された。
次に、発明者らは、実施形態37(「検出−スペック」)で開発された加重AML DNAメチル化スコアおよび閾値が、GEOからの79人のAML患者およびTCGAからの140人の患者、そして正常な血液からの正規化されたIllumina 450K DNAメチル化ベータ値が含まれる「検証コーホート」でAMLを検出することを実証した。この方法を使用して、100%のAMLサンプルが検出された(図42A)。図42Bに示されるROC曲線は、血液からのAMLを検出するためのこのメチル化スコアの特異性(1)および感度(1)を明らかにしている(図42C)。これらのDNAメチル化マーカーとメチル化値からの計算されたメチル化スコアは、血液DNAを使用して、リスクのある人や一般的な健康な人におけるAMLの早期発見に使用できる。
血液は、K3−EDTAを含む9mlチューブに収集され、1時間以内に処理された。新鮮な血液サンプルを4℃で1000gで10分間遠心分離した。細胞層を乱すことなく上澄みをファルコンチューブに注意深く移し、残りの細胞を完全に除去するために再度10分間遠心分離し、−80℃で凍結した。血漿サンプルを解凍し、血漿DNA用のQiagenキットやEZ DNA直接抽出法など、血漿DNA抽出用のいくつかの利用可能な方法と市販のキットでDNAを抽出する。AMPure XP磁気ビーズなどの市販の方法を使用してDNAを精製し、精製したDNAを、例えばEZ DNAバイサルファイト処理キットを使用して亜硫酸水素ナトリウムで処理する。ターゲット配列のライブラリーは、2段階のPCR反応によって生成される(図40)。第一のPCR反応は、表5および表6の特定のCGIDをターゲットにする。PCR1プライマーは、第二のPCR2プライマーと相補的な配列を持っていることに注意する(図45)。本発明者らは、HEK293細胞からのヒトバイサルファイト変換ゲノムDNAを使用して、標準的なTaqポリメラーゼ反応で以下のプライマーを使用したマルチプレックスPCR反応において、HIF3A(232塩基対領域)、TPM4(213塩基対領域)、およびCTTN(199塩基対領域)から前立腺がんを検出するCGIDを含むDNAの3つの配列を同時に増幅した:CGID cg02879662の場合、フォワードプライマー:
およびリバースプライマー:
CGID cg16232979の場合、フォワードプライマー:
およびリバースプライマー:
CGID:cg14041701およびcg14498227の場合、フォワードプライマー:
およびリバースプライマー:
増幅した断片をアガロースゲルで分画した。
用する:
フォワードプライマー:
バーコードプライマー(リバース):
(太字の塩基はインデックスである。このインデックスの200のバリエーションが使用される。プライマーの第二のセットは、各患者のインデックスと、リバースおよびフォワードシーケンスプライマーを導入する。前立腺がんHIF3A 232 bp、TPM4
213 bp、およびCTTN 199 bpの3つのマーカーに対するマルチプレックスPCR1反応は、図46に示すように、さまざまなプライマー濃度を使用する右側のパネルに表示される。
本発明者らは、実施形態39が、何百人もの患者からの血漿サンプルを使用して、前立腺がんおよび他のがんを同時にハイスループット(high throughput)予測することに使用され得ることを実証する。高度に予測可能なCG IDのインデックス付き増幅と、がんを示すメチル化スコアを計算するための合理化された方法は、前立腺がんと他のがんの早期発見に使用できる。
Claims (54)
- ゲノムワイドDNAメチル化マップから「バイナリーカテゴリー区別(BCD)」法を使用して「バイナリー」DNAメチル化シグネチャを導出するステップを含む、がんの「バイナリーカテゴリー」DNAメチル化シグネチャを使用してがんを検出する方法。
- 前記ゲノムワイドDNAメチル化マップが、がん細胞、正常な組織および血液DNAの1つ以上である、請求項1に記載の方法。
- 前記「バイナリーカテゴリー区別(BCD)」法が、Illumina27K、450KまたはEPICアレイ、ゲノムワイドバイサルファイトシーケンス、メチル化DNA免疫沈降(MeDIP)シーケンス、およびオリゴヌクレオチドアレイとのハイブリダイゼーションの1つ以上の使用を含む、請求項1に記載の方法。
- 次の表とサブセットから1つ以上のCG IDのDNAメチル化レベルを測定すること、そして患者由来の唾液、尿、糞便および無細胞血漿DNAなどの生物学的材料にある腫瘍に由来するDNAの「バイナリーカテゴリー」または線形回帰方程式、および受信者動作特性(ROC)アッセイを使用した「がんメチル化スコア」を導き出すことにより、乳
がんを検出し(検出)、そして他の腫瘍と区別する(スペック)ための請求項1に記載の方法。
表とサブセットは、次のとおりである。
検出するためのサブセット:
cg13031251,cg09734791,cg09695735,cg03637878;および
スペックのためのサブセット:
cg03113878,cg20180843 - 次の表とサブセットから1つ以上のCG IDのDNAメチル化レベルを測定すること、そして患者由来の唾液、尿、糞便および無細胞血漿DNAなどの生物学的材料にある腫瘍に由来するDNAの「バイナリーカテゴリー」または線形回帰方程式、および受信者動
作特性(ROC)アッセイを使用した「がんメチル化スコア」を導き出すことにより、膵臓がんを検出し(検出)、そして他の腫瘍と区別する(スペック)ための請求項1に記載の方法。
表とサブセットは、次のとおりである。
検出するためのサブセット:
cg25024074,cg15386964,cg16232979;および
スペックのためのサブセット:
cg01237565,cg08182975,cg20983577,cg25591377 - 次の表とサブセットから1つ以上のCG IDのDNAメチル化レベルを測定すること、そして患者由来の唾液、尿、糞便および無細胞血漿DNAなどの生物学的材料にある腫瘍に由来するDNAの「バイナリーカテゴリー」または線形回帰方程式、および受信者動作特性(ROC)アッセイを使用した「がんメチル化スコア」を導き出すことにより、胃(gastric)[胃(stomach)]がんを検出し(検出)、そして他の腫瘍と区別する(スペック)ための請求項1に記載の方法。
表とサブセットは、次のとおりである。
検出するためのサブセット:
cg05611779,cg09734791,cg15760257;および
スペックのためのサブセット:
cg0511779,cg19235339 - 次の表とサブセットから1つ以上のCG IDのDNAメチル化レベルを測定すること、そして患者由来の唾液、尿、糞便および無細胞血漿DNAなどの生物学的材料にある腫瘍に由来するDNAの「バイナリーカテゴリー」または線形回帰方程式、および受信者動作特性(ROC)アッセイを使用した「がんメチル化スコア」を導き出すことにより、卵巣がんを検出し(検出)、そして他の腫瘍と区別する(スペック)ための請求項1に記載の方法。
表とサブセットは、次のとおりである。
検出するためのサブセット:
cg24339193,cg22694l53,cg11252337,cg21210985;および
スペックのためのサブセット:
cg07068768,cg19846609 - 次の表とサブセットから1つ以上のCG IDのDNAメチル化レベルを測定すること、そして患者由来の唾液、尿、糞便および無細胞血漿DNAなどの生物学的材料にある腫瘍に由来するDNAの「バイナリーカテゴリー」または線形回帰方程式、および受信者動作特性(ROC)アッセイを使用した「がんメチル化スコア」を導き出すことにより、子宮頸がんを検出し(検出)、そして他の腫瘍と区別する(スペック)ための請求項1に記載の方法。
表とサブセットは、次のとおりである。
検出するためのサブセット:
cg00757182,cg01601746;および
スペックのためのサブセット:
cg07066594,cg09260640,cg1296l842 - 次の表とサブセットから1つ以上のCG IDのDNAメチル化レベルを測定すること、そして患者由来の唾液、尿、糞便および無細胞血漿DNAなどの生物学的材料にある腫瘍に由来するDNAの「バイナリーカテゴリー」または線形回帰方程式、および受信者動作特性(ROC)アッセイを使用した「がんメチル化スコア」を導き出すことにより、頭頸部扁平上皮がんを検出し(検出)、そして他の腫瘍と区別する(スペック)ための請求項1に記載の方法。
表とサブセットは、次のとおりである。
検出するためのサブセット:
cg07900968,cg20334243,cg27420520;および
スペックのためのサブセット:
cg18006328,cg19287220 - 次の表とサブセットから1つ以上のCG IDのDNAメチル化レベルを測定すること、そして患者由来の唾液、尿、糞便および無細胞血漿DNAなどの生物学的材料にある腫瘍に由来するDNAの「バイナリーカテゴリー」または線形回帰方程式、および受信者動作特性(ROC)アッセイを使用した「がんメチル化スコア」を導き出すことにより、食道がんを検出し(検出)、そして他の腫瘍と区別する(スペック)ための請求項1に記載の方法。
表とサブセットは、次のとおりである。
検出するためのサブセット:
cg03280624,cg03735888,cg27420520,cg09734791;および
スペックのためのサブセット:
cg09556952,cg12473285 - 次の表とサブセットから1つ以上のCG IDのDNAメチル化レベルを測定すること、そして患者由来の唾液、尿、糞便および無細胞血漿DNAなどの生物学的材料にある腫瘍に由来するDNAの「バイナリーカテゴリー」または線形回帰方程式、および受信者動作特性(ROC)アッセイを使用した「がんメチル化スコア」を導き出すことにより、血液がんを検出する(検出)ための請求項1に記載の方法。
表とサブセットは、次のとおりである。 - 請求項1に記載の方法に従ってDNAメチル化スコアのDNAメチル化測定値を導き出すために使用される機器および1つ以上の試薬を含む、がんを検出するためのキット。
- 請求項4に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、肝細胞がん(HCC)を検出するためのキット。
- 請求項5に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、肺がんを検出するためのキット。
- 請求項6に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、前立腺がんを検出するためのキット。
- 請求項7に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、乳がんを検出するためのキット。
- 請求項8に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、大腸がんを検出するためのキット。
- 請求項9に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、膵臓がんを検出するためのキット。
- 請求項10に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、脳がん(膠芽腫)を検出するためのキット。
- 請求項11に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、胃(gastric)[胃(stomach)]がんを検出するためのキット。
- 請求項12に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、卵巣がんを検出するためのキット。
- 請求項13に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、子宮頸がんを検出するためのキット。
- 請求項14に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、頭頸部扁平上皮がん(HNSC)を検出するためのキット。
- 請求項15に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、食道がんを検出するためのキット。
- 請求項16に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、膀胱がんを検出するためのキット。
- 請求項17に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、腎臓がんを検出するためのキット。
- 請求項18に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、精巣がんを検出するためのキット。
- 請求項19に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、一般的な固形腫瘍を検出するためのキット。
- 請求項20に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、血液がんを検出するためのキット。
- 請求項21に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、急性骨髄性白血病(AML)を検出するためのキット。
- 請求項22に記載の方法による、DNAメチル化シグネチャのDNAメチル化測定値のための機器および1つ以上の試薬を含む、黒色腫を検出するためのキット。
- DNAメチル化の組み合わせを使用することによりがんを予測するためにDNAパイロシーケンスメチル化アッセイを使用するステップをさらに含む、請求項1乃至請求項22に記載の方法。
- がんを検出するためにIllumina MiSeqなどの次世代シーケンサーで多重増幅標的化バイサルファイトシーケンスを使用するステップをさらに含む、請求項1乃至請求項22に記載の方法。
- がんを予測するためのメチル化スコアを計算するために「バイナリーカテゴリーアッセイ」を使用するステップをさらに含む、請求項1乃至請求項22に記載の方法。
- がんを予測するためのメチル化スコアを計算するために多変量線形回帰方程式を使用するステップをさらに含む、請求項1乃至請求項22に記載の方法。
- DNAメチル化の組み合わせの測定値を使用することにより、受信者動作特性曲線(R
OC)アッセイを使用してがんを非がんおよび起源の組織から区別する「メチル化スコア」閾値を定義するステップをさらに含む、請求項1乃至請求項22に記載の方法。 - 唾液、尿、血漿、糞などの体液中の無細胞DNAの起源の組織または組織バイオプシーを検出するためのDNAメチル化シグネチャおよび「ポリジーンDNAメチル化マーカー」を識別する方法であり、該方法は、特定の組織のゲノムワイドDNAメチル化マップおよび他のすべての正常な組織と血液DNAのゲノムワイドDNAメチル化マップにおいて、Illumina27K、450KまたはEPICアレイ、ゲノムワイドバイサルファイトシーケンス、メチル化DNA免疫沈降(MeDIP)シーケンス、またはサンプルから取得したDNAメチル化測定値の統計分析を実行するステップを含むオリゴヌクレオチドアレイとのハイブリダイゼーションなどの「バイナリーカテゴリー区別(BCD)」法を使用することを含む。
- 血漿中の死にゆくニューロンCF DNAなどの識別がアルツハイマー病などの病気の早期発見に使用され得る、脳のニューロン、糖尿病の膵臓、虚血の心臓、および心臓病などの病変組織の「ポリジーンDNAメチル化マーカー」をさらに識別するための請求項48に記載の方法。
- 前記DNAメチル化測定値が、1つ以上のサンプルから抽出されたDNAのIlluminaビーズチップ450KまたはEPICアッセイを行うことによって得られる、請求項48に記載の方法。
- 前記DNAメチル化測定値が、iSeq、MiniSeq、MiSeqまたはNextSeqシーケンサー、トレントシーケンス、DNAパイロシーケンス、サンプルから抽出されたDNAの質量分析ベース(EpityperTM)およびPCRベースのメチル化アッセイの1つ以上のプラットフォームでIllumina次世代シーケンスを実行することにより得られる、請求項48に記載の方法。
- 前記統計分析はピアソン相関を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記統計分析が受信者動作特性曲線(ROC)アッセイを含む、請求項48に記載の方法。
- 前記統計分析が階層的クラスタリング分析アッセイを含む、請求項48に記載の方法。
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