JP2021527710A - マラセチア由来の化合物および／またはその化学的類縁体を含有する光保護組成物 - Google Patents

マラセチア由来の化合物および／またはその化学的類縁体を含有する光保護組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、皮膚色素沈着を調節し、ならびに被験体における、ＵＶによって誘発される、皮膚損傷、紅斑、皮膚の老化、日焼けおよび色素沈着過剰を処置または予防するための化合物、組成物および方法に関する。本発明の化合物、組成物および方法は、一般的には、マラセジンおよびインジルビンを含むマラセチア由来の化合物ならびに／またはその化学的類縁体を伴う。本明細書に開示されている化合物および組成物のその他の用途としては、色素沈着過剰障害によって引き起こされる色素沈着過剰を改善すること、メラニン形成細胞のアポトーシスを誘導すること、ならびにアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性、メラニン形成、メラニン産生、メラノソーム生合成、メラノソーム輸送、メラニン形成細胞活性およびメラニン濃度を調節することが挙げられるが、これらに限定されない。

Description

関連出願の相互参照
本発明は、２０１８年６月１５日に出願された米国仮出願第６２／６８５，８００号、２０１８年６月１９日に出願された米国仮出願第６２／６８６，９１２号、２０１８年８月２４日に出願された米国仮出願第６２／７２２，４１２号および２０１８年１０月８日に出願された米国仮出願第６２／７４２，６５７号の利益を主張する。先述の出願の内容全体が、参照により組み込まれる。さらに、２０１６年３月１０日に出願された米国仮出願第６２／３０６，４６８号、２０１８年４月１２日に出願された米国仮出願第６２／６５６，７６９号、２０１８年５月７日に出願された米国仮出願第６２／６６８，００７号、現在米国特許第１０，１３１，６３１号である２０１７年３月１０日に出願された米国特許出願第１５／４５５，９３２号、２０１９年４月１２日に出願された米国特許出願第１６／３８２，８９１号および２０１９年５月７日に出願された米国特許出願第１６／４０５，１２７号の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、マラセチア酵母によって産生されるまたはマラセチア酵母に由来する化合物およびその化学的類縁体に関する。本発明の化合物および該化合物を含有する組成物は、他の有益な特性のうちでもとりわけ、光保護特性を有する。本発明の化合物および組成物を使用する方法も想定される。
世界中の人々が、抗老化効果を生成する、日光による損傷を修復する、およびある種の美の文化的基準を充足することなど、多数の美容上の目標を達成するために皮膚ブライトニング剤を使用している。多くの市販されている皮膚ブライトニング製品は、有効性の程度は様々であるが、有害な成分を含有し、そのうちいくつかはがんと関連付けられている。このため、現在市場に出ている薬剤より高いレベルの安全性および／または効力を示す新規皮膚ブライトニング剤および製剤に対する必要性が存在する。
マラセチアは、ヒトの皮膚の正常な細菌叢中に通常見出される親油性酵母の属である。マラセチアは、癜風（ｔｉｎｅａ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（ｐｉｔｙｒｉａｓｉｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ））、脂漏性皮膚炎およびアトピー性皮膚炎を含む多数の皮膚疾患の原因である。
Ｍ．ｆｕｒｆｕｒの天然の生息環境は、表皮上層である。しかしながら、紫外光への曝露は、その天然の生息環境においてこの生物を死滅させる。したがって、ＵＶフィルタリング剤が、この生物の生存のために必要であり得る。この生物によって産生される２つのこのようなＵＶフィルタリングインドール、ピチリアシトリンおよびピチリアラクトンが同定されている。Ｍａｙｓｅｒら、２００２に最初に記載されたピチリアシトリンは、Ｍ．ｆｕｒｆｕｒによって合成される。ピチリアシトリンは、ＵＶＡ、ＵＶＢおよびＵＶＣスペクトル中に幅広い吸収を示す安定な黄色の親油性化合物である。Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属から得られる類似の化合物が単離され、ＵＶ保護剤として特許が付与されている。（Ｚｈａｎｇら、２０１８年）
Ｇａｍｂｉｃｈｌｅｒら、２００７は、インビトロおよびインビボ試験法を用いて、ヒトにおけるピチリアシトリンのＵＶ保護効果を調べた。ピチリアシトリンクリームおよびビヒクルの分光光度測定が、２９０〜４００ｎｍの波長域において行われた。異なるクリーム製剤に対して、ＵＶ透過および日光阻止因子（「ＳＰＦ」）が査定された。比色分析を用いて、著者らは、健康な被験体のクリームで保護された皮膚および保護されていない皮膚の照射後に、紅斑および色素沈着を評価した。ピチリアシトリン濃度が増加するにつれて、ＵＶＢおよびＵＶＡの透過が減少した。１．２５、２．５および５％のピチリアシトリン濃度の増加は、それぞれ、１．４、１．５および１．７という僅かに増加するＳＰＦを伴った。インビボ試験は、インビトロで決定されたピチリアシトリン５％クリームのＳＰＦの妥当性を確認した。総合すると、ピチリアシトリンのＵＶ保護効果は極めて弱く、ピチリアシトリンは、おそらく、日光曝露後の白色癜風病変（ｐｉｔｙｒｉａｓｉｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ａｌｂａ ｌｅｓｉｏｎ）における色素沈着低下の発達における劣った補因子に過ぎないことを示唆する。
ピチリアシトリンのＵＶフィルタリング効果のさらなる研究が、ヒト皮膚ミクロフローラに対して行われた。（Ｍａｃｈｏｗｉｎｓｋｉら、２００６）。著者らは、ピチリアシトリンがＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよびブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）に対してＵＶ保護効果を有し、試験された範囲において毒性を有していないことを実証した。ピチリアラクトンのＵＶ保護特性も、酵母モデルにおいて確認された。（Ｍａｙｓｅｒら、２００３）。ピチリアラクトンは、ウッド灯検査下での癜風の黄色蛍光の原因であるように見受けられる。
癜風は、色素沈着レベルを局所的に変化させるマラセチア異常増殖によって引き起こされる非伝染性皮膚疾患である。マラセチア酵母は、メラニンおよびトリプトファン由来のインドール色素を合成するための２つの代謝経路を有する。マラセジンおよびインジルビンは、マラセチア異常増殖に特徴的な色素脱失に寄与し得るマラセチアのトリプトファン代謝物である。
本明細書に開示されている発明は、安全なおよび効果的な皮膚ブライトニングおよび皮膚暗色化組成物のための主成分として、マラセジン、インジルビンおよびこれらの化学的類縁体などの、マラセチア酵母によって産生されるまたはマラセチア酵母に由来する化合物を使用する。マラセジン、インジルビンおよびこれらの化学的類縁体を含む光保護組成物も本明細書に開示されている。
本発明の一実施形態は、組成物である。該組成物は、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明の別の実施形態は、被験体における皮膚をブライトニングするための方法である。該方法は、被験体を、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるメラニン形成細胞のアポトーシスを誘導するための方法である。該方法は、被験体を、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性を調節するための方法である。該方法は、被験体を、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、被験体におけるメラニン形成を調節するための方法である。該方法は、被験体を、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、被験体におけるメラニン濃度を調節するための方法である。該方法は、被験体を、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、組成物である。該組成物は、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明のさらなる実施形態は、皮膚をブライトニングするための組成物である。該組成物は、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明の別の実施形態は、メラニン形成細胞のアポトーシスを誘導するための組成物である。該組成物は、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明のさらなる実施形態は、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性を調節するための組成物である。該組成物は、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明のさらなる実施形態は、メラニン形成を調節するための組成物である。該組成物は、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明の別の実施形態は、メラニン濃度を調節するための組成物である。該組成物は、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体における皮膚をブライトニングするための方法である。該方法は、被験体を、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む組成物と接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体においてメラニン形成細胞のアポトーシスを誘導するための方法である。該方法は、被験体を、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む組成物と接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、被験体におけるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性を調節するための方法である。該方法は、被験体を、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む組成物と接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるメラニン形成を調節するための方法である。該方法は、被験体を、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む組成物と接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるメラニン濃度を調節するための方法である。該方法は、被験体を、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む組成物と接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、組成物である。該組成物は、マラセチア酵母と美容的にまたは薬学的に許容され得る、ビヒクル、希釈剤または担体とを含む。
本発明のさらなる実施形態は、組成物である。該組成物は、以下の式：
Figure 2021527710
 ［式中、
Ｘは、ＮＲ１４およびＯからなる群から選択され；Ｙは、共有結合、ＣＲ５Ｒ６、ＯまたはＮＲ１５であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、ハロゲン、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｒ１６またはＯＲ１６からなる群から独立に選択され；Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素またはＲ１６であり；Ｒ５およびＲ６は、水素、ヒドロキシル、ＯＲ１６、Ｒ１６およびＣ３〜６シクロアルキルからなる群から独立に選択されるか；またはＲ５およびＲ６は結合してオキソ（＝Ｏ）基またはＣ３〜６シクロアルキルを形成し；Ｒ１２は、水素、−ＣＯＲａおよびＲ１６からなる群から選択され；各Ｒ１６は、独立に、ホルミル、Ｃ１〜９アルキル、Ｃ２〜９アルケニルまたはＣ２〜９アルキニルであり；ならびにＲａは、水素、ヒドロキシルおよびＯＲ１６からなる群から選択される］
の構造を有する化合物、
あるいはその結晶形、水和物または美容的にもしくは薬学的に許容され得る塩と、
美容的にまたは薬学的に許容され得る、ビヒクル、希釈剤または担体とを含む。
本発明のさらなる実施形態は、組成物である。該組成物は、以下の式：
Figure 2021527710
 ［式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９およびＲ１０は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｒ１３、ＯＲ１３、ＯＣＯＲ１３および−ＣＨＯからなる群から独立に選択され；Ｒ２およびＲ３は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｒ１３、ＯＲ１３、ＯＣＯＲ１３および−ＣＨＯからなる群から独立に選択されるか、またはＲ２およびＲ３は結合して５員もしくは６員のヘテロシクリルを形成し；Ｒ７およびＲ８は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｒ１３、ＯＲ１３、ＯＣＯＲ１３および−ＣＨＯからなる群から独立に選択されるか、またはＲ７およびＲ８は結合して５員もしくは６員のヘテロシクリルを形成し；Ｒ１１およびＲ１２は、独立に、水素またはＲ１３であり；ならびに、各Ｒ１３は、独立に、Ｃ１〜９アルキル、Ｃ２〜９アルケニルまたはＣ２〜９アルキニルである］
の構造を有する化合物
あるいはその結晶形、水和物または美容的にもしくは薬学的に許容され得る塩と、
美容的にまたは薬学的に許容され得る、ビヒクル、希釈剤または担体とを含む。
本発明の別の実施形態は、組成物である。該組成物は、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または美容的にもしくは薬学的に許容され得る塩と、
美容的にまたは薬学的に許容され得る、ビヒクル、希釈剤または担体とを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるＵＶによって誘発される皮膚損傷を処置または予防する方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるＵＶによって誘発される紅斑を処置または予防する方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、被験体におけるＵＶによって誘発される皮膚の老化を処置または予防する方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体における日焼けを処置または予防する方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるＵＶによって誘発される色素沈着過剰を処置または予防する方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、被験体における皮膚をブライトニングするための方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体においてメラニン形成細胞のアポトーシスを誘導するための方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性を調節するための方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、被験体におけるメラニン形成を調節するための方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるメラニン濃度を調節するための方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
図１は、様々な濃度の図示された被験物質で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図１は、様々な濃度の図示された被験物質で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図１は、様々な濃度の図示された被験物質で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図１は、様々な濃度の図示された被験物質で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図１は、様々な濃度の図示された被験物質で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図１は、様々な濃度の図示された被験物質で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図２は、様々な濃度の図示された被験物質で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図２は、様々な濃度の図示された被験物質で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図２は、様々な濃度の図示された被験物質で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図２は、様々な濃度の図示された被験物質で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。
図３は、マラセチアによって産生される化合物を示す。 図３は、マラセチアによって産生される化合物を示す。 図３は、マラセチアによって産生される化合物を示す。 図３は、マラセチアによって産生される化合物を示す。
図４は、様々な濃度の図示された被験物質／試験組成物で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図４は、様々な濃度の図示された被験物質／試験組成物で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図４は、様々な濃度の図示された被験物質／試験組成物で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図５は、様々な濃度の図示された被験物質／試験組成物で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図５は、様々な濃度の図示された被験物質／試験組成物で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。 図５は、様々な濃度の図示された被験物質／試験組成物で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いた別々の実験から確認された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。
図６Ａ〜６Ｂは、ＡＢ１７５９０（図６Ａ）ならびにＡＢ１７６５３、ＡＢ１７６５４、ＡＢ１７６５５、ＡＢ１７６５６、ＡＢ１７６５７およびＡＢ１７６５８（図６Ｂ）についての合成スキームを示す。 図６Ａ〜６Ｂは、ＡＢ１７５９０（図６Ａ）ならびにＡＢ１７６５３、ＡＢ１７６５４、ＡＢ１７６５５、ＡＢ１７６５６、ＡＢ１７６５７およびＡＢ１７６５８（図６Ｂ）についての合成スキームを示す。 図６Ａ〜６Ｂは、ＡＢ１７５９０（図６Ａ）ならびにＡＢ１７６５３、ＡＢ１７６５４、ＡＢ１７６５５、ＡＢ１７６５６、ＡＢ１７６５７およびＡＢ１７６５８（図６Ｂ）についての合成スキームを示す。 図６Ａ〜６Ｂは、ＡＢ１７５９０（図６Ａ）ならびにＡＢ１７６５３、ＡＢ１７６５４、ＡＢ１７６５５、ＡＢ１７６５６、ＡＢ１７６５７およびＡＢ１７６５８（図６Ｂ）についての合成スキームを示す。
図７は、スキンタイプＩＶ患者に対する皮膚処置テンプレートを示す模式図である。値は、ｍＪ／ｃｍ２での所定面積に対するＵＶ線量を示す。
図８は、スキンタイプＩ〜ＶＩに対するＤｕａｌｉｇｈｔスケールを示す表である。
図９は、７日目の照射後の８日目でのメラニンおよび紅斑のＭｅｘａｍｅｔｅｒ ＭＸ １６測定を示す表である。
図１０は、１４日における照射後の１５日目でのメラニンおよび紅斑のＭｅｘａｍｅｔｅｒ ＭＸ １６測定を示す表である。 図１０は、１４日における照射後の１５日目でのメラニンおよび紅斑のＭｅｘａｍｅｔｅｒ ＭＸ １６測定を示す表である。
図１１は、様々な程度の紅斑と関連する数値の紅斑尺度を示す表である。
図１２は、図７に示されている皮膚処置テンプレートに従う様々なレベルのＵＶでの照射から２４時間後における被験体の皮膚を示す写真である。最小紅斑線量（「ＭＥＤ」）は、照射後２４時間に１２０ｍＪ ＵＶＢであった。
図１３は、７日目における被験体の皮膚上の試験部位を示す写真である。
図１４は、１２０ｍＪ ＵＶＢでの照射後２４時間、８日目における被験体の皮膚上の試験部位を示す写真である。
図１５は、さらに１週間マラセジン治療を行った後の１４日目における被験体の皮膚上の試験部位を示す写真である。処置領域に、１２０ｍＪ ＵＶＢを照射した。
図１６は、１２０ｍＪ ＵＶＢでの照射後２４時間、１５日目における被験体の皮膚上の試験部位を示す写真である。７日目および９日目についてのビヒクル部位での紅斑に注目せよ。１４日目、１０日目および８日目についてのマラセジン１％処置された部位での最小〜軽度の紅斑、１日目および３日目の微量の紅斑にも注目せよ。
本発明の一実施形態は、組成物である。該組成物は、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
この実施形態の一態様では、該組成物は、以下の式：
Figure 2021527710
 の構造を有する第１の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩；および以下の式：
Figure 2021527710
 の構造を有する第２の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩を含む。
本発明の別の実施形態は、被験体における皮膚をブライトニングするための方法である。該方法は、被験体を、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む。
この実施形態の一態様では、被験体を、以下の式：
Figure 2021527710
 の構造を有する第１の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩；および以下の式：
Figure 2021527710
 の構造を有する第２の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩と接触させる。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるメラニン形成細胞のアポトーシスを誘導するための方法である。該方法は、被験体を、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む。
この実施形態の一態様では、被験体を、以下の式：
Figure 2021527710
 の構造を有する第１の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩；および以下の式：
Figure 2021527710
 の構造を有する第２の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩と接触させる。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性を調節するための方法である。該方法は、被験体を、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む。
この実施形態の一態様では、被験体を、以下の式：
Figure 2021527710
 の構造を有する第１の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩；および以下の式：
Figure 2021527710
 の構造を有する第２の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩と接触させる。
本発明の別の実施形態は、被験体におけるメラニン形成を調節するための方法である。該方法は、被験体を、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む。
この実施形態の一態様では、被験体を、以下の式：
Figure 2021527710
 の構造を有する第１の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩；および以下の式：
Figure 2021527710
 の構造を有する第２の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩と接触させる。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるメラニン濃度を調節するための方法である。該方法は、被験体を、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む。
この実施形態の一態様では、被験体を、以下の式：
Figure 2021527710
 の構造を有する第１の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩；および以下の式：
Figure 2021527710
 の構造を有する第２の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩と接触させる。
本発明のさらなる実施形態は、組成物である。該組成物は、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明の別の実施形態は、皮膚をブライトニングするための組成物である。該組成物は、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明のさらなる実施形態は、メラニン形成細胞のアポトーシスを誘導するための組成物である。該組成物は、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明のさらなる実施形態は、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性を調節するための組成物である。該組成物は、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明の別の実施形態は、メラニン形成を調節するための組成物である。該組成物は、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明のさらなる実施形態は、メラニン濃度を調節するための組成物である。該組成物は、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体における皮膚をブライトニングするための方法である。該方法は、被験体を、組成物、すなわち、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む組成物と接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、被験体におけるメラニン形成細胞のアポトーシスを誘導するための方法である。該方法は、被験体を、組成物、すなわち、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む組成物と接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性を調節するための方法である。該方法は、被験体を、組成物、すなわち、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む組成物と接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるメラニン形成を調節するための方法である。該方法は、被験体を、組成物、すなわち、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む組成物と接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、被験体におけるメラニン濃度を調節するための方法である。該方法は、被験体を、組成物、すなわち、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む組成物と接触させることを含む。
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、表５に列記されている化合物を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、表６に列記されている化合物を含む。
追加の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、表７に列記されている化合物を含む。
さらなる好ましい実施形態では、本発明の組成物は、表８に列記されている化合物を含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、表９に列記されている化合物を含む。
追加の好ましい実施形態では、本発明の方法は、被験体を表５に列記されている化合物を含む組成物と接触させることを含む。
さらなる好ましい実施形態では、本発明の方法は、被験体を表６に列記されている化合物を含む組成物と接触させることを含む。
他の好ましい実施形態では、本発明の方法は、被験体を表７に列記されている化合物を含む組成物と接触させることを含む。
追加の好ましい実施形態では、本発明の方法は、被験体を表８に列記されている化合物を含む組成物と接触させることを含む。
さらなる好ましい実施形態では、本発明の方法は、被験体を表９に列記されている化合物を含む組成物と接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、組成物である。該組成物は、マラセチア酵母と美容的にまたは薬学的に許容され得る、ビヒクル、希釈剤または担体とを含む。
本発明のさらなる実施形態は、組成物である。該組成物は、以下の式：
Figure 2021527710
 ［式中、
Ｘは、ＮＲ１４およびＯからなる群から選択され；Ｙは、共有結合、ＣＲ５Ｒ６、ＯまたはＮＲ１５であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、ハロゲン、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｒ１６またはＯＲ１６からなる群から独立に選択され；Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素またはＲ１６であり；Ｒ５およびＲ６は、水素、ヒドロキシル、ＯＲ１６、Ｒ１６およびＣ３〜６シクロアルキルからなる群から独立に選択されるか；またはＲ５およびＲ６は結合してオキソ（＝Ｏ）基またはＣ３〜６シクロアルキルを形成し；Ｒ１２は、水素、−ＣＯＲａおよびＲ１６からなる群から選択され；各Ｒ１６は、独立に、ホルミル、Ｃ１〜９アルキル、Ｃ２〜９アルケニルまたはＣ２〜９アルキニルであり；ならびにＲａは、水素、ヒドロキシルおよびＯＲ１６からなる群から選択される］
の構造を有する化合物、
あるいはその結晶形、水和物または美容的にもしくは薬学的に許容され得る塩と、
美容的にまたは薬学的に許容され得る、ビヒクル、希釈剤または担体とを含む。
本発明の別の実施形態は、組成物である。該組成物は、以下の式：
Figure 2021527710
 ［式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９およびＲ１０は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｒ１３、ＯＲ１３、ＯＣＯＲ１３および−ＣＨＯからなる群から独立に選択され；Ｒ２およびＲ３は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｒ１３、ＯＲ１３、ＯＣＯＲ１３および−ＣＨＯからなる群から独立に選択されるか、またはＲ２およびＲ３は結合して５員もしくは６員のヘテロシクリルを形成し；Ｒ７およびＲ８は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｒ１３、ＯＲ１３、ＯＣＯＲ１３および−ＣＨＯからなる群から独立に選択されるか、またはＲ７およびＲ８は結合して５員もしくは６員のヘテロシクリルを形成し；Ｒ１１およびＲ１２は、独立に、水素またはＲ１３であり；ならびに、各Ｒ１３は、独立に、Ｃ１〜９アルキル、Ｃ２〜９アルケニルまたはＣ２〜９アルキニルである］
の構造を有する化合物、
あるいはその結晶形、水和物または美容的にもしくは薬学的に許容され得る塩と、
美容的にまたは薬学的に許容され得る、ビヒクル、希釈剤または担体とを含む。
本発明のさらなる実施形態は、組成物である。該組成物は、表１または図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または美容的にもしくは薬学的に許容され得る塩と、
美容的にまたは薬学的に許容され得る、ビヒクル、希釈剤または担体とを含む。
好ましい実施形態において、本発明の組成物のいずれもが、被験体におけるＵＶによって誘発される紅斑を予防する。
好ましい実施形態において、本発明の組成物のいずれもが、被験体における表皮メラニンを低減する。
好ましい実施形態において、本発明の組成物のいずれもが、被験体における光保護効果またはＵＶ保護効果を生成する。
好ましい実施形態において、本発明の組成物のいずれもが、ＵＶをフィルタリング、吸収、または反射する。
好ましい実施形態において、本発明の組成物のいずれもが、色素沈着過剰を予防し、および／または色素沈着低下を促進する。
好ましい実施形態において、本発明の組成物のいずれもが、日焼け止め剤、光保護剤および／またはＵＶ保護剤である。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるＵＶによって誘発される皮膚損傷を処置または予防する方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、被験体におけるＵＶによって誘発される紅斑を処置または予防する方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるＵＶによって誘発される皮膚の老化を処置または予防する方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体における日焼けを処置または予防する方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、被験体におけるＵＶによって誘発される色素沈着過剰を処置または予防する方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体における皮膚をブライトニングするための方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体においてメラニン形成細胞のアポトーシスを誘導するための方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、被験体におけるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性を調節するための方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるメラニン形成を調節するための方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
本発明のさらなる実施形態は、被験体におけるメラニン濃度を調節するための方法である。該方法は、本明細書に開示されている組成物のいずれかと被験体を接触させることを含む。
定義
本明細書において使用される「化合物」という用語は、１またはそれを超える化学結合によって接続されている２またはそれを超える原子を表す。本発明において、化学結合には、共有結合、イオン結合、水素結合およびファンデルワールス相互作用が含まれるが、これらに限定されない。本発明の共有結合には、単結合、二重結合および三重結合が含まれる。本発明の化合物には、有機分子が含まれるが、これに限定されない。
本発明の有機化合物／分子には、官能基を有するまたは有さない、直鎖、分岐および環状炭化水素が含まれる。アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアルコキシなどの化学部分とともに使用される場合、「Ｃｘ〜ｙ」という用語は、鎖中にｘ〜ｙ個の炭素を含む基を含むものとする。例えば、用語「Ｃｘ〜ｙアルキル」は、トリフルオロメチルおよび２，２，２−トリフルオロエチルなどのハロアルキル基を含めて、鎖中にｘ〜ｙ個の炭素を含む直鎖アルキルおよび分岐鎖アルキル基を含む置換されたまたは置換されていない飽和炭化水素基を意味する。「Ｃｘ〜ｙアルケニル」および「Ｃｘ〜ｙアルキニル」という用語は、長さおよび可能な置換が上記アルキルと同様であるが、それぞれ、少なくとも１つの二重結合または酸重結合を含む置換されたまたは置換されていない不飽和脂肪族基を表す。
本明細書において使用される「脂肪族」という用語は、芳香環を含まない、炭素および水素原子から構成される基を意味する。したがって、脂肪族基には、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびカルボシクリル基が含まれる。
本明細書において使用される「アルキル」という用語は非環式直鎖および分岐炭化水素基を意味し、例えば、「Ｃ１〜Ｃ２０アルキル」は、１〜２０個の炭素を有するアルキル基を表す。アルキル基は、直鎖または分岐であり得る。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルヘキシル、イソヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の利点に鑑みれば、他のアルキル基が、当業者に自明であろう。アルキル基は、非置換であっても、本明細書に記載されているとおりの１もしくはそれを超える置換基で置換されていてもよい。例えば、アルキル基は、１またはそれを超える（例えば、１、２、３、４、５または６個の独立に選択される置換基）、ハロゲン、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＯＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＮＨ２、−ＮＨＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＳＲ’または−ＳＯ２Ｒ’で置換され得、ここで、Ｒ’の各例は独立にＣ１〜Ｃ３アルキルである。実施形態において、アルキルは置換されていない。実施形態において、アルキルは、（例えば、本明細書に記載されている１、２、３、４、５または６の置換基で）置換されている。例えば、「ヒドロキシアルキル」という用語は、ヒドロキシル（−ＯＨ）置換基を含む本明細書に記載されているとおりのアルキル基を表し、−ＣＨ２ＯＨなどの基を含む。
本明細書に使用されている「アルケニル」は、鎖に沿った任意の安定な点において生じ得る１またはそれを超える不飽和炭素−炭素二重結合を有する任意の直鎖または分岐炭化水素鎖を意味し、例えば、「Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル」は、２〜２０個の炭素を有するアルケニル基を表す。例えば、アルケニル基には、プロパ−２−エニル、ブタ−２−エニル、ブタ−３−エニル、２−メチルプロパ−２−エニル、ヘキサ−２−エニル、ヘキサ−５−エニル、２，３−ジメチルブタ−２−エニルなどが含まれる。実施形態において、アルケニルは、１、２または３個の炭素−炭素二重結合を含む。実施形態において、アルケニルは、単一の炭素−炭素二重結合を含む。実施形態において、複数の二重結合（例えば、２個または３個）は共役している。アルケニル基は、非置換であっても、本明細書に記載されているとおりの１もしくはそれを超える置換基で置換されていてもよい。例えば、アルケニル基は、１またはそれを超える（例えば、１、２、３、４、５または６個の独立に選択される置換基）、ハロゲン、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＮＨ２、−ＮＨＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＳＲ’または−ＳＯ２Ｒ’で置換され得、ここで、Ｒ’の各例は独立にＣ１〜Ｃ３アルキルである。実施形態において、アルケニルは置換されていない。実施形態において、アルケニルは、（例えば、本明細書に記載されている１、２、３、４、５または６の置換基で）置換されている。
本明細書に使用されている「アルキニル」は、鎖に沿った任意の安定な点において生じる１またはそれを超える炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐配置のいずれかの任意の炭化水素鎖を意味し、例えば、「Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル」は、２〜２０個の炭素を有するアルキニル基を表す。アルキニル基の例としては、プロパ−２−イニル、ブタ−２−イニル、ブタ−３−イニル、ペント−２−イニル、３−メチルペント−４−イニル、ヘキサ−２−イニル、ヘキサ−５−イニルなどが挙げられる。実施形態において、アルキニルは、１つの炭素−炭素三重結合を含む。アルキニル基は、非置換であっても、本明細書に記載されているとおりの１もしくはそれを超える置換基で置換されていてもよい。例えば、アルキニル基は、１またはそれを超える（例えば、１、２、３、４、５または６個の独立に選択される置換基）、ハロゲン、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＮＨ２、−ＮＨＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＳＲ’または−ＳＯ２Ｒ’で置換され得、ここで、Ｒ’の各例は独立にＣ１〜Ｃ３アルキルである。実施形態において、アルキニルは置換されていない。実施形態において、アルキニルは、（例えば、本明細書に記載されている１、２、３、４、５または６の置換基で）置換されている。
本明細書において使用される「シクロアルキル」という用語は、非芳香族、飽和、環状基、例えば、「Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル」を意味する。実施形態において、シクロアルキルは単環式である。実施形態において、シクロアルキルは多環式（例えば、二環式または三環式）である。多環式シクロアルキル基においては、個々の環は、縮合、架橋またはスピロ環式であり得る。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ノルボルナニル、ビシクロ［３．２．１］オクタニル、オクタヒドロ−ペンタレニルおよびスピロ［４．５］デカニルなどが挙げられる。「シクロアルキル」という用語は、「炭素環」という用語と互換的に使用され得る。シクロアルキル基は、非置換であっても、本明細書に記載されているとおりの１もしくはそれを超える置換基で置換されていてもよい。例えば、シクロアルキル基は、１またはそれを超える（例えば、１、２、３、４、５または６個の独立に選択される置換基）、ハロゲン、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＮＨ２、−ＮＨＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＳＲ’または−ＳＯ２Ｒ’で置換され得、ここで、Ｒ’の各例は独立にＣ１〜Ｃ３アルキルである。実施形態において、シクロアルキルは置換されていない。実施形態において、シクロアルキルは、（例えば、本明細書に記載されている１、２、３、４、５または６の置換基で）置換されている。
本明細書において使用される「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
本明細書において使用される「芳香族化合物」、「芳香族」または「芳香環」を含む化合物は、アリールまたはヘテロアリール化合物である。本明細書において使用される「アリール」という用語には、環の各原子が炭素である置換されたまたは置換されていない単環芳香族基が含まれる。好ましくは、環は、３〜８員環、より好ましくは、６員環である。「アリール」という用語には、２またはそれを超える炭素が２つの隣接する環に共通する２またはそれを超える環状の環を有し、これらの環のうちの少なくとも１つが芳香族であり、例えば、他の環状の環が、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよび／またはヘテロシクリルであり得る多環式環系も含まれる。アリール基には、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、フェノール、アニリンなどが含まれる。「ヘテロアリール」という用語には、その環構造が少なくとも１つのヘテロ原子、好ましくは、１〜４つのヘテロ原子、より好ましくは、１または２のヘテロ原子を含む、置換されたまたは置換されていない芳香族単環構造、好ましくは、３〜８員環、より好ましくは５〜７員環、さらに好ましくは５〜６員環が含まれる。「ヘテロアリール」という用語には、２またはそれを超える炭素が２つの隣接する環に共通する２またはそれを超える環状の環を有し、これらの環のうちの少なくとも１つが複素芳香族であり、例えば、他の環状の環が、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよび／またはヘテロシクリルであり得る多環式環系も含まれる。ヘテロアリール基としては、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、インドール、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどが挙げられる。好ましくは、本発明のある化合物は、少なくとも１つ、好ましくは２つのインドール基、および少なくとも１つのアルデヒド基を含む。
「置換された」という用語は、骨格の１またはそれを超える炭素上の水素原子を置き換える少なくとも１つの置換基を有する部分を意味する。「置換」または「〜で置換された」は、このような置換が置換された原子および置換基の許容される原子価に従っているという黙示的条件を含むこと、ならびに置換が、例えば、転位、環化、脱離などによる転換を自発的に起こさない安定な化合物をもたらすことが理解されるであろう。許容され得る置換基は１またはそれを超えることができ、適切な有機化合物に関して同一であり得または異なり得る。
本明細書において使用される「複素環」または「複素環式」という用語は、少なくとも１つのヘテロ原子を含む単環式、二環式または三環式環系を意味する。ヘテロ原子には、酸素、窒素および硫黄が含まれるが、これらに限定されない。
単環式複素環式環は、例えば、少なくとも１つのヘテロ原子を含む３、４、５、６、７、８、９または１０員環からなる。単環式複素環式環の代表的な例としては、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオラニル、１，３−ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニルおよびトリチアニルが挙げられるが、これらに限定されない。
二環式複素環式環は、非限的な例として、遠位アリール環に縮合された単環式複素環式環、または遠位シクロアルキル環に縮合された単環式複素環式環、または遠位シクロアルケニル環に縮合された単環式複素環式環、または遠位単環式複素環式環に縮合された単環式複素環式環、または遠位単環式ヘテロアリール環に縮合された単環式複素環式環である。二環式複素環式環の代表的な例としては、１，３−ベンゾジオキソリル、１，３−ベンゾジチオリル、２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシニル、２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラニル、２，３−ジヒドロ−１−ベンゾチエニル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドリルおよび１，２，３，４−テトラヒドロキノリニルが挙げられるが、これらに限定されない。
三環式複素環式環は、非限的な例として、フェニル基に縮合された二環式複素環式環、またはシクロアルキル基に縮合された二環式複素環式環、またはシクロアルケニル基に縮合された二環式複素環式環、または別の単環式複素環式環に縮合された二環式複素環式環である。三環式複素環式環の代表的な例としては、２，３，４，４ａ，９，９ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−カルバゾリル、５ａ，６，７，８，９，９ａ−ヘキサヒドロジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニルおよび５ａ，６，７，８，９，９ａ−ヘキサヒドロジベンゾ［ｂ，ｄ］チエニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の複素環は、非限定的な例として、アルケニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルコキシアルキニル、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアルキル、アルコキシ−ＮＨ＝Ｃ（アルキル）−、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルキル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルスルホニル、アルキルチオ、アルキニル、アリール、アリールアルコキシ、アリールアルキル、アリールカルボニル、アリールオキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、シアノ、シアノアルキル、シクロアルキル、カルボニル、シクロアルキルアルキル、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、メルカプト、ニトロ、オキソおよびフェニルから独立に選択される置換基で置換されることができる。
本明細書において使用される「皮膚色素沈着を調節する」およびその文法的変形語は、本発明の化合物および組成物の皮膚ブライトニングおよび皮膚暗色化効果を一般的に表す。
本明細書において使用される「皮膚ブライトニング」およびその文法的変形語は、皮膚色素沈着の任意の現実のまたは知覚された低下を一般的に表す。皮膚ブライトニング法は、年齢、日光曝露または色素沈着過剰障害から生じる皮膚の過剰色素沈着した領域の色素沈着を低下させるために使用されてきた。例えば、被験体の皮膚への本発明の化合物および組成物の適用は、皮膚が前記適用の前より明るくまたは白く見えるように色素沈着を低下させることができる。皮膚色素沈着は、例えば、フォン・ルシャンの色スケール（ｖｏｎ Ｌｕｓｃｈａｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｓｃａｌｅ）、フィッツパトリック・スキンタイピング試験（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋら、１９８８）およびテイラー・ハイパーピグメンテーション・スケール（Ｔａｙｌｏｒら、２００５）を使用する視覚的査定、ならびに反射率分光光度法（Ｚｏｎｉｏｓら、２００１）を含むがこれらに限定されない多数の方法で査定することができる。例えば、フィッツパトリック・スキンタイピング試験は、６つの種類の皮膚（Ｉ〜ＶＩ）を含み、タイプＶまたはそれ未満になるタイプＶＩの皮膚は、本明細書においてこの用語が使用されるとおりに「ブライトニングされ」ている。以下でさらに論述されているように、皮膚ブライトニングは、メラニン形成細胞活性の調節、メラニン形成細胞のアポトーシスの誘導、またはアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性、メラニン形成、メラノソーム生合成、メラノソーム輸送もしくはメラニン濃度の調節を含むがこれらに限定されない多数の現象の結果として生じ得る。
同様に、本明細書において使用される「皮膚暗色化」およびその文法的変形語は、皮膚色素沈着の任意の現実のまたは知覚された増加を一般的に表す。皮膚暗色化法は、例えば、色素沈着低下障害から生じた皮膚の色素沈着が低下した領域の色素沈着を増加させるために使用されてきた。例えば、被験体の皮膚への本発明の化合物および組成物の適用は、皮膚が前記適用の前より暗く見えるように色素沈着を増加させることができる。
本発明のある種の化合物は、マラセチア酵母によって産生され、マラセチア酵母に由来し、マラセチア酵母から単離され、またはマラセチア酵母から単離可能である。マラセチア酵母はマラセチア属の酵母であり、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｇｌｏｂｏｓａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｒｅｓｔｒｉｃｔａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｌｏｏｆｆｉａｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｏｂｔｕｓａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｄｅｒｍａｔｉｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｎａｎａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｙａｍａｔｏｅｎｓｉｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｅｑｕｉｎｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｃａｐｒａｅおよびＭａｌａｓｓｅｚｉａ ｃｕｎｉｃｕｌｉが含まれるが、これらに限定されない。（Ｇｕｅｈｏら、１９９６；Ｇａｉｔａｎｉｓら、２０１３）。マラセチア酵母は、正常なヒトの皮膚の細菌叢の一部であり、通例、病原性作用を生じない。しかしながら、マラセチア酵母は、癜風（色素沈着過剰および色素沈着低下の種類の両方）、脂漏性皮膚炎、ふけ、アトピー性皮膚炎、マラセチア毛包炎、乾癬および融合性細網状乳頭腫症を含むがこれらに限定されない多数の疾患を引き起こすことができる。（Ｇａｉｔａｎｉｓら、２０１３）。
本明細書において使用される「化学的類縁体」という用語は、親化合物に構造的に関連し、異なる官能基または置換基を含む化合物を表す。例えば、本発明の親化合物はマラセジンおよびインジルビンを含み、マラセジンおよびインジルビンの化学的類縁体は、それぞれ、マラセジンおよびインジルビンと異なるある種の官能基および置換基を含む。本発明の化学的類縁体は、美容的または薬学的用途に適した薬物動態的プロファイルを含む、所定の親化合物を上回る顕著な利点を有し得る。いくつかの実施形態において、化学的類縁体は、１またはそれを超える化学反応によって親分子から生成される。他の実施形態において、本発明の化学的類縁体を生成するために、親化合物を起源としない別の合成スキームを使用することができる。
その生活環の間に、マラセチア酵母が、適切な増殖条件下で該化合物を合成し、分泌し、蓄積し、またはその他生成すれば、本発明の化合物はマラセチア酵母によって産生される。マラセチア酵母は、その増殖培地に何が補充されているかに応じて、異なる化合物を分泌する。（Ｎａｚｚａｒｏ−Ｐｏｒｒｏら、１９７８）。本発明は、任意の増殖条件下でマラセチア酵母によって産生された任意の化合物を含むが、好ましい化合物としては、例えば、マラセジン、インジルビンおよびこれらの化学的類縁体が挙げられる。
酵母の生活環の任意の時点で、本発明の化合物が酵母上または酵母中に存在すれば、本発明の化合物は、マラセチア酵母に由来する。
マラセジンは、本発明のマラセチア酵母によって産生される化合物の一例である。マラセジンは、２−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドとしても知られ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒから最初に単離されたトリプトファン代謝物である。マラセジンは、細胞増殖、分化および遺伝子発現に関与していると推定される受容体であるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の公知のアゴニストである。（Ｗｉｌｌｅら、２００１）。マラセジンは、初代ヒトメラニン形成細胞中でアポトーシスも誘導する。（Ｋｒａｅｍｅｒら、２００５）。最近、マラセジンのある化学的類縁体が、この類縁体のＡｈＲアゴニスト活性を調べたＷｉｎｓｔｏｎ−ＭｃＰｈｅｒｓｏｎおよび同僚によって合成された。（Ｗｉｎｓｔｏｎ−ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、２０１４）。
インジルビンは、本発明のマラセチア酵母によって産生される化合物の別の例である。インジルビンは、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒから単離された代謝物である。インジルビンは、細胞増殖、分化および遺伝子発現に関与していると推定される受容体であるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の公知のアゴニストである。
本明細書において使用される「メラニン形成細胞」という用語は、通常、チロシナーゼを合成し、メラノソーム内で色素メラニンを合成する、表皮の樹状細胞を表す。本発明のメラニン形成細胞は、以下のもののうちの１つまたはそれより多くを含むがこれらに限定されないある種の遺伝子の上方制御を示す：チロシナーゼ（眼皮膚白子症ＩＡ）、小眼球症誘発関連転写因子、α−２−マクログロブリン、チロシナーゼ関連タンパク質１、溶質輸送体ファミリー１６、ＧＳ３９５５タンパク質、ｖ−ｋｉｔハーディー・ズッカーマン４ネコ肉腫、眼白子症１、Ｒａｇ Ｄタンパク質、グリコゲニン２、Ｇタンパク質共役型受容体、ファミリーＣ、眼皮膚白子症ＩＩ、食道がん欠失１、ｍｅｌａｎ−Ａ、ＳＲＹ−ボックス１０、ＡＴＰアーゼ、クラスＶ、タイプ１０Ｃ、マトリックスメタロプロテイナーゼ１、潜在性形質転換増殖因子ベータｂ、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＣ、ヒドロキシプロスタグランジン脱水素酵素１５、膜貫通７スーパーファミリーメンバー１、グルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼならびにＬｅｅおよび同僚によって同定されたその他の遺伝子。（Ｌｅｅら、２０１３）。
メラニン形成細胞は、多くの他の細胞型と同様、プログラムされた細胞死、すなわち、アポトーシスを受ける。メラニン形成細胞のアポトーシス経路は、当業者に公知であり（Ｗａｎｇら、２０１４）、アポトーシス経路は、Ｅｌｍｏｒｅによって一般的に概説されている（Ｅｌｍｏｒｅ，２００７）。本発明の化合物または組成物は、例えば、ある種のアポトーシス促進シグナル伝達経路の活性化を引き起こすことによって、またはメラニン形成細胞中のある種の抗アポトーシス経路の抑制を引き起こすことによって、メラニン形成細胞のアポトーシスを「誘導」する。本発明の化合物または組成物は、経路のシグナル伝達分子と直接相互作用することによって、または経路内で通例機能しない１もしくはそれを超える中間の分子との直接の相互作用を介して経路の分子と間接的に相互作用することによって、アポトーシス関連経路を直接活性化／抑制することができることが想定される。
メラニン形成細胞のアポトーシスを誘導すること、またはメラニン形成細胞の遺伝子発現、細胞運動性、細胞増殖、メラニン産生、メラノソーム生合成もしくはメラノソーム輸送を変化させることを含むがこれらに限定されない本発明において想定される多数の方法でメラニン形成細胞の活性を調節することができる。
本明細書において使用される場合「調節する」、「調節している」という用語およびこれらの文法的変形語は、所望のレベルへの生物学的活性または現象の調整を表す。本発明の「調節」は生物学的活性または現象のレベルを増加または減少させる調整を含むことが想定される。
本明細書において使用される「アゴニスト」、「刺激する（ａｇｏｎｉｚｉｎｇ）」という用語およびこれらの文法的変形語は、１またはそれを超える生物学的活性を惹起する（例えば、開始するまたは促進する）、部分的にまたは完全に、増強する、刺激する、または活性化する分子を表す。本発明のアゴニストは、受容体と相互作用し得、この受容体を活性化し得、これにより、その受容体に特徴的な生理的または薬理学的応答を開始させ得る。本発明のアゴニストは、天然に存在する物質、および合成物質を含む。
本明細書において使用される「アンタゴニスト」、「拮抗する」という用語およびこれらの文法的変形語は、１またはそれを超える生物学的活性を部分的にまたは完全に、抑制する、阻害するまたは不活性化させる分子を表す。本発明のアンタゴニストは、アゴニストと同じ部位において受容体に競合的に結合し得るが、受容体の活性な形態によって開始される細胞内応答を活性化させない。本発明のアンタゴニストは、アゴニストまたは部分アゴニストの細胞内応答を阻害し得る。
本発明のアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）は、本明細書に記載されているとおりの、被験体中に天然に存在する任意のアリール炭化水素受容体である。アリール炭化水素受容体は、当業者に公知である。（Ｎｏａｋｅｓ，２０１５）。アリール炭化水素受容体のアゴニストとしては、キヌレニン、キヌレン酸、シンナバリン酸および６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）などのトリプトファン関連化合物が挙げられるが、これらに限定されない。マラセジンも、アリール炭化水素受容体アゴニストとして公知である。（Ｗｉｌｌｅら、２００１）。
本明細書において使用される場合、本発明の化合物、組成物および方法は、例えば、色素沈着過剰障害によって冒された領域中の色素沈着過剰のレベルを低下させることによって、さらなる色素沈着過剰を遅らせることによって、またはさらなる色素沈着過剰が生じることを防ぐことによって、色素沈着過剰障害によって引き起こされる色素沈着過剰を改善させるために使用することができる。しかしながら、全ての被験体が、特定の投薬プロトコール、レジメンまたは過程に応答するとは限らないので、色素沈着過剰障害によって引き起こされた色素沈着過剰を改善することは、全ての被験体または被験体集団において、所望の生理的応答または結果が達成されることを必要としない。従って、ある被験体または被験体集団は、投薬に応答しないまたは十分に応答しないことがあり得るが、その他の被験体または被験体集団は応答し、従って、その色素沈着過剰障害の改善を経験することがあり得る。
本明細書において使用される「色素沈着過剰」という用語は、現実のまたは知覚された、過剰な暗色の皮膚障害である。皮膚機能障害は、現実のもの（ａｃｔｕａｌ）であり得、例えば、年齢、過剰な日光曝露または暗い皮膚領域をもたらす疾患もしくは症状に起因し得る。暗い皮膚領域は、斑点、痣または暗色の相対的に大きな領域の形態であり得る。皮膚機能障害は、例えば、自身の皮膚の色調が暗すぎるという個人による知覚など、知覚されることもできる。個人は、皮膚の色調を明るくしたいという美容的な願望を有し得る。
色素沈着過剰障害は、色素沈着過剰が一次的症候である障害、および色素沈着過剰が二次的症候として起こる障害である。本発明の色素沈着過剰障害としては、先天性色素沈着過剰障害および後天性色素沈着過剰障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の先天性色素沈着過剰障害としては、表皮性色素沈着過剰（母斑細胞母斑、スピッツ母斑および扁平母斑）、真皮色素沈着過剰（青色母斑、太田母斑、真皮メラニン沈着症、伊藤母斑および蒙古斑）、雀卵斑、網状肢端色素沈着症、先端色素沈着症／肢端色素沈着症、および多発性黒子症候群（全身性多発性黒子症候群、レオパード症候群、遺伝性パターン状多発性黒子症候群、カーニー複合、ポイツ・ジェガース症候群、ロージェ・フュンツイカー・バラン症候群およびクロンカイト・カナダ症候群）を伴うものが挙げられるが、これらに限定されない。（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、２０１４）。本発明の後天性色素沈着過剰障害としては、老年性黒子、肝斑／褐色斑、リール黒皮症、口唇メラトニン斑、陰茎／外陰膣メラニン沈着症、顔面毛包性紅斑黒皮症（北村）、ＵＶ誘発性色素沈着（日焼けおよび光線性花弁状色素斑）、炎症後色素沈着（摩擦黒皮症および色素異常性固定紅斑）、化学物質／薬物誘発性色素沈着（ポリ塩化ビフェニル、ヒ素、５−ＦＵ、ブレオマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、クロルプロマジン、フェニトイン、テトラサクリンおよびクロロキン）、色素分界線条ならびに外来物質沈着（例えば、カロテン、銀、金、水銀、ビスマスおよび入れ墨など）が挙げられるが、これらに限定されない。全身性障害と関連する色素沈着過剰としては、代謝／酵素障害（ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、ゴーシェ病、ニーマンピック病、アミロイドーシス、組織黒変症、黒色表皮腫および晩発性皮膚ポルフィリン症）、内分泌障害（アジソン病、クッシング症候群および甲状腺機能亢進症）、栄養障害（ペラグラ、ビタミンＢ１２欠乏、葉酸欠乏、バガボンド病および色素性痒疹）、肥満細胞症、膠原病、肝機能障害および腎機能障害が挙げられる。色素沈着過剰は、感染性の疾患（麻疹、梅毒およびＭａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ）ならびに症候群（フォンレックリングハウゼン病、ソトス症候群、ＰＯＥＭＳ症候群、ネーゲリ症候群、カントゥ症候群、マキューン・オルブライト症候群、ワトソン症候群およびブルーム症候群）とも関連し得る。（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、２０１４）。
メラニンは、皮膚および毛髪に色を与える天然に産生される色素である。メラニンは、メラニン形成として知られる過程によって、メラノソームとして知られる細胞小器官中でメラニン形成細胞によって産生される。本発明の化合物または組成物は、例えば、メラノソーム生合成を調節し、酵素レベルでメラニン合成を直接的にまたは間接的に阻害することによって、被験体におけるメラニン産生（別称、メラニン形成）を調節する。
メラノソーム生合成は、４つのステージを介して起こる：ステージＩは、本質的に非色素性液胞である前メラノソームによって特徴づけられる。ステージＩＩでは、前メラノソームが、ステージＩＩＩにおいてその上にメラニンが沈着する条線を発達させる。ステージＩＶは、メラニン含量に富む成熟したメラノソームをもたらす。本発明の化合物および組成物は、通常はこれらのステージのうちのいずれかまたは全てを促進する生物学的過程を阻害または弱化することによってメラノソーム生合成を調節する。（Ｗａｓｍｅｉｅｒら、２００８）。
メラニン合成には、主に、３つの酵素：チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１およびドパクロムトートメラーゼが関与する。これらの酵素の細胞内輸送に影響を及ぼすさらなる因子としては、ＢＬＯＣ−１、ＯＡ１およびＳＬＣ４５Ａ２が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物および組成物は、例えば、これらの酵素または因子のいずれかの活性を阻害または弱化することによって、メラニン産生を調節することができる。（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、２０１４）。
メラノソームが形成され、メラニンが合成されると、メラノソームは、表皮のメラニン形成細胞から皮膚および毛髪ケラチン産生細胞へ移される必要がある。メラノソームは、メラニン形成細胞の核付近で生じ、微小管およびアクチンフィラメントに沿ってメラニン形成細胞の周囲に輸送される。本発明の化合物および組成物は、核周囲領域から、メラニン形成細胞周囲を経て、隣接するケラチン産生細胞中へのメラノソームの輸送をもたらす生物学的過程のいずれかを妨害することによってメラノソーム輸送を調節する。
メラニン濃度は、例えば、メラニン形成を増加もしくは減少させることによって、または被験体におけるメラニン分解もしくは被験体からのメラニン排除を促進することによって調節され得る。
本発明のマラセチア酵母から単離される化合物は、必ず、単離前に、マラセチア酵母中に存在するか、またはマラセチア酵母によって産生される。したがって、マラセチア酵母から単離された化合物は、実際の酵母細胞に由来する。細胞材料から化合物を抽出するための標準的なプロトコールは、当業者に公知である。
マラセチア酵母から単離可能な化合物は、実際の酵母細胞に由来する必要はない。代わりに、実際の酵母細胞の関与なしに酵母中で産生される化合物を生成するために、合成反応を使用することができる。有機合成反応は当業者に周知であり、これに関して使用することができる。
本明細書において使用される「表皮メラニン」という用語は、表皮中で産生され、表皮に輸送され、またはその他表皮中に見出されるメラニンを表す。
本明細書において使用される「低下させる」という用語およびその文法的変形語は、所定の生物学的現象または種のレベルの減少を引き起こすことを意味する。例えば、本発明の化合物および組成物は、被験体における表皮メラニンを低下させる、すなわち、本発明の化合物および組成物は、被験体における表皮メラニンのレベルの減少を惹起する。用語「低下させる」およびその文法的変形語は、例えば、所定の現象または種のレベルを少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％減少させることを意味することができる。
本明細書において使用される「接触させる」という用語およびその文法的変形語は、２またはそれを超える材料が相互作用できるのに十分近接するように、２またはそれを超える材料を近づけることを表す。このため、単なる例示として、本発明の化合物は、例えば、メラニン形成細胞の表面上の受容体と相互作用することによって、メラニン形成細胞と接触することができる。同様に、本発明の組成物は、例えば、被験体の皮膚に直接適用されることによって、ヒト被験体と接触することができる。
本明細書において使用される「被験体」は、哺乳動物の細胞、組織、生物またはこれらの集団を意味する。本発明の被験体は、好ましくは、ヒトの細胞、組織および人間を含むヒトであるが、その他に、霊長類、畜産動物、家庭用動物、実験用動物などが含まれる。農業動物のいくつかの例としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギなどが挙げられる。家庭用動物のいくつかの例としては、イヌ、ネコなどが挙げられる。実験用動物のいくつかの例としては、霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなどが挙げられる。
本明細書において使用される、色素沈着過剰障害によって引き起こされる色素沈着過剰の改善を「必要とする」被験体には、本当のまたは知覚された改善の必要を有する被験体が含まれる。
本明細書において使用される「処置する」、「処置している」、「処置」という用語およびこれらの文法的変形語は、その被験体、例えば、患者中で生理的応答または結果を得ることが所望される、プロトコール、レジメン、過程または療法に個々の被験体を供することを意味する。特に、本発明の方法および組成物は、疾患症候の発達を遅らせるために、または疾患もしくは症状の開始を遅延させるために、あるいは疾患発達の進行を停止させるために使用され得る。しかしながら、全ての処置された被験体が、特定の処置プロトコール、レジメン、過程または療法に応答するわけではないので、処置することは、全ての被験体または被験体集団、例えば、患者集団において、所望の生理的応答または結果が達成されることを必要としない。したがって、所定の被験体または被験体集団、例えば、患者集団は、処置に対して応答しない、または不十分に応答することがあり得る。
本明細書において使用される「予防する」、「予防している」、「予防」という用語およびこれらの文法的変形語は、投与の時点でおそらく障害または疾患を有すると診断されていないが、障害もしくは疾患を発症すると通常予想されるまたは障害もしくは疾患の増大したリスクがある患者に投与されたときに、本発明の化合物が有用であることを意味する。本発明の化合物および組成物は、例えば、障害もしくは疾患の症候の発達を遅らせ、障害もしくは疾患の開始を遅延させ、または個体が障害もしくは疾患を全く発症しないようにする。予防することには、年齢、家族歴、遺伝的もしくは染色体的異常に起因して、および／または障害もしくは疾患に関する１もしくはそれを超える生物学的マーカーの存在に起因して、障害または疾患に関して素因があると考えられる個体への本発明の化合物の投与も含まれる。
本明細書において使用される「促進する」という用語およびその文法的変形語は、もたらすことを可能にする、増強する、許容する、容易にする、助長する、促す、誘導するまたはその他助けることを意味する。
本明細書において使用される「生成する（ｐｒｏｄｕｃｅ）」という用語およびその文法的変形語は、特定の結果が起こる、生じるまたは存在するようにすることを意味する。非限定的な例として、本発明の化合物および組成物は、被験体に光保護またはＵＶ保護効果を生成する。
本明細書において使用される「紅斑」という用語は、皮膚の発赤を表す。紅斑は、表層の毛細血管の拡張および／または刺激によって引き起こされ得る。「ＵＶ誘発性紅斑」という用語は、ＵＶ曝露の結果として発生する皮膚発赤を表す。本明細書において使用される「日焼け」およびその文法的変形語は、日光または人工のＵＶ源（例えば、日焼け用ベッド（ｔａｎｎｉｎｇ ｂｅｄｓ））への曝露によって引き起こされるＵＶ誘発性紅斑を表す。
本明細書において使用される「色素沈着過剰」という用語は、皮膚の隣接する領域より色素沈着がより多い皮膚の領域を全般的に表す（例えば、色素斑（ｐｉｇｍｅｎｔ ｓｐｏｔ）、染み（ａｇｅ ｓｐｏｔ）、黒子（ｍｏｌｅ）など）。本発明の色素沈着過剰としては、メラニン形成細胞の活動亢進による局所の色素沈着過剰、良性のメラニン形成細胞の活動亢進および増殖によるその他の局所的な色素沈着過剰、疾患関連色素沈着過剰ならびに偶発的な色素沈着過剰、例えば、光線過敏、遺伝的体質、化学物質摂取またはその他の曝露（例えば、ＵＶ曝露）、年齢および病変後の瘢痕によるものなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用される「ＵＶ誘発性色素沈着過剰」は、天然または人工のＵＶへの曝露によって引き起こされる任意の色素沈着過剰を表す。
本明細書において使用される「色素沈着低下」という用語は、皮膚の隣接する領域より色素沈着がより少ない皮膚の領域を全般的に表す。本発明の色素沈着低下としては、白斑、色素脱失、白色粃糠疹、局所的色素脱失、炎症後色素脱失、限局性白皮症、白皮症、癜風、光線過敏症、先天性色素欠如症、無色性色素失調症、アトピー性皮膚炎、乾癬などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「ＵＶ誘発性皮膚損傷」は、ＵＶＡ、ＵＶＢおよびＵＶＣを含むＵＶへの曝露から生じる皮膚損傷を意味する。本発明のＵＶ誘発性皮膚損傷には、しわ、色素沈着過剰、異形成、日光角化症および皮膚がんが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「ＵＶ誘発性皮膚の老化」は、ＵＶＡ、ＵＶＢおよびＵＶＣを含むＵＶへの曝露から生じる皮膚の老化を意味する。本発明のＵＶ誘発性皮膚の老化は、例えば、ＵＶによって全体的にまたは部分的に引き起こされる、しわ、小じわ、染み、黒子、皮膚の乾燥、痩せ、または低下した弾性、不均一な皮膚の張りおよび皮膚の輝き、きめ、弾力性、堅さ、弛み（ｓａｇｇｉｎｅｓｓ）および明るさのその他の低下として現れる。
本明細書において使用される「光保護」という用語およびその文法的変形語は、本発明の化合物および組成物の効果を記載するために使用される場合、本明細書に記載されている化合物および組成物が、光、特に日光によって引き起こされる損傷を抑制および／または軽減することを意味する。同様に、本発明の「光保護剤」は、光、特に日光によって引き起こされる損傷を抑制および／または軽減する本明細書に記載されている化合物および組成物である。
本明細書において使用される「ＵＶ保護」という用語およびその文法的変形語は、本発明の化合物および組成物の効果を記載するために使用される場合、本明細書に記載されている化合物および組成物は、紫外（「ＵＶ」）光によって引き起こされる損傷を抑制および／または軽減することを意味する。同様に、本発明の「ＵＶ保護剤」は、ＵＶによって引き起こされる損傷を抑制および／または軽減する本発明に記載されている化合物および組成物である。本発明の紫外光としては、例えば、ＵＶＡ（３２０〜２４０ｎｍ）、ＵＶＢ（２９０〜３２０ｎｍ）およびＵＶＣ（２００〜２９０ｎｍ）が挙げられる。
本発明において使用される「フィルタリングする」という用語およびその文法的変形語は、ＵＶを遮断し、反射し、吸収しまたは散乱することを意味する。本発明の「日焼け止め剤」には、ＵＶを遮断し、反射し、吸収し、または散乱する本発明の全ての化合物および組成物が含まれる。
本明細書において使用される「吸収する」という用語およびその文法的変形語は、ＵＶを取り込むこと、またはＵＶを熱エネルギーへ変換することを意味する。非限定的な例として、本発明の化合物および組成物は、ＵＶを吸収し得、その結果、熱エネルギーをその周囲に放射することができる。
本明細書において使用される「反射する」という用語およびその文法的変形語は、ＵＶに関して使用される場合、ＵＶを吸収せずに、ＵＶを投げ返すまたは跳ね返すことを意味する。
本明細書において使用される場合、「組成物」という用語は、１またはそれを超える本発明の化合物を含む実体、および１またはそれを超える本発明の化合物の他の成分との組み合わせから直接的にまたは間接的にもたらされる任意の実体を意味する。本発明の組成物は、例えば、インビトロまたはインビボ研究試薬として使用することができる。本発明の組成物は、美容または薬学的効果のために、ヒトまたは非ヒト被験体の皮膚に直接適用することもできる。さらに、本発明の組成物は、表１または図３に列記されている化合物、あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物、または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１もしくはそれより多くを含む。
本発明の組成物は、インビトロおよびインビボ用途の両方のために、腹腔内、皮下、局所、皮内、吸入、肺内、直腸、膣、舌下、筋肉内、静脈内、動脈内、くも膜下腔内またはリンパ内などの任意の適切な様式での経口摂取のためまたは非経口もしくはその他の投与のために、任意の所望される有効な様式で投与され得る。さらに、本発明の組成物は、他の組成物とともに投与され得る。本発明の組成物は、所望であれば、胃またはその他の分泌物に対して、カプセルに被包されまたはその他保護され得る。
本発明の組成物は、１またはそれを超える美容的にまたは薬学的に許容され得る担体、ならびに必要に応じて１またはそれを超える他の化合物、成分および／または材料と混合された、１またはそれを超える活性成分を含む。選択された投与経路に関わらず、本発明の化合物および組成物は、当業者に公知の慣用の方法によって、美容的にまたは薬学的に許容され得る剤形へ製剤化される。
美容的にまたは薬学的に許容され得る、ビヒクル、希釈剤および担体は本分野において周知であり、過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー応答などなしに、ヒトおよび非ヒトの組織と接触させるのに適した材料が含まれる。美容的にまたは薬学的に許容され得る、ビヒクル、希釈剤および担体には、本発明の化合物および組成物がその中において安定な状態を保ち、ヒトまたは非ヒト被験体に適用され、摂取され、注射され、またはその他投与されたときに生体利用可能である化粧品または薬剤の、例えば、局所、経口、腹腔または皮下投与のために慣用的に使用可能な任意の実質的に無毒な物質が含まれる。局所的適用に適した美容的にまたは薬学的に許容され得る担体は当業者に公知であり、美容的にまたは薬学的に許容され得る、液体、クリーム、油、ローション、軟膏、ゲルまたは固体、例えば、慣用の美容ナイトクリーム、ファウンデーションクリーム、日焼け止めローション、日焼け止め、ハンドローション、化粧品および化粧品下地、美顔用パックなどが含まれる。選択された剤形および意図される投与経路に適した担体は本分野において周知であり、選択された剤形および投与の方法のために許容され得る担体は、本分野における通常の技術を用いて決定することができる。
本発明の組成物は、香料、エストロゲン、ビタミンＡ、ＣおよびＥ、ピルビン酸、乳酸またはグリコール酸などのα−ヒドロキシ酸またはα−ケト酸、ラノリン、バセリン、アロエベラ、メチルまたはプロピルパラベン、色素などを含む、化粧品において慣用のその他の成分を含有することができる。非限定的な美容的にまたは薬学的に許容され得る、本発明のビヒクル、希釈剤および担体としては、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトール）、デンプン、セルロース調製物、リン酸カルシウム（例えば、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウムおよびリン酸水素カルシウム）、クエン酸ナトリウム、水、水溶液（例えば、生理食塩水、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、デキストロース注射剤、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射剤、乳酸リンゲル注射剤）、アルコール（例えば、エチルアルコール、プロピルアルコールおよびベンジルアルコール）、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）、有機エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびトリグリセリド）、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物））、エラストマーマトリックス、リポソーム、小球体、油（例えば、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、ゴマ、綿実および落花生）、ココアバター、蝋（例えば、坐剤蝋）、パラフィン、シリコーン、タルク、シリシレート（ｓｉｌｉｃｙｌａｔｅ）などが挙げられる。
本発明の組成物は、美容組成物中で一般的に使用されるさらなる成分および／または材料を必要に応じて含有し得る。これらの成分および材料は本分野において周知であり、例えば、（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよびアラビアゴム；（３）保湿剤、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のシリケート、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋されたカルボキシメチルセルロースナトリウムおよび炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；（６）吸収加速剤、例えば、四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土；（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコールおよびラウリル硫酸ナトリウム；（１０）懸濁剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント；（１１）緩衝剤；（１２）賦形剤、例えば、ラクトース、乳糖（ｍｉｌｋ ｓｕｇａｒｓ）、ポリエチレングリコール、動物および植物脂肪、油、蝋、パラフィン、ココアバター、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、サリチレート、酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末；（１３）不活性な希釈剤、例えば、水またはその他の溶媒；（１４）防腐剤；（１５）界面活性剤；（１６）分散剤；（１７）徐放または吸収遅延剤、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリックス、生分解性ポリマー、リポソーム、小球体、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンおよび蝋；（１８）乳白剤（ｏｐａｃｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）；（１９）佐剤；（２０）湿潤剤；（２１）乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）および懸濁剤；（２２）可溶化剤および乳化物質（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ）、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシおよびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、（２３）噴霧剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素ならびに揮発性の置換されていない炭化水素、例えば、ブタンおよびプロパン；（２４）抗酸化剤；（２５）製剤を予定されるレシピエントの血液と等張にする因子、例えば、糖および塩化ナトリウム；（２６）増粘剤；（２７）コーティング材料、例えば、レシチン；ならびに（２８）甘味剤、着香剤、着色剤、芳香剤および防腐剤が挙げられる。それぞれのこのような成分または材料は、製剤の他の成分と適合性であり、被験体に対して有害でないという意味で「許容され得る」ものでなければならない。選択された剤形および意図される投与経路に適した成分および材料は本分野において周知であり、選択された剤形および投与の方法に関して許容され得る成分および材料は、本分野における通常の技術を用いて決定され得る。
経口投与に適した本発明の組成物は、カプセル、カシェー剤、丸薬、錠剤、粉末、顆粒、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油もしくは油中水液体エマルジョン、エリキシルまたはシロップ、トローチ、巨丸薬、舐剤またはペーストの形態であり得る。これらの製剤は、本分野において公知である方法によって、例えば、慣用のパーコーティング、混合、造粒または凍結乾燥過程を用いて調製され得る。
経口投与用の固体剤形（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、顆粒など）は、例えば、１またはそれを超える美容的にまたは薬学的に許容され得る担体、ならびに必要に応じて、１またはそれを超える充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収加速物質、湿潤剤、吸収剤、滑沢剤および／または着色剤と活性成分（単数もしくは複数）とを混合することによって、調製され得る。類似の種類の固体組成物は、適切な賦形剤を用いて、軟および硬ゼラチンカプセル中で充填剤として利用され得る。錠剤は、必要に応じて１またはそれを超える補助成分とともに、圧縮または成型によって作製され得る。圧縮された錠剤は、適切な結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、防腐剤、崩壊剤、界面活性剤または分散剤を用いて調製され得る。成型された錠剤は、適切な機械中での成型によって作られ得る。錠剤およびその他の固体剤形、例えば、カプセル、丸薬および顆粒は、必要に応じて割線を付けられ得るか、または化粧品製剤化の分野において周知の腸溶コーティングおよびその他のコーティングなどのコーティングおよび殻を用いて、調製され得る。錠剤およびその他の固体剤形は、その中の活性成分の遅い放出または徐放を与えるようにも製剤化され得る。錠剤およびその他の固体剤形は、例えば、細菌保持フィルターを通じたろ過によって滅菌され得る。これらの組成物は、必要に応じて乳白剤も含有し得、胃腸管のある部分のみでまたは優先的に、必要に応じて、遅延された様式で、活性成分を放出するような組成のものであり得る。活性成分は、マイクロカプセル化された形態とすることもできる。
経口投与用の液体剤形としては、美容的にまたは薬学的に許容され得る、エマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。液体剤形は、本分野において一般的に使用される適切な不活性希釈剤を含有し得る。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、着香剤、着色剤、芳香剤および防腐剤などの佐剤も含み得る。懸濁液は、懸濁剤を含有し得る。
直腸または膣投与用の本発明の組成物は、室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔中で融解し、活性な化合物を放出する１またはそれを超える適切な非刺激性担体と１またはそれを超える活性成分を混合することによって調製され得る坐剤として与えられ得る。膣投与に適した本発明の組成物としては、本分野において適切であることが公知である美容的にまたは薬学的に許容され得る担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー製剤も挙げられる。
局所または経皮投与のための剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、点滴薬、エマルジョン、懸濁液、エアロゾルおよび吸入剤が挙げられる。任意の所望の慣用のビヒクル、補助剤および必要に応じてさらなる活性成分が製剤に添加され得る。
好ましい補助剤は、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、可溶化剤、ビタミン、着色剤、匂い改良剤、塗膜形成剤、増粘剤および保湿剤を含む群から得られる。
溶液およびエマルジョンは、溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコール、油、特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油、グリセロール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物などの慣用のビヒクルを含むことができる。
エマルジョンは、様々な形態で存在し得る。このため、エマルジョンは、例えば、油中水（Ｗ／Ｏ）型または水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンもしくはマイクロエマルジョンまたは、例えば、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型の多重エマルジョンであり得る。
本発明の組成物は、乳化剤を含まない分散調製物の形態でもあり得る。本発明の組成物は、例えば、水分散液（ｈｙｄｒｏｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）またはＰｉｃｋｅｒｉｎｇエマルジョンであり得る。
懸濁液は、液体希釈剤、例えば、水、エタノールまたはプロピレングリコール、懸濁媒、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントまたはこれらの物質の混合物などの慣用のビヒクルを含み得る。
ペースト、軟膏、ゲルおよびクリームは、慣用のビヒクル、例えば、動物および植物脂肪、蝋、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛またはこれらの物質の混合物を含み得る。
フェイスおよびボディーオイルは、慣用のビヒクル、例えば、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、シリコーン油などの合成油、植物油および油性植物抽出物、パラフィン油、ラノリン油などの天然油またはこれらの物質の混合物を含み得る。
スプレーは、慣用の噴霧剤、例えば、クロロフルオロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルを含み得る
非経口投与に適した本発明の組成物は、適切な抗酸化剤、緩衝剤、製剤を予定されるレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含有し得る、１またはそれを超える美容的にまたは薬学的に許容され得る、無菌等張水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルジョンまたは使用直前に無菌注射可能溶液もしくは分散液に再構成され得る無菌の粉末と組み合わされて、１またはそれを超える化合物を含む。適切な流動性は、例えば、コーティング材料の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。これらの組成物は、適切な佐剤、例えば、湿潤剤、乳化剤および分散剤も含有し得る。等張剤を含むことが望ましい場合もあり得る。さらに、注射可能な化粧品形態の延長された吸収は、吸収を遅延させる因子を含めることによってもたらされ得る。
いくつかの事例において、効果を延長するために、皮下注射または筋肉内注射からのその吸収を遅らせることが望ましい。これは、乏しい水溶性を有する結晶性または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。
次いで、活性因子／薬物の吸収の速度は、その溶解速度に依存し、続いて、溶解速度は、結晶サイズおよび結晶形に依存し得る。または、非経口的に投与された組成物の遅延された吸収は、油ビヒクル中に活性な組成物を溶解または懸濁することによって達成され得る。注射可能なデポ形態は、生分解性ポリマー中で活性成分のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作られ得る。ポリマーに対する活性成分の比率および使用される具体的なポリマーの性質に応じて、活性成分放出の速度は調節することができる。注射可能なデポ製剤は、身体組織と適合性があるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を捕捉することによっても調製される。注射可能な材料は、例えば、細菌保持フィルターを通すろ過によって滅菌することができる。
本発明の組成物は、単位用量または複数用量の密閉された容器、例えば、アンプルおよびバイアル中に存在し得、使用直前に無菌液体担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥された状態で保存され得る。即時注射溶液および懸濁液は、上記種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
本発明において、「結晶形」という用語は、化合物の結晶構造を意味する。化合物は、異なる構造的、物理的、薬理学的または化学的特徴を有し得る１またはそれを超える結晶形で存在し得る。異なる結晶形は、核生成、成長速度論、凝集および破損の変動を用いて取得され得る。相転移エネルギー障壁を乗り越え、これにより、過飽和された溶液から粒子が形成可能となったときに、核生成が生じる。結晶成長は、結晶の既存の表面上への化学的化合物の沈着によって引き起こされる結晶粒子の拡大である。核生成および成長の相対的速度は、形成される結晶のサイズ分布を決める。核生成および成長の両方についての熱力学的駆動力は過飽和であり、過飽和は熱力学的平衡からの逸脱として定義される。凝集は、２またはそれを超える粒子（例えば、結晶）が一緒にくっつき、より大きな結晶構造を形成することを通じたより大きな粒子の形成である。
本明細書において使用される「水和物」という用語は、分子複合体中に水を含む化学的化合物の固体または半固体形態を意味する。水は、一般的には、化学的化合物に関して化学量論的な量である。
本明細書において使用される「美容的にまたは薬学的に許容され得る塩」は、化合物がその酸または塩基塩を作ることによって改変されている、本明細書に開示された化合物の誘導体を表す。美容的にまたは薬学的に許容され得る塩の例には、アミンなどの塩基性残基の鉱酸または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが含まれるが、これらに限定されない。例えば、このような塩としては、アンモニア、Ｌ−アルギニン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、水酸化カルシウム、コリン、デアノール、ジエタノールアミン（２，２’−イミノビス（エタノール））、ジエチルアミン、２−（ジエチルアミノ）−エタノール、２−アミノエタノール、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−グルカミン、ヒドラバミン、１Ｈ−イミダゾール、リジン、水酸化マグネシウム、４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、ピペラジン、水酸化カリウム、１−（２−ヒドロキシ−エチル）−ピロリジン、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン（２，２’，２’’−ニトリロトリス（エタノール））、トロメタミン、水酸化亜鉛、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、（＋）−ショウノウ酸、（＋）−カンファー−１０−スルホン酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、デカン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｏｎｏｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸（ｇａｌａｃａｒｉｃ ａｃｉｄ）、ゲンチジン酸、Ｄ−グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルクロン酸、グルタミン酸、グルタンチン酸（ｇｌｕｔａｎｔｉｃ ａｃｉｄ）、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリシン、グリコール酸、ヘキサン酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸 イソ酪酸、ＤＬ−乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、リジン、マレイン酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、ガラクタル酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オクタン酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸（エンボン酸）、リン酸、プロピオン酸、（−）−Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびウンデシレン酸から得られる塩が挙げられる。さらなる美容的にまたは薬学的に許容され得る塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛などの金属から得られる陽イオンとともに形成されることができる。
本発明の美容的にまたは薬学的に許容され得る塩は、慣用の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含む本明細書に開示された化合物から合成することができる。一般的には、このような塩は、これらの化合物の遊離の酸または塩基形態を、水の中で、またはエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールもしくはアセトニトリルもしくはこれらの混合物のような有機希釈剤の中で、十分な量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。
本発明の化合物および組成物は、インビトロおよびインビボ用途の両方のために、美容的または薬学的組成物中に含められ得ることが想定される。
表１もしくは図３に列記されている１もしくはそれを超える化合物、あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物、または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩を含む本発明の化合物および組成物は、本発明の皮膚色素沈着調節目的を生じさせるために被験体に同時投与され得ることが想定される。
本発明の組成物は、表１もしくは図３に列記されている１もしくはそれを超える化合物、あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物、または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩を含み得ることも想定される。例えば、本発明の組成物は、マラセジンまたはその化学的類縁体と組み合わせて、インジルビンまたはその化学的類縁体を含み得る。
さらに、本発明の化合物は、マラセチアによって産生される化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物、または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩を含むことが想定される。さらに、本発明の組成物および方法は、マラセチアによって産生される１もしくはそれを超える化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物、または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩を伴い得ることが想定される。例えば、マラセチアによって産生されるまたはマラセチアに由来する化合物には、図３に示されている化合物が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法は、本明細書に記載されている皮膚色素沈着調節目的を生じさせるために、２またはそれを超える本発明の化合物および／または組成物を同時投与することを伴い得ることがさらに想定される。
同時投与された本発明の化合物および組成物は、例えば、実質的に同時にまたは順次に被験体と接触し得る。
１またはそれを超えるマラセチア由来化合物またはその化学的類縁体を含有する本発明の組成物は、単独での成分化合物を上回る、平均組織生存率、メラニン濃度、皮膚ブライトニング、皮膚暗色化、メラニン形成細胞アポトーシスの誘導、およびアリール炭化水素（ＡｈＲ）活性、メラニン形成またはメラニン濃度の調節を含むがこれらに限定されない様々な有効性基準に対する相乗効果を実証し得る。
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記述するためのみのものであり、限定することは意図されていない。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に反対の意味を指示しなければ、複数の指示対象を含む。
本明細書中の数的範囲の記述に関しては、同じ精度を有するその中間の数字のそれぞれが、明示的に想定される。例えば、６〜９の範囲に関しては、６および９に加えて、数字７および８が想定され、範囲６．０〜７．０に関しては、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明示的に想定される。
以下の実施例は、本発明の方法をさらに例示するために提供されている。これらの実施例は、例示に過ぎず、本発明の範囲を限定することを決して意図していない。
実施例１
化合物の表記
下表１は、本発明の化合物に対する構造および名称を示す。
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 実施例２
インジルビンおよびインジルビン誘導体のアポトーシス誘導活性
試薬
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（１×）、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ３／７ Ａｓｓａｙ、ＲＰＭＩ １６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地および抗生物質・抗真菌薬溶液（１００×）。
細胞株ＭｅＷｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−６５（商標））、ＷＭ１１５（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６７５）およびＢ１６Ｆ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−６３２３）を、以下の培養培地中に維持する：ＭｅＷｏおよびＢ１６Ｆ１のための培地：１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ；ＷＭ１１５のための培地：１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０。
実験の方法
細胞を採集し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて細胞数を決定した。所望の密度になるように、細胞を培地で希釈した。最終細胞密度は、例えば、６時間および２４時間処理については４，０００細胞／ウェル、４８時間および７２時間処理については２，０００細胞／ウェルであり得る。アネキシンＶアッセイについては、３８４ウェル透明底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３７１２）が使用されるのに対して、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏアッセイについては、３８４ウェルのソリッド白色底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５７０）が使用される。細胞接着のために、全てのプレートを蓋で覆い、３７℃および５％ＣＯ２に一晩配置する。
３０ｍＭ原液になるように、試験化合物をＤＭＳＯ中に溶解する。３ｍＭおよび０．３ｍＭ濃度を得るために、１０倍希釈を行う。０．９ｍＭスタウロスポリンを陽性対照として使用し、ＤＭＳＯを陰性対照（ＮＣ）として使用する。ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｅｒ Ｅｃｈｏ５５０を用いて、１３２．５ｎＬの化合物を、化合物源プレートから３８４ウェル細胞培養プレート（単数または複数）へ移す。表記インキュベーション時間後に、検出のために、インキュベータからプレートを取り出す。
アネキシンＶアッセイのために、インキュベータからプレートを取り出し、培養培地を除去する。４０ｕＬのＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ウェル当たり１５ｕＬの予め混合されたアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素希釈標準溶液を加える。プレートを室温で２０分間、インキュベートし、密封し、泡を除去するために、１，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｎａｎｏを用いて、プレートを読み取る。
Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏアッセイのために、インキュベータからプレートを取り出し、室温で１５分間平衡化する。実験前に、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７試薬も融解し、室温に平衡化する。培地に対して１：１の比率で、必要とされるウェルにＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ試薬を添加する。プレートを室温で１５分間インキュベートし、ＥｎＳｐｉｒｅ（商標）プレートリーダーを用いて読み取る。以下の式にしたがって倍数誘導を計算する：倍数誘導＝Ｌｕｍ試料／ＬｕｍＮＣ。
アネキシンＶアッセイおよびカスパーゼ３／７アッセイの結果
インジルビンおよびその化学的類縁体を含む本発明の化合物および組成物は細胞死を誘導すると予測される。インジルビンの化学的類縁体は、例えば、インジルビンと比べてより強力なアポトーシス誘導活性を示すと予測される。同様に、インジルビンのある種の化学的類縁体は、例えば、インジルビンと比べてより有効性が低いアポトーシス誘導活性を示すと予測される。このような化合物は、より強力な化合物と比べて、より好ましい毒性プロファイルを有し得る。
実施例３
インジルビンおよびインジルビン誘導体への曝露後の細胞生存率
試薬
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０アッセイ
実験の方法
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイのために、試験化合物を１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液中に調製する。化合物を１２の濃度に系列希釈する。１００，０００細胞／ｍＬ懸濁液から得た４０ｕＬの細胞を、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５７０）の各ウェル中に分配する。３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で、プレートを一晩インキュベートする。試験化合物を添加し、ＤＭＳＯをビヒクル対照とする。３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で６、２４または４８時間、プレートをインキュベートし、細胞生存率を査定するために、４０ｕＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬をウェルに添加する。
結果
インジルビンおよびその化学的類縁体を含む本発明の化合物および組成物は細胞死を誘導すると予測される。インジルビンの化学的類縁体は、例えば、インジルビンと比べてより強力なアポトーシス誘導活性を示すと予測される。同様に、インジルビンのある種の化学的類縁体は、例えば、インジルビンと比べてより有効性が低いアポトーシス誘導活性を示すと予測される。このような化合物は、より強力な化合物と比べて、より好ましい毒性プロファイルを有し得る。
実施例４
インジルビンおよびインジルビン誘導体のアリール炭化水素受容体活性化能
アッセイ手順
高グルコースおよびＬ−グルタミンならびに１０％ＦＢＳをＤＭＥＭに補充することによって、安定に形質移入されたＨｅｐＧ２細胞のための培養培地を調製する。
３７℃、５％ＣＯ２および９５％相対湿度で、ＨｅｐＧ２−ＡｈＲ−Ｌｕｃ細胞をＴ−７５フラスコ中で培養する。剥離および分離前に、細胞を８０〜９０％の集密度に達するようにする。
５ｍＬ ＰＢＳで培養された細胞をすすぐ。ＰＢＳを吸引除去し、１．５ｍＬトリプシンをフラスコに加え、３７℃でおよそ５分間または細胞が剥離され、浮遊するまで、細胞をインキュベートする。トリプシンは、過剰な血清含有培地を添加することによって不活化される。
細胞懸濁液を円錐チューブに移し、細胞をペレット化させるために、１２０ｇで１０分間遠心する。適切な密度で、播種培地中に細胞を再懸濁する。４０μＬの細胞を３８４ウェル培養プレートに移す（５×１０３細胞／ウェル）。３７℃で２４時間、インキュベータ中にプレートを配置する。
その後、試験化合物およびオメプラゾール陽性対照の原溶液を調製する。Ｅｃｈｏ５５０を用いて、化合物溶液をアッセイプレート中に移す。次いで、化合物処理のために、プレートをインキュベータ中に戻す。
その後、２４時間の処理後に、インキュベータからプレートを取り出し、室温で冷却させる。培地のものと等しい３０μＬのＯｎｅ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに加える。細胞を少なくとも３分間溶解させ、次いで、ルミノメーター中で測定する。
ＸＬｆｉｔでの非線形回帰分析を用いて用量応答をグラフ化し、ＥＣ５０値も計算する。
結果
インジルビンおよびその化学的類縁体を含む本発明の化合物および組成物はＡｈＲ活性を調節すると予測される。インジルビンの化学的類縁体は、例えば、インジルビンと比べてより強力なＡｈＲアゴニスト活性を示すと予測される。同様に、インジルビンのある種の化学的類縁体は、例えば、インジルビンと比べてより有効性が低いＡｈＲアゴニスト活性を示すと予測される。
実施例５
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ａｓｓａｙ
本研究の目的は、反復した被験物質曝露後に、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌ中で、皮膚メラニン形成調節物質としての被験物質の潜在的作用を評価することであった。第二に、本研究の目的は、反復した曝露後に、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌへの被験物質の潜在的皮膚刺激を評価することであった。陰性／溶媒対照処理された組織と比較した、被験物質処理された組織中でのＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の相対的変換を測定することによって毒性を決定した。陰性／溶媒対照処理された組織と比較した、被験物質処理された組織によって産生されたメラニンの濃度を測定することによって、メラニン産生に対する潜在的な影響を決定した。
試験物質およびアッセイ対照の特定
Figure 2021527710
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アッセイ対照には、陽性対照−１％コウジ酸；陰性対照−無菌の脱イオン水；および溶媒対照−ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）が含まれ、ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ中で調製される。
この研究のためには、陰性対照は使用されなかった。代わりに、それぞれ、陽性対照および被験物質で処理された組織に関するデータを補正するために、溶媒対照（１７ＡＡ７０）を使用した。
さらに、４つの組織の群に、被験物質および対照を適用し、そのうち２つが組織生存率（ＭＴＴ）エンドポイントのために、２つがメラニンエンドポイントのためにそれぞれ使用された。
試験系
ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）によって提供されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌを本研究で使用した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織は、ヒト表皮の多層化され、高度に分化されたモデルを形成するために培養されてきた正常なヒト由来の、上皮ケラチン産生細胞（ＮＨＥＫ）およびメラニン形成細胞（ＮＨＭ）からなる。同時培養物内のＮＨＭは、様々なレベルの色素沈着の組織をもたらす、自発的メラニン形成を経る。気・液界面において細胞培養挿入物上で培養物を増殖させ、皮膚調節物質の局所適用を可能にした。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）モデルは、インビボ様の形態的および超微細構造的特徴を示す。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織の基底細胞層中に局在化されたＮＨＭは樹状であり、組織の層を次第に定植するメラニン顆粒を自発的に産生する。このように、陰性対照と比べて、メラニンの産生を阻害または刺激し得る材料に関してスクリーニングするために、この試験系が使用される。
実験のデザインおよび方法論
本研究の実験デザインは、可能であれば無溶媒被験物質（および／または適宜投薬溶液）のｐＨの決定、ならびに反復された曝露後における相対的組織生存率およびＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌに対する皮膚メラニン形成調節物質としての被験物質の潜在的作用を決定するための確定的アッセイからなった。合計７日間、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌに被験物質を曝露した。４８時間ごとに（前の処理から４８＋２時間の時間枠内に）、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌに被験物質を局所的に適用した。対照および被験物質で処理された組織中でのＭＴＴのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性ミクロソーム酵素還元によって（および、より低い程度で、ＭＴＴのコハク酸脱水素酵素還元によって）、被験物質の毒性を決定した。データは、相対的な生存の形態で与えられた（陰性／溶媒対照と比較したＭＴＴ変換）。陰性／溶媒対照処理された組織と比較した、被験物質処理された組織中で産生されたメラニンの濃度を決定することによって、メラニン産生に対する潜在的な影響を評価した。データは、メラニン標準曲線を用いて決定された、被験物質処理された組織によって産生されたメラニンの濃度の形態で与えられた。または、データは、陰性／溶媒対照処理された組織についてのメラニン濃度のパーセント変化として与えられ得る。
使用された方法は、ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって供給された手順の改変である。
培地および試薬
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ）は、ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌ（ＭＥＬ−３００−Ａ）は、ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。１％コウジ酸（無菌の脱イオン水中に調製された）は、Ｓｉｇｍａから購入した。ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、Ｓｉｇｍａから購入した。２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＭＴＴ Ａｄｄｉｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）は、Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。抽出溶媒（イソプロパノール）は、Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。無菌の無Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＣＭＦ−ＤＰＢＳ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。メラニンは、Ｓｉｇｍａから購入した。無菌の脱イオン水は、Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。Ｓｏｌｖａｂｌｅは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入した。
被験物質の調製および送達
このプロトコール内に別段の明記がなければ、２５μＬの各被験物質を組織上に直接適用して、上面を被覆した。被験物質の性質（液体、ゲル、クリーム、泡など）に応じて、組織の表面上に被験物質を均一に広げるために、投薬装置、メッシュまたはその他の補助を使用することが、必要となり得た。
投与経路
７日の試験の間、４８時間ごとに（前の処理から４８＋２時間の時間枠内に）、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織に被験物質を局所的に適用した。２５μＬの各被験物質を各組織に適用した。それぞれ、２５μＬの陽性および陰性／溶媒対照を各組織に適用した。
ｐＨ決定
可能であれば、無溶媒被験物質（および／または適宜投薬溶液）のｐＨを決定した。ｐＨは、ｐＨ紙を用いて（例えば、推定のために０〜１４のｐＨ範囲、および／またはより正確な値を決定するために５〜１０のｐＨ範囲で）決定した。より狭い範囲のｐＨ紙上での典型的なｐＨ増分は、およそ０．３〜０．５ｐＨ単位であった。ｐＨ紙上での最大の増分は、１．０ｐＨ単位であった。
対照
確定的アッセイは、陰性対照、陽性対照および１つの溶媒対照（ＤＭＳＯ）を含んだ。アッセイ陰性対照に指定されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織は、２５μＬの無菌脱イオン水で処理した。アッセイ陽性対照に指定された組織に投薬するために、２５μＬの１％コウジ酸（無菌の脱イオン水中で調製され、調製の時点でろ過された）を使用した。調製の２時間以内に使用されるまで、１％コウジ酸は、アルミホイルで被覆されたチューブ中に保存した。陰性／溶媒および陽性対照曝露時間は、被験物質に関して使用された曝露時間と同一であった。非処理組織も対照として使用した。
直接的な被験物質によるＭＴＴの還元の査定
各被験物質がＭＴＴを直接還元する能力を査定することが必要であった。ＭＴＴ Ａｄｄｉｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ中で、１．０ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ溶液を調製した。１ｍＬのＭＴＴ溶液に、およそ２５μＬの被験物質を添加し、暗所にて、３７±１℃で、１〜３時間、混合物をインキュベートした。陰性対照である２５μＬの無菌脱イオン水を同時に試験した。ＭＴＴ溶液の色が青／紫色に変化したら、被験物質がＭＴＴを還元したと推定した。水に不溶性の試験材料は、被験物質と培地の界面においてのみ、直接の還元（暗色化）を示し得た。
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）の受領
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｋｉｔを受領して直ちに、製造業者によって示されたとおりに溶液を保存した。使用されるまで、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を２〜８℃で保存した。
受領の日（投薬の前日）に、適切な体積のＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ）を取り出し、３７±１℃に加温した。９／１０（０．９）ｍＬのＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ／ウェルを、６ウェルプレートの適切なウェル中に分割した。密封された梱包を開封する前に、アガロースゲルと細胞培養挿入物間の気泡に関して、各ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を検査した。細胞培養挿入物面積の５０％より大きな気泡を有する組織は、使用しなかった。２４ウェル搬送容器をビニール袋から取り出し、７０％エタノールで表面を消毒した。適切な数のＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、２４ウェル搬送容器から６ウェルプレート中に無菌的に移した。組織を馴らすために、３７±１℃で、空気中５±１％ＣＯ２の加湿された雰囲気中において（標準培養条件）、一晩（少なくとも１６時間）、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をインキュベートした。袋を開封したら直ちに、組織転移の時点で搬送寒天上に残存する使用されていない全ての組織に５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気で短時間気体を供給し、袋を密封し、その後の使用のために２〜８℃で保存した。
確定的アッセイ
組織曝露：培養の開始から少なくとも１６時間後に、アッセイのゼロ時点での組織の色素沈着の程度の視覚的査定を補助するために、デジタルカメラを用いて、５つのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織（０日目では処理されていないと考えた）の写真を撮影した。ＣＭＦ−ＤＰＢＳで２つのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をすすぎ、無菌の吸収紙上にブロットして乾燥させ、過剰の液体を除去した。すすいだ後、適切なＭＴＴ含有ウェルにＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を移し、ＭＴＴアッセイにおいて処理した。ＣＭＦ−ＤＰＢＳで３つのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をすすぎ、無菌の吸収紙上にブロットして乾燥させ、過剰の液体を除去した。無菌のメスを用いて、細胞培養挿入物からＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を取り出し、ラベルを付けた１．５ｍＬの微量遠心管の中に入れ、その後のメラニン分析のために、−６０℃未満で保存した。
培養の開始から少なくとも１６時間後に、０．９ｍＬ／ウェルの新鮮な予め加温されたＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭを含む新しい６ウェルプレート上に残りの組織を移した。７日の時間枠にわたって、試験を行った。最初の日に、および４８時間ごとに（前回の処理から４８＋２時間の時間枠内に）、２５μＬの各被験物質で５つの組織を局所的に処理した。培地は毎日（前回の再補充から２４＋２時間の時間枠内に）交換し、０．９ｍＬ／ウェルの新鮮な予め加温されたＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭを含む新しい６ウェルプレートに組織を移した。
最初の日に、および４８時間ごとに（前回の処理から４８＋２時間の時間枠内に）、それぞれ、２５μＬの陽性および陰性／溶媒対照で５つの組織を局所的に処理した。培地は毎日（前回の再補充から２４＋２時間の時間枠内に）交換し、０．９ｍＬ／ウェルの新鮮な予め加温されたＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭを含む新しい６ウェルプレートに組織を移した。３７±１℃で、空気中５±１％ＣＯ２の加湿された雰囲気中において（標準培養条件）、適切な曝露時間、組織をインキュベートした。
投薬の日に、全ての残存する被験物質を除去するために、すすぎ毎に約５００μＬのＣＭＦ−ＤＰＢＳを用いて、まず、穏やかにＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を３回すすいだ。ＣＭＦ−ＤＰＢＳをウェル中に穏やかにピペットで加え、次いで、無菌の吸引装置を用いて取り出した。０．９ｍＬの新鮮な、予め加温されたＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭを含む新しい６ウェルプレートに組織を移し、適切な被験物質、陰性／溶媒または陽性対照を投薬した。３７±１℃で、空気中５±１％ＣＯ２の加湿された雰囲気中において（標準培養条件）、適切な曝露時間、組織をインキュベートした。
７日の試験の終了時に、アッセイの終了時（７日）に組織の色素沈着の程度の目視による査定を助けるために、デジタルカメラを用いて、陰性／溶媒または陽性対照でおよび各被験物質で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織の写真を撮影した。次いで、ＭＴＴ還元によって、それぞれ陽性および陰性対照でならびに各被験物質で処理された２つの組織の生存率を決定した。７日の試験の終了時に、それぞれ、各被験物質、陽性および陰性／溶媒対照で処理された３つの組織によって産生されたメラニンを測定した。
ＭＴＴアッセイ：（バッチ調製時にろ過された）ＰＢＳ中に調製されたＭＴＴの１０Ｘ原液を融解し、加温したＭＴＴ Ａｄｄｉｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ中に希釈して、使用の最大２時間前に、１．０ｍｇ／ｍＬ溶液を作製した。予めラベルを付けた２４ウェルプレートの各指定されたウェルに、３００μＬのＭＴＴ溶液を加えた。
曝露時間後、ＭＴＴアッセイに指定された各ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をＣＭＦ−ＤＰＢＳですすぎ（この工程に許容され得るスプレー瓶の使用）、無菌の吸収紙上でブロットして乾燥させ、過剰の液体を除去した。すすいだ後、適切なＭＴＴ含有ウェルにＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を移した。３±０．１時間、２４ウェルプレートを標準条件でインキュベートした。
３±０．１時間後に、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を無菌の吸収紙上にブロットし、過剰の液体を除去し、各指定されたウェル中に２．０ｍＬのイソプロパノールを含む予めラベルを付けた２４ウェルプレートに移した。プレートをパラフィンで覆い、最後の曝露時間が採集されるまで、冷蔵庫（２〜８℃）中に保存した。必要であれば、ＭＴＴを抽出する前に、プレートを一晩（または最後の曝露時間が採集された後最長２４時間）冷蔵庫中に保存した。次いで、少なくとも２時間、室温で、プレートを振盪した。抽出期間の終了時に、細胞培養挿入物がそこから採取されたウェル中に、細胞培養挿入物内の液体のデカンテーションを行った。抽出溶液を混合し、９６ウェルプレートの適切なウェルに２００μＬを移した。ブランクとして指定されたウェルに、２００μＬのイソプロパノールを加えた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｖｍａｘプレートリーダーを用いて、各ウェルの５５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ５５０）を測定した。
メラニンアッセイ：適切な曝露時間の終了時に、培地から全ての残存する被験物質または過剰のフェノールレッドを除去するために、すすぎごとに約５００μＬのＣＭＦ−ＤＰＢＳを用いて、メラニンアッセイに指定されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を穏やかに少なくとも３回すすぎ、無菌の吸収紙上でブロットして乾燥させ、過剰の液体を取り除いた。アッセイの終了時に、デジタルカメラを用いてＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織の写真を撮影した。無菌のメスまたは無菌の穿孔器（単数もしくは複数）を用いて、細胞培養挿入物からＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を取り出し、ラベルを付けた１．５ｍＬの微量遠心管の中に入れ、その後のメラニン分析のために、−６０℃未満で保存した。
メラニン抽出アッセイの日に、室温でおよそ１０分間、切り取られた組織を融解した。各微量遠心管に２５０μＬのＳｏｌｖａｂｌｅを加え、少なくとも１６時間、６０＋２℃で、管をインキュベートした。メラニンをＳｏｌｖａｂｌｅ中に溶解することによって、１ｍｇ／ｍＬのメラニン標準原溶液を調製した。０ｍｇ／ｍＬ〜０．３３ｍｇ／ｍＬの範囲のメラニン標準物質の系列を１ｍｇ／ｍＬ原液から調製した。１．２ｍＬのＳｏｌｖａｂｌｅに０．６ｍＬの１ｍｇ／ｍＬメラニン標準原溶液を加えることによって、標準物質の系列を調製し、次いで、さらに５つの希釈液の系列（３の希釈係数）を作製した。ゼロ標準物質として、Ｓｏｌｖａｂｌｅを使用した。メラニン標準物質系列およびＳｏｌｖａｂｌｅを、少なくとも１６時間、６０＋２℃でインキュベートした。
メラニン抽出を開始してから少なくとも１６時間後に、試料（ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織から抽出されたメラニンに相当する）および標準物質を含む管を室温で冷却し、１３，０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心した。２００μＬの試料（単一のウェル）または標準物質（二連のウェル）を、９６ウェルプレートの適切なウェルに移した。二連のウェルでブランクとして指定されたウェルに、２００μＬのＳｏｌｖａｂｌｅを加えた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｖｍａｘプレートリーダーを用いて（Ａｕｔｏｍｉｘ機能を選択して）、各ウェルの４９０ｎｍでの吸光度（ＯＤ４９０）を測定した。
残存する被験物質によるＭＴＴの還元の査定のための死滅対照
残存する可能性がある被験物質がＭＴＴを直接還元するように作用していなかったことを実証するために、試験材料が組織に結合して、偽のＭＴＴ還元シグナルをもたらさなかったことを示すために、確定的アッセイにおいて機能的チェックを行った。
残存する被験物質がＭＴＴを直接還元するように作用していたかどうかを判定するために、凍結死滅された対照組織を使用した。少なくとも一晩、処理されていないＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）／ＥｐｉＤｅｒｍ（商標）（メラニン形成細胞なしのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標））組織を−２０℃の冷凍庫中に置き、室温に融解し、次いで、再度凍結することによって、凍結死滅された組織を調製した。死滅したら、組織は冷凍庫中に無期限に保存され得る。凍結死滅された組織は、ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから既に調製されたものを受領して、使用まで−２０℃の冷凍庫中に保存してもよい。残存する被験物質による還元を試験するために、通常の様式で、死滅組織を被験物質で処理した。全てのアッセイ手順は、生きた組織に対するのと同じように行った。死滅組織内の残存するＮＡＤＨおよび付随する酵素から少量のＭＴＴ還元が予想されるので、無菌の脱イオン水で処理された少なくとも１つの死滅対照（陰性死滅対照）を平行して試験した。
被験物質処理された死滅対照中でほとんどまたは全くＭＴＴ還元が観察されなければ、被験物質処理された生きた組織中で観察されたＭＴＴ還元は、生きた細胞によるものであり得る。（処理された生きた組織中の量と比べて）処理された死滅対照中にかなりのＭＴＴ還元が存在すれば、化学的還元を考慮するためにさらなる工程を踏まなければならず、またはその被験物質はこの系において試験不能と考えられ得る。
データ解析
ブランクウェルの平均ＯＤ５５０値を計算した。陰性／溶媒対照の平均ＯＤ５５０値からブランクウェルの平均ＯＤ５５０値を差し引くことによって、陰性／溶媒対照の補正された平均ＯＤ５５０値を求めた。各被験物質曝露および陽性対照曝露の補正されたＯＤ５５０値は、ブランクウェルについての平均ＯＤ５５０値をそれぞれから差し引くことによって求めた。全ての計算は、Ｅｘｃｅｌスプレッドシートを用いて行った。論述されているアルゴリズムは処理群レベルで最終エンドポイント解析を計算するために行われるが、個別の反復実験のために同じ計算を適用することができる。
補正された被験物質曝露ＯＤ５５０＝被験物質曝露ＯＤ５５０−ブランク平均ＯＤ５５０
死滅対照（ＫＣ）が使用された場合、被験物質残留物によって直接還元されたＭＴＴの量に関して補正するために、以下のさらなる計算を行った。被験物質処理された死滅対照の正味のＯＤ５５０値を求めるために、被験物質処理された死滅対照の各々についての生のＯＤ５５０値から陰性対照死滅対照についての生のＯＤ５５０値を差し引いた。
各被験物質ＫＣについての正味のＯＤ５５０＝生のＯＤ５５０被験物質ＫＣ−生のＯＤ５５０陰性／溶媒対照ＫＣ
正味のＯＤ５５０値は、特定の曝露時間での被験物質残留物による直接の還元に起因する還元されたＭＴＴの量に相当する。一般に、正味のＯＤ５５０値が０．１５０より大きければ、最終的な補正されたＯＤ５５０値を得るために、生きた処理された組織の補正されたＯＤ５５０値からＭＴＴ還元の正味の量を差し引く。次いで、対照生存率の％を求めるために、これらの最終的な補正されたＯＤ５５０値を使用する。
最終的な補正されたＯＤ５５０＝補正された被験物質ＯＤ５５０（生きた）−正味のＯＤ５５０被験物質（ＫＣ）
最後に、以下の対照の％計算を行う。
％生存率＝［（被験物質または陽性対照の最終的な補正されたＯＤ５５０）／（陰性／溶媒対照（単数または複数）の補正された平均ＯＤ５５０）］×１００
メラニン分析：生の吸光度データを捕捉し、プリントファイルとして保存し、Ｅｘｃｅｌスプレッドシート中に取り込んだ。各試験試料の（０日目の非処理ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織、７日目に各被験物質、陰性／溶媒または陽性対照で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織から抽出されたメラニンに相当する）およびメラニン標準物質のＯＤ４９０値を求めた。ブランクウェルの平均ＯＤ４９０値を差し引くことによって、試験試料および各メラニン標準物質についての補正されたＯＤ４９０値を求めた。標準曲線は、対応する補正された吸光度に対して、ｍｇ／ｍＬでの標準物質の濃度（ｙ軸）としてプロットされた。それぞれの個別の組織中のメラニンの量を標準曲線（線形）から内挿した。最後に、それぞれ、各被験物質または対照処理群についてのメラニン濃度の平均を計算した。
結果
図１は、被験物質、陽性対照および非処理組織についての平均組織生存率およびメラニン濃度の結果を要約する。予備的結果は、本発明のカルバゾール化合物に適用されたある種の製剤が、カルバゾールの皮膚暗色化活性を和らげる中度の皮膚ブライトニング効果を独立に示し得ることを示唆する。
図２は、別個の実験で観察された被験物質および非処理組織についての平均組織生存率およびメラニン濃度の結果を要約する。例えば、マラセジンとインジルビンを含む組み合わせ処理は、いずれかの化合物単独より有効な皮膚ブライトニング効果を示した。
実施例６
インジルビンおよびインジルビン誘導体のメラニン形成能
本研究の目的は、インジルビンおよびインジルビン誘導体に曝露されたＢ１６メラニン形成細胞のメラニン形成および生存率を観察および報告することである。
材料および試薬
平板培地は、Ｌ−グルタミンなしのＤＭＥＭ、ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを含むであろう。アッセイ培地は、フェノールレッドおよびＬ−グルタミンなしのＤＭＥＭ、ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンおよびａＭＳＨを含むであろう。他の試薬は、コウジ酸、ＤＭＳＯおよびＭＴＴを含むであろう。試験される細胞は、Ｂ１６細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６４７５）であろう。
プロトコール
７０％集密度になるまで、Ｂ１６メラニン形成細胞を培養し、採集する。４０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中に細胞を播種し、一晩付着させる。翌日、被験物質および対照をＢ１６アッセイ培地中に希釈する。一晩経た培地を吸引し、２００ｕｌの被験物質および対照を加える。３７℃および１０％ＣＯ２で７２時間、細胞をインキュベートする。７２時間のインキュベーション後に、５４０ｎｍで吸光度を読み取る。培地を除去し、１ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴを含有する１００ｕｌの平板培地と交換し、３７℃および１０％ＣＯ２で２時間インキュベートする。ＭＴＴ培地を除去し、２００ｕｌの９５％エタノール／５％イソプロパノールと交換し、１５分間振盪する。次いで、５７０ｎｍでＭＴＴ吸光度を読み取る。
結果
インジルビンおよびその化学的類縁体を含む本発明の化合物および組成物はメラニン形成を阻害すると予測される。インジルビンの化学的類縁体は、例えば、インジルビンと比べてより強力なメラニン形成阻害活性を示すと予測される。同様に、インジルビンのある種の化学的類縁体は、例えば、インジルビンと比べてより有効性が低いメラニン形成阻害活性を示すと予測される。
実施例７
インビトロでの効力
本発明の化合物および組成物は、インジルビンと少なくとも同程度に強力に、メラニン形成細胞のアポトーシスを誘導し、メラニン形成細胞の活性、メラニン産生、メラノソーム生合成および／またはメラノソーム輸送を調節すると予測される。本発明の化合物および組成物のいくつかは、インジルビンより低い強度でこれらの生物学的過程に影響を与えることも想定される。このような化合物および組成物は、より強力な種と比べて、より好ましい毒性プロファイルを有し得る。
実施例８
インビボでの効力
本発明の化合物および組成物は、皮膚をブライトニングすることおよび様々な障害によって引き起こされる色素沈着過剰／色素沈着低下を改善することを含む、皮膚色素沈着を調節するのに少なくともインジルビンと同程度に有効であることが予測される。本発明の化合物および組成物は、例えば、半減期および吸収に関して好ましい薬物動態プロファイルを示すことがさらに予測される。ある種の化合物はより長い半減期を示すのに対して、その他の化合物はより短い半減期を示すであろう。同様に、ある種の化合物は異なる吸収プロファイルを示し、いくつかの化合物は完全に吸収されるのにより長くかかり、その他の化合物は完全に吸収されるのにかかる時間がより短い。
実施例９
マラセチア由来の化合物および／またはその化学的類縁体を含有する組成物のアポトーシス誘導活性
試薬
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（１×）、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ３／７ Ａｓｓａｙ、ＲＰＭＩ １６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地および抗生物質・抗真菌薬溶液（１００×）。
細胞株ＭｅＷｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−６５（商標））、ＷＭ１１５（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６７５）およびＢ１６Ｆ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−６３２３）を、以下の培養培地中に維持する：ＭｅＷｏおよびＢ１６Ｆ１のための培地：１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ；ＷＭ１１５のための培地：１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０。
実験の方法
細胞を採集し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて細胞数を決定した。所望の密度になるように、細胞を培地で希釈した。最終細胞密度は、例えば、６時間および２４時間処理については４，０００細胞／ウェル、４８時間および７２時間処理については２，０００細胞／ウェルであり得る。アネキシンＶアッセイについては、３８４ウェル透明底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３７１２）が使用されるのに対して、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏアッセイについては、３８４ウェルのソリッド白色底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５７０）が使用される。細胞接着のために、全てのプレートを蓋で覆い、３７℃および５％ＣＯ２に一晩配置する。
３０ｍＭ原液になるように、試験化合物をＤＭＳＯ中に溶解する。３ｍＭおよび０．３ｍＭ濃度を得るために、１０倍希釈を行う。０．９ｍＭスタウロスポリンを陽性対照として使用し、ＤＭＳＯを陰性対照（ＮＣ）として使用する。ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｅｒ Ｅｃｈｏ５５０を用いて、１３２．５ｎＬの化合物を、化合物源プレートから３８４ウェル細胞培養プレート（単数または複数）へ移す。表記インキュベーション時間後に、検出のために、インキュベータからプレートを取り出す。
試験組成物は、ＤＭＳＯ、ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭまたは任意の適切な溶媒中に溶解され、以下の表２〜７中の指示にしたがって調製され得る。適切な溶媒は、当業者に周知である。
アネキシンＶアッセイのために、インキュベータからプレートを取り出し、培養培地を除去する。４０ｕＬのＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ウェル当たり１５ｕＬの予め混合されたアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素希釈標準溶液を加える。プレートを室温で２０分間、インキュベートし、密封し、泡を除去するために、１，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｎａｎｏを用いて、プレートを読み取る。
Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏアッセイのために、インキュベータからプレートを取り出し、室温で１５分間平衡化する。実験前に、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７試薬も融解し、室温に平衡化する。培地に対して１：１の比率で、必要とされるウェルにＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ試薬を添加する。プレートを室温で１５分間インキュベートし、ＥｎＳｐｉｒｅ（商標）プレートリーダーを用いて読み取る。以下の式にしたがって倍数誘導を計算する：倍数誘導＝Ｌｕｍ試料／ＬｕｍＮＣ。
アネキシンＶアッセイおよびカスパーゼ３／７アッセイの結果
組成物＃１〜５を含む本発明の化合物および組成物は細胞死を誘導すると予測される。本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの成分化合物単独と比べて、より強力なアポトーシス誘導活性を示すと予測される。同様に、本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの成分化合物単独と比べて、より有効性が低いアポトーシス誘導活性を実証すると予測される。このような組成物は、より強力な組成物と比べて、より好ましい毒性プロファイルを有し得る。
実施例１０
マラセチア由来の化合物および／またはその化学的類縁体を含有する組成物への曝露後の細胞生存率
試薬
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０アッセイ
実験の方法
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイのために、試験化合物を１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液中に調製する。化合物を１２の濃度に系列希釈する。１００，０００細胞／ｍＬ懸濁液から得た４０ｕＬの細胞を、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５７０）の各ウェル中に分配する。３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で、プレートを一晩インキュベートする。試験化合物を添加し、ＤＭＳＯをビヒクル対照とする。３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で６、２４または４８時間、プレートをインキュベートし、細胞生存率を査定するために、４０ｕＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬をウェルに添加する。
試験組成物は、ＤＭＳＯ、ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭまたは任意の適切な溶媒中に溶解され、以下の表２〜７中の指示にしたがって調製され得る。適切な溶媒は、当業者に周知である。
結果
組成物＃１〜５を含む本発明の化合物および組成物は細胞死を誘導すると予測される。本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの成分化合物単独と比べて、より強力なアポトーシス誘導活性を示すと予測される。同様に、本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの成分化合物単独と比べて、より有効性が低いアポトーシス誘導活性を実証すると予測される。このような組成物は、より強力な組成物と比べて、より好ましい毒性プロファイルを有し得る。
実施例１１
マラセチア由来の化合物および／またはその化学的類縁体を含有する組成物のアリール炭化水素受容体活性化能
アッセイ手順
高グルコースおよびＬ−グルタミンならびに１０％ＦＢＳをＤＭＥＭに補充することによって、安定に形質移入されたＨｅｐＧ２細胞のための培養培地を調製する。
３７℃、５％ＣＯ２および９５％相対湿度で、ＨｅｐＧ２−ＡｈＲ−Ｌｕｃ細胞をＴ−７５フラスコ中で培養する。剥離および分離前に、細胞を８０〜９０％の集密度に達するようにする。
５ｍＬ ＰＢＳで培養された細胞をすすぐ。ＰＢＳを吸引除去し、１．５ｍＬトリプシンをフラスコに加え、３７℃でおよそ５分間または細胞が剥離され、浮遊するまで、細胞をインキュベートする。トリプシンは、過剰な血清含有培地を添加することによって不活化される。
細胞懸濁液を円錐チューブに移し、細胞をペレット化させるために、１２０ｇで１０分間遠心する。適切な密度で、播種培地中に細胞を再懸濁する。４０μＬの細胞を３８４ウェル培養プレートに移す（５×１０３細胞／ウェル）。３７℃で２４時間、インキュベータ中にプレートを配置する。
その後、試験化合物、試験組成物およびオメプラゾール陽性対照の原溶液を調製する。Ｅｃｈｏ５５０を用いて、化合物および組成物溶液をアッセイプレート中に移す。次いで、化合物／組成物処理のために、プレートをインキュベータ中に戻す。
その後、２４時間の処理後に、インキュベータからプレートを取り出し、室温で冷却させる。培地のものと等しい３０μＬのＯｎｅ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに加える。細胞を少なくとも３分間溶解させ、次いで、ルミノメーター中で測定する。
ＸＬｆｉｔでの非線形回帰分析を用いて用量応答をグラフ化し、ＥＣ５０値も計算する。
結果
組成物＃１〜５を含む本発明の化合物および組成物はＡｈＲ活性を調節すると予測される。本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの成分化合物単独と比べて、より強力なＡｈＲアゴニスト活性を示すと予測される。同様に、本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの成分化合物単独と比べて、より有効性が低いＡｈＲアゴニスト活性を実証すると予測される。本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの成分化合物単独と比べて、より強力なＡｈＲアンタゴニスト活性も示すと予測される。同様に、本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの成分化合物単独と比べて、より有効性が低いＡｈＲアンタゴニスト活性も実証することも予測される。
実施例１２
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ａｓｓａｙ
本研究の目的は、反復した被験物質曝露後に、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌ中で、皮膚メラニン形成調節物質としての被験物質の潜在的作用を評価することであった。第二に、本研究の目的は、反復した曝露後に、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌへの被験物質の潜在的皮膚刺激を評価することであった。陰性／溶媒対照処理された組織と比較した、被験物質処理された組織中でのＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の相対的変換を測定することによって毒性を決定した。陰性／溶媒対照処理された組織と比較した、被験物質処理された組織によって産生されたメラニンの濃度を測定することによって、メラニン産生に対する潜在的な影響を決定した。
試験物質およびアッセイ対照の特定
Figure 2021527710
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アッセイ対照には、陽性対照−マラセジン（ＣＶ−８６８４）（５００μＭ）（１７ＡＪ４１）；および溶媒対照−ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）が含まれ、ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ中で調製される。
さらに、４つの組織の群に、被験物質および対照を適用し、そのうち２つが組織生存率（ＭＴＴ）エンドポイントのために、２つがメラニンエンドポイントのためにそれぞれ使用された。
試験系
ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）によって提供されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌを本研究で使用した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織は、ヒト表皮の多層化され、高度に分化されたモデルを形成するために培養されてきた正常なヒト由来の、上皮ケラチン産生細胞（ＮＨＥＫ）およびメラニン形成細胞（ＮＨＭ）からなる。同時培養物内のＮＨＭは、様々なレベルの色素沈着の組織をもたらす、自発的メラニン形成を経る。気・液界面において細胞培養挿入物上で培養物を増殖させ、皮膚調節物質の局所適用を可能にした。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）モデルは、インビボ様の形態的および超微細構造的特徴を示す。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織の基底細胞層中に局在化されたＮＨＭは樹状であり、組織の層を次第に定植するメラニン顆粒を自発的に産生する。このように、陰性対照と比べて、メラニンの産生を阻害または刺激し得る材料に関してスクリーニングするために、この試験系が使用される。
実験のデザインおよび方法論
本研究の実験デザインは、可能であれば無溶媒被験物質（および／または適宜投薬溶液）のｐＨの決定、ならびに反復された曝露後における相対的組織生存率およびＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌに対する皮膚メラニン形成調節物質としての被験物質の潜在的作用を決定するための確定的アッセイからなった。合計７日間、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌに被験物質を曝露した。４８時間ごとに（前の処理から４８±２時間の時間枠内に）、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌに被験物質を局所的に適用した。対照および被験物質で処理された組織中でのＭＴＴのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性ミクロソーム酵素還元によって（および、より低い程度で、ＭＴＴのコハク酸脱水素酵素還元によって）、被験物質の毒性を決定した。データは、相対的な生存の形態で与えられた（陰性／溶媒対照と比較したＭＴＴ変換）。陰性／溶媒対照処理された組織と比較した、被験物質処理された組織中で産生されたメラニンの濃度を決定することによって、メラニン産生に対する潜在的な影響を評価した。データは、メラニン標準曲線を用いて決定された、被験物質処理された組織によって産生されたメラニンの濃度の形態で与えられた。または、データは、陰性／溶媒対照処理された組織についてのメラニン濃度のパーセント変化として与えられ得る。
使用された方法は、ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって供給された手順の改変である。
培地および試薬
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ）は、ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌ（ＭＥＬ−３００−Ａ）は、ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。１％コウジ酸（無菌の脱イオン水中に調製された）は、Ｓｉｇｍａから購入した。ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、Ｓｉｇｍａから購入した。２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＭＴＴ Ａｄｄｉｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）は、Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。抽出溶媒（イソプロパノール）は、Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。無菌の無Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＣＭＦ−ＤＰＢＳ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。メラニンは、Ｓｉｇｍａから購入した。無菌の脱イオン水は、Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。Ｓｏｌｖａｂｌｅは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入した。
被験物質の調製および送達
このプロトコール内に別段の明記がなければ、２５μＬの各被験物質を組織上に直接適用して、上面を被覆した。被験物質の性質（液体、ゲル、クリーム、泡など）に応じて、組織の表面上に被験物質を均一に広げるために、投薬装置、メッシュまたはその他の補助を使用することが、必要となり得た。
投与経路
７日の試験の間、４８時間ごとに（前の処理から４８＋２時間の時間枠内に）、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織に被験物質を局所的に適用した。２５μＬの各被験物質を各組織に適用した。それぞれ、２５μＬの陽性および陰性／溶媒対照を各組織に適用した。
ｐＨ決定
可能であれば、無溶媒被験物質（および／または適宜投薬溶液）のｐＨを決定した。ｐＨは、ｐＨ紙を用いて（例えば、推定のために０〜１４のｐＨ範囲、および／またはより正確な値を決定するために５〜１０のｐＨ範囲で）決定した。より狭い範囲のｐＨ紙上での典型的なｐＨ増分は、およそ０．３〜０．５ｐＨ単位であった。ｐＨ紙上での最大の増分は、１．０ｐＨ単位であった。
対照
確定的アッセイは、陰性対照、陽性対照および１つの溶媒対照（ＤＭＳＯ）または陽性対照および溶媒対照（ＤＭＳＯ）を含んだ。アッセイ陰性／溶媒対照に指定されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織は、２５μＬの無菌脱イオン水またはＤＭＳＯで処理した。アッセイ陽性対照に指定された組織は、２５μＬの１％コウジ酸、マラセジン（ＣＶ−８６８４）（１７ＡＪ４１）５００μＭまたは組成物＃２で処理した。調製の２時間以内に使用されるまで、１％コウジ酸は、アルミホイルで被覆されたチューブ中に保存した。陰性／溶媒および陽性対照曝露時間は、被験物質に関して使用された曝露時間と同一であった。非処理組織も対照として使用した。
直接的な被験物質によるＭＴＴの還元の査定
各被験物質がＭＴＴを直接還元する能力を査定することが必要であった。ＭＴＴ Ａｄｄｉｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ中で、１．０ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ溶液を調製した。１ｍＬのＭＴＴ溶液に、およそ２５μＬの被験物質を添加し、暗所にて、３７±１℃で、１〜３時間、混合物をインキュベートした。陰性対照である２５μＬの無菌脱イオン水、または溶媒対照である２５μＬのＤＭＳＯを同時に試験した。ＭＴＴ溶液の色が青／紫色に変化したら、被験物質がＭＴＴを還元したと推定した。水に不溶性の試験材料は、被験物質と培地の界面においてのみ、直接の還元（暗色化）を示し得た。
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）の受領
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｓｋｉｎ Ｋｉｔを受領して直ちに、製造業者によって示されたとおりに溶液を保存した。使用されるまで、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を２〜８℃で保存した。
受領の日（投薬の前日）に、適切な体積のＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ）を取り出し、３７±１℃に加温した。９／１０（０．９）ｍＬのＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ／ウェルを、６ウェルプレートの適切なウェル中に分割した。密封された梱包を開封する前に、アガロースゲルと細胞培養挿入物間の気泡に関して、各ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を検査した。細胞培養挿入物面積の５０％より大きな気泡を有する組織は、使用しなかった。２４ウェル搬送容器をビニール袋から取り出し、７０％エタノールで表面を消毒した。適切な数のＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、２４ウェル搬送容器から６ウェルプレート中に無菌的に移した。組織を馴らすために、３７±１℃で、空気中５±１％ＣＯ２の加湿された雰囲気中において（標準培養条件）、一晩（少なくとも１６時間）、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をインキュベートした。袋を開封したら直ちに、組織転移の時点で搬送寒天上に残存する使用されていない全ての組織に５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気で短時間気体を供給し、袋を密封し、その後の使用のために２〜８℃で保存した。
確定的アッセイ
組織曝露：培養の開始から少なくとも１６時間後に、アッセイのゼロ時点での組織の色素沈着の程度の視覚的査定を補助するために、デジタルカメラを用いて、５つのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織（０日目では処理されていないと考えた）の写真を撮影した。ＣＭＦ−ＤＰＢＳで２つのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をすすぎ、無菌の吸収紙上にブロットして乾燥させ、過剰の液体を除去した。すすいだ後、適切なＭＴＴ含有ウェルにＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を移し、ＭＴＴアッセイにおいて処理した。ＣＭＦ−ＤＰＢＳで２つまたは３つのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をすすぎ、無菌の吸収紙上にブロットして乾燥させ、過剰の液体を除去した。無菌のメスを用いて、細胞培養挿入物からＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を取り出し、ラベルを付けた１．５ｍＬの微量遠心管の中に入れ、その後のメラニン分析のために、−６０℃未満で保存した。
培養の開始から少なくとも１６時間後に、０．９ｍＬ／ウェルの新鮮な予め加温されたＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭを含む新しい６ウェルプレート上に残りの組織を移した。７日の時間枠にわたって、試験を行った。最初の日に、および４８時間ごとに（前回の処理から４８＋２時間の時間枠内に）、２５μＬの各被験物質で４つまたは５つの組織を局所的に処理した。培地は毎日（前回の再補充から２４＋２時間の時間枠内に）交換し、０．９ｍＬ／ウェルの新鮮な予め加温されたＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭを含む新しい６ウェルプレートに組織を移した。
最初の日に、および４８時間ごとに（前回の処理から４８＋２時間の時間枠内に）、それぞれ、２５μＬの陽性および陰性／溶媒対照で４つまたは５つの組織を局所的に処理した。培地は毎日（前回の再補充から２４＋２時間の時間枠内に）交換し、０．９ｍＬ／ウェルの新鮮な予め加温されたＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭを含む新しい６ウェルプレートに組織を移した。３７±１℃で、空気中５±１％ＣＯ２の加湿された雰囲気中において（標準培養条件）、適切な曝露時間、組織をインキュベートした。
投薬の日に、全ての残存する被験物質を除去するために、すすぎ毎に約５００μＬのＣＭＦ−ＤＰＢＳを用いて、まず、穏やかにＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を３回すすいだ。ＣＭＦ−ＤＰＢＳをウェル中に穏やかにピペットで加え、次いで、無菌の吸引装置を用いて取り出した。０．９ｍＬの新鮮な、予め加温されたＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭを含む新しい６ウェルプレートに組織を移し、適切な被験物質、陰性／溶媒または陽性対照を投薬した。３７±１℃で、空気中５±１％ＣＯ２の加湿された雰囲気中において（標準培養条件）、適切な曝露時間、組織をインキュベートした。
７日の試験の終了時に、アッセイの終了時（７日）に組織の色素沈着の程度の目視による査定を助けるために、デジタルカメラを用いて、陰性／溶媒または陽性対照でおよび各被験物質で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織の写真を撮影した。次いで、ＭＴＴ還元によって、それぞれ陽性および陰性対照でならびに各被験物質で処理された２つの組織の生存率を決定した。７日の試験の終了時に、それぞれ、各被験物質、陽性および陰性／溶媒対照で処理された３つの組織によって産生されたメラニンを測定した。
ＭＴＴアッセイ：（バッチ調製時にろ過された）ＰＢＳ中に調製されたＭＴＴの１０Ｘ原液を融解し、加温したＭＴＴ Ａｄｄｉｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ中に希釈して、使用の最大２時間前に、１．０ｍｇ／ｍＬ溶液を作製した。予めラベルを付けた２４ウェルプレートの各指定されたウェルに、３００μＬのＭＴＴ溶液を加えた。
曝露時間後、ＭＴＴアッセイに指定された各ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をＣＭＦ−ＤＰＢＳですすぎ（この工程に許容され得るスプレー瓶の使用）、無菌の吸収紙上でブロットして乾燥させ、過剰の液体を除去した。すすいだ後、適切なＭＴＴ含有ウェルにＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を移した。３±０．１時間、２４ウェルプレートを標準条件でインキュベートした。
３±０．１時間後に、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を無菌の吸収紙上にブロットし、過剰の液体を除去し、各指定されたウェル中に２．０ｍＬのイソプロパノールを含む予めラベルを付けた２４ウェルプレートに移した。プレートをパラフィンで覆い、最後の曝露時間が採集されるまで、冷蔵庫（２〜８℃）中に保存した。必要であれば、ＭＴＴを抽出する前に、プレートを一晩（または最後の曝露時間が採集された後最長２４時間）冷蔵庫中に保存した。次いで、少なくとも２時間、室温で、プレートを振盪した。抽出期間の終了時に、細胞培養挿入物がそこから採取されたウェル中に、細胞培養挿入物内の液体のデカンテーションを行った。抽出溶液を混合し、９６ウェルプレートの適切なウェルに２００μＬを移した。ブランクとして指定されたウェルに、２００μＬのイソプロパノールを加えた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｖｍａｘプレートリーダーを用いて、各ウェルの５５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ５５０）を測定した。
メラニンアッセイ：適切な曝露時間の終了時に、培地から全ての残存する被験物質または過剰のフェノールレッドを除去するために、すすぎごとに約５００μＬのＣＭＦ−ＤＰＢＳを用いて、メラニンアッセイに指定されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を穏やかに少なくとも３回すすぎ、無菌の吸収紙上でブロットして乾燥させ、過剰の液体を取り除いた。アッセイの終了時に、デジタルカメラを用いてＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織の写真を撮影した。無菌のメスまたは無菌の穿孔器（単数もしくは複数）を用いて、細胞培養挿入物からＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を取り出し、ラベルを付けた１．５ｍＬの微量遠心管の中に入れ、その後のメラニン分析のために、−６０℃未満で保存した。
メラニン抽出アッセイの日に、室温でおよそ１０分間、切り取られた組織を融解した。各微量遠心管に２５０μＬのＳｏｌｖａｂｌｅを加え、少なくとも１６時間、６０＋２℃で、管をインキュベートした。メラニンをＳｏｌｖａｂｌｅ中に溶解することによって、１ｍｇ／ｍＬのメラニン標準原溶液を調製した。０ｍｇ／ｍＬ〜０．３３ｍｇ／ｍＬの範囲のメラニン標準物質の系列を１ｍｇ／ｍＬ原液から調製した。１．２ｍＬのＳｏｌｖａｂｌｅに０．６ｍＬの１ｍｇ／ｍＬメラニン標準原溶液を加えることによって、標準物質の系列を調製し、次いで、さらに５つの希釈液の系列（３の希釈係数）を作製した。ゼロ標準物質として、Ｓｏｌｖａｂｌｅを使用した。メラニン標準物質系列およびＳｏｌｖａｂｌｅを、少なくとも１６時間、６０＋２℃でインキュベートした。
メラニン抽出を開始してから少なくとも１６時間後に、試料（ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織から抽出されたメラニンに相当する）および標準物質を含む管を室温で冷却し、１３，０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心した。２００μＬの試料（単一のウェル）または標準物質（二連のウェル）を、９６ウェルプレートの適切なウェルに移した。二連のウェルでブランクとして指定されたウェルに、２００μＬのＳｏｌｖａｂｌｅを加えた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｖｍａｘプレートリーダーを用いて（Ａｕｔｏｍｉｘ機能を選択して）、各ウェルの４９０ｎｍでの吸光度（ＯＤ４９０）を測定した。
残存する被験物質によるＭＴＴの還元の査定のための死滅対照
残存する可能性がある被験物質がＭＴＴを直接還元するように作用していなかったことを実証するために、試験材料が組織に結合して、偽のＭＴＴ還元シグナルをもたらさなかったことを示すために、確定的アッセイにおいて機能的チェックを行った。
残存する被験物質がＭＴＴを直接還元するように作用していたかどうかを判定するために、凍結死滅された対照組織を使用した。少なくとも一晩、処理されていないＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）／ＥｐｉＤｅｒｍ（商標）（メラニン形成細胞なしのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標））組織を−２０℃の冷凍庫中に置き、室温に融解し、次いで、再度凍結することによって、凍結死滅された組織を調製した。死滅したら、組織は冷凍庫中に無期限に保存され得る。凍結死滅された組織は、ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから既に調製されたものを受領して、使用まで−２０℃の冷凍庫中に保存してもよい。残存する被験物質による還元を試験するために、通常の様式で、死滅組織を被験物質で処理した。全てのアッセイ手順は、生きた組織に対するのと同じように行った。死滅組織内の残存するＮＡＤＨおよび付随する酵素から少量のＭＴＴ還元が予想されるので、無菌の脱イオン水で処理された少なくとも１つの死滅対照（陰性死滅対照）を平行して試験した。
被験物質処理された死滅対照中でほとんどまたは全くＭＴＴ還元が観察されなければ、被験物質処理された生きた組織中で観察されたＭＴＴ還元は、生きた細胞によるものであり得る。（処理された生きた組織中の量と比べて）処理された死滅対照中にかなりのＭＴＴ還元が存在すれば、化学的還元を考慮するためにさらなる工程を踏まなければならず、またはその被験物質はこの系において試験不能と考えられ得る。
データ解析
ブランクウェルの平均ＯＤ５５０値を計算した。陰性／溶媒対照の平均ＯＤ５５０値からブランクウェルの平均ＯＤ５５０値を差し引くことによって、陰性／溶媒対照の補正された平均ＯＤ５５０値を求めた。各被験物質曝露および陽性対照曝露の補正されたＯＤ５５０値は、ブランクウェルについての平均ＯＤ５５０値をそれぞれから差し引くことによって求めた。全ての計算は、Ｅｘｃｅｌスプレッドシートを用いて行った。論述されているアルゴリズムは処理群レベルで最終エンドポイント解析を計算するために行われるが、個別の反復実験のために同じ計算を適用することができる。
補正された被験物質曝露ＯＤ５５０＝被験物質曝露ＯＤ５５０−ブランク平均ＯＤ５５０
死滅対照（ＫＣ）が使用された場合、被験物質残留物によって直接還元されたＭＴＴの量に関して補正するために、以下のさらなる計算を行った。被験物質処理された死滅対照の正味のＯＤ５５０値を求めるために、被験物質処理された死滅対照の各々についての生のＯＤ５５０値から陰性対照死滅対照についての生のＯＤ５５０値を差し引いた。
各被験物質ＫＣについての正味のＯＤ５５０＝生のＯＤ５５０被験物質ＫＣ−生のＯＤ５５０陰性／溶媒対照ＫＣ
正味のＯＤ５５０値は、特定の曝露時間での被験物質残留物による直接の還元に起因する還元されたＭＴＴの量に相当する。一般に、正味のＯＤ５５０値が０．１５０より大きければ、最終的な補正されたＯＤ５５０値を得るために、生きた処理された組織の補正されたＯＤ５５０値からＭＴＴ還元の正味の量を差し引く。次いで、対照生存率の％を求めるために、これらの最終的な補正されたＯＤ５５０値を使用する。
最終的な補正されたＯＤ５５０＝補正された被験物質ＯＤ５５０（生きた）−正味のＯＤ５５０被験物質（ＫＣ）
最後に、以下の対照の％計算を行う。
％生存率＝［（被験物質または陽性対照の最終的な補正されたＯＤ５５０）／（陰性／溶媒対照（単数または複数）の補正された平均ＯＤ５５０）］×１００
メラニン分析：生の吸光度データを捕捉し、プリントファイルとして保存し、Ｅｘｃｅｌスプレッドシート中に取り込んだ。各試験試料の（０日目の非処理ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織、７日目に各被験物質、陰性／溶媒または陽性対照で処理されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織から抽出されたメラニンに相当する）およびメラニン標準物質のＯＤ４９０値を求めた。ブランクウェルの平均ＯＤ４９０値を差し引くことによって、試験試料および各メラニン標準物質についての補正されたＯＤ４９０値を求めた。標準曲線は、対応する補正された吸光度に対して、ｍｇ／ｍＬでの標準物質の濃度（ｙ軸）としてプロットされた。それぞれの個別の組織中のメラニンの量を標準曲線（線形）から内挿した。最後に、それぞれ、各被験物質または対照処理群についてのメラニン濃度の平均を計算した。
結果
図４は、被験物質、試験組成物、陽性対照および溶媒対照についての平均組織生存率およびメラニン濃度の結果を要約する。組成物＃１および＃２を含む化合物は、単一の組成物中に組み合わされたときに相乗効果を実証した。
図５は、被験物質、試験組成物、陽性対照および溶媒対照についての平均組織生存率およびメラニン濃度の結果を要約する。組成物＃２、＃３、＃４および＃５を含む化合物は、単一の組成物中に組み合わされたときに相乗効果を実証した。
実施例１３
マラセチア由来の化合物および／またはその化学的類縁体を含有する組成物のメラニン形成能
本研究の目的は、マラセチア由来の化合物および／またはその化学的類縁体を含有する組成物に曝露されたＢ１６メラニン形成細胞のメラニン形成および生存率を観察および報告することである。
材料および試薬
平板培地は、Ｌ−グルタミンなしのＤＭＥＭ、ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを含むであろう。アッセイ培地は、フェノールレッドおよびＬ−グルタミンなしのＤＭＥＭ、ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンおよびａＭＳＨを含むであろう。他の試薬は、コウジ酸、ＤＭＳＯおよびＭＴＴを含むであろう。試験される細胞は、Ｂ１６細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６４７５）であろう。
プロトコール
７０％集密度になるまで、Ｂ１６メラニン形成細胞を培養し、採集する。４０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中に細胞を播種し、一晩付着させる。翌日、被験物質、試験組成物および対照をＢ１６アッセイ培地中に希釈する。一晩経た培地を吸引し、２００ｕｌの被験物質および対照を加える。３７℃および１０％ＣＯ２で７２時間、細胞をインキュベートする。７２時間のインキュベーション後に、５４０ｎｍで吸光度を読み取る。培地を除去し、１ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴを含有する１００ｕｌの平板培地と交換し、３７℃および１０％ＣＯ２で２時間インキュベートする。ＭＴＴ培地を除去し、２００ｕｌの９５％エタノール／５％イソプロパノールと交換し、１５分間振盪する。次いで、５７０ｎｍでＭＴＴ吸光度を読み取る。
結果
組成物＃１〜５を含む本発明の化合物および組成物はメラニン形成を阻害すると予測される。本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの成分化合物と比べて、より強力なメラニン形成阻害活性を示すと予測される。同様に、ある種の組成物は、例えば、少なくとも１つの成分化合物と比べて、より有効性が低いメラニン形成阻害活性を実証すると予測される。
実施例１４
インビトロでの効力
本発明の化合物および組成物は、メラニン形成細胞のアポトーシスを誘導し、メラニン形成細胞の活性、メラニン産生、メラニン濃度、メラノソーム生合成および／またはメラノソーム輸送を調節すると予測される。本発明の化合物および組成物のいくつかは、より低い強度でこれらの生物学的過程に影響を与えることも想定される。このような化合物および組成物は、より強力な種と比べて、より好ましい毒性プロファイルを有し得る。
実施例１５
インビボでの効力
本発明の化合物および組成物は、皮膚をブライトニングすることおよび様々な障害によって引き起こされる色素沈着過剰／色素沈着低下を改善することなど、皮膚色素沈着を調節することが予測される。本発明の化合物および組成物は、例えば、半減期および吸収に関して好ましい薬物動態プロファイルを示すことがさらに予測される。ある種の化合物はより長い半減期を示すのに対して、その他の化合物はより短い半減期を示すであろう。同様に、ある種の化合物は異なる吸収プロファイルを示し、いくつかの化合物は完全に吸収されるのにより長くかかり、その他の化合物は完全に吸収されるのにかかる時間がより短い。
実施例１６
マラセジンおよびインジルビンの化学的類縁体の合成
ＡＢ１７５９０の合成
図６Ａに示されているように、テトラヒドロフラン（２５０ｍＬ）中の化合物１ａ（２５．０ｇ、０．３５７ｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、０℃でエチニルマグネシウムブロミド（ＴＨＦ中０．５Ｍ、１．０７Ｌ、０．５３５ｍｏｌ、１．５当量）を加え、反応混合物を室温に加温し、２時間撹拌した。次いで、塩化アンモニウムの飽和水溶液でこの混合物をクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中０〜１０％酢酸エチル）によって残留物を精製して、化合物１ｂ（９．５ｇ、２７％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝２０：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物１ａ）＝０．３；Ｒｆ（化合物１ｂ）＝０．７。
テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中の化合物１ｂ（９．５ｇ、９８．９６ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物に、窒素雰囲気下において、０℃で、ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）中の６０％水素化ナトリウム（４．７ｇ、０．１１９ｍｏｌ、１．２当量）の溶液を加えた。３０分後に、硫酸ジメチル（２２．４ｇ、０．１７８ｍｏｌ、１．８当量）を０℃で加えた。添加後、反応混合物を室温に加温し、室温で３０分間撹拌し、次いで、酢酸（１ｍｌ）をゆっくり加えた。反応混合物から生成物を直接蒸留した。このようにして得られた化合物１ｃ（１０．０ｇ、９１％収率）が存在した。
トリエチルアミン（８０ｍＬ）中の、化合物１（８．０ｇ、２４．０２ｍｍｏｌ、１．０当量）および化合物１ｃ（２．９ｇ、２６．４３ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液に、室温で、窒素雰囲気下において、ヨウ化第一銅（４５６ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ、０．１当量）およびＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（３３７ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ、０．０２当量）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中０〜１０％酢酸エチル）によって残留物を精製して、化合物２（７．０ｇ、９２％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝１０：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物１）＝０．８；Ｒｆ（化合物２）＝０．６。
オーブンで乾燥されたフラスコに、ジオキサン（６５０ｍＬ）中の、二塩化白金（６９４ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ、０．１当量）、炭酸ナトリウム（３．３ｇ、３０．９５ｍｍｏｌ、１．５当量）、トリス（ペンタフルオロフェニル）ホスフィン（２．２ｇ、４．１３ｍｍｏｌ、０．２当量）、６−メチルインドール（４．８ｇ、４１．２７ｍｍｏｌ、２．０当量）および化合物２（６．５ｇ、２０．６３ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を加えた。フラスコを窒素で脱気し、密封し、１００℃に１６時間加熱した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。溶媒を減圧下で濃縮した。残留物を酢酸エチルで希釈し、水、飽和塩水で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中０〜１０％酢酸エチル）によって残留物を精製して、化合物３（３．０ｇ、３６％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝１０：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物２）＝０．６；Ｒｆ（化合物３）＝０．２。
テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中の化合物３（３．０ｇ、７．５０ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、０℃で、ナトリウムメタノラート（ＭｅＯＨ中５Ｍ、６．０ｍＬ、２９．９８ｍｍｏｌ、４．０当量）を加えた。反応混合物を室温まで加温し、２時間撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。反応混合物を減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中０〜１０％酢酸エチル）によって残留物を精製して、化合物４（１．５ｇ、６６％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝５：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物３）＝０．７；Ｒｆ（化合物４）＝０．４。
０℃でアルゴン下にある乾燥された５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を加えた。次いで、１０分にわたって、内部温度を５℃未満に維持しながら、オキシ塩化リン（１．２ｇ、７．６０ｍｍｏｌ、１．２当量）をゆっくり加えた。０℃で３０分間撹拌した後、１０分にわたって、内部温度を５℃未満に維持しながらジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中の化合物４（１．９ｇ、６．３３ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液をゆっくり添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。反応が完了した後（ヘキサン中の２０％酢酸エチルを使用するＴＬＣによってモニターされる）、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）中に注ぎ、１時間撹拌した。得られた混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水、飽和塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒をろ過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中１０〜５０％酢酸エチル）によって残留物を精製して、化合物５（１．８ｇ、８９％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝１：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物４）＝０．８；Ｒｆ（化合物５）＝０．５。
テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の化合物５（１．８ｇ、５．４９ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、０℃で、二炭酸ジｔｅｒｔ−ブチル（３．０ｇ、１３．７２ｍｍｏｌ、２．５当量）および４−ジメチルアミノピリジン（１．４ｇ、１１．２５ｍｏｌ、２．０５当量）を加えた。反応混合物を室温まで加温し、３時間撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。減圧下で反応混合物を濃縮し、残留物を酢酸エチルで希釈し、１Ｎ塩酸、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３００ｍＬ）および塩水（３００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中０〜１０％酢酸エチル）によって残留物を精製して、化合物６（２．４ｇ、８２％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝１０：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物５）＝０．１；Ｒｆ（化合物６）＝０．５。
ｔｅｒｔ−ブタノール（６０ｍＬ）中の化合物６（２．４ｇ、４．５５ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、２−メチル−２−ブテン（３０ｍＬ）を加えた後、０℃で、亜塩素酸ナトリウム（８．２ｇ、９０．９１ｍｍｏｌ、２０．０当量）、リン酸ナトリウム一塩基性（１４．２ｇ、９０．９１ｍｍｏｌ、２０．０当量）および水（６０ｍＬ）を添加した。混合物をゆっくり室温まで加温し、室温で１５時間撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、分離した。有機層を水（８０ｍＬ）、塩水（８０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して未精製の化合物７（２．５ｇ、９９％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝２：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物６）＝０．７；Ｒｆ（化合物７）＝０．３。
ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中の化合物７（２．５ｇ、４．６０ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、０℃で、炭酸カリウム（９５２ｍｇ、６．８９ｍｍｏｌ、１．５当量）およびヨウ化メチル（９７８ｍｇ、６．８９ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。反応混合物を室温まで加温し、２時間撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬ）および塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中５〜１７％酢酸エチル）によって残留物を精製して、化合物８（２．３ｇ、８９％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝５：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物７）＝０．１；Ｒｆ（化合物８）＝０．６。
塩酸（ＥＡ中３Ｍ、３０ｍＬ）中の化合物８（１．３ｇ、２．３３ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を、室温で１６時間撹拌した。反応をＴＬＣによってモニターした。次いで、混合物を減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中１０〜２５％酢酸エチル）によって残留物を精製して、黄色の固体として化合物ＡＢ１７５９０（５０２ｍｇ、６１％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝３：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物８）＝０．８；Ｒｆ（化合物ＡＢ１７５９０）＝０．５；ＬＣ−ＭＳ：３５９（Ｍ＋１）＋；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．１２ （ｄ， Ｊ ＝ １９．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．９４ （ｓ， １Ｈ）， ７．４２ （ｓ， １Ｈ）， ７．３５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １５．７， ８．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．０４ （ｄ， Ｊ ＝ ９．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４５ （ｓ， ３Ｈ）， １．４２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ０．７８ − ０．６８ （ｍ， １Ｈ）， ０．６２ （ｄ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ０．５４ − ０．４１ （ｍ， ２Ｈ）．
ＡＢ１７６５３の合成
図６Ｂに示されているように、メタノール（１０ｍＬ）中の、化合物１（７２１ｍｇ、３．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物１ａ（５６０ｍｇ、３．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（８６６ｍｇ、８．１７ｍｍｏｌ、２．５５当量）の混合物を、室温で３時間、窒素雰囲気下において撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。反応の完了後、混合物をろ過し、メタノールおよび水でろ過ケーキを洗浄して、赤色の固体として化合物ＡＢ１７６５３（９７９ｍｇ、８９％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ／ＥＡ＝３／１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物１）＝０．６；Ｒｆ（化合物ＡＢ１７６５３）＝０．４；ＬＣ−ＭＳ：３３８．９５（Ｍ−１）−；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ１１．０１ （ｄ， Ｊ ＝ ２１．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．６４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６２ （ｄ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．００ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．８， ４．６ Ｈｚ， ２Ｈ）．
ＡＢ１７６５４の合成
図６Ｂに示されているように、ピリジン（３０ｍＬ）中の、化合物ＡＢ１７６５３（９７９ｍｇ、２．８８ｍｍｏｌ、１．０当量）およびヒドロキシルアミン塩酸塩（５２０ｍｇ、７．４９ｍｍｏｌ、２．６当量）の混合物を、１２０℃で２時間、窒素雰囲気下において撹拌した。反応混合物の進行をＬＣＭＳによってモニターした。反応の完了後、減圧下で混合物を濃縮し、固体が現れるまで、１Ｎ ＨＣｌを加えた。混合物をろ過し、ろ過ケーキを１Ｎ ＮａＯＨ中に溶解した。次いでｐＨ＝５に調整するために、３Ｎ ＨＣｌを加え、ろ過した。ろ過ケーキを１Ｎ ＨＣｌで洗浄して、赤色の固体として化合物ＡＢ１７６５４（５００ｍｇ、４８％）を得た。ＬＣ−ＭＳ：３５７．９５（Ｍ＋１）＋；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ １３．５９ （ｓ， １Ｈ）， １１．７１ （ｓ， １Ｈ）， １０．８２ （ｓ， １Ｈ）， ８．５３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４２ − ７．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１１ − ６．９６ （ｍ， ３Ｈ）．
ＡＢ１７６５５の合成
図６Ｂに示されているように、メタノール（１０ｍＬ）中の、化合物２（６３７ｍｇ、３．８６ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物１ａ（６７６ｍｇ、３．８６ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（１０４４ｍｇ、９．８４ｍｍｏｌ、２．５５当量）の混合物を、室温で３時間、窒素雰囲気下において撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。反応の完了後、混合物をろ過し、メタノールおよび水でろ過ケーキを洗浄して、赤色の固体として化合物ＡＢ１７６５５（１０２７ｍｇ、９５％）を得た。ＬＣ−ＭＳ：２８１．０５（Ｍ＋１）＋；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ１１．０６ （ｓ， １Ｈ）， １０．８６ （ｓ， １Ｈ）， ８．５４ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．５， ２．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６７ − ７．５３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４１ − ７．３８ （ｍ， １Ｈ）， ７．０９ − ６．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ６．８５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．５， ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）．
ＡＢ１７６５６の合成
図６Ｂに示されているように、ピリジン（３０ｍＬ）中の、化合物ＡＢ１７６５５（１０２７ｍｇ、３．６７ｍｍｏｌ、１．０当量）およびヒドロキシルアミン塩酸塩（６６３ｍｇ、９．５４ｍｍｏｌ、２．６当量）の混合物を、１１０℃で２時間、窒素雰囲気下において撹拌した。反応混合物の進行をＬＣＭＳによってモニターした。反応の完了後、減圧下で混合物を濃縮し、固体が現れるまで、１Ｎ ＨＣｌを加えた。混合物をろ過し、ろ過ケーキを１Ｎ ＮａＯＨ中に溶解した。次いでｐＨ＝５に調整するために、３Ｎ ＨＣｌを加え、ろ過した。ろ過ケーキを１Ｎ ＨＣｌで洗浄して、赤色の固体として化合物ＡＢ１７６５６（５００ｍｇ、４８％）を得た。ＬＣ−ＭＳ：２９６．００（Ｍ＋１）＋；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ１３．６０ （ｓ， １Ｈ）， １１．７７ （ｓ， １Ｈ）， １０．６９ （ｓ， １Ｈ）， ８．４３ （ｓ， １Ｈ）， ８．２０ （ｄ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３９ （ｄ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．０２ （ｓ， １Ｈ）， ６．９１ （ｓ， １Ｈ）， ６．８３ （ｄ， Ｊ ＝ ４．９ Ｈｚ， １Ｈ）．
ＡＢ１７６５７の合成
図６Ｂに示されているように、メタノール（１０ｍＬ）中の、化合物３（３６２ｍｇ、２．４６ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物１ａ（４３１ｍｇ、２．４６ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（６６６ｍｇ、６．２８ｍｍｏｌ、２．５５当量）の混合物を、室温で３時間、窒素雰囲気下において撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。反応の完了後、混合物をろ過し、メタノールおよび水でろ過ケーキを洗浄して、化合物４（６０６ｍｇ、９３％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ／ＥＡ＝１／１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物３）＝０．７；Ｒｆ（化合物４）＝０．５。
ピリジン（２０ｍＬ）中の、化合物４（６０６ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびヒドロキシルアミン塩酸塩（４１８ｍｇ、６．０１ｍｍｏｌ、２．６当量）の混合物を、１２０℃で２時間、窒素雰囲気下において撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。反応の完了後、減圧下で混合物を濃縮し、固体が現れるまで、１Ｎ ＨＣｌを加えた。混合物をろ過し、ろ過ケーキを１Ｎ ＮａＯＨ中に溶解した。次いでｐＨ＝５に調整するために、３Ｎ ＨＣｌを加え、ろ過した。ろ過ケーキを１Ｎ ＨＣｌで洗浄して、茶色の固体として化合物ＡＢ１７６５７（５００ｍｇ、７８％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ／ＥＡ＝１／１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物４）＝０．５；Ｒｆ（化合物ＡＢ１７６５７）＝０．４；ＬＣ−ＭＳ：２７８．１０（Ｍ＋１）＋；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ１３．６０ （ｓ， １Ｈ）， １１．７７ （ｓ， １Ｈ）， １０．６９ （ｓ， １Ｈ）， ８．４３ （ｓ， １Ｈ）， ８．２０ （ｄ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３９ （ｄ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．０２ （ｓ， １Ｈ）， ６．９１ （ｓ， １Ｈ）， ６．８３ （ｄ， Ｊ ＝ ４．９ Ｈｚ， １Ｈ）．
ＡＢ１７６５８の合成
図６Ｂに示されているように、アセトニトリル（１０ｍＬ）中の、化合物５ａ（３３７ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物５ｂ（５５４ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ、１．０当量）および水酸化カリウム（１１１４ｍｇ、３．４６ｍｍｏｌ、２．０当量）の混合物を、３５℃で１．５時間、窒素雰囲気下において撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。反応の完了後、減圧下で混合物を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーによって残留物を精製して化合物５ｃ（４３６ｍｇ、９９％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ／ＥＡ＝１／１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物５ａ）＝０．８；Ｒｆ（化合物５ｃ）＝０．５。
メタノール（１０ｍＬ）中の、化合物５（３３０ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物５ｃ（４３６ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（４６５ｍｇ、４．３８ｍｍｏｌ、２．５５当量）の混合物を、室温で３時間、窒素雰囲気下において撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。反応の完了後、混合物をろ過し、メタノールおよび水でろ過ケーキを洗浄して、化合物６（６１７ｍｇ、９３％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ／ＥＡ＝１／１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物５）＝０．５；Ｒｆ（化合物６）＝０．４。
ピリジン（２０ｍＬ）中の、化合物６（６１７ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ、１．０当量）およびヒドロキシルアミン塩酸塩（２９０ｍｇ、４．１７ｍｍｏｌ、２．６当量）の混合物を、１１０℃で２時間、窒素雰囲気下において撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニターした。反応の完了後、減圧下で混合物を濃縮し、固体が現れるまで、１Ｎ ＨＣｌを加えた。混合物をろ過し、ろ過ケーキを１Ｎ ＮａＯＨ中に溶解した。次いでｐＨ＝５に調整するために、３Ｎ ＨＣｌを加え、ろ過した。ろ過ケーキを１Ｎ ＨＣｌで洗浄して、赤色の固体として化合物ＡＢ１７６５８（５００ｍｇ、７８％）を得た。ＴＬＣ：ＰＥ／ＥＡ＝１／１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物６）＝０．４；Ｒｆ（化合物ＡＢ１７６５８）＝０．３；ＬＣ−ＭＳ：４０２．９５（Ｍ＋１）＋；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ｄ６−ＤＭＳＯ） δ１１．８６ （ｓ， １Ｈ）， １１．３９ （ｓ， １Ｈ）， ９．４０ （ｄ， Ｊ ＝ ２．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．３３ （ｄ， Ｊ ＝ １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．６， ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）．
実施例１７
マラセジン、他のマラセチア由来化合物およびこれらの化学的類縁体の光保護特性のインビボ査定
マラセジン１％製剤
本研究において使用されるマラセジン１％製剤は、以下の成分を含有した：水（アクア）−６５．９３９％；ジメチルイソソルビド−２０．０００％；オリーブ油グリセレス−８エステル−３．０００％；グリセリン−２．９９１％；ココナツアルカン−２．７００％、アクリル酸ヒドロキシエチル／アクリロイルジメチルタウリン酸ナトリウムコポリマー−１．７００％；マラセジン−１．０００％；ペンチレングリコール−１．０００％；フェノキシエタノール−０．６４０％；Ｃｏｃｏ−カプリレート／カプレート−０．３００％；カプリリルグリコール−０．２００％；クロルフェネシン−０．１６０％；イソステアリン酸ソルビタン−０．１４０％；トコフェロール−０．１００％；ポリソルベート６０−０．０８０％；およびＥＤＴＡ二ナトリウム−０．０５０％。
実験のデザイン
この概念実証研究には、３９歳のスキンタイプＩＶの女性が含まれた。
実験の第１日目に、標的化される広域Ｄｕａｌｉｇｈｔ ＵＶＢ装置を用いて、最小紅斑投薬量（「ＭＥＤ」）を決定するために、被験体を評価した。試験被験体の左腰部（１．５ｃｍ×１．５ｃｍ）上に、６つの矩形のテンプレートを配置した。図７参照。
被験体のスキンタイプに対するＭＥＤ光試験線量は、ｍＪ／ｃｍ２単位で、図８に列記されている。照射の２４時間後に、被験体はＭＥＤ査定のために戻った。図１２に示されているように、被験体のＭＥＤは１２０ｍＪであった。
その後、被験体は、１日２回、７日間、右背中の上部試験矩形中に、マラセジン１％を塗布した。第二の右下方矩形は１日２回、４日目から７日目まで処置され、第三の中央矩形は７日目に１回塗布した。製品ビヒクルは、左の背中に、７日間、１日２回塗布した。図１３参照。被験体は、７日目での照射のために、研究センターに戻った。図９参照。各試験部位には、１２０ｍＪのＵＶＢ曝露を照射した。光毒性／光保護の査定のために、被験体は２４時間以内に戻った。図１４参照。
被験体は、合計１４日間マラセジン１％を受けて、実験を継続した。図１５〜１６は、以下の処置に曝露された被験体の皮膚の領域を示す：それぞれ、部位１４には、１日２回、１４日間、マラセジン１％を塗布した；部位１０には、１日２回、１１日間、マラセジン１％を塗布した；部位８には、１日２回、８日間、マラセジン１％を塗布した；部位３には、１日２回、３日間、マラセジン１％を塗布した；部位１には、マラセジン１％を１回塗布した；ビヒクル部位には、１日２回、７および９日間、ビヒクルを塗布した。
結果
図１４に示されているように、ＵＶＢ曝露の２４時間後に、被験体は、ビヒクル試験部位に１プラスから２プラスの紅斑を示した。紅斑の尺度については、図１１参照。これに対して、マラセジン１％の７日間処置された部位においては、より少ない紅斑（軽度）が認められた。３日間処置された部位の評価は最小限の紅斑を示し、そして１日適用部位については紅斑の不存在を示した。Ｍｅｘａｍｅｔｅｒ ＭＸ１６を用いて、各部位から比色分析測定値が取得され、臨床観察を裏付けた。ビヒクル部位において、最大の紅斑読取値が観察され、マラセジンで７日間処置された部位がこれに続いた。最低の値は、それぞれ、マラセジン３日および１日の部位で観察された。図９参照。
被験体は実験を継続し、１４日目に反復ＵＶＢ照射のために戻り、１５日目に解釈を行った。図１５参照。１５日目の臨床的評価は、７日目に関してビヒクル部位で中度の紅斑を明らかにし、９日において著しくより低い紅斑を明らかにした。図１６参照。１４日、１０日および８日部位を含め、マラセジン１％処置された部位には、より低い紅斑（軽度）が認められた。１日および３日に関して、マラセジン１％部位において、最小限の紅斑が認められた。紅斑およびメラニン量指数を測定するために、比色分析読み取り値を各部位から取得した。結果は、マラセジン１％処置された部位におけるより低い紅斑という臨床観察を裏付けた。図１０参照。
９日にビヒクル部位ならびに１日および３日に関してマラセジン１％処置部位から生検を採取した。メラニン形成細胞の定量およびアフィメトリクス研究のために、ヘマトキシリンおよびエオシン、フォンタナ・マッソン染色およびＭＡＲＴ Ｉに関して検体を分析した。
診断：（Ａ）皮膚−１日処置（マラセジン１％）：バスケットウィーブ角層、正常な外観のメラニン形成細胞（Ｍａｒｔ−１による免疫ペルオキシダーゼ染色によって確認）および表皮メラニン（フォンタナ・マッソンによる免疫ペルオキシダーゼ染色によって確認）。
診断：（Ｂ）皮膚−３日処置（マラセジン１％）バスケットウィーブ角層、ＣおよびＤと比較したときに、樹状突起がより少ないメラニン形成細胞（ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａによる免疫ペルオキシダーゼ染色によって確認）、不連続病変（フォンタナ・マッソンによる免疫ペルオキシダーゼ染色によって確認）として、表皮メラニンのわずかな減少を伴う。
診断：（Ｃ）皮膚−ビヒクル：正常な外観の表皮メラニン形成細胞（Ｍａｒｔ−１による免疫ペルオキシダーゼ染色によって確認）および表皮メラニン（フォンタナ・マッソンによる免疫ペルオキシダーゼ染色によって確認）。
診断：（Ｄ）皮膚−正常：正常な外観の表皮メラニン形成細胞（Ｍａｒｔ−１による免疫ペルオキシダーゼ染色によって確認）および表皮メラニン（フォンタナ・マッソンによる免疫ペルオキシダーゼ染色によって確認）。
結論
この概念実証研究の結果は、マラセジンのＵＶ保護特性を実証する。
さらなる患者が参加するさらなる研究は、マラセジンの等価なまたはより効果的なＵＶ保護特性を実証するであろうと想定される。さらなる研究は、マラセジン誘導性光保護と関連する分子シグナル伝達経路を明らかにすることも想定される。
文献
Figure 2021527710
Figure 2021527710
Figure 2021527710
本願中で引用される全ての文献は、完全に本明細書中に記述されているのと同様に、参照により、本明細書に組み込まれる。
本発明の例示的な実施形態が本明細書に記載されているが、本発明は記載されている実施形態に限定されないこと、および本発明の範囲または精神から逸脱することなく、当業者によって、様々な他の変更または改変が施され得ることが理解されるべきである。

Claims (12)

  1. 表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くを含む、組成物。
  2. 前記組成物が、以下の式：
    Figure 2021527710
     の構造を有する第１の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩；および
    以下の式：
    Figure 2021527710
     の構造を有する第２の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 被験体における皮膚をブライトニングするための方法であって、前記被験体を、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む、方法。
  4. 前記被験体を、以下の式：
    Figure 2021527710
     の構造を有する第１の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩；および
    以下の式：
    Figure 2021527710
     の構造を有する第２の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩と接触させる、請求項３に記載の方法。
  5. 被験体におけるメラニン形成細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、前記被験体を、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む、方法。
  6. 前記被験体を、以下の式：
    Figure 2021527710
     の構造を有する第１の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩；および
    以下の式：
    Figure 2021527710
     の構造を有する第２の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩と接触させる、請求項５に記載の方法。
  7. 被験体におけるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性を調節するための方法であって、前記被験体を、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む、方法。
  8. 前記被験体を、以下の式：
    Figure 2021527710
     の構造を有する第１の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩；および
    以下の式：
    Figure 2021527710
     の構造を有する第２の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩と接触させる、請求項７に記載の方法。
  9. 被験体におけるメラニン形成を調節するための方法であって、前記被験体を、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む、方法。
  10. 前記被験体を、以下の式：
    Figure 2021527710
     の構造を有する第１の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩；および
    以下の式：
    Figure 2021527710
     の構造を有する第２の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩と接触させる、請求項９に記載の方法。
  11. 被験体におけるメラニン濃度を調節するための方法であって、前記被験体を、表１もしくは図３に列記されている化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩のうちの１つまたはそれより多くと接触させることを含む、方法。
  12. 前記被験体を、以下の式：
    Figure 2021527710
     の構造を有する第１の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩；および
    以下の式：
    Figure 2021527710
     の構造を有する第２の化合物あるいはその化学的類縁体、結晶形、水和物または薬学的にもしくは美容的に許容され得る塩と接触させる、請求項１１に記載の方法。
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