JP2021526016A - 改良された食品を得るためのペプチジルアルギニンデイミナーゼの使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、タンパク質を含む食品の甘味、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、並びに／又は消化性及び／若しくはプロテアーゼ阻害活性を修飾するためのプロセスについて記載する。【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明
［分野］
本発明は、食品の分野に関する。
［背景］
人口が増えつつある世界において、タンパク質の需要が増加している。この増えつつあるタンパク質の需要に応えるために、タンパク質のより幅広い用途に注目する必要がある。加えて、植物が、動物よりも、タンパク質の持続可能な供給源になると考えられるので、動物タンパク質の代替物として植物タンパク質を見つけることが望まれている。食品における植物タンパク質の使用は、消化性、風味、及び栄養価が不十分なこともあり、今でも限られている。
それほど精製されていない穀類及び豆類を含有している飲食物中のタンパク質の不十分な消化性は、存在する又は加工の間に形成される、あまり消化のよくないタンパク質画分、高レベルの不溶性繊維、及び／又は高濃度の抗栄養因子の存在による。食物性の抗栄養因子（ＡＮＦ）は、タンパク質消化性、アミノ酸の生物学的利用能、及び食品のタンパク質の質に悪影響を与えることが知られている（Ｇ．Ｓａｒｗａｒ Ｇｉｌａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（２０１２），１０８，Ｓ３１５−Ｓ３３２））。
ダイズ及び他の豆類中の高レベルのトリプシン阻害剤の存在は、ネズミ及びブタにおいてタンパク質消化性の著しい低下（５０％以下）を引き起こすことが示された（Ｇ．Ｓａｒｗａｒ Ｇｉｌａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（２０１２），１０８，Ｓ３１５−Ｓ３３２）。それらの阻害部位の残基に基づいて、これらの阻害剤は、リシンタイプ又はアルギニンタイプの阻害剤のどちらかとされる。ダイズは、トリプシン阻害剤の主な供給源であり、脱脂大豆中のタンパク質のおよそ６％を占める。２つの主なタイプのトリプシン阻害剤がある−反応部位にアルギニンを有するＫｕｎｉｔｚダイズトリプシン阻害剤（ＫＳＴＩ）及び阻害部位にリシンを有するＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤（ＢＢＩ）。
ダイズの湿熱処理（２０分間１００℃）は、阻害剤の一部を非活性化するが、元のトリプシン活性が著しく残る。完全に阻害活性を破壊するために必要とされる長時間の加熱は、ダイズ製品のタンパク質の消化性及び質を著しく低下させるであろう（Ｇ．Ｓａｒｗａｒ Ｇｉｌａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（２０１２），１０８，Ｓ３１５−Ｓ３３２）。いくつかの市販の大豆飲料は、全阻害活性の約７０％以下を含有することが報告された。同様に、大豆ベースの乳児用調合乳は、２８％を含有することがわかった。未加工のダイズ中のトリプシン阻害剤は、感受性の動物において成長阻害及び膵臓拡張を引き起こす。
植物ベースのタンパク質飲料を作製する際の別の重要な要素は、それらの風味及び口当たりである。植物性タンパク質は、少ないタンパク質含有量でさえ、苦味などのように風味が損なわれ、口当たりが増加することが欠点である。さらに、多くの植物タンパク質飲料は、含有するタンパク質の量が非常に少なく、植物タンパク質飲料をそれほど栄養価もなく、それほどおいしくもない食品にしている。
国際公開第２００８／０００７１４号パンフレットは、タンパク質アルギニンデイミナーゼ及びシトルリンの量の増加が伴う、食料品の調製におけるこの酵素の使用を開示する。
国際公開第２０１７／００９１００号パンフレットは、植物タンパク質、たとえばエンドウマメ、大豆、及び米タンパク質の溶解性を改良するためのプロセスを開示し、植物タンパク質は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼと共にインキュベートされる。エンドウマメタンパク質などのような植物タンパク質の気泡容積は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼとのインキュベーションの後に低下した。
（植物）タンパク質を含む食品の特性を改良する必要が当技術分野においてある。
図１は、アッセイ中のトリプシン活性に直接関係する、ある時間内での吸光度の変化（実施例１において記載されるＢＡＥＥ連続アッセイ）を示す図である。サンプル「ｍｉｎ ＰＡＤ」は、阻害タンパク質の存在下におけるトリプシン活性を表すのに対して、「ｐｌｕｓ ＰＡＤ」は、ＰＡＤ酵素により前処理した阻害タンパク質の存在下において測定したトリプシン活性を表す。矢印は、酵素ＰＡＤの作用によるトリプシン阻害活性（ＴＩＡ）の低下の度合いを示す。 図２は、酵素処理なしの（白丸）及びＰＡＤ酵素処理ありの（黒丸）ＳＹＭＰＨＹＤ消化モデルにおいてＲＰＩからある時間内に放出されたＮＨ２を示す図である。矢印は、追加の時点を示し、ぞれぞれ、ペプシンは５分、パンクレアチンは８０分とする。 図３は、実施例４において記載されるＰＡＤ酵素処理あり及びなしの豆乳の官能パネル評価を示す図である。黒色のバーは、大豆ドリンクの官能的側面を示し、模様入りのバーは、ＰＡＤ酵素により処理した大豆ドリンクの官能的側面を示す。特質「ｐｏｗｄｅｒｙ−ｃｈａｌｋ−ｍｆ」は、粉状／粉っぽい口当たりを示し、「ｆｕｌｌｎｅｓｓ−ｍｆ」は、こくについての口当たりを示し、「ｔｈｉｃｋ−ｍｆ」は、口の中でのとろみを示す。 図４は、ＰＡＤ処理あり及びなしのナタネタンパク質分離物の２％溶液の官能的特質を示す図である。四角：ＰＡＤにより処理していないナタネタンパク質分離物の溶液の官能的特質；菱形：１Ｌ当たり２Ｕ ＰＡＤにより処理したナタネタンパク質分離物の溶液の官能的特質；三角：１Ｌ当たり２０ＵのＰＡＤにより処理したナタネタンパク質分離物の溶液の官能的特質；丸：１Ｌ当たり６０ＵのＰＡＤにより処理したナタネタンパク質分離物の溶液の官能的特質。官能的特質は、渋味についての口当たり（Ｉ）、味の強度（ＩＩ）、甘い味（ＩＩＩ）、苦い味（ＩＶ）、カンゾウの味（Ｖ）、苦い後味（ＶＩ）、後味の長さ（ＶＩＩ）、及び渋味のある後味（ＶＩＩＩ）とする。 図５は、ＰＡＤ酵素と共にインキュベートした様々な植物性ドリンクの等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルを示す図である：レーン１−エンドウマメドリンク（Ｂｏｌｔｈｏｕｓｅ Ｆａｒｍ ｕｎｓｗｅｅｔｅｎｅｄ）；レーン２−ＰＡＤと共にインキュベートしたエンドウマメドリンク（Ｂｏｌｔｈｏｕｓｅ Ｆａｒｍ ｕｎｓｗｅｅｔｅｎｅｄ）；レーン３−大豆ドリンク（Ｐｒｏｖａｍｅｌ ｕｎｓｗｅｅｔｅｎｅｄ）；レーン４−ＰＡＤと共にインキュベートした大豆ドリンク（Ｐｒｏｖａｍｅｌ ｕｎｓｗｅｅｔｅｎｅｄ）；レーン５−エンドウマメドリンク（Ｒｉｐｐｌｅ ｕｎｓｗｅｅｔｅｎｅｄ）；レーン６−ＰＡＤと共にインキュベートしたエンドウマメドリンク（Ｒｉｐｐｌｅ ｕｎｓｗｅｅｔｅｎｅｄ）、及びレーン７ ｐｌマーカー。 図６は、多様なｐＨ及び温度でのＰＡＤ酵素の相対的安定性を示す図である。酵素活性は、活性測定前のｐＨ７及び４℃でのインキュベーションについて１００％に設定した。三角形は３７℃での酵素安定性；円形は実施例７において記載されるように４℃での酵素安定性を示す。
［配列表］
配列番号１ フザリウム・グラミネラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）由来のペプチジルアルギニンデイミナーゼ
［概要］
本発明は、タンパク質を含む食品の甘味、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、並びに／又は消化性及び／若しくはプロテアーゼ阻害活性を修飾するためのプロセスに関する。
本発明はまた、甘味、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、並びに／又は消化性及び／若しくはプロテアーゼ阻害活性を修飾するためのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）の使用にも関する。
本発明はまた、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）を含む栄養補助食品にも関する。
［詳細な説明］
植物性タンパク質の不十分な消化性は、トリプシン阻害剤などのような、高レベルの抗栄養因子（ＡＮＦ）によるものもある。植物タンパク質から調製されるドリンクの口当たりは、通常、許容されないものと評される。本発明までは、植物タンパク質ドリンクのこれらの短所を克服するのに利用可能な許容される溶液はなかった。これは、概して、タンパク質を含む食品に同様に当てはまる。
ＰＡＤは、タンパク質中のアルギニン残基をシトルリンに脱イミノ化する（ｄｅｉｍｉｎａｔｅ）。アルギニンが反応部位を占めるトリプシン阻害剤については、ＰＡＤの作用は、阻害剤をトリプシンに対して不活性にするであろう。キモトリプシンプロテアーゼ阻害剤及びα−アミラーゼ阻害剤も、トリプシン阻害剤と同様に、食品の消化性を下げる一因となる。これらの阻害剤のいくつかは、阻害機能にとって重要な、決定的なアルギニン残基を持つことが示された（Ｇｉｄｅｏｎ Ｍ．Ｐｏｌｙａ，Ａｔｔａ−ｕｒ−Ｒａｈｍａｎ Ｅｄ．．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ ２９，ｐ５６７−６４１）。
すべてのプロテアーゼ阻害剤のうちの約１０％は、反応性のＰ１部位にアルギニン（Ｒ）残基を含有する（プロテアーゼ阻害剤についてＭＥＲＯＰＳデータベースにおいて見つけられる３３００配列のうち３０９配列）。Ｐ１部位に「Ｒ」を有するトリプシン阻害剤は、マメ科植物、穀類、種実類（大豆、ナタネ、ナッツ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ジャガイモ、米、カラスムギ、トマトなど）などのような、あらゆる分類の植物性タンパク質中に見つけることができるが、すべての阻害活性が、様々な種内に同様に分布していることが見つけられるというわけではない。たとえば、ジャガイモ中のタンパク質の約４０％は、プロテアーゼ阻害剤であり、多くの様々なクラスのプロテアーゼ阻害剤が存在し（１０を超える様々なプロテアーゼ阻害剤が同定されており）、これらの阻害剤の分布はジャガイモの品種に依存する（Ｐｏｕｖｒｅａｕ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，２００１，ｖｏｌ４９，ｐ２８６４−２８７４）。
Ｋｕｎｉｔｓダイズトリプシン阻害剤の非活性化は、哺乳類ＰＡＤ酵素を使用して以前に示された（Ｈ．Ｔａｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２６０，Ｎｏ．１４，ｐａｇｅｓ８３７８−８３８３）。しかしながら、大豆粉などのような複合タンパク質マトリックス中のＴＩＡ（トリプシン阻害剤活性）の非活性化は、示されなかった。食料品の有益性のために、複合食品マトリックスにおけるＰＡＤ活性は不可欠である。加えて、哺乳類ＰＡＤは、アルギニン含有タンパク原料に対する選択性が狭く、哺乳類ＰＡＤ２酵素を使用して、アルギニン残基を含有するすべてのタンパク質を修飾することができるわけではない。トリプシン阻害反応部位の１つにアルギニン残基を含有するニワトリ卵白オボムコイドは、哺乳類ＰＡＤ酵素によって修飾することができなかったことが示された。対照的に、発明者らは、本明細書において、微生物のＰＡＤが、ニワトリ卵白オボムコイドにおけるトリプシン阻害活性を減少させることができ、この酵素を、プロテアーゼ阻害活性を含有する種々様々なタンパク質食品において使用するのに適したものにすることを示す。さらに、以前の研究は、ピーナッツ中のトリプシン−キモトリプシン阻害剤、Ｂｉｌｌが、哺乳類ＰＡＤ酵素によって修飾することができることを示したが、プロテアーゼ阻害活性に関与するすべてのアルギニン残基を修飾することができるわけではない（Ｔｏｍｏｆｕｍｉ Ｋｕｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８７，ｖｏｌ１０１，ｐ１３６１−１３６７）。この研究は、しかしながら、ピーナッツ由来の精製ピーナッツＢｉｌｌプロテアーゼ阻害剤に対する酵素の効果に注目したものである。本発明では、微生物のＰＡＤが、Ｂｉｌｌトリプシン阻害活性だけではなく、まるのままのピーナッツのトリプシン阻害活性を低下させることができることが示される。本発明における微生物酵素ＰＡＤの効果は、加工されたピーナッツバターなどのような、より複雑な食品においても見られる。
驚いたことに、本発明の発明者らは、タンパク質を含む食品の官能及び／又は口当たり及び／又は消化性及び／又はプロテアーゼ阻害活性といった様々な側面を、ＰＡＤを使用して改良することができることを示す。
本発明の態様の１つにおいて、本発明は、タンパク質を含む食品の甘味、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、並びに／又は消化性及び／若しくはプロテアーゼ阻害活性を修飾するためのプロセスであって、
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）とタンパク質溶液をインキュベートすること及び
任意選択で、前記ＰＡＤ処理タンパク質溶液を、タンパク質を含む食品に加工すること
を含むプロセスに関する。
好ましくは、本発明のプロセスは、挙げられた特性の少なくとも１つを修飾する、すなわち、本発明のプロセスは、タンパク質を含む食品の甘味を修飾する（好ましくは減少させる）ための方法を提供する。その代わりに、本発明は、タンパク質を含む食品のカンゾウを修飾する（好ましくは減少させる）ためのプロセスを提供する。本発明はまた、タンパク質を含む食品の渋味を修飾する（好ましくは減少させる）ためのプロセスをも提供する。本発明は、タンパク質を含む食品の粉状／粉っぽさを修飾する（好ましくは減少させる）ためのプロセスをさらに提供する。その代わりに、本発明は、タンパク質を含む食品のこく味を修飾する（好ましくは減少させる）プロセスを提供する。本発明はまた、タンパク質を含む食品のとろみを修飾する（好ましくは減少させる）プロセスをも提供する。本発明は、タンパク質を含む食品の消化性を修飾する（好ましくは増加させる）プロセスをさらに提供する。本発明はまた、タンパク質を含む食品のプロテアーゼ阻害活性を修飾する（好ましくは減少させる）ためのプロセスをも提供する。別の好ましい実施形態では、本発明のプロセスは、タンパク質を含む食品の粉状／粉っぽさ、こく味、及びとろみを修飾するためのプロセスなどのように、挙げられた特性の少なくとも２、３、又は４つを修飾する。
本明細書において使用される用語「甘味」は、糖が豊富な食品を食べた時に最も一般的に知覚される基本的な風味を指す。
本明細書において使用される用語「カンゾウ」は、味覚／スペインカンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｇｌａｂｒａ）の甘い根又はステビア植物種に存在する構成成分を指す。
本明細書において使用される用語「渋味」は、たとえば多くの果物中に見つけられるタンニンによって又はとりわけ酸性環境におけるタンパク質によって引き起こされる口当たりに似ている、辛口の、顔をしかめる口当たりを指す。
本明細書において使用される用語「粉状／粉っぽさ」は、製品が口の中で粉状又は粒状に感じる程度を指す。
本明細書において使用される用語「こく味」は、口の中でのこくのあるまろやかな感じを指す。
本明細書において使用される用語「とろみ」は、口の中でのかたさを指し、舌と口蓋との間に製品を押し入れるために必要とされる力に相当する。
本明細書において使用される用語「消化性」は、消化される性質を指し、摂取される食品の分量に対する、身体が保留する食品の分量に関する。タンパク質の消化性は、ペプシン及び膵臓ペプチダーゼなどのような消化プロテアーゼが生理学的な適切な条件下で前記タンパク質とのインキュベーションの際に行った加水分解の度合いに直接関係する。
本明細書において使用される用語「プロテアーゼ阻害活性」は、プロテアーゼ（タンパク質の分解を助ける酵素）の機能を阻害する活性（好ましくはタンパク質）を指す。
用語「修飾」は、目指す目標に依存して、減少させること又は増加させることを指す。たとえば、本発明は、タンパク質を含む食品の消化性を増加させるためのプロセスであって、
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）とタンパク質溶液をインキュベートすること及び
任意選択で、前記ＰＡＤ処理タンパク質溶液を、タンパク質を含む食品に加工すること
を含むプロセスを提供する。
本発明はまた、タンパク質を含む食品の甘味、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、及び／又はとろみを減少させるためのプロセスであって、
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）とタンパク質溶液をインキュベートすること及び
任意選択で、前記ＰＡＤ処理タンパク質溶液を、タンパク質を含む食品に加工すること
を含むプロセスをも提供する。
本発明はまた、タンパク質を含む食品のプロテアーゼ阻害活性を減少させるためのプロセスであって、
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）とタンパク質溶液をインキュベートすること及び
任意選択で、前記ＰＡＤ処理タンパク質溶液を、タンパク質を含む食品に加工すること
を含むプロセスをも提供する。
挙げられた特性のいずれかが増加するか減少するかどうかは、タンパク質溶液がＰＡＤと共にインキュベートされない以外、他の点では同一の、調製された食品と比較することによって決定される。
用語「タンパク質を含む食品」は、一体となっているその構成成分として又は追加される成分としてタンパク質を含む食品、すなわちタンパク質を含んでいる食品を指す。タンパク質を含む食品は、好ましくは、少なくとも０．１％のタンパク質を含む。任意の適したタンパク質が、本発明のプロセスにおいて使用されてもよい。好都合には、タンパク質は、少なくとも１モル％、２、３、４、５、又は少なくとも６モル％などのような、タンパク質に結合したアルギニンを含む。
タンパク質溶液（あるいは：食品タンパク質成分）は、タンパク質を含む液体タンパク質組成物である。タンパク質を含む食品の消化性が修飾される（好ましくは増加する）場合、タンパク質溶液は、プロテアーゼ阻害剤活性を含む。プロテアーゼ阻害活性が修飾される（好ましくは減少する）場合、タンパク質溶液は、プロテアーゼ阻害剤活性を含む。本明細書において使用されるように、用語「プロテアーゼ阻害剤活性」は、プロテアーゼに追加すると、プロテアーゼ活性を減少させるであろうペプチドのことである。用語「タンパク質溶液」はまた、すべての構成成分が溶解されるわけではない溶液をも含む、すなわち、用語「タンパク質溶液」はまた、タンパク質懸濁液をも含む。
「ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）とタンパク質溶液をインキュベートする」ステップは、任意の適した酵素濃度で、任意の適した時間、任意の適したｐＨで実行することができる。当業者は、何の問題もなく、適した酵素量又は適したインキュベーション温度又は適したインキュベーションｐＨ又は適したインキュベーション時間を確立することができ、たとえば、４〜９の間のｐＨ、５〜８．５の間のｐＨなど、５．５〜８の間のｐＨなど、６〜７の間のｐＨなど又は６．２〜６．８の間のｐＨで、たとえば約６．５のｐＨで、ペプチジルアルギニンデイミナーゼとタンパク質をインキュベートすることができる。タンパク質をＰＡＤと共にインキュベートするのに適した温度は、摂氏２０〜６０度の間、３０〜５０の間など又は摂氏３５〜４５度の間であってもよい。
ＰＡＤ処理タンパク質溶液は、たとえば、これに限定されないがタンパク質ドリンクなどのような最終製品とすることができる。その代わりに、ＰＡＤ処理タンパク質溶液は、続いてタンパク質を含む食品にさらに加工することができる食品成分である。
上記に記載されるように、任意の適したタンパク質を、本発明のプロセスにおいて使用することができる。好ましい態様では、本発明のプロセスにおけるタンパク質は、植物タンパク質又は植物性タンパク質である（これらの用語は、本明細書において区別なく使用される）。好ましくは、本発明のプロセスにおいて使用されるタンパク質溶液は、大豆タンパク質、ナタネタンパク質、コムギタンパク質、ソバタンパク質、トウモロコシタンパク質、オオムギタンパク質、ジャガイモタンパク質、米タンパク質、カラスムギタンパク質、エンドウマメタンパク質、（ピー）ナッツタンパク質、ハウチワマメタンパク質、アーモンドタンパク質などのような植物タンパク質を含む溶液である又は前記タンパク質は、卵タンパク質、乳タンパク質、ゼラチンタンパク質、若しくは微生物タンパク質である。
本発明のプロセスは、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）とタンパク質溶液をインキュベートする少なくとも１つのステップを含む。上記に記載され、またタンパク質溶液が食品成分であるか、タンパク質を含む最終の食品であるかどうかに依存して、本発明のプロセスは、任意選択で、前記ＰＡＤ処理タンパク質溶液をタンパク質を含む食品に加工するステップを含む。出発物質に依存して、さらに任意のものを、本発明のプロセスに含むことができる。出発物質が、これに限定されないが植物タンパク質の粉などのような粉である場合、本発明のプロセスは、タンパク質溶液を得るために、粉を溶解するステップを含むであろう。粉の溶解は、通常、粉への液体（たとえば水又はバッファー）の追加及び粉が前記液体において少なくとも部分的に溶解するのを可能にすることを伴う。粉の特徴に依存して、一定の時間、液体と粉を混合すること、任意選択で、溶解を改良する／速めるためにいくらか加熱することが必要とされるかもしれない。その代わりに、懸濁液は、水又は適したバッファー中で調製される。すなわち、本発明の方法の任意選択の追加のステップは：タンパク質溶液を得るために粉を溶解すること又は粉から懸濁液を調製することを含む。
タンパク質アルギニンデイミナーゼ及びペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）という用語は、本明細書において区別なく使用される。タンパク質又はペプチジルアルギニンデイミナーゼは、ペプチド又はタンパク質に結合したアルギニンをペプチド又はタンパク質に結合したシトルリンに変換する酵素のファミリー（ＥＣ３．５．３．１５）に属する。このプロセスは、脱アミノ化又はシトルリン化と呼ばれる。アルギニンからシトルリンへの反応において、アルギニン側鎖の末端の窒素原子の１つは、酸素と置換される。反応は、１分子の水を使用し、副産物としてアンモニアがもたらされる（ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｉｏｎ）。アルギニンは、中性のｐＨで正に電荷するのに対して、シトルリンは無電荷である。驚いたことに、アルギニンの少なくとも一部がシトルリンに変換され、それによって、それほど電荷を有していないタンパク質がもたらされるタンパク質は、修飾された甘味、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、及び／又は消化性を呈したことがわかった。
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）は、任意の適した起源に、たとえば哺乳類又は微生物の起源に由来してもよい。本発明において使用されるＰＡＤは、好都合には、微生物の供給源に由来する、すなわち、本発明のプロセスにおいて使用されるＰＡＤは、微生物のＰＡＤである。たとえば、ＰＡＤは、フザリウム・グラミネラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）などのようなフザリウム種、ケトミウム・グロボサム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、ファエオスフェリア・ノドラム（Ｐｈａｅｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）からなどのような真菌起源に又は細菌ストレプトマイセス、たとえばジャガイモそうか病菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｓ）、ストレプトマイセス・クラブリゲレス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｅｓ）などのような細菌起源に由来してもよい。本明細書において開示されるポリペプチドの起源に関する「由来する」又は「由来し得る」という表現は、本明細書において開示されるポリペプチドでＢＬＡＳＴ検索を実行する場合に、ポリペプチドが、微生物細胞などのような自然源に由来し得るかもしれず、その内因性ポリペプチドが、本明細書において開示されるポリペプチドと最も高い相同性又は同一性パーセンテージを示すことを意味する。
ペプチジルアルギニンデイミナーゼは、たとえば、国際公開第２００８／０００７１４号パンフレットから既知である。国際公開第２００８／０００７１４号パンフレットは、タンパク質アルギニンデイミナーゼによりタンパク質を酵素的に処理するプロセスを開示し、アルギニンの少なくとも３０％は、シトルリンに変換される。
ペプチジルアルギニンデイミナーゼは、純粋な又は精製されたペプチジルアルギニンデイミナーゼであってもよい。純粋な精製されたペプチジルアルギニンデイミナーゼは、たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はこの目的に適しており、当業者に知られている任意の他の分析方法によって決定されるように、少なくとも５０％純粋な、たとえば少なくとも６０％純粋な、少なくとも７０％純粋な、少なくとも７５％純粋な、少なくとも８０％純粋な、少なくとも８５％純粋な、少なくとも８０％純粋な、少なくとも９０％純粋な、又は少なくとも９５％純粋な、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％純粋な酵素である。
好ましくは、使用されるペプチジルアルギニンデイミナーゼは、Ｃａ２＋非依存性である。より好ましくは、使用されるペプチジルアルギニンデイミナーゼは、微生物のＰＡＤであり、Ｃａ２＋非依存性である。
好都合には、本発明のプロセスにおいて使用されるペプチジルアルギニンデイミナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して又は配列番号１の成熟アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチドであり、ポリペプチドは、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ活性を有する。
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の配列同一性のパーセンテージを決定するために、配列が、最適な比較の目的のためにアライメントされることについてここで解説する。２つの配列の間のアライメントを最適化するために、ギャップが、比較される２つの配列のいずれかに導入されてもよい。そのようなアライメントは、比較されている配列の全長に対して実行することができる。その代わりに、アライメントは、より長さの短いもの、たとえば約２０、約５０、約１００、又はそれ以上のアミノ酸に対して実行されてもよい。配列同一性は、報告されたアライメント領域にわたって２つの配列の間で完全に一致するパーセンテージのことである。２つのアミノ酸配列の間の配列同一性パーセントは、２つの配列のアライメントのためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用して決定されてもよい。（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。アミノ酸配列及びヌクレオチド配列はともに、アルゴリズムによってアライメントすることができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータープログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的のために、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０又はそれ以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）ｐｐ２７６−２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、ＥＢＬＯＳＵＭ６２を置換マトリックスに使用する。使用する任意選択のパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティー及び０．５のギャップエクステンションペナルティーとする。これらの異なるパラメーターはすべて、わずかに異なる結果をもたらすであろうが、異なるアルゴリズムを使用したとしても、２つの配列の全体的な同一性パーセンテージは有意には変化しないことを当業者は十分に理解するであろう。
「成熟ポリペプチド」は、その最終の形態をしたポリペプチドとして本明細書において定義され、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳及び前記ポリペプチドの翻訳後修飾の後に得られる。翻訳後修飾は、Ｎ−末端プロセシング、Ｃ−末端切り詰め、グリコシル化、リン酸化、並びに切断によるシグナルペプチドなどのようなリーダー配列、プロペプチド、及び／又はプレプロペプチドの除去を含む。
配列番号１の成熟ポリペプチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸１９、２０、２１、２２、２３、２４〜６４０を含んでいてもよく又は含有してもよく、好都合には、配列番号１の成熟ポリペプチド配列は、配列番号１のアミノ酸２２〜６４０を含み又は含有し、配列番号１における１位のメチオニンは、１番と数えられる。
用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結され、かつ５つを超えるアミノ酸残基を含有するアミノ酸残基を含む分子を指す。本明細書において使用される用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と同義であり、また２つ又はそれ以上のポリペプチドを指してもよい。したがって、用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、区別なく使用することができる。ポリペプチドは、機能性を追加するために任意選択で修飾されてもよい（たとえばグリコシル化、リン酸化、アシル化、ファルネシル化、プレニル化、スルホン化、及びその他同種のもの）。ある条件下で特異的な基質の存在下において活性を呈するポリペプチドは、酵素と呼ばれてもよい。
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ又はペプチジルアルギニンデイミナーゼ活性を有するポリペプチドは、当技術分野において知られている方法によって任意の適した宿主生物において、たとえば真菌アスペルギルス、たとえばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）若しくはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ、又は酵母サッカロマイセス及びクリベロマイセス又はストレプトマイセス属若しくはバチルス属の細菌において産生されてもよい。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）においてペプチジルアルギニンデイミナーゼ活性を有するポリペプチドを発現させるのに適した方法は、たとえば、参照によって本明細書に含まれる国際公開第２００８／０００７１４号パンフレットの実施例３及び４において開示される。
本明細書において使用される用語「タンパク質を含む食品」は、食品が少なくともタンパク質を含む限り、任意のタイプの食品を指す。食品という用語は、固形食及びドリンクを指す。
本発明の一実施形態では、本発明は、タンパク質を含む食品の甘味、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、並びに／又は消化性及び／若しくはプロテアーゼ阻害活性を修飾するためのプロセスであって、
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）とタンパク質溶液をインキュベートすること及び
任意選択で、前記ＰＡＤ処理タンパク質溶液を、タンパク質を含む食品に加工することを含み、
前記タンパク質を含む食品は、タンパク質を含むドリンク、すなわち摂取が意図される液体である、プロセスを提供する。
タンパク質を含むドリンクは、任意のタイプのドリンクとすることができるが、好ましい態様では、タンパク質を含むドリンクは、植物タンパク質ドリンク又は発酵植物タンパク質製品である。適した植物タンパク質ドリンクの例は、ダイズ豆ドリンク、エンドウマメドリンク、ピーナッツドリンク、オオムギドリンク、米ドリンク、カラスムギドリンク、キノアドリンク、アーモンドドリンク、カシュードリンク、ココナツドリンク、ヘーゼルナッツドリンク、アサドリンク、ゴマ種子ドリンク、コムギドリンク、ジャガイモドリンク、又はヒマワリ種子ドリンクである。適した発酵植物タンパク質製品の例は、発酵ダイズ豆製品、発酵エンドウマメ製品、発酵ピーナッツ製品、発酵オオムギ製品、発酵米製品、発酵カラスムギ製品、発酵キノア製品、発酵アーモンド製品、発酵カシュー製品、発酵ココナツ製品、発酵ヘーゼルナッツ製品、発酵アサ製品、発酵ゴマ種子ドリンク、発酵コムギ製品、発酵ジャガイモ製品、又は発酵ヒマワリ種子製品である。
ダイズ豆タンパク質は、乳児用、フォローオン、又は幼児用ドリンクを調製するために一般的に使用される。甘味、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、及び／又は消化性のような特性は、本発明のプロセスを使用することによって改良することができる。本発明は、そのため、タンパク質を含む食品の甘味、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、並びに／又は消化性及び／若しくはプロテアーゼ阻害活性を修飾するためのプロセスであって、
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）とタンパク質溶液をインキュベートすること及び
任意選択で、前記ＰＡＤ処理タンパク質溶液を、タンパク質を含む食品に加工すること
を含み、前記タンパク質を含む食品は、タンパク質を含むドリンクであり、前記ドリンクは、乳児用、フォローオン、又は幼児用ドリンクであり、前記タンパク質は、ダイズ豆タンパク質である、プロセスを提供する。
産生されるタンパク質を含むドリンクは、追加のタンパク質なし又はありで産生されるドリンクとすることができる。タンパク質強化（植物）タンパク質ドリンクは、改良された栄養価などのような利点を提供するが、通常、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみなどのような望まれない特性により、摂取するのが困難であると見なされる。本発明のプロセスにより調製されたタンパク質強化（植物）タンパク質ドリンクは、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみが改良されており（低下しており）、よって、本発明は、タンパク質を含む食品の甘味、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、並びに／又は消化性及び／若しくはプロテアーゼ阻害活性を修飾するためのプロセスであって、
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）とタンパク質溶液をインキュベートすること及び
任意選択で、前記ＰＡＤ処理タンパク質溶液を、タンパク質を含む食品に加工すること
を含み、前記タンパク質を含む食品は、タンパク質強化（植物）タンパク質ドリンクである、プロセスを提供する。タンパク質強化ドリンクの例は、カロリー摂取量を増加させるための、高齢の又は（手術後の）回復中の人々のためのタンパク質強化ドリンクである。その代わりに、そのようなタンパク質強化ドリンクは、薬用若しくは医療用ドリンク又はスポーツドリンクである。
本発明のプロセスによって調製されるタンパク質を含むドリンクは、中性の又は酸性のｐＨを有することができる。
本発明は、甘味、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、並びに／又は消化性及び／若しくはプロテアーゼ阻害活性を修飾するためのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）の使用をさらに提供する。好ましくは、本発明は、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、並びに／又は消化性及び／若しくはプロテアーゼ阻害活性を修飾するためのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）の使用を提供する。好ましくは、本発明は、カンゾウ、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、並びに／又は消化性及び／若しくはプロテアーゼ阻害活性を修飾するためのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）の使用を提供する。好ましくは、本発明は、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、並びに／又は消化性及び／若しくはプロテアーゼ阻害活性を修飾するためのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）の使用を提供する。本発明のプロセスについての上記に記載される特色は、使用の部分に同様に当てはまる。
本明細書において記載されるプロセスのいずれかから直接得られる製品もまた、本発明の範囲内にある。
別の態様では、本発明は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）、好ましくは微生物のペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）を含むニュートラシューティカル（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）組成物を提供する。より好ましくは、微生物のペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）は、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する又は配列番号１の成熟アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。
本明細書において使用されるニュートラシューティカルという用語は、栄養学及び薬学の両方の応用分野における有用性を示す。したがって、新規なニュートラシューティカル組成物は、食品及び飲料へのサプリメントとしての並びにカプセル若しくは錠剤などのような固形製剤又は水剤若しくは懸濁剤などのような液体製剤であってもよい、経腸又は非経口適用のための医薬製剤又は医薬としての使用を見出すことができる。前述のことから明らかであるように、ニュートラシューティカル組成物という用語はまた、本明細書において記載される方法のいずれかによって得られる食品及びドリンク並びにサプリメント組成物、たとえば健康補助食品を含む。
本明細書において使用される健康補助食品という用語は、飲食物を補足することが意図される「食物性の成分」を含有する、口によって取り入れられる製品を示す。これらの製品における「食物性の成分」は、ビタミン、ミネラル、ハーブ、又は他の植物性の薬品、アミノ酸、及び酵素などのような物質、器官組織、小腺（ｇｌａｎｄｕｌｅ）、並びに代謝産物を含んでいてもよい。健康補助食品はまた、抽出物又は濃縮物とすることができ、錠剤、カプセル、ソフトカプセル、ジェルキャップ、液体、又は散剤などのような多くの形態で見つけられてもよい。それらはまた、バーなどのような他の形態をとることもできるが、そうであれば、健康補助食品のラベル上の情報は、概して、その製品を、従来の食品又は食事若しくは飲食物の単独の品目として説明することはないであろう。
本発明は、下記の実施例においてより詳細に説明され、実施例は本発明を限定しない。
［実験の部］
［材料］
［ペプチジルアルギニンデイミナーゼのクローニング及び発現］
配列番号１によるペプチジルアルギニンデイミナーゼ活性を有するポリペプチドのクローニング及び発現を、国際公開第２００８／０００７１４号パンフレットの実施例３及び４において開示されるように実行した。
［ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）活性］
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ活性は、α−Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−エチルエステル（ＢＡＥＥ）におけるシトルリン残基の形成を測定することによって決定した。インキュベーション混合物は、７００μｌの最終容量中１００ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＢＡＥＥを含有した。インキュベーションは、３０分間５５℃で実行し、反応は、１００μｌ ８Ｎ ＨＣｌＯ４を追加することによって停止させた。シトルリンは、Ｇｕｔｈｏｈｒｌｅｉｎ ａｎｄ Ｋｎａｐｐｅ，（１９６８） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６，１８８の方法による比色分析によって決定した。
ペプチジルアルギニンデイミナーゼの１単位は、形成された１μｍｏｌのシトルリン／分／タンパク質ｍｇとして表現する。
［実施例１］
［ＰＡＤ酵素により処理されたタンパク質中のトリプシン阻害活性（ＴＩＡ）の低下］
ＴＩＡを含有する様々なタンパク質をＰＡＤと共にインキュベートし、ＴＩＡの低下を２つの異なるアッセイにより測定した。ＰＡＤインキュベーションあり及びなしのタンパク質の調製並びにＴＩＡを測定するために使用するアッセイについて下記に記載する。
大豆ドリンクサンプルの調製：地元の店の４００μｌの市販の大豆ドリンク（Ｐｒｏｖａｍｅｌ ｕｎｓｗｅｅｔｅｎｅｄ）を、６００μｌの水道水で希釈した。続いて、０．１７Ｕ／ｍｌのＰＡＤを追加し、この溶液を４０℃で２．５時間インキュベートした（サーモミキサー６００ｒｐｍ）。コントロールサンプルを、ＰＡＤの代わりに同じ容量の水と共にインキュベートした。
大豆粉サンプルの調製：１ｇの大豆を、４９ｇ ０．０１Ｎ ＮａＯＨと混合した。この懸濁液のｐＨを、４Ｎ ＨＣｌにより１０に合わせた。この懸濁液を、外界温度で３時間、磁気撹拌により完全に混合した。続いて、サンプルを、３２００＊ｇで１０分間遠心分離した。上清（脂質を含有する上層部分なしを２０８１７ｇで１０分間再び遠心分離した。結果として生じる１５０μｌの上清に、０．０４ＵのＰＡＤを追加し、この溶液を、４５℃で３０分間インキュベートした（サーモミキサー６００ｒｐｍ）。コントロールサンプルを、ＰＡＤの代わりに同じ容量の水と共にインキュベートした。
ニワトリ卵白オボムコイドサンプルの調製：オボムコイド（Ｓｉｇｍａ）を、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．２中で可溶化した（０．２５ｍｇ／ｍｌ）。これに０．１７Ｕ／ｍｌのＰＡＤを追加し、３７℃でインキュベートした。反応を、２５μｌ ０．２Ｍ ＥＤＴＡにより停止させた。
［菜種粕サンプルの調製：］
１００ｍｇの菜種粕（低温圧搾したナタネ油の種粕から得た）に、９００μｌ ２％ ＮａＣｌ及び０．１７単位のＰＡＤを追加した。ナタネは、８００ｒｐｍでサーモミキサーにおいて５５℃で３０分間可溶化した。この後、サンプルを、２０８１７ｇで１０分間遠心分離した。コントロールの菜種粕サンプルは、ＰＡＤの非存在下において可溶化した。
［ナタネタンパク質分離物（ＲＰＩ）サンプルの調製：］
ＲＰＩは、低温圧搾したナタネ油の種粕から出発して、国際公開第２０１８／００７４９２号パンフレットの特許において記載されるように調製した。ＲＰＩの２％（ｗ／ｖ）溶液を、このサンプルから調製した。続いて、０．１７Ｕ／ｍｌのＰＡＤを追加し、溶液を４０℃で２．５時間インキュベートした（サーモミキサー６００ｒｐｍ）。コントロールサンプルを、ＰＡＤの代わりに同じ容量の水と共にインキュベートした。
ピーナッツ及びピーナッツバターサンプルの調製：ピーナッツ（殻付き）を地元の店から買った。殻を除去し、ピーナッツ１の割合を水４の割合と混合した（ｗ／ｗ）。ピーナッツバターを、地元の店で購入し（Ｔｅｒｒａ Ｓａｎａブランド）、水３の割合と混合した（ｗ／ｗ）。５００μｌのこの懸濁液に、０．４ＵのＰＡＤ又は水（コントロール）を追加し、４０℃で２時間インキュベートした。続いて、１の割合を、２の割合の１０ｍＭ酢酸で希釈した。１２５μｌを、下記に記載されるように分析した（ＴＩＡの測定）。
［オオムギサンプルの調製］
１グラムのオオムギを、１０ｍｌの水中で混合した（磁気撹拌）。５００μｌのこの懸濁液に、０．４ＵのＰＡＤを追加し、４５℃で９０分間インキュベートした（サーモミキサー６００ｒｐｍ）。コントロールとして、水をＰＡＤの代わりに追加した。
［ソバ粉及びソバドリンクサンプルの調製：］
地元の店から買ったソバ粉の１０％溶液を混合により水中で調製した。地元の店から買った生物学的なソバドリンク（ブランド名Ｉｓｏｌａ）は、そのまま使用した。５００μｌのこの懸濁液に、０．４ＵのＰＡＤを追加し、４５℃で１００分間インキュベートした（サーモミキサー６００ｒｐｍ）。コントロールのインキュベーションについては、水をＰＡＤの代わりに追加した。トリプシン阻害活性は、ＡｚｏＣａｓｅｉｎアッセイを使用して下記に記載されるように測定した。
［ハウチワマメサンプルの調製］
ハウチワマメの種子を、地元の生産者からもらい、水中で１０％の粉の懸濁液にさらに加工した。５００μｌのこの懸濁液に、０．４ＵのＰＡＤを追加し、４５℃で１００分間インキュベートした（サーモミキサー６００ｒｐｍ）。コントロールのインキュベーションのために、水をＰＡＤの代わりに追加した。トリプシン阻害活性は、ＡｚｏＣａｓｅｉｎアッセイを使用して下記に記載されるように測定した
［ＴＩＡの測定］
［ＢＡＥＥアッセイによるＴＩＡの測定］
本明細書において使用されるアッセイは、本質的に、Ｓｉｇｍａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ「ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ−ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｅｎｚｙｍａｔｉｃ−ａｓｓａｙ−ｏｆ−ｔｒｙｐｓｉｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．ｈｔｍｌ）において記載されるとおりである。１ｍＭ ＨＣｌ中２５μｌの１ｍｇ／ｍｌトリプシン（Ｓｉｇｍａ；ウシ膵臓由来のトリプシン；１５２６７単位／ｍｇ固形分）を、１．８７５ｍｌの１ｍＭ ＨＣｌに追加した。続いて、上記に記載されるように調製した１００μｌのタンパク質サンプル（酵素とのインキュベーションあり又はなし）を、反応混合物の中に追加した。コントロールとして、１００μｌの１ｍＭ ＨＣｌを、トリプシン活性測定において阻害剤の代わりに追加した。これらの溶液を、外界温度で５分間インキュベートした。
２．７ｍｌの６７ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．６（２５℃）に、３００μｌのＢＡＥＥ（Ｓｉｇｍａ；Ｎａ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル塩酸塩 同じバッファー中０．８６ｍｇ／ｍｌ）及び１００μｌの１ｍＭ ＨＣｌを追加した。トリプシン活性は、１００μｌのトリプシン溶液の追加の後に決定し、反応を２５３ｎｍでモニターした。分光光度計は、トリプシン溶液の代わりに１００μｌの１ｍＭ ＨＣｌを含有するブランクにより調整した。反応を２０分間続け、毎分のデータポイントを３とした（図１）。
２５３ｎｍでの吸光度の増加（線の傾きの増加）は、トリプシンによるＢＡＥＥの切断を示す。基質であるＢＡＥＥの追加の前にトリプシンをタンパク質サンプルと共にインキュベートすると、２５３ｎｍでの吸光度は、ある時間内で減少し、これは、トリプシン酵素活性の阻害を示す。タンパク質サンプルを、トリプシンへの追加の前に、ＰＡＤと共にインキュベートすると、２５３ｎｍでの吸光度は、（ある程度）戻り、タンパク質サンプルによるトリプシン阻害が小さくなることを示す。ＰＡＤ処理サンプルあり及びなしの傾きから、ＰＡＤによるＴＩＡレベルの低下を計算することができる。トリプシン阻害（％）は：１００−（サンプル−サンプルバックグラウンド）／（トリプシン−ブランク）によって計算した。
［Ａｚｏ Ｃａｓｅｉｎアッセイを使用するＴＩＡの測定］
タンパク原料中のＴＩＡのレベルは、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｍａｔｒｉｃｅｓ」，Ｒｏｂｉｎ Ｅ．Ｊ．Ｓｐｅｌｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．；Ｔｈｅ Ｏｐｅｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１１，５，４２−４６において記載されるアッセイを使用して評価した。手短に言えば、１２５μｌのタンパク質サンプル（又はブランクについては１２５μｌの１０ｍＭ酢酸）を、１ｍＭ塩酸中２５μｌの０，３５ｍｇ／ｍｌトリプシンと混合した。反応は、ｐＨ８．５の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ塩化カルシウム中への３０ｍｇ／ｍｌアゾカゼインの追加によって開始した。バックグラウンドシグナルについて、トリプシンを１ｍＭ ＨＣｌと置換した。３０分後、３７℃で、サンプルを１５０μｌ １５％ ＴＣＡによりクエンチした。加水分解されていないタンパク原料及び他の不溶性のものは、４℃で１５０００＊ｇで１０分間遠心分離によって除去した。１００μｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートの中に移し、１００μｌの１．５Ｍ ＮａＯＨと混合した。４５０ｎｍでの吸光度を測定した。トリプシン阻害（％）は：１００−（サンプル−サンプルバックグラウンド）／（トリプシン−ブランク）によって計算した。
表１に、上記に記載されるタンパク質についてＢＡＥＥアッセイ又はＡｚｏｃａｓｅｉｎアッセイによって測定したＴＩＡの低下を示す。
Figure 2021526016
［実施例２］
［国際標準分析法を使用する大豆ドリンク及び大豆粉におけるＴＩＡの定量化］
トリプシン阻害活性を測定するための国際標準分析法を、ＰＡＤによる酵素処理の前及び後に大豆粉及び大豆ドリンクのトリプシン阻害活性を測定するために、Ｅｕｒｏｆｉｎ ｌａｂｃｏ（ＥＮ−ＩＳＯ １４９０２：２００１）で使用した。
［大豆ドリンク及び大豆粉の酵素処理：］
地元の店から買った大豆ドリンク（Ｐｒｏｖａｍｅｌ ｕｎｓｗｅｅｔｅｎｅｄ）：３００ｇを、０．０４Ｕ ＰＡＤ／ｇ大豆ドリンクと共に４５℃で９０分間水浴においてインキュベートした（磁気撹拌）。コントロールとして、大豆ドリンクは何も追加せずにインキュベートした。続いて、サンプルを−２０℃で一晩保存した。この後、サンプルを冷凍乾燥させた。
大豆粉：未加工の大豆粉の１０％懸濁液（ｗ／ｗ）を、０．０１Ｍ ＮａＯＨの溶液中で調製した。ｐＨをｐＨ１０に調節した。続いて、懸濁液を、外界温度で３時間混合した（磁気撹拌）。この後、懸濁液を、２つに等分し（２００ｇ）、４５℃の水浴に移動させた。１５分後、一方に０．０５Ｕ ＰＡＤ／ｇ大豆粉懸濁液を追加し、３０分間インキュベートした。続いて、サンプルを−２０℃で一晩保存した。この後、サンプルを冷凍乾燥させた。
ＴＩＡの測定の結果を、下記の表２に示す。
Figure 2021526016
［実施例３］
［インビトロモデルを使用するナタネタンパク質の消化性の改良］
ＰＡＤによるナタネタンパク質サンプルの処理：ナタネタンパク質分離物（ＲＰＩ）を、国際公開第２０１８／００７４９２号パンフレットの特許において記載されるように調製した。水中５００ｍｌの１０％ ＲＰＩに４３Ｕ ＰＡＤを追加した。この懸濁液を４０〜４５℃で３時間インキュベートした。続いて、サンプルを凍結させ、凍結乾燥させた。
インビトロにおける消化性を、Ｈｅ，Ｔａｏ＆Ｇｉｕｓｅｐｐｉｎ，Ｍａｒｃｏ．（２０１３）．Ｓｌｏｗ ａｎｄ ｆａｓｔ ｄｉｅｔａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｆｏｏｄ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．６５．１０．３１０９／０９６３７４８６．２０１３．８６６６３９において記載されるようにＳＹＭＰＨＹＤプラットフォームを使用してＮＩＺＯ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒで測定した。
ＲＰＩ及びＰＡＤにより処理したＲＰＩのタンパク消化についてのインビトロモデルの結果を、図２に示す。
放出されたアンモニアの増加（ＯＰＡ法によって測定した）は、タンパク質サンプルの消化性がより高いことを示す。未処理サンプルと比較して、ＰＡＤにより処理したＲＰＩについて、消化の終了時に２０％超の消化性の増加が観察される。
［実施例４］
［ＰＡＤにより処理した大豆ドリンクの口当たりの改良］
［ＰＡＤとの大豆ドリンクのインキュベーション］
大豆ドリンクＰｒｏｖａｍｅｌ ｕｎｓｗｅｅｔｅｎｅｄ：１０００ｍｌ（４＊２５０ｍｌ）を、０．２７Ｕ／ｍｌ Ｕ ＰＡＤと共に４５℃で４時間、水浴においてインキュベートした（振盪４０ｒｐｍ）。コントロールとして、大豆ドリンクは何も追加せずにインキュベートした。続いて、サンプルを、マイクロ波により６５℃まで加熱し、ＰＡＤ酵素を不活性化するために５分間その温度で保った。この後、サンプルを氷水中で冷却した。次いで、官能パネル評価をこれらのサンプルに対して実行した。サンプルは、検査において、製品に関係のある特質について、パネル（ｎ＝１２）が、Ｍｅｉｌｇａａｒｄ Ｍ．，Ｃｉｖｉｌｌｅ ＧＶ．，Ｃａｒｒ ＢＴ．２００７．Ｓｅｎｓｏｒｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．４ｔｈ ｅｄ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ．において記載されるように、定量的記述分析（ＱＤＡ）によって判定した。検査の間、サンプルは、偏りのないように最適化されたデザインに従って提供され、二通り、ＥｙｅＱｕｅｓｔｉｏｎにおいて０〜１００の構造化されていない線尺度でスコア化した。データは、個々のサンプル間の有意差を見出すために、ＡＮＯＶＡにより分析した。ｐ＜０．０５での差異は、有意であると見なした。官能パネル評価の結果を図３に示す。口当たりの有意な減少が、酵素で処理したドリンクについて、口の中での粉状、こく味、及びとろみなどのような特質に関して観察された。
［実施例５］
［ＰＡＤ酵素により処理したナタネタンパク質の官能評価］
サンプル当たり、１０００ｍｌの２％のタンパク質の粉の懸濁液を、水道水で作製し（植物タンパク質の粉はタンパク質の含有量に合わせて調整）、ｐＨを４Ｍ Ｈ２Ｓ０４によりｐＨ−６．５に調節した。
懸濁液は、様々な酵素量でＰＡＤ酵素を追加して及び追加しないで、４５℃で２時間インキュベートした。酵素は６５℃で材料を加熱することによって不活性化し、保持時間を５分間とした。サンプルは、検査において、製品について関係のある特質について、官能パネル（ｎ＝１３）が記述分析（ＱＤＡ）によって判定した。検査の間、サンプルは、偏りのないように最適化されたデザインに従って提供され、二通り、ＥｙｅＱｕｅｓｔｉｏｎにおいて０〜１００の構造化されていない線尺度でスコア化した。データは、個々のサンプル間の有意差を見出すために、ＡＮＯＶＡにより分析した。ｐ＜０．０５での差異は、有意であると見なした（図４）。ＰＡＤ酵素によるＲＰＩの処理によって、検査した甘味、カンゾウ、渋味、苦味、後味の長さ（図の説明文において記載される）などのようなすべての官能的特質が、追加するＰＡＤの量の増加と共に減少した。
［実施例６］
［ＰＡＤにより処理したエンドウマメ及び大豆タンパク質ドリンクにおけるＩＥＦの減少］
サンプルを、Ｈ２Ｏで４倍に希釈した。続いて、サンプルを、ＩＥＦサンプルバッファーにより１対１に希釈した。１０μｌのサンプルを、Ｎｏｖｅｘ（商標）ｐＨ ３−７ ＩＥＦ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌに加えた。実行時間の合計２．５時間（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコールによる）。ＰＡＤ処理の後の大豆ドリンク及びエンドウマメドリンクについてのｐｌの低下を、図５に示す。これらのタンパク質のｐｌの低下は、タンパク質の正電荷の数を低下させる、これらのタンパク質に対するＰＡＤ酵素活性と一致している。アーモンドタンパク質の等電点の類似する低下は、ＰＡＤにより処理したアーモンドの粉において測定された（データ示さず）。より酸性の値へのこれらのタンパク質についてのｐｌの変化は、中性の飲料製剤においてこれらのタンパク質のよりよい溶解性を可能にする。
［実施例７］
［酸性ｐＨでのＰＡＤ酵素の安定性］
ＰＡＤ酵素の安定性を、３〜７のｐＨ領域で、２つの温度で（４℃の氷上で及び３７℃の水浴において）、４０分間のインキュベーションの後に判定した。ｐＨ３〜５については、ＰＡＤサンプルは、１００ｍＭのクエン酸バッファー中で６倍に希釈し、ｐＨは、１Ｎ 水酸化ナトリウムの追加によって上昇させた。５を上回るｐＨについては、酵素は、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー中で希釈した。酵素活性は、国際公開第２０１７／００９１００Ａ１号パンフレットにおいて記載されるように測定した。図６は、本実験の結果を示す。ＰＡＤ酵素は、本実験においてｐＨ７で最大活性を有するが、ｐＨ４では、活性の約５０％が、３７℃での４０分間の酵素インキュベーション時に残っており、酵素が、哺乳類の胃において見出される条件に似ている条件において活性となり得ることを示す。

Claims (16)

  1. タンパク質を含む食品の甘味、カンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、並びに／又は消化性及び／若しくはプロテアーゼ阻害活性を修飾するためのプロセスであって、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）とタンパク質溶液をインキュベートすること及び任意選択で、前記ＰＡＤ処理タンパク質溶液を、タンパク質を含む食品に加工することを含むプロセス。
  2. 前記タンパク質溶液は、食品成分である、請求項１に記載のプロセス。
  3. 前記タンパク質は、大豆タンパク質、ナタネタンパク質、コムギタンパク質、ソバタンパク質、トウモロコシタンパク質、オオムギタンパク質、ジャガイモタンパク質、米タンパク質、カラスムギタンパク質、エンドウマメタンパク質、（ピー）ナッツタンパク質、ハウチワマメタンパク質、アーモンドタンパク質などのような植物タンパク質である又は前記タンパク質は、卵タンパク質、乳タンパク質、ゼラチンタンパク質、若しくは微生物タンパク質である、請求項１〜２のいずれか一項に記載のプロセス。
  4. タンパク質溶液を得るために粉を溶解することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
  5. 前記ＰＡＤは、微生物のＰＡＤである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
  6. 前記ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）は、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する又は配列番号１の成熟アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
  7. 前記タンパク質を含む食品は、タンパク質を含むドリンクである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
  8. 前記タンパク質を含むドリンクは、植物タンパク乳又は発酵植物タンパク質製品である、請求項７に記載のプロセス。
  9. 前記植物タンパク質ドリンクは、ダイズ豆ドリンク、エンドウマメドリンク、ピーナッツドリンク、オオムギドリンク、米ドリンク、カラスムギドリンク、キノアドリンク、アーモンドドリンク、カシュードリンク、ココナツドリンク、ヘーゼルナッツドリンク、アサドリンク、ゴマ種子ドリンク、コムギドリンク、ジャガイモドリンク、又はヒマワリ種子ドリンクである、請求項７又は８に記載のプロセス。
  10. 前記ドリンクは、乳児用、フォローオン、又は幼児用ドリンクであり、前記タンパク質は、ダイズ豆タンパク質である、請求項９に記載のプロセス。
  11. 前記（植物）タンパク質ドリンクは、タンパク質強化（植物）タンパク質ドリンクである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
  12. 前記（植物）タンパク質ドリンクは、中性の又は酸性のｐＨを有するドリンクである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
  13. 前記（植物）タンパク質ドリンクは、薬用ドリンク又はスポーツドリンクである、請求項７〜１２のいずれか一項に記載のプロセス。
  14. タンパク質を含む食品のカンゾウ、渋味、粉状／粉っぽさ、こく味、とろみ、及び／又は消化性を修飾するためのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）の使用。
  15. ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）、好ましくは微生物のペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）を含むニュートラシューティカル組成物。
  16. 前記微生物のペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）は、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する又は配列番号１の成熟アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１５に記載のニュートラシューティカル組成物。
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