JP2021525259A - ネイティブケミカルライゲーションを用いる新規フロー合成方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、アミド含有化合物のフロー合成に関する。特に、本開示は、ネイティブケミカルライゲーションを介したポリペプチドのフロー合成に関する。本開示はまた、チオール、ジスルフィド、セレノールまたはジセレニド官能基をそれぞれ含むアミド含有化合物、特にポリペプチドの選択的脱硫または脱セレン化に関する【選択図】

Description

本開示は、アミド含有化合物のフロー合成に関する。特に、本開示は、ネイティブケミカルライゲーションによるポリペプチドのフローでの合成に関する。本開示はまた、それぞれチオール、ジスルフィド、セレノールまたはジセレニド官能基を含むアミド含有化合物、特にポリペプチドの選択的な脱硫または脱セレン化に関する。
ペプチドおよびタンパク質は生物系において遍在する分子であり、一般に、それらの標的に対する精巧な選択性を示し、この特性は、治療薬としてのポリペプチドへの新たな関心をもたらしてきている。これらのいわゆる「生物製剤」は、小分子治療薬の承認率の２倍であると報告されており（Ｈａｙ ２０１４）、現在、承認された薬物の１０％を占めている（Ｆｏｓｇｅｒａｕ ２０１５； Ｕｓｍａｎｉ ２０１７）。ポリペプチドベースの治療におけるこの再生の結果として、これらの生体分子に効率的にアクセスするための方法の開発が注目されている。
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、化学合成を介してペプチドを生成するための最も効率的な手段を代表する（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ １９６３； Ｋｅｎｔ １９８８）。しかし、一括して産生され得る標的のサイズ（典型的には４０〜５０残基）には有意な限界がある。ＳＰＰＳのこの限界には、大部分が、保護されていないペプチドフラグメントの収束および化学選択的融合を可能にする形質転換技術であるネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）の発展によって対処された（Ｄａｗｓｏｎ １９９４； Ｋｅｎｔ ２００９）。ＮＣＬは、Ｎ末端システイン（Ｃｙｓ）残基を含有するペプチドとＣ末端チオエステルとして官能化されたペプチドとの間で行われ、通常、律速トランス−チオエステル化工程を促進する反応性チオエステル（ＳＲ2）を生成するために適切なチオール添加剤の使用を必要とする（Ｊｏｈｎｓｏｎ ２００６； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ２０１４）。機構的には、反応は最初のトランス−チオエステル化工程を経て進行し、続いて急速なＳ→Ｎアシル転位を経て、天然のペプチド結合を与える。ＮＣＬは、全化学合成によって組み立てることができる標的ポリペプチドのサイズを劇的に大きくした。
この影響力の大きい方法論に対する重要な進歩は、金属ベースの脱硫（Ｙａｎ ２００１）の開発、および、その後の、ライゲーション接合部での最小量のタンパク質生成アミノ酸Ｃｙｓのアラニン（Ａｌａ）残基への変換を容易にする、より穏やかなラジカルベースのプロトコル（Ｗａｎ ２００７； Ｊｉｎ ２０１７）であった。チオール化アミノ酸（Ｃｙｓ代用物として）のその後の開発は、ＮＣＬ技術を介してアクセス可能な標的の数を拡大するのに役立った（Ｄａｗｓｏｎ ２０１１； Ｋｕｌｋａｒｎｉ ２０１８； Ｍａｌｉｎｓ ２０１５； Ｍａｌｉｎｓ ２０１４； Ｍａｌｉｎｓ ２０１５； Ｂｏｎｄａｌａｐａｔｉ ２０１６）。さらなる革新はチオール添加剤（例えば、トリフルオロエタンチオール（ＴＦＥＴ））（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ２０１４； Ｈｕａｎｇ ２０１６）を使用するワンポットライゲーション−脱硫化学の開発であった。これらの添加剤はＮＣＬ反応の速度を高めるのに役立つが、伝統的に使用されているアリールチオールとは異なり、その後のラジカル脱硫化学を妨害せず、したがって、中間精製なしで実施することができる。
ＮＣＬおよび関連する方法論的進歩がペプチドおよびタンパク質科学の分野に及ぼした影響にもかかわらず、この技術は、任意の承認されたペプチドまたはタンパク質医薬の製造にはまだ使用されていない。天然のペプチドおよびタンパク質の迅速かつ容易な調製を可能にし、さらに、清潔で、強固で、かつスケーラブルである方法の開発が依然として必要とされている。
本明細書における先行技術への言及は、この先行技術が任意の管轄区域における共通の一般的知識の一部を形成すること、またはこの先行技術が当業者によって、他の先行技術と理解され、関連すると見なされ、および/または組み合わされることが合理的に期待され得ることの承認または示唆ではない。
本開示は、
（ｉ）エステルを
（ｉｉ）システイン、シスチン、チオール誘導体化アミノ酸、ジスルフィド誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノール誘導体化アミノ酸、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む分子；
と反応させる工程を含み、前記エステルはチオエステルまたはセレノエステルである、
アミド含有化合物のフローでの製造方法に関する。
前記アミド含有化合物は、好ましくはポリペプチドである。好ましくは、前記ポリペプチドは式（Ｉ）：
Figure 2021525259
 で定義され、前記エステルは式（ＩＩ）：
Figure 2021525259
 で定義され、
システイン、チオール誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、およびセレノール誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む前記分子は式（ＩＩＩ）：
Figure 2021525259
 で定義され、
シスチン、ジスルフィド誘導体化アミノ酸、セレノシスチン、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む前記分子は式（ＩＶ）：
Figure 2021525259
 で定義され、
式中、
Ｎtermは前記ポリペプチドのＮ末端であり；
Ｃtermは前記ポリペプチドのＣ末端であり；
ＡＡはアミノ酸であり；
Ｎは整数であり；
（ＡＡ）nはアミノ酸モノマーをｎ数含むポリペプチドを表し；
ＤＧは、チオレートとセレノエートから選択される置換可能な基であり；
Figure 2021525259
 は、システイン、シスチン、チオール誘導体化アミノ酸、ジスルフィド誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノール誘導体化アミノ酸、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択されるライゲーション部位のチオール、ジスルフィド、セレノールまたはジセレニド官能化アミノ酸残基である。
エステルは、好ましくは「反応性エステル」である。反応性エステルはチオール添加剤またはセレノール添加剤の非存在下で分子中の末端アミノ酸と反応することができ、律速エステル交換工程を促進する。好ましくは、反応性エステルは、トリフルオロエチルチオエステル、４−メルカプトフェニル酢酸チオエステル、メルカプトエチルスルホネートチオエステル、メチルチオグリコール酸チオエステル、チオフェニルチオエステル、ベンジルメルカプタンチオエステル、フェニルセレノエステル、および４−セレノフェニル酢酸セレノエステルからなる群より選択される。好ましくは、エステルが反応性エステルである場合、反応はチオール添加剤またはセレノール添加剤の非存在下で行われる。
別の実施形態では、エステルが反応性の低いエステルであってもよい。エステルをチオール添加剤またはセレノール添加剤と反応させることによって、エステルを反応性エステルに変換することができる。反応性の低いエステルの例としては、エチル３−メルカプトプロピオン酸チオエステル、還元型Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）チオエステル、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）チオエステル、メルカプトプロピオン酸−ロイシンチオエステル、ｔｅｒｔ−ブチルチオールチオエステル、メルカプトプロパノイルグリシンチオエステル、セレノアセトアミドセレノエステル、セレノプロピオン酸−イソロイシンセレノエステル、および（９−フルオレニルメチル）セレノエステルがあげられる。この実施形態では、反応がチオール添加剤またはセレノール添加剤の存在下で行われる。一実施形態では、エステルはチオエステルであり、反応はチオール添加剤またはセレノール添加剤の存在下で行われる。好ましくは、チオール添加剤は、トリフルオロエタンチオール、４−メルカプトフェニル酢酸、メルカプトエチルスルホネート、チオグリコール酸メチル、チオフェノール、およびベンジルメルカプタンからなる群より選択される。好ましくは、セレノール添加剤はアリールセレノール、より好ましくはフェニルセレノールまたは４−セレノフェニル酢酸である。
別の実施形態では、エステルはセレノエステルであり、反応はセレノール添加剤の存在下で行われる。好ましくは、セレノール添加剤はアリールセレノール、より好ましくはフェニルセレノールまたは４−セレノフェニル酢酸である。
好ましくは、反応は水溶液中で行われる。
一実施形態では、反応が第１の求核剤の存在下で行われる。第１の求核剤は、ライゲーション反応の速度を加速することができる。好ましくは、第１の求核剤はイミダゾールを含む。より好ましくは、第１の求核剤は２−メチルイミダゾール、イミダゾールおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
一実施形態では、第２の求核剤を使用して、アミド含有化合物とエステルとの間に形成される生成物エステルをチオリシス分解、アミノリシス分解、加水分解またはヒドラジン分解することができる。好ましい実施形態において、第２の求核剤は、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、システイン、イミダゾール、アミン、水酸化物イオン、ヒドラジン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、第２の求核剤はＧＳＨである。好ましくは、第２の求核剤がライゲーション反応の完了後にライゲーション反応混合物に添加される。
反応は、約５ｍＭ〜約２０ｍＭの末端アミノ酸を含む分子の濃度を使用して実施され得る。別の実施形態において、反応は、約１ｍＭ未満、好ましくは約５００μＭ未満、より好ましくは約１００μＭ未満、より好ましくは約５０μＭ未満の末端アミノ酸を含む分子の濃度を使用して、高希釈で行われ得る。好ましくは、反応は少なくとも約１．２モル相当量、より好ましくは約２モル相当量のエステルを含む。
１つの実施形態において、該方法は、アミド含有化合物をフローで脱硫または脱セレン化する工程をさらに含む。
好ましい実施形態において、
Figure 2021525259
 が、システイン、シスチン、チオール誘導体化アミノ酸、およびジスルフィド誘導体化アミノ酸からなる群より選択されるライゲーション部位におけるチオールまたはジスルフィド官能化アミノ酸残基である場合、本方法は、アミド含有化合物をフローで脱硫する工程をさらに含む。好ましくは、脱硫がホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に暴露することを含む。
別の好ましい実施形態では、
Figure 2021525259
 が、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノール誘導体化アミノ酸、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択されるライゲーション部位におけるセレノールまたはジセレニド官能化アミノ酸残基である場合、本方法はアミド含有化合物をフローで脱セレン化する工程をさらに含む。好ましくは、この脱セレン化がホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に曝露することを含む。
本発明の別の態様では、チオール基またはジスルフィド基を含むアミド含有化合物のフローでの脱硫方法が提供される。好ましくは、アミド含有化合物がネイティブケミカルライゲーション反応の反応生成物である。好ましくは、脱硫はホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に暴露することを含む。
本発明のさらに別の態様では、セレノール基またはジセレニド基を含むアミド含有化合物をフローで脱セレン化する方法が提供される。好ましくは、アミド含有化合物がネイティブケミカルライゲーション反応の反応生成物である。好ましくは、脱セレン化はホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に曝露することを含む。
本発明の本発明の別の態様では、チオール基またはジスルフィド基を含むアミド含有化合物を脱硫する方法であって、ホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に暴露することを含む方法が提供される。この方法は、バッチまたはフローで実施することができる。
本発明のさらに別の態様では、セレノール基またはジセレニド基を含むアミド含有化合物を脱セレン化する方法であって、ホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に曝露することを含む方法が提供される。この方法は、バッチまたはフローで実施することができる。
ホスフィンは、好ましくは水溶性である。好ましくは、ホスフィン源はＴＣＥＰである。
別の好ましい実施形態では、脱硫または脱セレン化が水素原子源をさらに含む。好ましくは、水素原子源は、還元型Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｔｅｒｔ−ブチルチオール、システイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。より好ましくは、水素原子源はＧＳＨである。
別の好ましい実施形態において、脱硫または脱セレン化は、化学ラジカル開始剤の非存在下で行われる。
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって調製されるアミド含有化合物に関する。本発明はまた、本明細書中に記載される方法によって調製される脱硫または脱セレン化アミド含有化合物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、
（ｉ）エステルを、
（ｉｉ）システイン、シスチン、チオール誘導体化アミノ酸、ジスルフィド誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノール誘導体化アミノ酸、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む分子と
場合によりラジカルスカベンジャーを含む、還元剤の存在下で反応させる工程を含み、
前記エステルはチオエステルまたはセレノエステルであり、
前記分子の濃度は、約１ｍＭ未満である、
バッチでアミド含有化合物を製造する方法に関する。
この実施形態の好ましい形態において、末端アミノ酸を含む分子の濃度は、約５００μＭ未満、より好ましくは約１００μＭ未満、より好ましくは約５０μＭ未満である。
好ましくは、反応は少なくとも約１．２モル相当量、より好ましくは約２モル相当量のエステルを含む。
この実施形態の好ましい形態では、還元剤がチオール基含有還元剤、セレノール基含有還元剤、ホスフィン基含有還元剤、またはそれらの組み合わせを含む群から選択されていてもよい。チオール基含有還元剤の例としては、ＭＰＡＡ（４−メルカプトフェニル酢酸）、チオフェノール、ＴＦＥＴ（２，２，２−トリフルオロエタンチオール）、メチルチオグリコール酸メチル、ベンジルメルカプタン、およびＭＥＳＮａ（２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム）が挙げられるが、これらに限定されない。セレノール基含有還元剤の例としては、フェニルセレノール、４−セレノフェニル酢酸、およびメチルセレノールが挙げられるが、これらに限定されない。ホスフィン基含有還元剤の例としては、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、トリブチルホスフィンおよびＴＨＰＰ（トリス（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン）が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、還元剤は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、グルタチオン、ＮａＢＨ4、ＮａＨＢＨ3ＣＮ、およびアスコルビン酸から選択されてもよい。別の実施形態では、還元剤が電気化学的還元剤などの非化学的還元剤であってもよい。
一実施形態では、ラジカルスカベンジャーがアリールセレノールおよびジセレニド、より具体的にはフェニルセレノール、ジフェニルジセレニド、および４−セレノフェニル酢酸；アリールチオール、より具体的にはＭＰＡＡおよびチオフェノール；より具体的にはアスコルビン酸、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン、テトラヒドロキシ−１，４−ベンゾキノン、フェニルＮ−ｔ−ブチルニトロン、２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル、およびナリンゲニンを含む群から選択されていてもよい。
本明細書で使用されるように、文脈がさもなければ必要とする場合を除き、「含む」、「含む」、および「含む」などの用語「含む」およびその変換体は、さらなる添加剤、成分、整数または工程を除外することを意図しない。
本発明のさらなる態様、および前の段落で説明された態様のさらなる実施形態は、例として与えられている以下の明細書から、および添付の図面を参照して、明らかになるであろう。
ネイティブケミカルライゲーション脱硫。Ａ）チオール添加剤によるトランスチオエステル化；Ｂ）２つの反応ペプチド断片間のトランスチオエステル化；Ｃ）チオエステル中間体の分子内Ｓ→Ｎアシルシフト；Ｄ）ライゲーション接合部でのＣｙｓのＡｌａへの脱硫。 モデルペプチド１とモデルペプチドチオエステル２、３、４および５との間のネイティブケミカルライゲーションの概略図。 （上）フローシンボルの説明が付いているＮＣＬ最適化実験を実行するために使用されるフロー回路図。（下）フロー実験を実施するために使用される物理的フロー装置：ｉ）ＦｌｏｗＣｏｍｍａｎｄｅｒソフトウェアとのコンピュータインターフェース；ｉｉ）手動制御のためのアナログボタン；ｉｉｉ）システムパラメータの視覚的モニターを有するマスターコントロールダイヤル；ｉｖ）システム溶媒リザーバー；ｖ）ピストンポンプ；ｖｉ）６バルブレオダイン；ｖｉｉｉ）Ｔ接合部；ｉｘ）加熱反応器モジュール；ｘ）背圧調節器；ｘｉ）収集容器；ｘｉｉ）蠕動ポンプ；ｘｉｉｉ）Ｒａｙｏｎｅｔ ＲＰＲ−１００光反応器。 Ａ）ペプチド１とチオエステル２と３との間のフローＮＣＬ；Ｂ）モデルペプチド１とトリフルオロエチルチオエステル４と５との間のフローＮＣＬ；Ｃ）ペプチド１とペプチドチオエステル５との間の反応のための最適化されたＮＣＬフローシステムの概略図。 Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １およびＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ２のライゲーション：Ａ）チオール添加剤を用いないか、またはＭＥＳＮａ（５００ｍＭ）を用いて；Ｂ）ＭＰＡＡ（２５０ｍＭ）を用いて；Ｃ）ＴＦＥＴ（２５０ｍＭ）を用いて；およびＤ）バッチおよびフローで、１０分後のＴＦＥＴ−添加剤ライゲーションのＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたる０〜３０％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。ピーク１：Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2、ピーク６：Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2、ピーク２：Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ、ピーク４：Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3。ライゲーション率は、λ＝２８０ｎｍでの分析用ＵＰＬＣクロマトグラムからのピークを積分することによって計算した。エラーバーは、３つの独立した実験から計算された平均の上下１標準偏差を表す。 Ａ）添加剤として２．５Ｍ ２−ＭＩＭを含むまたは含まない異なる当量のチオエステルを用いた、Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １とＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ２またはＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ４との間のライゲーションのキネティクス。Ｂ）０〜１２分にわたる、図６Ａからのキネティクスデータの拡大区画。Ｃ）添加剤として２．５Ｍ ２−ＭＩＭを含むまたは含まない、Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ３またはＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ５との間のライゲーションのキネティクス。Ｄ）０〜７０分にわたる、図６Ｃからのキネティクスデータの拡大区画。ライゲーション率は、λ＝２８０ｎｍでの分析用ＵＰＬＣクロマトグラムからのピークを積分することによって計算した。エラーバーは、３つの独立した実験から計算された平均の上下１標準偏差を表す。 Ａ）バッチ（青色）およびフロー（赤色）において０．７５μｍｏｌスケールで、バッチ（緑色）において２０μｍｏｌスケールでの７を生成する、添加剤として２−ＭＩＭ（２．５Ｍ）を用いた、ペプチド１とペプチドトリフルオロエチルチオエステル５との反応、ならびに、バッチ（黒色）で外部添加剤としてＴＦＥＴを用いた、２０μｍｏｌスケールでの、７を生成する１と３との反応。Ｂ）１〜５の間の最適化されたフローライゲーションからの粗溶離液のＵＰＬＣ（勾配：５分間にわたり０〜２８％Ｂ、λ＝２１４ｎｍ）＊ピークは、ヒドラジンでクエンチした後の５のアシルヒドラジド誘導体に対応し；＃ピークは加水分解された５に対応する。 Ａ）高希釈でのフローＮＣＬの実験設定の概略図。Ｂ）バッチおよびフローでのＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（０．５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ４（２当量、１．０ｍＭ）との間のライゲーション速度。Ｃ）バッチおよびフローでのＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（０．０５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ４（２当量、０．１０ｍＭ）と間のライゲーション速度。ライゲーション率は、λ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムピークを積分することによって計算される。 Ｃｙｓ含有ペプチド１、６および７の脱硫の一般的スキーム。 フローマニホールド内で標準脱硫を行うために使用されるフローシステム。 ＶＡ−０４４を用いて紫外線を照射せずに化学的に脱硫を開始した場合の、バッチでの１、６、７、およびフローでの１の脱硫速度 ＶＡ−０４４および紫外線照射による１の光脱硫の一般的なスキーム。 ＶＡ−０４４の非存在下でのＵＶ光照射による１、６および７の光脱硫のための一般的スキーム。 ペプチド１、６および７の光脱硫を実施するために使用されるフローシステム。 Ｒａｙｏｎｅｔ ＲＰＲ−１００ＵＶ光反応器（３５Ｗ、室温）内の種々の波長の紫外線照射での２０ｍＭ ＶＡ−０４４の存在下でのＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １の脱硫のフローでのキネティクス。脱硫率は、λ＝２８０ｎｍでの分析用ＵＰＬＣクロマトグラムのピーク積分によって計算した。 ４０ｍＭ ＧＳＨ、２００ｍＭＴＣＥＰを使用し、ＶＡ−０４４の非存在下で、λ＝２５４ｎｍ、３０２ｎｍ、および３６５ｎｍ（３５Ｗ、室温）の紫外線照射下で実行した脱硫実験Ａ）１５０μＬスケールでスキームＳ７に示すフローシステムにおけるキネティクス；Ｂ）０．２５分後に２５４ｎｍで実施したＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １のＨ−ＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ８へ光脱硫の粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０、５分間にわたり０〜１５％Ｂ、０．１％ＴＥＡ）；Ｃ）１５０μＬスケールでのキネティクス；Ｄ）０．２５分後および４．０分後にバッチで行った、Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １のＨ−ＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ８への光脱硫の粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０、５分間にわたり０〜１５％Ｂ、０．１％ＴＥＡ）。４．０分後、複数の同定されていないピークが、所望の生成物と一緒に観察された。脱硫率は、λ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムピークを積分することから計算した。エラーバーは、３つの独立した実験から計算された平均の上下１標準偏差を表す。挿入ＭＳデータを、ＵＰＬＣ−ＭＳクロマトグラム中の標的ペプチドＵＶピーク全体にわたって収集した。 Ａ）新規ペプチド光脱硫；Ｂ）１〜８（５分間にわたり０〜１５％Ｂ、λ＝２１４ｎｍ）およびＣ）７〜１０（５分間にわたり０〜２８％Ｂ、λ＝２１４ｎｍ）の粗光脱硫反応のためのＵＰＬＣクロマトグラム。 チオリシスに最適化された条件を用いたフローでの汎用の光脱硫スキーム。 Ａ）スキームＳ１２に示すフローシステムを用いた、Ｈ−ＣＳＰＭＹＳ−ＮＨ2 Ｓ６のＨ−ＡＳＰＭＹＳ−ＮＨ2 Ｓ７への光脱硫のための反応スキーム。Ｂ）光脱硫反応のキネティクス。脱硫率は、λ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムピークを積分することから計算される。Ｃ）０．５分後の光脱硫の粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分にわたり０〜１５％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。 Ａ）スキームＳ１２に示すフローシステムを用いた、Ｈ−ＣＳＰＣ（Ａｃｍ）ＹＳ−ＮＨ2 Ｓ８のＨ−ＡＳＰＣ（Ａｃｍ）ＹＳ−ＮＨ2 Ｓ９への光脱硫のための反応スキーム。Ｂ）光脱硫反応のキネティクス。脱硫率は、λ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムピークを積分することから計算される。Ｃ）０．５分後の光脱硫の粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分にわたり０〜１５％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。 Ａ）スキームＳ１２に示すフローシステムを用いた、Ｈ−ＰｅｎＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 Ｓ１０からＨ−ＶＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 Ｓ１１への光脱硫のための反応スキーム。Ｂ）１．０分後の光脱硫の粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたり０〜１５％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。 Ａ）スキームＳ１２に示すフローシステムを用いた、Ｈ−（β−ＳＨ）ＤＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 Ｓ１２からＨ−ＤＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 Ｓ１３への光脱硫のための反応スキーム。Ｂ）０．５分後の光脱硫の粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分にわたり０〜１５％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。 Ａ）フローでのライゲーション−光脱硫手順のためのセットアップ。１と、Ｂ）アラニンチオエステル４との間で行って９（全反応時間５分）を生成し、Ｃ）バリンチオエステル５との間で行って１０（全反応時間１８分）を生成するライゲーション−光脱硫手順の粗ＵＰＬＣトレース（勾配：５分間にわたり０〜２８％Ｂ、λ＝２８０ｎｍ）。＊ピークは４および５のＧＳＨチオエステルに相当する。 異なる添加条件下でのバリン生成物チオエステルＳ３のチオリシスおよびヒドラジン分解の速度。 ライゲーション中の生成物チオエステル種の形成。 Ｓ３およびＳ４のチオリシスおよびヒドラジン分解の一般的スキーム。 生成物チオエステルＳ３およびＳ４のチオリシス速度を調べるためにフローでライゲーション−光脱硫を実施するために使用されるフローシステム。 Ａ）異なる添加条件下での１の光脱硫のためのスキーム；およびＢ）異なる添加条件下での１の光脱硫の速度（生成物チオエステルのチオリシスのために使用される）。脱硫率は、λ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムピークを積分することから計算した。 Ａ）Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １からＨ−ＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ８への光脱硫キネティクス；Ｂ）０．２５分後の関連するＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ，５分間にわたり０〜１５％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）、Ｃ）Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ６からＡｃ−ＬＹＲＡＮＡＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ９への光脱硫キネティクス；Ｄ）１．５分後の関連するＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたり０〜２８％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。Ｅ）Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ７からＡｃ−ＬＹＲＡＮＶＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １０への光脱硫キネティクス；Ｅ）１．５分後の関連するＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたり０〜２８％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。脱硫率は、λ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムピークを積分することから計算される。エラーバーは、３つの独立した実験から計算された平均の上下の単一の標準偏差を表す。 Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １からＨ−ＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ８への、Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ６からＡｃ−ＬＹＲＡＮＡＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ９への、およびＡｃ−ＬＹＲＡＮＶＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ７からＡｃ−ＬＹＲＡＮＶＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １０への、いずれかの標準ＶＡ−０４４（２０ｍＭ）開始条件下、またはλ＝２５４ｎｍ、３５Ｗでの光照射条件下での光脱硫のキネティクス。脱硫率は、λ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムピークを積分することから計算される。エラーバーは、３つの独立した実験から計算された平均の上下の単一の標準偏差を表す。 Ａ）使用した新規光脱硫プロトコルのスキーム；Ｂ）バッチで２０μｍｏｌスケールでの６および７の光脱硫のためのキネティクス；Ｃ）所望の生成物Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ９、およびチオエステルＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ４に由来するグルタチオンチオエステルＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＧＳＨ４＊を示す、アラニンにおけるフローでのインラインライゲーション−光脱硫のための粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたり０〜２８％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。Ｄ）所望の生成物Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １０およびチオエステルＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ５に由来するグルタチオンチオエステルＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＧＳＨ５＊を示す、バリンにおけるフローでのインラインライゲーション−光硫化のための粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたり０〜２８％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。脱硫率は、λ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムピークを積分することから計算される。挿入ＭＳデータを、ＵＰＬＣ−ＭＳクロマトグラム中の標的ペプチドＵＶピーク全体にわたって収集した。 ネイティブケミカルライゲーションは、添加剤としてペプチドトリフルオロエチルチオエステル４および５ならびに２．５Ｍ ２−ＭＩＭを用いて、バッチおよびフローにおいて０．７５μｍｏｌスケールで、およびバッチにおいて２０μｍｏｌスケールで行った。キネティクスは、Ａ）アラニン接合部、およびＢ）バリン接合部でモニターした。Ｃ）所望の生成物Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ６ならびにペプチドアシルヒドラジドＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＮＨＮＨ2 ４＊（ヒドラジン水和物を添加して反応をクエンチした際にＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ４から形成される）への変換を示す、バッチおよびフローの両方における０．７５μｍｏｌスケールでのアラニンでのライゲーションのための粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたり０〜２８％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。Ｄ）所望の生成物Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ７ならびにペプチドアシルヒドラジドＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＮＨＮＨ2 ５＊（ヒドラジン水和物を添加して反応をクエンチした際にＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ５から形成される）への変換を示す、バッチおよびフローの両方における０．７５μｍｏｌスケールのバリンでのライゲーションのための粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたる０〜２８％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。挿入ＭＳデータを、ＵＰＬＣ−ＭＳクロマトグラム中の標的ペプチドＵＶピーク全体にわたって収集した。 Ａ）アラニンおよびＢ）バリンで２０μｍｏｌスケールで添加剤としてＴＦＥＴとエチル３−メルカプトプロピオネートチオエステルとを用いたネイティブケミカルライゲーションのキネティクス；Ｃ）所望のライゲーション生成物Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ６、その側にペプチドアシルヒドラジドＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＮＨＮＨ2 ２＊（ヒドラジン水和物を添加して反応をクエンチした際にＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ２から形成される）および加水分解生成物Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＯＨ２＊＊を示す、アラニンでのライゲーションのための粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたり０〜２８％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。Ｄ）所望のライゲーション生成物Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ７、その側にペプチドアシルヒドラジドＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＮＨＮＨ2 ３＊（ヒドラジン水和物を加えて反応をクエンチした際にＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ３から形成される）、加水分解生成物Ａｃ ＬＹＲＡＮＶ−ＯＨ３＊＊、および未反応のＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １を示す、バリンでのライゲーションのための粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたり０〜２８％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。挿入ＭＳデータを、ＵＰＬＣ−ＭＳクロマトグラム中の標的ペプチドＵＶピーク全体にわたって収集する。 外部添加剤6としてＴＦＥＴとエチル３−メルカプトプロピオネートチオエステルとを用いて、以前に報告されたバッチ条件を使用してＮＣＬを実施するための反応スキーム。 ワンポット脱硫を、ＶＡ−０４４を用いて標準条件下で行った。Ａ）用いた標準的な脱硫技術のためのスキーム；Ｂ）アラニンおよびバリンのバッチでの脱硫のキネティクス；Ｃ）所望の生成物Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 ９、その側に未反応のＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ２、および加水分解されたペプチド遊離酸Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＯＨとグルタチオンチオエステルＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＧＳＨとの混合物２＊を示す、６の脱硫のための粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたり０〜２８％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）；Ｄ）所望の生成物Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １０、その側に未反応のＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ３，加水分解されたペプチド遊離酸Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＯＨとグルタチオンチオエステルＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＧＳＨとの混合物３＊およびＨ−ＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2８を示す、７の脱硫のための粗ＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたり０〜２８％Ｂ、０．１％ＴＦＡ） エンフビルチド１３の合成に使用したフローシステム。 Ａ）エンフビルチド１３のフロー合成のための合成スキーム。Ｂ）ライゲーション−光脱硫溶液の粗ＵＰＬＣトレース（λ＝２１４ｎｍ、５分間にわたり０〜７０％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。１１の＊ＧＳＨチオエステルＣ）精製ペプチドのＵＰＬＣトレース（λ＝２１４ｎｍ、５分間にわたり０〜７０％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。Ｄ）精製生成物のＥＳＩ−ＭＳ。Ｅ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：計算質量値Ｃ204Ｈ302Ｎ51Ｏ64＋［Ｍ＋Ｈ］+：４４９２．２００，Ｃ204Ｈ301Ｎ51Ｏ64Ｎａ+［Ｍ＋Ｎａ］+：４５１４．１９０；質量実測値；４４９２．２９３［Ｍ＋Ｈ］+，４５１４．２７４［Ｍ＋Ｎａ］+。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータは、ＴＡ３０（０．１％ＴＦＡを含有する３０％アセトニトリル／７０％Ｈ2Ｏ）中の飽和αシアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸のマトリックスを使用する一般的な合成手順の下で概説されるように得られた。 ソマトレリン１６の合成に使用されるフローシステム。 Ａ）ソマトレリン１６のフロー合成のための合成スキーム。Ｂ）ライゲーション−光脱硫溶液の粗ＵＰＬＣトレース（λ＝２１４ｎｍ、５分間にわたり０〜７０％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。１４＊：１４のグルタチオンチオエステル；１４＃：加水分解１４；１４＾：１４のラクタムＣ）精製ペプチドのＵＰＬＣトレース（λ＝２１４ｎｍ、５分間にわたり０〜７０％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。Ｄ）精製生成物のＥＳＩ−ＭＳ。Ｅ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：計算質量値Ｃ215Ｈ359Ｎ72Ｏ66Ｓ+［Ｍ＋Ｈ］+：５０３９．６７２、Ｃ204Ｈ360Ｎ72Ｏ66Ｓ2+［Ｍ＋２Ｈ］2+：２５２０．３４０；質量実測値；５０３９．５９８［Ｍ＋Ｈ］+，２５１８．３１３［Ｍ＋２Ｈ］2+。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータは、２’，４’，６’−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）／クエン酸水素二アンモニウム（５００μＬのＴＡ３０中１８ｍｇ／７ｍｇ）のマトリックスを用いて、一般的な合成手順に概説されるように得た。 Ａ）Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５との間のフローＮＣＬを実施するために使用される実験設定の概略図。Ｂ）バッチでのｐＨ６．２およびｐＨ７．０におけるＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５（２．０当量、１０ｍＭ）との間のライゲーションキネティクス。Ｃ）フローでのｐＨ６．２およびｐＨ７．０におけるＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５（２．０当量，１０ｍＭ）と間のライゲーションキネティクス。Ｄ）バッチでのｐＨ７．０におけるＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５（１．２５当量，１．５当量，２．０当量）との間のライゲーションキネティクス。Ｅ）フローでのｐＨ７．０におけるＨ‐ＣＳＰＧＹＳ‐ＮＨ2 １（５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５（１．５当量、２．０当量）間のライゲーションキネティクス。ライゲーション率は、λ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムピークを積分することによって計算される。 ワンポットジセレニド−セレノエステルライゲーション−脱セレン化法のスキーム。 Ａ）インラインフロージセレニド−セレノエステルライゲーション−脱セレン化に使用される実験セットアップの概略図。Ｂ）Ｓ１４のモノマーに対して２当量または２０当量のいずれかのＴＣＥＰを用いた種々の時点での脱セレン化率。脱セレン化率は、λ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムピークを積分することによって計算される。Ｃ）２．２分の脱セレン化後の２０当量のＴＣＥＰを使用するインラインフロー手順からの粗反応混合物のＵＰＬＣクロマトグラム（λ＝２８０ｎｍ、５分間にわたり０〜２８％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）。 希釈時のインラインフロージセレニド−セレノエステルライゲーションに使用した実験セットアップの概略図。 特定のジセレニド濃度での、種々のフロー滞留時間での還元性ＤＳＬのライゲーション率。ライゲーション率は、λ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムピークを積分することによって計算される。 Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（１、配列番号１）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ）。 Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ（２、配列番号２）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ（３、配列番号３）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3（４、配列番号４）の1Ｈ｛19Ｆ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3（４、配列番号４）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，１２６ＭＨｚ） Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3（４、配列番号４）の19Ｆ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，４７１ＭＨｚ） Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳＣＨ2ＣＦ3（５、配列番号５）の1Ｈ｛19Ｆ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳＣＨ2ＣＦ3（５、配列番号５）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，１２６ＭＨｚ） Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳＣＨ2ＣＦ3（５、配列番号５）の19Ｆ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，４７１ＭＨｚ） Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（６、配列番号６）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（７、配列番号７）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ｈ−ＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（８、配列番号８）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，４００ＭＨｚ） Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（９、配列番号９）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（１０、配列番号１０）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） エンフビルチド（１−１８）（１１、配列番号１１）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（９５％ ｄ6−ＤＭＳＯ＋５％ Ｄ2Ｏ，８００ＭＨｚ） エンフビルチド（１−１８）（１１、配列番号１１）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（９５％ ｄ6−ＤＭＳＯ＋５％ Ｄ2Ｏ，２０１ＭＨｚ） エンフビルチド（１−１８）（１１、配列番号１１）の19Ｆ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（９５％ ｄ6−ＤＭＳＯ＋５％ Ｄ2Ｏ，３７６ＭＨｚ） エンフビルチド（１９−３６）（１２、配列番号１２）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（９５％ ｄ6−ＤＭＳＯ＋５％ Ｄ2Ｏ，８００ＭＨｚ） エンフビルチド（１３、配列番号１３）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（９５％ ｄ6−ＤＭＳＯ ５％ Ｄ2Ｏ，８００ ＭＨｚ） エンフビルチド（１３、配列番号１３）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（９５％ ｄ6−ＤＭＳＯ＋５％ Ｄ2Ｏ，２０１ＭＨｚ） ソマトレリン（１−１８）（１４、配列番号１４）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，８００ＭＨｚ） ソマトレリン（１−１８）（１４、配列番号１４）の19Ｆ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，４７１ＭＨｚ） ソマトレリン（１９−４４）（１５、配列番号１５）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，８００ＭＨｚ） ソマトレリン（１９−４４）（１５、配列番号１５）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，２０１ＭＨｚ） ソマトレリン（１６、配列番号１６）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，８００ＭＨｚ） ソマトレリン（１６、配列番号１６）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，２０１ＭＨｚ） Ｈ−ＣＳＰＭＹＳ−ＮＨ2（Ｓ６、配列番号１８）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ｈ−ＣＳＰＭＹＳ−ＮＨ2（Ｓ６、配列番号１８）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，１２６ＭＨｚ） Ｈ−ＡＳＰＭＹＳ−ＮＨ2（Ｓ７、配列番号１９）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ｈ−ＡＳＰＭＹＳ−ＮＨ2（Ｓ７、配列番号１９）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，１２６ＭＨｚ） Ｈ−ＣＳＰＣ（Ａｃｍ）ＹＳ−ＮＨ2（Ｓ８、配列番号２０）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ｈ−ＣＳＰＣ（Ａｃｍ）ＹＳ−ＮＨ2（Ｓ８、配列番号２０）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，１２６ＭＨｚ） Ｈ−ＡＳＰＣ（Ａｃｍ）ＹＳ−ＮＨ2（Ｓ９、配列番号２１）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ｈ−ＡＳＰＣ（Ａｃｍ）ＹＳ−ＮＨ2（Ｓ９、配列番号２１）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，１２６ＭＨｚ） Ｈ−ＰｅｎＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（Ｓ１０、配列番号２２）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ｈ−ＰｅｎＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（Ｓ１０、配列番号２２）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，１２６ＭＨｚ） Ｈ−ＶＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（Ｓ１１、配列番号２３）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ｈ−ＶＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（Ｓ１１、配列番号２３）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，１２６ＭＨｚ） Ｈ−（β−ＳＨ）ＤＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（Ｓ１２、配列番号２４）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ｈ−（β−ＳＨ）ＤＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（Ｓ１２、配列番号２４）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，１２６ＭＨｚ） Ｈ−ＤＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（Ｓ１３、配列番号２５）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） Ｈ−ＤＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（Ｓ１３、配列番号２５）の13Ｃ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，１２６ＭＨｚ） トリフルオロ酢酸の1Ｈ｛19Ｆ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） トリフルオロ酢酸の19Ｆ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，４７１ＭＨｚ） トリフルオロエタンチオールの1Ｈ｛19Ｆ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ） トリフルオロエタンチオールの19Ｆ｛1Ｈ｝−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，４７１ＭＨｚ） Ｈ−ＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2とＡｃ−ＬＹＲＡＮＦ−ＳｅＰｈとの間のバッチジセレニド−セレノエステルライゲーション（ＤＳＬ）と、それに続く中間精製なしのワンポットフロー脱セレン化の概略図。 還元的ジセレニド−セレノエステルライゲーションのための反応スキーム。 Ａ）様々なモノマー濃度の（Ｈ−ＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2 Ｓ１４（配列番号２６）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５（配列番号２７）（モノマーに対して２当量）との間のバッチでのライゲーションのキネティクスデータ。Ｂ）０〜１７分の反応時間についてのキネティクスデータの拡大図。５ｍＭおよび５００μＭの濃度についてλ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムピークを積分することから、ライゲーション率を計算した。５０μＭ濃度については、２８０ｎｍの励起波長を用いて、ＦＬＲディテクターを用いたＨＰＬＣによってライゲーションをモニターした。エラーバーは、３つの独立した実験から計算された平均の上下１標準偏差を表す。
本明細書で別段の定義がない限り、本願して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。また、文脈によって特に必要とされない限り、単数の用語は複数を含むものとし、複数の用語は、単数を含むものとする。したがって、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は複数のタンパク質を含み、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞の集団を含む。
本明細書において、「添加剤」という用語は、外部供給源から、別に反応混合物に添加される、反応を促進するための、および／または副反応を防止するための任意の手段を指す。反応混合物は試薬を含有する。反応混合物は溶媒を含むことができる。当業者は、溶媒が水溶液を含み得ることを理解するのであろう。水溶液は、緩衝塩および変性剤を含み得る。例として、添加剤は、反応混合物に添加される外因性分子を指すことができる。添加剤はまた、電気化学的還元において必要とされるような電子の添加を指してもよい。添加剤のいくつかの非限定的な例は、求核剤および還元剤である。説明のために、ＮＣＬにおいて伝統的に使用されてきたいくつかのチオール基含有還元剤は、ＭＰＡＡ、チオフェノール、トリフルオロエタンチオール（ＴＦＥＴ）、チオグリコール酸メチル、ベンジルメルカプタンおよびＭＥＳＮａである。本明細書中に開示されるライゲーション反応に使用され得る還元剤としてはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、ＴＨＰＰ（トリス（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、ＮａＢＨ4、ＮａＨＢＨ3ＣＮおよびアスコルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、チオール系またはセレノール系求核剤または還元剤、および／またはイミダゾール系求核剤を使用してもよい。本明細書中に開示される方法は特に明記しない限り、添加剤の非存在下で実施され得る。
本明細書の文脈において、「チオール添加剤」とはチオール系添加剤またはジスルフィド系添加剤をいい、「セレノール添加剤」とはセレノール系添加剤またはジセレニド系添加剤をいう。「チオール添加剤」および「セレノール添加剤」がライゲーション反応における律速エステル交換工程を促進することができる。「チオール添加剤」または「セレノール添加剤」が反応性の低いエステルを反応性エステルに変換するために使用される。具体的には「チオール添加剤」が反応性の低いチオエステルを反応性チオエステルに変換するために使用され、「セレノール添加剤」は反応性の低いチオエステルを反応性セレノエステルに、または反応性の低いセレノエステルを反応性セレノエステルに変換するために使用される。チオール添加剤の例としてはトリフルオロエタンチオール（ＴＦＥＴ）、４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、メルカプトエチルスルホネート、チオグリコール酸メチル、チオフェノール、およびベンジルメルカプタンが挙げられるが、これらに限定されない。セレノール添加剤の例としては、アリールセレノール、より具体的にはフェニルセレノールまたは４−セレノフェニル酢酸が含まれる。
本明細書において、「アミノ酸」とはアミノ基とカルボキシ基の両方を含む分子をいう。例えば、αアミノ酸には、アミノ基とカルボキシル基の両方を有する炭素原子に直接結合した「αアミノ基」と、アミノ基とカルボキシル基の両方を有する炭素原子に直接結合した「αカルボキシル基」がある。「カルボキシル」という用語はＣＯＯＨ基または−ＣＯＯ−基のいずれかをいう。αアミノ酸はＨ2Ｎ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨの一般型（式中、Ｒは側鎖またはＨ）である。側鎖は一般的にアルキル鎖であり、これは置換されていてもよく、置換は通常遠位端であるが必ずしもそうである必要はない。アミノ酸（またはペプチド）のＮ末端はアミン官能基（任意にイオン化または置換／保護されていてもよい）が位置する末端であり、Ｃ末端は、カルボキシル官能基（任意にイオン化または置換/保護されていてもよい）が位置する末端である。
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」はアミド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸残基を含む（またはからなる）鎖をいう。それらはジペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質などであり得る。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は本明細書中で交換可能に使用され、ペプチド結合を介して共有結合で連結された２つ以上のアミノ酸の分子鎖を含む。これらの用語は、生成物の特定の長さを指すものではない。この用語には、ペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、ビオチン化、４−ペンチノイル化、ＰＥＧ化、リン酸化、硫酸化などが含まれる。さらに、タンパク質断片、類似体、変異または変異体タンパク質、融合タンパク質などは、ポリペプチドの意味に含まれる。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸類似体または非カノニカルまたは非天然アミノ酸が含まれる分子を含む。天然または合成のいずれかのタンパク質が「ペプチド」という用語の範囲内に入ることは理解されるであろう。本発明の文脈において、天然タンパク質およびペプチドは組換え発現タンパク質およびペプチド、例えば酵素、ホルモン、構造タンパク質、輸送タンパク質、シグナルタンパク質、抗原、および抗体を含む。好ましくは「ペプチド」は合成および発現ペプチドおよびタンパク質、例えばセレノタンパク質、システイニルタンパク質、タンパク質ヒドラジド、タンパク質セレノエステル、およびタンパク質チオエステルを含む。さらに、例えば、Ｓｍｉｔｈ， Ｍ． Ｂ． Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ， ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ； Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．： Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ， ２０１３； Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ； Ｃｈａｎ， Ｗ．Ｃ．， Ｗｈｉｔｅ， Ｐ． Ｄ．， Ｅｄｓ．； Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ２０００ （ｃｈａｐｔｅｒ ６， ｐａｇｅｓ １３７−１７８； ｃｈａｐｔｅｒ ９， ｐａｇｅｓ ２１５−２２７， ｃｈａｐｔｅｒ １１， ｐａｇｅｓ ２４３−２６２）； ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）； Ｊｅｎｓｅｎ， Ｋ． Ｊ．， Ｓｈｅｌｔｏｎ， Ｐ． Ｔ．， Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｓ． Ｌ．， Ｅｄｓ．； Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ２０１３ （ｃｈａｐｔｅｒ ８， ｐａｇｅｓ １１９−１３０）で説明されている周知の有機化学技術によって、ペプチドは、本明細書に記載されているように、誘導体化することができる。
「アリール」という用語は単独で、または組み合わせて、１、２、さらには３つの環を含む炭素環式芳香族部分を意味し、このような環は縮合する形式で一緒に結合していてもよい。したがって、「アリール」という用語はフェニル、ナフチル、インデニル、テトラヒドロナフチル、アントラセニル、およびインダニルなどの芳香族基を包含する。前記「アリール」基は低級アルキル、ヒドロキシル、ハロ、ハロアルキル、ニトロ、シアノ、アルコキシ、および低級アルキルアミノなどの１個以上の置換基を有していてもよい。-O-CH2-O−で置換されたフェニルはアリールベンゾジオキソリル置換基を形成する。本明細書で使用されるアリールは、完全に不飽和の環を意味する。
置換可能な「置換可能な基」は一般に、反応の過程の間に分子から置換可能な基をいう。
「脱離基」は一般に、求核剤によって置換可能な基をいう。このような脱離基は、当技術分野で知られている。脱離基の例としてはハロゲン化物（例えば、Ｉ、Ｂｒ、Ｆ、Ｃｌ）、スルホネート（例えば、メシレート、トシレート）、スルフィド（例えば、ＳＣＨ3）、チオレート、セレノエート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「求核剤」は脱離基の付着点で分子を攻撃することができ、脱離基の置換を引き起こす種である。求核剤は、当技術分野で知られている。求核基の例としてはアミン、チオール、アルコール、セレノール、グリニャール試薬、アニオン種（例えば、アルコキシド、アミド、カルバニオン）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書の文脈において、「第１の求核剤」とは、ライゲーション反応の速度を加速する求核剤をいう。好適な第１の求核剤の例としては、イミダゾールが挙げられる。好ましい実施形態において、第１の求核剤は、２-メチルイミダゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。本明細書の文脈において、第１の求核剤は、チオール添加剤またはセレノール添加剤とは区別されるものである。第１の求核剤は、チオールまたはセレノール部分を含むことができる。
明細書の文脈において、「第２の求核剤」とは、アミド含有化合物とエステルとの間に形成された生成物エステルをチオリシス分解、アミノリシス分解、加水分解またはヒドラジン分解するために使用され得る求核剤を意味する。適切な第２の求核剤の例としては還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、システイン、イミダゾール、アミン、水酸化物イオン、ヒドラジン、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。第２の求核剤はライゲーション反応の前、間、または後に、またはそれらの組み合わせで添加されてもよい。したがって、ライゲーション反応は、第２の求核剤の存在下で行ってもよい。あるいはチオリシス分解、アミノリシス分解、加水分解またはヒドラジン分解はライゲーション反応の終了後に行われる追加の工程であってもよい。好ましい態様において、第２の求核剤は、ライゲーション反応の終了後のライゲーション反応混合物に添加される。
チオール添加剤またはセレノール添加剤、第１の求核剤および第２の求核剤は、独立して使用してもよい。一実施形態ではエステルが反応性エステルである場合、反応はチオール添加剤またはセレノール添加剤の非存在下で行われるが、第１の求核剤の存在下で行われる。実施形態のこの形態では、第１の求核剤がチオールまたはセレノール部分を含んでいてもよい。別の実施形態ではエステルが反応性の低いエステルである場合、反応はチオール添加剤またはセレノール添加剤の存在下、および第１の求核剤の存在下で行われる。
第１の求核剤および第２の求核剤は、独立して使用されてもよい。一実施形態では、フローライゲーション法が第２の求核剤ではなく、第１の求核剤を含む。別の実施形態では、フローライゲーション法が第１の求核剤ではなく、第２の求核剤を含む。さらに別の実施形態では、フローライゲーション法が第１の求核剤および第２の求核剤の両方を含む。本明細書中に記載されるペプチドをさらに記載する際に、１文字の略語系はしばしば、天然に存在するペプチドおよびタンパク質に一般に組み込まれる、２０個の「カノニカル」またはタンパク新生アミノ酸残基および２１番目のアミノ酸セレノシステインの同一性を示すために適用される（表１）。このような１文字の略語は、３文字の略語、または非略語のアミノ酸名と、意味において完全に交換可能である。
非カノニカルまたは非タンパク新生性アミノ酸残基は、本明細書中に開示される技術を使用することによって、ペプチドに組み込まれ得る。用語「非カノニカルアミノ酸残基」は、例えば、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、セレノアミノ酸、チオアミノ酸、および誘導体化側鎖を有するアミノ酸（例えば、ＵＳ２０１５／００２３９８８に記載されるもの）などの、天然に存在するタンパク質に一般的に組み込まれる２０個のカノニカルアミノ酸の中にない、Ｄ型またはＬ型のアミノ酸残基をいう。
Figure 2021525259
ＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）によるアミノ酸およびペプチドの命名法および記号は、以下の文献：Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， １９８４， ２１９， ３４５−３７３； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９８４， １３８， ９−３７； １９８５， １５２， １； １９９３， ２１３， ２； Ｉｎｔｅｒｎａｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ．， １９８４， ２４， ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐａｇｅ ８４； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８５， ２６０， １４−４２； Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８４， ５６， ５９５−６２４； Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， １９８５， １６， ３８７−４１０； Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｐｏｒｔｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ， １９９２，３９−６９頁において公表されており、これらはすべてその全体が本明細書中で参照される。
本明細書において上記したように、本開示に従って、記載したペプチドはまた、公知の有機化学技術によって、１つ以上のアミノ酸残基で化学的に誘導体化することができる。「誘導体」または「誘導体化」は、官能性側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ペプチドをいう。このような誘導体化分子は例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成した分子を含む。遊離カルボキシル基は、塩、メチルエステルおよびエチルエステル、または他のタイプのエステルもしくはヒドラジドを形成するように誘導体化されてもよい。遊離の水酸基は、誘導体化されＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成していてもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化してＮ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。また、化学誘導体としては、Ｌ−またはＤ−形態であるかにかかわらず、２０個のカノニカルアミノ酸の１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンに置換してもよく、５−ヒドロキシリジンをリジンに置換してもよく、３−メチルヒスチジンをヒスチジンに置換してもよく、ホモセリンをセリンに置換してもよく、オルニチンをリジンに置換してもよい。
有用な誘導体化には、造影剤、例えば、蛍光色素、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴ造影剤、またはペプチドの潜在的な治療活性に活性が加わる治療薬を結合させるためのＮ末端遊離アミノ基の修飾が含まれる。Ｎ末端はアシル化または置換アミンに修飾することができ、または芳香族部分（例えば、インドール酸、ベンジル（ＢｚｌまたはＢｎ）、ジベンジル（ＤｉＢｚｌまたはＢｎ2）、またはベンジルオキシカルボニル（ＣｂｚまたはＺ））、Ｎ， Ｎ−ジメチルグリシンまたはクレアチンなどの別の官能基で誘導体化することができる。例えば、いくつかの実施形態では、限定されるものではないが、ホルミル、アセチル（Ａｃ）、プロパノイル、ブタニル、ペンタニル、ヘプタニル、ヘキサノイル、オクタノイル、またはノナノイルなどのアシル部分を、ペプチドのＮ末端に共有結合させることができる。他の例示的なＮ末端誘導体基としては−ＮＲＲ1（−ＮＨ2以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ1、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）2Ｒ1、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ1、スクシンイミド、またはベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（Ｃｂｚ−ＮＨ−）が挙げられ、ここで、ＲおよびＲ1はそれぞれ独立して、水素または低級アルキルまたはフェニルであり、フェニル環はＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、クロロ、およびブロモから選択される１〜５置換基で置換されてもよい。
いくつかの実施形態において、アミノ酸残基間の１つ以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］結合（結合）は、非ペプチジル結合によって置換され得る。
例示的な非ペプチジル結合は、−ＣＨ2−カルバメート［−ＣＨ2−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ2−スルホンアミド［−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ−］、チオ尿素［−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ2−二級アミン、およびアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ6（式中、Ｒ6は低級アルキルである）］である。
誘導体化の上記の例は、網羅的な処理であることを意図するものではなく、単に例示的なものである。当業者は例えば、Ｓｍｉｔｈ， Ｍ． Ｂ． ＭａｒｃｈのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ， ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ； Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．： Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ， ２０１３に記載されているような周知の有機化学技術によって、１つ以上の個々のアミノ酸を誘導体化することができること；および種々の誘導体化剤が例えば、Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ； Ｃｈａｎ， Ｗ．Ｃ．， Ｗｈｉｔｅ， Ｐ． Ｄ．， Ｅｄｓ．； Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ２０００； Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）； Ｊｅｎｓｅｎ， Ｋ． に記載されているように選択的な側鎖や末端残基と反応することが知られていることを理解するであろう。
本明細書に開示され、定義された本発明は、本文または図面から言及され、または明らかな個々の特徴の２つ以上の代替的な組合せのすべてに及ぶことが理解されるのであろう。これらの異なる組み合わせの全ては、本発明の様々な代替態様を構成する。
本発明は、
（ｉ）エステルを
（ｉｉ）システイン、シスチン、チオール誘導体化アミノ酸、ジスルフィド誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノール誘導体化アミノ酸、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む分子；
と反応させる工程を含み、
ここで前記エステルはチオエステルまたはセレノエステルである、
フローでのアミド含有化合物の製造方法に関する。
エステルは、エステル官能基を含む分子であってもよい。エステルは、ポリマー（ペプチドを含む）、小分子（治療剤、または蛍光色素、放射性同位体、ＭＲＩ造影剤、もしくはＰＥＴ造影剤などの診断薬を含む）、または抗体から選択することができる。
好ましくは、エステルはペプチドである。
エステルは、好ましくは反応性エステルである。反応性エステルはチオール添加剤またはセレノール添加剤の非存在下で分子中の末端アミノ酸と反応することができ、律速エステル交換工程を加速する。好ましくは、反応性エステルがトリフルオロエチルチオエステル、４−メルカプトフェニル酢酸チオエステル、メルカプトエチルスルホネートチオエステル、メチルチオグリコール酸チオエステル、チオフェニルチオエステル、ベンジルメルカプタンチオエステル、フェニルセレノエステル、および４−セレノフェニル酢酸セレノエステルからなる群より選択される。好ましくはエステルが反応性エステルである場合、反応はチオール添加剤またはセレノール添加剤の非存在下で行われる。
別の実施形態では、エステルが反応性の低いエステルであってもよい。エステルをチオール添加剤またはセレノール添加剤と反応させることによって、エステルを反応性エステルに変換することができる。反応性の低いエステルの例としては、エチル３−メルカプトプロピオン酸チオエステル、還元Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）チオエステル、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）チオエステル、メルカプトプロピオン酸−ロイシンチオエステル、ｔｅｒｔ−ブチル−ブチルチオールチオエステル、メルカプトプロパノイルグリシンチオエステル、セレノアセトアミドセレノエステル、セレノプロピオン酸−イソロイシンセレノエステル、および（９−フルオレニルメチル）セレノエステルが挙げられる。この実施形態では、反応がチオール添加剤またはセレノール添加剤の存在下で行われる。一実施形態では、エステルはチオエステルであり、反応はチオール添加剤またはセレノール添加剤の存在下で行われる。好ましくは、チオール添加剤がトリフルオロエタンチオール、４−メルカプトフェニル酢酸、メルカプトエチルスルホネート、チオグリコール酸メチル、チオフェノール、およびベンジルメルカプタンからなる群より選択される。別の実施形態では、エステルはセレノエステルであり、反応はセレノール添加剤の存在下で行われる。好ましくは、セレノール添加剤はアリールセレノール、より好ましくはフェニルセレノールまたは４−セレノフェニル酢酸である。
システイン、シスチン、チオール誘導体化アミノ酸、ジスルフィド誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノール誘導体化アミノ酸、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む分子は、ポリマー（ペプチドを含む）、小分子（治療剤、または蛍光色素、放射性同位体、ＭＲＩ造影剤、もしくはＰＥＴ造影剤などの診断薬を含む）、または抗体から選択され得る。好ましくは、分子はペプチドである。
チオール官能基を含むアミノ酸は、還元型（システインまたはチオール誘導体化アミノ酸）または酸化形態（シスチンまたはジスルフィド誘導体化アミノ酸）のいずれかであり得ることが理解される。酸化形態では、チオール官能基が酸化チオール官能基を含む第２のアミノ酸とジスルフィド結合を形成し、二量体を形成していてもよい。例えば、分子は式（ＩＶ）の二量体を形成していてもよい：
Figure 2021525259
 式中、ＡＡligはシスチンおよびジスルフィド誘導体化アミノ酸から選択される。
セレノール官能基を含むアミノ酸は、還元型（セレノシステインまたはセレノール誘導体化アミノ酸）または酸化形態（セレノシスチンまたはジセレニド誘導体化アミノ酸）のいずれかであり得ることが理解される。酸化形態では、セレノール官能基が酸化されたセレノール官能基を含む第２のアミノ酸とジセレニド結合を形成し、二量体を形成していてもよい。例えば、分子は式（ＩＶ）の二量体を形成していてもよい：
Figure 2021525259
 式中、ＡＡligはセレノシスチンおよびジセレニド誘導体化アミノ酸から選択される。
アミド含有化合物は、エステルと分子との間のライゲーション反応の生成物である。好ましくは、アミド含有化合物はポリペプチドである。好ましくは、エステルおよび分子が合成および天然ペプチドから独立して選択される。本開示は、天然および非天然ペプチドの合成を意図する。天然ペプチドは、Ｌ立体化学を有する天然に存在するアミノ酸を含む。
非天然ペプチドはＤ立体化学を有するアミノ酸を含む１つ以上の非天然アミノ酸、または診断剤（例えば、蛍光色素、放射性同位体、ＭＲＩ造影剤、またはＰＥＴ造影剤）または治療剤（例えば、薬物、または抗体）を組み込むアミノ酸を含む誘導体化アミノ酸を含むペプチドを含む。非天然ペプチドはまた、アミノ酸残基間の１つ以上のペプチジル結合が非ペプチジル結合によって置換されているペプチドを含む。本発明において使用されるアミノ酸はＬであってもよいし、Ｄであってもよいし、ラセミ体であってもよい。現在記載されている化学は、アミノ酸の立体化学を保存することができる。
特に好ましい実施形態では、ポリペプチドは式（Ｉ）で定義される：
Figure 2021525259
 エステルは式（ＩＩ）で定義される：
Figure 2021525259
 システイン、チオール誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、およびセレノール誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む分子は式（ＩＩＩ）で定義される：
Figure 2021525259
 シスチン、ジスルフィド誘導体化アミノ酸セレノシスチン、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む分子は式（ＩV）で定義される：
Figure 2021525259
式中、
Ｎtermは前記ポリペプチドのＮ末端であり；
Ｃtermは前記ポリペプチドのＣ末端であり；
ＡＡはアミノ酸であり；
Ｎは整数であり；
（ＡＡ）nはアミノ酸モノマーをｎ数含むポリペプチドを表し；
ＤＧは、チオレートとセレノエートから選択される置換可能な基であり；
Figure 2021525259
は、システイン、シスチン、チオール誘導体化アミノ酸、ジスルフィド誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノール誘導体化アミノ酸、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択されるライゲーション部位のチオール、ジスルフィド、セレノールまたはジセレニド官能化アミノ酸残基である。
式（Ｉ）のポリペプチドは、還元型または酸化型のいずれかであり得ることが理解される。還元型では、式（Ｉ）のポリペプチドは単量体である。酸化型では、式（Ｉ）のポリペプチドのＡＡｌｉｇが式（Ｉ）の第２のポリペプチドのＡＡｌｉｇと結合を形成し、二量体を形成していてもよい。
好ましくは、反応が約５ｍＭ〜約２０ｍＭの末端アミノ酸を含む分子の濃度を使用して行われる。別の実施形態において、反応は、約１ｍＭ未満、好ましくは約５００μＭ未満、より好ましくは約１００μＭ未満、より好ましくは約５０μＭ未満の末端アミノ酸を含む分子の濃度を使用して、高希釈で行われ得る。好ましくは、反応が少なくとも約１．２モル相当量、より好ましくは約２モル相当量のエステルを含む。
好ましくは、反応は水溶液中で行われる。水溶液は好ましくはＨＥＰＥＳ、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＭＯＰＳ、およびＴｒｉｓから選択される緩衝液であり、より好ましくはＨＥＰＥＳである。
好ましくは、水溶液は約４〜９、好ましくは約６〜８の範囲のｐＨを有する。
水溶液は、任意選択で変性剤を含むことができる。好ましくは、変性剤は６Ｍ塩酸グアニジンまたは尿素、より好ましくは６Ｍ塩酸グアニジンである。
水溶液は、任意で還元剤を含んでいてもよい。好ましくは、還元剤がトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびＬ−グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選択され、より好ましくはＴＣＥＰである。
反応は、適度に上昇した温度で、または室温もしくはそれ以下で行うことができる。一般に、本明細書中に記載されるライゲーション反応は室温で行われる。それにもかかわらず、当業者は副反応を最小限に抑えるためにより低い温度で反応を行うことができ、または、例えば、反応速度をさらに加速するために上昇温度で反応を行うことができることを理解するであろう。適切なより低い温度は、室温未満、０℃未満〜約−１００℃、例えば−１０、−２０、−５０、−７０℃、または約−１００〜約０℃、または約−１００〜−５０、−１００〜−７０、−５０〜０、−２０〜０、または−８０〜−６０℃、例えば約１００、９０、−８０、−７８、−７０、−６０、−５０、−４０、−３０、−２０、−１０、または０℃である。好適な高温は、室温より高く、約３０、４０、５０、６０、７０より高く、約８０℃までである。約１０〜約８０℃、または約２０〜８０、５０〜８０、７０〜８０、１０〜３０、１０〜５０、３０〜６０、３０〜４０、４０〜７０または５０〜７０℃、例えば約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０℃。
ライゲーション反応は、好ましくはエステルの溶液を、システイン、シスチン、チオール誘導体化アミノ酸、ジスルフィド誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノール誘導体化アミノ酸、およびジセレノル誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む分子の溶液とフローで組み合わせることによって開始し、次いで、分析技術によって測定しながら、完了まで進行させる。好ましくは、ライゲーション反応は約１００%完了まで進行させるようにすればよい。ライゲーション反応は、少なくとも９０%の完了、少なくとも８５%の完了、少なくとも８０%の完了、少なくとも７５%の完了、少なくとも７０%の完了、少なくとも６５%の完了、少なくとも６０%の完了、少なくとも５５%の完了、少なくとも５０%の完了、少なくとも４５%の完了、少なくとも４０%の完了、少なくとも３５%の完了、少なくとも３０%の完了、少なくとも２５%の終了まで進行させられ得ることが理解される。好ましくは、ライゲーション反応は少なくとも９０％の完了、より好ましくは約１００％の完了まで進行させることができる。
反応がＨＰＬＣ−ＭＳによって測定しながら約４０分以内に完了するＡＡｌｉｇがＩｌｅまたはＶａｌから選択される反応を除き、反応は、ＨＰＬＣ−ＭＳによって生成物の形成に留意して測定しながら約１０分以内に完了することが好ましい。
一実施形態では、反応が第１の求核剤の存在下で行われる。第１の求核剤は、ライゲーション反応の速度を加速する。好ましくは、第１の求核剤はイミダゾールを含む。より好ましくは、第１の求核剤が２−メチルイミダゾール、イミダゾールおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
エステルと分子との間のライゲーション反応は、アミド含有化合物を生成する。アミド含有化合物は、ライゲーション反応混合物中の過剰のエステルと反応して生成物エステルを形成することができる。
一実施形態では、第２の求核剤を使用して、アミド含有化合物とエステルとの間に形成される生成物エステルをチオリシス分解、アミノリシス分解、加水分解またはヒドラジン分解することができる。好ましい実施形態において、第２の求核剤は、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、システイン、イミダゾール、アミン、水酸化物イオン、ヒドラジン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、第２の求核剤はＧＳＨである。好ましくは、第２の求核剤はライゲーション反応の完了後にライゲーション反応混合物に添加される。
フローで行ったライゲーション反応は、室温で広範囲のｐＨを有する水性緩衝液中で、保護されていないペプチドフラグメントを用いて迅速に進行する。
ライゲーション反応に続いて、粗反応混合物は中間体の精製なしに（しかし、任意に、ライゲーション反応に使用される少なくとも１つの試薬または触媒の少なくとも部分的な除去を伴う）、適切な脱硫または脱セレン化状態および試薬に供することができる。得られた、ライゲーションされ選択的に脱硫または脱セレン化された生成物ペプチドは、反応に適した時間に続いて、得られた反応混合物から得ることができる。
１つの実施形態において、該方法は、アミド含有化合物をフローで脱硫または脱セレン化する工程をさらに含む。好ましい実施形態において、ＡＡｌｉｇがシステイン、シスチン、チオール誘導体化アミノ酸、およびジスルフィド誘導体化アミノ酸からなる群より選択されるライゲーション部位におけるチオールまたはジスルフィド官能化アミノ酸残基である場合、本方法は、アミド含有化合物をフローで脱硫する工程をさらに含む。
別の好ましい実施形態において、ＡＡｌｉｇがセレノシステイン、セレノシスチン、セレノール誘導体化アミノ酸、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択されるライゲーション部位におけるセレノールまたはジセレニド官能化アミノ酸残基である場合、本方法は、アミド含有化合物をフローで脱セレン化する工程をさらに含む。
一実施形態では、脱硫または脱セレン化工程がアミド含有化合物にフローで化学ラジカル開始剤を添加することを含む。水溶性ラジカル開始剤の非限定的な例は、２，２’−アゾビス（２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジヒドロクロリド（ＶＡ−０４４）である。
好ましい実施形態において、脱硫または脱セレン化工程は、ホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に曝露することを含む。
好ましくは、光脱硫または光脱セレン化工程は化学ラジカル開始剤の非存在下で行われる。
本発明の別の態様では、チオール基またはジスルフィド基を含むアミド含有化合物をフローで脱硫する方法が提供される。好ましくは、アミド含有化合物がネイティブケミカルライゲーション反応の反応生成物である。一実施形態では、脱硫はアミド含有化合物に化学ラジカル開始剤をフローで添加することを含む。好ましくは、脱硫はホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に暴露することを含む。
本発明のさらに別の態様では、セレノール基またはジセレニド基を含むアミド含有化合物をフローで脱セレン化する方法が提供される。好ましくは、アミド含有化合物がネイティブケミカルライゲーション反応の反応生成物である。一実施形態では、脱セレン化がアミド含有化合物に化学ラジカル開始剤をフローで添加することを含む。好ましくは、脱セレン化はホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に曝露することを含む。
本発明の別の態様では、チオール基またはジスルフィド基を含むアミド含有化合物を脱硫する方法であって、上記脱硫がホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に暴露することを含む方法が提供される。この方法は、バッチまたはフローで実施することができる。
本発明のさらに別の態様では、セレノール基またはジセレニド基を含むアミド含有化合物を脱セレン化する方法であって、上記脱セレン化がホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に曝露することを含む方法が提供される。この方法は、バッチまたはフローで実施することができる。
脱硫または脱セレン化反応は、好ましくはチオール基、ジスルフィド基、セレノール基またはジセレニド基を含むアミド含有化合物を含む溶液を、好ましくはホスフィン源の存在下で紫外線照射に暴露することによってフローで開始し、次いで、分析技術によって測定しながら完了まで進行させる。好ましくは、脱硫または脱セレン化を約１００％まで進行させるようにすればよい。脱硫または脱セレン化反応は、少なくとも９０％の完了、少なくとも８５％の完了、少なくとも８０％の完了、少なくとも７５％の完了、少なくとも７０％の完了、少なくとも６５％の完了、少なくとも６０％の完了、少なくとも５５％の完了、少なくとも５０％の完了、少なくとも４５％の完了、少なくとも４０％の完了、少なくとも３５％の完了、少なくとも３０％の完了、少なくとも２５％の完了まで進行させることができることを理解されたい。好ましくは、脱硫または脱セレン化は少なくとも９０％の完了、より好ましくは約１００％の終了まで進行させればよい。
ホスフィンは、好ましくは水溶性である。好適な水溶性ホスフィンの例としてはビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィン二水和物二カリウム塩、ビス（４，６−ジメチル−３−スルホナトフェニル）（２，４−ジメチルフェニル）ホスフィン、二ナトリウム塩水和物、１，２−ビス（ジ−４−スルホナトフェニルホスフィノ）ベンゼン四ナトリウム塩、ビス（３−スルホナトフェニル）（３，５−ジ−トリフルオロメチルフェニル）ホスフィン二ナトリウム塩一水和物、ビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィン二水和物二カリウム塩、ビス（３−スルホナトフェニル）（２−トリフルオロメチルフェニル）ホスフィン二ナトリウム二水和物、ビス（３−スルホナトフェニル）（４−トリフルオロメチルフェニル）ホスフィン二ナトリウム二水和物、ジ−ｔ−ブチル（３−スルホナトプロピル）ホスフィン、２’−ジシクロヘキシルホスフィノ−２，６−ジメトキシ−３−スルホナト−１，１’−ビフェニル水和物ナトリウム塩、２’−ジシクロヘキシルホスフィノ−２，６−ジ−ｉ−プロピル−４−スルホナト−１，１’−ビフェニル水和物ナトリウム塩、ジフェニル（ｍ−スルホナトフェニル）ホスフィン二水和物ナトリウム塩、２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド、ジフェニル（ｐ−スルホナトフェニル）ホスフィン一水和物ジメチルスルホキシド付加物、カリウム塩、ジシクロヘキシル−｛９−［３−（４−スルホニルフェニル）プロピル］−２−スルホニルフルオレン−９−イル｝ホスホニウム硫酸水素塩、テトラブチルホスホニウムクロリド、１，３，５−トリアザ−７−ホスファアダマンタン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（４，６−ジメチル−３−スルホナトフェニル）ホスフィン三ナトリウム塩水和物、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン、トリス（３−ヒドロキシプロピル）ホスフィン、およびトリス（３−スルホナトフェニル）ホスフィン水和物ナトリウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ホスフィン源はＴＣＥＰである。
別の好ましい実施形態では、脱硫または脱セレン化が水素原子源をさらに含む。好ましくは、水素原子源が還元型Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｔｅｒｔ−ブチルチオール、システイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、水素原子源はＧＳＨである。
別の好ましい実施形態では、光脱硫または光脱セレン化が化学ラジカル開始剤の非存在下で行われる。
本発明はまた、エステルを、システイン、シスチン、チオール誘導体化アミノ酸、ジスルフィド誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノール誘導体化アミノ酸、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む分子とフローで反応させることによって調製されるアミド含有化合物に関する。
本発明はまた、本明細書中に記載される方法によって調製される脱硫または脱セレン化アミド含有化合物に関する。
実験項
以下の実施例は、合成ペプチドの使用に関する。当業者は、本開示が合成ペプチドに限定されず、発現されたペプチドおよびタンパク質を含むことを理解するであろう。
一般的な合成手順
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、３００ＫでＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＤＰＸ ４００、５００または８００分光計のいずれかを使用して、個々のスペクトルについて図の説明文に特定されるようにＤ2Ｏまたはｄ6−ＤＭＳＯ中で内部標準としての残留溶媒ピークで較正して実施した。０．１％ＴＦＡ（ＴＡ３０）を含有する３：７ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ中の飽和α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸または２’，４’，６’−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）／クエン酸水素二アンモニウム（５００μＬのＴＡ３０中１８ｍｇ／７ｍｇ）のいずれかのマトリックスを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ（ＭＡ，ＵＳＡ）Ａｕｔｏｆｌｅｘ（商標）Ｓｐｅｅｄ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ上のリフレクトロンモードで高分解能質量スペクトルを取得した。ＴＡ３０およびマトリックス中の試料の等量を十分に混合し、研磨したスチールＭＡＬＤＩプレートにスポットし、次いで乾燥させた。データはプロテイン１キャリブラント（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて取得し、次いでＦｌｅｘａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｒｕｋｅｒ）ソフトウェアを用いて分析した。
分析ＵＰＬＣは、Ｓａｍｐｌｅ Ｍａｎａｇｅｒ ＦＴＮ、Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒ（Ｈ−Ｃｌａｓｓ）およびＰＤＡ ｅλディテクター（λ＝２１０〜４００ｎｍ）を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで行った。分析は、０．６０ｍＬ／分で操作するＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ−１８ＢＥＨ（１３０Å、１．７μｍ）２．１ｍｍ×５０ｍｍカラムを用いて行った。分取逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ‐ＨＰＬＣ）を、２３０ｎｍおよび２８０ｎｍで動作するＷａｔｅｒｓ２４８９ＵＶ／Ｖｉｓ検出器モジュールおよびＷａｔｅｒｓ分画コレクターＩＩＩを結合したＷａｔｅｒｓ２５３５四次勾配システム上で実施した。特に明記しない限り、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ−１８ＯＢＤ（１００Å、５μｍ）、３０×１５０ｍｍカラムを３８．０ｍＬ／分の流速で使用した。両装置は、ミリＱ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）水中の０．１ｖｏｌ％ＴＦＡ（Ａ／溶媒Ａ）とＨＰＬＣグレードアセトニトリル（Ｂ／溶媒Ｂ）中の０．１ｖｏｌ％ＴＦＡとから成る移動相を用い、線形勾配を用いて操作した。クロマトグラム分析は、Ｅｍｐｏｗｅｒ３Ｐｒｏソフトウェア（２０１０）を用いて行った。
ＵＰＬＣ−ＭＳは、ＤＧＵ−２０Ａ５Ｒ脱気ユニットおよびＳＰＤ−Ｍ３０Ａダイオードアレイ検出器を有するＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−３０ＡＤ液体クロマトグラフィーポンプモジュールを用いて行った。ＣＴＯ−２０Ａカラムオーブンを、０．６０ｍＬ／分で操作するＷａｔｅｒｓ Ｃ−１８ ＢＥＨ（１３０Å、１．７μｍ）２．１×５０ｍｍカラムと共に使用した。これらの構成要素を、Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ ＳＩＬ−３０ＡＣオートサンプラーおよびポジティブモードで動作するＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ−２０２０質量分析計と共に、ＣＢＭ−２０Ａ通信バスモジュールと結合した。ペプチドを、ミリＱ水および０．１体積％ギ酸およびＨＰＬＣグレードのアセトニトリル中の０．１体積％ギ酸の移動相を用い線形勾配を用いて操作して分析した。分析は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェアを用いて行った。精製タンパク質のＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、全体勾配および洗浄サイクルにわたる総イオン数を平均することによって得た。
フロー実験はＶａｐｏｕｒｔｅｃ ＲＳ−２００自動制御システムを使用し、ステンレススチールＲ２シリーズポンピングモジュールおよびＶａｐｏｕｒｔｅｃ標準コイルチューブ反応器を備えたＲ４対流加熱モジュールと共に行った。これらのモジュールは２つのＶ−３蠕動ポンプを有するＲ−２Ｓポンピングモジュールと一緒に、予めインストールされたＦｌｏｗ Ｃｏｍｍａｎｄｅｒソフトウェアと結合された。ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）チューブ（０．５０ｍｍ ｉｄ×１．６０ｍｍ ｏｄ）またはポリフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）チューブ（０．５０ｍｍ ｉｄ×１．６０ｍｍ ｏｄ）を、１００μＬ、５００μＬ、２．０ｍＬ（０．５０ｍｍ ｉｄ×１．６０ｍｍ ｏｄ）および５．０ｍＬ（０．７５ｍｍ ｉｄ×１．６０ｍｍ ｏｄ）容量のＰＴＦＥ注入ループと一緒に、特定されているように使用した。Ｒａｙｏｎｅｔ ＲＰＲ−１００光反応器をλ＝２５４ｎｍ、３０２ｎｍ、および３６５ｎｍ（３５Ｗ）で使用した。
使用したモデルペプチドにおけるチロシン残基の吸光度（εＴｙｒ＝１２８０Ｍ-1ｃｍ-1）に対応するλ＝２８０ｎｍでのＵＰＬＣクロマトグラムにおけるピークの積分に基づいて、モデル系のライゲーション進行を計算した。報告された反応収率は、理論的反応収率に対する単離されたペプチドの質量から計算される。収率は、反応モニタリングのために除去された任意のアリコートを補うように調整される。
材料
市販の材料は特に断らない限り、受け取ったまま使用した。アミノ酸、カップリング試薬および樹脂は、ＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍまたはＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍから入手した。市販されていない試薬は、実験項に示されているように文献手順に従って合成した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、ＭｅｒｃｋまたはＬａｂｓｃａｎからペプチド合成等級で入手した
化合物Ｓ１はＳａｙｅｒｓ２０１５で報告されているように合成した。
Figure 2021525259
 化合物Ｓ２はＴｈｏｍｐｓｏｎ２０１３で報告されているように合成した。
Figure 2021525259
Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ手順
すべての試薬当量は、樹脂にロードされたアミノ酸のモル数と比較して報告される。
樹脂ローディング
リンクアミド樹脂
リンクアミド樹脂（コポリ（スチレン−１％ＤＶＢ）１００〜２００メッシュ）（２００μｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2で３０分間膨潤させ、次いでＤＭＦ（５×５ｍＬ）で洗浄した。樹脂をＤＭＦ（５×５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）およびＤＭＦ（５×５ｍＬ）で洗浄する前に、ＤＭＦ中２０ｖｏｌ．％ピペリジン（２×５ｍＬ、３分）でＦｍｏｃ−脱保護した。ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ（４当量）（０．１２５ＭのＦｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ）にＰｙＢＯＰ（４当量）およびＮＭＭ（８当量）を添加し、２時間撹拌しながら室温で上記樹脂に添加した。ローディング溶液を除去し、樹脂をＤＭＦ（５×５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）およびＤＭＦ（５×５ｍＬ）で洗浄し、次いで、ＤＭＦ（５ｍＬ）中でＡｃ2Ｏ（０．１２５Ｍ）およびｉＰｒ2ＥｔＮ（０．１２５Ｍ）でキャップした。樹脂をＤＭＦ（５×５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）およびＤＭＦ（５×５ｍＬ）で洗浄した。
２−クロロトリチルクロリド樹脂
２−クロロトリチルクロリド樹脂（コポリ（スチレン−１％ ＤＶＢ）１００−２００メッシュ）（２００μｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2で３０分間膨潤させ、Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ（２当量）とｉＰｒ2ＥｔＮ（４当量）のＣＨ2Ｃｌ2溶液（Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨの０．１２５Ｍ）を樹脂に加え、１６時間室温で撹拌した。ローディング溶液を除去し、樹脂をＤＭＦ（５×５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（５×５ｍＬ）で洗浄した。樹脂をＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ／ｉＰｒ2ＥｔＮ（１７：２：１ｖ／ｖ／ｖ、５ｍＬ）の溶液で１時間処理し、ＤＭＦ（５×５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（５×５ｍＬ）で洗浄した。
ヒドラジンによる２−クロロトリチルクロリド樹脂の誘導体化
この手順は、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１３から採用した。２−クロロトリチルクロリド樹脂（コポリ（スチレン−１％ＤＶＢ）１００−２００メッシュ）（２００μｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2中で３０分間膨潤させた。５ｖｏｌ．％ Ｎ2Ｈ4・Ｈ2ＯのＤＭＦ溶液を樹脂に添加し、３０分間穏やかに攪拌した。樹脂をＤＭＦ（５×５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（５×５ｍＬ）で洗浄し、続いてヒドラジン処理および洗浄を繰り返した。ＤＭＦ中の５ｖｏｌ％のＣＨ3ＯＨのキャッピング溶液を樹脂に添加し、１０分間撹拌した。次いで、樹脂をＤＭＦ（５×５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（５×５ｍＬ）で洗浄して、淡黄緑色樹脂を得た。次いで、標準的なペプチドカップリング手順を直ちに行った。
樹脂ローディング量の定量化
樹脂（１０ｍｇ）を２ｖｏｌ％、１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｍｌ）で処理し、３０分撹拌した後、アセトニトリル８ｍｌを添加した。得られた溶液の１ｍＬアリコートを採取し、アセトニトリルで１２．５ｍＬに希釈した。ＤＢＵ−フルベン付加物の吸光度（λ＝３０４、ε＝９２５４Ｍ-1ｃｍ-1）を測定してローディングを推定した。
反復ペプチド集合（Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ）
脱保護
樹脂（２００μｍｏｌの初期ローディング）を、ＤＭＦ中の２０体積％ピペリジン（２×５ｍＬ、３分）で処理し、ＤＭＦ（５×５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（５×５ｍＬ）で洗浄した。
一般的なアミノ酸カップリング
Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ（４当量）、ＰｙＢＯＰ（４当量）およびＮＭＭ（８当量）のＤＭＦ溶液（０．１２５ＭのＦｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ）を樹脂（２００μｍｏｌ初期ローディング）に添加し、室温で１時間撹拌した。次いで、樹脂をＤＭＦ（５×５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（５×５ｍＬ）で洗浄した。
キャッピング
Ａｃ2Ｏ（０．１２５Ｍ）およびｉＰｒ2ＥｔＮ（０．１２５Ｍ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）を樹脂に添加した。３分後、樹脂（２００μｍｏｌの初期ローディング）をＤＭＦ（５×５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（５×５ｍＬ）で洗浄した。
側鎖脱保護なしの樹脂からの切断および後処理
樹脂（２００μｍｏｌの初期ローディング）をＨＦＩＰ／ＣＨ2Ｃｌ2（３：７、ｖ／ｖ、５ｍＬ）で処理し、室温で４０分間撹拌した。樹脂を濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾液を窒素流下で濃縮した。
完全側鎖脱保護による樹脂からの切断および後処理
ＴＦＡ／ｉＰｒ3ＳｉＨ／Ｈ2Ｏ（９０：５：５ｖ／ｖ／／ｖ）の混合物を樹脂に添加した（２００μｍｏｌの初期ローディング）。２時間後、樹脂を濾過し、ＴＦＡ（３×５ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾液を窒素流下で５ｍＬ未満に濃縮した。ジエチルエーテル（４０ｍＬ）を加え、溶液を−２０℃に１５分間冷却した。沈殿物を４０００ｒｃｆで８分間の遠心分離によってペレット化し、上清をデカントした。
自動化ＳＰＰＳ
自動化Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳを、Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで行った。
ＤＭＦ中の２０ｖｏｌ％ピペリジンを使用するＦｍｏｃ−脱保護、およびＤＭＦ中のＡｃ2Ｏ（０．３Ｍ）およびｉＰｒ2ＥｔＮ（０．３Ｍ）を使用するキャッピングのための一般的な合成プロトコルを、上記のように行った。カップリング溶液を、ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ（０．３Ｍ）、ＤＭＦ中のＯｘｙｍａＰｕｒｅ（登録商標）（０．３Ｍ）、およびＤＭＦ中のＤＩＣ（０．３Ｍ）について調製した。
マイクロ波支援ペプチド合成
マイクロ波支援ペプチド合成を、ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ自動マイクロ波ペプチド合成機（ＵＳＡ，ＮＣ）上で９０℃または５０℃のいずれかで行った。高温カップリングは、４分間カップリング法を使用した：［２分間カップリング（９０℃）、１分間脱保護（９０℃）、１分間関連洗浄および液体処理］一方、２−クロロトリチルクロライド樹脂（Ｎ末端セグメント）上での合成を、３０分間カップリング法を用いて５０℃で行った：［２０分間カップリング（５０℃）、２×３分間脱保護（室温）、４分間関連洗浄および液体処理］。どちらの方法も、４倍過剰のＦｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ、ＯｘｙｍａおよびＤＩＣを使用した。未反応Ｎ末端アミンのキャッピングは、Ｎ−アセチルグリシン、ＯｘｙｍａおよびＤＩＣを用いて、９０℃カップリングを１分間、または５０℃カップリングを３分間用いて５倍モル過剰で達成した。
溶液相チオエステル化
粗側鎖保護ペプチドを乾燥ＤＭＦ（２０ｍＭ）に溶解し、−３０℃に冷却した。これに、３−メルカプトプロピオン酸エチル（３０当量）、続いてＰｙＢＯＰ（５当量）およびｉＰｒ2ＥｔＮ（５当量）を、アルゴン雰囲気下で３時間にわたり撹拌しながら添加した。溶液を室温に温め、窒素流下で濃縮した。脱保護および後処理は、樹脂上の完全に保護されたペプチドについて記載された酸性脱保護条件を用いて達成された。この手順を用いてエピマー化は観察されなかった。
ペプチドヒドラジドのジアゾ化とチオエステル化
ペプチドヒドラジドのペプチドチオエステルへの変換を、Ｚｈｅｎｇ２０１３によって報告されたものを若干改変した手順を用いて行った。Ｃ末端アシルヒドラジドを有する完全に脱保護されたペプチドを、水溶液ライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ）中で４０ｍＭ濃度まで溶媒和した。この溶液をｐＨ３．０に調整し、−１５℃に冷却した。これに、ＮａＮＯ2の水溶液（１２Ｍ、１０当量）を添加した。１０分後、蒸留ＴＦＥＴ（Ａｌａチオエステルについては１０当量、Ｖａｌチオエステルについては２０当量）を添加した（警告：ＴＦＥＴは刺激性であり、急性毒性であり、ヒュームカップボード中で使用すべきである）。溶液をｐＨ６．８〜７．０に調整し、室温に温めた。１０分後、得られたペプチドトリフルオロエチルチオエステルをＨＰＬＣで精製した。
フローでのネイティブケミカルライゲーション
ネイティブケミカルライゲーションは、Ｎ末端システイン（Ｃｙｓ）残基を含むペプチドと、Ｃ末端チオエステルとして官能化されたペプチドとの間で行われる（図１）。
機構的には、最初のトランス−チオエステル化工程により進行し、続いて急速なＳ→Ｎアシル転位を経て、天然のペプチド結合を与える。
通常、適切なチオール添加剤が、律速トランス−チオエステル化工程を加速する反応性チオエステル（ＳＲ2）を生成するために必要とされる。
モデルペプチドＨ‐ＣＳＰＧＹＳ‐ＮＨ2（１、配列番号１）とモデルペプチドチオエステルＡｃ−ＬＹＲＡＮＸ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ（２：Ｘ＝Ａ（配列番号２），３：Ｘ＝Ｖ（配列番号３２））との間のフローでのモデルＮＣＬ反応を行った（図２〜４）。
使用した任意の添加剤を、６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭ ＴＣＥＰを含む脱気ライゲーション緩衝液（５００ｍＭ ＭＰＡＡ、５００ｍＭ ＴＦＥＴ、５．０Ｍ ２−ＭＩＭ）（ｐＨ７．４〜７．５）（注意：ＴＦＥＴは刺激性であり、急性毒性であり、ヒュームカップボード中で使用すべきである）中で溶媒和した。この溶液をモデルペプチド１（１０ｍＭ、１．０当量）に添加した。６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭ ＴＣＥＰを含む脱気ライゲーション緩衝液（１０ｍＭ）（ｐＨ７．１〜７．２）中のモデルペプチドチオエステル２または３（１．２当量または２．０当量）の第２の溶液を調製した。これらの溶液を注入ループに挿入し、系溶媒として石油エーテルを用いて１５０μＬスケールでＴピースで合わせた（図３Ａ）。得られた反応流は、３７℃（６バールＢＰＲ）でＰＴＦＥコイル反応器Ｉ（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ）に入った。ミリＱ水中の等容量の７ｖｏｌ．％のＮ2Ｈ4・Ｈ2Ｏを使用して、回収時に反応溶液を直接クエンチした。ライゲーション時間経過は、反応器Ｉの体積および滞留時間を調節するための流速を変えることによって得た。クエンチした溶液の１０μＬのアリコートを採取し、ミリＱ水中の０．１％ＴＦＡ４０μＬで希釈し、次いでＵＰＬＣによって分析した。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε２８０（１）＝１２８０Ｍ-1ｃｍ-1、ε２８０（６、７）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ-1］での出発物質１および所望のライゲーション生成物６または７の相対ピーク面積に基づいていた。
バッチでのネイティブケミカルライゲーション
モデルペプチドＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（１、配列番号１）とモデルペプチドチオエステルＡｃ−ＬＹＲＡＮＸ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ（２：Ｘ＝Ａ（配列番号２），３：Ｘ＝Ｖ（配列番号３））との間のバッチにおける比較ＮＣＬ反応を行った。
使用した任意の添加剤を、６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭ ＴＣＥＰを含む脱気ライゲーション緩衝液（５００ｍＭ ＭＰＡＡ、５００ｍＭ ＴＦＥＴ、５．０Ｍ ２−ＭＩＭ）（ｐＨ７．４〜７．５）（注意：ＴＦＥＴは刺激性であり、急性毒性であり、ヒュームカップボード中で使用すべきである）中で溶媒和した。この溶液をモデルペプチド１（１０ｍＭ、１．０当量）に添加した。モデルペプチドチオエステル２または３（１．２当量または２．０当量）の第２の溶液を、６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭ ＴＣＥＰを含む脱気ライゲーション緩衝液（ｐＨ７．１〜７．２）中で調製した。これらの溶液を合わせ（１：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）、穏やかに撹拌した後、３７℃でインキュベートした（スキームＳ１）。ライゲーション時間経過は種々の時点で５μＬのアリコートを採取し、５μＬのミリＱ水中の７ｖｏｌ％のＮ2Ｈ4・Ｈ2Ｏでクエンチすることによってプロットした。この溶液をミリＱ水中の０．１％ＴＦＡ４０μＬで希釈し、次いでＵＰＬＣで分析した。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε２８０（１）＝１２８０Ｍ-1ｃｍ-1、ε２８０（６、７）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ−1］での出発物質１および所望のライゲーション生成物６または７の相対ピーク面積に基づいていた。
トリフルオロエタンチオール（ＴＦＥＴ）、４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）およびＭＥＳＮａから選択されるチオール添加剤の非存在下または存在下のいずれかでの、バッチおよびフローにおけるモデルペプチド１とモデルペプチドチオエステル２との間のライゲーション反応のキネティクスを図５に示す。
予備形成された反応性チオエステルを用いるフローでのネイティブケミカルライゲーション
予備形成したトリフルオロエチルチオエステルＡｃ−ＬＹＲＡＮＸ−ＳＣＨ2ＣＦ3（４：Ｘ＝Ａ（配列番号４）、５：Ｘ＝Ｖ（配列番号５））を、任意の添加剤として２−メチルイミダゾール（２−ＭＩＭ）を用いて１と連結（ライゲーション）するＮＣＬフロー戦略を開発した（図４Ｂ）。上記と同じフロー設定を使用して、これらの条件は、２分でペプチド１とチオエステル４との間、および１１分でチオエステル５との間の完全なライゲーションをもたらした（図４Ｂおよび４Ｃ、図６を参照のこと）。
予備成形された反応性チオエステルを使用するバッチでのネイティブケミカルライゲーション
任意の添加剤として２−メチルイミダゾール（２−ＭＩＭ）を用いて、１と結合した予備形成したトリフルオロエチルチオエステル−ＬＹＲＡＮＸ−ＳＣＨ2ＣＦ3（４：Ｘ＝Ａ（配列番号４），５：Ｘ＝Ｖ（配列番号５））のバッチでの比較ＮＣＬ反応を行った。
添加剤としてＴＦＥＴを用いた１とチオエステル３との間、および１と予め活性化されたトリフルオロエチルチオエステル４または５との間のバッチおよびフローのライゲーション反応の反応速度を比較した（図６および７）。一般的なバッチおよびフローのライゲーションを、Ａｃ−ＬＹＲＡＮＸ−ＳＣＨ2ＣＦ3チオエステル４および５の１．２当量または２．０当量のいずれかを使用して、２．５Ｍ ２−ＭＩＭを加えてまたは加えずに上記の手順に従って行った。速度加速は、添加剤として２−ＭＩＭを加え２．０当量または１．２当量についてフローｖｓバッチで行った実験において観察された。
予備活性化チオエステルを使用する最適化フロー手順は対応するバッチ反応よりも実質的に速い（４〜５０倍）ことが証明され、速度差は活発な混合にもかかわらず、より大きなスケール（２０μｍｏｌ）でより顕著である（図７Ａ）。フローライゲーションの反応終点は、スケールアップ時に変化せず（３ｖｏｌ％ヒドラジンでクエンチした後の、１〜５の間のライゲーションの粗ＵＰＬＣトレースについては図７Ｂを参照のこと）、フロー溶離液の直接ＨＰＬＣ精製時に優れた単離収率をもたらした（６については１８ｍｇ、６７％、および７については１８ｍｇ、６５％）。
希釈時のフローでのネイティブケミカルライゲーション
２つの０．５ｍＬ溶液を調製した：１つはＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（１ｍＭまたは０．１ｍＭ）およびＴＣＥＰ（５０ｍＭ）をライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．０）中に含有する溶液であり、他方は２当量のＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ４（配列番号４）（２ｍＭまたは０．２ｍＭ）およびＴＣＥＰ（５０ｍＭ）をライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．０）中に含有する溶液である。これらの溶液を注入ループに挿入し、系溶媒として石油エーテルを用いてＴピースで合わせた。得られた反応流は、３７℃（６バールＢＰＲ）でＰＴＦＥコイル反応器Ｉ（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ）に入った。反応溶液をヒドラジン一水和物水溶液（７ｖｏｌ．％）のクエンチング溶液中に回収し、ＵＰＬＣおよびＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε２８０（１）＝１２８０Ｍ-1ｃｍ-1、ε２８０（６）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ-1］での出発物質と脱硫生成物の相対ピーク面積に基づいていた。
モデルペプチド１とモデルペプチドチオエステル２の希釈溶液間のチオールまたはセレノール添加剤なしでのバッチおよびフローでのライゲーション反応のキネティクスを、図８に示す。
フローでの標準脱硫
フローでのＮＣＬのための最適化されたプロトコルを確立し、本発明者らは同様のマニホルドの下で脱硫が実施できるかどうかを調査した。Ｃｙｓ含有ペプチド１、６または７の脱硫の一般的スキームを図９に示す。
Ｃｙｓ含有ペプチド１、６または７を、６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＴＣＥＰおよび２．５Ｍ ２−ＭＩＭを含む脱気ライゲーション緩衝液（５ｍＭ）（ｐＨ７．３〜７．４）中で溶媒和した。６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび３５０ｍＭ ＴＣＥＰを含む脱気ライゲーション緩衝液（ｐＨ７．４〜７．５）中に４０ｍＭ ＶＡ−０４４および８０ｍＭ ＧＳＨを含む第２の溶液を調製した。これらの２つの溶液を注入ループに挿入し、系溶媒として石油エーテルを用いて１５０μＬスケールでＴピースで合わせた（図１０）。次に、得られた反応流を３７℃に加熱したＰＴＦＥコイル反応器Ｉに入れた。脱硫時間経過は、滞留時間を調節するために反応器容積および流速を変えることによって得た。反応液は６バールＢＰＲを通って系から出て、ミリＱ水中の等量の中性１５ｍＭ ＭＰＡＡ溶液でクエンチされた。この溶液の５μＬアリコートを、ミリＱ水中の０．１％ＴＦＡ４０μＬで希釈し、ＵＰＬＣによって分析した。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε２８０（１，８）＝１２８０Ｍ-1ｃｍ-1、ε２８０（６，７，９，１０）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ-1］での出発物質および脱硫生成物の相対ピーク面積に基づいていた。
バッチでの標準脱硫
バッチでのＣｙｓ含有ペプチド１、６または７の比較脱硫反応を行った。
Ｃｙｓ含有ペプチド１、６または７を、６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭ ＴＣＥＰを含む脱気ライゲーション緩衝液（５ｍＭ）（ｐＨ７．３〜７．４）中で溶媒和した。６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび３５０ｍＭ ＴＣＥＰ中に４０ｍＭ ＶＡ−０４４および８０ｍＭ還元Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）を含む第２の溶液を調製した（ｐＨ７．４〜７．５）。これらの溶液を、ポリプロピレンマイクロ遠心管中で１５０μＬスケール（１：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）で合わせ、穏やかに撹拌した後、３７℃でインキュベートした（図９）。脱硫時間経過は、３μＬの中性２５ｍＭ ＭＰＡＡミリＱ水溶液で５μＬアリコートを種々の時点でクエンチすることにより得た。この溶液をミリＱ水中の０．１％ＴＦＡ４０μＬで希釈し、ＵＰＬＣで分析した。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε２８０（１，８）＝１２８０Ｍ-1ｃｍ-1、ε２８０（６，７，９，１０）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ-1］での出発物質および脱硫生成物の相対ピーク面積に基づいていた。
化学ラジカル開始剤ＶＡ−０４４（２０ｍＭ）および４０ｍＭ ＧＳＨを用いてバッチおよびフローで行った脱硫の結果を図１１に示す。
フローでの光脱硫
化学的ラジカル阻害剤の存在下または非存在下で脱硫するためのプロトコルを開発した。
Ｃｙｓ含有ペプチド１、６または７を、６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＴＣＥＰおよび２．５Ｍ ２−ＭＩＭを含む脱気ライゲーション緩衝液（５ｍＭ）（ｐＨ７．３〜７．４）中で溶媒和した。６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび３５０ｍＭ ＴＣＥＰを含む脱気ライゲーション緩衝液中に、４０ｍＭ ＶＡ−０４４を含むかまたはＶＡ−０４４を含まず、８０ｍＭ ＧＳＨを含む第２の液を調製した。これらの２つの溶液を注入ループに挿入し、系溶媒として石油エーテルを用いて１５０μＬスケールでＴピースで合わせた（図１２〜１７）。得られた反応流は、λ＝２５４ｎｍ、３０２ｎｍ、または３６５ｎｍ（３５Ｗ、室温）でＲａｙｏｎｅｔ ＲＰＲ−１００ ＵＶ光反応器内のＰＦＡコイル反応器に入った。脱硫時間経過は、滞留時間を調節するために反応器容積および流速を変えることによって得た。反応液は６バーＢＰＲを通って系から出て、ミリＱ水中の等量の中性２５ｍＭ ＭＰＡＡ溶液でクエンチされた。この溶液の５μＬアリコートを、ミリＱ水中の０．１％ＴＦＡ４０μＬで希釈し、ＵＰＬＣによって分析した。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε２８０（１，８）＝１２８０Ｍ-1ｃｍ-1、ε２８０（６，７，９，１０）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ-1］での出発物質および脱硫生成物の相対ピーク面積に基づいていた。
バッチでの光脱硫
バッチ中のＣｙｓ含有ペプチド１、６または７の比較光脱硫反応を行った。
Ｃｙｓ含有ペプチド１、６または７を、６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＴＣＥＰおよび２．５Ｍ ２−ＭＩＭを含む脱気ライゲーション緩衝液（５ｍＭ）（ｐＨ７．３〜７．４）中で溶媒和した。６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび３５０ｍＭ ＴＣＥＰを含む脱気ライゲーション緩衝液（ｐＨ７．４〜７．５）中に、４０ｍＭ ＶＡ−０４４を含むか（図１２）またはＶＡ−０４４を含まず（図１３）、８０ｍＭ ＧＳＨを含む第２の溶液を調製した。これらの溶液を、ポリプロピレンマイクロ遠心管中で１５０μＬスケール（１：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）で合わせ、穏やかに撹拌し、Ｒａｙｏｎｅｔ ＲＰＲ−１００ ＵＶ光反応器を用いてλ＝２５４ｎｍ、３０２ｎｍ、または３６５ｎｍ（３５Ｗ、室温）で光照射した。脱硫時間経過はミリＱ水中の中性２５ｍＭ ＭＰＡＡ溶液３μＬで５μＬアリコートをクエンチすることにより、種々の時点で得た。この溶液をミリＱ水中の０．１％ ＴＦＡ４０μＬで希釈し、ＵＰＬＣで分析した。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε２８０（１，８）＝１２８０Ｍ-1ｃｍ-1、ε２８０（６，７，９，１０）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ-1］での出発物質および脱硫生成物の相対ピーク面積に基づいていた。
化学ラジカル開始剤ＶＡ−０４４が存在しない場合、１の脱硫生成物８へのきれいな変換が室温で１５秒のλ＝２５４ｎｍ（３５Ｗ）での光照射の際にのみ観察された（図１７ＡおよびＢ）。初期のフローＮＣＬ反応からの生成物６および７（内部Ｃｙｓ残基を有する）もまた、これらの光脱硫条件に供され、６０〜９０秒できれいに９および１０を生成した（図１７Ｃ）。反応はまた、潜在的に反応性の側鎖（例えば、メチオニンおよび側鎖保護されたＣｙｓ残基）の存在下で化学選択的であった（図１８〜２０）。最後に、ペニシラミンおよびβ−チオール−アスパラギン酸残基を有するペプチドを＜１分できれいに光脱硫して、それぞれ天然バリンおよびアスパラギン酸残基を得た（図２１および２２）。フロー下での光照射は、バッチ反応と比較して生成物の分解を最小限にした。
本発明者らは、チオール基を含むアミド含有化合物を脱硫するための新規な方法を開発した。この方法は、化合物を、ホスフィン源の存在下で、任意に水素原子源をさらに含む紫外線照射に曝露することを含む。この方法は、バッチおよびフローに適している。驚くべきことに、化学ラジカル開始剤は必要とされない。
フローでのライゲーション−光脱硫
フローでのライゲーションおよび光脱硫反応を最適化した後、これらを組み合わせて「インライン」ライゲーション−光脱硫２０μｍｏｌ流動実験を行った。
２０μｍｏｌの流動実験を行い、それによって１の溶液（１０ｍＭ、５Ｍ ２−ＭＩＭおよび５０ｍＭ ＴＣＥＰを含むライゲーション緩衝液中）を、チオエステル４または５（２０ｍＭ、５０ｍＭ ＴＣＥＰを含むライゲーション緩衝液中、図２３）とＴピースで混合した。ＰＴＦＥコイル反応器を３７℃で通過させた後（４：３分、５：１１分）、生成物を第２のＴピースでライゲーション緩衝液中の２５０ｍＭ ＧＳＨおよび３５０ｍＭ ＴＣＥＰの流れと混合し、３７℃の第２のＰＴＦＥ反応器に向かわせ（４：１分、５：６分）、ライゲーション生成物６または７の内部Ｃｙｓと過剰チオエステル４または５との間のトランスチオエステル化によって生成される生成物チオエステルをチオリシス分解した（図２４〜２８）。最後に、反応混合物を１分間光照射して（λ＝２５４ｎｍ）、回収前に光脱硫を促進させた（図２３Ｂおよび２３Ｃならびに図２９−３０を参照のこと）。ＨＰＬＣ精製後、所望の生成物を２つの工程にわたって優れた収率で単離した（９：１７ｍｇ、６５％、１０：１７ｍｇ、６３％）。ペプチドはまた、迅速なタイムスケールで生成された；９の全反応時間は５分間、１０の全反応時間は１８分間のみが必要であり、後者は、最も困難なライゲーション結合の１つ（Ｖａｌチオエステル）を代表する。
バッチでのワンポットライゲーション−光脱硫
ワンポットライゲーション−光脱硫手順を、２０μｍｏｌスケールでバッチで行った。
２つの２．０ｍＬ溶液を調製し、一方は脱気ライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４〜７．５）中に１０ｍＭ Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １、５０ｍＭ ＴＣＥＰおよび５．０Ｍ ２−ＭＩＭを含み、他方はライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１〜７．２）中に２０ｍＭ Ａｃ−ＬＹＲＡＮＸ−ＳＣＨ2ＣＦ3（４：Ｘ＝Ａ（配列番号４）、５：Ｘ＝Ｖ（配列番号５））および５０ｍＭ ＴＣＥＰを含む。５．０ｍｌのライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４〜７．５）中にＧＳＨ（２５０ｍＭ）およびＴＣＥＰ（３５０ｍＭ）を含む脱硫溶液を調製した。脱気の際に、２つのライゲーション溶液を合わせ、３７℃で活発に混合した。ＵＰＬＣ（Ｘ＝Ａ：６分、Ｘ＝Ｖ：４０分）によって決定された完全なライゲーションの際に、反応溶液を１５ｍＬのコーニング（商標）Ｆａｌｃｏｎ（商標）ポリプロピレンコニカル遠心管に移し、４．０ｍＬの脱硫溶液と合わせた。この混合物にλ＝２５４ｎｍ（３５Ｗ、室温）で光照射した（図３１）。ＵＰＬＣ（Ｘ＝Ａ：２．５時間；Ｘ＝Ｖ：２．５時間）による完了のとき、直ちにＲＰ−ＨＰＬＣを用いて生成物を単離した（Ｘ＝Ａ：９、総処理時間２．６時間、単離収率６６％；Ｘ＝Ｖ：１０、総処理時間３．２時間、単離収率６６％。処理時間とは、完全な注入と反応にかかる合計時間を指す）。
特に、予め活性化されたチオエステル（４：２．６時間、５：３．２時間、図３１および３２）を使用した場合、反応時間の一桁の増加がフローと比較してバッチで観察された。さらに、フローＮＣＬ−光脱硫プロセスはバッチでの従来のライゲーション−脱硫反応（添加剤としてチオエステル２または３およびＴＦＥＴを用いる）と比較して２桁速かったが、同等の単離収率を与えた（図３３〜３５）。
エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）の合成
エンフビルチドは臨床的に承認された３６残基ペプチドＨＩＶ侵入阻害剤である。有機溶媒中での３つの保護フラグメントの縮合によって商業的に製造されている。エンフビルチドを、トリフルオロエチルチオエステルとして誘導体化されたＣ末端リジンを有するペプチド１１（エンフビルチド１−１８、配列番号１１）を、Ｎ末端βチオールアスパラギン残基を有するペプチド１２（エンフビルチド１９−３６、配列番号１２）と反応させることにより、フローでのＮＣＬ−光脱硫によって調製した（図３６）。
両ペプチドはＦｍｏｃ−ＳＰＰＳを用いて作製した。
Figure 2021525259
ヒドラジン由来の２−クロロトリチルクロリド樹脂（コポリ（スチレン−１％ ＤＶＢ）１００−２００メッシュ）に、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１２５μｍｏｌ、１．６ｍｍｏｌ／ｇ）をロードし、一般的な手順に記載されるように、自動化Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳを使用してペプチドを伸長した。完全にアセンブルされた樹脂結合ペプチドを、ＴＦＡ／ｉＰｒ3ＳｉＨ／Ｈ2Ｏ（９０：５：５ｖ／ｖ／ｖ）での処理を介して樹脂から切断し、同時に全ての側鎖保護基を脱保護した。反応物を室温で２時間撹拌し、真空中で濃縮した。完全に脱保護されたペプチドアシルヒドラジドを、水溶液ライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ３．０）中で１０ｍＭまで溶媒和し、−１５℃に冷却した。これに、ＮａＮＯ2の水溶液（１Ｍ、１０当量、１．２５ｍＬ）を添加した。１０分後、ＴＦＥＴ（２０当量、２２１μＬ）を添加した（警告：ＴＦＥＴは刺激性であり、急性毒性であり、ヒュームカップボード中で使用すべきである）。溶液を室温に温め、４５分間撹拌した。チオエステルへの完全な変換をＵＰＬＣ−ＭＳによって確認し、粗物質をＨＰＬＣ（４０分間にわたり２０〜６０％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）によって精製して、凍結乾燥後に白色固体としてペプチド１１を得た（７０ｍｇ，当初の樹脂ロード量に基づく収率２２％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ ４．５２分（λ＝２３０ｎｍ，５分にわたり０〜６０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）；計算質量値［Ｍ＋２Ｈ］２＋：１１４４．５，［２Ｍ＋３Ｈ］３＋：１５２５．７，［３Ｍ＋４Ｈ］４＋：１７１６．０，［４Ｍ＋５Ｈ］５＋：１８３０．６。質量実測値（ＥＳＩ＋）：１１４４．７［Ｍ＋２Ｈ］２＋，１５２６．０［２Ｍ＋３Ｈ］３＋，１７１６．７［３Ｍ＋４Ｈ］４＋，１８３１．０［４Ｍ＋５Ｈ］５＋（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）１９Ｆ｛１Ｈ｝−ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ−６５．１ｐｐｍ。エンフビルチド（１−１８）１１のＮＭＲスペクトルを図５９〜６１に示す。
Figure 2021525259
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨを、Ｒｉｎｋアミド樹脂（コポリ（スチレン−１％ ＤＶＢ）１００〜２００メッシュ）（１００μｍｏｌ）上にロードし、一般的な手順に概説されるように、自動化Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳを使用してペプチドを伸長した。ＤＭＦ（最終濃度０．１Ｍ）中のβ−チオールアスパラギンＳ１１（１．２０当量）、ＰｙＡＯＰ（１．２０当量）、およびＮＭＭ（２．４０当量）の予備活性化溶液を樹脂に添加した。室温で２時間穏やかに撹拌した後、樹脂をＤＭＦ（５×３ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×３ｍＬ）およびＤＭＦ（５×３ｍＬ）で洗浄した。完全に保護された樹脂結合ペプチドを固体支持体から切断し、ＴＦＡ／ｉＰｒ3ＳｉＨ／Ｈ2Ｏ／ＥＤＴ（８９：５：５：１ｖ／ｖ／ｖ）の溶液を用いて脱保護した。反応物を室温で２時間撹拌し、真空中で濃縮した。粗ペプチド１２を冷Ｅｔ2Ｏから沈殿させ、粗生成物を分取逆相（４０分かけて２０〜８０％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）によって精製して、凍結乾燥後に白色固体としてペプチド１２を得た（５１．６ ｍｇ，当初の樹脂ロード量に基づき収率２０％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ４．４３分（λ＝２１４ｎｍ，５分にわたり０〜６０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）；計算質量値［Ｍ＋２Ｈ］２＋：１１７７．１，［２Ｍ＋３Ｈ］３＋：１５６９．１。質量実測値（ＥＳＩ＋）：１１７７．２［Ｍ＋２Ｈ］２＋，１５６９．３［２Ｍ＋３Ｈ］３＋（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）エンフビルチド（１９−３６）１２のＮＭＲスペクトルを図６２に示す。
Figure 2021525259
５０ｍＭ ＴＣＥＰおよび５．０Ｍ ２−ＭＩＭ（ｐＨ ７．０）を含むライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ）中で、エンフビルチド（１９−３６）１２（５μｍｏｌ、１２．９ｍｇ、１０ｍＭ）の液を調製した。エンフビルチド（１−１８）１１（１０μｍｏｌ、２５．１ｍｇ、２０ｍＭ）の第２の溶液を、５０ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ６．２）を含むライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ）中で調製した。８００ｍＭ ＴＣＥＰおよび２５０ｍＭ ＧＳＨを含むライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）中で脱硫液を調製した。ライゲーション溶液を０．５０ｍＬの注入ループに挿入し、脱硫溶液を２．０ｍＬの注入ループに挿入した（図３６）。２つのペプチド溶液を、最初に、系溶媒として石油エーテルを使用して、５μｍｏｌスケールでＴピースで合わせた（０．２０ｍＬ／分）。得られた反応流を３７℃でＰＴＦＥコイル反応器（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ、１２．０ｍＬ）に入れた。次いで、反応溶液を、第２のＴピースで脱硫溶液（０．４０ｍＬ／分）と合わせ、３７℃で第２のＰＴＦＥコイル反応器（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ、１．０ｍＬ）に入れ、続いて、Ｒａｙｏｎｅｔ ＲＰＲ−１００光反応器（λ＝２５４ｎｍ、３５Ｗ、室温）内の最終ＰＦＡコイル反応器（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ、２．５ｍＬ）に入れた。反応混合物を６バールＢＰＲ（総処理時間３８分）を通して回収し、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて直ちに精製して、綿毛状白色固体を得た。（９．７ｍｇ，４０％，０．８μｍｏｌ／分）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ５．７５分（λ＝２１４ｎｍ，５分にわたり０〜７０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）；計算質量値［Ｍ＋３Ｈ］３＋：１４９８．１，［Ｍ＋４Ｈ］４＋：１１２３．８；質量実測値（ＥＳＩ＋）；１４９８．１［Ｍ＋３Ｈ］３＋，１１２４．０［Ｍ＋４Ｈ］４＋。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）（図３７）．エンフビルチド１３のＮＭＲスペクトルを図６３および６４に示す。
この結果はＣｙｓに加えてチオール化アミノ酸との相溶性と同様に、複雑な標的アセンブリにおけるフロー方法論の有用性を明確に実証する。
ソマトレリン（ｓｏｍａｔｏｒｅｌｉｎ）の合成
ソマトレリンは、成長ホルモン欠乏症を決定するための診断薬として使用される４４残基ペプチドである。ソマトレリンは、Ｃ末端チオエステルを有するペプチド１４（ソマトレリン１−１８、配列番号１４）と、Ｎ末端Ｃｙｓ残基を含むペプチド１５（ソマトレリン１９−４４、配列番号１５）とを反応させることによって、フローのＮＣＬ光脱硫によって調製した（図３８）。
両ペプチドはＦｍｏｃ−ＳＰＰＳを用いて調製した。
Figure 2021525259
ヒドラジン由来の２−クロロトリチルクロリド樹脂（コポリ（スチレン−１％ＤＶＢ）１００−２００メッシュ）にＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（２５０μｍｏｌ、１．１ｍｍｏｌ／ｇ）をロードし、一般的な手順に記載されるように、マイクロ波支援自動化Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳを用いてペプチドを伸長した。Ｎ末端セグメントの１−８、１１−１３および１５−１６位で二重カップリングを行い、１３位（バリン）からＮ−アセチルグリシンキャッピングを行った。合成後、樹脂をＤＭＦ（５×１０ｍＬ）およびＣＨ2Ｃｌ2（５×１０ｍＬ）で洗浄した後、真空中で乾燥した。次いで、完全長樹脂結合ペプチドを、ＴＦＡ／ｉＰｒ3ＳｉＨ／Ｈ2Ｏ（９０：５：５ｖ／ｖ／ｖ）で２時間処理することによって樹脂から切断し、これにより、全ての側鎖保護基の同時脱保護をもたらした。切断カクテルを真空中で濃縮し、次いで粗ペプチドを冷Ｅｔ2Ｏから沈殿させ、真空中で乾燥させた。完全に脱保護されたペプチドアシルヒドラジド（２２５ｍｇ）を、水溶液ライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１ＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ３．０）中で１０ｍＭに溶媒和し、−１５℃に冷却した。これに、ＮａＮＯ2の水溶液（１Ｍ、１０当量、１．１２５ｍＬ）を添加した。１０分後、ＴＦＥＴ（２０当量、１８６μＬ）を添加し、溶液を室温まで温め、４５分間撹拌した（警告：ＴＦＥＴは刺激性であり、急性毒性であり、ヒュームカップボード中で使用すべきである）。チオエステルへの完全な変換をＵＰＬＣ−ＭＳによって確認し、生成物を分取逆相ＨＰＬＣ（４０分間にわたって２０〜３５％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）によって精製して、凍結乾燥後に綿毛状白色固体としてペプチド１４を得た。（３×２５０μｍｏｌ合成；２７２．０ｍｇ，当初の樹脂ロード量に基づく収率１４．６％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ４．２５分（λ＝２１４ｎｍ，５分にわたり０〜５０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）；計算質量値［Ｍ＋３Ｈ］３＋：７１５．７，［Ｍ＋２Ｈ］２＋：１０７３．０，［２Ｍ＋３Ｈ］３＋：１４３０．４。質量実測値（ＥＳＩ＋）：７１５．８［Ｍ＋３Ｈ］３＋，１０７３．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋，１４３０．７［２Ｍ＋３Ｈ］３＋（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）１９Ｆ｛１Ｈ｝ＮＭＲ（４７１ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ−６６．４ｐｐｍ。ソマトレリン（１−１８）１４のＮＭＲスペクトルを図６５および６６に示す。
Figure 2021525259
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨを、リンクアミド樹脂（コポリ（スチレン−１％ＤＶＢ）１００〜２００メッシュ）（２５０μｍｏｌ）にロードし、ペプチドを、一般的な手順に概説されるように、マイクロ波補助自動化Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳを使用して伸長した。単一カップリングによって設置された３２位のＦｍｏｃ−（ＤＭＢ）Ｇｌｙ−ＯＨを除いて、配列中の全ての残基を二重カップリングした。この残基を取り込んだ後、Ｎ−アセチルグリシンを用いてキャッピングを行った。合成後、樹脂をＤＭＦ（５×１０ｍＬ）、次いでＣＨ2Ｃｌ2（５×１０ｍＬ）で十分に洗浄し、次いで真空中で乾燥させ、完全に保護された樹脂結合ペプチドを固体支持体から切断し、ＴＦＡ／ｉＰｒ3ＳｉＨ／Ｈ2Ｏ／チオアニソール／２，２’−（エチレンジオキシ）ジエタノール（９０：２．５：２．５：２．５：２．５：２．５：２．５／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）の溶液を使用して脱保護した。反応物を室温で２時間撹拌し、真空中で濃縮した。粗ペプチド１５を冷Ｅｔ2Ｏから沈殿させ、生成物を分取逆相ＨＰＬＣ（４０分かけて５〜３０％Ｂ、０．１％ＴＦＡ）によって精製して、凍結乾燥後に白色固体としてペプチド１５を得た（２３４．０ｍｇ，当初の樹脂ロード量に基づく収率２４％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ３．３５分（λ＝２１４ｎｍ，５分にわたり０〜５０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）；計算質量値［Ｍ＋６Ｈ］６＋：５０８．１，［Ｍ＋５Ｈ］５＋：６０９．５，［Ｍ＋４Ｈ］４＋：７６１．７，［Ｍ＋３Ｈ］３＋：１０１５．２，［Ｍ＋２Ｈ］２＋：１５２２．３。質量実測値（ＥＳＩ＋）：５０８．２［Ｍ＋６Ｈ］６＋，６０９．７［Ｍ＋５Ｈ］５＋，７６１．９［Ｍ＋４Ｈ］４＋，１０１５．５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，１５２２．６［Ｍ＋２Ｈ］２＋。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）．ソマトレリン（１９−４４）１５のＮＭＲスペクトルを図６７および６８に示す。
Figure 2021525259
ソマトレリン（１９−４４）１５（３０μｍｏｌ、１１５．２ｍｇ、１０ｍＭ）の溶液を、５０ｍＭ ＴＣＥＰおよび５．０Ｍ ２−ＭＩＭを含むライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．０）中で調製した。ソマトレリン（１−１８）トリフルオロエチルチオエステル１４（６０μｍｏｌ、１４９．１ｍｇ、２０ｍＭ）の第２の溶液を、５０ｍＭ ＴＣＥＰを含むライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ６．２）中で調製した。８００ｍＭ ＴＣＥＰおよび２５０ｍＭ ＧＳＨを含むライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）中で脱硫溶液を調製した。ペプチド溶液を３．０ｍＬの注入ループに挿入し、脱硫溶液を７．０ｍＬの注入ループに挿入した（スキームＳ２４）。２つのペプチド溶液を、まず、系溶媒として石油エーテルを使用して、３０μｍｏｌスケールでＴピースで合わせた（０．２５ｍＬ／分）。得られた反応流を３７℃でＰＴＦＥコイル反応器（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ、５．０ｍＬ）に入れた。次いで、反応溶液を、第２のＴピースで脱硫溶液（０．１０ｍＬ／分）と合わせ、３７℃で第２のＰＴＦＥコイル反応器（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ、１．０ｍＬ）に入れ、続いて、Ｒａｙｏｎｅｔ ＲＰＲ−１００光反応器（λ＝２５４ｎｍ、３５Ｗ、室温）内の最終ＰＦＡコイル反応器（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ、２．５ｍＬ）に入れた。反応混合物を６バールＢＰＲを通して回収し（総処理時間２７分）、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて直ちに精製し、綿毛状白色固体を得た。（１０２．９ｍｇ，５７％，１．４μｍｏｌ／分）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ４．２０分（λ＝２１４ｎｍ，５分にわたり０〜７０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）；計算質量値［Ｍ＋７Ｈ］７＋：７２０．８，［Ｍ＋６Ｈ］６＋：８４０．８，［Ｍ＋５Ｈ］５＋：１００８．７，［Ｍ＋４Ｈ］４＋：１２６０．７，［Ｍ＋３Ｈ］３＋：１６８０．６。質量実測値（ＥＳＩ＋）：７２０．９［Ｍ＋７Ｈ］７＋，８４０．９［Ｍ＋６Ｈ］６＋，１００８．８［Ｍ＋５Ｈ］５＋，１２６０．９［Ｍ＋４Ｈ］４＋，１６８０．９［Ｍ＋３Ｈ］３＋。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）（図３９）ソマトレリン１６のＮＭＲスペクトルを図６９および７０に示す。
モデルペプチドおよびペプチドチオエステル
Figure 2021525259
ペプチド１は、リンクアミド樹脂上でのＦｍｏｃ−ストラテジーＳＰＰＳの概要手順を用いて合成した（７３０μｍｏｌ）。ペプチドを樹脂から切断し、一般的な手順に従って酸性条件下で脱保護した。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜２０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド１を白色固体で得た（２５７ｍｇ，収率５７％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ３．９９分（５分にわたり０〜１５％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：６１２．２。質量実測値（ＥＳＩ+）：６１２．５［Ｍ＋Ｈ］+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（１、配列番号１）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ）を図４５に示す。
Figure 2021525259
完全側鎖保護ペプチド２は、２−ＣＴＣ樹脂上でのＦｍｏｃ−ストラテジーＳＰＰＳの概要手順を用いて合成した（７３０μｍｏｌ）。保護ペプチドを、一般的な手順に従って、樹脂から切断し、チオエステル化し、脱保護した。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド２を白色固体で得た（２８８ｍｇ，収率４６％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ３．６３分（５分にわたり０〜３０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：８６５．４，［Ｍ＋２Ｈ］２＋：４３３．２。質量実測値（ＥＳＩ+）：８６５．８［Ｍ＋Ｈ］＋，４３３．４［Ｍ＋２Ｈ］2+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ（２、配列番号２）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ）を図４６に示す。
Figure 2021525259
完全側鎖保護ペプチド３は、２−ＣＴＣ樹脂上でのＦｍｏｃ−ストラテジーＳＰＰＳの概要手順を用いて合成した（３５０μｍｏｌ）。保護ペプチドを、一般的な手順に従って、樹脂から切断し、チオエステル化し、脱保護した。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド３を白色固体で得た（１２８ｍｇ，収率４１％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ３．８９分（５分にわたり０〜３０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：８９３．５，［Ｍ＋２Ｈ］2+：４４７．２。質量実測値（ＥＳＩ+）：８９３．９［Ｍ＋Ｈ］+，４４７．４［Ｍ＋２Ｈ］2+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ（３、配列番号３）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ）を図４７に示す。
Figure 2021525259
ペプチドアシルヒドラジド４は、ヒドラジンで官能化された２−ＣＴＣ樹脂上でのＦｍｏｃ−ストラテジーＳＰＰＳの概要手順を用いて合成した（４８０μｍｏｌ）。樹脂からの切断および全体の脱保護を、一般的な手順に従って酸性条件下で行い、続いて、粗生成物のジアゾ化およびチオエステル化を行なった。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド４を白色固体で得た（３５１ｍｇ，収率８６％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ３．７３分（５分にわたり０〜３０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：８４７．４，［Ｍ＋２Ｈ］2+：４２４．２．質量実測値（ＥＳＩ+）：８４７．７［Ｍ＋Ｈ］＋，４２４．４［Ｍ＋２Ｈ］2+（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）19Ｆ｛1Ｈ｝ＮＭＲ（４７１ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ−６６．５ｐｐｍ。Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3（４、配列番号４）のＮＭＲスペクトルを図４８〜５０に示す。
Figure 2021525259
ペプチドアシルヒドラジド５は、ヒドラジンで官能化された２−ＣＴＣ樹脂上でのＦｍｏｃ−ストラテジーＳＰＰＳの概要手順を用いて合成した（６４０μｍｏｌ）。樹脂からの切断および全体の脱保護を、一般的な手順に従って酸性条件下で行い、続いて、粗生成物のジアゾ化およびチオエステル化を行なった。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド５を白色固体で得た（４３１ｍｇ，収率７７％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ４．０５分（５分にわたり０〜３０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：８７５．４，［Ｍ＋２Ｈ］2+：４３８．２。質量実測値（ＥＳＩ+）：８７５．８［Ｍ＋Ｈ］+，４３８．４［Ｍ＋２Ｈ］2+（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）。19Ｆ｛1Ｈ｝ＮＭＲ（４７１ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ−６６．５ｐｐｍ。Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳＣＨ2ＣＦ3（５、配列番号５）のＮＭＲスペクトルを図５１〜５３に示す。
Figure 2021525259
６のバッチ合成：Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（１２．２ｍｇ，２０μｍｏｌ，５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ４（３３．９ｍｇ，４０μｍｏｌ，１０ｍＭ）とのバッチでのライゲーション（２．５Ｍ ２−ＭＩＭ，３７°Ｃ，ｔ＝６．０分）を反応溶液を活発に撹拌しながら一般的な手順に従って行なった。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド６を白色固体で得た（１８．３ｍｇ，収率６８％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ５．２３分（５分にわたり０〜２８％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：１３４２．６，［Ｍ＋２Ｈ］2+：６７１．８．質量実測値（ＥＳＩ+）：１３４３．６［Ｍ＋Ｈ］+，６７２．４［Ｍ＋２Ｈ］2+．（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）．
６のフロー合成：Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（１２．２ｍｇ，２０μｍｏｌ，５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ４（３３．９ｍｇ，４０μｍｏｌ，１０ｍＭ）とのライゲーションを一般的な手順に従って２．５Ｍ ２−ＭＩＭによりフローで行なった（ポンプＡ，Ｂ：０．５０ｍＬ／分，反応器Ｉ：３．０ｍＬ，Ｔ＝３７Ｃ， τＩ（滞留時間）＝３．３分）。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド６を白色固体で得た（１８．０ｍｇ，収率６７％，３．４μｍｏｌ／分）。分析データは上記で調製した６と同じである。Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（６、配列番号６）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ）を図５４に示す。
Figure 2021525259
７のバッチ合成：Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（１２．２ｍｇ，２０μｍｏｌ，５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ５（３５．０ｍｇ，４０μｍｏｌ，１０ｍＭ）とのバッチでのペプチドライゲーション（３７°Ｃ，２．５Ｍ ２−ＭＩＭ，ｔ＝４０．０分）を反応溶液を活発に撹拌しながら一般的な手順に従って行なった。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド７を白色固体で得た（１８．６ｍｇ，収率６７％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ５．８０分（５分にわたり０〜２８％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：１３７０．７，［Ｍ＋２Ｈ］2+：６８５．８．質量実測値（ＥＳＩ+）：１３７２．１［Ｍ＋Ｈ］+，６８６．３［Ｍ＋２Ｈ］2+（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）
７のフロー合成：Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）（１２．２ｍｇ，２０μｍｏｌ，５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ５（配列番号５）（３５．０ｍｇ，４０μｍｏｌ，１０ｍＭ）とのライゲーションを一般的な手順に従って２．５Ｍ ２−ＭＩＭによりフローで行なった（ポンプＡ，Ｂ：０．５０ｍＬ／分，反応器Ｉ：１０．０ｍＬ，Ｔ＝３７°Ｃ，τＩ ＝１０．８分）。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド７を白色固体で得た（１８．０ｍｇ，収率６５％，３．３μｍｏｌ／分）。分析データは上記で調製した７と同じであった。Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（７、配列番号７）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ）を図５５に示す。
Figure 2021525259
Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）（３．２ｍｇ，５．２μｍｏｌ，２．５ｍＭ）の光脱硫を、既に概説した一般的な手順に従ってバッチで行なった。（λ＝２５４ｎｍ，１２５ｍＭ ＧＳＨ，ｔ＝１．０分）分取逆相ＨＰＬＣによる精製（３０分にわたり０〜２０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド８を白色固体で得た（２．５ｍｇ，収率８２％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ３．７２分（５分にわたり０〜１５％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：５８０．３．質量実測値（ＥＳＩ+）：５８０．４［Ｍ＋Ｈ］+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）Ｈ−ＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（８、配列番号８）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，４００ＭＨｚ）を図５６に示す。
Figure 2021525259
９のバッチ合成，ｉ：Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）（１２．２ｍｇ，２０μｍｏｌ，５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ２（配列番号２）（３４．６ｍｇ，４０μｍｏｌ，１０ｍＭ）とのバッチでのライゲーション（２５０ｍＭ ＴＦＥＴ，２５分）（警告：ＴＦＥＴは刺激性であり、急性毒性であり、ヒュームカップボード中で使用すべきである）、続いてその場での脱硫（２０ｍＭ ＶＡ−０４４，４０ｍＭ ＧＳＨ，３７°Ｃ，ｔ＝１６時間）を反応溶液を活発に撹拌しながら一般的な手順に従って行なった。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド９を白色固体で得た（１８．１ｍｇ，収率６９％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ５．１５分（５分にわたり０〜２８％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：１３１０．６，［Ｍ＋２Ｈ］2+：６５５．８．質量実測値（ＥＳＩ）：１３１１．４［Ｍ＋Ｈ］+，６５６．４［Ｍ＋２Ｈ］2+．（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）．
９のバッチ合成，ｉｉ：Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）（１２．２ｍｇ，２０μｍｏｌ，５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ４（配列番号４）（３３．９ｍｇ，４０μｍｏｌ，１０ｍＭ）とのバッチでのライゲーションを活発に撹拌しながら行い（２．５Ｍ ２−ＭＩＭ，３７°Ｃ，６．０分）、続いてその場での光脱硫（１２５ｍＭＧＳＨ，λ＝２５４ｎｍ，室温，ｔ＝２．５時間）を１５ｍＬのコーニング（商標）Ｆａｌｃｏｎ（商標）ポリプロピレンコニカル遠心管中で一般的な手順に従って行なった。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド９を白色固体で得た（１７．３ｍｇ，収率６６％）。分析データは上記で調製した９と同じであった。
９のフロー合成：Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）（１２．２ｍｇ，２０μｍｏｌ，５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ４（配列番号４）（３３．９ｍｇ，４０μｍｏｌ，１０ｍＭ） とのフローでのライゲーション（２．５Ｍ ２−ＭＩＭ，ポンプＡ，Ｂ：０．２５ｍＬ／分，反応器Ｉ：１．５ｍＬ，３７°Ｃ）、続いて新規のその場での光脱硫（１２５ｍＭ ＧＳＨ，ポンプＣ：０．５０ｍＬ／分，反応器ＩＩ：１．０ｍＬ，反応器ＩＩＩ：１．０ｍＬ，λ＝２５４ｎｍ，室温）を、一般的な手順に従って行なった（τｔｏｔａｌ＝５．０分）。分取逆相ＨＰＬＣによる精製を行い（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド９を白色固体で得た（１７．０ｍｇ，収率６５％，１．６μｍｏｌ／分）。分析データは上記で調製した９と同じであった。Ａｃ−ＬＹＲＡＮＡＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（９、配列番号９）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ）を図５７に示す。
Figure 2021525259
１０のバッチ合成，ｉ：Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）（１２．２ｍｇ，２０μｍｏｌ，５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ３（配列番号３）（３５．７ｍｇ，４０μｍｏｌ，１０ｍＭ）とのバッチでのライゲーション（２５０ｍＭ ＴＦＥＴ，ｔ＝９時間）（警告：ＴＦＥＴは刺激性であり、急性毒性であり、ヒュームカップボード中で使用すべきである）、続いてその場での脱硫（２０ｍＭ ＶＡ−０４４， ４０ｍＭ ＧＳＨ，３７°Ｃ，ｔ＝１６時間）を、反応溶液を活発に撹拌しながら一般的な手順に従って行なった。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド１０を白色固体で得た（１６．４ｍｇ，収率６１％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ５．４７分（５分にわたり０〜２８％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：１３３８．７，［Ｍ＋２Ｈ］2+：６６９．８．質量実測値（ＥＳＩ+）：１３３９．６［Ｍ＋Ｈ］+，６７０．３［Ｍ＋２Ｈ］2+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）
１０のバッチ合成，ｉｉ：Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）（１２．２ｍｇ，２０μｍｏｌ，５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ５（配列番号５）（３５．０ｍｇ，４０μｍｏｌ，１０ｍＭ）とのバッチでのライゲーションを活発に撹拌しながら行い（２．５Ｍ ２−ＭＩＭ，３７°Ｃ，ｔ＝４０．０分）、続いてその場での光脱硫（１２５ｍＭ ＧＳＨ，λ＝２５４ｎｍ，室温，ｔ＝２．５時間）を１５ｍＬのコーニング（商標）Ｆａｌｃｏｎ（商標）ポリプロピレンコニカル遠心管中で一般的な手順に従って行なった。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド１０を白色固体で得た（１７．７ｍｇ，収率６６％）。分析データは上記で調製した１０と同じである。
１０のフロー合成：Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）（１２．２ｍｇ，２０μｍｏｌ，５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ５（配列番号５）（３５．０ｍｇ，４０μｍｏｌ，１０ｍＭ）とのフローでのライゲーション（２．５Ｍ ２−ＭＩＭ，ポンプＡ，Ｂ：０．２０ｍＬ／分，反応器Ｉ：４．０ｍＬ，Ｔ＝３７°Ｃ）、続いて新規のその場での光脱硫（１２５ｍＭ ＧＳＨ，ポンプＣ：０．４０ｍＬ／分，反応器ＩＩ：５．０ｍＬ，反応器ＩＩＩ：１．０ｍＬ，λ＝２５４ｎｍ，室温）を、一般的な手順に従って行なった（τｔｏｔａｌ＝１７．５分）。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチド１０を白色固体で得た（１６．９ｍｇ，収率６３％，１．３μｍｏｌ／分）。分析データは上記で調製した１０と同じである。Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（１０、配列番号１０）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ2Ｏ，５００ＭＨｚ）を図５８に示す。
追加の特性評価
Figure 2021525259
Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）（４．１ｍｇ，６．７０μｍｏｌ，５ｍＭ）１とＡｃ−ＬＹＲＡＮＡ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ４（配列番号４）（１１．３ｍｇ，１３．４μｍｏｌ，１０ｍＭ）とのバッチでのペプチドライゲーションを一般的な手順で詳説されるように、生成物チオエステルのヒドラジン分解無しで行なった（３７°Ｃ，ｔ＝１２．０分）。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ３を白色固体で得た（８．６ｍｇ，収率６２％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ３．５４分（５分にわたり０〜３０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：２０７３．０，［Ｍ＋２Ｈ］2+：１０３７．０，［Ｍ＋３Ｈ］３+：６９１．７．質量実測値（ＥＳＩ+）：１０３７．９［Ｍ＋２Ｈ］2+，６９２．２［Ｍ＋３Ｈ］3+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）

Figure 2021525259
Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）（４．４ｍｇ，７．２μｍｏｌ，５ｍＭ）とＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳＣＨ2ＣＦ3 ５（配列番号５）（１２．６ｍｇ，１４．４μｍｏｌ，１０ｍＭ）とのバッチでのペプチドライゲーションを一般的な手順（３７°Ｃ，ｔ＝６０．０分）で詳説されるように、生成物チオエステルのヒドラジン分解無しで行なった。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ４を白色固体で得た（８．９ｍｇ，収率５８％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ３．６２分（５分にわたり０〜３０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋２Ｈ］2+：１０６５．０，［Ｍ＋３Ｈ］3+：７１０．４。質量実測値（ＥＳＩ+）：１０６６．２［Ｍ＋２Ｈ］2+，７１１．０［Ｍ＋３Ｈ］3+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）
Figure 2021525259
１．５当量のＢｏｃ−無水物（４３９ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）を、２ｍＬのＴＨＦおよび２ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム溶液中のＬ−ペニシラミン（２００ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）に加え、１８時間（室温）反応させた。得られた溶液を０℃に冷却し、および０．５当量の過酸化水素（３０ｗｔ％、６８μｌ、０．６７ｍｍｏｌ）を混合しながら滴下し、５分間反応させた。次に、溶液を１Ｍ ＨＣｌ水溶液で酸性化し、化合物を等量の酢酸エチルで３回抽出した。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、濃縮し、次にシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（１％酢酸を含むＣＨ2Ｃｌ2中の０−１０％メタノール）によって精製して、化合物Ｓ５を無定形白色固体（１８５ｍｇ、５５％）として得た。［α］D＋１２７．９（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）；ＩＲ νmax ２９７７，２９３１，１７１２，１６５５，１４９８，１４５６，１３９３，１３６７，１３２７，１２４７，１１５８，１１１６，１０５０，１０２７；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ ４．２３（ｓ，２Ｈ），１．４５（ｓ，１８Ｈ），１．４１（ｓ，６Ｈ），１．３８（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ；13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＭｅＯＤ） δ１７３．５，１５７．６，８０．９，６２．４，５２．０，２８．７，２６．８，２４．９ｐｐｍ；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ20Ｈ36Ｎ2Ｏ8Ｓ2Ｎａの計算質量値［Ｍ＋Ｎａ］+：５１９．１８０５；質量実測値［Ｍ＋Ｎａ］+：５１９．１８１３。
Figure 2021525259
ペプチドＳ６はリンクアミド樹脂上でのＦｍｏｃ−ストラテジーＳＰＰＳの概要手順を用いて合成した（１００μｍｏｌ）。ペプチドを樹脂から切断し、一般的な手順に従って酸性条件下で脱保護した。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜２０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ６を白色固体で得た（１７．４ｍｇ，収率２２％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ４．２６分（５分にわたり０〜１５％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：６８６．８，［２Ｍ＋Ｈ］+：１３７１．５。質量実測値（ＥＳＩ+）：６８６．４［Ｍ＋Ｈ］+，１３７２．０［２Ｍ＋Ｈ］+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）Ｈ−ＣＳＰＭＹＳ−ＮＨ2（Ｓ６、配列番号１８）のＮＭＲスペクトルを図７１および７２に示す。
Figure 2021525259
Ｈ−ＣＳＰＭＹＳ−ＮＨ2 Ｓ６（配列番号１８）（１４．７７，１８．４μｍｏｌ，２．５ｍＭ）の光脱硫を、既に概説した一般的な手順に従ってフローで行なった（λ＝２５４ｎｍ，１２５ｍＭ ＧＳＨ，ｔ＝１．０分）。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり２〜２０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ７を白色固体で得た（１０．５ｍｇ，収率７４％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ５．１０分（５分にわたり０〜１５％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：６５４．３，［Ｍ＋Ｎａ］+：６７７．３，［２Ｍ＋Ｈ］+：１３０７．６。質量実測値（ＥＳＩ+）：６５４．４［Ｍ＋Ｈ］+，６７６．４［Ｍ＋Ｎａ］+，１３０８．３［２Ｍ＋Ｈ］+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）
Ｈ−ＡＳＰＭＹＳ−ＮＨ2（Ｓ７、配列番号１９）のＮＭＲスペクトルを図７３および７４に示す。
Figure 2021525259
ペプチドＳ８はリンクアミド樹脂上でのＦｍｏｃ−ストラテジーＳＰＰＳの概要手順を用いて合成した（１００μｍｏｌ）。ペプチドを樹脂から切断し、一般的な手順に従って酸性条件下で脱保護した。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜２０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ８を白色固体で得た（３９．８ｍｇ，収率４７％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ４．８９分（５分にわたり０〜１５％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：７２９．８，［２Ｍ＋Ｈ］+：１４５７．５。質量実測値（ＥＳＩ+）：７２９．５［Ｍ＋Ｈ］+，１４５７．９［２Ｍ＋Ｈ］+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）Ｈ−ＣＳＰＣ（Ａｃｍ）ＹＳ−ＮＨ2（Ｓ８、配列番号２０）のＮＭＲスペクトルを図７５および７６に示す。
Figure 2021525259
Ｈ−ＣＳＰＣ（Ａｃｍ）ＹＳ−ＮＨ2 Ｓ８（配列番号２０）（３８．９ｍｇ，４６．２μｍｏｌ，２．５ｍＭ）の光脱硫を、既に概説した一般的な手順に従ってフローで行なった（λ＝２５４ｎｍ，１２５ｍＭ ＧＳＨ，ｔ＝１．０分）。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり２〜２０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ９を白色固体で得た（３０．６ｍｇ，収率８２％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ４．４１分（５分にわたり０〜１５％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ−Ａｃｍ＋Ｈ］+：６２６．３，［Ｍ＋Ｈ］+：６９７．３，［Ｍ＋Ｎａ］+：７１９．３，［２Ｍ＋Ｈ］+：１３９３．６。質量実測値（ＥＳＩ+）：６２６．４［Ｍ−Ａｃｍ＋Ｈ］+，６９７．５［Ｍ＋Ｈ］+，７１９．４［Ｍ＋Ｎａ］+，１３９３．５［２Ｍ＋Ｈ］+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）
Ｈ−ＡＳＰＣ（Ａｃｍ）ＹＳ−ＮＨ2（Ｓ９、配列番号２１）のＮＭＲスペクトルを図７７および７８に示す。
Figure 2021525259
ペプチドＳ１０はリンクアミド樹脂上でのＦｍｏｃ−ストラテジーＳＰＰＳの概要手順を用いて合成した（１００μｍｏｌ）。最終カップリングを、１．１当量のＮ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−ペニシラミン二量体Ｓ５（５４．６ｍｇ，１１０μｍｏｌ）を１．１当量のＨＯＡｔ（１５．０ｍｇ，１１０ μｍｏｌ）および１．１当量のＤＩＣ（１７．０μＬ，１１０μｍｏｌ）と共に用いて、室温で１８時間行なった。ペプチドを樹脂から切断し、一般的な手順に従って酸性条件下で脱保護した。粗生成物（６ｍＭ）をＴＣＥＰ水溶液（３００ｍＭ，８ｍＬ）に溶解し、ｐＨ１２に調整し、続いて室温でインキュベートした。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜２０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ１０を白色固体で得た（１８．１ｍｇ，収率２８％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ４．４０分（５分にわたり０〜１５％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：６４０．７，［２Ｍ＋Ｈ］+：１２７９．５。質量実測値（ＥＳＩ+）：６４０．３［Ｍ＋Ｈ］+，１２７９．６［２Ｍ＋Ｈ］+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）Ｈ−ＰｅｎＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（Ｓ１０、配列番号２２）のＮＭＲスペクトルを図７９および８０に示す。
Figure 2021525259
Ｈ−ＰｅｎＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 Ｓ１０（配列番号２２）（１６．９ｍｇ，２２．４μｍｏｌ，２．５ｍＭ）の光脱硫を、既に概説した一般的な手順に従ってフローで行なった（λ＝２５４ｎｍ，１２５ｍＭ ＧＳＨ，ｔ＝１．０分）。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり２〜２０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ１１を白色固体で得た（１３．５ｍｇ，収率８３％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ４．２４分（５分にわたり０〜１５％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：６０８．３，［Ｍ＋Ｎａ］+：６３０．３，［２Ｍ＋Ｈ］+：１２１５．６。質量実測値（ＥＳＩ+）：６０８．３［Ｍ＋Ｈ］+，６３０．４［Ｍ＋Ｎａ］+，１２１６．２［２Ｍ＋Ｈ］+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）Ｈ−ＶＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（Ｓ１１、配列番号２３）のＮＭＲスペクトルを図８１および８２に示す。
Figure 2021525259
ペプチドＳ１２はリンクアミド樹脂上でのＦｍｏｃ−ストラテジーＳＰＰＳの概要手順を用いて合成した（５０μｍｏｌ）。最終カップリングのため、１．１当量のＮ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−３−（２，４，６−トリメトキシベンジルチオール）−Ｌ−アスパラギン酸（２７．６ｍｇ，５５μｍｏｌ）を１．１当量のＨＯＡｔ（７．５ｍｇ，５５μｍｏｌ）および１．１当量のＤＩＣ（８．６μＬ，５５μｍｏｌ）と室温で１８時間カップリングした。ペプチドを樹脂から切断し、一般的な手順に従って酸性条件下で脱保護した。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜２０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ１２を白色固体で得た（１１．８ｍｇ，収率３６％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ３．５９分（５分にわたり０〜１５％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：６５６．２，［２Ｍ＋Ｈ］+：１３１１．５。質量実測値（ＥＳＩ+）：６５６．４［Ｍ＋Ｈ］+，１３１１．４［２Ｍ＋Ｈ］+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）Ｈ−（β−ＳＨ）ＤＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（Ｓ１２、配列番号２４）のＮＭＲスペクトルを図８３および８４に示す。
Figure 2021525259
Ｈ−（β−ＳＨ）ＤＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 Ｓ１２（配列番号２４）（１１．１ｍｇ，１４．４μｍｏｌ，２．５ｍＭ）の光脱硫を、既に概説した一般的な手順に従ってフローで行なった（λ＝２５４ｎｍ，１２５ｍＭ ＧＳＨ，ｔ＝０．５分）。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり２〜２０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ１３を白色固体で得た（５．７ｍｇ，収率５０％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ３．６５分（５分にわたり０〜１５％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：６２４．３，［Ｍ＋Ｎａ］+：６４６．２，［２Ｍ＋Ｈ］+：１２４７．５。質量実測値（ＥＳＩ＋）：６２５．３［Ｍ＋Ｈ］+，６４７．０［Ｍ＋Ｎａ］+，１２４８．６［２Ｍ＋Ｈ］+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）Ｈ−ＤＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（Ｓ１３、配列番号２５）のＮＭＲスペクトルを図８５および８６に示す。
生成物チオエステルのチオリシス
ライゲーション中に生成物チオエステル種が形成されることが観察された。
バッチでのチオリシスとヒドラジン分解のキネティクス研究
生成物チオエステルＳ３またはＳ４の溶液を、６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＴＣＥＰおよび２．５Ｍ ２−ＭＩＭを含む脱気ライゲーション緩衝液（５ｍＭ）（ｐＨ ７．３−７．４）中で調製した。チオリシス試薬（２５０ｍＭ ＧＳＨもしくは２５０ｍＭ ＤＴＴ）または７ｖｏｌ．％Ｎ２Ｈ４・Ｈ２Ｏを含む第２の溶液を６ＭＧｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび３５０ｍＭ ＴＣＥＰを含むライゲーション緩衝液（ｐＨ７．４−７．５）中で調製した。等量の２つの溶液を組み合わせ、３７°Ｃでインキュベートした。５μＬのアリコートを複数の時点で採取し、ミリＱ水中の０．１％ＴＦＡ４５μＬで希釈し、次いですぐにＵＰＬＣで分析した。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε２８０（Ｓ２，Ｓ３）＝３８４０Ｍ-1ｃｍ-1、λ280（６、７）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ−1］での出発物質チオエステルおよび得られたライゲーションペプチドの相対ピーク面積に基づいていた。
フローでのチオリシスのキネティクス研究
６ＭのＧｄｎ・ＨＣｌ、０．１ＭのＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭのＴＣＥＰを含むライゲーション緩衝液（ｐＨ７．１〜７．２）中のモデルペプチドチオエステル４または５（２０ｍＭ）の水溶液流れを、６ＭのＧｄｎ・ＨＣｌ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＴＣＥＰおよび５．０Ｍの２−ＭＩＭを含むライゲーション緩衝液（ｐＨ７．４〜７．５）中のモデルペプチド１（１０ｍＭ）の水溶液流れと、系溶媒として石油エーテルを用いてＴピースで１５０μＬスケールで混合した（個々のポンプ速度；Ｘ＝Ａ：０．２５ｍＬ／分、Ｘ＝Ｖ：０．２０ｍＬ／分）（使用した流れ系については図２７を参照）。この反応流は、３７℃で操作されているＰＴＦＥコイル反応器Ｉ（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ、Ｘ＝Ａ：１．５ｍＬ、Ｘ＝： ４．０ｍＬ）に入った。６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌおよび０．１Ｍ ＨＥＰＥＳを含むライゲーション緩衝液（ｐＨ７．４〜７．５）中のＴＣＥＰ（３５０ｍＭ）およびＧＳＨ（２５０ｍＭ）の第３の溶液を、第２のＴピースでライゲーション混合物と合わせた（個々のポンプ速度；Ｘ＝Ａ：０．５０ｍＬ／分、Ｘ＝Ｖ：０．４０ｍＬ／分）。この反応流をＰＴＦＥコイル反応器ＩＩ（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ、３７℃）に入れ、次いでＰＦＡ反応器ＩＩＩ（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ、１．０ｍＬ）に入れ、Ｒａｙｏｎｅｔ ＲＰＲ−１００光反応器中でλ＝２５４ｎｍ（３５Ｗ、室温）で照射した。反応溶液を、６バールＢＰＲを通して、ミリＱ水中の等容量の中性ＭＰＡＡ（１５ｍＭ）中に回収した。５μＬのアリコートを複数の時点で採取し、ミリＱ水中の０．１％ＴＦＡ４５μＬで希釈し。直ちにＵＰＬＣ分析を行った。チオリシス時間経過は、反応器ＩＩの体積を変更することによって得られた。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε２８０（Ｓ２，Ｓ３）＝３８４０Ｍ-1ｃｍ-1、λ280（６、７）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ−1］での脱硫ペプチド（９，１０）に対する出発物質チオエステル（Ｓ２，Ｓ３）および得られたライゲーション生成物（６，７）の相対ピーク面積に基づいていた。
モデル系の分取スケール反応
新規のネイティブケミカルライゲーション手順を、２０μｍｏｌスケールでバッチおよびフローで行なった
バッチでのネイティブケミカルライゲーション
２つの２．０ｍＬ溶液を調製し、一方はライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４〜７．５）中に１０ｍＭＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１），５０ｍＭ ＴＣＥＰおよび５．０Ｍ ２−ＭＩＭを含み、他方はライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．１〜７．２）中に２０ｍＭのＡｃ−ＬＹＲＡＮＸ−ＳＣＨ2ＣＦ3（４：Ｘ＝Ａ（配列番号４），５：Ｘ＝Ｖ（配列番号５））および５０ｍＭＴＣＥＰを含む。バッチで当量のこれらの反応溶液を活発に混合し、完了時、ミリＱ水中のヒドラジン１水和物（７ｖｏｌ．％）でクエンチし、すぐにＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製した（Ｘ＝Ａ：６，６分，単離収率６８％；Ｘ＝Ｖ：７，４０分，単離収率６７％）。
フローでのネイティブケミカルライゲーション
２つの２．０ｍＬ溶液を調製し、一方はライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４〜７．５）中に０ｍＭ Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１），５０ｍＭ ＴＣＥＰおよび５．０Ｍ ２−ＭＩＭを含み、他方はライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．１〜７．２）中に２０ｍＭ Ａｃ−ＬＹＲＡＮＸ−ＳＣＨ2ＣＦ3（４：Ｘ＝Ａ（配列番号４），５：Ｘ＝Ｖ（配列番号５））および５０ｍＭ ＴＣＥＰを含む。これらの溶液を注入ループに挿入し、系溶媒として石油エーテルを用いて２０μＬスケールでＴピースで合わせた（０．５０ｍＬ／分）。得られた反応流は、３７℃（６バールＢＰＲ）でＰＴＦＥコイル反応器Ｉ（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ，Ｘ＝Ａ：３．０ｍＬ，Ｘ＝Ｖ：１０．０ｍＬ）に入った。これらの反応溶液ヒドラジン１水和物（７ｖｏｌ．％）水溶液のクエンチング溶液に回収し、すぐにＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製した（Ｘ＝Ａ：６，総処理時間６分，単離収率６７％，生産率３．４μｍｏｌ／分；Ｘ＝Ｖ：７，総処理時間１５分，単離収率６５％，生産率３．３μｍｏｌ／分。処理時間とは、完全な注入と反応にかかる合計時間を指す。）
バッチでの標準ワンポットライゲーション−光脱硫
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．によって開発された標準ワンポットライゲーション−光脱硫バッチ手順を、ここで報告されているフロー手法との比較を提供するために調べた。この標準的な手順を、アラニンとバリンの両方の接合部において２０μｍｏｌスケールでバッチで実行した。２つのライゲーション溶液を調製し、一方はライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４〜７．５）中にＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）（１０ｍＭ）およびＴＣＥＰ（５０ｍＭ）を含み、他方はライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４〜７．５）中にＡｃ−ＬＹＲＡＮＸ−Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｅｔ（２０ｍＭ，Ｘ＝Ａ：２（配列番号２），Ｘ＝Ｖ：３（配列番号３））およびＴＣＥＰ（５０ｍＭ）を含むＶＡ−０４４（４０ｍＭ），ＧＳＨ（８０ｍＭ）およびＴＣＥＰ（３５０ｍＭ）を含む脱硫溶液もライゲーション緩衝液（６ＭＧｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）４．０ｍＬ中に調製した。全ての溶液を１０分間脱気し、その後、２つのライゲーション緩衝液を合わせて、ＴＦＥＴ（２５０ｍＭ）をすぐに添加した（警告：ＴＦＥＴは刺激性であり、急性毒性であり、ヒュームカップボード中で使用すべきである）。このライゲーション混合物を３７℃で活発に混合し、反応の進行をＵＰＬＣでモニターした。完了時（Ｘ＝Ａ：２５分，Ｘ＝Ｖ：９時間）、脱硫溶液を添加し、反応混合物を３７℃で活発に混合した。ＵＰＬＣ分析で判断した完了時（Ｘ＝Ａ：１６時間，Ｘ＝Ｖ：１６時間）、純粋な脱硫ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣを用いて単離した。（Ｘ＝Ａ：９，総処理時間１６．５時間，単離収率６９％；Ｘ＝Ｖ：１０，総処理時間２５．０時間，単離収率６１％。処理時間とは、完全な注入と反応にかかる合計時間を指す）。
バッチでのワンポットライゲーション−光脱硫
ワンポットライゲーション−光脱硫手順を、２０μｍｏｌスケールでバッチおよびフローで行った。
２つの２．０ｍＬ溶液を調製した：一方は脱気ライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４〜７．５）中に１０ｍＭ Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）、５０ｍＭ ＴＣＥＰおよび５．０Ｍ ２−ＭＩＭを含み、他方はライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１〜７．２）中に２０ｍＭ Ａｃ−ＬＹＲＡＮＸ−ＳＣＨ2ＣＦ3（４：Ｘ＝Ａ（配列番号４）、５：Ｘ＝Ｖ（配列番号５））および５０ｍＭ ＴＣＥＰを含む。５．０ｍｌのライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４〜７．５）中にＧＳＨ（２５０ｍＭ）およびＴＣＥＰ（３５０ｍＭ）を含む脱硫溶液を調製した。脱気の際に、２つのライゲーション溶液を合わせ、３７℃で活発に混合した。ＵＰＬＣ（Ｘ＝Ａ：６分、Ｘ＝Ｖ：４０分）によって決定された完全なライゲーションの際に、反応溶液を１５ｍＬのコーニング（商標）Ｆａｌｃｏｎ（商標）ポリプロピレンコニカル遠心管に移し、４．０ｍＬの脱硫溶液と合わせた。この混合物にλ＝２５４ｎｍ（３５Ｗ、室温）で光照射した。ＵＰＬＣ（Ｘ＝Ａ：２．５時間；Ｘ＝Ｖ：２．５時間）による完了のとき、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて直ちに生成物を単離した（Ｘ＝Ａ：９、総処理時間２．６時間、単離収率６６％；Ｘ＝Ｖ：１０、総処理時間３．２時間、単離収率６６％。処理時間とは、完全な注入と反応にかかる合計時間を指す）。
フローでのライゲーション−光脱硫
２つの２．０ｍＬ溶液を調製した：一方は脱気ライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４〜７．５）中に１０ｍＭ Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１），５０ｍＭ ＴＣＥＰおよび５．０Ｍ ２−ＭＩＭを含み、他方はライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１〜７．２）中に２０ｍＭ Ａｃ−ＬＹＲＡＮＸ−ＳＣＨ2ＣＦ3（４：Ｘ＝Ａ（配列番号４），５：Ｘ＝Ｖ（配列番号５））および５０ｍＭ ＴＣＥＰを含む。脱気ライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４〜７．５）５．０ｍＬ中にＧＳＨ（２５０ｍＭ）およびＴＣＥＰ（３５０ｍＭ）を含む脱硫溶液を調製した。これらの溶液を注入ループにロードし、２つのペプチド溶液を系溶媒として石油エーテルを用いて２０μＬスケールでＴピースにおいて合わせた（Ｘ＝Ａ：０．２５ｍＬ／分，Ｘ＝Ｖ：０．２０ｍＬ／分）。得られた反応流は、３７℃でＰＴＦＥコイル反応器Ｉ（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ，Ｘ＝Ａ：１．５ｍＬ，Ｘ＝Ｖ：４．０ｍＬ）に入った。続いて、反応溶液は第２のＴピースで脱硫溶液と合わせ（Ｘ＝Ａ：０．５ ｍＬ／分；Ｘ＝Ｖ：０．４０ｍＬ／分）、３７℃で第２のＰＴＦＥコイル反応器ＩＩ（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ，Ｘ＝Ａ：１．０ｍＬ，Ｘ＝Ｖ：５．０ｍＬ））に入れ、次いでＲａｙｏｎｅｔ ＲＰＲ−１００光反応器（λ＝２５４ｎｍ，３５Ｗ，室温）中でＰＦＡ反応器ＩＩＩ（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ、１．０ｍＬ）に入れた。反応混合物を、６バールＢＰＲを通して、回収し、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて直ちに精製した（Ｘ＝Ａ：９，総処理時間０．２６時間，単離収率６５％，生産率１．６μｍｏｌ／分；Ｘ＝Ｖ：１０，総処理時間０．４６時間，単離収率６３％，生産率１．３μｍｏｌ／分処理時間とは、完全な注入と反応にかかる合計時間を指す）。
セレノエステルを用いたフローでのネイティブケミカルライゲーション
モデルペプチドＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）とモデルペプチドＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５（配列番号２７）との間のフローでのモデルＮＣＬ反応を行った（図４０Ａ）。
モデルペプチドＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）を６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ６．２または７．０）を含むライゲーション緩衝液（１０ｍＭ，１．０当量．）中で溶媒和させた。モデルペプチドＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５（配列番号２７）の第２の溶液を６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭ ＴＣＥＰを含むライゲーション緩衝液（２０ｍＭ，２．０当量．；または１５ｍＭ，１．５当量）（ｐＨ６．２または７．０）で調製した。モデルペプチドＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５（配列番号２７）を、ＷＯ２０１６／１３８５６３に記載の方法に従って調製した。これらの溶液を注入ループに挿入し、系溶媒として石油エーテルを用いて１５０μＬスケールでＴピースで合わせた。得られた反応流は、３７℃（６バールＢＰＲ）でＰＴＦＥコイル反応器（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ）に入った。等体積のミリＱ水中のＮ2Ｈ4・Ｈ2Ｏの７Ｖｏｌ％を使用して、回収時に反応溶液をクエンチした。ライゲーション時間経過は、滞留時間を調節するために反応器容積および流速を変更することによって得られた。クエンチした溶液の１０μＬのアリコートを採取し、ミリＱ水中の０．１％ＴＦＡ４０μＬで希釈し、次いでＵＰＬＣによって分析した。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε280（Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）＝１２８０Ｍ-1ｃｍ-１，ε280（Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ-１］での出発物質Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）および所望のライゲーション生成物Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（配列番号７）の相対ピーク面積に基づいていた。
セレノエステルを用いたバッチでのネイティブケミカルライゲーション
モデルペプチドＨ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）を６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ６．２または７．０）を含むライゲーション緩衝液（１０ｍＭ，１．０当量．）中で溶媒和させた。モデルペプチドＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５（配列番号２７）の第２の溶液を、６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭ ＴＣＥＰを含むライゲーション緩衝液（ｐＨ６．２または７．０）で調製した（２０ｍＭ，２．０当量；または１５ｍＭ，１．５当量．；または１２．５ｍＭ，１．２５当量．）。モデルペプチドＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈ（配列番号２７）を、ＷＯ２０１６／１３８５６３に記載の方法に従って調製した。これらの溶液を合わせて３７℃でインキュベートした。ライゲーション時間経過は、５μＬのアリコートを等量の７ｖｏｌ％Ｎ2Ｈ4・Ｈ2Ｏを含むミリＱ水中でクエンチすることによって得た。この溶液をミリＱ水中の０．１％ＴＦＡ４０μＬで希釈し、次いでＵＰＬＣで分析した。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε280（Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）＝１２８０Ｍ-1ｃｍ-１，ε280（Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ-１］での出発物質Ｈ−ＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2 １（配列番号１）および所望のライゲーション生成物Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＣＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（配列番号７）の相対ピーク面積に基づいていた。
モデルペプチド１とモデルペプチドＳ１５の間の、チオールまたはセレノール添加剤を含まないバッチおよびフローでのライゲーション反応のキネティクスを図４０Ｂ−Ｅに示す。
フローでの光脱セレン化
Ｈ−ＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2二量体Ｓ１４（配列番号２６）を６Ｍ Ｇｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳを含む脱気ライゲーション緩衝液（２．５ｍＭ）（ｐＨ６．２〜６．３）中で溶媒和させた。６Ｍ Ｇｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳを含む脱気ライゲーション緩衝液（ｐＨ６．２〜６．３）中で溶媒和したＡｃ−ＬＹＲＡＮＦ−ＳｅＰｈＳ１６（配列番号２８）（６ｍＭ，１．２当量）を含む第２の溶液を調製した。これらの２つの溶液を混合し、３７℃で１５分インキュベートし、その時点でのＵＰＬＣ−ＭＳ分析（Ｈ2Ｏ中１／１０希釈、勾配：５分にわたりＨ2Ｏ［０．１％ＦＡ］中０〜４０％ＭｅＣＮ）によりライゲーションが完了まで進んだことが示された。等量の石油エーテルをライゲーション混合物に加え、続いてデカントして沈殿したＤＰＤＳを除去した。次に、抽出されたライゲーション混合物を注入ループに挿入し、第２の注入ループには、トリス（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（５０ｍＭ，１０量）の６Ｍ Ｇｎ・ＨＣｌ，０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０〜７．２）緩衝液中の溶液を挿入した。次に、これらのループを個々の流量でフロー系に注入して、非混和性システム溶媒として石油エーテルを使用して、所望の滞留時間を与えた。２つの溶液をＴピースで混合し、得られた反応流をＲａｙｏｎｅｔ ＲＰＲ−１００ＵＶ光反応器内のＰＦＡコイル反応器にλ＝２５４ｎｍ（３５Ｗ、３７℃）で２分の滞留時間入れた。次に、反応溶液は６バールの背圧調節器（ＢＰＲ）を介して系から排出され、ＵＰＬＣ−ＭＳ分析によって反応の完了が判断された（Ｈ2Ｏ中１／１０希釈，勾配：５分にわたりＨ２Ｏ［０．１％ＦＡ］中０〜４０％ＭｅＣＮ）．
フローでのジセレニドセレノエステルライゲーション−光脱セレン化
２つの０．５ｍＬ溶液を調製した：一方は脱気ライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．２Ｍ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ，ｐＨ４．７）中に５ｍＭの二量体（Ｈ−ＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2 Ｓ１４（配列番号２６）を含み、他方はライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．２Ｍ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ，ｐＨ４．７）中に１２．５ｍＭ Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５（配列番号２７）を含む。脱気ライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．２Ｍ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ，ｐＨ５．５）１．０ｍＬ中にＴＣＥＰ（１０ｍＭまたは１００ｍＭ）を含む脱セレン化溶液を調製した。これらの溶液を注入ループに挿入し、２つのペプチド溶液を系溶媒として石油エーテルを用いてＴピースで合わせた。得られた反応流は、３７℃でＰＴＦＥコイル反応器Ｉ（０．５ｍ×１．６ｍｍ，５分）に入った。続いて、反応溶液は第２のＴピースで脱セレン化溶液と合わせ、３７℃でＲａｙｏｎｅｔ ＲＰＲ−１００光反応器（λ＝２５４ｎｍ，３５Ｗ，室温）中の第２のＰＴＦＥコイル反応器ＩＩ（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ）に入れた。反応混合物を、６バールＢＰＲを通して回収し、ＵＰＬＣを用いて直ちに分析した。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε280（（Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2）＝５１２０Ｍ-1ｍ-１，ε280（Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ-１］でのライゲーション生成物（Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2（配列番号２９）および所望の脱セレン化生成物Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＡＳＰＧＹＳ−ＮＨ2（配列番号１０）の相対ピーク面積に基づいていた。
フローでの還元型ジセレニド−セレノエステルライゲーション
２つの０．５ｍＬ溶液を調製した：一方は脱気ライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．２Ｍ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ，ｐＨ．０）中に（Ｈ−ＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2 Ｓ１４（配列番号２６）（５ｍＭ，０．５ｍＭ，０．０５ｍＭ；二量体に対して），ＴＣＥＰ（５０ｍＭ），およびＤＰＤＳ（１０ｍＭ）を含み、他方はライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ，０．２Ｍ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ，ｐＨ６．０）中に１．２５当量。Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５（配列番号２７）（１２．５ｍＭ，１．２５ｍＭ，０．１２５ｍＭ），ＴＣＥＰ（５０ｍＭ），およびＤＰＤＳ（１０ｍＭ）を含む。これらの溶液を注入ループにロードし、２つのペプチド溶液を系溶媒として石油エーテルを用いてＴピースで合わせた。得られた反応流は、３７℃でＰＴＦＥコイル反応器Ｉ（０．５ｍｍ×１．６ｍｍ）に入った。反応混合物を、６バールＢＰＲを通して、回収し、ＵＰＬＣを用いて直ちに分析した。変換推定値は、λ＝２８０ｎｍ［ε280（Ｓ１４）＝２５６０Ｍ-1ｃｍ-１，ε280（（Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2）＝５１２０Ｍ-1ｃｍ-１］での出発物質（Ｈ−ＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2 Ｓ１４および所望のライゲーション生成物（Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2（配列番号２９）の相対ピーク面積に基づいていた。
溶液相セレノエステル化
粗側鎖保護ペプチドを乾燥ＤＭＦ（２０ｍＭ）に溶解し、０℃に冷却した。これにＤＰＤＳ（３０当量）、続いてＢｕ3Ｐ（３０当量）をアルゴン雰囲気下で３時間撹拌しながら加えた。溶液を室温に温め、窒素流下で濃縮した。脱保護および後処理は、樹脂上の完全に保護されたペプチドについて記載された酸性脱保護条件を用いて達成された。この手順を用いてエピマー化は観察されなかった。
希釈時のバッチでの還元型ジセレニド−セレノエステルライゲーション
高希釈でのフローでの還元型ジセレニド−セレノエステルライゲーションのための最適化されたプロトコルを確立し、本発明者らは、バッチでの還元型ジセレニド−セレノエステルライゲーションを行なうことができるかどうかを調べた。驚くべきことに、本発明者らは、高希釈でのバッチでの還元型ジセレニド−セレノエステルライゲーションが添加剤の存在下で進行することを見出した。
２つの０．５ｍＬ溶液を調製した：一方はライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．２Ｍ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ｐＨ５．２）中に（Ｈ−ＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2 Ｓ１４（配列番号２６）（５ｍＭ、０．１ｍＬ；０．５ｍＭ、０．１ｍＬ；または０．０５ｍＭ、１．０ｍＬ；二量体に対して）、ＴＣＥＰ（３０ｍＭ）、およびＤＰＤＳ（２０ｍＭ）を含み、他方は、ライゲーション緩衝液（６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、０．２Ｍ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ｐＨ ５．２）中にＡｃ−ＬＹＲＡＮＶ−ＳｅＰｈＳ１５（配列番号２７）（２０ｍＭ、０．１ｍＬ；２ｍＭ、０．１ｍＬ；または０．２ｍＭ、１．０ｍＬ）、ＴＣＥＰ（３０ｍＭ）、およびＤＰＤＳ（２０ｍＭ）を含む。これらの溶液を合わせ、３７℃でインキュベートした。５ｍＭまたは０．５ｍＭ（Ｈ−ＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2（配列番号２６）モノマーの最終濃度を含む反応混合物のライゲーション時間経過は、ミリＱ水中７ｖｏｌ％の等量のＮ2Ｈ4・Ｈ2Ｏで５μＬの反応アリコートをクエンチすることによって得られた。１０分後、これらの溶液をミリＱ水中の１．５％ＴＦＡ２０μＬで希釈し、ＵＰＬＣで分析した。０．０５ｍＭ（Ｈ−ＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2モノマーを含む反応混合物について、１００μＬアリコートをミリＱ水中３０ｖｏｌ％Ｎ2Ｈ4・Ｈ2Ｏ１０μＬでクエンチし、次いで１０分後にミリＱ水中３０ｖｏｌ％ＴＦＡ１１μＬで希釈し、続いてＦＬＲ検出器と結合した分析ＨＰＬＣで分析した。変換推定値は、出発物質（Ｈ−ＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2 Ｓ１４（配列番号２６）とλ＝２８０ｎｍでの所望のライゲーション生成物（Ａｃ−ＬＹＲＡＮＶＵＳＰＧＹＳ−ＮＨ2）2（配列番号２９）の相対ピーク面積に基づいていた。
Figure 2021525259
ペプチドＳ１４はリンクアミド樹脂上でのＦｍｏｃ−ストラテジーＳＰＰＳの概要手順を用いて合成した。ペプチドを樹脂から切断し、一般的な手順に従って酸性条件下で脱保護した。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜２０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ１４を白色固体で得た（７８ｍｇ，収率６１％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ３．７９分（５分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：１３１７．４，［Ｍ＋２Ｈ］2+：６５９．２．質量実測値（ＥＳＩ+）：１３１７．３［Ｍ＋Ｈ］+，６５９．３［Ｍ＋２Ｈ］2+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）

Figure 2021525259
完全側鎖保護ペプチドＳ１５は２−ＣＴＣ樹脂上でのＦｍｏｃ−ストラテジーＳＰＰＳの概要手順を用いて合成した。保護されたペプチドを樹脂から切断し、一般的な手順に従ってセレノエステル化および脱保護した。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ１５を白色固体で得た（４２８ｍｇ，収率７７％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ４．７１分（５分にわたり０〜６０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：９１７．４。質量実測値（ＥＳＩ+）：９１７．４［Ｍ＋Ｈ］+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）
Figure 2021525259
完全側鎖保護ペプチドＳ１６は２−ＣＴＣ樹脂上でのＦｍｏｃ−ストラテジーＳＰＰＳの概要手順を用いて合成した。保護されたペプチドを樹脂から切断し、一般的な手順に従ってセレノエステル化および脱保護した。分取逆相ＨＰＬＣによる精製（４０分にわたり０〜４０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ）、続いて凍結乾燥を行い、ペプチドＳ１６を白色固体で得た（１３．２ｍｇ，収率３７％）。ＵＰＬＣ：Ｒｔ４．５２分（５分にわたり０〜６０％Ｂ，０．１％ＴＦＡ，λ＝２１４ｎｍ）；計算質量値［Ｍ＋Ｈ］+：９６５．４。質量実測値（ＥＳＩ+）：９６５．３［Ｍ＋Ｈ］+。（ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＵＰＬＣ−ＭＳの勾配と洗浄のサイクル全体にわたって収集した。）
当業者であれば、本開示の広範な一般的範囲から逸脱することなく、上述の実施形態に対して多数の変形および/または修飾を行うことができることを理解するのであろう。
したがって、本実施形態はすべての点で例示的であり、限定的ではないと考えられるべきである。
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Claims (28)

  1. （ｉ）エステルを
    （ｉｉ）システイン、シスチン、チオール誘導体化アミノ酸、ジスルフィド誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノール誘導体化アミノ酸、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む分子；
    と反応させる工程を含み、
    前記エステルがチオエステルまたはセレノエステルである、
    アミド含有化合物のフローでの製造方法。
  2. 前記アミド含有化合物がポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ポリペプチドが式（Ｉ）：
    Figure 2021525259
     で定義され、前記エステルは式（ＩＩ）：
    Figure 2021525259
     で定義され、
    システイン、チオール誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、およびセレノール誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む前記分子は式（ＩＩＩ）：
    Figure 2021525259
     で定義され、
    シスチン、ジスルフィド誘導体化アミノ酸、セレノシスチン、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択される末端アミノ酸を含む前記分子は式（ＩＶ）：
    Figure 2021525259
     で定義され、
    式中、
    Ｎtermは前記ポリペプチドのＮ末端であり；
    Ｃtermは前記ポリペプチドのＣ末端であり；
    ＡＡはアミノ酸であり；
    Ｎは整数であり；
    （ＡＡ）nはアミノ酸モノマーをｎ数含むポリペプチドを表し；
    ＤＧは、チオレートとセレノエートから選択される置換可能な基であり；
    Figure 2021525259
     は、システイン、シスチン、チオール誘導体化アミノ酸、ジスルフィド誘導体化アミノ酸、セレノシステイン、セレノシスチン、セレノール誘導体化アミノ酸、およびジセレニド誘導体化アミノ酸からなる群より選択されるライゲーション部位のチオール、ジスルフィド、セレノールまたはジセレニド官能化アミノ酸残基である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記反応がチオール添加剤またはセレノール添加剤の存在下で行われ、前記エステルを反応性エステルに変換する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記エステルが、エチル３−メルカプトプロピオン酸チオエステル、還元型Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）チオエステル、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）チオエステル、メルカプトプロピオン酸−ロイシンチオエステル、ｔｅｒｔ−ブチルチオールチオエステル、メルカプトプロパノイルグリシンチオエステル、セレノアセトアミドセレノエステル、セレノプロピオン酸−イソロイシンセレノエステル、および（９−フルオレニルメチル）セレノエステルからなる群より選択される請求項４に記載の方法。
  6. 前記エステルがチオエステルであり、
    前記チオール添加剤が、トリフルオロエタンチオール、４−メルカプトフェニル酢酸、メルカプトエチルスルホネート、チオグリコール酸メチル、チオフェノール、およびベンジルメルカプタンからなる群より選択され、
    前記セレノール添加剤がアリールセレノールである、請求項４または５に記載の方法。
  7. 前記エステルがセレノエステルであり、前記セレノール添加剤がアリールセレノールである、請求項４または５に記載の方法。
  8. 前記アリールセレノールがフェニルセレノールおよび４−セレノフェニル酢酸からなる群より選択される、請求項６または７に記載の方法。
  9. 前記エステルがチオール添加剤またはセレノール添加剤の非存在下で前記分子中の前記末端アミノ酸と反応することができる反応性エステルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記反応性エステルが、トリフルオロエチルチオエステル、４−メルカプトフェニル酢酸チオエステル、メルカプトエチルスルホネートチオエステル、メチルチオグリコール酸チオエステル、チオフェニルチオエステル、ベンジルメルカプタンチオエステル、フェニルセレノエステル、および４−セレノフェニル酢酸セレノエステルからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記反応がチオール添加剤またはセレノール添加剤の非存在下で行なわれる、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記反応が水溶液中で行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記反応が第１の求核剤の存在下で行われ、前記反応の速度を加速する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記第１の求核剤がイミダゾールを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記第１の求核剤が２−メチルイミダゾール、イミダゾールおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 第２の求核剤を添加して、前記エステルと反応する前記アミド含有化合物により形成された生成物エステルをチオリシス分解、アミノリシス分解、加水分解またはヒドラジン分解する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記第２の求核剤が、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、システイン、イミダゾール、アミン、水酸化物イオン、ヒドラジン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記第２の求核剤が前記反応の完了後に添加される、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 前記アミド含有化合物をフローで脱硫または脱セレン化する工程をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. チオール基またはジスルフィド基を含むアミド含有化合物のフローで脱硫する方法。
  21. セレノール基またはジセレニド基を含むアミド含有化合物をフローで脱セレン化する方法。
  22. 前記脱硫または脱セレン化がホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に曝露することを含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. チオール基またはジスルフィド基を含むアミド含有化合物を脱硫する方法であって、前記脱硫がホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に曝露することを含む方法。
  24. セレノール基またはジセレニド基を含むアミド含有化合物を脱セレン化する方法であって、前記脱セレン化がホスフィン源の存在下で化合物を紫外線照射に曝露することを含む方法。
  25. 前記ホスフィン源がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 水素原子源をさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記水素原子源が、還元型Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｔｅｒｔ−ブチルチオール、システイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記方法が化学ラジカル開始剤の非存在下で行われる、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の方法。
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