JP2021520810A - 融合事象によって引き起こされるアライメントエラーを検出および抑制する方法 - Google Patents

融合事象によって引き起こされるアライメントエラーを検出および抑制する方法 Download PDF

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Abstract

対象からの生物学的試料中の無細胞核酸から得られた試験配列リードのセットにおいて１つ以上のスプリット配列リードを識別するステップと、試験配列リードのセット中で（ｉ）所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含むスプリット配列リードの１つ以上の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つ以上の少なくとも一部分を抑制することによりフィルタリングされた配列情報データセットを生成するか（ｉｉ）所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含むスプリット配列リードの１つ以上のベースコールおよび／または試験配列リードの１つ以上のベースコールを抑制することによりフィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップとによりフィルタリングされたリード配列情報データセットを生成する方法およびシステム。

Description

相互参照
本国際特許出願は、２０１８年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６５７，２００号に基づく優先権を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
背景
ゲノム再編成事象によって引き起こされる重複したゲノム領域は、重複特異的バリアントが誤って標的に割り当てられる可能性があるため、臨床的シーケンシング適用における正確なバリアントコーリングに対する課題を提示し得る。プロセスされた偽遺伝子（processed pseudogenes）（ＰＰＧ）は、ＬＩＮＥ（長鎖散在エレメント（Long Interspersed Element））に媒介される逆転写およびプロセシングされたｍＲＮＡのゲノム組込みにより生じ得る重複したコーディング配列の原因であり、もともとの遺伝子の部分的または完全なコピーをもたらし、イントロン配列が欠如している。参照ゲノムにおいて見出される偽遺伝子により生じる偽陽性バリアント、たとえば、ＰＩＫ３ＣＡおよびＰＴＥＮのものは、十分に研究されているが、しかしながら、珍しいもの、およびさらには個体特異的ながん関連のＰＰＧの発見は、試料ごとでのＰＰＧに関連する臨床アーチファクトのより体系的な調査および介在の必要性を示す。
要旨
ある特定の態様では、本開示は、遺伝子配列リードにおけるアライメントエラーを検出するための方法であって、対象の試料からの無細胞デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子をシーケンシングするステップであって、無細胞ＤＮＡ分子のそれぞれが、複数の配列リードを生成する、ステップと、シーケンシングにより導出された配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、対象の試料からの無細胞ＤＮＡ分子において真の遺伝子バリアントを検出することにおいて、アライメントエラーを抑制するための方法であって、対象の試料からの無細胞ＤＮＡ分子をシーケンシングするステップであって、無細胞ＤＮＡ分子のそれぞれが、複数の配列リードを生成する、ステップと、シーケンシングにより導出された配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップと、１つまたは複数の遺伝子融合リードのサブセットにおいて、１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの少なくとも一部分をフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップと、参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、対象の試料からの無細胞ＤＮＡ分子において真の遺伝子バリアントを検出することにおいて、アライメントエラーを抑制するための方法であって、対象の試料からの無細胞ＤＮＡ分子をシーケンシングするステップであって、無細胞ＤＮＡ分子のそれぞれが、複数の配列リードを生成する、ステップと、シーケンシングにより導出された配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットが、ＳＭＡＤ４および／またはＲＡＦ１に対応する遺伝子配列を含む、ステップと、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットにおいて、１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの少なくとも一部分を、フィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップと、参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、遺伝子配列リードにおけるアライメントエラーを検出するための方法であって、対象の試料からの無細胞ＤＮＡ分子をシーケンシングするステップであって、無細胞ＤＮＡ分子のそれぞれが、複数の配列リードを生成する、ステップと、シーケンシングにより導出された配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを決定するステップと、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを決定するステップであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップと、所定の基準を満たす、領域内のそれぞれの遺伝子バリアントを、アライメントエラーとして識別するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、対象の試料からの無細胞ＤＮＡ分子において真の遺伝子バリアントを検出することにおいて、アライメントエラーを抑制するための方法であって、対象の試料からの無細胞ＤＮＡ分子をシーケンシングするステップであって、無細胞ＤＮＡ分子のそれぞれが、複数の配列リードを生成する、ステップと、シーケンシングにより導出された配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを決定するステップと、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを決定するステップであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップと、所定の基準を満たす、領域内のそれぞれの遺伝子バリアントを、アライメントエラーとして識別するステップと、１つまたは複数の遺伝子融合リードのサブセットにおいて、１つまたは複数のアライメントエラーをフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップと、参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、遺伝子配列リードにおけるアライメントエラーを検出するための方法であって、コンピュータによって、対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた遺伝子配列リードを含む、配列情報を受信するステップと、遺伝子配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、対象の生物学的試料からの無細胞核酸分子において真の遺伝子バリアントを検出することにおいて、アライメントエラーを抑制するための方法であって、コンピュータによって、無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む、配列情報を受信するステップと、配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップと、１つまたは複数の遺伝子融合リードのサブセットにおいて、１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの少なくとも一部分をフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップと、参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、対象の試料からの無細胞核酸分子において真の遺伝子バリアントを検出することにおいて、アライメントエラーを抑制するための方法であって、コンピュータによって、無細胞核酸分子から得られたシーケンシングリードを含む、配列情報を受信するステップと、配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットが、ＳＭＡＤ４、ＴＹＲＯ３、および／またはＲＡＦ１に対応する遺伝子配列を含む、ステップと、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットにおいて、１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの少なくとも一部分をフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップと、参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、遺伝子配列リードにおけるアライメントエラーを検出するための方法であって、コンピュータによって、対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた遺伝子配列リードを含む、配列情報を受信するステップと、遺伝子配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを決定するステップと、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを決定するステップであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップと、所定の基準を満たす、領域内のそれぞれの遺伝子バリアントを、アライメントエラーとして識別するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、対象の試料からの無細胞核酸分子において真の遺伝子バリアントを検出することにおいて、アライメントエラーを抑制するための方法であって、コンピュータによって、無細胞核酸分子から得られたシーケンシングリードを含む、配列情報を受信するステップと、配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットが、ＳＭＡＤ４、ＴＹＲＯ３、および／またはＲＡＦ１に対応する遺伝子配列を含む、ステップと、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットにおいて、１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの少なくとも一部分をフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップと、参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、遺伝子融合リードのセットは、１つまたは複数のプロセスされた偽遺伝子（ＰＰＧ）に対応する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＰＰＧは、１つまたは複数の試料特異的ＰＰＧを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＰＰＧは、参照ゲノムにおけるギャップに起因して、またはＰＰＧが試料特異的ＰＰＧであるためのいずれかにより、参照ゲノムには存在しない。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の試料特異的ＰＰＧにより、対象の集団において対象が識別される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＰＰＧは、ＳＭＡＤ４、ＧＮＡＳ、ＴＰ５３、ＲＡＦ１、ＣＤＫ４、ＴＹＲＯ３、ＭＡＰＫ１、ＳＴＫ１１、ＣＣＮＤ１、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、およびＮＲＡＳからなる群に由来する遺伝子のエクソン配列に由来する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＰＰＧは、ＳＭＡＤ４、ＧＮＡＳ、ＴＰ５３、ＲＡＦ１、ＣＤＫ４、ＴＹＲＯ３、ＭＡＰＫ１、ＳＴＫ１１、ＣＣＮＤ１、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、およびＮＲＡＳからなる群に由来する１つまたは複数の配列からの２つまたはそれを上回るＰＰＧを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＰＰＧは、ＳＭＡＤ４、ＧＮＡＳ、ＴＰ５３、ＲＡＦ１、ＣＤＫ４、ＴＹＲＯ３、ＭＡＰＫ１、ＳＴＫ１１、ＣＣＮＤ１、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、およびＮＲＡＳからなる群に由来する１つまたは複数の配列からの３つまたはそれを上回るＰＰＧを含む。
ある特定の実施形態では、遺伝子バリアントまたは真の遺伝子バリアントは、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）または挿入もしくは欠失（インデル）を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子バリアントは、ＳＮＶを含む。ある特定の実施形態では、ＳＮＶは、イントロン−エクソン境界部に位置する。ある特定の実施形態では、ＳＮＶは、遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）内に位置する。ある特定の実施形態では、遺伝子バリアントは、インデルを含む。
ある特定の実施形態では、領域は、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する約２個、４個、６個、８個、１０個、１５個、または２０個のヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、領域は、融合ブレイクポイントから、約１００、５０、２０、１５、１０、８、６、４、２ヌクレオチド未満である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの一部分は、試料中の突然変異対立遺伝子画分が、試料中の遺伝子内融合ブレイクポイントに対応する遺伝子内融合に対する突然変異対立遺伝子画分よりも低いかまたはそれと同等である、検出されたアライメントエラーに基づいて、フィルタリングされる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの一部分は、事前に定義された臨床的に対処可能なバリアントのセットに属さない遺伝子バリアントを含む遺伝子融合リードに基づいて、フィルタリングされる。
ある特定の実施形態では、試料は、血液、血漿、血清、尿、唾液、粘膜排出物、喀痰、糞便、および涙液からなる群から選択される、体液試料である。ある特定の実施形態では、対象は、疾患または障害を有する。ある特定の実施形態では、疾患は、がんである。
ある特定の実施形態では、本方法は、対象の生物学的試料から、無細胞核酸分子を単離するステップを含む。ある特定の実施形態では、無細胞核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、無細胞核酸分子は、無細胞ＤＮＡである。ある特定の実施形態では、無細胞核酸分子は、二本鎖ＤＮＡである。
ある特定の実施形態では、本方法は、シーケンシングの前に、分子バーコードを含む１つまたは複数のアダプターを、無細胞核酸分子に結合させて、タグ付けされた親ポリヌクレオチドを生成するステップを含む。ある特定の実施形態では、アダプターは、無細胞核酸分子の両端に結合される。ある特定の実施形態では、無細胞核酸分子は、固有にバーコーディングされる。ある特定の実施形態では、無細胞核酸分子は、非固有にバーコーディングされる。ある特定の実施形態では、それぞれのバーコードは、選択された領域からシーケンシングされる多様な分子と組み合わせて、固有な分子の識別を可能にする、固定またはセミランダムなオリゴヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、本方法は、タグ付けされた親ポリヌクレオチドを増幅させて、子孫ポリヌクレオチドを生成するステップを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、目的の標的配列に関して、子孫ポリヌクレオチドを選択的に濃縮させ、それによって、濃縮された子孫ポリヌクレオチドを生成するステップを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、濃縮された子孫ポリヌクレオチドを増幅させるステップを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、子孫ポリヌクレオチドまたは濃縮された子孫ポリヌクレオチドに、試料インデックス配列をタグ付けするステップを含む。
ある特定の実施形態では、配列情報は、核酸シーケンサーから得られる。ある特定の実施形態では、遺伝子融合リードのセットは、シーケンシングされたペアエンドリードをアライメントおよび接続することによって識別される。ある特定の実施形態では、遺伝子融合リードのセットは、イントロン−エクソン境界部にまたがるカバレッジにおける不連続性に基づいて識別される。ある特定の実施形態では、事前に定義されたセットは、ＣＯＳＭＩＣ、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）、またはＥｘｏｍｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥｘＡＣ）において見出されるバリアントを含む。
ある特定の実施形態では、本方法は、コンピュータにより実装することができ、その結果、湿式化学反応ステップ以外の本明細書および添付の特許請求の範囲に記載されるステップのうちのいずれかまたはすべては、好適なプログラミングされたコンピュータにおいて実施され得る。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、遺伝子配列リードにおけるアライメントエラーを検出するための方法であって、対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた遺伝子配列リードを含む、配列情報を受信するステップと、遺伝子配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップとを含む、方法を実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、対象の生物学的試料からの無細胞核酸分子において真の遺伝子バリアントを検出することにおいて、アライメントエラーを抑制するための方法であって、無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む、配列情報を受信するステップと、配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップと、１つまたは複数の遺伝子融合リードのサブセットにおいて、１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの少なくとも一部分をフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップと、参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップとを含む、方法を実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、対象の試料からの無細胞核酸分子において真の遺伝子バリアントを検出することにおいて、アライメントエラーを抑制するための方法であって、無細胞核酸分子から得られたシーケンシングリードを含む、配列情報を受信するステップと、配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットが、ＳＭＡＤ４、ＴＹＲＯ３、および／またはＲＡＦ１に対応する遺伝子配列を含む、ステップと、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットにおいて、１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの少なくとも一部分をフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップと、参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップとを含む、方法を実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、遺伝子配列リードにおけるアライメントエラーを検出するための方法であって、対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた遺伝子配列リードを含む、配列情報を受信するステップと、遺伝子配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む遺伝子融合リードのセットを決定するステップと、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを決定するステップであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップと、所定の基準を満たす、領域内のそれぞれの遺伝子バリアントを、アライメントエラーとして識別するステップとを含む、方法を実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、対象の試料からの無細胞核酸分子において真の遺伝子バリアントを検出することにおいて、アライメントエラーを抑制するための方法であって、対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む、配列情報を受信するステップと、配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む遺伝子融合リードのセットを決定するステップと、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを決定するステップであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップと、所定の基準を満たす、領域内のそれぞれの遺伝子バリアントを、アライメントエラーとして識別するステップと、１つまたは複数の遺伝子融合リードのサブセットにおいて、１つまたは複数のアライメントエラーをフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップと、参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップとを含む、方法を実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、フィルタリングされた配列情報データセットを生成する方法であって、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードを含む、試験配列情報を受信するステップと、（ｂ）試験配列リードの中から、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｃ）試験配列情報において、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制し、それによって、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、フィルタリングされた配列情報データセットを生成する方法であって、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制し、それによって、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、フィルタリングされた配列情報データセットを生成する方法であって、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードの１つもしくは複数のベースコールおよび／または試験配列リードの１つもしくは複数のベースコールを抑制し、それによって、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、フィルタリングされた配列情報データセットを生成する方法であって、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードを含む、試験配列情報を受信するステップと、（ｂ）試験配列リードの中から、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｃ）試験配列情報において、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードの１つもしくは複数のベースコールおよび／または試験配列リードの１つもしくは複数のベースコールを抑制し、それによって、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、フィルタリングされた配列情報データセットを生成する方法であって、（ａ）対象から得られた生物学的試料中の無細胞核酸（ｃｆＮＡ）から得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制し、それによって、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、フィルタリングされた配列情報データセットを生成する方法であって、（ａ）対象から得られた生物学的試料中の無細胞核酸（ｃｆＮＡ）から得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードの１つもしくは複数のベースコールおよび／または試験配列リードの１つもしくは複数のベースコールを抑制し、それによって、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、フィルタリングされた配列情報データセットを生成する方法であって、（ａ）対象から得られた生物学的試料中の無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）をシーケンシングして、試験配列リードのセットを生成するステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｃ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制し、それによって、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、標的配列バリアントを検出する方法であって、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの非標的配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制して、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップと、（ｃ）フィルタリングされた配列情報データセットにおいて、標的配列バリアントを含む、少なくとも１つの標的試験配列リードを識別し、それによって、標的配列バリアントを検出するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、対象における疾患、障害、または状態を処置する方法であって、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの非標的配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制して、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップと、（ｃ）フィルタリングされた配列情報データセットにおいて、対象における疾患、障害、または状態の指標である標的配列バリアントを含む、少なくとも１つの標的試験配列リードを識別するステップと、（ｄ）疾患、障害、または状態を処置するのに有効な１つまたは複数の治療を、対象に投与し、それによって、対象における疾患、障害、または状態を処置するステップとを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本方法は、追加の試験配列リードが、ＳＭＡＤ４、ＧＮＡＳ、ＴＰ５３、ＲＡＦ１、ＣＤＫ４、ＴＹＲＯ３、ＭＡＰＫ１、ＳＴＫ１１、ＣＣＮＤ１、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、およびＮＲＡＳからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子配列の少なくとも一部分とアライメントする場合に、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内にない１つまたは複数の配列バリアントを含む、１つまたは複数の追加の試験配列リードを抑制するステップを含む。
ある特定の実施形態では、所与のスプリット配列リードを識別するステップは、参照配列情報と部分的にしかアライメントしない試験配列リードを識別することを含む。ある特定の実施形態では、所与のスプリット配列リードを識別するステップは、参照配列情報と比べて、試験配列情報における１つまたは複数のゲノム領域を含むスプリット配列リードが欠如した１つまたは複数のゲノム領域のカバレッジの増加を識別することを含む。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のゲノム領域は、少なくとも１つのコーディング配列（ＣＤＳ）を含む。ある特定の実施形態では、所与のスプリット配列リードを識別するステップは、互いに異なり、それぞれが同一のブレイクポイントを含む、少なくとも２つのスプリット配列リードを識別することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、フィルタリングされた配列情報データセットにおいて、少なくとも１つの標的試験配列リードを識別するステップを含む。ある特定の実施形態では、標的試験配列リードは、対象における所与の疾患、障害、または状態の指標である標的配列バリアントを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、対象における所与の疾患、障害、または状態を処置するステップを含む。
ある特定の実施形態では、抑制されたスプリット配列リードのうちの１つまたは複数は、プロセスされた偽遺伝子（ＰＰＧ）の少なくとも一部分を含む。ある特定の実施形態では、本方法は、試験配列情報から、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に配列バリアントを含む、スプリット配列リードおよび／または試験配列リードを除去するステップを含む。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードを含む、試験配列情報を受信するステップと、（ｂ）試験配列リードの中から、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｃ）試験配列情報において、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードの１つもしくは複数のベースコールおよび／または試験配列リードの１つもしくは複数のベースコールを抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードを含む、試験配列情報を受信するステップと、（ｂ）試験配列リードの中から、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｃ）試験配列情報において、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードの１つもしくは複数のベースコールおよび／または試験配列リードの１つもしくは複数のベースコールを抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中の無細胞核酸（ｃｆＮＡ）から得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードの１つもしくは複数のベースコールおよび／または試験配列リードの１つもしくは複数のベースコールを抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡをシーケンシングして、試験配列リードのセットを生成するステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｃ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの非標的配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制して、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップと、（ｃ）フィルタリングされた配列情報データセットにおいて、標的配列バリアントを含む、少なくとも１つの標的試験配列リードを識別するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中の無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）から得られた試験配列リードを含む、試験配列情報を受信するステップと、（ｂ）試験配列リードの中から、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｃ）試験配列情報において、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードの１つもしくは複数のベースコールおよび／または試験配列リードの１つもしくは複数のベースコールを抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードを含む、試験配列情報を受信するステップと、（ｂ）試験配列リードの中から、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｃ）試験配列情報において、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードの１つもしくは複数のベースコールおよび／または試験配列リードの１つもしくは複数のベースコールを抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードの１つもしくは複数のベースコールおよび／または試験配列リードの１つもしくは複数のベースコールを抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中の無細胞デオキシリボ核酸（ｃｆＤＮＡ）をシーケンシングして、試験配列リードのセットを生成するステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｃ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、少なくとも、（ａ）対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡから得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、（ｂ）試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの非標的配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制して、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップと、（ｃ）フィルタリングされた配列情報データセットにおいて、標的配列バリアントを含む、少なくとも１つの標的試験配列リードを識別するステップとを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を提供する。
図１は、プロセスされた偽遺伝子の存在に起因するアライメントエラーを検出および抑制するための例示的な方法を示す図である。
図２は、本開示の一部の実施形態による、フィルタリングされた配列情報データセットを生成する例示的な方法ステップを概略的に示す、フローチャートである。
図３は、本開示の一部の実施形態による、フィルタリングされた配列情報データセットを生成する例示的な方法ステップを概略的に示す、フローチャートである。
図４Ａは、プロセスされた偽遺伝子が生じるプロセスを示す図である。ヒトＬＩＮＥエレメントに存在する非特異的逆転写酵素機序により、プロセシングされた（すなわち、イントロンのない）ｍＲＮＡのＤＮＡコピーが、作成され、ゲノムに組み込まれる。図４Ｂは、試料特異的ＰＰＧがヒトゲノムアセンブリ（たとえば、ｈＧ１９）にはないため、偽遺伝子を起源とするリードが、どのようにして、もともとの遺伝子に固有にマッピングされ得るかを示す図である。しかしながら、偽遺伝子の存在は、イントロン−エクソン境界部にまたがるＰＰＧ断片を起源とするスプリットリードの存在によって判明し得る。
図５は、本明細書に提供される方法を実装するようにプログラミングされるか、またはそうでなければそのように構成される、コンピュータシステムを示す図である。
図６は、ＳＭＡＤ４エクソン１１にマッピングされる配列リードを示す図である。単一の分子を起源とするリードは、共通した色（すなわち、灰色スケールの濃淡）およびゲノム座標でグループ分けされる。ＰＰＧの存在は、イントロン配列の配列が欠如した複数のソフトクリップリードの存在（リードの右手側の複数色のパターン）、ならびにイントロン−エクソン境界部におけるカバレッジの不連続性（図の上部）の両方によって判明する。矢印によって示される疑似Ａ＞Ｃ ＳＮＶコールは、１．７％の対立遺伝子頻度で観察される。
図７Ａは、ＰＰＧが検出された場合に、ＨＲＡＳ、ＳＭＡＤ４、およびＰＴ５３では、ＰＰＧを有さない試料において予測されるものよりも高いパーセンテージでスプライスジャンクションにおけるＳＮＶコールが観察されることを示すグラフである。１０，０００個のランダムなバックグラウンド試料において、これらの同じジャンクション内でコールされるＳＮＶはなく、結果として、灰色のバックグラウンドバーは、同じ高さ、０、となり、したがって、見えていない。図７Ｂは、ＰＰＧが検出された場合に、ＳＮＶが、ＳＭＡＤ４およびＲＡＦ１のコーディング配列（ＣＤＳ）内で高いパーセンテージでコールされることを示すグラフである。≧ＰＰＧを有する試料を有するすべての遺伝子が示されているが、ＧＮＡＳもＴＰ５３も、ＰＰＧが存在する場合に、高いパーセンテージのＣＤＳ ＳＮＶコールを示さなかった。＊＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．カイ二乗検定に基づいて有意差なし（１ ｄ．ｆ．）。
図８は、ヒト第１５染色体上のＴＹＲＯ３にマッピングされる配列リードを示す図である。単一の分子を起源とするリードは、共通した色（すなわち、灰色スケールの濃淡）およびゲノム座標でグループ分けされる。ＰＰＧによって生じるエクソン−エクソンジャンクションにまたがるアライメントアーチファクトは、ＴＹＲＯ３遺伝子座の状況で示される。疑似Ｃ．Ｔ． ＳＮＶコール（ＴＹＲＯ３ ｃ．１４２２Ｃ＞Ｔ）は、矢印で示されている。
定義
「対象」という用語は、動物、たとえば、哺乳動物種（好ましくは、ヒト）または鳥類（たとえば、鳥）種を指し得る。より具体的には、対象は、脊椎動物、たとえば、哺乳動物、たとえば、マウス、霊長類、サル、またはヒトであり得る。動物には、家畜動物、競技動物、および愛玩動物が含まれる。対象は、健康な個体、症状もしくは徴候を有するかまたは疾患もしくは疾患の素因を有するかことが疑われる個体、または治療を必要とするかもしくは治療を必要とすることが疑われる個体であり得る。一部の実施形態では、対象は、ヒト、たとえば、がんを有するかまたはがんを有することが疑われるヒトである。
「無細胞核酸」という語句は、細胞内に含まれていないかもしくは細胞に結合していない核酸、または換言すると、インタクトな細胞を除去した後に試料中に残存している核酸を指し得る。無細胞核酸は、対象からの体液（たとえば、血液、尿、ＣＳＦなど）から得られた非封入核酸と称され得る。無細胞核酸としては、ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、およびそれらのハイブリッドが挙げられ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、循環ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長い非コーディングＲＮＡ（長いｎｃＲＮＡ）、またはこれらのうちのいずれかの断片が含まれる。無細胞核酸は、二本鎖であっても、一本鎖であっても、部分的に二本鎖および一本鎖であってもよい。無細胞核酸は、分泌または細胞死プロセス、たとえば、細胞壊死およびアポトーシスを通じて、体液中に放出され得る。一部の無細胞核酸、たとえば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、がん細胞から、体液中に放出される。その他のものは、健常細胞から放出される。ｃｔＤＮＡは、非封入腫瘍由来断片化ＤＮＡであり得る。無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）は、母体血流中に自由に循環している胎児ＤＮＡである。無細胞核酸は、１つまたは複数の関連するエピジェネティックな改変を有し得、たとえば、アセチル化、５−メチル化、ユビキチン化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、リボシル化、および／またはシトルリン化され得る。一部の実施形態では、無細胞核酸は、ｃｆＤＮＡであり、これは、通常、二本鎖ｃｆＤＮＡを含む。
「核酸タグ」という語句は、核酸を、異なる種類または異なるプロセシングを受けた、異なる試料（たとえば、試料インデックスを提示する）、または同じ試料中の異なる核酸分子（たとえば、分子バーコードを提示する）と区別するために、核酸分子を標識するのに使用される、短い核酸（たとえば、５００、１００、５０、または１０ヌクレオチド長を下回る）を指し得る。タグは、一本鎖であっても、二本鎖であっても、少なくとも部分的に二本鎖であってもよい。タグは、同じ長さを有してもよく、または変動した長さを有してもよい。タグは、平滑末端であってもよく、またはオーバーハングを有してもよい。タグは、核酸の一方の末端または両方の末端に結合され得る。核酸タグは、デコードされると、核酸の起源試料、形態、またはプロセシングなどの情報を示し得る。タグを使用して、異なる分子タグおよび／または試料インデックスを有する核酸を含む複数の試料のプールおよび並行したプロセシングを可能にすることができ、核酸は、後で分子タグを読み取ることによりデコンボリューションされる。追加または代替として、核酸タグは、同じ試料中の異なる分子（すなわち、分子バーコード）を区別するために使用することができる。これには、試料中の異なる分子を固有にタグ付けすること、または試料中の分子を非固有にタグ付けすることの両方が含まれる。非固有にタグ付けする場合には、異なる分子が、少なくとも１つのタグと組み合わせて、参照ゲノム上にマッピングされるそれらの開始位置および／または終止位置（すなわち、ゲノム座標）に基づいて区別され得るように、限られた数の異なるタグを使用して、分子をタグ付けすることができる。そのため、典型的には、同じ開始／終止を有する任意の２つの分子が、同じタグも有する確率が低くなるように（たとえば、１０％を下回る、５％を下回る、１％を下回る、または０．１％を下回る）、十分な数の異なるタグが使用される。一部のタグは、複数の試料、１つの試料内の複数の分子形態、ならびに同じ開始点および終止点を有する１つの形態内の複数の分子を標識するための複数の識別子を含む。そのようなタグは、形式Ａ１ｉで存在し得、ここで、文字は、試料の種類を示し、アラビア数字は、試料内の分子の形態を示し、ローマ数字は、形態内の分子を示す。
「アダプター」という用語は、通常、試料核酸分子のいずれかの末端または両方の末端への連結のために、少なくとも部分的に二本鎖になっている、短い核酸（たとえば、５００、１００、または５０ヌクレオチド長を下回る）を指す。アダプターは、両方の末端においてアダプターが隣接した核酸分子の増幅を可能にするプライマー結合部位、および／または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のためのプライマー結合部位を含むシーケンシングプライマー結合部位を含み得る。アダプターはまた、捕捉用プローブ、たとえば、フローセル支持体に結合したオリゴヌクレオチドの結合部位も含み得る。アダプターはまた、上述のようなタグも含み得る。タグがアンプリコンおよび核酸分子のシーケンシングリードに含まれるように、タグは、好ましくは、プライマーおよびシーケンシングプライマー結合部位に対して位置付けられる。同じかまたは異なる配列のアダプターが、核酸分子のそれぞれの末端に連結され得る。同じ配列のアダプターが、それぞれの末端に連結されることがあるが、ただし、バーコードは異なる。好ましいアダプターは、Ｙ字型アダプターであり、その場合、一方の末端が、平滑末端であるかまたは核酸分子への結合のための尾部があり、この核酸分子もまた、平滑末端であるかまたは１つもしくは複数の相補的ヌクレオチドを有する尾部がある。別の好ましいアダプターは、釣鐘型アダプターであり、同様に、平滑末端または分析しようとする核酸への結合のための尾部を有する末端を有する。
本明細書において使用される場合、「シーケンシング」または「シーケンサー」という用語は、生体分子、たとえば、核酸、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を判定するために使用されるいくつかの技術のうちのいずれかを指す。例示的なシーケンシング方法としては、標的化シーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、エクソンシーケンシング、電子顕微鏡に基づくシーケンシング、パネルシーケンシング、トランジスタに媒介されるシーケンシング、ダイレクトシーケンシング、ランダムショットガンシーケンシング、サンガージデオキシターミネーションシーケンシング、全ゲノムシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ピロシーケンシング、二重鎖シーケンシング、サイクルシーケンシング、単一塩基伸長シーケンシング、固相シーケンシング、高スループットシーケンシング、大規模並列シグネチャーシーケンシング、エマルジョンＰＣＲ、低変性温度における共増幅−ＰＣＲ（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ）、多重ＰＣＲ、可逆的色素ターミネーターによるシーケンシング、ペアエンドシーケンシング、ニアタームシーケンシング（near-term sequencing）、エクソヌクレアーゼシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、短いリードのシーケンシング、単一分子シーケンシング、合成によるシーケンシング、リアルタイムシーケンシング、逆ターミネーターシーケンシング、ナノポアシーケンシング、４５４シーケンシング、Ｓｏｌｅｘａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンシング、ＳＯＬｉＤ（商標）シーケンシング、ＭＳ−ＰＥＴシーケンシング、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、シーケンシングは、遺伝子分析装置、たとえば、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販入手可能な遺伝子分析装置などによって実施することができる。
「次世代シーケンシング」またはＮＧＳという語句は、従来的なサンガー法およびキャピラリー電気泳動に基づくアプローチと比較して増加したスループットを有し、たとえば、一度に数十万個の比較的小さな配列リードを生成する能力を有する、シーケンシング技術を指す。次世代シーケンシング技法の一部の例としては、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、およびハイブリダイゼーションによるシーケンシングが挙げられるが、これらに限定されない。
「ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）」という用語は、それぞれが４つの核酸塩基、すなわち、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）のうちの１つを含む、デオキシリボヌクレオシドを含む、ヌクレオチドの鎖を指す。「ＲＮＡ（リボ核酸）」という用語は、それぞれが４つの核酸塩基、すなわち、Ａ、ウラシル（Ｕ）、Ｇ、およびＣのうちの１つを含む、４つの種類のリボヌクレオシドを含む、ヌクレオチドの鎖を指す。ある特定のヌクレオチド対は、相補的様式で互いに特異的に結合する（相補的塩基対合と称される）。ＤＮＡの場合、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と対合し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と対合する。ＲＮＡの場合、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と対合し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と対合する。第１の核酸鎖が、第１の鎖のものに相補的なヌクレオチドでできた第２の核酸鎖に結合すると、２つの鎖は、結合して二本鎖を形成する。本明細書において使用される場合、「核酸シーケンシングデータ」、「核酸シーケンシング情報」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ゲノム配列」、「遺伝子配列」、または「断片配列」、または「核酸シーケンシングリード」は、核酸、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子（たとえば、ゲノム全体、トランスクリプトーム全体、エクソーム、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または断片）におけるヌクレオチド塩基（たとえば、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンまたはウラシル）の順序を示す、任意の情報またはデータを指す。本教示は、キャピラリー電気泳動、マイクロアレイ、ライゲーションに基づくシステム、ポリメラーゼに基づくシステム、ハイブリダイゼーションに基づくシステム、直接的または間接的ヌクレオチド識別システム、ピロシーケンシング、イオンまたはｐＨに基づく検出システム、および電子シグネチャーに基づくシステムを含むがこれらに限定されない、すべての利用可能な種類の技法、プラットフォーム、または技術を使用して得られた配列情報を企図することを理解されたい。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシド間結合によって結合された、ヌクレオシドの線形ポリマー（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはそれらの類似体を含む）を指す。典型的には、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオシドを含む。オリゴヌクレオチドは、多くの場合、サイズが、数モノマー単位、たとえば、３〜４個から、数百モノマー単位までの範囲に及ぶ。ポリヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字列によって表される場合は常に、ヌクレオチドが、左から右に、５’から３’の順序になっており、別途示されない限り、「Ａ」はアデノシンを示し、「Ｃ」はシトシンを示し、「Ｇ」はグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示すことが理解されるであろう。Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴという文字は、当該技術分野において標準的なように、塩基自体、ヌクレオシド、または塩基を含むヌクレオチドを指して使用され得る。
「参照配列」という語句は、実験的に決定された配列と比較するために使用される公知の配列を指す。たとえば、公知の配列は、ゲノム全体、染色体、またはその任意のセグメントであり得る。参照物は、典型的には、少なくとも２０個、５０個、１００個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、１０００個、またはそれを上回るヌクレオチドを含む。参照配列は、ゲノムもしくは染色体の単一の連続配列とアライメントし得るか、またはゲノムもしくは染色体の異なる領域とアライメントする非連続的セグメントを含み得る。一部の実施形態では、参照配列は、ヒトゲノムである。参照ヒトゲノムとして、たとえば、ｈＧ１９およびｈＧ３８が挙げられる。
「偽遺伝子」という用語は、一般に、その遺伝子配列が、対応物である完全な遺伝子に類似であるが、細胞内遺伝子発現またはタンパク質コーディング能力における少なくとも一部の機能性が失われている、ゲノムＤＮＡのセグメントを指す。偽遺伝子は、その対応物である機能性遺伝子に対して、高い程度の相同性または同一性を有し得る。一部の実施形態では、偽遺伝子は、対応物である機能性遺伝子と少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を共有する。
「プロセスされた偽遺伝子」という用語は、一般に、逆転写されたｍＲＮＡ転写産物である相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が、ゲノム内の新しい位置に再度組み込まれる、レトロ転位（retrotransposition）のプロセスから生じる偽遺伝子を指す。プロセスされた偽遺伝子は、一般に、イントロンが欠如しており、それによって、エクソン−エクソンの遺伝子内（すなわち、遺伝子の内部での）融合が生じる。プロセスされた偽遺伝子の他の特徴としては、ポリＡ尾部、短縮された５’末端（対応物である完全な遺伝子と比較して）、および転写機序（たとえば、プロモーター領域）の欠如が挙げられる。
本明細書において使用される「生物学的試料」という語句は、一般に、対象からの組織または体液試料を指す。生物学的試料は、対象から直接的に得ることができる。生物学的試料は、１つまたは複数の核酸分子、たとえば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得るか、またはそれを含み得る。生物学的試料は、任意の器官、組織、または生物学的流体に由来し得る。生物学的試料は、たとえば、体液または固体組織試料を含み得る。固体組織試料の例は、たとえば、固形腫瘍生検からの腫瘍試料である。体液としては、たとえば、血液、血清、血漿、腫瘍細胞、唾液、尿、リンパ液、前立腺液、精液、乳、喀痰、糞便、涙液、およびこれらの誘導体が挙げられる。一部の実施形態では、生物学的試料は、血液であるか、または血液からである。
「突然変異対立遺伝子画分」、「突然変異量（mutation dose）」、または「ＭＡＦ」という語句は、所与の試料中の、所与のゲノム位置に対立遺伝子の改変または突然変異を有する核酸分子の画分を指す。ＭＡＦは、一般に、画分またはパーセンテージとして表される。たとえば、ＭＡＦは、典型的に、所与の遺伝子座に存在するすべての体細胞系バリアントまたは対立遺伝子のうち、約０．５、０．１、０．０５、または０．０１を下回る（すなわち約５０％、１０％、５％、または１％を下回る）。
核酸配列情報の文脈における「スプリット配列リード」または「スプリットリード」または「遺伝子融合リード」という語句は、所与の参照配列の異なる非連続的な領域または遺伝子座にマッピングされる部分配列を含む、シーケンシングリードを指す。ある特定の実施形態では、たとえば、所与のスプリット配列リードの第１の部分配列は、参照配列の所与の遺伝子の第１のエクソンにマッピングされ、一方で、その所与のスプリット配列リードの第２の部分配列は、参照配列の同じ遺伝子の第２のエクソンにマッピングされ、この第１および第２のエクソンは、参照配列の同じ遺伝子の介在イントロンによって離間している。これらの実施形態のうちの一部では、そのようなスプリット配列リードは、所与のスプリット配列リードが得られた対象のゲノムにおける遺伝子内融合の存在を示す。他の例示的な実施形態では、所与のスプリット配列リードの第１の部分配列は、参照配列の第１の遺伝子のエクソンにマッピングされ、一方で、その所与のスプリット配列リードの第２の部分配列は、参照配列の異なる第２の遺伝子のエクソンにマッピングされ、これらのエクソンは、参照配列において互いに非連続的である。これらの実施形態のうちの一部では、そのようなスプリット配列リードは、所与のスプリット配列リードが得られた対象のゲノムにおける遺伝子間融合の存在を示す。
核酸融合分子または対応するシーケンシングリードの文脈における「ブレイクポイント」という用語は、核酸融合の、または対応するシーケンシングリードにおいて表される、融合された部分配列間のジャンクションにおける末端ヌクレオチド位置を指す。たとえば、所与のスプリット配列リードは、第１の部分配列を含み得、これは、そのスプリット配列リードにおける第２の部分配列と連続的であり、その５’にあり、ここで、第１の部分配列は、参照配列において、第１の遺伝子座にマッピングされ、第１の遺伝子座は、その参照配列における第２の部分配列がマッピングされる第２の遺伝子座とは非連続的である。この例では、スプリット配列リードの第１の部分配列は、その３’末端ヌクレオチドにブレイクポイントを含むが、一方でスプリット配列リードの第２の部分配列は、その５’末端ヌクレオチドにブレイクポイントを含む。ある特定の適用では、これらのようなブレイクポイントは、「ブレイクポイント対」と称される。
治療剤（たとえば、治療用核酸構築物）の文脈における「投与する」という語句は、その薬剤を、対象に与えること、対象に適用すること、または対象と接触させることを意味する。投与は、たとえば、局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内、および皮内を含む、いくつかの経路のうちのいずれかによって達成することができる。
目的とされる１つまたは複数の値または要素に適用される「約」または「およそ」という語句は、言及された参照値または要素に類似する値または要素を指す。ある特定の実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、別途示されない限りまたは文脈からそうでないことが明らかでない限り、言及された参照値または要素のいずれかの方向で（より大きいかまたは小さい）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内、またはそれよりも小さい範囲に入る値または要素の範囲を指す（ただし、そのような数が可能な値または要素の１００％を超える場合を除く）。
Ｉ．概要
臨床診断用シーケンシング試験の主な課題は、短いリードのアーチファクトを受けやすいゲノム領域を識別し、それらの影響を軽減することである。これらの領域の多くは、ヒトゲノムアセンブリの分析により識別されているが、しかしながら、野生型染色体の全体的な構造が同じ染色体上の非隣接ゲノム領域を近接させるように改変される試料特異的融合事象、または逆転写のアーチファクト、たとえば、プロセスされた偽遺伝子（ＰＰＧ）の存在によって生じるものは、生殖細胞系および体細胞系のいずれも、適切に識別されなかった場合、体細胞系対立遺伝子頻度に、偽陽性バリアントのコールをもたらし得る。試料ごとに、これらの融合事象によって生じるシグナルを識別することによって、本明細書に開示される方法およびシステムは、臨床的に誤った方向へ導くバリアントの重要な供給源を識別および排除し、同時に感度に対する最小限の費用で高い特異度を維持することができる。
本明細書に提供される方法およびシステムは、核酸分子、特に無細胞核酸分子の分析に、特に有用であり得る。一部の場合には、無細胞核酸分子は、対象からの生物学的試料から抽出および単離することができる。生物学的試料としては、血液、血漿、血清、尿、唾液、粘膜排出物、喀痰、糞便、および涙液を含むがこれらに限定されない群から選択される、体液試料を挙げることができる。無細胞核酸分子は、イソプロパノール沈降および／またはシリカに基づく精製を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の様々な方法を使用して抽出することができる。
生物学的試料は、様々な対象、たとえば、疾患を有さない対象、疾患、たとえば、がんもしくはウイルスの危険性にあるか、その症状を示すか、もしくはそれを有する対象、または遺伝性障害の危険性にあるか、その症状を示すか、もしくはそれを有する対象から採取され得る。一部の実施形態では、疾患または障害は、免疫不全障害、血友病、サラセミア、鎌状赤血球症、血液疾患、慢性肉芽腫性障害、先天性盲目、リソソーム蓄積症、筋ジストロフィー、がん、神経変性疾患、またはこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、疾患は、がんである。
無細胞核酸分子の獲得および提供の後に、核酸分子をシーケンシング用に調製するためのいくつかの異なるライブラリー調製手順のうちのいずれかを、無細胞核酸分子に実施することができる。無細胞核酸分子は、シーケンシングの前に、１つまたは複数の試薬（たとえば、酵素、アダプター、タグ（たとえば、バーコード）、プローブなど）で処理されてもよい。タグ付けされた分子は、次いで、下流の適用、たとえば、個々の分子を追跡することができるシーケンシング反応において、使用することができる。
一部の実施形態では、本方法は、シーケンシングの前に、タグ付けされた分子の領域が選択的または非選択的に濃縮される、濃縮ステップをさらに含んでもよい。
無細胞核酸分子のシーケンシングデータが収集されると、１つまたは複数のバイオインフォマティクスプロセスを、配列データに適用して、アライメントエラー（たとえば、偽陽性配列リード）、たとえば、ＰＰＧの存在によって引き起こされるものを検出し、遺伝子シーケンシング試験の結果を提供することにおいて、そのアライメントエラーを抑制または排除することができる。そのようなプロセスには、生殖細胞系および体細胞系遺伝子融合配列リードを識別するステップ、配列リード内の体細胞系単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）および／または挿入もしくは欠失（インデル）を識別するステップ、遺伝子融合ブレイクポイント（たとえば、遺伝子内または遺伝子間）の領域内のアライメントエラーを判定するステップ、フィルターを適用して、所定の基準に基づいて、配列リードまたは最終的な検出されたバリアントのセットからアライメントエラーを除去するステップ、ならびにフィルタリングされた配列リードから、真の遺伝子バリアントを識別するステップが含まれ得るが、これらに限定されない。
一部の場合には、シーケンシング反応により生成された配列リードは、バイオインフォマティクス分析を実行するために、参照配列に対してアライメントすることができる。バイオインフォマティクス分析の様々な態様では、１つまたは複数の閾値が、品質を確保するように設定され得る。たとえば、アライメント閾値は、高度に類似する配列リード（たとえば、参照配列と配列リードとの間のミスマッチが１０個またはそれよりも少ない）だけが、参照配列にマッピングされるように、設定され得る。一部の場合には、たとえば、配列リードのクロマトグラムに基づいて、品質閾値を通過できない配列リードは、除去され得る。一部の場合には、所与の配列のコピー数または量は、所与の配列にマッピングまたはアライメントする配列リードの数に基づいて、定量され得る。一部の場合には、配列の過剰出現は、すべての配列リード間で異なる配列のコピー数または量を比較することによって判定され得る。
ある特定の実施形態では、試料は、同じ核酸の任意の２つのコピーが、一方の末端または両方の末端に連結されたアダプターから、同じアダプター分子バーコードの組合せを受容する確率が低くなるように（たとえば１％を下回る）十分な数のアダプターと接触され得る。アダプターをこの様式で使用することにより、参照配列にアライメント（またはマッピング）される同じ開始点および終止点を有し、同じバーコードの組合せに連結された配列リードを、同じもとの分子から生成されたリードのファミリーにグループ分けすることが可能となり得る。そのようなファミリーは、増幅前の試料中の核酸の増幅産物の配列を表し得る。
一部の実施形態では、ファミリーメンバーの配列をコンパイルして、平滑末端化およびアダプター結合によって改変された、もとの試料中の核酸分子のコンセンサスヌクレオチドまたは完全なコンセンサス配列を導出することができる。換言すると、試料中の核酸の特定の位置を占有しているヌクレオチドは、ファミリーメンバー配列においてその対応する位置を占有しているヌクレオチドのコンセンサスであると決定され得る。コンセンサスヌクレオチドは、２つの非限定的で例示的な方法を挙げると、投票または信頼性スコアなどの方法によって、決定することができる。ファミリーには、二本鎖核酸の一方の鎖または両方の鎖の配列が含まれ得る。ファミリーのメンバーが、二本鎖核酸由来の両方の鎖の配列を含む場合、一方の鎖の配列を、すべての配列をコンパイルする目的で相補物に変換して、コンセンサスヌクレオチドまたは配列を導出する。一部のファミリーは、単一メンバー配列のみを含み得る。この場合には、この配列は、増幅前の試料中の核酸の配列として解釈され得る。あるいは、単一メンバー配列のみを有するファミリーは、後続の分析から排除してもよい。
参照配列は、１つまたは複数の公知の配列、たとえば、所与の対象の公知の全体的または部分的なゲノム配列、たとえば、ヒト対象の全ゲノム配列であり得る。参照配列は、ｈＧ１９であってもよい。シーケンシングされた核酸は、試料中の核酸について直接的に決定された配列、または上述のように、そのような核酸の増幅産物の配列のコンセンサスを提示し得る。比較は、参照配列における１つまたは複数の指定位置で行われ得る。それぞれの配列を最大にアライメントしたときに、参照配列の指定位置に対応する位置を含む、シーケンシングされた核酸のサブセットを、識別することができる。そのようなサブセット内で、あるとすればどのシーケンシングされた核酸が、指定位置にヌクレオチド変動を含むか、および必要に応じて、あるとすればどれが参照ヌクレオチド（すなわち、参照配列におけるものと同じもの）を含むかを、判定することができる。ヌクレオチドバリアントを含むサブセット内のシーケンシングされた核酸の数が、閾値を超えた場合、バリアントヌクレオチドが、指定位置においてコールされ得る。閾値は、単純な数字、たとえば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の、ヌクレオチドバリアントを含むサブセット内のシーケンシングされた核酸であってもよく、または閾値は、比、たとえば、他の可能性の中でもとりわけ、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、もしくは２０パーセントの、ヌクレオチドバリアントを含むサブセット内のシーケンシングされた核酸であってもよい。比較は、参照配列における任意の目的とされる指定位置について、繰り返すことができる。しばしば、比較は、参照配列上の少なくとも２０個、１００個、２００個、または３００個の連続した位置、たとえば、２０〜５００個または５０〜３００個の連続した位置を占有する指定位置について、行われ得る。
図１は、アライメントエラーを検出および抑制するための方法の実施形態を示す。概して、本方法は、バリアントコーラーおよび／または融合コーラーを使用して、所定の指定閾値セットに従って、可能性のある遺伝子バリアントのセットを識別することができる。たとえば、バリアントコーラーを使用して、指定閾値に従って、体細胞系ＳＮＶまたはインデルバリアントのセットを識別することができ、融合コーラーを使用して、特定の閾値に従って、生殖細胞系および体細胞系遺伝子内（遺伝子の内部での）遺伝子融合のセットを識別することができる。そのような可能性のある遺伝子バリアントのセットは、バリアントが、プロセスされた偽遺伝子の存在を起源とする場合に、それが誤って遺伝子に割り当てられる可能性のある、１つまたは複数のアライメントエラーを含む場合がある（それによって、偽陽性遺伝子バリアントの検出が引き起こされる）。そのようなアライメントエラーは、バリアントコーリングプロセス中に、たとえば、そのような検出されたアライメントエラーを特定からフィルタリングもしくは除去すること、または可能性のある遺伝子バリアントとしてのさらなる分析などによって、検出および抑制することができる。
本明細書に開示される方法の態様をさらに例示するために、図２および３に、少なくとも部分的にコンピュータを使用して、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するための例示的な方法ステップを概略的に示すフローチャートを提供する。本明細書に開示される方法のいずれも、必要に応じて、少なくとも部分的に、システムまたはコンピュータ可読媒体において実装または具現化され、これらも、本明細書にさらに説明されている。図２および３に示されるように、方法２００および３００は、いずれも、それぞれステップ２０２および３０２において、対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡ分子または断片から得られた試験配列リードのセットにおいて、スプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップを含む。典型的に、方法２００および３００は、それぞれが、ステップ２０２および３０２の前に対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡ分子からの試験配列リードを含む、試験配列情報を（たとえば、電気通信ネットワークまたは他の通信もしくは記憶媒体を介して）受容するステップを含む。一部の実施形態では、方法２００および３００は、それぞれが、ステップ２０２および３０２の前に、対象から得られた生物学的試料中のｃｆＤＮＡ断片をシーケンシングして、試験配列リード（すなわち、試験配列情報）のセットを生成するステップを含む。
スプリット配列リードまたはアライメントエラーは、必要に応じて、試料から得られた試験配列情報において、様々な技法のうちのいずれか１つまたは複数を使用して識別される。一部の実施形態では、スプリット配列リードは、試験配列情報セットにおいて、所与の参照配列情報セットと部分的にしかアライメントしない試験配列リードを識別することによって識別される。たとえば、スプリット配列リードは、典型的に、所与の参照ゲノム配列の第１の領域にマッピングされる少なくとも第１の部分配列、および所与の参照ゲノム配列の第２の領域にマッピングされる少なくとも第２の部分配列を含み、ここで、所与の参照ゲノム配列の第１および第２の領域は、互いに非連続的であるかまたは隣接していない。これらの実施形態のうちの一部では、本方法は、第１の遺伝子座（たとえば、所与の参照ゲノム配列の遺伝子内または遺伝子間の遺伝子座）にマッピングされる第１のブレイクポイントに隣接する第１の部分配列を識別するステップと、第２の異なる遺伝子座（たとえば、所与の参照ゲノム配列の非連続的遺伝子内または非連続的遺伝子間の遺伝子座）にマッピングされる第２のブレイクポイントに隣接する第２の部分配列を識別するステップとを含む。これらの実施形態では、第１のブレイクポイントおよび第２のブレイクポイントは、ブレイクポイント対を形成する。
他の例示的な実施形態では、所与のスプリット配列リードまたはアライメントエラーは、参照配列情報と比べて、試験配列情報において観察される、ゲノム領域を含むスプリット配列リードが欠如しているゲノム領域（たとえば、コーディング配列（ＣＤＳ）など）のカバレッジの増加を識別することによって識別される。一部の実施形態では、疑わしいスプリット配列または遺伝子融合（たとえば、プロセスされた偽遺伝子（ＰＰＧ））は、スプリット配列リードが所与の試料中の異なるｃｆＤＮＡ断片を起源とすることを示し得る、それぞれが少なくとも１つの同一なブレイクポイントを含むが、それ以外は所与の特性、たとえば、長さに関して、互いに異なる、少なくとも２つの（たとえば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれを上回る）スプリット配列リード以外は、コールされない。これにより、典型的に、真のスプリット配列または遺伝子融合が所与の試料において観察されている、信頼性レベルが増加する。必要に応じて本開示の方法および関連する態様での使用に適合される、スプリット配列リードおよび遺伝子融合を識別することに関するさらなる詳細は、たとえば、ＷＯ２０１７／０６２９７０およびＷＯ２０１８／２１３８１４号に提供されており、これらは、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
また図２および３に示されるように、方法２００は、ステップ２０４において、試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分（たとえば、所与のリードおよび／もしくは全リードの少なくとも一部分）および／または試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分（たとえば、所与のリードおよび／もしくは全リードの少なくとも一部分）を抑制するステップを含み、一方で、方法３００は、ステップ３０４において、試験配列リードのセットにおいて、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、スプリット配列リードの１つもしくは複数のベースコールおよび／または試験配列リードの１つもしくは複数のベースコールを抑制して、フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップを含む。配列リード（またはその部分）および／またはベースコールは、典型的に、所与のデータセットからその情報を除去することによって、または単純にデータセットの所与の適用においてその情報を使用しないことによって、「抑制」される。一部の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるように、抑制されたスプリット配列リードは、プロセスされた偽遺伝子（ＰＰＧ）の少なくとも一部分を含む。
一部の実施形態では、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内の配列バリアントは、生物学的試料中のブレイクポイントの突然変異対立遺伝子画分（ＭＡＦ）よりも低いかまたはそれに等しいＭＡＦを含む。必要に応じて、他の数が使用されるが、所与のブレイクポイントからの選択されたヌクレオチドの数は、典型的に、約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１９個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれを上回るヌクレオチドを含む。他の実施形態では、所与のブレイクポイントからのヌクレオチドの数は、１００個、５０個、２０個、１５個、１０個、８個、６個、４個、または２個を下回るヌクレオチドを含んでもよい。加えて、所与のブレイクポイントからの選択された数のヌクレオチドは、所与のブレイクポイントに対して５’および／または３’（すなわち、所与のブレイクポイントのいずれかの側または両側）に位置している。本明細書に記載されるように、様々な種類の配列バリアントが、必要に応じて、本開示の方法を実施することにおいて使用される。これらの実施形態のうちの一部では、たとえば、配列バリアントは、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）および／または挿入もしくは欠失（インデル）を含む。ある特定の実施形態では、本方法は、追加の試験配列リードが、ＳＭＡＤ４、ＧＮＡＳ、ＴＰ５３、ＲＡＦ１、ＣＤＫ４、ＴＹＲＯ３、ＭＡＰＫ１、ＳＴＫ１１、ＣＣＮＤ１、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、およびＮＲＡＳからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子配列の少なくとも一部分とアライメントする場合に、所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内にない１つまたは複数の配列バリアントを含む、１つまたは複数の追加の試験配列リードまたはその部分を抑制するステップを含む。
本明細書に開示される方法を使用して得られたフィルタリングされた配列情報データセットは、多種多様な用途において使用することができる。典型的に、それらは、対象が、所与の疾患、障害、または状態を有するかどうかを判定するために、対象から得られた試験試料において、臨床的有意性のある配列バリアントを識別することを容易にするために使用される。ある特定の実施形態では、特定の疾患、障害、または状態が、そのようにして診断されると、本方法は、本明細書にさらに記載されるように、対象におけるその疾患、障害、または状態を処置するために、１つまたは複数の治療を対象に投与するステップをさらに含む。
遺伝子融合は、液体生検アッセイを使用して無細胞ＤＮＡ（たとえば、循環腫瘍ＤＮＡ、ｃｔＤＮＡを含む）における体細胞系ゲノム改変を識別することによって、対象の試料から識別され得る。そのようなアッセイは、無細胞ＤＮＡ分子をシーケンシングして、配列リードを生成すること、ならびに遺伝子マーカー（たとえば、ＡＬＫ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＮＴＲＫ１、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１）のパネルを使用して配列リードを分析することを含み得る。
ＰＰＧは、生殖細胞系起源または体細胞系起源であり得、１つまたは複数の遺伝子座においてゲノム全体にわたる配列リードカバレッジデータを分析することによって識別することができる。たとえば、ＰＰＧは、アライメントアーチファクトがエクソン−エクソンジャンクションにまたがって観察される位置に見出され得る。ＰＰＧの存在は、イントロン配列が欠如した複数のソフトクリップリード（すなわち、配列リードの一部が参照配列にアライメントしないリード）の存在によって、またはイントロン−エクソン境界部におけるカバレッジの不連続性によって、判明し得る。ＰＰＧは、たとえば、ＳＭＡＤ４、ＧＮＡＳ、ＴＰ５３、ＲＡＦ１、ＣＤＫ４、ＴＹＲＯ３、ＭＡＰＫ１、ＳＴＫ１１、ＣＣＮＤ１、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、およびＮＲＡＳのエクソン配列に由来し得る。
１つまたは複数の基準を使用して、可能性のあるアライメントエラーを識別することができる。たとえば、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む遺伝子融合に対応する配列リードのセット（遺伝子融合リード）のうち、可能性のあるアライメントエラーは、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合とオーバーラップするリードのサブセットから識別され得る。この領域は、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する２０個またはそれを下回るヌクレオチド（たとえば、約２０個、１５個、１０個、８個、６個、４個、または２個のヌクレオチド）を含み得る。遺伝子融合リードのセットは、１つまたは複数のプロセスされた偽遺伝子（ＰＰＧ）、たとえば、試料特異的ＰＰＧ（所与の試料または対象に特異的であり、参照ヒトゲノム、たとえば、ｈＧ１９において一般に見出されないもの）に対応し得る。遺伝子バリアントは、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）または挿入もしくは欠失（インデル）を含み得る。たとえば、ＳＮＶは、イントロン−エクソン境界部に位置し得るか、または遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）内に位置し得る。
別の例として、遺伝子融合に対応する配列リードのセット（遺伝子融合リード）のうち、可能性のあるアライメントエラーは、ＳＭＡＤ４、ＴＹＲＯ３、および／またはＲＡＦ１遺伝子において検出されている遺伝子融合リードのサブセットから識別され得る。
識別されている、可能性のあるアライメントエラーは、真の遺伝子バリアント（たとえば、対象の試料からの無細胞ＤＮＡ分子からである）を検出することにおいて、抑制され得る。たとえば、そのような識別されている可能性のあるアライメントエラーの少なくとも一部分を、遺伝子融合リードのセットからフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成することができる。そのようなフィルタリングされた配列リードを、次いで、プロセシングまたは分析して、参照配列と比較して、真の遺伝子バリアント（たとえば、ＰＰＧの存在の結果として偽陽性バリアントによって引き起こされるものではないもの）を検出し、それによって、有利なことに、バリアントの偽陽性検出の比率を減少させることができる。結果として、バリアントは、対象から得られた試料の分析により、より高い精度、感度、特異度、陽性的中率（ＰＰＶ）、陰性的中率（ＮＰＶ）、または曲線下面積（ＡＵＣ）で、識別され得る。
一部の場合には、検出されたアライメントエラーの一部分は、試料中の突然変異対立遺伝子画分（ＭＡＦ）が、試料中の遺伝子内融合ブレイクポイントに対応する遺伝子内融合のＭＡＦよりも低いかまたはそれと同等である、検出されたアライメントエラーに基づいて、フィルタリングされる。融合に媒介されるエラーは、融合スパニングリードに見出され得るため、偽陽性アライメントエラーは、試料中のＭＡＦが、試料中の遺伝子内融合ブレイクポイントに対応する遺伝子内融合のＭＡＦよりも大きくなる可能性はない。
一部の場合には、検出されたアライメントエラーの一部分は、事前に定義された臨床的に対処可能なバリアントのセットに属さない遺伝子バリアントを含む遺伝子融合リードに基づいて、フィルタリングされる。そのような「ホワイトリスト」のバリアントは、対象の試料中の存在が、対象における疾患または障害（たとえば、がん）と相関性があるかまたはその指標であることが示されている、バリアントの様々なデータベースにおいて見出すことができる。そのようなバリアントのデータベースとしては、たとえば、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ （ＴＣＧＡ）、およびＥｘｏｍｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ （ＥｘＡＣ）を挙げることができる。事前に定義されたそのようなカタログにあるバリアントのセットは、臨床決定（たとえば、診断、予後診断、処置選択、標的化処置、処置モニタリング、再発のモニタリングなど）との関連性に起因して、さらなるバイオインフォマティクス分析に指定することができる。そのような事前に定義されたセットは、たとえば、臨床試料（たとえば、疾患または障害の存在または不在が判明している患者コホートのもの）の分析、ならびに公的データベースおよび臨床文献から得られる注釈情報に基づいて、判定することができる。
アライメントエラーを特定および抑制した後、フィルタリングされた配列リードのセットは、参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを検出するために分析することができる。
本開示はさらに、本明細書に開示される方法ステップが、必要に応じて、本明細書に開示されるシステムおよび／またはコンピュータ可読媒体を使用した実施に適合されることを提供する。ある特定の態様では、システムは、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、本明細書に記載される方法のうちの少なくとも１つを実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含み得る。
一部の実施形態では、シーケンサーは、ＤＮＡシーケンサーである。一部の実施形態では、シーケンサーは、高スループットシーケンシング、たとえば、次世代シーケンシングを実施するように設計される。一部の実施形態では、システムは、シーケンサーにおいて、アダプターがタグ付けされたｃｆＤＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、アダプターがタグ付けされたｃｆＤＮＡ分子は、１つの対象または複数の対象から得られる。一部の実施形態では、試料からのｃｆＤＮＡ分子は、固有または非固有のバーコードを有する。
一部の実施形態では、コンピュータプロセッサーによって実装される方法は、配列リードをファミリーにグループ分けするステップであって、ファミリーのそれぞれが、同じバーコードを含み同じ開始位置および終止位置を有する配列リードを含み、それによって、ファミリーのそれぞれが、同じもともとのｃｆＤＮＡ分子から増幅された配列リードを含む、ステップをさらに含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法およびシステムは、デジタル処理デバイスを利用する。さらなる実施形態では、デジタル処理デバイスは、デバイスの機能を実行する１つまたは複数のハードウェア中央処理装置（ＣＰＵ）または汎用グラフィック処理装置（ＧＰＧＰＵ）を含む。なおもさらなる実施形態では、デジタル処理デバイスは、実行可能命令を実施するように構成される、オペレーティングシステムをさらに含む。一部の実施形態では、デジタル処理デバイスは、必要に応じて、コンピュータネットワークに接続されている。さらなる実施形態では、デジタル処理デバイスは、必要に応じて、ワールドワイドウェブにアクセスするように、インターネットに接続されている。なおもさらなる実施形態では、デジタル処理デバイスは、必要に応じて、クラウドコンピューティングインフラストラクチャに接続されている。他の実施形態では、デジタル処理デバイスは、必要に応じて、イントラネットに接続されている。他の実施形態では、デジタル処理デバイスは、必要に応じて、データ記憶デバイスに接続されている。本明細書の説明によると、好適なデジタル処理デバイスとしては、非限定的な例として、サーバーコンピュータ、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、ノートブックコンピュータ、ハンドヘルドコンピュータ、インターネット機器、モバイルスマートフォン、およびタブレットコンピュータが挙げられる。
一部の実施形態では、デジタル処理デバイスは、実行可能命令を実施するように構成される、オペレーティングシステムを含む。オペレーティングシステムは、たとえば、デバイスのハードウェアを管理し、アプリケーションの実行のためのサービスを提供する、プログラムおよびデータを含む、ソフトウェアである。当業者であれば、好適なサーバーオペレーティングシステムとして、非限定的な例として、ＦｒｅｅＢＳＤ、ＯｐｅｎＢＳＤ、ＮｅｔＢＳＤ（登録商標）、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ ＯＳ Ｘ Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）Ｓｏｌａｒｉｓ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、およびＮｏｖｅｌｌ（登録商標）ＮｅｔＷａｒｅ（登録商標）が挙げられることを認識するであろう。当業者であれば、好適なパーソナルコンピュータオペレーティングシステムとして、非限定的な例として、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ ＯＳ Ｘ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、およびＧＮＵ／Ｌｉｎｕｘ（登録商標）などのＵＮＩＸ（登録商標）様オペレーティングシステムが挙げられることを認識するであろう。一部の実施形態では、オペレーティングシステムは、クラウドコンピューティングによって提供される。当業者であれば、好適なモバイルスマートフォンオペレーティングシステムとして、非限定的な例として、Ｎｏｋｉａ（登録商標）Ｓｙｍｂｉａｎ（登録商標）ＯＳ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＯＳ（登録商標）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎ Ｍｏｔｉｏｎ（登録商標）ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＯＳ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｐｈｏｎｅ（登録商標）ＯＳ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｍｏｂｉｌｅ（登録商標）ＯＳ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、およびＰａｌｍ（登録商標）ＷｅｂＯＳ（登録商標）が挙げられることも認識するであろう。
一部の実施形態では、デバイスには、記憶および／またはメモリデバイスが含まれる。記憶および／またはメモリデバイスは、データまたはプログラムを、一時的または恒久的に記憶するために使用される、１つまたは複数の物理的装置である。一部の実施形態では、デバイスは、揮発性メモリであり、記憶された情報を維持するために電力を必要とする。一部の実施形態では、デバイスは、不揮発性メモリであり、デジタル処理デバイスが電力供給を受けていない場合にも記憶された情報を保持する。さらなる実施形態では、不揮発性メモリは、フラッシュメモリを含む。一部の実施形態では、不揮発性メモリは、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）を含む。一部の実施形態では、不揮発性メモリは、強誘電体ランダムアクセスメモリ（ＦＲＡＭ（登録商標））を含む。一部の実施形態では、不揮発性メモリは、相変化ランダムアクセスメモリ（ＰＲＡＭ）を含む。他の実施形態では、デバイスは、記憶デバイスであり、これには、非限定的な例として、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリデバイス、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光学ディスクドライブ、およびクラウドコンピューティングに基づく記憶装置が含まれる。さらなる実施形態では、記憶および／またはメモリデバイスは、本明細書に開示されるものなどのデバイスの組合せである。
一部の実施形態では、デジタル処理デバイスには、視覚的情報をユーザーに送信するための電子ディスプレイが含まれる。一部の実施形態では、ディスプレイは、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）である。さらなる実施形態では、ディスプレイは、薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（ＴＦＴ−ＬＣＤ）である。一部の実施形態では、ディスプレイは、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）ディスプレイである。様々なさらなる実施形態では、ＯＬＥＤディスプレイは、パッシブマトリックスＯＬＥＤ（ＰＭＯＬＥＤ）またはアクティブマトリックスＯＬＥＤ（ＡＭＯＬＥＤ）ディスプレイである。一部の実施形態では、ディスプレイは、プラズマディスプレイである。他の実施形態では、ディスプレイは、ビデオプロジェクターである。なおも他の実施形態では、ディスプレイは、デジタル処理デバイスと通信する頭部装着型ディスプレイ、たとえば、ＶＲヘッドセットである。さらなる実施形態では、好適なＶＲヘッドセットとしては、非限定的な例として、ＨＴＣ Ｖｉｖｅ、Ｏｃｕｌｕｓ Ｒｉｆｔ、Ｓａｍｓｕｎｇ Ｇｅａｒ ＶＲ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＨｏｌｏＬｅｎｓ、Ｒａｚｅｒ ＯＳＶＲ、ＦＯＶＥ ＶＲ、Ｚｅｉｓｓ ＶＲ Ｏｎｅ、Ａｖｅｇａｎｔ Ｇｌｙｐｈ、Ｆｒｅｅｆｌｙ ＶＲヘッドセットなどが挙げられる。なおもさらなる実施形態では、ディスプレイは、本明細書に開示されるものなどのデバイスの組合せである。
一部の実施形態では、デジタル処理デバイスは、ユーザーから情報を受信するための入力デバイスを含む。一部の実施形態では、入力デバイスは、キーボードである。一部の実施形態では、入力デバイスは、非限定的な例として、マウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ゲームコントローラー、またはスタイラスを含む、ポインティングデバイスである。一部の実施形態では、入力デバイスは、タッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンである。他の実施形態では、入力デバイスは、音声または他の音による入力を捕捉するためのマイクロホンである。他の実施形態では、入力デバイスは、動きまたは視覚的入力を捕捉するためのビデオカメラまたは他のセンサーである。さらなる実施形態では、入力デバイスは、Ｋｉｎｅｃｔ、Ｌｅａｐ Ｍｏｔｉｏｎなどである。なおもさらなる実施形態では、入力デバイスは、本明細書に開示されるものなどのデバイスの組合せである。
一部の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行されると、本明細書に提供される方法を実施する、非一過的コンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができる、コントローラーを含む、システムを提供する。
図５は、本明細書に提供される方法を実装するようにプログラミングされるか、またはそうでなければそのように構成される、コンピュータシステム５０１を示す。
コンピュータシステム５０１は、遺伝子配列リードにおけるアライメントエラーを検出および／または抑制するための方法を実装するようにプログラミングされ得るか、またはそうでなければそのように構成され得る。コンピュータシステム５０１は、本開示の様々な態様、たとえば、（ａ）生物学的試料中の無細胞核酸分子をシーケンシングして、遺伝子配列リードを生成するステップ、（ｂ）遺伝子配列リードを参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップ、（ｃ）アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップ、（ｄ）遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップ、（ｅ）遺伝子融合リードのサブセットにおいて、検出されたアライメントエラーの少なくとも一部分をフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップ、および（ｆ）参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップなどを統制することができる。コンピュータシステム５０１は、ユーザーの電子デバイスであってもよく、または電子デバイスに対して遠隔に位置するコンピュータシステムであってもよい。電子デバイスは、携帯型電子デバイスであってもよい。
コンピュータシステム５０１は、中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書において「プロセッサー」および「コンピュータプロセッサー」とも）５０５を含み、これは、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサーであり得るか、または並列処理のための複数のプロセッサーであり得る。コンピュータシステム５０１はまた、メモリまたはメモリ位置５１０（たとえば、ランダムアクセスメモリ、読出し専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置５１５（たとえば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース５２０（たとえば、ネットワークアダプター）、ならびに周辺デバイス５２５、たとえば、キャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置、および／もしくは電子ディスプレイアダプターも含む。メモリ５１０、記憶装置５１５、インターフェース５２０、および周辺デバイス５２５は、通信バス（実線）、たとえば、マザーボードを通じて、ＣＰＵ５０５と通信状態にある。記憶装置５１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（またはデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム５０１は、通信インターフェース５２０を利用して、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）５３０に作動可能に連結され得る。ネットワーク５３０は、インターネット、インターネット（internet）および／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信するイントラネットおよび／またはエクストラネットであり得る。ネットワーク５３０は、一部の場合には、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク５３０は、クラウドコンピューティングなどの分散型コンピューティングを可能にすることができる、１つまたは複数のコンピュータサーバーを含み得る。ネットワーク５３０は、一部の場合には、コンピュータシステム５０１を利用して、コンピュータシステム５０１に連結されたデバイスが、クライアントまたはサーバーとして挙動することを可能にし得る、ピアトゥピアネットワークを実装することができる。
ＣＰＵ５０５は、プログラムまたはソフトウェアで具現化され得る、一連の機械可読命令を実行することができる。命令は、メモリ５１０などのメモリ位置に記憶され得る。命令は、ＣＰＵ５０５へと指示され得、これが、続いて、ＣＰＵ５０５を、本開示の方法を実装するようにプログラミングするか、またはそうでなければそのように構成し得る。ＣＰＵ５０５によって実施される動作の例としては、フェッチ、復号、実行、およびライトバックを挙げることができる。
ＣＰＵ５０５は、集積回路など、回路の一部であり得る。システム５０１の１つまたは複数の他の構成要素が、回路に含まれてもよい。一部の場合には、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
記憶装置５１５は、ドライバ、ライブラリー、および保存されたプログラムなど、ファイルを記憶することができる。記憶装置５１５は、ユーザーデータ、たとえば、ユーザーの選好およびユーザーのプログラムを記憶することができる。コンピュータシステム５０１は、一部の場合には、コンピュータシステム５０１に対して外部である、たとえば、イントラネットまたはインターネットを通じてコンピュータシステム５０１と通信するリモートサーバーに位置する、１つまたは複数の追加のデータ記憶装置を含み得る。
コンピュータシステム５０１は、ネットワーク５３０を通じて、１つまたは複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。たとえば、コンピュータシステム５０１は、ユーザーのリモートコンピュータシステムと通信し得る。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（たとえば、ポータブルＰＣ）、スレートもしくはタブレットＰＣ（たとえば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）のｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）のＧａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（たとえば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）のｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、または携帯情報端末が挙げられる。ユーザーは、ネットワーク５３０を介して、コンピュータシステム５０１にアクセスすることができる。
本明細書に記載される方法は、コンピュータシステム５０１の電子記憶位置、たとえば、メモリ５１０または電子記憶装置５１５などに記憶された、機械（たとえば、コンピュータプロセッサー）により実行可能なコードを用いて実装され得る。機械により実行可能なコードまたは機械により読み取り可能なコードは、ソフトウェアの形態で提供され得る。使用の際、コードが、プロセッサー５０５によって実行され得る。一部の場合には、コードは、記憶装置５１５から取り出され、プロセッサー５０５による即時アクセスのために、メモリ５１０に記憶され得る。一部の状況では、電子記憶装置５１５は、除外され得、機械により実行可能な命令は、メモリ５１０に記憶される。
コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサーを有する機械で使用するために、プリコンパイルされ、そのように構成され得るか、または実行時にコンパイルされてもよい。コードは、コードがプリコンパイルまたは即時コンパイルの様式で実行されるのを可能にするように選択され得る、プログラミング言語で供給され得る。
コンピュータシステム５０１など、本明細書において提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングで具現化され得る。この技術の様々な態様は、典型的には、機械（またはプロセッサー）により実行可能なコードおよび／または機械可読媒体の一種で運搬もしくは具現化される関連データの形態をした、「製品」または「製造品」であると考えることができる。機械により実行可能なコードは、メモリ（たとえば、読出し専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）、またはハードディスクなど、電子記憶装置に記憶され得る。「記憶装置」型の媒体としては、コンピュータ、プロセッサーなどのありとあらゆる有形メモリ、またはその関連モジュール、たとえば、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどが含まれ得、これらは、ソフトウェアプログラミングの任意の時点において、非一過的記憶装置を提供し得る。ソフトウェアのすべてまたは一部分は、時折、インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワークを通じて通信され得る。そのような通信は、たとえば、ソフトウェアを１つのコンピュータまたはプロセッサーから別のものへ、たとえば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへ、ロードすることを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を保持し得る別の種類の媒体としては、光波、電波、および電磁波、たとえば、ローカルデバイス間の物理的インターフェースで、有線および光学の地上ネットワークを通じて、ならびに様々なエアリンク上で、使用されるものが挙げられる。そのような波を有する物理的要素、たとえば、有線または無線リンク、光学リンクなどもまた、ソフトウェアを保持する媒体と考えることができる。本明細書において使用される場合、非一過的有形「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のために命令をプロセッサーに提供することに関与する任意の媒体を指す。
したがって、コンピュータにより実行可能なコードなど、機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体を含むがこれらに限定されない、多数の形態を取り得る。不揮発性記憶媒体としては、たとえば、光ディスクまたは磁気ディスク、たとえば、任意のコンピュータなどにおける記憶デバイスのうちのいずれか、たとえば、図面に示されているデータベースなどを実装するために使用することができるものが挙げられる。揮発性記憶媒体としては、ダイナミックメモリ、たとえば、そのようなコンピュータプラットフォームの主メモリが挙げられる。有形伝送媒体としては、同軸ケーブル、銅線、および光ファイバ、たとえば、コンピュータシステム内のバスを含む電線が挙げられる。搬送波伝送媒体は、電気信号もしくは電磁信号または音波もしくは光波、たとえば、無線（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信の際に生成されるものの形態を取り得る。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、たとえば、次のものが挙げられる：フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、任意の他の孔のパターンによる物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を伝送する搬送波、そのような搬送波を伝送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取ることができる任意の他の媒体。これらのコンピュータ可読媒体の形態の多くは、実行のために１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスをプロセッサーに搬送することに関与し得る。
コンピュータシステム５０１は、ユーザーインターフェース（ＵＩ）５４０を含む、電子ディスプレイ５３５を含み得るか、またはそれと通信し得る。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースユーザーインターフェースが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の方法およびシステムは、１つまたは複数のアルゴリズムを用いて実施することができる。アルゴリズムは、中央処理装置５０５により実行すると、ソフトウェアによって実装され得る。アルゴリズムは、たとえば、（ａ）生物学的試料中の無細胞核酸分子をシーケンシングして、遺伝子配列リードを生成すること、（ｂ）遺伝子配列リードを参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成すること、（ｃ）アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別すること、（ｄ）遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出することであって、この領域が、遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含むこと、（ｅ）遺伝子融合リードのサブセットにおいて、検出されたアライメントエラーの少なくとも一部分をフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成すること、および（ｆ）参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出することを行うことができる。
ＩＩ．方法の一般的な特徴
Ａ．試料
試料は、対象から単離された任意の生物学的試料であり得る。試料としては、体組織、たとえば、判明しているかまたは疑われる固形腫瘍、全血、血小板、血清、血漿、糞便、赤血球、白血球（white blood cell）もしくは白血球（leucocyte）、内皮細胞、組織生検、脳脊髄液、関節液、リンパ液、腹水、間質液もしくは細胞外液、細胞間の空間の流体が挙げられ、歯肉溝滲出液、骨髄、胸水、脳脊髄液、唾液、粘液、喀痰、精液、汗、尿が挙げられる。試料は、好ましくは、体液、特に、血液およびその画分、ならびに尿である。試料はまた、腫瘍から流れ出た核酸、たとえば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）も含み得る。核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡを挙げることができ、二本鎖および一本鎖の形態であり得る。試料は、対象からもともと単離した形態であってもよく、または成分、たとえば、細胞を除去もしくは追加するため、１つの成分を別の成分と比べて濃縮するため、もしくは１つの形態の核酸を別のものに、たとえば、ＲＮＡからＤＮＡに、もしくは一本鎖核酸から二本鎖に変換するために、さらなるプロセシングに供されていてもよい。したがって、たとえば、分析のための体液は、無細胞核酸、たとえば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、血漿または血清である。
血漿の体積は、シーケンシングされる領域の所望されるリード深度に依存し得る。例示的な体積は、０．４〜４０ｍｌ、５〜２０ｍｌ、および１０〜２０ｍｌである。たとえば、体積は、０．５ｍｌ、１ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、または４０ｍｌであり得る。サンプリングされる血漿の体積は、５〜２０ｍｌであり得る。
試料は、ゲノム等価物を含む様々な量の核酸を含み得る。たとえば、約３０ｎｇのＤＮＡの試料は、約１０，０００（１０４）個のハプロイドヒトゲノム等価物を含み得、ｃｆＤＮＡの場合には、約２０００億（２×１０１１）個の個々のポリヌクレオチド分子を含み得る。同様に、約１００ｎｇのＤＮＡの試料は、約３０，０００個のハプロイドヒトゲノム等価物を含み得、ｃｆＤＮＡの場合には、約６０００億個の個々の分子を含み得る。
試料は、異なる源、たとえば、無細胞または外来物からの核酸を含み得る。試料は、突然変異を有する核酸を含み得る。たとえば、試料は、生殖細胞系突然変異および／または体細胞系突然変異を有するＤＮＡを含み得る。試料は、がん関連突然変異（たとえば、がん関連体細胞系突然変異）を有するＤＮＡを含み得る。
増幅前の試料中の無細胞核酸の例示的な量は、約１フェムトグラム（ｆｇ）〜約１マイクログラム（ｕｇ）、たとえば、１ピコグラム（ｐｇ）〜２００ナノグラム（ｎｇ）、１ｎｇ〜１００ｎｇ、１０ｎｇ〜１０００ｎｇの範囲である。たとえば、量は、最大約６００ｎｇ、最大約５００ｎｇ、最大約４００ｎｇ、最大約３００ｎｇ、最大約２００ｎｇ、最大約１００ｎｇ、最大約５０ｎｇ、または最大約２０ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。量は、少なくとも１ｆｇ、少なくとも１０ｆｇ、少なくとも１００ｆｇ、少なくとも１ｐｇ、少なくとも１０ｐｇ、少なくとも１００ｐｇ、少なくとも１ｎｇ、少なくとも１０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも１５０ｎｇ、または少なくとも２００ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。量は、最大１フェムトグラム（ｆｇ）、１０ｆｇ、１００ｆｇ、１ピコグラム（ｐｇ）、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、または２００ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。本方法は、１フェムトグラム（ｆｇ）〜２００ｎｇを得ることを含み得る。
ある特定の実施形態では、試料中の無細胞核酸の量は、約５ｎｇ〜３００ｎｇである。
無細胞核酸は、約１００〜５００ヌクレオチドの例示的なサイズ分布を有し、１１０〜約２３０ヌクレオチドの分子が、分子の約９０％に相当し、最頻値は約１６８ヌクレオチドであり、第２のマイナーピークは、２４０〜４４０ヌクレオチドの範囲にある。無細胞核酸は、約１６０〜約１８０ヌクレオチド、または約３２０〜約３６０ヌクレオチド、または約４４０〜約４８０ヌクレオチドであり得る。
無細胞核酸は、溶液中に見出される無細胞核酸を、インタクトな細胞および体液の他の不溶性成分から分離する、分割ステップによって、体液から単離することができる。分割には、遠心分離または濾過などの技法が含まれ得る。あるいは、体液中の細胞を、溶解し、無細胞核酸および細胞核酸を、一緒にプロセシングしてもよい。一般に、緩衝液の添加および洗浄ステップの後に、無細胞核酸は、アルコールで沈降させることができる。混入物質または塩を除去するために、シリカベースカラムなどのさらなる洗浄ステップを使用してもよい。手順のある特定の態様、たとえば、収率を最適化するために、たとえば、非特異的バルク担体核酸を、反応全体にわたり添加してもよい。そのようなプロセシングの後、試料は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、および一本鎖ＲＮＡを含む、様々な形態の核酸を含み得る。必要に応じて、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡは、後続のプロセシングおよび分析ステップに含められるように、二本鎖形態に変換してもよい。
Ｂ．タグ
試料インデックスおよび／または分子バーコードを提供するタグは、他の方法の中でもとりわけ、化学合成、ライゲーション、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって、アダプターに組み込まれ得るか、またはそれ以外では結合され得る。一般に、反応における固有または非固有の分子バーコードの割当ては、米国特許出願第２００１００５３５１９号、同第２０１１０１６００７８号、ならびに米国特許第６，５８２，９０８号、同第７，５３７，８９８号、および同第９，５９８，７３１号に記載されている方法およびシステムに従う。
タグは、ランダムまたは非ランダムで、試料核酸に連結され得る。一部の場合には、それらは、予測された比で導入される。バーコード集団は、固有であってもよく、たとえば、すべてのバーコードが、同じヌクレオチド配列を有する。バーコード集団は、非固有であってもよく、たとえば、バーコードのうちの一部が、同じヌクレオチド配列を有し、バーコードのうちの一部が、異なるヌクレオチド配列を有する。たとえば、ゲノム試料当たり１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、５０個、１００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個、５０，０００個、１００，０００個、５００，０００個、１，０００，０００個、１０，０００，０００個、５０，０００，０００個、または１，０００，０００，０００個を上回る識別子がロードされるように、識別子がロードされ得る。一部の場合には、ゲノム試料当たり２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、５０個、１００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個、５０，０００個、１００，０００個、５００，０００個、１，０００，０００個、１０，０００，０００個、５０，０００，０００個、または１，０００，０００，０００個を下回る識別子がロードされるように、識別子がロードされ得る。一部の場合には、試料ゲノム当たりのロードされる識別子の平均数は、ゲノム試料当たり約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、５０個、１００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個、５０，０００個、１００，０００個、５００，０００個、１，０００，０００個、１０，０００，０００個、５０，０００，０００個、または１，０００，０００，０００個の識別子を下回るか、または上回る。
好ましい形式は、標的分子の両方の末端にライゲーションされる２０〜５０個の異なるタグを使用し、２０〜５０×２０〜５０個のタグが作製される。そのような数のタグは、同じ開始点および終止点を有する異なる分子が、異なる組合せのタグを受容する高い確率（たとえば、少なくとも９４％、９９．５％、９９．９９％、９９．９９９％）を有するのに十分である。
一部の場合には、識別子は、所定のまたはランダムなまたはセミランダムな配列のオリゴヌクレオチドであり得る。他の場合には、バーコードが複数の中で必ずしも互いに固有とならないような、複数のバーコードが使用されてもよい。この例では、バーコードは、バーコードおよびそれが結合され得る配列の組合せが、個別にトラッキングすることができる固有の配列をもたらすように、（たとえば、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅によって）個々の分子に結合され得る。本明細書に記載されるように、参照配列またはゲノムにマッピングされる配列リードの最初の（開始）点および終わりの（終止）点の配列データと組み合わせた、非固有の分子バーコードの検出により、特定の分子に固有の同一性を割り当てることが可能となり得る。個々の配列リードの長さまたは塩基対の数もまた、そのような分子に固有の同一性を割り当てるために使用することができる。本明細書に記載されるように、固有の同一性が割り当てられた核酸の一本鎖からの断片は、それによって、後続の親鎖からの断片および／または相補鎖の特定を可能にし得る。
核酸分子に分子バーコードおよび／または試料インデックスを導入するために、従来的な核酸増幅方法を使用して、１回または複数回の増幅を適用することができる。増幅は、１つまたは複数の反応混合物において行うことができる。分子バーコードおよび試料インデックスは、同時、または任意の逐次的順序で導入することができる。分子バーコードおよび試料インデックスは、配列捕捉（たとえば、濃縮）の前および／または後に導入することができる。一部の実施形態では、分子タグのみが、プローブ捕捉の前に導入され、一方で試料インデックス／タグは、配列捕捉の後に導入される。一部の場合には、分子バーコードおよび試料インデックスの両方が、プローブ捕捉の前に導入される。一部の場合には、試料インデックスは、配列捕捉の後に導入される。通常、配列捕捉は、標的化配列に相補的な一本鎖核酸分子を導入することを伴う。典型的に、増幅により、２００ヌクレオチド（ｎｔ）〜７００ｎｔ、２５０ｎｔ〜３５０ｎｔ、または３２０ｎｔ〜５５０ｎｔの範囲のサイズで、分子バーコードおよび試料インデックスを有する非固有または固有にタグ付けされた複数の核酸アンプリコンが生成される。一部の実施形態では、アンプリコンは、約３００ｎｔのサイズを有する。一部の実施形態では、アンプリコンは、約５００ｎｔのサイズを有する。
Ｃ．増幅
アダプターが隣接する試料核酸は、ＰＣＲ、および典型的にはプライマーが増幅させようとする核酸分子に隣接するアダプターのプライマー結合部位に結合することによりプライミングされる他の増幅方法によって、増幅させることができる。増幅方法は、サーモサイクリングの結果としての伸長、変性、およびアニーリングのサイクルを含み得るか、または転写に媒介される増幅にあるような等温のものであってもよい。他の増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸配列に基づく増幅、および自己持続性配列に基づく複製が挙げられる。
Ｄ．濃縮
配列は、シーケンシングの前に濃縮させることができる。濃縮は、特定の標的領域に実施してもよく、または非特異的に実施してもよい（「標的配列」）。一部の実施形態では、目的とされる標的化領域は、差次的タイリングおよび捕捉スキームを使用して、１つまたは複数のベイトセットパネルに選択される捕捉プローブ（「ベイト」）を用いて濃縮され得る。差次的タイリングおよび捕捉スキームは、異なる相対濃度のベイトセットを使用して、ベイトと関連するゲノム領域全体に差次的にタイリングし（たとえば、異なる「分解能」で）、拘束セット（たとえば、シーケンサー拘束、たとえば、シーケンシングロード、それぞれのベイトの有用性など）に供され、下流シーケンシングに所望されるレベルで、それらを捕捉する。一部の実施形態では、１つまたは複数の目的とされる領域に対するプローブを有するビオチン標識化ビーズを使用して、標的配列を捕捉し、必要に応じて、続いて、これらの領域を増幅させ、目的の領域を濃縮することができる。
配列捕捉は、典型的に、標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を伴う。プローブセット戦略は、目的の領域全体にプローブをタイリングすることを含み得る。そのようなプローブは、たとえば、約６０〜１２０塩基の長さであり得る。セットは、約２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、８ｘ、９ｘ、１０ｘ、１５ｘ、２０ｘ、５０ｘ、またはそれを上回る深度を有し得る。配列捕捉の有効性は、部分的に、プローブの配列に相補的である（またはほぼ相補的である）標的分子内の配列の長さに依存する。
Ｅ．シーケンシング
前の増幅の有無にかかわらず、アダプターが隣接している試料核酸は、シーケンシングに供することができる。シーケンシング方法としては、たとえば、サンガーシーケンシング、高スループットシーケンシング、ピロシーケンシング、合成によるシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代シーケンシング、合成による単一分子シーケンシング（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模並列シーケンシング、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガンシーケンシング、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｇｅｎｉａ、Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング、プライマーウォーキング、ＰａｃＢｉｏ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、またはナノポアのプラットフォームを使用したシーケンシングが挙げられる。シーケンシング反応は、様々な試料プロセシングユニットにおいて行うことができ、これは、複数レーン、複数チャネル、複数ウェル、または複数の試料セットを実質的に同時にプロセシングする他の手段であり得る。試料プロセシングユニットにはまた、複数の実行を同時にプロセシングすることを可能にする複数の試料チャンバが含まれ得る。
シーケンシング反応は、他の疾患のがんのマーカーを含むことが公知の１つまたは複数の断片型に行うことができる。シーケンシング反応はまた、試料中に存在する任意の核酸断片に行うこともできる。シーケンシング反応は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または１００％のゲノムの配列カバレッジを提供し得る。他の場合には、ゲノムの配列カバレッジは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または１００％を下回り得る。
多重シーケンシングを使用して、同時のシーケンシング反応を行ってもよい。一部の場合には、無細胞ポリヌクレオチドは、少なくとも１０００回、２０００回、３０００回、４０００回、５０００回、６０００回、７０００回、８０００回、９０００回、１００００回、５００００回、または１００，０００回のシーケンシング反応でシーケンシングされ得る。他の場合では、無細胞ポリヌクレオチドは、１０００回、２０００回、３０００回、４０００回、５０００回、６０００回、７０００回、８０００回、９０００回、１００００回、５００００回、または１００，０００回を下回るシーケンシング反応でシーケンシングされ得る。シーケンシング反応は、逐次的に行われてもよく、または同時に行われてもよい。後続のデータ分析は、シーケンシング反応のすべてまたは一部に行われ得る。一部の場合には、データ分析は、少なくとも１０００回、２０００回、３０００回、４０００回、５０００回、６０００回、７０００回、８０００回、９０００回、１００００回、５００００回、または１００，０００回のシーケンシング反応に行われ得る。他の場合には、データ分析は、１０００回、２０００回、３０００回、４０００回、５０００回、６０００回、７０００回、８０００回、９０００回、１００００回、５００００回、または１００，０００回を下回るシーケンシング反応に行われ得る。例示的なリード深度は、遺伝子座（塩基）１つ当たり１０００〜５００００リードである。
Ｆ．分析
本開示の実施形態によるシーケンシングにより、複数の配列リードが生成される。本開示による配列リードは、一般に、約１５０塩基を下回る長さ、または約９０塩基を下回る長さのヌクレオチドデータの配列を含む。ある特定の実施形態では、リードは、約８０〜約９０塩基、たとえば、約８５塩基の長さである。一部の実施形態では、本開示の方法は、非常に短いリード、すなわち、約５０塩基または約３０塩基を下回る長さのリードに、適用される。配列リードデータには、配列データならびにメタ情報が含まれ得る。配列リードデータは、当業者には公知のように、たとえば、ＶＣＦファイル、ＦＡＳＴＡファイル、またはＦＡＳＴＱファイルを含む、任意の好適なファイル形式で記憶することができる。
ＦＡＳＴＡは、もともと、配列データベースを検索するためのコンピュータプログラムであり、ＦＡＳＴＡという名称は、標準ファイル形式も指すようになっている。Pearson & Lipman, 1988, Improved tools for biological sequence comparison, PNAS 85:2444-2448を参照されたい。ＦＡＳＴＡ形式の配列は、単一行の説明で開始され、複数行の配列データが続く。説明の行は、１列目における大なり（「＞」）の記号によって、配列データと区別される。「＞」記号に続く言葉は、配列の識別子であり、その行の残りが、説明である（いずれも必要に応じたものである）。「＞」と識別子の１文字目との間にスペースは入れないものとする。すべて行のテキストは、８０文字よりも短くすることが推奨される。「＞」で開始する別の行が出現すると配列は終了し、これは、別の配列の開始を示す。
ＦＡＳＴＱ形式は、生物学的配列（通常、ヌクレオチド配列）およびその対応する品質スコアの両方を記憶するためのテキストに基づく形式である。これは、ＦＡＳＴＡ形式に類似であるが、配列データに続いて品質スコアを有する。配列の文字および品質スコアのいずれも、簡潔さのために単一のＡＳＣＩＩ文字でコードされる。ＦＡＳＴＱ形式は、高スループットのシーケンシング機器、たとえば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒの出力を記憶するための事実上の標準物である。Cock et al., 2009, The Sanger FASTQ file format for sequences with quality scores, and the Solexa/Illumina FASTQ variants, Nucleic Acids Res 38(6):1767-1771。
ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＱのファイルに関して、メタ情報は、説明の行を含み、配列データの行は含まない。一部の実施形態では、ＦＡＳＴＱファイルについては、メタ情報は、品質スコアを含む。ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＱのファイルに関して、配列データは、説明の行の後に開始され、典型的に、ＩＵＰＡＣの多義コードのあるサブセットを使用し、必要に応じて「−」を用いて表す。好ましい実施形態では、配列データは、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＮの文字を使用し、必要に応じて、「−」またはＵを必要な場合には（たとえば、ギャップまたはウラシルを表すために）含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのマスター配列リードファイルおよび出力ファイルは、プレーンテキストファイルとして（たとえば、ＡＳＣＩＩ、ＩＳＯ／ＩＥＣ ６４６、ＥＢＣＤＩＣ、ＵＴＦ−８、またはＵＴＦ−１６などのコーディングを使用して）記憶される。本発明によって提供されるコンピュータシステムは、プレーンテキストファイルを開くことができるテキストエディタプログラムを含み得る。テキストエディタプログラムは、コンピュータスクリーン上にテキストファイル（たとえば、プレーンテキストファイル）の内容を提示することができ、ヒトによるテキストの編集が可能である（たとえば、モニター、キーボード、およびマウスを使用して）、コンピュータプログラムを指し得る。例示的なテキストエディタとしては、限定することなく、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄ、ｅｍａｃｓ、ｐｉｃｏ、ｖｉ、ＢＢＥｄｉｔ、およびＴｅｘｔＷｒａｎｇｌｅｒが挙げられる。好ましくは、テキストエディタプログラムは、コンピュータスクリーン上にプレーンテキストファイルを表示し、ヒト可読形式で（たとえば、バイナリでコードされるのではなく、代わりに、ヒトの活字で使用されるような英数字を使用して）メタ情報および配列リードを示すことができる。
方法は、ＦＡＳＴＡまたはＦＡＳＴＱファイルに関連して考察されているが、本開示の方法およびシステムを使用して、たとえば、Ｖａｒｉａｎｔ Ｃａｌｌ Ｆｏｒｍａｔ（ＶＣＦ）形式のファイルを含む、任意の好適な配列ファイル形式を圧縮してもよい。典型的なＶＣＦファイルは、ヘッダー部分およびデータ部分を含む。ヘッダーは、それぞれが「＃＃」という文字で開始される任意の数のメタ情報の行、ならびに単一の「＃」文字で開始されるタブ区切りのフィールド定義の行を含む。フィールド定義の行には、８つの必須列が示され、本体部分には、フィールド定義の行によって定義される列を埋めるデータの行が含まれる。ＶＣＦ形式は、Danecek et al., 2011, The variant call format and VCFtools, Bioinformatics 27(15):2156-2158に記載されている。ヘッダー部分は、圧縮ファイルに書き込むためのメタ情報として扱うことができ、データ部分は、行として扱うことができ、これらのそれぞれは、固有である場合にのみマスターファイルに記憶されることになる。
本開示のある特定の実施形態は、配列リードのアセンブリを提供する。アライメントごとのアセンブリの場合、たとえば、リードは、互いに対してまたは参照に対してアライメントされる。それぞれのリードを、次に参照ゲノムに対してアライメントすることにより、リードのすべてが、互いに関連して位置付けられて、アセンブリが作成される。加えて、配列リードの参照配列に対するアライメントまたはマッピングは、配列リード内のバリアント配列を識別するために使用することもできる。バリアント配列の特定は、本明細書に記載される方法およびシステムと組み合わせて、疾患もしくは状態の診断もしくは予後診断、または処置決定を誘導するのをさらに補助するために使用することができる。
一部の実施形態では、ステップのうちのいずれかまたはすべてが、自動化される。あるいは、本発明の方法は、たとえば、それぞれが、必要に応じて、Ｃ＋＋などのコンパイル言語で記述され、次いでバイナリとしてコンパイルされ配布される、１つまたは複数の専用プログラムにおいて全体的または部分的に具現化され得る。本発明の方法は、全体的もしくは部分的に既存の配列分析プラットフォーム内のモジュールとして、またはプラットフォーム内の機能性を呼び出すことによって、実装されてもよい。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、いずれも単一の開始キュー（たとえば、ヒトの活動、別のコンピュータプログラム、または機械を起源とするトリガー事象のうちの１つまたは組合せ）に応答して自動的に呼び出される、いくつかのステップを含む。したがって、本発明は、ステップのうちのいずれかまたはステップの任意の組合せが、キューに応答して自動的に発生し得る方法を提供する。自動的にとは、一般に、ヒトによる入力、影響、または相互作用が介在しない（すなわち、もともとのまたはキュー前のヒトの活動にのみ応答する）ことを意味する。
システムは、対象核酸の正確かつ高感度の解釈を含む、様々な形式の出力も包含する。検索（retrieval）の出力は、コンピュータファイルの形式で提供され得る。ある特定の実施形態では、出力は、ＦＡＳＴＡファイル、ＦＡＳＴＱファイル、またはＶＣＦファイルである。出力は、テキストファイル、または参照ゲノムの配列に対してアライメントされた核酸の配列などの配列データを含むＸＭＬファイルが得られるように処理され得る。他の実施形態では、処理により、参照ゲノムと比べた対象核酸における１つまたは複数の突然変異を示す座標またはストリングを含む出力が得られる。当該技術分野において公知のアライメントストリングとしては、Ｓｉｍｐｌｅ ＵｎＧａｐｐｅｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔ（ＳＵＧＡＲ）、Ｖｅｒｂｏｓｅ Ｕｓｅｆｕｌ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｇａｐｐｅｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔ（ＶＵＬＧＡＲ）、およびＣｏｍｐａｃｔ Ｉｄｉｏｓｙｎｃｒａｔｉｃ Ｇａｐｐｅｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔ（ＣＩＧＡＲ）（Ning, Z., et al., Genome Research 11(10):1725-9 (2001)）が挙げられる。これらのストリングは、たとえば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈｉｎｘｔｏｎ、ＵＫ）からのＥｘｏｎｅｒａｔｅ配列アライメントソフトウェアにおいて実装される。
一部の実施形態では、たとえば、ＣＩＧＡＲストリングを含む、配列アライメントマップ（ＳＡＭ）またはバイナリアライメントマップ（ＢＡＭ）ファイルなどの配列アライメントが得られる（ＳＡＭ形式は、たとえば、Li, et al., The Sequence Alignment/Map format and SAMtools, Bioinformatics, 2009, 25(16):2078-9に記載されている）。一部の実施形態では、ＣＩＧＡＲは、１行ごとでギャップ付きアライメントを提示するかまたはそれを含む。ＣＩＧＡＲは、ＣＩＧＡＲストリングとして報告される圧縮されたペアでのアライメント形式である。ＣＩＧＡＲストリングは、長い（たとえば、ゲノムの）ペアでのアライメントを表すのに有用である。ＣＩＧＡＲストリングは、参照ゲノム配列に対するリードのアライメントを表すためにＳＡＭ形式で使用される。
ＣＩＧＡＲストリングは、確立されたモチーフに従う。それぞれの文字には、事象の塩基数を示す数が先行している。使用される文字としては、Ｍ、Ｉ、Ｄ、Ｎ、およびＳを挙げることができる（Ｍ＝マッチ、Ｉ＝挿入、Ｄ＝欠失、Ｎ＝ギャップ、Ｓ＝置換）。ＣＩＧＡＲストリングは、マッチ／ミスマッチおよび欠失（またはギャップ）の配列を定義する。たとえば、ＣＩＧＡＲストリング２ＭＤ３Ｍ２Ｄ２Ｍは、アライメントが、２つのマッチ、１つの欠失（１という数は、スペースを節約するために省略される）、３つのマッチ、２つの欠失、および２つのマッチを含むことを意味する。
本発明によって企図されるように、上述の機能は、ソフトウェア、ハードウェア、ファームウェア、ハードワイヤ（hardwiring）、またはこれらの任意の組合せを含むシステムを使用して実装され得る。機能を実装する特徴はまた、機能の部分が、異なる物理位置で実装されるように分配されることを含め、様々な位置に物理的に位置してもよい。
システムは、サーバーコンピュータ、端末、シーケンサー、シーケンサーコンピュータ、コンピュータ、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含み得る。それぞれのそのようなコンピュータデバイスは、ネットワークを介して通信し得る。シーケンサーは、必要に応じて、たとえば、それ専用のシーケンサーコンピュータ（任意の入力／出力機序（Ｉ／Ｏ）、プロセッサー、およびメモリを含む）を含むか、またはそれに作動可能に連結され得る。追加または代替として、シーケンサーは、ネットワークを介してサーバーまたはコンピュータ（たとえば、ラップトップ、デスクトップ、またはタブレット）に作動可能に連結されてもよい。コンピュータは、１つまたは複数のプロセッサー、メモリ、およびＩ／Ｏを含む。本発明の方法が、クライアント／サーバーアーキテクチャを利用する場合、本発明の方法の任意のステップは、サーバーを使用して行われてもよく、このサーバーには、プロセッサー、メモリ、およびＩ／Ｏのうちの１つまたは複数が含まれ、データ、命令などを取得すること、またはインターフェースモジュールを介して結果を提供すること、または結果をファイルとして提供することができる。サーバーは、コンピュータもしくは端末を通じてネットワークにつながっていてもよく、またはサーバーは、端末に直接接続されてもよい。端末は、好ましくは、コンピュータデバイスである。本発明によるコンピュータは、好ましくは、Ｉ／Ｏ機序およびメモリに連結された１つまたは複数のプロセッサーを含む。
プロセッサーは、たとえば、単一コアまたは複数コアのプロセッサーのうちの１つまたは複数を含む、１つまたは複数のプロセッサーによって提供され得る。Ｉ／Ｏ機序としては、ビデオディスプレイユニット（たとえば、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）もしくは陰極線管（ＣＲＴ））、英数字入力デバイス（たとえば、キーボード）、カーソルコントロールデバイス（たとえば、マウス）、ディスクドライブユニット、シグナル生成デバイス（たとえば、スピーカー）、加速度計、マイクロホン、セルラー無線周波数アンテナ、およびネットワークインターフェースデバイス（たとえば、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）、Ｗｉ−Ｆｉカード、セルラーモデム、データジャック、イーサーネットポート、モデムジャック、ＨＤＭＩ（登録商標）ポート、ミニＨＤＭＩ（登録商標）ポート、ＵＳＢポート）、タッチスクリーン（たとえば、ＣＲＴ、ＬＣＤ、ＬＥＤ、ＡＭＯＬＥＤ、スーパーＡＭＯＬＥＤ）、ポインティングデバイス、トラックパッド、光（たとえば、ＬＥＤ）、光／画像投射デバイス、またはこれらの組合せを挙げることができる。本発明によるメモリは、好ましくは、本明細書に記載される手法または機能のうちのいずれか１つまたは複数を具現化する１つまたは複数の命令セットが記憶された１つまたは複数の機械可読媒体（たとえば、ソフトウェア）を含む、１つまたは複数の有形デバイスによって提供される、非一過的メモリを指す。ソフトウェアはまた、完全にまたは少なくとも部分的に、システム内のコンピュータによる実行時に主メモリ内、プロセッサー内、またはその両方に存在してもよく、主メモリおよびプロセッサーもまた、機械可読媒体を構築している。ソフトウェアは、さらに、ネットワークインターフェースデバイスを介してネットワーク上で送信または受信されてもよい。
機械可読媒体は、例示的な実施形態では、単一の媒体であり得るが、「機械可読媒体」という用語は、１つまたは複数の命令セットを記憶する単一の媒体または複数の媒体（たとえば、集中型もしくは分散型データベース、ならびに／または関連するキャッシュおよびサーバー）を含んで解釈されるべきである。「機械可読媒体」という用語はまた、機械によって実行するための命令セットを記憶、コード、または保有することができ、機械に本発明の手法のうちのいずれか１つまたは複数を実行させる、任意の媒体を含んで解釈されるべきである。メモリは、たとえば、ハードディスクドライブ、ソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）、光ディスク、フラッシュメモリ、ジップディスク、テープドライブ、「クラウド」記憶位置、またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数であり得る。ある特定の実施形態では、本発明のデバイスは、メモリのための有形の非一過的コンピュータ可読媒体を含む。メモリとして使用するための例示的なデバイスとしては、半導体メモリデバイス（たとえば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）、およびフラッシュメモリデバイス、たとえば、ＳＤ、マイクロＳＤ、ＳＤＸＣ、ＳＤＩＯ、ＳＤＨＣカード）、磁気ディスク（たとえば、内蔵ハードディスクまたは取外し可能なディスク）、ならびに光学ディスク（たとえば、ＣＤおよびＤＶＤディスク）が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステムおよび方法の結果は、インプットとして使用され、レポートが生成される。レポートは、紙形式であってもよい。たとえば、レポートは、本明細書に開示される方法およびシステムによって識別される、フィルタリングされた配列情報からのデータを含み得る。そのようなデータは、たとえば、識別された配列情報を踏まえた診断情報または治療法の推奨を含み得る。一部の実施形態では、レポートは、本明細書に開示される方法およびシステムによって識別される、１つまたは複数の真の遺伝子バリアントなどの情報を含み得る。
本明細書に開示される方法の様々なステップ、または本明細書に開示されるシステムによって実行されるステップは、同じかもしくは異なる時点で、同じかもしくは異なる地理的位置、たとえば、国において、および／または同じかもしくは異なる人々によって実行され得る。
ＩＩＩ．例示的な適用
Ａ．シーケンシングパネル
突然変異を示す腫瘍を検出する可能性を向上させるために、シーケンシングされるＤＮＡの領域は、遺伝子またはゲノム領域のパネルを含んでもよい。限定的なシーケンシングの領域（たとえば、限定パネル）を選択することにより、必要とされる総シーケンシング（たとえば、シーケンシングされるヌクレオチドの総量を低減することができる。シーケンシングパネルは、単一のがん、がんのセット、またはすべてのがんを検出するために、複数の異なる遺伝子または領域を標的とし得る。あるいは、ＤＮＡは、シーケンシングパネルを使用せずに、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）または他の非バイアス型シーケンシング法によってシーケンシングしてもよい。
一部の態様では、複数の異なる遺伝子またはゲノム領域を標的とするパネルは、がんを有する対象のうちの決定されたパーセンテージが、パネル内の１つまたは複数の異なる遺伝子において遺伝子バリアントまたは腫瘍マーカーを示すように、選択される。パネルは、シーケンシングの領域を、固定の塩基対数に限定するように選択することができる。パネルは、所望される量のＤＮＡをシーケンシングするように選択することができる。パネルは、さらに、所望される配列リード深度を達成するように選択することができる。パネルは、シーケンシングされる塩基対の量に所望される配列リード深度または配列リードカバレッジを達成するように選択することができる。パネルは、試料中の１つまたは複数の遺伝子バリアントを検出するための理論上の感度、理論上の特異度、および／または理論上の精度を達成するように選択することができる。
領域のパネルと検出するためのプローブとしては、目的のゲノム領域（ホットスポット領域）を検出するためのもの、ならびにヌクレオソームを意識した（nucleosome-aware）プローブ（たとえば、ＫＲＡＳコドン１２および１３）を挙げることができ、ｃｆＤＮＡカバレッジならびにヌクレオソーム結合パターンおよびＧＣ配列組成によって影響を受ける断片サイズ変動の分析に基づいて、捕捉を最適化するように設計され得る。本明細書で使用される領域としては、ヌクレオソーム位置およびＧＣモデルに基づいて最適化された非ホットスポット領域も含まれ得る。パネルは、起源組織（たとえば、公開文献を使用して、組織全体でもっとも多様な転写プロファイルを有する遺伝子を示す、５０〜１００個のベイトを定義する（プロモーターとは限らない））、全ゲノムスキャフォールド（たとえば、コピー数ベースライニング目的で、超保存的ゲノムコンテンツを識別し、一握りのプローブを染色体全体に分散してタイリングするため）、転写開始部位（ＴＳＳ）／ＣｐＧアイランド（たとえば、たとえば、腫瘍サプレッサー遺伝子（たとえば、結腸直腸がんにおけるＳＥＰＴ９／ＶＩＭ）のプロモーターにおける差示的にメチル化された領域（たとえば、差示的メチル化領域（ＤＭＲ））を捕捉するため）を識別するための部分パネルを含む、複数の部分パネルを含み得る。一部の実施形態では、起源組織のマーカーは、組織特異的エピジェネティックマーカーである。
目的のゲノム位置の一覧の一部の例は、表１および表２に見出すことができる。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるゲノム位置は、表１の遺伝子のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、または９７個の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるゲノム位置は、表１のＳＮＶのうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、または７０個を含む。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるゲノム位置は、表１のＣＮＶのうちの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、または１８個を含む。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるゲノム位置は、表１の融合のうちの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または６個を含む。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるゲノム位置は、表１のインデルのうちの少なくとも１個、少なくとも２個、または３個の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるゲノム位置は、表２の遺伝子のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個、少なくとも１０５個、少なくとも１１０個、または１１５個の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるゲノム位置は、表２のＳＮＶのうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、または７３個を含む。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるゲノム位置は、表２のＣＮＶのうちの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、または１８個を含む。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるゲノム位置は、表２の融合のうちの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または６個を含む。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるゲノム位置は、表２のインデルのうちの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、または１８個の少なくとも一部分を含む。これらの目的とされるゲノム位置のそれぞれは、所与のベイトセットパネルの骨格領域またはホットスポット領域として識別され得る。目的とされるホットスポットゲノム位置の一覧の例は、表３に見出すことができる。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるゲノム位置は、表３の遺伝子のうちの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の少なくとも一部分を含む。それぞれのホットスポットゲノム位置は、関連する遺伝子、それが存在する染色体、遺伝子座を表すゲノムの開始位置および終止位置、塩基対での遺伝子座の長さ、遺伝子によってカバーされるエクソン、および目的とされる所与のゲノム位置が捕捉しようとし得る重要な特性（たとえば、突然変異の種類）を含む、いくつかの特徴とともに列挙されている。
Figure 2021520810
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一部の実施形態では、パネル内の１つまたは複数の領域は、外科手術の後に残留しているがんを検出するための１つまたは複数の遺伝子からの１つまたは複数の遺伝子座を含む。この検出は、既存のがん検出方法で可能であるよりも早期であり得る。一部の実施形態では、パネル内の１つまたは複数のゲノム位置は、高リスク患者集団においてがんを検出するための１つまたは複数の遺伝子からの１つまたは複数の遺伝子座を含む。たとえば、喫煙者は、一般の集団よりもはるかに高い肺がん率を有する。さらに、喫煙者は、肺における不規則な小結節の発生など、がんの検出をより困難にする他の肺状態を発症し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法により、既存のがん検出方法で可能であるよりも早期に、高リスク患者におけるがんが検出される。
ゲノム位置は、その遺伝子または領域に腫瘍マーカーを有する、がんを有する対象の数に基づいて、シーケンシングパネルへの包含に選択され得る。ゲノム位置は、その遺伝子に存在するがんおよび腫瘍マーカーを有する対象の有病率に基づいて、シーケンシングパネルへの包含に選択されてもよい。領域内の腫瘍マーカーの存在は、がんを有する対象を示し得る。
一部の事例では、パネルは、１つまたは複数のデータベースからの情報を使用して選択され得る。がんに関する情報は、がん腫瘍生検またはｃｆＤＮＡアッセイに由来してもよい。データベースは、シーケンシングした腫瘍試料の集団を説明する情報を含み得る。データベースは、腫瘍試料におけるｍＲＮＡの発現に関する情報を含み得る。データベースは、腫瘍試料における制御エレメントまたはゲノム領域に関する情報を含み得る。シーケンシングした腫瘍試料に関連する情報は、様々な遺伝子バリアントの頻度を含み得、その遺伝子バリアントが生じる遺伝子または領域を説明し得る。遺伝子バリアントは、腫瘍マーカーであり得る。そのようなデータベースの非限定的な例は、ＣＯＳＭＩＣである。ＣＯＳＭＩＣは、様々ながんにおいて見出される体細胞系突然変異のカタログである。特定のがんに関して、ＣＯＳＭＩＣは、突然変異の頻度に基づいて、遺伝子をランク付けしている。遺伝子は、所与の遺伝子内に高頻度の突然変異を有することにより、パネルへの包含に選択され得る。たとえば、ＣＯＳＭＩＣは、シーケンシングした乳がん試料集団のうちの３３％が、ＴＰ５３に突然変異を有し、サンプリングした乳がん集団のうちの２２％が、ＫＲＡＳに突然変異を有することを示す。ＡＰＣを含め、他のランク付けされている遺伝子は、シーケンシングした乳がん試料集団のうちの約４％にしか見出されない突然変異を有する。ＴＰ５３およびＫＲＡＳは、サンプリングされた乳がんの中で、比較的高い頻度（たとえば、約４％の頻度で生じるＡＰＣと比較して）を有することに基づいて、シーケンシングパネルに包含され得る。ＣＯＳＭＩＣは、非限定的な例として提供されているが、しかしながら、がんを遺伝子または遺伝子領域に位置する腫瘍マーカーと関連付ける任意のデータベースまたは情報セットを、使用してもよい。別の例では、ＣＯＳＭＩＣによって提供されるように、１１５６個の胆道がん試料のうち、３８０個の試料（３３％）が、ＴＰ５３に突然変異を有していた。いくつかの他の遺伝子、たとえば、ＡＰＣは、すべての試料のうちの４〜８％において突然変異を有する。したがって、ＴＰ５３は、胆道がん試料集団における比較的高い頻度に基づいて、パネルへの包含に選択され得る。
遺伝子またはゲノム部分は、腫瘍マーカーの頻度が、サンプリングした腫瘍組織または循環腫瘍ＤＮＡにおいて、所与のバックグラウンド集団において見出されるものよりも有意に高い場合に、パネルに選択され得る。ゲノム位置の組合せは、がんを有する対象の少なくとも過半数が、パネル内のゲノム位置または遺伝子のうちの少なくとも１つに存在する腫瘍マーカーまたはゲノム領域を有し得るように、パネルの包含に選択され得る。ゲノム位置の組合せは、特定のがんまたはがんのセットについて、対象の過半数が、選択された領域のうちの１つまたは複数に１つまたは複数の腫瘍マーカーを有することを示すデータに基づいて、選択され得る。たとえば、がん１を検出するために、がん１を有する対象のうちの９０％がパネルの領域Ａ、Ｂ、Ｃ、および／またはＤに腫瘍マーカーを有することを示すデータに基づいて、領域Ａ、Ｂ、Ｃ、および／またはＤを含むパネルを選択することができる。あるいは、腫瘍マーカーは、がんを有する対象において２つまたはそれを上回る領域に独立して生じることが示されてもよく、結果として、組合せで、２つまたはそれを上回る領域における腫瘍マーカーが、がんを有する対象集団の過半数に存在する。たとえば、がん２を検出するために、対象のうちの９０％が１つまたは複数の領域に腫瘍マーカーを有し、そのような対象のうちの３０％において、腫瘍マーカーは領域Ｘにのみ検出され、一方で腫瘍マーカーが検出された対象の残りについては、腫瘍マーカーが領域Ｙおよび／またはＺにのみ検出されることを示すデータに基づいて、領域Ｘ、Ｙ、およびＺを含むパネルを選択することができる。１つまたは複数のがんと関連することがこれまでに示されている１つまたは複数のゲノム位置に存在する腫瘍マーカーは、腫瘍マーカーがその時点でそれらの領域のうちの１つまたは複数において５０％またはそれを上回って検出される場合、がんを有する対象を示すかまたは予測することができる。１つまたは複数の領域内の腫瘍マーカーのセットのがん頻度を踏まえてがんを検出する条件付き確率を利用するモデルなど、コンピュータによるアプローチを使用して、どの領域が、単独または組合せで、がんを予測し得るかを予測することができる。パネル選択の他のアプローチは、大型パネルおよび／または全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、Ｃｈｉｐ−ｓｅｑ、重硫酸塩（bisulfate）シーケンシング、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ、およびその他）による腫瘍の包括的ゲノムプロファイリングを利用した研究から得られた情報を記載しているデータベースの使用を伴う。文献から収集した情報により、ある特定のがんにおいて共通して影響を受け、突然変異している経路を説明することもできる。パネル選択は、遺伝子情報を説明するオントロジーの使用によってさらに詳しいものとなり得る。
シーケンシングのためのパネルに含まれる遺伝子は、完全に転写される領域、プロモーター領域、エンハンサー領域、制御エレメント、および／または下流配列を含み得る。突然変異を示す腫瘍を検出する可能性をさらに増加させるために、エクソンのみを、パネルに含めてもよい。パネルは、選択された遺伝子のすべてのエクソンを含んでもよく、または選択された遺伝子のエクソンのうちの１つまたは複数のみを含んでもよい。パネルは、複数の異なる遺伝子のそれぞれからのエクソンから構成されてもよい。パネルは、複数の異なる遺伝子のそれぞれからの少なくとも１つのエクソンを含み得る。
一部の態様では、複数の異なる遺伝子のそれぞれからのエクソンのパネルは、がんを有する対象のうちの決定されたパーセンテージが、エクソンのパネル内の少なくとも１つのエクソンに遺伝子バリアントを示すように、選択される。
遺伝子のパネル内のそれぞれの異なる遺伝子からの少なくとも１つの完全なエクソンが、シーケンシングされ得る。シーケンシングされるパネルは、複数の遺伝子からのエクソンを含み得る。パネルは、２〜１００個の異なる遺伝子、２〜７０個の遺伝子、２〜５０個の遺伝子、２〜３０個の遺伝子、２〜１５個の遺伝子、または２〜１０個の遺伝子からのエクソンを含み得る。
選択されるパネルは、様々な数のエクソンを含み得る。パネルは、２〜３０００個のエクソンを含み得る。パネルは、２〜１０００個のエクソンを含み得る。パネルは、２〜５００個のエクソンを含み得る。パネルは、２〜１００個のエクソンを含み得る。パネルは、２〜５０個のエクソンを含み得る。パネルは、３００個以下のエクソンを含み得る。パネルは、２００個以下のエクソンを含み得る。パネルは、１００個以下のエクソンを含み得る。パネルは、５０個以下のエクソンを含み得る。パネルは、４０個以下のエクソンを含み得る。パネルは、３０個以下のエクソンを含み得る。パネルは、２５個以下のエクソンを含み得る。パネルは、２０個以下のエクソンを含み得る。パネルは、１５個以下のエクソンを含み得る。パネルは、１０個以下のエクソンを含み得る。パネルは、９個以下のエクソンを含み得る。パネルは、８個以下のエクソンを含み得る。パネルは、７個以下のエクソンを含み得る。
パネルは、複数の異なる遺伝子からの１つまたは複数のエクソンを含み得る。パネルは、あるパーセンテージの複数の異なる遺伝子のそれぞれからの１つまたは複数のエクソンを含み得る。パネルは、異なる遺伝子のうちの少なくとも２５％、５０％、７５％、または９０％のそれぞれからの少なくとも２つのエクソンを含み得る。パネルは、異なる遺伝子のうちの少なくとも２５％、５０％、７５％、または９０％のそれぞれからの少なくとも３つのエクソンを含み得る。パネルは、異なる遺伝子のうちの少なくとも２５％、５０％、７５％、または９０％のそれぞれからの少なくとも４つのエクソンを含み得る。
シーケンシングパネルのサイズは、変動し得る。シーケンシングパネルは、たとえば、パネル内の特定の領域のシーケンシングされるヌクレオチドの総量またはシーケンシングされる固有の分子の数を含む、いくつかの因子に応じてより大きくまたはより小さく作製することができる（ヌクレオチドサイズに関して）。シーケンシングパネルは、５ｋｂ〜５０ｋｂにサイズ決定され得る。シーケンシングパネルは、サイズが１０ｋｂ〜３０ｋｂであり得る。シーケンシングパネルは、サイズが１２ｋｂ〜２０ｋｂであり得る。シーケンシングパネルは、サイズが１２ｋｂ〜６０ｋｂであり得る。シーケンシングパネルは、サイズが、少なくとも１０ｋｂ、１２ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂ、または１５０ｋｂであり得る。シーケンシングパネルは、サイズが１００ｋｂ、９０ｋｂ、８０ｋｂ、７０ｋｂ、６０ｋｂ、または５０ｋｂを下回り得る。
シーケンシングに選択されるパネルは、少なくとも１個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、８０個、または１００個のゲノム位置（たとえば、それぞれが目的のゲノム領域を含む）を含み得る。一部の場合には、パネル内のゲノム位置は、位置のサイズが比較的小さくなるように選択される。一部の場合には、パネル内の領域は、約１０ｋｂもしくはそれを下回る、約８ｋｂもしくはそれを下回る、約６ｋｂもしくはそれを下回る、約５ｋｂもしくはそれを下回る、約４ｋｂもしくはそれを下回る、約３ｋｂもしくはそれを下回る、約２．５ｋｂもしくはそれを下回る、約２ｋｂもしくはそれを下回る、約１．５ｋｂもしくはそれを下回る、または約１ｋｂもしくはそれを下回るか、またはそれを下回るサイズを有する。一部の場合には、パネル内のゲノム位置は、約０．５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約０．５ｋｂ〜約６ｋｂ、約１ｋｂ〜約１１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１５ｋｂ、約１ｋｂ〜約２０ｋｂ、約０．１ｋｂ〜約１０ｋｂ、または約０．２ｋｂ〜約１ｋｂのサイズを有する。たとえば、パネル内の領域は、約０．１ｋｂ〜約５ｋｂのサイズを有し得る。
本明細書において選択されるパネルは、（たとえば、試料から得られた無細胞核酸分子中の）低頻度の遺伝子バリアントを検出するのに十分であるディープシーケンシングを可能にし得る。試料中の遺伝子バリアントの量は、所与の遺伝子バリアントの少数対立遺伝子頻度に関して、言及され得る。少数対立遺伝子頻度は、所与の核酸集団、たとえば、試料において、少数対立遺伝子（たとえば、もっとも一般的な対立遺伝子ではない）が生じる頻度を指し得る。低い少数対立遺伝子頻度の遺伝子バリアントは、試料における比較的低い存在頻度を有し得る。一部の場合には、パネルは、少なくとも０．０００１％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、または０．５％の少数対立遺伝子頻度の遺伝子バリアントの検出を可能にする。パネルは、０．００１％またはそれを上回る少数対立遺伝子頻度の遺伝子バリアントの検出を可能にし得る。パネルは、０．０１％またはそれを上回る少数対立遺伝子頻度の遺伝子バリアントの検出を可能にし得る。パネルは、０．０００１％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０２５％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２５％、０．５％、０．７５％、または１．０％ほどに低い頻度で試料中に存在する遺伝子バリアントの検出を可能にし得る。パネルは、少なくとも０．０００１％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０２５％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２５％、０．５％、０．７５％、または１．０％の頻度で試料中に存在する腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、１．０％ほどに低い頻度の腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、０．７５％ほどに低い頻度の腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、０．５％ほどに低い頻度の腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、０．２５％ほどに低い頻度の腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、０．１％ほどに低い頻度の腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、０．０７５％ほどに低い頻度の腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、０．０５％ほどに低い頻度の腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、０．０２５％ほどに低い頻度の腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、０．０１％ほどに低い頻度の腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、０．００５％ほどに低い頻度の腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、０．００１％ほどに低い頻度の腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、０．０００１％ほどに低い頻度の腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、１．０％〜０．０００１％ほどに低い頻度のシーケンシングされたｃｆＤＮＡにおける腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。パネルは、試料中、０．０１％〜０．０００１％ほどに低い頻度のシーケンシングされたｃｆＤＮＡにおける腫瘍マーカーの検出を可能にし得る。
遺伝子バリアントは、疾患（たとえば、がん）を有する対象の集団に対するパーセンテージで、表すことができる。一部の場合には、がんを有する集団のうちの少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が、パネル内の領域のうちの少なくとも１つに、１つまたは複数の遺伝子バリアントを呈する。たとえば、がんを有する集団のうちの少なくとも８０％が、パネル内のゲノム位置のうちの少なくとも１つに、１つまたは複数の遺伝子バリアントを呈し得る。
パネルは、１つまたは複数の遺伝子のそれぞれからの、目的のゲノム領域を含む１つまたは複数の位置を含み得る。一部の場合には、パネルは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、または８０個の遺伝子のそれぞれからの目的のゲノム領域を含む１つまたは複数の位置を含み得る。一部の場合には、パネルは、多くとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、または８０個の遺伝子のそれぞれからの目的のゲノム領域を含む１つまたは複数の位置を含み得る。一部の場合には、パネルは、約１〜約８０個、１〜約５０個、約３〜約４０個、５〜約３０個、１０〜約２０個の異なる遺伝子のそれぞれからの目的のゲノム領域を含む１つまたは複数の位置を含み得る。
パネル内の領域は、１つまたは複数の組織にわたって差示的に転写される配列を含むように、選択することができる。一部の場合には、ゲノム領域を含む位置は、ある特定の組織において、他の組織と比較して高いレベルで転写される配列を含み得る。たとえば、ゲノム領域を含む位置は、ある特定の組織では転写されるが他の組織では転写されない配列を含み得る。
パネル内のゲノム位置は、コーディング配列および／または非コーディング配列を含み得る。たとえば、パネル内のゲノム位置は、エクソン、イントロン、プロモーター、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、制御エレメント、転写開始部位、および／またはスプライス部位における１つまたは複数の配列を含み得る。一部の場合には、パネル内の領域は、偽遺伝子、反復配列、トランスポゾン、ウイルスエレメント、およびテロメアを含む、他の非コーディング配列を含んでもよい。一部の場合には、パネル内のゲノム位置は、非コーディングＲＮＡ、たとえば、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡにおける配列を含み得る。
パネル内のゲノム位置は、所望されるレベルの感度で（たとえば、１つまたは複数の遺伝子バリアントの検出を通じて）がんを検出（診断）するように選択することができる。たとえば、パネル内の領域は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の感度で（たとえば、１つまたは複数の遺伝子バリアントの検出を通じて）がんを検出するように選択することができる。パネル内のゲノム位置は、１００％の感度でがんを検出するように選択することができる。
パネル内のゲノム位置は、所望されるレベルの特異度で（たとえば、１つまたは複数の遺伝子バリアントの検出を通じて）がんを検出（診断）するように選択することができる。たとえば、パネル内のゲノム位置は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の特異度で（たとえば、１つまたは複数の遺伝子バリアントの検出を通じて）がんを検出するように選択することができる。パネル内のゲノム位置は、１００％の特異度で１つまたは複数の遺伝子バリアントを検出するように選択することができる。
パネル内のゲノム位置は、所望される陽性的中率でがんを検出（診断）するように選択することができる。陽性的中率は、感度（たとえば、実際の陽性が検出される確率）および／または特異度（たとえば、実際の陰性を陽性であると間違わない確率）を増加させることによって、増加させることができる。非限定的な例として、パネル内のゲノム位置は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の陽性的中率で１つまたは複数の遺伝子バリアントを検出するように選択することができる。パネル内の領域は、１００％の陽性的中率で１つまたは複数の遺伝子バリアントを検出するように選択することができる。
パネル内のゲノム位置は、所望される精度でがんを検出（診断）するように選択することができる。本明細書において使用される場合、「精度」という用語は、疾患状態（たとえば、がん）と健常状態とを区別する試験の能力を指し得る。精度は、感度および特異度、的中率、尤度比、ＲＯＣ曲線下面積、ヨーデン指標、および／または診断オッズ比などの尺度を使用して定量化することができる。
精度は、パーセンテージとして表すことができ、これは、正確な結果が得られた試験の回数と試験が行われた合計回数との間の比を指す。パネル内の領域は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の精度でがんを検出するように選択することができる。パネル内のゲノム位置は、１００％の精度でがんを検出するように選択することができる。
パネルは、感度が高く、低頻度の遺伝子バリアントを検出するように、選択することができる。たとえば、パネルは、試料中に０．０１％、０．０５％、または０．００１％ほどの低い頻度で存在する遺伝子バリアントまたは腫瘍マーカーを、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の感度で検出することができるように、選択することができる。パネル内のゲノム位置は、試料中に１％またはそれを下回る頻度で存在する腫瘍マーカーを、７０％またはそれを上回る感度で検出するように選択することができる。パネルは、試料中に０．１％ほどの低い頻度で存在する腫瘍マーカーを、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の感度で検出するように選択することができる。パネルは、試料中に０．０１％ほどの低い頻度で存在する腫瘍マーカーを、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の感度で検出するように選択することができる。パネルは、試料中に０．００１％ほどの低い頻度で存在する腫瘍マーカーを、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の感度で検出するように選択することができる。
パネルは、特異度が高く、低頻度の遺伝子バリアントを検出するように、選択することができる。たとえば、パネルは、試料中に０．０１％、０．０５％、または０．００１％ほどの低い頻度で存在する遺伝子バリアントまたは腫瘍マーカーを、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の特異度で検出することができるように、選択することができる。パネル内のゲノム位置は、試料中に１％またはそれを下回る頻度で存在する腫瘍マーカーを、７０％またはそれを上回る特異度で検出するように選択することができる。パネルは、試料中に０．１％ほどの低い頻度で存在する腫瘍マーカーを、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の特異度で検出するように選択することができる。パネルは、試料中に０．０１％ほどの低い頻度で存在する腫瘍マーカーを、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の特異度で検出するように選択することができる。パネルは、試料中に０．００１％ほどの低い頻度で存在する腫瘍マーカーを、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の特異度で検出するように選択することができる。
パネルは、精度が高く、低頻度の遺伝子バリアントを検出するように、選択することができる。パネルは、試料中に０．０１％、０．０５％、または０．００１％ほどの低い頻度で存在する遺伝子バリアントまたは腫瘍マーカーを、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の精度で検出することができるように、選択することができる。パネル内のゲノム位置は、試料中に１％またはそれを下回る頻度で存在する腫瘍マーカーを、７０％またはそれを上回る精度で検出するように選択することができる。パネルは、試料中に０．１％ほどの低い頻度で存在する腫瘍マーカーを、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の精度で検出するように選択することができる。パネルは、試料中に０．０１％ほどの低い頻度で存在する腫瘍マーカーを、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の精度で検出するように選択することができる。パネルは、試料中に０．００１％ほどの低い頻度で存在する腫瘍マーカーを、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の精度で検出するように選択することができる。
パネルは、的中率が高く、低頻度の遺伝子バリアントを検出するように、選択することができる。パネルは、試料中に０．０１％、０．０５％、または０．００１％ほどの低い頻度で存在する遺伝子バリアントまたは腫瘍マーカーが、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の陽性的中率を有し得るように、選択することができる。
パネルにおいて使用されるプローブまたはベイトの濃度を増加させて（２〜６ｎｇ／μＬ）、試料内のより多くの核酸分子を捕捉することができる。パネルにおいて使用されるプローブまたはベイトの濃度は、少なくとも２ｎｇ／μＬ、３ｎｇ／μＬ、４ｎｇ／μＬ、５ｎｇ／μＬ、６ｎｇ／μＬ、またはそれを上回り得る。プローブの濃度は、約２ｎｇ／μＬ〜約３ｎｇ／μＬ、約２ｎｇ／μＬ〜約４ｎｇ／μＬ、約２ｎｇ／μＬ〜約５ｎｇ／μＬ、約２ｎｇ／μＬ〜約６ｎｇ／μＬであり得る。パネルにおいて使用されるプローブまたはベイトの濃度は、２ｎｇ／μＬまたはそれを上回って、６ｎｇ／μＬまたはそれを下回り得る。一部の事例では、これにより、生物学的試料内のより多くの分子を分析することが可能となり、それによって、より低頻度の対立遺伝子を検出することが可能となり得る。
Ｂ．がんおよび他の疾患
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法および態様は、患者における所与の疾患、障害、または状態を診断するために使用される。典型的に、考慮される疾患は、一種のがんである。そのようながんの非限定的な例としては、胆道がん、膀胱がん、移行上皮癌、尿路上皮癌、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、乳癌、化生性癌、子宮頸がん、子宮頸扁平上皮癌、直腸がん、結腸直腸癌、結腸がん、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん、結腸直腸腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、食道がん、食道扁平上皮癌、食道腺癌、眼内黒色腫、ブドウ膜黒色腫、胆嚢癌、胆嚢腺癌、腎細胞癌、腎明細胞癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、ウイルムス腫瘍、白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性（ＣＭＭＬ）、肝臓がん、肝臓癌、ヘパトーマ、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、神経芽細胞腫、口腔咽頭がん、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓がん、膵管腺癌、偽乳頭新生物、腺房細胞癌、前立腺がん、前立腺の腺癌、皮膚がん、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、小腸癌、胃がん、胃癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮がん、または子宮肉腫が挙げられる。
必要に応じて本明細書に開示される方法およびシステムを使用して評価される、他の遺伝子に基づく疾患、障害、または状態の非限定的な例としては、軟骨形成不全、アルファ−１抗トリプシン欠損症、抗リン脂質症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）、ネコ鳴き症候群、クローン病、嚢胞性線維症、ダーカム病、ダウン症候群、デュアン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン血栓形成傾向、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、全前脳胞症、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、マルファン症候群、筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ヌーナン症候群、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポーランド奇形、ポルフィリン症、早老症、網膜色素変性、重症複合型免疫不全症（ｓｃｉｄ）、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮症、ティサックス病、サラセミア、トリメチルアミン尿症、ターナー症候群、口蓋心臓顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、ウイルソン病などが挙げられる。
Ｃ．カスタマイズされた治療および関連する投与
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、所与の疾患、障害、または状態を有する患者を識別し、患者に治療を投与することに関する。本質的にあらゆるがん治療（たとえば、外科手術治療、放射線療法、化学療法など）が、これらの方法の一部として含まれる。典型的には、治療には、少なくとも１つの免疫療法（または免疫療法剤）が含まれる。免疫療法は、一般に、所与のがん種に対する免疫応答を増強させる方法を指す。ある特定の実施形態では、免疫療法は、腫瘍またはがんに対するＴ細胞応答を増強させる方法を指す。
一部の実施形態では、免疫療法または免疫療法剤は、免疫チェックポイント分子を標的とする。ある特定の腫瘍は、免疫チェックポイント経路を制圧することによって、免疫系を回避することができる。したがって、腫瘍が免疫系を回避する能力に対抗し、ある特定のがんに対する抗腫瘍免疫を活性化するための有効なアプローチとして、免疫チェックポイントの標的化が生じた。Pardoll, Nature Reviews Cancer, 2012, 12:252-264。
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、抗原に対するＴ細胞応答に関与するシグナルを低減させる阻害性分子である。たとえば、ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞上に発現され、抗原提示細胞上のＣＤ８０（Ｂ７．１としても知られる）またはＣＤ８６（Ｂ７．２としても知られる）に結合することによって、Ｔ細胞活性化を下方制御する役割を果たす。ＰＤ−１は、Ｔ細胞上に発現される別の阻害性チェックポイント分子である。ＰＤ−１は、炎症性応答の際に、末梢組織においてＴ細胞の活性を制限する。加えて、ＰＤ−１のリガンド（ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）は、一般に、多数の異なる腫瘍の表面において上方制御されており、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答の下方制御をもたらしている。ある特定の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１である。他の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１のリガンド、たとえば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２である。他の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＣＴＬＡ４のリガンド、たとえば、ＣＤ８０またはＣＤ８６である。他の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、ガレクチン９（ＧＡＬ９）、またはアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）である。
これらの免疫チェックポイント分子を標的とするアンタゴニストを使用して、ある特定のがんに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を増強させることができる。したがって、ある特定の実施形態では、免疫療法または免疫療法剤は、阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニストである。ある特定の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１である。ある特定の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−Ｌ１である。ある特定の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニストは、抗体（たとえば、モノクローナル抗体）である。ある特定の実施形態では、抗体またはモノクローナル抗体は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、または抗ＰＤ−Ｌ２抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗ＰＤ−１抗体である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ−１抗体の組合せ、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せ、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＰＤ−１抗体の組合せである。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））またはニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））のうちの１つまたは複数である。ある特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、またはデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））のうちの１つまたは複数である。
ある特定の実施形態では、免疫療法または免疫療法剤は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＡＧ３、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、またはＡ２ａＲに対するアンタゴニスト（たとえば、抗体）である。他の実施形態では、アンタゴニストは、阻害性免疫チェックポイント分子の可溶性バージョン、たとえば、阻害性免疫チェックポイント分子の細胞外ドメインおよび抗体のＦｃドメインを含む、可溶性融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、可溶性融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、可溶性融合タンパク質は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＡＧ３、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、またはＡ２ａＲの細胞外ドメインを含む。一実施形態では、可溶性融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ２またはＬＡＧ３の細胞外ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、抗原に対するＴ細胞応答に関与するシグナルを増幅させる共刺激性分子である。たとえば、ＣＤ２８は、Ｔ細胞上に発現される共刺激性受容体である。Ｔ細胞が、そのＴ細胞受容体を通じて抗原に結合する際、ＣＤ２８は、抗原提示細胞上のＣＤ８０（Ｂ７．１としても知られる）またはＣＤ８６（Ｂ７．２としても知られる）に結合して、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を増幅させ、Ｔ細胞活性化を促進する。ＣＤ２８は、ＣＴＬＡ４と同じリガンド（ＣＤ８０およびＣＤ８６）に結合するため、ＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８によって媒介される共刺激性シグナル伝達に対抗するかまたはそれを制御することができる。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＣＤ２８、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、またはＣＤ２７から選択される共刺激性分子である。他の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、たとえば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、またはＣＤ７０を含む、共刺激性分子のリガンドである。
これらの共刺激性チェックポイント分子を標的とするアゴニストを使用して、ある特定のがんに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を増強させることができる。したがって、ある特定の実施形態では、免疫療法または免疫療法剤は、共刺激性チェックポイント分子のアゴニストである。ある特定の実施形態では、共刺激性チェックポイント分子のアゴニストは、アゴニスト抗体であり、好ましくは、モノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、アゴニスト抗体またはモノクローナル抗体は、抗ＣＤ２８抗体である。他の実施形態では、アゴニスト抗体またはモノクローナル抗体は、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０、または抗ＣＤ２７抗体である。他の実施形態では、アゴニスト抗体またはモノクローナル抗体は、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗Ｂ７ＲＰ１、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＯＸ４０Ｌ、または抗ＣＤ７０抗体である。
がん以外の特定の遺伝子に基づく疾患、障害、または状態を処置するための治療選択肢は、概して、当業者に周知であり、具体的な疾患、障害、または状態を考慮すると、明らかであろう。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるカスタマイズされた治療は、典型的に、非経口で（たとえば、静脈内または皮下に）投与される。免疫療法剤を含有する医薬組成物は、典型的に、静脈内投与される。ある特定の治療剤は、経口で投与される。しかしながら、カスタマイズされた治療（たとえば、免疫療法剤など）はまた、たとえば、頬内、舌下、直腸内、膣内、尿道内、局所、眼内、鼻内、および／または心房内を含む、当該技術分野において公知の任意の方法によって、投与され得、この投与には、錠剤、カプセル、顆粒、水性懸濁液、ゲル、スプレー、坐剤、膏薬、軟膏などが含まれ得る。
（実施例１）
ＰＰＧの検出
１７，８２５個の臨床試料のセットを、Ｇｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手した７３遺伝子パネルｃｆＤＮＡ試験を使用して、処理し、分析した。このセットの中で、１０７個の試料を、以下の表４に示されるように、１１２個の試料特異的ＰＰＧを有するとして識別した。これは、試料当たりのＰＰＧ率０．６％、または臨床試料１６７個につき１つの試料特異的ＰＰＧに相当する。
Figure 2021520810
Figure 2021520810
表４には、試料特異的ＰＰＧが少なくとも１つの試料において検出されたすべての遺伝子を示すが、すべてのシングルトンは、「シングルトン」のカテゴリーに集約されている。
生殖細胞系および体細胞系の両方の試料特異的ＰＰＧによって生じるエクソン−エクソンジャンクションにまたがるアライメントアーチファクトは、図５に示されるように、疑似バリアントコールをもたらし得る。ＰＰＧの存在は、イントロン配列が欠如した複数のソフトクリップリードの存在、ならびにイントロン−エクソン境界部におけるカバレッジの不連続性の両方によって判明する。矢印によって示される疑似Ａ．Ｃ ＳＮＶコールは、１．７％の対立遺伝子頻度（ＡＦ）で観察される。
（実施例２）
ＰＰＧの臨床的重要性
ＰＰＧの存在は、偽陽性バリアントコールの２つの異なる原因をもたらし得る。第１に、ＰＰＧによって生じるＰＰＧエクソン−エクソンジャンクションにまたがるリード間でのアライメントアーチファクトにより、疑似バリアントコールが生じ得る（図６）。第２に、ＰＰＧに存在するＳＮＶは、もともとの遺伝子にマッピングされ得る。
ＰＰＧが検出されなかった１０，０００個の臨床試料のランダムなサブセットを使用して、イントロン−エクソン境界部（図７Ａ）およびコーディング配列（ＣＤＳ）内（図７Ｂ）において偶然で予測されるであろうものよりも多くのＳＮＶをもたらすいくつかの遺伝子のＰＰＧコピーの存在が、観察された。
（実施例３）
偽陽性バリアントの排除
合計で、スプライスジャンクションでは４８個のＳＮＶ、ならびにＣＤＳでは３２個のＳＮＶが、ＨＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＳＭＡＤ４、およびＴＰ５３からのＰＰＧの存在に起因する可能性があると判定された。ＰＰＧを意識した偽陽性バリアントの抑制を行うことにより、表５に示されるように、試料当たりの偽陽性率の増加０．４５％（８０／１７，８２５）が、回避された。
Figure 2021520810
 （実施例４）
ＴＹＲＯ３ ＰＰＧによって生じる偽陽性バリアントの検出および抑制
２，０９４個の患者試料のセットを、Ｇｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手した５００遺伝子パネルｃｆＤＮＡ試験を使用して、処理し、分析した。このセットの中で、１，１４０個の試料を、遺伝子ＴＹＲＯ３に関して、試料特異的ＰＰＧを有するとして識別した。これは、試料当たりのＰＰＧ率５４％、または試料２つにつき１つのＰＰＧに相当する。これらの試料を、偽陽性が疑われる第１５染色体４１，８６２，４７７位のＴＹＲＯ３遺伝子座におけるＣからＴの突然変異（ＴＹＲＯ３ ｃ．１４２２Ｃ＞Ｔとして知られている）の存在について評価した。
Figure 2021520810
表６において、ＰＰＧが検出された１１個の試料において偽陽性が疑われるバリアントが観察されるが、ＰＰＧが検出されていない試料では観察されず、統計学的に有意な差があった（フィッシャー直接検定、ｐ＝０．００１３）。バリアントは、ＰＰＧの存在下においてのみ確認されるため、ＴＹＲＯ３遺伝子座にアライメントするＰＰＧを起源とするリードのアーチファクトであることが示唆される。
ＰＰＧによって生じるエクソン−エクソンジャンクションにまたがるアライメントアーチファクトは、図８に示されるように、ＴＹＲＯ３遺伝子座の状況で示されている。疑似Ｃ．Ｔ． ＳＮＶコール（ＴＹＲＯ３ ｃ．１４２２Ｃ＞Ｔ）は、矢印で示される。
本開示の様々な実施形態が本明細書に示され、説明されているが、そのような実施形態が単なる例示として提供されていることが、当業者には理解されるであろう。当業者であれば、本開示から逸脱することなく、多数の変化形、変更、および置換を想起し得る。本明細書に記載される本開示の実施形態に対する様々な代替形を、用いることができることを理解されたい。
上記または下記に引用されるすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、それぞれ個々の品目が、具体的かつ個別に、参照により組み込まれると示されるのと同程度に、あらゆる目的で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが、異なる時点で、１つの受託番号と関連付けられている場合、本出願の有効出願日の時点で受託番号と関連付けられているバージョンを意味する。有効出願日は、実際の出願日、または該当する場合には受託番号に言及している優先出願の出願日のうちの早い方を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが、異なる時点で公開されている場合、別途示されない限り、本出願の有効出願日の時点でもっとも新しく公開されているバージョンを意味する。本開示の任意の特性、ステップ、要素、実施形態、または態様は、別途具体的に示されない限り、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本開示は、明確さおよび理解の目的で、図示および例を用いていくらか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲内で、ある特定の変更および修正が実施されてもよいことは明らかであろう。

Claims (39)

  1. 少なくとも部分的にコンピュータを使用して、遺伝子配列リードにおけるアライメントエラーを検出するための方法であって、
    （ａ）前記コンピュータによって、対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた前記遺伝子配列リードを含む、配列情報を受信するステップと、
    （ｂ）前記遺伝子配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、
    （ｃ）前記アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、
    （ｄ）前記遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、前記遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、前記領域が、前記遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップとを含む、方法。
  2. 少なくとも部分的にコンピュータを使用して、対象の生物学的試料からの無細胞核酸分子において真の遺伝子バリアントを検出することにおいて、アライメントエラーを抑制するための方法であって、
    （ａ）前記コンピュータによって、前記無細胞核酸分子から得られた配列リードを含む、配列情報を受信するステップと、
    （ｂ）前記配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、
    （ｃ）前記アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、
    （ｄ）前記遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、前記遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、前記領域が、前記遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップと、
    （ｅ）前記１つまたは複数の遺伝子融合リードの前記サブセットにおける前記１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの少なくとも一部分をフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップと、
    （ｆ）前記参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップとを含む、方法。
  3. 少なくとも部分的にコンピュータを使用して、対象の試料からの無細胞核酸分子において真の遺伝子バリアントを検出することにおいて、アライメントエラーを抑制するための方法であって、
    （ａ）前記コンピュータによって、前記無細胞核酸分子から得られたシーケンシングリードを含む、配列情報を受信するステップと、
    （ｂ）前記配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、
    （ｃ）前記アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、
    （ｄ）遺伝子バリアントを含む、前記遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、前記遺伝子融合リードのうちの前記１つまたは複数の前記サブセットが、ＳＭＡＤ４、ＴＹＲＯ３、および／またはＲＡＦ１に対応する遺伝子配列を含む、ステップと、
    （ｅ）前記遺伝子融合リードのうちの前記１つまたは複数の前記サブセットにおける前記１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの少なくとも一部分をフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップと、
    （ｆ）前記参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップとを含む、方法。
  4. 少なくとも部分的にコンピュータを使用して、遺伝子配列リードにおけるアライメントエラーを検出するための方法であって、
    （ａ）前記コンピュータによって、対象からの生物学的試料中の無細胞核酸分子から得られた前記遺伝子配列リードを含む、配列情報を受信するステップと、
    （ｂ）前記遺伝子配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、
    （ｃ）前記アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを判定するステップと、
    （ｄ）前記遺伝子内融合ブレイクポイントを含む領域内に遺伝子バリアントを含む、前記遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを判定するステップであって、前記領域が、前記遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する１つまたは複数のヌクレオチドを含む、ステップと、
    （ｅ）所定の基準を満たす前記領域内のそれぞれの遺伝子バリアントを、アライメントエラーとして識別するステップとを含む、方法。
  5. 少なくとも部分的にコンピュータを使用して、対象の試料からの無細胞核酸分子において真の遺伝子バリアントを検出することにおいて、アライメントエラーを抑制するための方法であって、
    （ａ）前記コンピュータによって、前記無細胞核酸分子から得られたシーケンシングリードを含む、配列情報を受信するステップと、
    （ｂ）前記配列リードを、参照配列に対してアライメントして、アライメントされた配列リードを生成するステップと、
    （ｃ）前記アライメントされた配列リードから、遺伝子内融合ブレイクポイントを含む、遺伝子融合リードのセットを識別するステップと、
    （ｄ）遺伝子バリアントを含む、前記遺伝子融合リードのうちの１つまたは複数のサブセットを識別することによって、アライメントエラーを検出するステップであって、前記遺伝子融合リードのうちの前記１つまたは複数の前記サブセットが、ＳＭＡＤ４、ＴＹＲＯ３、および／またはＲＡＦ１に対応する遺伝子配列を含む、ステップと、
    （ｅ）前記遺伝子融合リードのうちの前記１つまたは複数の前記サブセットにおける前記１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの少なくとも一部分をフィルタリングして、フィルタリングされた配列リードを生成するステップと、
    （ｆ）前記参照配列と比較して、真の遺伝子バリアントを含む、フィルタリングされた配列リードを検出するステップとを含む、方法。
  6. 前記遺伝子融合リードの前記セットが、１つまたは複数のプロセスされた偽遺伝子（ＰＰＧ）に対応する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記１つまたは複数のＰＰＧが、１つまたは複数の試料特異的ＰＰＧを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記１つまたは複数の試料特異的ＰＰＧにより、対象の集団において、前記対象が識別される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記１つまたは複数のＰＰＧが、ＳＭＡＤ４、ＧＮＡＳ、ＴＰ５３、ＲＡＦ１、ＣＤＫ４、ＴＹＲＯ３、ＭＡＰＫ１、ＳＴＫ１１、ＣＣＮＤ１、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、およびＮＲＡＳからなる群に由来する、請求項６に記載の方法。
  10. 前記１つまたは複数のＰＰＧが、ＳＭＡＤ４、ＧＮＡＳ、ＴＰ５３、ＲＡＦ１、ＣＤＫ４、ＴＹＲＯ３、ＭＡＰＫ１、ＳＴＫ１１、ＣＣＮＤ１、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、およびＮＲＡＳからなる群に由来する２つまたはそれを上回るＰＰＧを含む、請求項６に記載の方法。
  11. 前記１つまたは複数のＰＰＧが、ＳＭＡＤ４、ＧＮＡＳ、ＴＰ５３、ＲＡＦ１、ＣＤＫ４、ＴＹＲＯ３、ＭＡＰＫ１、ＳＴＫ１１、ＣＣＮＤ１、ＨＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、およびＮＲＡＳからなる群に由来する３つまたはそれを上回るＰＰＧを含む、請求項６に記載の方法。
  12. 前記遺伝子バリアントまたは真の遺伝子バリアントが、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）または挿入もしくは欠失（インデル）を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記遺伝子バリアントが、ＳＮＶを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ＳＮＶが、イントロン−エクソン境界部に位置する、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記ＳＮＶが、遺伝子コーディング配列（ＣＤＳ）内に位置する、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記遺伝子バリアントが、インデルを含む、請求項１２に記載の方法。
  17. 前記領域が、前記遺伝子内融合ブレイクポイントに隣接する約２、４、６、８、１０、１５、または２０個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  18. 前記１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの一部分が、前記試料中の前記遺伝子内融合ブレイクポイントに対応する前記遺伝子内融合の画分よりも低いかまたはそれと同等である前記試料中の突然変異対立遺伝子画分を有する、前記検出されたアライメントエラーに基づいて、フィルタリングされる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
  19. 前記１つまたは複数の検出されたアライメントエラーの一部分が、事前に定義された臨床的に対処可能なバリアントのセットに属さない遺伝子バリアントを含む前記遺伝子融合リードに基づいて、フィルタリングされる、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記試料が、血液、血漿、血清、尿、唾液、粘膜排出物、喀痰、糞便、および涙液からなる群から選択される体液試料である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記対象が、疾患または障害を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記疾患が、がんである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記対象の前記生物学的試料から、無細胞核酸分子を単離するステップを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記無細胞核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記無細胞核酸分子が、二本鎖ＤＮＡである、請求項２４に記載の方法。
  26. シーケンシングの前に、分子バーコードを含む１つまたは複数のアダプターを、前記無細胞核酸分子に結合させて、タグ付けされた親ポリヌクレオチドを生成するステップをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記アダプターが、前記無細胞核酸分子の両端に結合される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記無細胞核酸分子が、固有にバーコーディングされる、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記無細胞核酸分子が、非固有にバーコーディングされる、請求項２６に記載の方法。
  30. それぞれのバーコードが、選択された領域からシーケンシングされる多様な分子と組み合わせて、固有な分子の識別を可能にする、固定またはセミランダムなオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記タグ付けされた親ポリヌクレオチドを増幅させて、子孫ポリヌクレオチドを生成するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  32. 目的の標的配列に関して、前記子孫ポリヌクレオチドを選択的に濃縮させ、それによって、濃縮された子孫ポリヌクレオチドを生成するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記濃縮された子孫ポリヌクレオチドを増幅させるステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記子孫ポリヌクレオチドまたは濃縮された子孫ポリヌクレオチドに、試料インデックス配列がタグ付けされる、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記配列情報が、核酸シーケンサーから得られる、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
  36. 前記遺伝子融合リードのセットが、シーケンシングされたペアエンドリードをアライメントおよび接続することによって識別される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記遺伝子融合リードのセットが、イントロン−エクソン境界部にまたがるカバレッジにおける不連続性に基づいて識別される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記事前に定義されたセットが、ＣＯＳＭＩＣ、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）、またはＥｘｏｍｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥｘＡＣ）において見出されるバリアントを含む、請求項１９に記載の方法。
  39. 少なくとも部分的にコンピュータを使用して、フィルタリングされたリード配列情報データセットを生成するための方法であって、
    （ａ）対象から得られた生物学的試料中の無細胞核酸（ｃｆＮＡ）から得られた試験配列リードのセットにおいて、１つまたは複数のスプリット配列リードを識別するステップであって、それぞれのスプリット配列リードが、少なくとも１つのブレイクポイントを含む、ステップと、
    （ｂ）前記試験配列リードのセットにおいて、（ｉ）所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む、前記スプリット配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分および／または前記試験配列リードのうちの１つもしくは複数の少なくとも一部分を抑制し、それによって前記フィルタリングされた配列情報データセットを生成するか、あるいは（ｉｉ）所与のブレイクポイントから選択されたヌクレオチド数以内に少なくとも１つの配列バリアントを含む前記スプリット配列リードの１つもしくは複数のベースコールおよび／または前記試験配列リードの１つもしくは複数のベースコールを抑制し、それによって、前記フィルタリングされた配列情報データセットを生成するステップとを含む、方法。
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