JP2021516977A

JP2021516977A - 植物発現エンハンサ

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Publication number: JP2021516977A
Application number: JP2020547373A
Authority: JP
Inventors: − オリビエールラボワイエ、ピエール; − アンドレドースト、マルク; 加藤　晃; 晃加藤; 将太朗山崎
Original assignee: Nara Institute of Science and Technology NUC; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Current assignee: Nara Institute of Science and Technology NUC; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 2018-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2021-07-15
Anticipated expiration: 2039-03-14
Also published as: RU2020132255A; MX2020009495A; CA3093592A1; BR112020018639A2; AU2019233860A1; EP3765618A4; CN112400021A; US20210246462A1; JP7423875B6; JP7423875B2; WO2019173924A1; EP3765618A1

Abstract

植物、植物の一部または植物細胞において活性な単離された発現エンハンサである、発現エンハンサが提供される。単離された発現エンハンサは、ｎｂＭＴ７８（配列番号１）；ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）；ｎｂＤＪ４６（配列番号３）；ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）；ｎｂＥＮ４２（配列番号５）；ａｔＨＳＰ６９（配列番号６）；ａｔＧＲＰ６２（配列番号７）；ａｔＰＫ６５（配列番号８）；ａｔＲＰ４６（配列番号９）；ｎｂ３０Ｓ７２（配列番号１０）；ｎｂＧＴ６１（配列番号１１）；ｎｂＰＶ５５（配列番号１２）；ｎｂＰＰＩ４３（配列番号１３）；ｎｂＰＭ６４（配列番号１４）；およびｎｂＨ２Ａ８６（配列番号１５）からなる群より選択され得る。単離された発現エンハンサを使用する方法も提供される。

Description

本発明は、植物において活性である発現エンハンサに関する。本発明はまた、植物における目的のタンパク質の発現に関し、植物における目的のタンパク質の生産のための方法および組成物を提供する。

植物は、組換えタンパク質の生産系として大きな可能性を提供する。植物で外来タンパク質を生産する１つのアプローチは、安定なトランスジェニック植物系統を生成することである。しかしながら、これは時間がかかり、労働集約的な工程である。トランスジェニック植物の代替策は、植物ウイルスベースの発現ベクターの使用である。植物ウイルスベースのベクターは、植物におけるタンパク質の迅速で高レベルな一過性発現を可能にする。

植物における外来タンパク質の高レベルの一過性発現は、ササゲモザイクウイルス（Ｃｏｗｐｅａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ＣＰＭＶ）；例えば、ＷＯ２００７／１３５４８０；ＷＯ２００９／０８７３９１；ＵＳ２０１０／０２８７６７０、ＳａｉｎｓｂｕｒｙＦ．ｅｔｅｔａｌ．，２００８，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ；１４８：１２１−１２１８；ＳａｉｎｓｂｕｒｙＦ．ｅｔａｌ．，２００８，ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ；６：８２−９２；ＳａｉｎｓｂｕｒｙＦ．ｅｔａｌ．，２００９，ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ；７：６８２−６９３；ＳａｉｎｓｂｕｒｙＦ．ｅｔａｌ．２００９，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｒｏｔｅｉｎｓＦｒｏｍＰｌａｎｔｓ，ｖｏｌ．４８３：２５−３９参照）などのコモウイルスを含むＲＮＡ植物ウイルスに基づくベクターを使用して得られてきた。

コモウイルスササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）のＲＮＡ−２の５’ＵＴＲの修飾は、野生型ＣＰＭＶ５’ＵＴＲと比較した場合、（目的の核酸または目的のタンパク質の測定された発現レベルとして）さらなる発現エンハンサ活性をもたらした。例えば、ＣＰＭＶＲＮＡ−２ベクターの１６１位の開始コドンの変異（Ｕ１６２Ｃ；ＨＴ）は、５１２位の開始コドンの後に挿入された配列によってコードされるタンパク質の発現レベルを増加させる。これは、ウイルス複製を必要とせずに高レベルの外来タンパク質の生産を可能にし、ＣＰＭＶ−ＨＴ系と称された（ＷＯ２００９／０８７３９１；ＳａｉｎｓｂｕｒｙａｎｄＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，２００８，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１４８，１２１２−１２１８）。ｐＥＡＱ発現プラスミド（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙｅｔａｌ．，２００９，ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ，７，ｐｐ６８２−６９３；ＵＳ２０１０／０２８７６７０）では、発現される配列は５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの間に配置される。ｐＥＡＱシリーズの５’ＵＴＲはＵ１６２Ｃ（ＨＴ）変異を担持する。

植物内の目的の核酸の発現をさらに増加させる、ＣＰＭＶ５’ＵＴＲ領域のさらなる修飾が記述されている。例えば、「ＣＭＰＶＨＴ＋」（１１５〜１１７位および１６１〜１６３位に修飾されたＡＴＧを有するＣＰＭＶ５’ＵＴＲのヌクレオチド１〜１６０を含む；参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／１４３５６７）、ならびに「ＣＰＭＶＸ」（ここで、Ｘ＝１６０、１５５、１５０、または１１４核酸の長さ；参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／１０３７０４）。ＣＭＰＶＸの例は、発現エンハンサ「ＣＰＭＶ１６０」である。ＣＰＭＶＨＴ＋に機能的に連結された核酸配列の発現は、「ＣＰＭＶＨＴ」発現エンハンサに機能的に連結された同じ核酸配列を使用した同じ目的のタンパク質の生成と比較した場合、核酸配列によってコード化された目的のタンパク質の生成の有意の増加をもたらした（ＷＯ２０１５／１４３５６７の図２および３参照）。さらに、「ＣＰＭＶ１６０」発現エンハンサに機能的に連結された核酸配列の発現は、「ＣＰＭＶＨＴ」発現エンハンサに機能的に連結された同じ核酸配列を使用した同じ目的のタンパク質の生成と比較した場合、核酸配列によってコード化された目的のタンパク質の生成の有意の増加をもたらした（ＷＯ２０１５／１４３５６７の図２および３参照）。

Ｄｉａｍｏｓｅｔ．ａｌ（参照により本明細書に組み込まれる、ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ．２０１６，ｖｏｌ７ｐｐ．１−１５）は、発現エンハンサＮｂＰｓａＫ２３’を含む、植物におけるタンパク質の生産を増加させるために使用し得るいくつかの発現エンハンサを記述している（Ｄｉａｍｏｓｅｔ．ａｌ．の表２参照）。Ｄｉａｍｏｓｅｔ．ａｌ．（２０１６）の図４に示されているように、ＮｂＰｓａＫ２３’に機能的に連結された核酸によってコードされた目的のタンパク質の生成は、他のトランケートされたｐｓａＫ発現エンハンサに機能的に連結された同じ核酸配列によってコードされた同じタンパク質の生成と比較した場合、タンパク質生成の増強をもたらした。

植物において活性な改善された発現エンハンサを提供することが本発明の目的である。

本発明によれば、植物において活性な単離された発現エンハンサが提供され、発現エンハンサは以下からなる群より選択される：
ｎｂＭＴ７８（配列番号１）；
ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）；
ｎｂＤＪ４６（配列番号３）；
ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）；
ｎｂＥＮ４２（配列番号５）；
ａｔＨＳＰ６９（配列番号６）；
ａｔＧＲＰ６２（配列番号７）；
ａｔＰＫ６５（配列番号８）；
ａｔＲＰ４６（配列番号９）；
ｎｂ３０Ｓ７２（配列番号１０）；
ｎｂＧＴ６１（配列番号１１）；
ｎｂＰＶ５５（配列番号１２）；
ｎｂＰＰＩ４３（配列番号１３）；
ｎｂＰＭ６４（配列番号１４）；
ｎｂＨ２Ａ８６（配列番号１５）、および
配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に９０〜１００％の配列同一性を有する核酸。ここで、発現エンハンサは、目的の核酸、例えば目的の異種核酸に機能的に連結されている場合、目的の核酸の発現をもたらす。さらに、発現エンハンサは、目的の核酸、例えば目的の異種核酸に連結されている場合、発現エンハンサに機能的に連結されていない、または例えば先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（配列番号１６）に機能的に連結されている場合の目的の同じ核酸または異種核酸の発現レベルと比較した場合、目的の核酸または目的の異種核酸の発現レベルを増加させ得る。

本開示はまた、上記の単離された発現エンハンサの１つを含む核酸配列を提供し、発現エンハンサは、目的のタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結されている。異種ヌクレオチド配列は、ウイルスタンパク質または抗体をコードしてもよく、例えば、限定と見なされるべきではないが、ウイルスタンパク質はインフルエンザタンパク質またはノロウイルスタンパク質であってもよい。目的のタンパク質がインフルエンザタンパク質である場合、これは、Ｍ２、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、インフルエンザＢ型赤血球凝集素の群から選択される赤血球凝集素タンパク質、またはそれらの組み合わせを含み得る。目的のタンパク質がノロウイルスタンパク質である場合、これは、ＧＩ．１、ＧＩ．２、ＧＩ．３、ＧＩ．５、ＧＩ．７、ＧＩＩ．１、ＧＩＩ．２、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４、ＧＩＩ．５、ＧＩＩ．６、ＧＩＩ．７、ＧＩＩ．１２、ＧＩＩ．１３、ＧＩＩ．１４、ＧＩＩ．１７およびＧＩＩ．２１の群から選択される、ＶＰ１タンパク質、ＶＰ２タンパク質、またはそれらの組み合わせを含み得る。

本発明はまた、上記の核酸配列の１つまたは複数を含む植物発現系を提供する。植物発現系は、コモウイルス３’ＵＴＲをさらに含み得る。

本発明はまた、上記のように、異種核酸またはヌクレオチド配列と機能的に連結された１つまたは複数の単離された核酸配列を含む植物発現系を提供する。植物発現系は、コモウイルス３’ＵＴＲをさらに含み得る。

また、植物または植物の一部に、核酸配列の１つまたは複数を含む上記の植物発現系を導入すること、および目的のタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列のそれぞれの発現を可能にする条件下で、植物、植物の一部、または植物細胞をインキュベートすることを含む、植物または植物の一部において目的のタンパク質を生産する方法が本明細書に開示される。例えば、目的のタンパク質は、インフルエンザタンパク質またはノロウイルスタンパク質などのウイルスタンパク質であり得る。目的のタンパク質がインフルエンザタンパク質である場合、これは、Ｍ２、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、インフルエンザＢ型赤血球凝集素の群から選択される赤血球凝集素タンパク質、およびそれらの組み合わせを含み得る。目的のタンパク質がノロウイルスタンパク質である場合、これは、ＧＩ．１、ＧＩ．２、ＧＩ．３、ＧＩ．５、ＧＩＩ．１、ＧＩＩ．２、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４、ＧＩＩ．５、ＧＩＩ．６、ＧＩＩ．７、ＧＩＩ．１２、ＧＩＩ．１３、ＧＩＩ．１４、ＧＩＩ．１７およびＧＩＩ．２１の群から選択される、ＶＰ１タンパク質、ＶＰ２タンパク質、またはそれらの組み合わせを含み得る。

目的の多量体タンパク質を生成する方法も本明細書に記載されている。この方法は、植物、植物の一部、または植物細胞において、安定なまたは一過性の方法で、２つまたは２つを超える上記の核酸配列を共発現させること、ここで、２つまたは２つを超える核酸配列のそれぞれは多量体タンパク質の成分をコードし、ならびに目的の多量体タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列のそれぞれの発現を可能にする条件下で植物、植物の一部、または植物細胞をインキュベートすることを含む。

また、上記の植物発現系で一過性に形質転換または安定に形質転換された植物、植物の一部、または植物細胞が本明細書で提供される。

本明細書に記載される発現エンハンサを含む植物ベースの発現系は、目的の核酸の発現をもたらす。さらに、本明細書に記載の発現エンハンサを含む植物ベースの発現系は、本明細書に記載されるように、分泌タンパク質（ＳＰＥＥ）をコードする核酸から得られる発現エンハンサ、または細胞質タンパク質（ＣＰＥＥ）をコードする核酸から得られる発現エンハンサのいずれかである、発現エンハンサに機能的に連結された異種オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列の発現の増加または増強をもたらす。発現の増加は、本明細書に記載される発現エンハンサを使用して得られる発現レベルを、異種オープンリーディングフレームをコードするが発現エンハンサに機能的に連結されていない同じヌクレオチド配列の発現レベル、または例えば先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（配列番号１６）に機能的に連結されている場合の発現レベルと比較することによって決定され得る。

本明細書に記載の１つまたは複数の発現エンハンサを含む植物ベースの発現系、ベクター、構築物および核酸は、例えば目的の遺伝子またはヌクレオチド配列のための好都合なクローニング部位を含むなどのいくつかの特性を有することもでき、費用効率の高い方法で植物を容易に形質転換するために使用でき、接種された植物の効率的な局所的または全身的形質転換を生じさせ得る。さらに、植物の形質転換は、有用なタンパク質材料の良好な収率を提供するはずである。

本発明のこの概要は、必ずしも本発明のすべての特徴を記載するものではない。

本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照する以下の説明からより明らかになるであろう。

図１Ａは先行技術であり、インフルエンザＨ１Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｈ３Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ｈ５ＩｎｄｏｎｅｓｉａおよびＢＷｉｓｃｏｎｓｉｎをそれぞれコードする、ＣＰＭＶＨＴ発現エンハンサ（ＷＯ２００９／０８７３９１に記載）またはＣＰＭＶ１６０＋発現エンハンサ（ＷＯ２０１５／１０３７０４に記載）に機能的に連結された核酸を発現することによって植物において生成されたこれらのタンパク質のそれぞれの相対力価を示す。図１Ｂは先行技術であり、Ｈ１Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｈ３Ｖｉｃｔｏｒｉａ、ＢＢｒｉｓｂａｎｅ、ＢＢｒｉｓｂａｎｅ＋Ｈ１Ｔｍ、ＢＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＢＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ＋Ｈ１Ｔｍ、ＢＷｉｓｃｏｎｓｉｎおよびＢＷｉｓｃｏｎｓｉｎ＋Ｈ１Ｔｍをそれぞれコードする、ＣＰＭＶＨＴ発現エンハンサ（ＷＯ２００９／０８７３９１に記載）またはＣＰＭＶ１６０＋発現エンハンサ（ＷＯ２０１５／１０３７０４に記載）に機能的に連結された核酸を発現することによって植物において生成されたこれらのタンパク質のそれぞれの相対力価を示す。図１Ｃは先行技術であり、ＧＦＰタンパク質をコードする、以下の発現エンハンサ：ＮｂＰｓａＫ２３’（本明細書ではｎｂＰＫ７４と称される）、ＡｔＰｓａＫ３’（本明細書ではａｔＰＫ４１と称される）、ＮｂＰｓａＫ１３’、ＡｔＰｓｋＫ、ＡｔＰｓａｋ５’、ＴＭＶ、ＮｂＰｓａＫ２およびＮｂＰＳａｋ１（Ｄｉａｍｏｓｅｔ．ａｌ．，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ．２０１６，ｖｏｌ７ｐｐ．１−１５）に機能的に連結された核酸を発現することによって植物において生成されたＧＦＰの相対的生産を示す。

図２は、Ｄａｓｈｅｒタンパク質（ＤａｓｈｅｒＧＦＰ；ＦＰＢ−２７２６９；ＡＴＵＭから）をコードする、先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（ＷＯ２０１５／１０３７０４に記載）もしくはａｔＰＫ４１（Ｄｉａｍｏｓｅｔ．ａｌ．，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ．２０１６，ｖｏｌ７ｐｐ．１−１５に記載）、または本発明の発現エンハンサ：ｎｂＭＴ７８（配列番号１）；ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）；ｎｂＤＪ４６（配列番号３）；ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）；ｎｂＥＮ４２（配列番号５）；ａｔＨＳＰ６９（配列番号６）；ａｔＧＲＰ６２（配列番号７）；ａｔＰＫ６５（配列番号８）；ａｔＲＰ４６（配列番号９）；ｎｂ３０Ｓ７２（配列番号１０）；ｎｂＧＴ６１（配列番号１１）；ｎｂＰＶ５５（配列番号１２）；ｎｂＰＰＩ４３（配列番号１３）；ｎｂＰＭ６４（配列番号１４）；およびｎｂＨ２Ａ８６（配列番号１５）に機能的に連結された核酸を発現することによって植物において生成されたＤａｓｈｅｒタンパク質の蛍光活性を示す。

図３Ａは、Ｈ１Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａタンパク質をコードする、先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（ＷＯ２０１５／１０３７０４に記載）もしくはａｔＰＫ４１（Ｄｉａｍｏｓｅｔ．ａｌ．，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ．２０１６，ｖｏｌ７ｐｐ．１−１５に記載）、または本発明の発現エンハンサ：ｎｂＭＴ７８（配列番号１）；ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）；ｎｂＤＪ４６（配列番号３）；ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）；ｎｂＥＮ４２（配列番号５）；ａｔＨＳＰ６９（配列番号６）；ａｔＧＲＰ６２（配列番号７）；ａｔＰＫ６５（配列番号８）；ａｔＲＰ４６（配列番号９）；ｎｂ３０Ｓ７２（配列番号１０）；ｎｂＧＴ６１（配列番号１１）；ｎｂＰＶ５５（配列番号１２）；ｎｂＰＰＩ４３（配列番号１３）；ｎｂＰＭ６４（配列番号１４）；およびｎｂＨ２Ａ８６（配列番号１５）に機能的に連結された核酸を発現することによって植物において生成されたＨ１Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９インフルエンザウイルスのＨＡ力価を示す。図３Ｂは、Ｈ１Ｍｉｃｈ／４５／１５、Ｈ３ＨＫ／４８０１／１４、ＨＡＢＢｒｉｓ／６０／０８およびＨＡＢＰｈｕ／３０７３／１３をそれぞれコードする、先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（ＷＯ２０１５／１０３７０４に記載）、または本発明の発現エンハンサ：ｎｂＭＴ７８（配列番号１）、ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）、ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）、およびａｔＨＳＰ６９（配列番号６）に機能的に連結された核酸を発現することによって植物において生成された、示されているＨＡタンパク質のＨＡ力価を示す。

図４は、勾配遠心分離後のノロウイルスＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ２０１２ＶＰ１ＶＬＰの相対的収量を示し、ＶＬＰは、ＶＰ１タンパク質をコードする核酸を発現することによって植物で産生され、ここで、ＶＰ１タンパク質をコードする核酸のそれぞれは、先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（ＷＯ２０１５／１０３７０４に記載）、先行技術の発現エンハンサＮｂＰｓａＫ２３’（本明細書ではｎｂＰＫ７４と称される；Ｄｉａｍｏｓｅｔａｌ．）、または本発明の発現エンハンサ：ｎｂＭＴ７８（配列番号１）、ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）、ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）、およびａｔＨＳＰ６９（配列番号６）に機能的に連結されている。

図５は、発現エンハンサのさまざまな組み合わせに機能的に連結された、リツキシマブ抗体の軽鎖（ＬＣ）をコードする第１の核酸とリツキシマブ抗体の重鎖（ＨＣ）をコードする第２の核酸を共発現させることによって植物において生成された多量体タンパク質リツキシマブの相対的収量を示す。ＨＣ核酸に関して：Ｃ１６０：多量体タンパク質をコードする第１および第２の核酸は両方とも、先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（ＷＯ２０１５／１０３７０４に記載されている）に機能的に連結されている；ｎｂＡＴＬ７５：ＨＣ多量体タンパク質をコードする第２の核酸はｎｂＡＴＬ７５発現エンハンサに機能的に連結され、ＬＣをコードする第１の核酸は、ｎｂＭＴ７８（配列番号１）、ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）、ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）およびａｔＨＳＰ６９（配列番号６）発現エンハンサの１つに機能的に連結されている；ｎｂＣＨＰ７９：ＨＣ多量体タンパク質をコードする第２の核酸はｎｂＣＨＰ７９発現エンハンサに機能的に連結され、ＬＣをコードする第１の核酸は、ｎｂＭＴ７８（配列番号１）、ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）、ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）およびａｔＨＳＰ６９（配列番号６）発現エンハンサの１つに機能的に連結されている；ｎｂＭＴ７８：ＨＣ多量体タンパク質をコードする第２の核酸はｎｂＭＴ７８発現エンハンサに機能的に連結され、ＬＣをコードする第１の核酸はｎｂＭＴ７８（配列番号１）、ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）、ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）およびａｔＨＳＰ６９（配列番号６）発現エンハンサの１つに機能的に連結されている；ａｔＨＳＰ６９：ＨＣ多量体タンパク質をコードする第２の核酸はａｔＨＳＰ６９発現エンハンサに機能的に連結され、ＬＣをコードする第１の核酸は、ｎｂＭＴ７８（配列番号１）、ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）、ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）およびａｔＨＳＰ６９（配列番号６）発現エンハンサの１つに機能的に連結されている。

図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ａは、構築物１６６６（２Ｘ３５Ｓプロモータ−アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモータおよびターミネータ下でのサイレンシングのＴＢＳＶＰ１９サプレッサの共発現をコードする配列を組み込んだＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳベースの発現カセット）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｂは、構築物４４６７（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＭＴ７８−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｃは、構築物４１６０（２Ｘ３５Ｓプロモータ−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳベースの発現カセットに加えて、アルファルファプラストシアニンプロモータおよびターミネータの制御下にあるインフルエンザＭ２イオンチャネル遺伝子を含む）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｄは、構築物４１７０（２Ｘ３５Ｓプロモータ−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳベースの発現カセットに加えて、ＮＯＳターミネータの後にタバコＲＢ７遺伝子からのマトリックス付着領域（ＭＡＲ）調節エレメントを含む）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｅは、構築物４４６０（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲＣＰＭＶ１６０−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｆは、構築物４４６１（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＧＴ６１−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｇは、構築物４４６２（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＡＴＬ７５−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｈは、構築物４４６３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＤＪ４６−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｉは、構築物４４６４（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＣＨＰ７９−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｊは、構築物４４６５（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＥＮ４２−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｋは、構築物４４６６（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂ３０Ｓ７２−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示しす。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｌは、構築物４４６８（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＰＶ５５−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｍは、構築物４４６９（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＰＰＩ４３−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｎは、構築物４４７０（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＰＭ６４−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｏは、構築物４４７１（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＨ２Ａ８６−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｐは、構築物４４７２（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＨＳＰ６９−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｑは、構築物４４７３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＧＲＰ６２−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｒは、構築物４４７４（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＰＫ６５−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図６は、Ｄａｓｈｅｒをコードする構築物を示す。図６Ｓは、構築物４４７５（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＲＰ４６−Ｄａｓｈｅｒ（ＦＰＢ−２７−６０９）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。

図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ａは、構築物４０２１（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲＣＰＭＶ１６０−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｂは、構築物４０６１（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＧＴ６１−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｃは、構築物４０６２（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＡＴＬ７５−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｄは、構築物４０６３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＤＪ４６−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｅは、構築物４０６４（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＣＨＰ７９−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｆは、構築物４０６５（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＥＮ４２−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｇは、構築物４０６６（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂ３０Ｓ７２−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｈは、構築物４０６７（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＭＴ７８−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｉは、構築物４０６８（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＰＶ５５−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｊは、構築物４０６９（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＰＰＩ４３−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｋは、構築物４０７０（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＰＭ６４−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｌは、構築物４０７１（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＨ２Ａ８６−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｍは、構築物４０７２（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＨＳＰ６９−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｎは、構築物４０７３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＧＲＰ６２−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｏは、構築物４０７４（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＰＫ６５−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図７は、Ｈ１−Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９をコードする構築物を示す。図７Ｐは、構築物４０７５（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＲＰ４６−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０Ｈ１Ａ−Ｃａｌ−７−０９−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。

図８は、Ｈ１−Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５をコードする構築物を示す。図８Ａは、構築物４０１３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲＣＰＭＶ１６０−ＳｐＰＤＩ−Ｈ１Ａ−Ｍｉｃｈ−４５−２０１５−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図８は、Ｈ１−Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５をコードする構築物を示す。図８Ｂは、構築物４７０１（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＡＴＬ７５−ＳｐＰＤＩ−Ｈ１Ａ−Ｍｉｃｈ−４５−２０１５−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図８は、Ｈ１−Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５をコードする構築物を示す。図８Ｃは、構築物４７０２（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＣＨＰ７９−ＳｐＰＤＩ−Ｈ１Ａ−Ｍｉｃｈ−４５−２０１５−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図８は、Ｈ１−Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５をコードする構築物を示す。図８Ｄは、構築物４７０３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＭＴ７８−ＳｐＰＤＩ−Ｈ１Ａ−Ｍｉｃｈ−４５−２０１５−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図８は、Ｈ１−Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５をコードする構築物を示す。図８Ｅは、構築物４７０４（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＨＳＰ６９−ＳｐＰＤＩ−Ｈ１Ａ−Ｍｉｃｈ−４５−２０１５−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。

図９は、Ｈ３−Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／１４をコードする構築物を示す。図９Ａは、構築物４０１４（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲＣＰＭＶ１６０−ＳｐＰＤＩ−Ｈ３Ａ−ＨＫ−４８０１−１４−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図９は、Ｈ３−Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／１４をコードする構築物を示す。図９Ｂは、構築物４７１１（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＡＴＬ７５−ＳｐＰＤＩ−Ｈ３Ａ−ＨＫ−４８０１−１４−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図９は、Ｈ３−Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／１４をコードする構築物を示す。図９Ｃは、構築物４７１２（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＣＨＰ７９−ＳｐＰＤＩ−Ｈ３Ａ−ＨＫ−４８０１−１４−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図９は、Ｈ３−Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／１４をコードする構築物を示す。図９Ｄは、構築物４７１３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＭＴ７８−ＳｐＰＤＩ−Ｈ３Ａ−ＨＫ−４８０１−１４−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図９は、Ｈ３−Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／１４をコードする構築物を示す。図９Ｅは、構築物４７１４（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＨＳＰ６９−ＳｐＰＤＩ−Ｈ３Ａ−ＨＫ−４８０１−１４−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。

図１０は、ＨＡ−Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８をコードする構築物を示す。図１０Ａは、構築物４０１５（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲＣＰＭＶ１６０−ＳｐＰＤＩ−ＨＡＢ／Ｂｒｉ／６０／０８−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１０は、ＨＡ−Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８をコードする構築物を示す。図１０Ｂは、構築物４７２１（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＡＴＬ７５−ＳｐＰＤＩ−ＨＡＢ／Ｂｒｉ／６０／０８−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１０は、ＨＡ−Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８をコードする構築物を示す。図１０Ｃは、構築物４７２２（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＣＨＰ７９−ＳｐＰＤＩ−ＨＡＢ／Ｂｒｉ／６０／０８−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１０は、ＨＡ−Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８をコードする構築物を示す。図１０Ｄは、構築物４７２３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＭＴ７８−ＳｐＰＤＩ−ＨＡＢ／Ｂｒｉ／６０／０８−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１０は、ＨＡ−Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８をコードする構築物を示す。図１０Ｅは、構築物４７２４（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＨＳＰ６９−ＳｐＰＤＩ−ＨＡＢ／Ｂｒｉ／６０／０８−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。

図１１は、ＨＡＢ／Ｐｈｕ／３０７３／１３をコードする構築物を示す。図１１Ａは、構築物４０１６（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲＣＰＭＶ１６０−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０ＨＡＢ／Ｐｈｕ／３０７３／１３−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１１は、ＨＡＢ／Ｐｈｕ／３０７３／１３をコードする構築物を示す。図１１Ｂは、構築物４７３１（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＡＴＬ７５−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０ＨＡＢ／Ｐｈｕ／３０７３／１３−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１１は、ＨＡＢ／Ｐｈｕ／３０７３／１３をコードする構築物を示す。図１１Ｃは、構築物４７３２（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＣＨＰ７９−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０ＨＡＢ／Ｐｈｕ／３０７３／１３−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１１は、ＨＡＢ／Ｐｈｕ／３０７３／１３をコードする構築物を示す。図１１Ｄは、構築物４７３３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＭＴ７８−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０ＨＡＢ／Ｐｈｕ／３０７３／１３−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１１は、ＨＡＢ／Ｐｈｕ／３０７３／１３をコードする構築物を示す。図１１Ｅは、構築物４７３４（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＨＳＰ６９−ＳｐＰＤＩ−ＨＡ０ＨＡＢ／Ｐｈｕ／３０７３／１３−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。

図１２は、ＶＰ１−ＧＩＩ．４Ｓｙｄｎｅｙ１２をコードする構築物を示す。図１２Ａは、構築物４１３３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲＣＰＭＶ１６０−ＶＰ１（ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図１２は、ＶＰ１−ＧＩＩ．４Ｓｙｄｎｅｙ１２をコードする構築物を示す。図１２Ｂは、構築物４１６１（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＡＴＬ７５−ＶＰ１（ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図１２は、ＶＰ１−ＧＩＩ．４Ｓｙｄｎｅｙ１２をコードする構築物を示す。図１２Ｃは、構築物４１６２（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＣＨＰ７９−ＶＰ１（ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図１２は、ＶＰ１−ＧＩＩ．４Ｓｙｄｎｅｙ１２をコードする構築物を示す。図１２Ｄは、構築物４１６３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＭＴ７８−ＶＰ１（ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。図１２は、ＶＰ１−ＧＩＩ．４Ｓｙｄｎｅｙ１２をコードする構築物を示す。図１２Ｅは、構築物４１６４（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＨＳＰ６９−ＶＰ１（ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２）−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。

図１３は、ＨＣＩｇＧ１をコードする構築物を示す。図１３Ａは、構築物３１９１（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲＣＰＭＶ１６０−ＳｐＰＤＩ−ＨＣＩｇＧ１−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１３は、ＨＣＩｇＧ１をコードする構築物を示す。図１３Ｂは、構築物４６４３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＡＴＬ７５−ＳｐＰＤＩ−ＨＣＩｇＧ１−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１３は、ＨＣＩｇＧ１をコードする構築物を示す。図１３Ｃは、構築物４６４４（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＣＨＰ７９−ＳｐＰＤＩ−ＨＣＩｇＧ１−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１３は、ＨＣＩｇＧ１をコードする構築物を示す。図１３Ｄは、構築物４６４５（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＭＴ７８−ＳｐＰＤＩ−ＨＣＩｇＧ１−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１３は、ＨＣＩｇＧ１をコードする構築物を示す。図１３Ｅは、構築物４６４６（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＨＳＰ６９−ＳｐＰＤＩ−ＨＣＩｇＧ１−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。

図１４は、ＬＣＩｇＧ１をコードする構築物を示す。図１４Ａは、構築物３１９２（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲＣＰＭＶ１６０−ＳｐＰＤＩ−ＬＣＩｇＧ１−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１４は、ＬＣＩｇＧ１をコードする構築物を示す。図１４Ｂは、構築物４６５３（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＡＴＬ７５−ＳｐＰＤＩ−ＬＣＩｇＧ１−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１４は、ＬＣＩｇＧ１をコードする構築物を示す。図１４Ｃは、構築物４６５４（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＣＨＰ７９−ＳｐＰＤＩ−ＬＣＩｇＧ１−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１４は、ＬＣＩｇＧ１をコードする構築物を示す。図１４Ｄは、構築物４６５５（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲｎｂＭＴ７８−ＳｐＰＤＩ−ＬＣＩｇＧ１−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。図１４は、ＬＣＩｇＧ１をコードする構築物を示す。図１４Ｅは、構築物４６５６（２Ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲａｔＨＳＰ６９−ＳｐＰＤＩ−ＬＣＩｇＧ１−ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ）を示す。Ｓｐ：シグナルペプチド。

図１５Ａは、ｎｂＭＴ７８の核酸配列（配列番号１）を示す。図１５Ｂは、ｎｂＡＴＬ７５の核酸配列（配列番号２）を示す。図１５Ｃは、ｎｂＤＪ４６の核酸配列（配列番号３）を示す。図１５Ｄは、ｎｂＣＨＰ７９の核酸配列（配列番号４）を示す。図１５Ｅは、ｎｂＥＮ４２の核酸配列（配列番号５）を示す。図１５Ｆは、ａｔＨＳＰ６９の核酸配列（配列番号６）を示す。図１５Ｇは、ａｔＧＲＰ６２の核酸配列（配列番号７）を示す。図１５Ｈは、ａｔＰＫ６５の核酸配列（配列番号８）を示す。図１５Ｉは、ａｔＲＰ４６の核酸配列（配列番号９）を示す。図１５Ｊは、ｎｂ３０Ｓ７２の核酸配列（配列番号１０）を示す。図１５Ｋは、ｎｂＧＴ６１の核酸配列（配列番号１１）を示す。図１５Ｌは、ｎｂＰＶ５５の核酸配列（配列番号１２）を示す。図１５Ｍは、ｎｂＰＰＩ４３の核酸配列（配列番号１３）を示す。図１５Ｎは、ｎｂＰＭ６４の核酸配列（配列番号１４）を示す。図１５Ｏは、ｎｂＨ２Ａ８６の核酸配列（配列番号１５）を示す。図１５Ｐは、ＣＰＭＶ１６０の核酸配列（配列番号１６）を示す（先行技術）。

図１６Ａは、Ｄａｓｈｅｒ構築物を調製するために使用されるプライマーの核酸配列を示す。図１６Ｂは、ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−Ｄａｓｈｅｒの核酸配列（配列番号２０）を示す。図１６Ｃは、Ｄａｓｈｅｒの核酸配列（配列番号７８）を示す。図１６Ｄは、Ｄａｓｈｅｒのアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。図１６Ｅは、２Ｘ３５ＳプロモータからＮＯＳターミネータまでの構築物４４６７（Ｄａｓｈｅｒ）の核酸配列（配列番号７５）を示す。図１６Ｆは、Ｄａｓｈｅｒのクローニングベクターである、Ｔ−ＤＮＡの左境界から右境界までの構築物１６６６の核酸配列（配列番号２２）を示す。

図１７Ａは、Ｈ１ＡＣａｌ−７−０９、Ｈ１Ａ−Ｍｉｃｈ−４５−１５、Ｈ３ＨＫ−４８０１−１４、ＨＡＢ−Ｂｒｉｓ−６０−０８、およびＨＡＢ＿Ｐｈｕ−３０７３−１３構築物を調製するために使用されるプライマーの核酸配列を示す。図１７Ｂは、ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋Ｈ１Ｃａｌの核酸配列（配列番号７９）を示す。図１７Ｃは、ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋Ｈ１Ｃａｌ核酸配列の核酸配列（配列番号８０）を示す。図１７Ｄは、ＰＤＩ＋Ｈ１Ｃａｌのアミノ酸配列（配列番号８１）を示す。図１７Ｅは、Ｈ３およびＨＡＢ構築物を調製するために使用されるクローニングベクターである、Ｔ−ＤＮＡの左境界から右境界までの構築物４１６０の核酸配列（配列番号７６）を示す。

図１８Ａは、ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋Ｈ１Ｍｉｃｈの核酸配列（配列番号８２）を示す。図１８Ｂは、ＰＤＩ＋Ｈ１Ｍｉｃｈの核酸配列（配列番号８３）を示す。図１８Ｃは、ＰＤＩ＋Ｈ１Ｍｉｃｈのアミノ酸配列（配列番号８４）を示す。図１８Ｄは、ＶＰ１ＧＩＩ．４構築物を調製するために使用されるクローニングベクターである、Ｔ−ＤＮＡの左境界から右境界までの構築物４１７０の核酸配列（配列番号７７）を示す。

図１９Ａは、ＣＰＭＶ１６０の５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋Ｈ３ＨＫの核酸配列（配列番号８５）を示す。図１９Ｂは、ＰＤＩ＋Ｈ３ＨＫの核酸配列（配列番号８６）を示す。図１９Ｃは、ＰＤＩ＋Ｈ３ＨＫのアミノ酸配列（配列番号８７）を示す。

図２０Ａは、ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋ＨＡＢＢｒｉの核酸配列（配列番号８８）を示す。図２０Ｂは、ＰＤＩ＋ＨＡＢＢｒｉの核酸配列（配列番号８９）を示す。図２０Ｃは、ＰＤＩ＋ＨＡＢＢｒｉアミノ酸配列のアミノ酸配列（配列番号９０）を示す。

図２１Ａは、ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋ＨＡＢＰｈｕの核酸配列（配列番号９１）を示す。図２１Ｂは、ＰＤＩ＋ＨＡＢＰｈｕの核酸配列（配列番号９２）を示す。図２１Ｃは、ＰＤＩ＋ＨＡＢＰｈｕのアミノ酸配列（配列番号９３）を示す。

図２２Ａは、ＧＩＩ．４ＶＰ１構築物を調製するために使用されるプライマーの核酸配列を示す。図２２Ｂは、ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＶＰ１（ＧＩＩ．４）の核酸配列を示す（配列番号９４）。図２２Ｃは、ＶＰ１（ＧＩＩ．４）の核酸配列（配列番号９５）を示す。図２２Ｄは、ＶＰ１（ＧＩＩ．４）のアミノ酸配列（配列番号９６）を示す。図２３Ａは、リツキシマブ構築物を調製するために使用されるプライマーの核酸配列を示す。図２３Ｂは、ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋リツキシマブＨＣの核酸配列（配列番号９７）を示す。図２３Ｃは、ＰＤＩ＋リツキシマブＨＣの核酸配列（配列番号９８）を示す。図２３Ｄは、ＰＤＩ＋リツキシマブＨＣのアミノ酸配列（配列番号９９）を示す。図２３Ｅは、ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋リツキシマブＬＣの核酸配列（配列番号１００）を示す。図２３Ｆは、ＰＤＩ＋リツキシマブＬＣの核酸配列（配列番号１０１）を示す。図２３Ｇは、ＰＤＩ＋リツキシマブＬＣのアミノ酸配列（配列番号１０２）を示す。

以下の説明は、好ましい実施形態である。

本明細書で使用される場合、「含む」、「有する」、「包含する」および「含有する」という用語、ならびにそれらの文法的変形は、包括的または制限のないものであり、追加の列挙されていない要素および／または方法工程を除外しない。本明細書で使用または方法に関連して使用される場合、「から本質的になる」という用語は、追加の要素および／または方法工程が存在し得るが、これらの追加は、列挙されている方法または使用が機能する方法に実質的に影響しないことを意味する。本明細書で使用または方法に関連して使用される場合、「からなる」という用語は、追加の要素および／または方法工程の存在を除外する。特定の要素および／または工程を含むものとして本明細書に記載される使用または方法はまた、これらの実施形態が具体的に言及されているか否かにかかわらず、特定の実施形態では、それらの要素および／または工程から本質的になり得、他の実施形態では、それらの要素および／または工程からなり得る。さらに、単数形の使用は複数形を含み、「または」は、特に明記されない限り「および／または」を意味する。本明細書で使用される「複数」という用語は、１より多く、例えば２以上、３以上、４以上などを意味する。本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、所与の値からの約±１０％の変動を指す。そのような変動は、具体的に言及されているか否かにかかわらず、本明細書で提供される所与の値に常に含まれることが理解されるべきである。本明細書で「含む」という用語と組み合わせて使用される場合の「１つの」という語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つまたは複数」の意味とも一致する。

「植物」、「植物の一部」、「植物部分」、「植物物質」、「植物バイオマス」、「植物材料」、「植物抽出物」、または「植物葉」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載される１つまたは複数の核酸の発現のための転写、翻訳、および翻訳後機構を提供することができ、ならびに発現された目的のタンパク質またはＶＬＰがそこから抽出および精製され得る、植物全体、組織、細胞、またはその任意の画分、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体もしくは固体抽出物、またはそれらの組み合わせを含み得る。植物は、例えばキャノーラ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａｓｐｐ．）、トウモロコシ、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｓｐｐ．）、（タバコ）、例えばニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・アラタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａａｌａｔａ）、シロイヌナズナ（アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ））、アルファルファ、ジャガイモ、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａｂａｔａｔｕｓ）、ニンジン、エンドウ豆、オートムギ、コメ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍｖｕｌｇａｒｅ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）を含む農作物を含み得るが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「植物部分」という用語は、葉、茎、根、花、果実、カルス組織または細胞培養植物組織、植物細胞のクラスタ、植物細胞、例えば葉、茎、根、花、果実から得られる植物細胞、植物細胞のカルスのクラスタまたは培養植物組織、葉、茎、根、花、果実から得られる植物抽出物、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、植物の任意の部分を指す。植物細胞という用語は、原形質膜によって結合されている植物の細胞を指し、細胞壁を含んでもよくまたは含まなくてもよい。植物細胞は、酵素的に消化された細胞を含み、当技術分野で周知の技術（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＤａｖｅｙＭＲｅｔａｌ．，２００５，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｄｖａｎｃｅｓ２３：１３１−１７１）を使用して得られ得るプロトプラスト（またはスフェロプラスト）を含む。カルス植物組織または培養植物組織は、当技術分野で周知の方法（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＭＫＲａｚｄａｎ２^ｎｄＥｄ．，ＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００３）を使用して生成し得る。「植物抽出物」という用語は、本明細書で使用される場合、植物、植物の一部、植物細胞、またはそれらの組み合わせを物理的に（例えば凍結した後、適切な緩衝液中で抽出することによって）、機械的に（例えば植物または植物の一部を粉砕または均質化した後、適切な緩衝液中で抽出することによって）、酵素的に（例えば細胞壁分解酵素を使用して）、化学的に（例えば１つ以上のキレート剤または緩衝液を使用して）、またはそれらの組み合わせで処理した後に得られる植物由来の生成物を指す。植物抽出物をさらに処理して、望ましくない植物成分、例えば細胞壁破片を除去し得る。植物抽出物は、植物、植物の一部または植物細胞からの１つ以上の成分、例えば植物、植物の一部、または植物細胞からのタンパク質（タンパク質複合体、タンパク質超構造体および／またはＶＬＰを含む）、核酸、脂質、炭水化物、またはそれらの組み合わせの回収を助けるために得られ得る。植物抽出物がタンパク質を含む場合、これはタンパク質抽出物と称され得る。タンパク質抽出物は、植物組織からの１つ以上のタンパク質、タンパク質複合体、タンパク質超構造体、および／またはＶＬＰを含む、粗植物抽出物、部分的に精製された植物もしくはタンパク質抽出物、または精製された生成物であり得る。所望する場合は、タンパク質抽出物または植物抽出物は、当業者に公知の技術を使用して部分的に精製されてもよく、例えば、抽出物は、塩もしくはｐＨ沈殿、遠心分離、勾配密度遠心分離、濾過、クロマトグラフィ、例えばサイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、またはそれらの組み合わせに供されてもよい。タンパク質抽出物はまた、当業者に公知の技術を使用して精製し得る。

「目的のヌクレオチド（または核酸）配列」または「目的のコード領域」とは、目的のタンパク質を生産するために植物、植物の一部、または植物細胞内で発現されるべき任意のヌクレオチド配列またはコード領域（これらの用語は互換的に使用され得る）を意味する。そのような目的のヌクレオチド配列は、天然または改変されたタンパク質、工業用酵素または改変された工業用酵素、農業用タンパク質または改変された農業用タンパク質、ヘルパータンパク質、タンパク質サプリメント、薬学的に活性なタンパク質、栄養補助食品、付加価値製品、または飼料、食品、もしくは飼料と食品の両方の使用のためのその断片をコードし得るが、これらに限定されない。

目的のタンパク質は、天然または非天然のシグナルペプチドを含み得る；非天然のシグナルペプチドは植物起源であり得る。例えば、限定と見なされるべきではないが、非天然のシグナルペプチドは、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩＳＰ；アクセッション番号Ｚ１１４９９のヌクレオチド３２〜１０３）、ジャガイモパタチン（ＰａｔＡＳＰ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ０８２１５のヌクレオチド１７３８〜１８０６に位置する）、キウイアクチニジン（Ａｃｔ）、タバコシステインプロテイナーゼ３前駆体（ＣＰ２３）、トウモロコシΔゼイン（Δゼイン）、パパイヤプロテイナーゼＩ（パパイン；Ｐａｐ）およびターレクレス（Ｔｈａｌｅｃｒｅｓｓ、シロイヌナズナ）システインプロテイナーゼＲＤ２１Ａ（ＲＤ２１）から得られ得る。天然のシグナルペプチドは、発現される目的のタンパク質のシグナルペプチドに対応し得る。

目的のヌクレオチド配列、または目的のコード領域には、薬学的に活性なタンパク質、例えば成長因子、成長調節因子、抗体、抗原、およびそれらの断片、または免疫もしくはワクチン接種に有用なそれらの誘導体などをコードするヌクレオチド配列も含まれ得る。そのようなタンパク質には、ヒト病原体であるタンパク質、ウイルスタンパク質、例えば、限定されないが、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）形成抗原、ノロウイルス由来の１つ以上のタンパク質、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、またはインターロイキン、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−２４、ＩＬ−２６およびＩＬ−２７の１つもしくは複数、サイトカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦまたはそれらの組み合わせ、インターフェロン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、血液凝固因子、例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはｔＰＡｈＧＨ、受容体、受容体アゴニスト、例えば、限定されないが、リツキシマブ、ニューロポリペプチド、インスリン、ワクチン、成長因子、例えば、限定されないが上皮成長因子、ケラチノサイト増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、成長調節因子、抗原、自己抗原、その断片、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

目的のタンパク質は、インフルエンザ赤血球凝集素を含み得る（ＨＡ；参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８、ＷＯ２０１０／００３２２５参照）。ＨＡはホモ三量体膜Ｉ型糖タンパク質であり、一般にシグナルペプチド、ＨＡ１ドメイン、およびＣ末端の膜貫通アンカー部位と小さな細胞質尾部を含むＨＡ２ドメインを含む。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は周知であり、利用可能である（例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、ＵＲＬ：ｂｉｏｈｅａｌｔｈｂａｓｅ．ｏｒｇ／ＧＳｅａｒｃｈ／ｈｏｍｅ．ｄｏ？ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ＩｎｆｌｕｅｎｚａのＢｉｏＤｅｆｅｎｓｅａｎｄＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＤａｔａｂａｓｅ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＲｅｓｅａｒｃｈＤａｔａｂａｓｅ；Ｓｑｕｉｒｅｓｅｔａｌ．，２００８，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ３６：Ｄ４９７−Ｄ５０３）、またはＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが管理するデータベース（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）を参照のこと）。

ＨＡタンパク質は、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザのものであり得るか、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８の群から選択されるＡ型インフルエンザＨＡのサブタイプである。本発明のいくつかの態様では、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７およびＨ９の群から選択されるＡ型インフルエンザに由来し得る。上記に列挙されたＨＡの断片もまた、目的のタンパク質と見なされ得る。さらに、上記に列挙されたＨＡタイプまたはサブタイプのドメインは、キメラＨＡを作製するために組み合され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００９／０７６７７８参照）。

ＨＡタンパク質を含むサブタイプの例には、Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＳｏｌｏｍｏｎＩｓｌａｎｄｓ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／ＮｅｗＹｏｒｋ／１９９５、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／ｈｅｒｒｉｎｇｇｕｌｌ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３２／２００３、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／ＭＮ／３３／００、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１／２０００、Ａ／ｎｏｒｔｈｅｒｎｐｉｎｔａｉｌ／ＴＸ／８２８１８９／０２、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／２２／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／３９／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ｃ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／６６、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ｈ７Ａ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）、Ａ／ｓｈｏｖｅｌｅｒ／Ｉｒａｎ／Ｇ５４／０３、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／Ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｇｕｒｊｅｖ／２６３／８２、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８、Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２様ウイルス（山形系統）、Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（山形系統）、またはＢ／Ｌｅｅ／４０が含まれる。

ＨＡはまた、改変またはキメラＨＡであってもよく、例えば、ＨＡの天然の膜貫通ドメインは異種膜貫通ドメインで置換されていてもよく（参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／１４８５１１）、ＨＡはキメラエクトドメインを含んでもよく（参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１２／０８３４４５）、またはＨＡはタンパク質分解ループ欠失を含んでもよい（参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／１５３６４７）。

目的のタンパク質には、米国特許仮出願第６２／４７５，６６０号（２０１７年３月２３日出願、参照により本明細書に組み込まれる）、または第６２／５９３，００６号（２０１７年１１月１１日出願、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているノロウイルスタンパク質または改変されたノロウイルスタンパク質も含まれ得る。ノロウイルスは、一本鎖のプラスセンスＲＮＡを有することを特徴とする、カリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科ノロウイルス属の非エンベロープウイルス株である。ノロウイルス株は、任意の公知のノロウイルス株を含み得るが、経時的に定期的に発生することが知られている公知のノロウイルス株の改変型も含み得る。例えば、ノロウイルス株には、ＧＩ．１、ＧＩ．２、ＧＩ．３、ＧＩ．５、ＧＩ．７、ＧＩＩ．１、ＧＩＩ．２、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４、ＧＩＩ．５、ＧＩＩ．６、ＧＩＩ．７、ＧＩＩ．１２、ＧＩＩ．１３、ＧＩＩ．１４、ＧＩＩ．１７およびＧＩＩ．２１、例えば、限定されないが、Ｈｕ／ＧＩ．１／ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ／Ｎｏｒｗａｌｋ／１９６８、Ｈｕ／ＧＩ．２／Ｌｅｕｖｅｎ／２００３／ＢＥＬ、Ｈｕ／ＧＩ．３／Ｓ２９／２００８／ＬｉｌｌａＥｄｅｔ／Ｓｗｅｄｅｎ、Ｈｕ／ＧＩ．５／Ｓｉｋｌｏｓ／Ｈｕｎ５４０７／２０１３／ＨＵＮ、Ｈｕ／ＧＩＩ．１／Ａｓｃｅｎｓｉｏｎ２０８／２０１０／ＵＳＡ、Ｈｕ／ＧＩＩ．２／ＣＧＭＨ４７／２０１１／ＴＷ、Ｈｕ／ＧＩＩ．３／Ｊｉｎｇｚｈｏｕ／２０１３４０２／ＣＨＮ、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ、ＵＳ９６／ＧＩＩ．４／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＤＥ＿ＡＹ７４１８１１、ＦＨ０２／ＧＩＩ．４／ＦａｒｍｉｎｇｔｏｎＨｉｌｌｓ／２００２／ＵＳ＿ＡＹ５０２０２３、Ｈｎｔ０４：ＧＩＩ．４／Ｈｕｎｔｅｒ−ＮＳＷ５０４Ｄ／２００４／ＡＵ＿ＤＱ０７８８１４、２００６ｂ：ＧＩＩ．４／Ｓｈｅｌｌｈａｒｂｏｕｒ−ＮＳＷ６９６Ｔ／２００６／ＡＵ＿ＥＦ６８４９１５、ＮＯ０９：ＧＩＩ．４／Ｏｒａｎｇｅ−ＮＳＷ００１Ｐ／２００８／ＡＵ＿ＧＱ８４５３６７、Ｈｕ／ＧＩＩ．５／ＡｌｂｅｒｔａＥＩ３９０／２０１３／ＣＡ、Ｈｕ／ＧＩＩ．６／Ｏｈｉｏ／４９０／２０１２／ＵＳＡ、ＧＩＩ．７／Ｍｕｓａ／２０１０／Ａｌｌ７３７７４、Ｈｕ／ＧＩＩ．１２／ＨＳ２０６／２０１０／ＵＳＡ、ＧＩＩ．１３／ＶＡ１７３／２０１０／Ｈ９ＡＷＵ４、ＧＩＩ．１４＿Ｓａｇａ＿２００８＿ＪＰＮ＿ＡＤＥ２８７０１ネイティブＶＰ１、Ｈｕ／ＧＩＩ．１７／Ｋａｗａｓａｋｉ３２３／２０１４／ＪＰ、およびＨｕ／ＧＩＩ．２１／Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ１５０／２０１１／ＵＳＡが含まれ得る。ノロウイルス株はまた、上記のノロウイルス株のいずれかと共に、ＶＰ１タンパク質、ＶＰ２タンパク質、またはＶＰ１およびＶＰ２タンパク質の両方に約３０〜１００％またはその間の任意の量のアミノ酸配列同一性を有する株を含む。

「パーセント類似性」、「配列類似性」、「パーセント同一性」、または「配列同一性」という用語は、特定の配列に言及する場合、例えばウィスコンシン大学のＧＣＧソフトウェアプログラムで説明されているように、または手動アライメントおよび目視検査によって使用される（例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．１９９５ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ参照）。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えばＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）のアルゴリズムを使用して、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）のアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４）の類似性方法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（例えばＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、実施することができる。

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９７７，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２）およびＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）にそれぞれ記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本明細書に記載されているパラメータと共に、本発明の核酸およびタンパク質のパーセント配列同一性を決定するために使用される。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用し得る。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用し得る。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照）を通じて公開されている。

本明細書で使用される「核酸セグメント」という用語は、目的のタンパク質をコードする核酸の配列を指す。核酸の配列に加えて、核酸セグメントは、核酸の配列に機能的に連結された調節領域およびターミネータを含む。調節領域は、プロモータ、およびプロモータに機能的に連結されたエンハンサエレメント（発現エンハンサ）を含み得る。

本明細書で使用される「核酸複合体」という用語は、２つまたは２つを超える核酸セグメントの組み合わせを指す。２つまたは２つを超える核酸セグメントは単一の核酸中に存在し得るため、核酸複合体は２つまたは２つを超える核酸セグメントを含み、各核酸セグメントは調節領域およびターミネータの制御下にある。あるいは、核酸複合体は２つ以上の別個の核酸を含み得、各核酸は１つまたは複数の核酸セグメントを含み、各核酸セグメントは調節領域およびターミネータの制御下にある。例えば、核酸複合体は２つの核酸セグメントを含む１つの核酸を含み得るか、核酸複合体は、各核酸が１つの核酸セグメントを含む２つの核酸を含み得るか、または核酸複合体は、各核酸が１つもしくは複数の核酸セグメントを含む２つもしくは２つを超える核酸を含み得る。

本明細書で使用される「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、外因性核酸配列を宿主細胞（例えば植物細胞）に移入し、宿主細胞における外因性核酸配列の発現を指示するための組換え核酸を指す。ベクターは、植物、植物の一部、または植物細胞に直接導入されてもよく、またはベクターは、植物発現系の一部として植物、植物の一部、または植物細胞に導入されてもよい。ベクターまたは発現ベクターは、構築物または発現構築物を含む。構築物または発現構築物は、適切なプロモータ、発現エンハンサ、または宿主細胞における目的の核酸の転写のための他の調節エレメントの制御下にあり、それらに機能的に（または作動可能に）連結された目的の核酸を含むヌクレオチド配列を含む。当業者に理解されるように、構築物または発現カセットは、植物宿主において活性な任意の配列である終結（ターミネータ）配列を含み得る。例えば、終結配列は、二分節ＲＮＡウイルス、例えばコモウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメントに由来してもよく、終結配列はＮＯＳターミネータであってもよく、ターミネータ配列は、アルファルファプラストシアニン遺伝子の３’ＵＴＲから得られてもよく、またはそれらの組み合わせであってもよい。

本開示の構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含み得る。３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる任意の他の調節シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラックの付加をもたらすことによって特徴付けられる。ポリアデニル化シグナルは一般に、標準型５’ＡＡＴＡＡＡ−３’との相同性の存在によって認識されるが、変異は珍しくない。適切な３’領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ遺伝子）などのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子およびダイズ貯蔵タンパク質遺伝子などの植物遺伝子、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子の小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ４，９６２，０２８）、プラストシアニン発現の調節に使用されるプロモータおよび／またはターミネータのポリアデニル化シグナルを含む、３’転写非翻訳領域である。

例えば、限定と見なされるべきではないが、ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ＋ＮＯＳターミネータは、目的のタンパク質をコードする核酸配列の３’末端に機能的に連結される３’ＵＴＲ配列として使用され得る。

「調節領域」、「調節エレメント」または「プロモータ」とは、典型的には、常にではないが、遺伝子のタンパク質コード領域の上流の核酸の部分を意味し、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、またはＤＮＡとＲＮＡの両方で構成され得る。調節領域が活性であり、目的のヌクレオチド配列と機能的に結合するか、または作動可能に連結されている場合、これは、目的のヌクレオチド配列の発現をもたらし得る。調節エレメントは、器官特異性を媒介する、または発生的もしくは一時的な遺伝子活性化を制御することが可能であり得る。「調節領域」には、プロモータエレメント、基本プロモータ活性を示すコアプロモータエレメント、外部刺激に応答して誘導性であるエレメント、負の調節エレメントまたは転写エンハンサなどのプロモータ活性を媒介するエレメントが含まれる。本明細書で使用される「調節領域」には、転写後に活性であるエレメント、例えば翻訳および転写エンハンサ、翻訳および転写リプレッサ、上流活性化配列、およびｍＲＮＡ不安定性決定因子などの遺伝子発現を調節する調節エレメントも含まれる。これらの後者のエレメントのいくつかは、コード領域の近位に位置し得る。

この開示の文脈において、「調節エレメント」または「調節領域」という用語は、典型的には、通常、常にではないが、転写が特定の部位で始まるために必要なＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の因子の認識を提供することによってコード領域の発現を制御する、構造遺伝子のコード配列の上流（５’側）のＤＮＡ配列を指す。しかしながら、イントロン内、または配列の３’側に位置する他のヌクレオチド配列もまた、目的のコード領域の発現の調節に寄与し得ることが理解されるべきである。特定の部位での開始を確実にするためのＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子の認識を提供する調節エレメントの例は、プロモータエレメントである。すべてではないが、ほとんどの真核生物プロモータエレメントは、転写開始部位の約２５塩基対上流に通常位置するアデノシンおよびチミジンヌクレオチド塩基対からなる保存された核酸配列である、ＴＡＴＡボックスを含む。プロモータエレメントは、転写の開始に関与する基本プロモータエレメント、ならびに遺伝子発現を改変する他の調節エレメントを含み得る。

発生的に調節される、誘導性または構成的であるものを含む、いくつかの種類の調節領域がある。発生的に調節される、またはその制御下で遺伝子の差次的発現を制御する調節領域は、特定の器官または組織の発生中の特定の時点でその器官または器官の組織内で活性化される。しかし、発生的に調節されるいくつかの調節領域は、特定の発生段階で特定の器官または組織内で選択的に活性であり得、それらはまた、発生的に調節される方法で、または植物内の他の器官もしくは組織でも基礎レベルで活性であり得る。組織特異的調節領域、例えば種子特異的調節領域の例には、ナピンプロモータ、およびクルシフェリンプロモータが含まれる（Ｒａｓｋｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１５２：５９５−５９９；Ｂｉｌｏｄｅａｕｅｔａｌ．，１９９４，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１４：１２５−１３０）。葉特異的プロモータの例には、プラストシアニンプロモータが含まれる（参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，１２５，９７８参照）。

誘導性調節領域は、誘導物質に応答して１つ以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化することができるものである。誘導物質が存在しない場合、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。典型的には、転写を活性化するための誘導性調節領域に特異的に結合するタンパク質因子は、不活性型で存在してもよく、その後誘導物質によって直接的または間接的に活性型に変換される。しかし、タンパク質因子は存在しないこともあり得る。誘導物質は、タンパク質、代謝産物、成長調整剤、除草剤もしくはフェノール化合物などの化学物質、または熱、低温、塩、もしくは毒性要素によって直接的に、もしくはウイルスなどの病原体もしくは病因物質の作用を介して間接的に課される生理学的ストレスであり得る。誘導性調節領域を含む植物細胞は、噴霧、散水、加熱、または同様の方法などによって細胞または植物に誘導物質を外部から適用することによって、誘導物質に曝露され得る。誘導性調節エレメントは、植物または非植物遺伝子のいずれかに由来し得る（例えばＧａｔｚ，Ｃ．ａｎｄＬｅｎｋ，Ｉ．Ｒ．Ｐ．，１９９８，ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ．３，３５２−３５８）。潜在的な誘導性プロモータの例には、テトラサイクリン誘導性プロモータ（Ｇａｔｚ，Ｃ．，１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，８９−１０８）、ステロイド誘導性プロモータ（Ａｏｙａｍａ，Ｔ．ａｎｄＣｈｕａ，Ｎ．Ｈ．，１９９７，ＰｌａｎｔＪ．２，３９７−４０４）およびエタノール誘導性プロモータ（Ｓａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔａｌ，１９９８，ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ１６，１２７−１３２；Ｃａｄｄｉｃｋ，Ｍ．Ｘ．，ｅｔａｌ，１９９８，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１６，１７７−１８０）、サイトカイニン誘導性ＩＢ６およびＣＫＩ１遺伝子（Ｂｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ，Ｉ．ａｎｄＫｉｅｂｅｒ，Ｊ．Ｊ．，１９９８，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１０，１００９−１０１９；Ｋａｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４，９８２−９８５）およびオーキシン誘導性エレメント、ＤＲ５（Ｕｌｍａｓｏｖ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，１９９７，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ９，１９６３−１９７１）が含まれるが、これらに限定されない。

構成的調節領域は、植物のさまざまな部分にわたって、および植物の発生全体にわたって継続的に遺伝子の発現を指示する。公知の構成的調節エレメントの例には、ＣａＭＶ３５Ｓ転写物に関連するプロモータ（ｐ３５Ｓ；参照により本明細書に組み込まれる、Ｏｄｅｌｌｅｔａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０−８１２）、ライスアクチン１（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ，１９９１，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，３：１１５５−１１６５）、アクチン２（Ａｎｅｔａｌ．，１９９６，ＰｌａｎｔＪ．，１０：１０７−１２１）、またはｔｍｓ２（Ｕ．Ｓ．５，４２８，１４７）、およびトリオースリン酸イソメラーゼ１（Ｘｕｅｔ．ａｌ．，１９９４，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０６：４５９−４６７）遺伝子、トウモロコシユビキチン１遺伝子（Ｃｏｒｎｅｊｏｅｔａｌ，１９９３，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：６３７−６４６）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ユビキチン１および６遺伝子（Ｈｏｌｔｏｒｆｅｔａｌ，１９９５，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：６３７−６４６）、タバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Ｍａｎｄｅｌｅｔａｌ，１９９５ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：９９５−１００４）；キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモータ、ｐＣＡＳ（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒｅｔａｌ．，１９９６）；リブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのプロモータ、ｐＲｂｃＳ：（Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖｅｔａｌ．，２００３）、ｐＵｂｉ（単子葉植物および双子葉植物のための）が含まれる。

本明細書で使用される「構成的」という用語は、構成的調節領域の制御下にあるヌクレオチド配列がすべての細胞型において同じレベルで発現されるが、その配列が、存在量の変動がしばしば観察されるとしても、広い範囲の細胞型で発現されることを必ずしも示すものではない。

上記の構築物または発現構築物は、ベクター（または発現ベクター）中に存在し得る。ベクターは、生物または宿主のゲノムへの発現カセットの移入および組み込みを可能にする境界配列を含み得る。構築物は、植物バイナリベクター、例えばｐＰＺＰに基づくバイナリ形質転換ベクター（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，ｅｔａｌ．１９９４）であり得る。他の例示的な構築物にはｐＢｉｎ１９が含まれる（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｄ．Ａ．，Ｌ．Ｗ．Ｈａｒｒｉｓ−Ｈａｌｌｅｒ，ｅｔａｌ．１９９５，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２７：４０５−４０９参照）。

タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、発現される遺伝子の上流に位置する「翻訳開始部位」もしくは「開始部位」または「翻訳出発部位」もしくは「出発部位」または「開始コドン」の存在を必要とする。そのような開始部位は、エンハンサ配列の一部として、または目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部として提供され得る。

「天然の」、「天然タンパク質」または「天然ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、野生型と同一の一次アミノ酸配列を有するタンパク質またはドメインを指す。天然タンパク質またはドメインは、野生型配列に１００％の配列類似性を有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。天然アミノ酸配列は、ヒトコドン（ｈＣｏｄ）最適化ヌクレオチド配列または野生型ヌクレオチド配列と比較した場合に増加したＧＣ含量を含むヌクレオチド配列によってもコードされ得るが、ただし、ｈＣｏｄヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は天然アミノ酸配列と１００％の配列同一性を示す。

「ヒトコドン最適化」または「ｈＣｏｄ」ヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列とは、ヒトヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチド配列内に一般的に見出されるコドン使用頻度に近づくオリゴヌクレオチド配列またはその断片の合成のための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択を意味する。「増加したＧＣ含量」とは、対応する天然オリゴヌクレオチド配列と比較した場合、ＧＣ含量の増加、例えばオリゴヌクレオチド配列のコード部分の長さ全体にわたって、約１〜約３０％、またはその間の任意の量の増加を含むコドン使用頻度に近づくためのオリゴヌクレオチド配列またはその断片の合成のための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択を意味する。例えば、オリゴヌクレオチド配列のコード部分の長さ全体にわたって、約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０％、またはそれらの間の任意の量。以下に記載するように、ヒトコドン最適化ヌクレオチド配列、または（野生型ヌクレオチド配列と比較した場合）増加したＧＣ含量を含むヌクレオチド配列は、非ヒト最適化（または低いＧＣ含量の）ヌクレオチド配列の発現と比較した場合、植物、植物の一部、または植物細胞内で発現の増加を示す。

本明細書で使用される「単一構築物（１つ）」または「単一構築物（複数）」という用語は、単一の核酸配列を含む核酸を指す。本明細書で使用される「二重構築物（１つ）」または「二重構築物（複数）」という用語は、２つの核酸配列を含む核酸を指す。

共発現とは、２つ以上のヌクレオチド配列の導入および発現を意味し、２つ以上のヌクレオチド配列はそれぞれ、目的のタンパク質、または植物、植物の一部または植物細胞内の目的のタンパク質の断片をコードする。２つ以上のヌクレオチド配列は、１つのベクター内の植物、植物の部分または植物細胞に導入され得、その結果、２つ以上のヌクレオチド配列のそれぞれは、別個の調節領域の制御下にある（例えば二重構築物を含む）。あるいは、２つ以上のヌクレオチド配列は、別個のベクター（例えば単一構築物を含む）内の植物、植物の部分または植物細胞に導入され得、各ベクターは、対応する核酸の発現のための適切な調節領域を含む。例えば、それぞれ別のベクター上にあり、別個のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主に導入された２つのヌクレオチド配列は、減圧浸潤の前に各Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主の懸濁液を所望の容量（例えば等しい容量、またはＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主の比率は変化させ得る）で混合することによって共発現させ得る。この方法で、複数のＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）懸濁液の共浸潤により、複数の導入遺伝子の共発現が可能になる。

本明細書に記載される目的のタンパク質をコードする核酸は、植物、植物の一部、または植物細胞における目的のタンパク質の発現を増強する配列をさらに含み得る。発現を増強する配列は本明細書に記載されており、例えば、目的のタンパク質をコードする核酸と機能的に関連した、分泌タンパク質をコードする核酸から得られる発現エンハンサエレメント（ＳＰＥＥ）または細胞質タンパク質をコードする核酸から得られる発現エンハンサエレメント（ＣＰＥＥ）の１つ以上を含み得る。分泌タンパク質の発現のために本明細書に記載の発現エンハンサを使用する非限定的な例には、目的のタンパク質を細胞外区画に標的化するシグナルペプチドもしくはシグナル配列を含む目的のタンパク質、例えば抗体（図５参照）、または原形質膜から出芽することが公知のウイルス様粒子（ＶＬＰ）、例えばインフルエンザＨＡ（例えば図３Ａおよび３Ｂ参照）が含まれる。細胞質で産生されるタンパク質の非限定的な例には、分泌ペプチドもしくはシグナル配列を含まない目的のタンパク質（例えば図２参照）、またはサイトゾル内で産生され、保持されることが公知のＶＬＰ、例えばノロウイルス（図４参照）が含まれる。

目的のタンパク質をコードする配列は、ヒトのコドン使用頻度、ＧＣ含量の増加、またはそれらの組み合わせについても最適化され得る。目的の第２のタンパク質をコードする核酸の共発現は、機能的な多量体タンパク質、例えば重鎖および軽鎖成分を含む抗体、またはタンパク質の収量の増加につながり得る。目的のタンパク質がＶＬＰの生成をもたらす場合、２つ以上のタンパク質の共発現は、目的のタンパク質を含むＶＬＰの収量の増加、密度の増加、完全性の増加、またはそれらの組み合わせをもたらし得る。収量、密度、完全性、またはそれらの組み合わせの増加は、本明細書に記載の発現エンハンサを使用して得られた収量、密度、完全性、またはそれらの組み合わせを、異種オープンリーディングフレームをコードするが発現エンハンサに機能的に連結されていない同じヌクレオチド配列、または例えば先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（配列番号１６）に機能的に連結されている場合の収量、密度、完全性、またはそれらの組み合わせと比較することによって決定され得る。

本明細書に記載の１つまたは複数の発現エンハンサと機能的に連結された調節領域を含む核酸および目的のヌクレオチド配列を含む植物発現系も提供される。植物発現系は、本明細書に記載の１つまたは複数の発現エンハンサと機能的に連結された調節領域および目的のヌクレオチド配列または核酸を含む、１つもしくは複数のベクター、１つもしくは複数の構築物、または１つもしくは複数の核酸を、植物、植物の一部または植物細胞に導入され得る他の成分と共に含み得る。例えば、植物発現系はまた、さらなるベクター、構築物、または核酸、共発現のためのベクター、構築物もしくは核酸を含むさらなるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）、形質転換の効率を改変するための１つもしくは複数の化合物、他の成分、またはそれらの組み合わせを含み得る。

さらに、本明細書に記載の発現エンハンサを含む発現エンハンサと機能的に連結されたプロモータ（調節領域）配列、および目的のヌクレオチド配列を含む核酸を説明する。核酸は、３’ＵＴＲをコードする配列、例えばコモウイルス３’ＵＴＲ、またはプラストシアニン３’ＵＴＲ、およびターミネータ配列、例えばＮＯＳターミネータをさらに含み、その結果、目的のヌクレオチド配列が３’ＵＴＲから上流に挿入される。

本明細書で言及される「発現エンハンサ（１つもしくは複数）」、「エンハンサ配列（１つもしくは複数）」または「エンハンサエレメント（１つもしくは複数）」は、目的の核酸、例えば目的の異種核酸に機能的に連結されている場合、目的の核酸の発現をもたらす。発現エンハンサはまた、それらが結合している下流の異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現を増強または増加させ得る。発現エンハンサは、エンハンサ配列の５’末端で植物において活性な調節領域と機能的に連結され得、および宿主、例えば植物、植物の一部または植物細胞内での目的のヌクレオチド配列の発現を駆動するために発現エンハンサの３’末端で目的のヌクレオチド配列と機能的に連結され得る。本明細書に記載される発現エンハンサは、ｎｂＭＴ７８（配列番号１）；ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）；ｎｂＤＪ４６（配列番号３）；ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）；ｎｂＥＮ４２（配列番号５）；ａｔＨＳＰ６９（配列番号６）；ａｔＧＲＰ６２（配列番号７）；ａｔＰＫ６５（配列番号８）；ａｔＲＰ４６（配列番号９）；ｎｂ３０Ｓ７２（配列番号１０）；ｎｂＧＴ６１（配列番号１１）；ｎｂＰＶ５５（配列番号１２）；ｎｂＰＰＩ４３（配列番号１３）；ｎｂＰＭ６４（配列番号１４）；およびｎｂＨ２Ａ８６（配列番号１５）から選択されるヌクレオチド配列に由来するか、または該ヌクレオチド配列と配列類似性を共有する配列を含む。

「機能的に連結された」とは、特定の配列が直接的または間接的に相互作用して、核酸配列の発現の媒介または調節などの意図された機能を実施することを意味する。機能的に連結された配列の相互作用は、例えば機能的に連結された配列と相互作用するタンパク質によって媒介され得る。

「５’ＵＴＲ」または「５’非翻訳領域」または「５’リーダ配列」という用語は、翻訳されないｍＲＮＡの領域を指す。５’ＵＴＲは、典型的には転写開始部位で始まり、コード領域の翻訳開始部位または開始コドン（通常はｍＲＮＡのＡＵＧ、ＤＮＡ配列のＡＴＧ）の直前で終結する。５’ＵＴＲは、ｍＲＮＡ転写物の安定性および／または翻訳を調節し得る。所望する場合、５’ＵＴＲの長さは、５’ＵＴＲの変異、例えば置換、欠失または挿入によって改変され得る。

発現エンハンサは、目的のヌクレオチドの植物発現系への挿入を容易にするために、１つ以上の「制限部位」または「制限認識部位」、「マルチクローニングサイト」、「ＭＣＳ」、「クローニングサイト」、「ポリリンカー配列」または「ポリリンカー」をさらに含み得る。制限部位は、制限酵素によって認識され、当技術分野で周知の特定の配列モチーフである。発現エンハンサは、５’ＵＴＲの下流（３’側）に位置する１つ以上の制限部位またはクローニングサイトを含み得る。ポリリンカー配列（マルチクローニングサイト）は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を５’ＵＴＲの３’末端に付加するおよび除去するのに有用な任意の核酸配列を含み得る。ポリリンカー配列は、４〜約１００個の核酸、またはその間の任意の量を含み得る。当業者に明らかであるように、任意のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、または異なる長さ（より短いまたはより長い）のＭＣＳが使用され得る。

本明細書に記載の１つまたは複数の発現エンハンサを使用して植物において目的の１つ以上のタンパク質を生産するための発現系またはベクターも提供される。本明細書に記載の発現系は、１つもしくは複数の発現エンハンサ、または１つもしくは複数の発現エンハンサと８０〜１００％もしくはその間の任意の量の配列類似性を含む配列を含有する発現カセットを含む。発現エンハンサを含む発現カセットは、発現エンハンサの５’末端に機能的に連結された植物において活性である調節領域をさらに含み得る。目的のヌクレオチド配列は、植物、植物の一部、または植物細胞内に導入された場合、植物内で目的のヌクレオチド配列の発現が達成されるように、発現カセットの３’末端に機能的に連結され得る。

植物、植物の一部、植物細胞、植物組織、植物全体、接種物、核酸、目的のタンパク質をコードする目的のヌクレオチド配列を含む構築物、本明細書に記載の１つまたは複数の発現エンハンサを含む発現カセットまたは発現系、および植物、植物の一部、または植物細胞において目的のタンパク質を発現させる方法も提供される。

本発明の構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、浸潤などを使用して、安定なまたは一過性の方法で植物細胞に導入することができる。そのような技術の概説については、例えば、ＷｅｉｓｓｂａｃｈａｎｄＷｅｉｓｓｂａｃｈ，ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３（１９８８）；ＧｅｉｅｒｓｏｎａｎｄＣｏｒｅｙ，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２ｄＥｄ．（１９８８）；およびＭｉｋｉａｎｄＩｙｅｒ，ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｏｆＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｉｎＰｌａｎｔｓ．（ＰｌａｎｔＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２ｄＥｄ．ＤＴ．Ｄｅｎｎｉｓ，ＤＨＴｕｒｐｉｎ，ＤＤＬｅｆｅｂｒｖｅ，ＤＢＬａｙｚｅｌｌ（ｅｄｓ），ＡｄｄｉｓｏｎＷｅｓｌｙ，ＬａｎｇｍａｎｓＬｔｄ．Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．５６１−５７９（１９９７））参照。他の方法には、直接ＤＮＡ取り込み、リポソームの使用、例えばプロトプラストを使用したエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたはウィスカー、および減圧浸潤が含まれる。例えば、Ｂｉｌａｎｇ，ｅｔａｌ．（Ｇｅｎｅ１００：２４７−２５０（１９９１）、Ｓｃｈｅｉｄｅｔａｌ．（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：１０４−１１２，１９９１）、Ｇｕｅｒｃｈｅｅｔａｌ．（ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ５２：１１１−１１６，１９８７）、Ｎｅｕｈａｕｓｅｅｔａｌ．（Ｔｈｅｏｒ．ＡｐｐｌＧｅｎｅｔ．７５：３０−３６，１９８７）、Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０−７３（１９８７）、Ｈｏｗｅｌｌｅｔａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ２０８：１２６５，１９８０）、Ｈｏｒｓｃｈｅｔａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１２２９−１２３１，１９８５）、ＤｅＢｌｏｃｋｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ９１：６９４−７０１，１９８９）、ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＷｅｉｓｓｂａｃｈａｎｄＷｅｉｓｓｂａｃｈ，ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，１９８８）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＳｃｈｕｌｅｒａｎｄＺｉｅｌｉｎｓｋｉ，ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，１９８９）、ＬｉｕａｎｄＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（Ｊ．ＶｉｒｏｌＭｅｔｈ，１０５：３４３−３４８，２００２）、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第６，４０３，８６５号；同第５，６２５，１３６号（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）参照。

本発明の構築物を発現するために一過性発現法を使用し得る（参照により本明細書に組み込まれる、ＬｉｕａｎｄＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，２００２，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，１０５：３４３−３４８参照）。あるいは、Ｋａｐｉｌａｅｔａｌ．１９９７（参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されている、減圧ベースの一過性発現法を使用し得る。これらの方法は、例えばアグロ接種またはアグロ浸潤の方法を含み得るが、これらに限定されず、他の一過性の方法も、上記のように使用し得る。アグロ接種またはアグロ浸潤のいずれかにより、所望の核酸を含むアグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）の混合物が、組織、例えば葉、植物の地上部分（茎、葉および花を含む）、植物の他の部分（茎、根、花）、または植物全体の細胞間隙に侵入する。表皮を横断した後、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は感染し、ｔ−ＤＮＡコピーを細胞に移入する。ｔ−ＤＮＡはエピソーム的に転写され、ｍＲＮＡが翻訳されて、感染細胞における目的のタンパク質の産生をもたらすが、核内へのｔ−ＤＮＡの通過は一過性である。

目的のヌクレオチド配列が植物に直接的または間接的に毒性である生成物をコードする場合、本発明の方法を使用することにより、所望の組織内でまたは植物発生の所望の段階で目的のヌクレオチド配列を選択的に発現させることによってそのような毒性を植物全体で低減し得る。さらに、一過性発現から生じる限られた発現期間は、植物において毒性の生成物を産生する場合の影響を低減し得る。誘導性プロモータ、組織特異的プロモータ、または細胞特異的プロモータを使用して、目的の配列の発現を選択的に指示し得る。

目的のヌクレオチド配列は、さまざまなアプローチを使用して、植物調節領域を含むエンハンサ配列に融合（機能的に連結）され得る。例えば、限定と見なされるべきではないが、目的のタンパク質をコードする目的のヌクレオチド配列は、５’ＵＴＲ配列の直後の発現エンハンサの３’末端に融合され得る。

本明細書に記載される発現エンハンサの例には、以下が含まれる：
ｎｂＭＴ７８（配列番号１）；ＡＣＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＴＴＡＧＴＧＡＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＧＴＣＴＡＴＴＡＴＣＴＣＣＣＡＡＣＡＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡ；
ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）；ＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＣＴＡＡＴＣＧＣＣＴＣＴＣＣＧＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＧＧＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡ；
ｎｂＤＪ４６（配列番号３）；ＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧ；
ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）；ＡＴＴＣＴＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＡＡＣＴＡＡＡＴＴＡＴＣＴＣＴＣＴＧＡＴＴＡＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＧＡＣ；
ｎｂＥＮ４２（配列番号５）；ＡＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＧＣＣ；
ａｔＨＳＰ６９（配列番号６）；ＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＴＴＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＧＡＣＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡ；
ａｔＧＲＰ６２（配列番号７）；ＡＴＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＡＡＧＡＡＴＡＴＡＴＣＧＡＡＡ；
ａｔＰＫ６５（配列番号８）；ＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＣＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＴＴＧＴＡＧＡＡＴＣＡＡＣＴＡＡＧＡＡＡ；
ａｔＲＰ４６（配列番号９）；ＡＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡ；
ｎｂ３０Ｓ７２（配列番号１０）；ＡＴＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＡＧＣＣＧＣＡＧＴＣＡＣＴＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＣＴＴＡＣＴＴＣＧＣＴＧＴＴＡＧＴＧＣＡＡＴＴＣＣＡＡＡＣＣ；
ｎｂＧＴ６１（配列番号１１）；ＡＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＴＡＴＡＡＴＣＴＡＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＴＴＧＡＴＣＧＡＡＡ；
ｎｂＰＶ５５（配列番号１２）；ＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＣＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡＧＴＣ；
ｎｂＰＰＩ４３（配列番号１３）；ＡＣＡＡＡＴＣＧＴＡＣＡＣＡＧＣＧＡＡＡＡＣＣＴＣＡＣＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＡＧＡＧ；
ｎｂＰＭ６４（配列番号１４）；ＡＧＡＡＡＧＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＡＡＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＧＣＡ；および
ｎｂＨ２Ａ８６（配列番号１５）；ＡＣＴＣＡＡＣＡＣＴＣＡＡＡＴＣＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＡＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＣＴＴＣＴＣＴＧＴＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＴＴＣＡＣＡＴＣＡ。
エンハンサ配列は、配列番号１〜１５のいずれか１つ、または配列番号１〜１５のいずれか１つに示す配列と１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、もしくはそれらの間の任意の量の配列同一性を示すヌクレオチド配列から選択され得、ここで、発現エンハンサは、目的の核酸に機能的に連結されている場合、目的の核酸の発現をもたらすか、または発現エンハンサに機能的に連結されていない同じ目的の核酸の発現レベル、もしくは例えば先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（配列番号１６）に機能的に連結されている場合の発現レベルと比較して、目的の核酸の発現レベルを増加させる。配列番号１〜１５に示すエンハンサ配列のそれぞれは、類似もしくは増加したエンハンサ活性をもたらすか、または発現エンハンサの別の有益な特性をもたらす発現エンハンサを生成するために、エンハンサ配列の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換を含む、当業者に公知の方法を使用して改変され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年７月１５日にオンラインで公開されたＤｉａｍｏｓｅｔ．ａｌ．，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ．２０１６，ｖｏｌ７ｐｐ．１−１５；ＤｖｉｒＳ．ｅｔ．ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ；ＬｅｐｐｅｋＫｅｔ．ａｌ．，２０１８，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１９：１５８−１７４参照）。例えば、有益な特性は、転写開始の改善、ｍＲＮＡ安定性の改善、ｍＲＮＡ翻訳の改善、またはそれらの組み合わせを含み得る。

配列番号１〜１５の上記発現エンハンサの１つまたは複数の使用は、目的の核酸の発現をもたらすか、または図２〜５を参照して示されるように目的の核酸もしくは目的のタンパク質の発現増加をもたらすことが観察された。

図２、３Ａおよび３Ｂを参照すると、発現エンハンサ、ｎｂＭＴ７８（配列番号１）；ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）；ｎｂＤＪ４６（配列番号３）；ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）；ｎｂＥＮ４２（配列番号５）；ａｔＨＳＰ６９（配列番号６）；ａｔＧＲＰ６２（配列番号７）；ａｔＰＫ６５（配列番号８）；ａｔＲＰ４６（配列番号９）；ｎｂ３０Ｓ７２（配列番号１０）；ｎｂＧＴ６１（配列番号１１）；ｎｂＰＶ５５（配列番号１２）；ｎｂＰＰＩ４３（配列番号１３）；ｎｂＰＭ６４（配列番号１４）；およびｎｂＨ２Ａ８６（配列番号１５）のそれぞれは、目的のタンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結されている場合、同じ目的のタンパク質をコードする同じ核酸配列に機能的に連結され、類似の条件下で発現された先行技術の発現エンハンサ配列ＣＭＰＶ１６０（配列番号１６；ＷＯ２０１５／１０３７０４）の活性と比較して、または指示される場合は、同じ目的のタンパク質をコードする同じ核酸配列に機能的に連結され、類似の条件下で発現された先行技術の発現エンハンサ配列ａｔＰＫ４１（Ｄｉａｍｏｓｅｔ．ａｌ．，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ．２０１６，ｖｏｌ７ｐｐ．１−１５ではＡｔＰｓａＫ３’と称される）の活性と比較して、Ｄａｓｈｅｒ（ＤａｓｈｅｒＧＦＰ；ＦＰＯＢ−２７Ｅ−２６９；ＡＴＵＭ．ｂｉｏから）；図２）、インフルエンザ赤血球凝集素Ｈ１Ａ（図３Ａ）、Ｈ１Ｍｉｃｈ／４５／１５、Ｈ３ＨＫ／４８０１／１４＋ＣｙｓＴｍ、ＨＡＢＢｒｉｓ／６０／０８、またはＨＡＢＰｈｕ／３０７３／１３（図３Ｂ）のいずれかのタンパク質の類似または増加した発現をもたらすことが観察された。

目的のタンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結された先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（配列番号１６）の活性が、先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ−ＨＴと比較して図１Ａおよび１Ｂに示されている。ＣＰＭＶＨＴエンハンサエレメントは、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ２ポリペプチドを調節する５’ＵＴＲをコードするヌクレオチド配列またはＷＯ２００９／０８７３９１；ＳａｉｎｓｂｕｒｙＦ．，ａｎｄＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆＧ．Ｐ．（２００８，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１４８：ｐｐ．１２１２−１２１８）に記載されているような改変されたＣＰＭＶ配列を指す。ＣＰＭＶ１６０発現エンハンサは、ＷＯ２０１５／１０３７０４に記載されているようにＣＰＭＶＲＮＡ２からの短縮５’ＵＴＲを含むヌクレオチド配列を指す。ＣＰＭＶ１６０およびＣＰＭＶ１６０＋発現エンハンサは、両方ともＣＭＰＶＲＮＡ２の５’ＵＴＲの最初の１６０核酸を含むが、ＣＰＭＶ１６０＋発現エンハンサは、発現エンハンサの３’末端にマルチクローニングサイトと植物コザック配列をさらに含む）。

したがって、本明細書に記載される発現エンハンサは、発現エンハンサ配列および目的のヌクレオチド配列と機能的に連結された調節領域を含む植物発現系内で使用され得る。

例えば、本発明は、植物において目的のタンパク質を生産する方法、または植物において目的のタンパク質、例えば、限定されないが、インフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、または改変ノロウイルスタンパク質の生産を増加させる方法を提供する。この方法は、目的のタンパク質、例えばインフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、または改変ノロウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された本明細書に記載の発現エンハンサを含む核酸を、植物、植物の一部、または植物細胞に導入すること、およびタンパク質を植物、植物の一部、または植物細胞において一過性または安定な方法で発現することを含む。ここで、発現の増加は、発現エンハンサに機能的に連結されたヌクレオチド配列の発現レベルを、発現エンハンサに機能的に連結されていない同じヌクレオチド配列の発現レベル、または、例えば先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（配列番号６）に機能的に連結されている場合の発現レベルと比較することによって決定され得る。あるいは、この方法は、目的のタンパク質、例えばインフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、改変ノロウイルスタンパク質、または多量体タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された本明細書に記載の発現エンハンサを含む植物、植物の一部、または植物細胞を提供すること、およびタンパク質をコードする核酸を植物、植物の一部、または植物細胞において一過性または安定な方法で発現することを含み得る。

さらに、本発明は、目的のタンパク質、例えばインフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、または改変ノロウイルスタンパク質を含む植物物質、植物抽出物、またはタンパク質抽出物を提供する。植物物質、植物抽出物、またはタンパク質抽出物を使用して、例えば対象におけるインフルエンザまたはノロウイルス感染に対する免疫を誘導し得る。あるいは、目的のタンパク質、例えばインフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、または改変ノロウイルスタンパク質を精製または部分的に精製してもよく、精製または部分的に精製された調製物を使用して、例えば対象におけるインフルエンザもしくはノロウイルス感染に対する免疫を誘導し得るか、または目的のタンパク質、例えばインフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、もしくは改変ノロウイルスタンパク質を、免疫応答を誘導するための組成物、および薬学的に許容される担体、アジュバント、ビヒクル、もしくは賦形剤内で使用し得る。

本明細書に記載される発現エンハンサは、目的の任意のタンパク質の生産のため、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生産のために使用され得る。例えば、図４を参照すると、本明細書に記載されるいくつかの発現エンハンサは、ノロウイルスＶＬＰの生産に有効であることが示されている。

したがって、本発明はまた、植物においてインフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、または改変ノロウイルスタンパク質を含むＶＬＰを生産する、または生産を増加させる方法を提供する。例えば、この方法は、インフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、または改変ノロウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された本明細書に記載の発現エンハンサを含む核酸を、一過性または安定な方法で植物、植物の一部、または植物細胞に導入すること、およびインフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、または改変ノロウイルスタンパク質を含むＶＬＰを生産するために、タンパク質を植物、植物の一部、または植物細胞において発現することを含み得る。発現の増加は、発現エンハンサに機能的に連結されたヌクレオチド配列の発現レベルを、発現エンハンサに機能的に連結されていない同じヌクレオチド配列の発現レベル、または、例えば先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（配列番号１６）に機能的に連結されている場合の発現レベルと比較することによって決定され得る。あるいは、この方法は、インフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、または改変ノロウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された本明細書に記載の発現エンハンサを含む植物、植物の一部、または植物細胞を提供すること、およびインフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、または改変ノロウイルスタンパク質を含むＶＬＰを生産するために、タンパク質をコードする核酸を発現することを含み得る。

さらに、本発明は、インフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、または改変ノロウイルスタンパク質を含むＶＬＰを含む植物物質、植物抽出物、またはタンパク質抽出物を提供する。植物物質、植物抽出物、またはタンパク質抽出物を使用して、対象におけるノロウイルス感染に対する免疫を誘導し得る。あるいは、インフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、または改変ノロウイルスタンパク質を含むＶＬＰを精製または部分的に精製してもよく、精製または部分的に精製された調製物を使用して、対象におけるノロウイルス感染に対する免疫を誘導し得るか、またはインフルエンザＨＡタンパク質、改変インフルエンザＨＡタンパク質、ノロウイルスタンパク質、もしくは改変ノロウイルスタンパク質を含むＶＬＰを、免疫応答を誘導するための組成物、および薬学的に許容される担体、アジュバント、ビヒクル、もしくは賦形剤内で使用し得る。

本明細書に記載される発現エンハンサはまた、目的の多量体タンパク質、例えば抗体の作製のために使用され得る。図５を参照して示されるように、抗体、例えばリツキシマブの軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）をコードする２つの核酸の共発現は、それぞれの核酸配列が本明細書に記載される同じまたは異なる発現エンハンサに機能的に連結されている場合、植物において発現され得る。例えば、リツキシマブのＨＣをコードし、発現エンハンサｎｂＡＴＬＫ７５に機能的に連結された第１の核酸と、リツキシマブのＬＣをコードし、同じ発現エンハンサｎｂＡＴＬＫ７５、またはｎｂＣＨＰ７９、ｎｂＭＴ７８、もしくはａｔＨＳＰ６９のいずれかの異なる発現エンハンサに機能的に連結された第２の核酸との共発現は、多量体タンパク質の発現をもたらすか、または同じＨＣおよびＬＣ配列をコードするが、第１と第２の核酸のそれぞれが先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（配列番号１６）に機能的に連結されている第１と第２の核酸の共発現と比較した場合、多量体タンパク質の発現の増加をもたらした。図５に示すように、本明細書に記載の発現エンハンサの他の組み合わせを使用して第１および第２の核酸が同時発現された場合も、同様の結果が観察された。

したがって、本発明はまた、植物において多量体タンパク質を生産するまたは生産を増加させる方法を提供する。例えば、この方法は、一過性または安定な方法で、第１のタンパク質成分をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された本明細書に記載の発現エンハンサを含む第１の核酸、および第２のタンパク質成分をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された本明細書に記載の発現エンハンサを含む第２の核酸を、植物、植物の一部、または植物細胞に導入すること、ならびに多量体タンパク質を生産するために、植物、植物の一部、または植物細胞において第１と第２の核酸を共発現させることを含み得る。発現の増加は、それぞれが発現エンハンサ（１つまたは複数）に機能的に連結された第１および第２の核酸の発現レベルを、それぞれが発現エンハンサ（１つまたは複数）に機能的に連結されていない同じ第１および第２の核酸の発現レベル、または、例えば先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（配列番号１６）に機能的に連結されている場合の発現レベルと比較することによって決定され得る。あるいは、この方法は、第１のタンパク質成分をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された本明細書に記載の発現エンハンサを含む第１の核酸、および第２のタンパク質成分をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された本明細書に記載の発現エンハンサを含む第２の核酸を含む植物、植物の一部、または植物細胞を提供すること、ならびに多量体タンパク質を生産するために第１および第２の核酸配列を共発現させることを含み得る。

さらに、本発明は、多量体タンパク質を含む植物物質、植物抽出物、もしくはタンパク質抽出物を提供するか、または多量体タンパク質は、精製もしくは部分的に精製され得る。

本明細書に記載されるように、目的のタンパク質をコードする目的のヌクレオチド配列に機能的に連結された発現エンハンサ配列を含む核酸構築物が提供される。本明細書に記載されるエンハンサ配列を含む構築物または１つもしくは複数の核酸を含む、植物発現系およびベクターも提供される。目的のタンパク質をコードする目的のヌクレオチド配列に機能的に連結されたエンハンサ配列と機能的に関連する植物調節領域を含む、植物発現系、ベクター、構築物、または核酸も提供される。エンハンサ配列は、配列番号１、１５のいずれか１つ、または配列番号１〜１５のいずれか１つに示す配列と１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、もしくはそれらの間の任意の量の配列同一性を示すヌクレオチド配列から選択され得、ここで、発現エンハンサは、目的の核酸に機能的に連結されている場合、目的の核酸の発現をもたらすか、または発現エンハンサに機能的に連結されていない同じ目的の核酸の発現レベル、もしくは例えば先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（配列番号１６）に機能的に連結されている場合の発現レベルと比較して、目的の核酸の発現レベルを増加させる。

配列番号１〜１５のいずれか１つのエンハンサ配列は、類似または増加したエンハンサ活性をもたらすか、または発現エンハンサの別の有益な特性をもたらす発現エンハンサを生成するために、エンハンサ配列の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換を含む、当業者に公知の方法を使用して改変され得る。例えば、有益な特性は、転写開始の改善、ｍＲＮＡ安定性の改善、ｍＲＮＡ翻訳の改善、またはそれらの組み合わせを含み得る。

本発明のエンハンサ配列は、宿主生物、例えば植物において目的のタンパク質を発現するために使用され得る。この場合、目的のタンパク質はまた、問題の宿主生物にとって異種であってもよく、当技術分野で公知の形質転換技術を使用して植物細胞に導入され得る。生物内の異種遺伝子は、内因性同等遺伝子、すなわち通常同じもしくは類似の機能を果たす遺伝子に置き換わり得るか、または挿入された配列は内因性遺伝子もしくは他の配列に付加され得る。

本発明はさらに、順番に、目的のヌクレオチド配列と融合した本明細書に記載の発現エンハンサ配列に機能的に連結されたプロモータまたは植物調節領域、３’ＵＴＲ配列、およびターミネータ配列を含む発現カセットを提供する。エンハンサ配列は、配列番号１〜１５のいずれか１つ、または配列番号１〜１５のいずれか１つに示す配列と１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、または９０％、またはそれらの間の任意の量の配列同一性を示すヌクレオチド配列によって定義され得る。エンハンサ配列はまた、エンハンサ配列が目的の核酸の発現をもたらすか、または、例えば発現エンハンサに機能的に連結されたヌクレオチド配列の発現レベルを、発現エンハンサに機能的に連結されていない同じヌクレオチド配列の発現レベル、もしくは例えば先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０（配列番号１６）に機能的に連結されている場合の発現レベルと比較することによって決定される、目的のヌクレオチド配列の発現レベルを増加させることを条件として、当業者に公知の技術を使用して改変され得る。

本出願に記載されている配列を表１に列挙する。

本発明を以下の実施例でさらに説明する。

例１：ポリソーム／ＣＡＧＥ分析を使用した植物５’ＵＴＲ配列の選択
ｍＲＮＡを、標準的なフェノール−クロロホルムプロトコルを使用してさまざまなストレス下で非浸潤および浸潤バイオマスまたは細胞培養物から抽出し、スクロース勾配による標準遠心分離を使用して低および高翻訳状態のｍＲＮＡを分離した。各非ポリソームおよびポリソーム画分中のｍＲＮＡを、標準的なフェノール−クロロホルム抽出プロトコルを使用して抽出した。各ポリソームおよび非ポリソーム画分中に存在する各ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの開始配列の決定を、遺伝子発現のキャップ分析（ＣＡＧＥ）法を使用して実施した。望ましくない配列タグ（リボソームＲＮＡ、葉緑体ＲＮＡおよびキャップなしタグ）を除去した後、配列決定されたタグを、遺伝子同定のために参照ゲノムデータベース、例えばシロイヌナズナ（アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ））のＴＡＩＲ（ＵＲＬ：ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／参照）またはニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のＳｏｌゲノムネットワーク（ＵＲＬ：ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｎｅｔ／参照）と比較した。各所与の遺伝子の配列決定されたタグの数を分析し、正規化した。翻訳状態を、ポリソーム画分で見出された正規化されたタグの数を各所与の遺伝子のタグの総数で除することにより、ポリソーム比（ＰＲ比）を確立することによって評価した。浸潤条件下で高翻訳状態の遺伝子ｍＲＮＡを、潜在的な５’ＵＴＲ候補を特定するために使用した。

この分析の結果、１５の候補５’ＵＴＲを特定し、さらに特徴付けた。

１．ｎｂＭＴ７８（配列番号１）：７８ｂｐの５’ＵＴＲは、メタロチオネイン様タンパク質１をコードする、遺伝子座Ｎｉｂｅｎ１０１Ｓｃｆ３８７６７ｇ００００６．１に位置する遺伝子の一部である。

２．ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）：７５ｂｐの５’ＵＴＲは、Ａｔ４ｇ３６０６０様タンパク質（塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）ＤＮＡ結合スーパーファミリータンパク質；ＴＡＩＲ：ＡＴ３Ｇ１９８６０．１）をコードする、遺伝子座Ｎｉｂｅｎ１０１Ｓｃｆ０８０１５ｇ０４００３．１に位置する遺伝子の一部である。

３．ｎｂＤＪ４６（配列番号３）：４６ｂｐの５’ＵＴＲは、ディフェンシンＪ１−２タンパク質をコードする、遺伝子座Ｎｉｂｅｎ１０１Ｓｃｆ１６２５８ｇ０２００４．１に位置する遺伝子の一部である。

４．ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）：７９ｂｐの５’ＵＴＲは、機能不明の保存された仮説上のタンパク質（トウゴマ（リシヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ））、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＥＥＦ４９１５７．１、６８アミノ酸タンパク質）をコードする、遺伝子座Ｎｉｂｅｎ１０１Ｓｃｆ０２５０９ｇ０７００５．１に位置する遺伝子の一部である。

５．ｎｂＥＮ４２（配列番号５）：４２ｂｐの５’ＵＴＲは、初期モジュリン様タンパク質２をコードする、遺伝子座Ｎｉｂｅｎ１０１Ｓｃｆ０６６３３ｇ０２００９．１に位置する遺伝子の一部である。シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）（ＡＴ３Ｇ２０５７０．１）では、タンパク質は電子担体活性および銅イオン結合膜タンパク質である可能性がある。

６．ａｔＨＳＰ６９（配列番号６）：６９ｂｐの５’ＵＴＲは、酸化ストレスとサリチル酸に応答して、植物防御における病原体からの基礎耐性の正の調節因子として機能する、線虫耐性タンパク質様ＨＳＰＲＯ２をコードするヌクレオチド配列（ＡＴ２Ｇ４００００．１＿０００６９）から得られる。

７．ａｔＧＲＰ６２（配列番号７）：６２ｂｐの５’ＵＴＲは、機能不明のグリシンリッチタンパク質をコードするヌクレオチド配列（ＡＴ５Ｇ６１６６０．１＿０００６２）から得られる。

８．ａｔＰＫ６５（配列番号８）：６５ｂｐの５’ＵＴＲは、植物光化学系Ｉ超複合体（ｐｓｉ）ファミリーの葉緑体マルチパス膜タンパク質メンバーをコードするヌクレオチド配列（ＡＴ１Ｇ３０３８０．１＿０００６５）から得られる。このタンパク質は、クロロフィル結合および光合成に関与する。

９．ａｔＲＰ４６（配列番号９）；４６ｂｐの５’ＵＴＲは、葉緑体ＡＴＲＰ１、ＰＰＤＫ調節タンパク質、ＲＰ１をコードするヌクレオチド配列（ＡＴ４Ｇ２１２１０．１＿０００４６）から得られる。

１０．ｎｂ３０Ｓ７２（配列番号１０）：７２ｂｐの５’ＵＴＲは、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１９をコードする、遺伝子座Ｎｉｂｅｎ１０１Ｓｃｆ０４０８１ｇ０２００５．１に位置する遺伝子の一部である。葉緑体に位置する小さなＳ１９タンパク質（９２アミノ酸）は、１６ＳリボソームＲＮＡに強く結合するＳ１３と複合体を形成する。

１１．ｎｂＧＴ６１（配列番号１１）：６１ｂｐの５’ＵＴＲは、グルタチオンを補因子として使用する小さなレドックス酵素のファミリーであるグルタレドキシン（ＧＲＸ）をコードする、遺伝子座Ｎｉｂｅｎ１０１Ｓｃｆ１７１６４ｇ０００２７．１に位置する遺伝子の一部である。

１２．ｎｂＰＶ５５（配列番号１２）：５５ｂｐの５’ＵＴＲは、機能不明の光化学系Ｉ反応中心サブユニットＶ葉緑体タンパク質をコードする、遺伝子座Ｎｉｂｅｎ１０１Ｓｃｆ０３７３３ｇ０３０１８．１に位置する遺伝子の一部である。

１３．ｎｂＰＰＩ４３（配列番号１３）：１４３ｂｐの５’ＵＴＲは、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼＡ（ＰＰｉ）をコードする、遺伝子座Ｎｉｂｅｎ１０１Ｓｃｆ０１８４７ｇ０３００４．１に位置する遺伝子の一部である。

１４．ｎｂＰＭ６４（配列番号１４）：６４ｂｐの５’ＵＴＲは、プロテアソーム成熟タンパク質ホモログをコードする、遺伝子座Ｎｉｂｅｎ１０１Ｓｃｆ０５６７８ｇ０２００４．１に位置する遺伝子の一部である。

１５．ｎｂＨ２Ａ８６（配列番号１５）：８６ｂｐの５’ＵＴＲは、ヒストン２Ａタンパク質をコードする、遺伝子座Ｎｉｂｅｎ１０１Ｓｃｆ００３６９ｇ０３０１８．１に位置する遺伝子の一部である。

上記で同定されたエンハンサを含む以下の構築物を以下のように調製した：

２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＭＴ７８５’ＵＴＲ／Ｄａｓｈｅｒ／ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳターミネータ（構築物番号４４６７；配列番号７５）
ｎｂＭＴ７８５’ＵＴＲに融合したＤａｓｈｅｒ蛍光タンパク質（Ａｔｕｍ、カタログ番号ＦＰＢ−２７−６０９）をコードする配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して２Ｘ３５Ｓプロモータ＋ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ発現系にクローニングした。１回目のＰＣＲでは、Ｄａｓｈｅｒ蛍光タンパク質を含む断片を、Ｄａｓｈｅｒ遺伝子配列（配列番号２０；図１６Ｂ）を鋳型として用いて、プライマーｎｂＭＴ７８＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ（配列番号１７）およびＩＦ−Ｄａｓｈｅｒ（２７−６０９）．ｒ（配列番号１８）を使用して増幅した。１回目の増幅からのＰＣＲ産物（表２のＦ１）を鋳型として用いて、ＩＦ−ｎｂＭＴ７８．ｃ（配列番号１９）およびＩＦ−Ｄａｓｈｅｒ（２７−６０９）．ｒ（配列番号１８）をプライマーとして使用してａｔＭＴ７８５’ＵＴＲ配列を付加した。最終的なＰＣＲ産物（表２のＦ２）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）を使用して２Ｘ３５Ｓプロモータ＋ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物番号１６６６（図６Ａ）をＡａｔＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線状化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリ反応に使用した。構築物番号１６６６は、２Ｘ３５Ｓプロモータ＋ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳベースの発現カセット中の目的の遺伝子の「Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのためのアクセプタプラスミドである。これは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモータおよびターミネータの下でサイレンシングのＴＢＳＶＰ１９サプレッサを共発現させるための遺伝子構築物も組み込んでいる。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリプラスミドであり、左のｔ−ＤＮＡ境界から右のｔ−ＤＮＡ境界までの配列は、配列番号２２に示されているとおりである。得られた構築物に番号４４６７を与えた（配列番号７５；配列番号図１６Ｅ）。Ｄａｓｈｅｒ蛍光タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２１に示す。構築物４４６７の表示を図６Ｂに示す。

本明細書に記載されているすべての構築物のプライマー、鋳型ならびに核酸およびタンパク質配列を表２に示す。

インフルエンザＨ３およびＨＡＢ構築物については、使用したクローニングベクターは、２Ｘ３５Ｓプロモータ＋ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳベースの発現カセットに加えて、アルファルファプラストシアニンプロモータおよびターミネータの制御下のインフルエンザＭ２イオンチャネル遺伝子を組み込んでいる。プラスミド番号４１６０（配列番号７６；図６Ｃ；１７Ｅ）をＡａｔＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応に使用した。

ノロウイルスＶＰ１構築物については、使用したクローニングベクターは、２Ｘ３５Ｓプロモータ＋ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳベースの発現カセットに加えて、ＮＯＳターミネータの後にタバコＲＢ７遺伝子からのマトリックス付着領域（ＭＡＲ）調節エレメントを組み込んでいる。プラスミド番号４１７０（配列番号７７；図６Ｄ；１８Ｄ）をＡａｔＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応に使用した。

例２：方法
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のトランスフェクション
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＧＬ１株を、Ｄ’Ａｏｕｓｔｅｔａｌ．，２００８（ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．６：９３０−４０）に記載されている方法を使用して、異なる発現ベクターを用いたエレクトロポレーションによってトランスフェクト（形質転換）した。トランスフェクトしたアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を、１０ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）および５０μｇ／ｍｌカナマイシンｐＨ５．６を添加したＬＢ培地で０．６〜１．６のＯＤ_６００まで増殖させ、１００μｌアリコートで凍結した。

植物バイオマス、接種材料およびアグロ浸潤の調製
Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物を、市販のピートモス基質を満たした苗用木箱で種子から生育させた。植物を、１６／８の光周期および２５℃日中／２０℃夜間の温度管理計画下に温室内で生育させた。播種の３週間後、個々の小植物を摘み取り、鉢に移植し、同じ環境条件下でさらに３週間、温室内で生育させた。

各発現ベクターでトランスフェクト（形質転換）したアグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）を、１０ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）および５０μｇ／ｍｌカナマイシンｐＨ５．６を添加したＬＢ培地で、０．６〜１．６のＯＤ_６００に達するまで増殖させた。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を使用前に遠心分離し、浸潤培地（１０ｍＭＭｇＣｌ_２および１０ｍＭＭＥＳｐＨ５．６）に再懸濁し、４°Ｃで一晩保存した。浸潤の日に、培養バッチを２．５培養容量に希釈し、使用前に加温した。Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の植物全体を、２０〜４０トールの減圧下で２分間、気密ステンレス鋼タンク内の細菌懸濁液中に逆さまに置いた。植物を、収穫まで６または９日間のインキュベーション期間、温室に戻した。

葉の収穫および全タンパク質抽出
インキュベーション後、植物の地上部を収穫し、−８０℃で凍結し、細かく砕いた。全可溶性タンパク質を、２容量の冷５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．０＋５００ｍＭＮａＣｌ、０．４μｇ／ｍｌメタビスルファイトおよび１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド中で凍結破砕した植物材料の各試料を均質化することによって（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）抽出した。均質化後、スラリーを４℃で１０分間、１０，０００ｇで遠心分離し、これらの清澄化した粗抽出物（上清）を分析のために保存した。

清澄化した粗抽出物の全タンパク質含有量を、ウシ血清アルブミンを参照標準として使用してＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって決定した。Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸＳｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ（商標）プレキャストゲル（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離した。クマシーブリリアントブルーでゲルを染色することによってタンパク質を視覚化した。あるいは、タンパク質をＧｅｌＤｏｃ（商標）ＥＺイメージングシステム（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で視覚化し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）にエレクトロトランスファーした。イムノブロッティングの前に、膜を、４℃で１６〜１８時間、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）中の５％スキムミルクおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０でブロックした。

粗抽出物の直接蛍光によって決定したＤａｓｈｅｒ発現

Ｄａｓｈｅｒ発現を、粗抽出物における蛍光の直接測定によって定量化した。凍結バイオマスを、５０ｍＭトリス＋１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ７．４抽出緩衝液を使用して機械的抽出によって抽出し、４℃、１００００ｇで１０分間遠心分離して、不溶性の破片を除去した。清澄化した粗抽出物をＰＢＳで１／１６、１／４８および１／１４４に希釈し、４８５ｎｍを励起フィルタとし、５１８ｎｍを発光フィルタとして使用するＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ａｓｃｅｎｔ）機器を使用して蛍光を測定した。

赤血球凝集アッセイを使用して決定したＨＡ発現（ＨＡ力価）
赤血球凝集反応アッセイは、ＮａｙａｋａｎｄＲｅｉｃｈｌ（２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１２２：９−１５）によって記載されている方法に基づいた。１００μＬのＰＢＳを含むＶ底９６ウェルマイクロタイタプレート中で試験試料（１００μＬ）の段階２倍希釈液を作製し、ウェルあたり１００μＬの希釈試料にした。１００μＬの０．２５％シチメンチョウ赤血球懸濁液（ＢｉｏＬｉｎｋＩｎｃ．，Ｓｙｒａｃｕｓｅ，ＮＹ；すべてのＢ株、Ｈ１、Ｈ５およびＨ７の場合）または０．５％モルモット赤血球懸濁液（Ｈ３の場合）を各ウェルに添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。完全な赤血球凝集を示す最も高い希釈の逆数をＨＡ活性として記録した。

ゲルデンシトメトリによって決定したリツキシマブ発現
リツキシマブ発現分析のために、１５０ｍＭＮａＣｌを含む１５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４緩衝液での機械的抽出によって葉から粗タンパク質抽出物（２ｇバイオマス／ＥＵ）を生成し、完全に構築されたＨ_２Ｌ_２型の抗体に対応するバンドのゲルデンシトメトリ定量化のために、非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥで抽出物を電気泳動した。タンパク質電気泳動をＢｉｏ−ＲａｄのＳｔａｉｎ−Ｆｒｅｅゲルで行い、画像分析とインゲル定量化のためのＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアを含むＧｅｌＤｏｃＸＲ＋システムを使用して、ゲルイメージングシステムを実施した。

ＶＬＰ形成／イオジキサノール勾配の分析
２容量の抽出緩衝液（１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２＋１５０ｍＭＮａＣｌ）を含むブレンダでの機械的抽出によって、凍結バイオマスからタンパク質を抽出した。スラリーを大きな孔のナイロンフィルタで濾過して大きな破片を除去し、４℃で５分間、５０００ｇで遠心分離した。上清を収集し、５０００ｇで３０分間（４°Ｃ）、再度遠心分離して、さらなる破片を除去した。次に上清を不連続なイオジキサノール密度勾配に充填する。分析密度勾配遠心分離を次のように行った：酢酸緩衝液中の不連続なイオジキサノール密度勾配（４５％のイオジキサノール１ｍｌ、３５％２ｍｌ、３３％２ｍｌ、３１％２ｍｌ、２９％２ｍｌおよび２５％５ｍｌ）を含む３８ｍｌチューブを調製し、ウイルス様粒子を含む２５ｍｌの抽出物で覆った。勾配を１７５０００ｇで４時間遠心分離した（４℃）。遠心分離後、１ｍｌの画分を下から上に収集し、タンパク質染色またはウエスタンブロットと組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって画分を分析した。

例３：植物でのタンパク質生産
Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉を、例２に記載されているように、目的のタンパク質の発現を可能にするために、定義された発現エンハンサに機能的に連結された目的のタンパク質をコードする発現ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて減圧浸潤し、葉を目的のタンパク質の産生について調べた。浸潤の９日後（ＤＰＩ）、葉のホモジネートから全粗タンパク質抽出物を調製し、血球凝集素力価を上記のように測定した。

図２を参照すると、Ｄａｓｈｅｒをコードする核酸配列に機能的に連結された発現エンハンサ、ｎｂＭＴ７８（配列番号１）；ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）；ｎｂＤＪ４６（配列番号３）；ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）；ｎｂＥＮ４２（配列番号５）；ａｔＨＳＰ６９（配列番号６）；ａｔＧＲＰ６２（配列番号７）；ａｔＰＫ６５（配列番号８）；ａｔＲＰ４６（配列番号９）；ｎｂ３０Ｓ７２（配列番号１０）；ｎｂＧＴ６１（配列番号１１）；ｎｂＰＶ５５（配列番号１２）；ｎｂＰＰＩ４３（配列番号１３）；ｎｂＰＭ６４（配列番号１４）；およびｎｂＨ２Ａ８６（配列番号１５）のそれぞれは、同じ目的のタンパク質をコードする同じ核酸配列に機能的に連結され、類似の条件下で発現された先行技術の発現エンハンサ配列ＣＭＰＶ１６０（ＷＯ２０１５／１０３７０４）または先行技術の発現エンハンサ配列ａｔＰＫ４１（Ｄｉａｍｏｓｅｔ．ａｌ．，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ．２０１６，ｖｏｌ７ｐｐ．１−１５ではＡｔＰｓａＫ３’と称される）の活性と比較した場合、タンパク質の発現の増加をもたらすことが観察された。

図３Ａに示されるように、インフルエンザ赤血球凝集素Ｈ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９（図３Ａ）をコードする核酸配列に機能的に連結された、発現エンハンサ、ｎｂＭＴ７８（配列番号１）；ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）；ｎｂＤＪ４６（配列番号３）；ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）；ｎｂＥＮ４２（配列番号５）；ａｔＨＳＰ６９（配列番号６）；ａｔＧＲＰ６２（配列番号７）；ａｔＰＫ６５（配列番号８）；ａｔＲＰ４６（配列番号９）；ｎｂ３０Ｓ７２（配列番号１０）；ｎｂＧＴ６１（配列番号１１）；ｎｂＰＶ５５（配列番号１２）；ｎｂＰＰＩ４３（配列番号１３）；ｎｂＰＭ６４（配列番号１４）；およびｎｂＨ２Ａ８６（配列番号１５）のそれぞれは、同じ目的のタンパク質をコードする同じ核酸配列に機能的に連結され、類似の条件下で発現された先行技術の発現エンハンサ配列ＣＭＰＶ１６０（ＷＯ２０１５／１０３７０４）または先行技術の発現エンハンサ配列ａｔＰＫ４１（Ｄｉａｍｏｓｅｔ．ａｌ．，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ．２０１６，ｖｏｌ７ｐｐ．１−１５ではＡｔＰｓａＫ３’と称される）の活性と比較した場合、類似のまたはわずかに増加したタンパク質発現をもたらすことが観察された。

図３Ｂを参照すると、改変Ｈ１Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／１５、改変Ｈ３ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８０１／１４、および改変ＨＡＢ／ＰｈｕｋｅｔＢｒｉｓ／６０／０８、または改変ＨＡＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／１３をコードする核酸配列に機能的に連結された、発現エンハンサ、ｎｂＭＴ７８（配列番号１）、ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）、ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）、ａｔＨＳＰ６９（配列番号６）のそれぞれは、同じ目的のタンパク質をコードする同じ核酸配列に機能的に連結され、類似の条件下で発現された先行技術の発現エンハンサ配列ＣＭＰＶ１６０（ＷＯ２０１５／１０３７０４）の活性と比較した場合、類似のまたはわずかに増加したタンパク質発現をもたらすことが観察された。

これらの結果は、本明細書に記載の発現エンハンサ配列が、植物、植物の一部、または植物細胞において、発現エンハンサに機能的に連結された目的のタンパク質の発現のために使用され得ることを示す。

例４：植物におけるノロウイルスＶＰ１タンパク質およびＶＬＰ生産

Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉を、例２に記載されるように、ＧＩＩ．４遺伝子型からのノロウイルスＶＰ１をコードする発現ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて減圧浸潤し、葉をＶＬＰ産生について調べた。浸潤の９日後（ＤＰＩ）、全粗タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシーで染色するか（ＶＰ１産生）、または上記の例２に記載されているように不連続なイオジキサノール密度勾配を使用して分離した（ＶＬＰ産生）。密度勾配からの画分を、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して調べた。ノロウイルスＶＰ１タンパク質は、約５５〜６０ｋＤａのバンドに現れる。密度勾配の画分内でのＶＰ１タンパク質の出現は、密度勾配遠心分離中にＶＬＰが平衡化する画分（１つまたは複数）を示す。密度勾配遠心分離後のピーク画分から得られたＶＬＰの収量も測定した。

改変ノロウイルスＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２ＶＰ１をコードする核酸配列に機能的に連結された、発現エンハンサ、ｎｂＭＴ７８（配列番号１）、ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）、ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）、およびａｔＨＳＰ６９（配列番号６）のそれぞれは、ノロウイルスタンパク質の発現をもたらすことが観察された。さらに、上記の発現エンハンサを使用したノロウイルスＧＩＩ．４ＶＰ１ＶＬＰの収量は、先行技術のＣＰＭＶ１６０発現エンハンサ（ＷＯ２０１５／１０３７０４）、または先行技術の発現エンハンサｎｂＰＫ７４（Ｄｉａｍｏｓｅｔ．ａｌ．，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ．２０１６，ｖｏｌ７ｐｐ．１−１５ではＮｂＰｓａＫ２３’と称される）を使用して得られたものと同様であった。これらの結果は、本明細書に記載の発現エンハンサがウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生産に使用され得ることを示す。

例５：植物における多量体タンパク質の生産
本明細書に記載される発現エンハンサはまた、目的の多量体タンパク質、例えば抗体の作製のために使用され得る。Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉を、例２に記載されているように、目的のタンパク質の発現を可能にするために、定義された発現エンハンサに機能的に連結された目的のタンパク質をコードする発現ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて減圧浸潤し、葉を目的のタンパク質の産生について調べた。浸潤の９日後（ＤＰＩ）、葉のホモジネートから全粗タンパク質抽出物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、上記のように、完全なＩｇＧのゲルデンシトメトリによって発現レベルを決定した。

図５を参照して示されるように、２つの核酸、すなわち次の発現エンハンサ、ｎｂＭＴ７８（配列番号１）、ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）、ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）、およびａｔＨＳＰ６９（配列番号６）の１つに機能的に連結されたリツキシマブの軽鎖（ＬＣ）をコードする第１の核酸と、次の発現エンハンサ、ｎｂＭＴ７８（配列番号１）、ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）、ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）、およびａｔＨＳＰ６９（配列番号６）の１つに機能的に連結されたリツキシマブの重鎖（ＨＣ）をコードする第２の核酸との共発現は、第１と第２の核酸のそれぞれが先行技術の発現エンハンサＣＰＭＶ１６０に機能的に連結された、同じＨＣおよびＬＣリツキシマブ配列をコードする第１と第２の核酸の共発現と比較した場合、同じかまたはわずかに増加した、植物における多量体タンパク質の収量をもたらした。

これらの結果は、本明細書に記載の発現エンハンサが、抗体などの多量体タンパク質を生産するために使用され得ること、および本明細書に記載の同じまたは異なる発現エンハンサが、多量体タンパク質の成分をコードするために使用される核酸配列のそれぞれに機能的に連結され得ることを示す。

すべての引用は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明を１つ以上の実施形態に関して説明してきた。しかしながら、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱することなく多くの変更および修正を行い得ることは、当業者には明らかであろう。

配列表１＜２２３＞発現エンハンサｎｂＭＴ７８
配列表２＜２２３＞発現エンハンサｎｂＡＴＬ７５
配列表３〜４＜２２３＞発現エンハンサ
配列表５＜２２３＞発現エンハンサｎｂＥＮ４２
配列表６＜２２３＞発現エンハンサａｔＨＳＰ６９
配列表７＜２２３＞発現エンハンサａｔＧＲＰ６２
配列表８＜２２３＞発現エンハンサａｔＰＫ６５
配列表９＜２２３＞発現エンハンサａｔＲＰ４６
配列表１０＜２２３＞発現エンハンサｎｂ３０Ｓ７２
配列表１１＜２２３＞発現エンハンサｎｂＧＴ６１
配列表１２＜２２３＞発現エンハンサｎｂＰＶ５５
配列表１３＜２２３＞発現エンハンサｎｂＰＰＩ４３
配列表１４＜２２３＞発現エンハンサｎｂＰＭ６４
配列表１５＜２２３＞発現エンハンサｎｂＨ２Ａ８６
配列表１６＜２２３＞ＣＰＭＶ１６０
配列表１７＜２２３＞プライマーｎｂＭＴ７８＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表１８＜２２３＞プライマーＩＦ−Ｄａｓｈｅｒ（２７−６０９）．ｒ
配列表１９＜２２３＞プライマーＩＦ−ｎｂＭＴ７８．ｃ
配列表２０＜２２３＞プライマーＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−Ｄａｓｈｅｒの核酸配列
配列表２１＜２２３＞Ｄａｓｈｅｒプライマーのアミノ酸配列
配列表２２＜２２３＞Ｔ−ＤＮＡの左境界から右境界までのクローニングベクター（Ｄａｓｈｅｒ用）１６６６
配列表２３＜２２３＞プライマーＩＦ−（２Ｘ３５Ｓ＋Ｃ）＿ＣＰＭＶ１６０．ｃ
配列表２４＜２２３＞プライマーｎｂＧＴ６１＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表２５＜２２３＞プライマーＩＦ−ｎｂＧＴ６１．ｃ
配列表２６＜２２３＞プライマーｎｂＡＴＬ７５＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表２７＜２２３＞プライマーＩＦ−ｎｂＡＴＬ７５．ｃ
配列表２８＜２２３＞プライマーｎｂＤＪ４６＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表２９＜２２３＞プライマーＩＦ−ｎｂＤＪ４６．ｃ
配列表３０＜２２３＞プライマーｎｂＣＨＰ７９＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表３１＜２２３＞プライマーＩＦ−ｎｂＣＨＰ７９．ｃ
配列表３２＜２２３＞プライマーｎｂＥＮ４２＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表３３＜２２３＞プライマーＩＦ−ｎｂＥＮ４２．ｃ
配列表３４＜２２３＞プライマーｎｂ３０Ｓ７２＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表３５＜２２３＞プライマーＩＦ−ｎｂ３０Ｓ７２．ｃ
配列表３６＜２２３＞プライマーｎｂＰＶ５５＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表３７＜２２３＞プライマーＩＦ−ｎｂＰＶ５５．ｃ
配列表３８＜２２３＞プライマーｎｂＰＰＩ４３＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表３９＜２２３＞プライマーＩＦ−ｎｂＰＰＩ４３．ｃ
配列表４０＜２２３＞プライマーｎｂＰＭ６４＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表４１＜２２３＞プライマーＩＦ−ｎｂＰＭ６４．ｃ
配列表４２＜２２３＞プライマーｎｂＨ２Ａ８６＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表４３＜２２３＞プライマーＩＦ−ｎｂＨ２Ａ８６．ｃ
配列表４４＜２２３＞プライマーａｔＨＳＰ６９＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表４５＜２２３＞プライマーＩＦ−ａｔＨＳＰ６９．ｃ
配列表４６＜２２３＞プライマーａｔＧＲＰ６２＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表４７＜２２３＞プライマーＩＦ−ａｔＧＲＰ６２．ｃ
配列表４８＜２２３＞プライマーａｔＰＫ６５＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表４９＜２２３＞プライマーＩＦ−ａｔＰＫ６５．ｃ
配列表５０＜２２３＞プライマーＩＦ−ａｔＲＰ４６＿Ｄａｓｈｅｒ．ｃ
配列表５１＜２２３＞プライマーＩＦ−Ｈ１ｃＴＭＣＴ．ｓ１−４ｒ
配列表５２＜２２３＞プライマーｎｂＧＴ６１＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表５３＜２２３＞プライマーｎｂＡＴＬ７５＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表５４＜２２３＞プライマーｎｂＤＪ４６＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表５５＜２２３＞プライマーｎｂＣＨＰ７９＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表５６＜２２３＞プライマーｎｂＥＮ４２＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表５７＜２２３＞プライマーｎｂ３０Ｓ７２＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表５８＜２２３＞プライマーｎｂＭＴ７８＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表５９＜２２３＞プライマーｎｂＰＶ５５＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表６０＜２２３＞プライマーｎｂＰＰＩ４３＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表６１＜２２３＞プライマーｎｂＰＭ６４＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表６２＜２２３＞プライマーｎｂＨ２Ａ８６＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表６３＜２２３＞プライマーａｔＨＳＰ６９＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表６４＜２２３＞プライマーａｔＧＲＰ６２＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表６５＜２２３＞ａｔＰＫ６５＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表６６＜２２３＞プライマーＩＦ−ａｔＲＰ４６＿ＳｐＰＤＩ．ｃ
配列表６７＜２２３＞プライマーＩＦ−Ｈ３＿Ｓｗｉ＿１３．ｒ
配列表６８＜２２３＞プライマーＩＦ−ＧＩＩ４Ｓｙｄ１２ＶＰ１．ｒ
配列表６９＜２２３＞プライマーｎｂＡＴＬ７５＋ＧＩＩ４Ｓｙｄ１２．ｃ
配列表７０＜２２３＞プライマーｎｂＣＨＰ７９＋ＧＩＩ４Ｓｙｄ１２．ｃ
配列表７１＜２２３＞プライマーｎｂＭＴ７８＋ＧＩＩ４Ｓｙｄ１２．ｃ
配列表７２＜２２３＞プライマーａｔＨＳＰ６９＋ＧＩＩ４Ｓｙｄ１２．ｃ
配列表７３＜２２３＞プライマーＩＦ−ＨＣ（Ｒｉｔｕｘ）．ｓ１−６ｒ
配列表７４＜２２３＞ＩＦ−ＬＣ（Ｒｉｔｕｘ）．ｓ１−６ｒ
配列表７５＜２２３＞２Ｘ３５ＳプロモータからＮＯＳターミネータまでの構築物４４６７（Ｄａｓｈｅｒ）
配列表７６＜２２３＞Ｔ−ＤＮＡの左境界から右境界までのクローニングベクター（Ｈ３およびＨＡＢ用）４１６０
配列表７７＜２２３＞Ｔ−ＤＮＡの左境界から右境界までのクローニングベクター（ノロウイルスＶＰ１用）４１７０
配列表７８＜２２３＞Ｄａｓｈｅｒプライマーの核酸配列
配列表７９＜２２３＞プライマーＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋Ｈ１Ｃａｌの核酸配列
配列表８０＜２２３＞ＰＤＩ＋Ｈ１Ｃａｌの核酸配列
配列表８１＜２２３＞ＰＤＩ＋Ｈ１Ｃａｌのアミノ酸配列
配列表８２＜２２３＞ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋Ｈ１Ｍｉｃｈの核酸配列
配列表８３＜２２３＞ＰＤＩ＋Ｈ１Ｍｉｃｈの核酸配列
配列表８４＜２２３＞ＰＤＩ＋Ｈ１Ｍｉｃｈのアミノ酸配列
配列表８５＜２２３＞ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋Ｈ３ＨＫの核酸配列
配列表８６＜２２３＞ＰＤＩ＋Ｈ３ＨＫの核酸配列
配列表８７＜２２３＞ＰＤＩ＋Ｈ３ＨＫのアミノ酸配列
配列表８８＜２２３＞ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋ＨＡＢＢｒｉの核酸配列
配列表８９＜２２３＞ＰＤＩ＋ＨＡＢＢｒｉの核酸配列
配列表９０＜２２３＞ＰＤＩ＋ＨＡＢＢｒｉのアミノ酸配列
配列表９１＜２２３＞ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋ＨＡＢＰｈｕの核酸配列
配列表９２＜２２３＞ＰＤＩ＋ＨＡＢＰｈｕの核酸配列
配列表９３＜２２３＞ＰＤＩ＋ＨＡＢＰｈｕのアミノ酸配列
配列表９４＜２２３＞プライマーＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＶＰ１（ＧＩＩ．４）の核酸配列
配列表９５＜２２３＞ＶＰ１（ＧＩＩ．４）の核酸配列
配列表９６＜２２３＞ＶＰ１（ＧＩＩ．４）のアミノ酸配列
配列表９７＜２２３＞ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋リツキシマブＨＣの核酸配列
配列表９８＜２２３＞ＰＤＩ＋リツキシマブＨＣの核酸配列
配列表９９＜２２３＞プライマーＰＤＩ＋リツキシマブＨＣのアミノ酸配列
配列表１００＜２２３＞ＣＰＭＶ１６０５’ＵＴＲ−ＰＤＩ＋リツキシマブＬＣの核酸配列
配列表１０１＜２２３＞ＰＤＩ＋リツキシマブＬＣの核酸配列
配列表１０２＜２２３＞ＰＤＩ＋リツキシマブＬＣのアミノ酸配列

Claims

植物、植物の一部または植物細胞において活性な単離された発現エンハンサであって、
ｎｂＭＴ７８（配列番号１）；
ｎｂＡＴＬ７５（配列番号２）；
ｎｂＤＪ４６（配列番号３）；
ｎｂＣＨＰ７９（配列番号４）；
ｎｂＥＮ４２（配列番号５）；
ａｔＨＳＰ６９（配列番号６）；
ａｔＧＲＰ６２（配列番号７）；
ａｔＰＫ６５（配列番号８）；
ａｔＲＰ４６（配列番号９）；
ｎｂ３０Ｓ７２（配列番号１０）；
ｎｂＧＴ６１（配列番号１１）；
ｎｂＰＶ５５（配列番号１２）；
ｎｂＰＰＩ４３（配列番号１３）；
ｎｂＰＭ６４（配列番号１４）；
ｎｂＨ２Ａ８６（配列番号１５）、および
配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に９０〜１００％の配列同一性を有する核酸
からなる群より選択され、
目的の核酸に機能的に連結されている場合、目的の核酸の発現をもたらす、上記単離された発現エンハンサ。
目的のタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列と機能的に連結された、請求項１に記載の単離された発現エンハンサを含む核酸配列。
異種ヌクレオチド配列がウイルスタンパク質または抗体をコードする、請求項２に記載の核酸配列。
ウイルスタンパク質がインフルエンザタンパク質またはノロウイルスタンパク質である、請求項３に記載の核酸。
インフルエンザタンパク質が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、およびインフルエンザＢ型赤血球凝集素の群から選択される赤血球凝集素タンパク質である、請求項４に記載の核酸。
ノロウイルスタンパク質が、ＧＩ．１、ＧＩ．２、ＧＩ．３、ＧＩ．５、ＧＩ．７、ＧＩＩ．１、ＧＩＩ．２、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４、ＧＩＩ．５、ＧＩＩ．６、ＧＩＩ．７、ＧＩＩ．１２、ＧＩＩ．１３、ＧＩＩ．１４、ＧＩＩ．１７およびＧＩＩ．２１の群から選択されるＶＰ１、ＶＰ２、またはそれらの組み合わせである、請求項４に記載の核酸。
請求項２に記載の核酸配列の１つまたは複数を含む植物発現系。
請求項３に記載の核酸配列の１つまたは複数を含む植物発現系。
請求項４に記載の核酸配列の１つまたは複数を含む植物発現系。
請求項５に記載の核酸配列の１つまたは複数を含む植物発現系。
請求項６に記載の核酸配列の１つまたは複数を含む植物発現系。
コモウイルス３’ＵＴＲをさらに含む、請求項７に記載の植物発現系。
植物、植物の一部、または植物細胞において目的のタンパク質を生産する方法であって、
植物、植物の一部、または植物細胞に、安定なまたは一過性の方法で、核酸配列の１つまたは複数を含む請求項８に記載のベクターを導入すること、および、
目的のタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列のそれぞれの発現を可能にする条件下で植物または植物の一部をインキュベートすること
を含む上記方法。
目的のタンパク質がウイルスタンパク質である、請求項１３に記載の方法。
ウイルスタンパク質がインフルエンザタンパク質またはノロウイルスタンパク質である、請求項１４に記載の方法。
インフルエンザタンパク質が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、およびインフルエンザＢ型赤血球凝集素の群から選択される赤血球凝集素タンパク質である、請求項１５に記載の方法。
ノロウイルスタンパク質が、ＧＩ．１、ＧＩ．２、ＧＩ．３、ＧＩ．５、ＧＩ．７、ＧＩＩ．１、ＧＩＩ．２、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４、ＧＩＩ．５、ＧＩＩ．６、ＧＩＩ．７、ＧＩＩ．１２、ＧＩＩ．１３、ＧＩＩ．１４、ＧＩＩ．１７およびＧＩＩ．２１の群から選択されるＶＰ１、ＶＰ２、またはそれらの組み合わせである、請求項１５に記載の方法。
目的のタンパク質が多量体タンパク質であり、および導入工程が、それぞれが多量体タンパク質の成分をコードする２つまたは２つを超える核酸配列を共発現させることを含む、請求項１３に記載の方法。
請求項８に記載のベクターで一過性に形質転換または安定に形質転換された植物、植物の一部、または植物細胞。