JP2021514198A - 単離された抗体またはその抗原結合断片、および腫瘍治療におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2017年12月29日に出願された、名称が「単離された抗体またはその抗原結合断片、および腫瘍治療におけるその使用」であり、出願番号が2017114761603である中国発明特許出願の優先権を主張する。
本発明は自主的に開発したマウス由来抗OX40抗体を改造することにより、ヒト−マウスキメラ抗OX40モノクローナル抗体を開発し、本発明の抗体は細胞表面OX40タンパク質と結合し、かつその下流のシグナル伝達経路を活性化し、T細胞の機能を活性化して、腫瘍または慢性ウイルス感染症の治療に可能性を提供する。
本発明における「抗体」なる用語は、特定の抗原に結合し得る任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体、または二重特異性(二価)抗体を含む。1つの天然の無傷抗体は、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む。各重鎖は一つの可変領域と第1、第2、第3の定常領域からなり、各軽鎖は一つの可変領域と一つの定常領域からなる。哺乳動物の重鎖はα、δ、ε、γおよびμに分けられ、哺乳動物の軽鎖はλまたはκに分けられる。抗体が「Y」型であり、Y型構造のネックは2つの重鎖の第2および第3の定常領域からなり、これはジスルフィド結合によって結合される。「Y」型構造の各アームは1つの軽鎖の可変領域および定常領域と結合された1つの重鎖の可変領域および第1の定常領域を含む。軽鎖と重鎖の可変領域は抗原の結合を決定する。各鎖の可変領域は相補性決定領域(CDR)と呼ばれる3つの超可変領域を含む。軽鎖(L)のCDRはLCDR1、LCDR2、LCDR3を含み、重鎖(H)のCDRはHCDR1、HCDR2、HCDR3を含む。本発明に開示される抗体および抗原結合断片のCDR境界はKabat、ChothiaまたはAl−Lazikani命名法によって命名または認識することができる。(AI−Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,273(4):927(1997);Chothia,C.等,J.Mol.Biol.,186(3):651−63(1985);Chothia,C.and Lesk、A.M.,J.Mol.Biol.,196:901(1987);Chothia,C.等,Nature,342(6252):877−83(1989);Kabat,E.A.等,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。ここで、3つのCDRは、CDRよりも高度に保存され、ステント支持超可変リングを形成するフレームワーク領域(FR)と呼ばれる側部連続部によって分離されている。重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合とは無関係であるが、様々なエフェクター機能を有する。抗体は重鎖定常領域のアミノ酸配列によっていくつかのクラスに分類することができる。抗体は、α、δ、ε、γおよびμ重鎖を含むか否かに応じて、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMの5つの主要な分類または異性体にそれぞれ分けることができる。いくつかの主要な抗体分類はまた、IgG1(γ1重鎖)、IgG2(γ2重鎖)、IgG3(γ3重鎖)、IgG4(γ4重鎖)、IgA1(α1重鎖)またはIgA2(α2重鎖)などのサブクラスに分けることができる。
特定の実施形態では、本願は、例示的なモノクローナル抗体MT01−L1、MT01−L1(M1)、MT01−L1(M2)、MT01−L1(M1/M2)、MT01−L1(G2)、MT01−L2およびMT01−L2(G2)、MT01−C1およびMT01−C1(G2)を提供する。そのCDR配列を表1に示し、重鎖または軽鎖相補性決定領域配列を以下に示す。
当該技術分野で公知の遺伝工学技術を用いて、表1のアミノ酸配列を対応するDNAコード配列に変換することができる。遺伝子コードの縮退性のため、変換されたDNA配列は完全に一致し得るが、コードされたタンパク質配列は不変のままである。
本願は、前記抗OX40抗体およびその抗原結合断片を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、前記キットは、生物学的試料中のOX40の存在またはレベルを検出するために使用される。前記生物学的試料は、細胞または組織を含むことができる。
本願はさらに、前記抗OX40抗体およびその抗原結合断片を含む医薬組成物および1つまたは複数の薬学的に許容される担体を提供する。
本願はさらに、前記抗OX40抗体またはその抗原結合断片を使用する方法を提供する。
本願発明者らは、マウスを免疫し、ハイブリドーマ細胞融合を行うために、OX40を過剰発現するCHO細胞株を構築した。抗原抗体結合実験と細胞機能スクリーニングにより、強いELISA結合活性とOX40活性化機能を有する一連のマウス由来抗体が得られた。配列決定により、各抗体の可変領域VHおよびVLの配列が得られ、それに基づいてヒト−マウスキメラ抗体を設計、発現し、前記重鎖相補性決定領域は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、およびSEQ ID NO:11からなる群から選択される1つまたは複数の配列からなる。前記軽鎖相補性決定領域は、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、およびSEQ ID NO:14からなる群から選択される1つまたは複数の配列からなる。
a.重鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、およびSEQ ID NO:3を含み、軽鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:6を含むか、
b.重鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、およびSEQ ID NO: 3を含み、軽鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:6を含むか、
c.重鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、およびSEQ ID NO:3を含み、軽鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:8を含むか、
d.重鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、およびSEQ ID NO:3を含み、軽鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:8を含むか、あるいは、
重鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、およびSEQ ID NO:11を含み、軽鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、およびSEQ ID NO:14を含む。
融合タンパク質をコードする重鎖および軽鎖のcDNA配列を、哺乳動物細胞発現ベクターpcDNA3.4にそれぞれクローニングした。重鎖発現プラスミドと軽鎖発現プラスミドを2:1のモル比でLipofectamine2000トランスフェクション試薬(Invitrogen)を用いてHEK293細胞にトランスフェクションし、37℃、5%二酸化炭素条件下で7日間培養した。培養液上清を採取し、上清中の抗体をProteinAアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製した抗体をPBS溶液で透析し、凍結乾燥して濃縮した後、−20℃で保存した。
濃度1μg/mLのタンパク質溶液を、96ウェル高親和性プレートで100μL/wellでコーティングし、4℃で一晩振盪した。翌日、PBST 300μL(Tween20:0.5%。)で3回洗浄した後、100μL/wellの5%BSA/PBSで2時間ブロッキングし、室温で振盪した。PBST 300μLで3回洗浄した。試料の勾配希釈溶液をPBSで調製した。96ウェルプレートを100μL/wellで加え、室温で1時間振盪した。PBST 300μLで3回洗浄した。二次抗体goat anti−human IgG HRP溶液を調製し、96ウェルプレートを100μL/wellで加え、室温で1時間振盪した。PBST 300μLで4回洗浄した。100μL/well TMBを加え、20min発色させた。100μL/well 0.6N H2SO4を加えて発色を停止し、OD450nmを検出した。
OX40抗体勾配をPBSで設定し、最終濃度の10×作動液を調製した。CHO−hOX40細胞を収集し、PBSを1回洗浄した後にカウントし、2*10^6/ml細胞懸濁液に希釈した。それぞれ10μlのOX40抗体作動液を100μlの細胞懸濁液に添加し、4℃で30min遮光インキュベートした。PBSで2回洗浄した後、二次抗体を添加し、4℃で30min遮光インキュベートし、PBSで1回洗浄した後、400μlのFACS bufferで懸濁し、機上検出した。図2に示すように、その結果、MT01−L1およびMT01−L2はヒトOX40と結合しており、そのEC50がそれぞれ1.22μg/mLおよび2.42μg/mLであることが示された。
本願発明者らは、OX40活性化抗体の機能を検出する細胞実験系を構築した。具体的には、本願発明者らは、Jurkat−OX40−NFκB−luciferase reporter安定形質転換細胞株を構築し、OX40活性化抗体を、当該安定形質転換細胞株およびFcRを過剰発現したHEK293細胞と混合すると、OX40抗体は、NFκB−luciferaseレポーター遺伝子の発現を活性化することができた。
OX40LをPBSで希釈し、最終濃度の10×作動液を調製し、PBSでOX40を配置して抗体勾配を精製し、最終濃度の2×作動液を調製し、氷上で操作した。Jurkat−NFkB−luc−OX40細胞を収集し、遠心分離後、培地に再懸濁し、細胞懸濁液とした。384ウェルプレートに、OX40Ab、細胞懸濁液およびOX40Lを加えた。37℃で、5%CO2インキュベーター中で5時間インキュベートした後、One−Glo(Promega)試薬を添加し、均一に混合した後、Pherastarで蛍光シグナルを検出した。図5で述べたように、結果は、OX40Lで誘導したJurkat細胞NFkBシグナル伝達経路活性化に対するMT01−L1およびMT01−L2の抑制IC50がそれぞれ0.686μg/mLおよび1.59μg/mLであることを示した。
CHO−OX40−lucを96ウェルプレーンプレートに敷き、一晩培養した。翌日、OX40Ab勾配希釈液を1640培地で調製し、96ウェルプレーンプレートに添加した。ヒトPBMCを加えてそれと共に48hインキュベートした後、遠心分離により上清を採取し、Cyto−Tox Gloキットで検出した。図6に示すように、結果は、キメラ抗体MT01−L1およびMT01−L2の両方が、1μg/mLを超える濃度で有意なADCC作用を有することを示した。
健常ボランティアの血液からCD4+細胞を単離し、PHA/IL−2を含有する1640完全培地で2日間培養して使用に備える。OKT3(0.1μg/ウェル)および勾配希釈後のOX40抗体または対照IgGを高親和性96ウェル丸底プレートにコーティングした。翌日、ウェルプレートをPBSで2回洗浄し、前処理したCD4+細胞を1ウェルあたり50000で抗体を予めコーティングした96ウェルプレートに加え、7日間培養を続けた後、CCK8キットで細胞増殖状況を検出した。図7に示すように、OKT3抗体が存在する場合、OX40抗体は、用量依存的にCD4 Th細胞の増殖を促進することが実験結果から示された。実験では最高濃度1500ng/mLのOX40抗体のみを加えた場合のCD4+細胞の生存率を同時に測定し、これを基にデータを標準化処理した。
マウス結腸癌細胞を、OX40ヒト化マウス(OX40細胞外部分をヒトOX40細胞外部分配列に置換した)の皮下に、106細胞/匹の量で接種した。腫瘍が約100mm3に成長した後、OX40抗体またはIgG1対照(10mg/kg)を3日に1回、合計4回静脈内投与した。図8(a)および図8(b)に示すように、MT01−L1は、投与開始13日間後に、対照群と比較して極めて有意な薬効を示した。同じ投与方法では、MT01−L2の薬効は統計学的有意差を達成しなかったが、明らかな薬効傾向を示した。
キメラ抗体に対してCDR graftingおよびアミノ酸復帰突然変異を行うことにより、ヒト化抗体MT01−C1およびMT01−C1(G2)を得た。
マウスPK実験では、C56BL6マウス、雌、6匹/群に各抗体を5mg/kgの用量で静脈内注射した。投与後1h、2h、6h、24h、48h、72h、96h、192h、312h、各時点で100μLの血液試料を1群あたり3匹のマウスから採取し、4度で2〜3h静置した後、5000rpmで10min遠心分離し、血清を採取し、−80℃で保存し、ELISA検出に用いた。
Claims (23)
- SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、およびSEQ ID NO:11からなる群から選択される1つまたは複数の配列からなる重鎖相補性決定領域と、軽鎖相補性決定領域とを含むことを特徴とする単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 前記重鎖相補性決定領域が、
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2および/またはSEQ ID NO:3であるか、
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7および/またはSEQ ID NO:3であるか、あるいは、
SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10および/またはSEQ ID NO:11であることを特徴とする請求項1に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。 - 前記軽鎖相補性決定領域が、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、およびSEQ ID NO:14からなる群から選択される1つまたは複数の配列からなることを特徴とする請求項1または請求項2に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 前記軽鎖相補性決定領域が、
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5および/またはSEQ ID NO:6であるか、
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5および/またはSEQ ID NO:8であるか、あるいは、
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13および/またはSEQ ID NO:14であることを特徴とする請求項3に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。 - 重鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、およびSEQ ID NO:3を含み、軽鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:6を含むか、
重鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、およびSEQ ID NO:3を含み、軽鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:6を含むか、
重鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、およびSEQ ID NO:3を含み、軽鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:8を含むか、
重鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、およびSEQ ID NO:3を含み、軽鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:8を含むか、あるいは、
重鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、およびSEQ ID NO:11を含み、軽鎖相補性決定領域がSEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、およびSEQ ID NO:14を含むことを特徴とする請求項1〜請求項4のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。 - 前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19またはSEQ ID NO:29に置換されていることを特徴とする請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20またはSEQ ID NO:30に置換されていることを特徴とする請求項6に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 重鎖可変領域がSEQ ID NO:15を含み、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:16を含むか、
重鎖可変領域がSEQ ID NO:17を含み、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:16を含むか、
重鎖可変領域がSEQ ID NO:15を含み、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:18を含むか、
重鎖可変領域がSEQ ID NO:17を含み、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:18を含むか、あるいは、
重鎖可変領域がSEQ ID NO:19を含み、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:20を含むことを特徴とする請求項6または請求項7に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。 - ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である請求項1〜請求項8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- ラクダ化シングルドメイン抗体、二機能性抗体、scFv、scFv二量体、BsFv、dsFv、dsFv2、dsFv−dsFv’、Fvフラグメント、Fab、Fab’、F(ab’)2、ds二機能性抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、または二価ドメイン抗体である請求項1〜請求項8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- ヒトIgG1、IgG2またはIgG4のタンパク質の定常領域を含む免疫グロブリン定常領域をさらに含む請求項1〜請求項8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- コンジュゲートをさらに含む請求項1〜請求項8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項1〜請求項8のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項13に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項14に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項13に記載の単離されたポリヌクレオチドを発現する条件下で、請求項15に記載の宿主細胞を培養することを含む請求項1〜請求項12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現させる方法。
- 請求項1〜請求項12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含むキット。
- 請求項1〜請求項12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、1種または複数種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- ヒトまたはサルOX40の存在またはレベルの検出における、請求項1〜請求項12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
- OX40アゴニストに応答する障害または状態病症または状況を有する個体の検出および同定における、請求項1〜請求項12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
- OX40アゴニスト治療の治療応答または疾患進行のモニタリングにおける、請求項1〜請求項12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
- 上方制御された免疫応答から利益を得ることができる状態状況を治療するための薬物の製造における、請求項1〜請求項12のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
- 前記状態が癌または慢性ウイルス感染症である、請求項22に記載の使用。
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