JP2021510510A - 細胞再プログラム化療法 - Google Patents

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Abstract

2つの細胞集団の動的な共培養のための系および方法が提供される。該系は、容器内に配置される刺激体細胞集団と応答体細胞集団を物理的に分離するように構成される障壁を含む。障壁は、細胞集団の少なくとも1つの分泌された因子に対して透過性である。応答体細胞集団は、分泌された因子への暴露により、刺激体細胞集団に由来する生体分子(例えば核酸)を含むおよび/または再プログラム化された細胞の親集団とは異なる1つ以上のさらなるもしくは改変された機能的活性を発揮する再プログラム化された細胞の集団を生じるように改変され得る。

Description

関連出願
本願は、2018年1月12日に出願された米国仮特許出願第62/616,930号の利益を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書に援用される。
政府支援
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号R01EB012521およびT32EB016652-01A1の下、政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
背景
造血細胞はしばしば、ヒトの身体において血液細胞を再構成するそれらの能力のために、細胞療法に使用される(Lorenz et al., 1951)。骨髄、末梢血動員造血幹細胞 (HSC)、臍帯血HSC、赤血球細胞、血小板および白血球は、患者から回収され、造血を修復する静脈内投与のために調製される生存細胞供給源である。造血細胞療法は拡張し続けているので、臨床適用のための造血細胞のエクソビボ維持および作り変えに使用され得る向上された生体処理系のための必要性がある。
概要
例えばエクソビボ拡大および治療的細胞の生体処理を支持する例えば線維芽細胞刺激体細胞およびHSC応答体細胞などの刺激体および応答体細胞の動的な共培養のための系および方法が提供される。
いくつかの態様において、共培養系は、容器内に配置される応答体細胞集団および刺激体細胞集団を含む。障壁は、応答体細胞集団と刺激体細胞集団を物理的に分離するように構成され、該障壁は、刺激体細胞集団の分泌された因子に対して透過性である。該系はさらに、応答体および刺激体細胞集団の少なくとも1つを含む懸濁液のフローを、容器を通って誘導するように構成される流体フロー駆動体を含む。
他の態様において、細胞を再プログラム化する方法が提供される。該方法は、応答体細胞集団を、刺激体細胞集団の分泌された因子に暴露する工程を含む。応答体および刺激体細胞集団は容器内に配置され、分泌された因子は、容器内の応答体および刺激体細胞集団を分離する障壁を通ってかん流され、応答体細胞集団は、分泌された因子への暴露後に改変される。該方法はさらに、容器内の応答体および刺激体細胞集団の少なくとも1つを含む細胞培養培地のフローを誘導する工程をさらに含む。
さらなる態様において、再プログラム化された細胞の集団を含む組成物が提供される。再プログラム化された細胞は、異なる細胞集団に由来する核酸を含む。再プログラム化された細胞はまた、再プログラム化された細胞の親集団とは異なる1つ以上のさらなるまたは改変された機能的活性を示す。組成物は、該組成物を必要とする患者に投与され得る。
他の態様において、再プログラム化された細胞の組成物を投与する方法が、該組成物を必要とする患者、例えば自己免疫障害、炎症性疾患または移植を有する患者などに提供される。該組成物は、静脈内投与または局所投与により送達され得、約5,000,000〜約1,000,000,000の再プログラム化された細胞の用量を含み得る。
図面の簡単な説明
前述のものは、添付の図面に図示されるように以下の例示態様のより詳細な記載から明らかであり、該図面において同様の参照記号は異なる図面を通じて同じ部分に言及する。図面は必ずしも一定の縮尺で作られておらず、代わりに態様の図示が強調される。
図1は、動的共培養系の模式図である。 図2A〜2Cは、LSKについて富化された3T3支持2D短期間共培養の結果を例示する。分析は、1間質細胞:10骨髄細胞(BMC)の比で、全骨髄細胞(BMC)に対して実施された。細胞は、接触非依存的様式で72時間培養した。図2Aは、72時間培養期間の終了時の細胞収率のグラフである。図2Bは、Lineagenegative Scapositive cKitpositive (LSK)割合のグラフである。図2Cは、Lineagenegative集団由来のLSK細胞の代表的ゲートの例示である。データは3回の生物学的反復実験を代表する。全ての値は平均+標準偏差である。*は、BM単独と比較したp値を示す。*p<0.05、**p<0.01および***p<0.0001。 図3A〜3Dは、マイクロリアクター内のヒト造血細胞の遅いフローの培養を例示する。分析は、デバイス播種の1時間後にBMCに対して実施した。図3Aは、全BMCを含むガス交換細胞バッグを、中空線維マイクロリアクターのキャピラリー内空間に連結し、次いで白金ケイ素耐圧チューブを介して、Masterflex(登録商標)(Cole-Parmer)ポンプに連結した遅いフロー培養系の模式図である。図3Bは、図3Aの遅いフロー培養系のマイクロリアクターの模式図である。キャピラリー外流入口を介して、キャピラリー外空間に間質細胞を播種した。キャピラリー内流入口を介して、全BMCをキャピラリー内空間に流した。図3Cは、図3Bのマイクロリアクター内の骨髄細胞(BMC)のフローの模式図である。間質細胞と全BMCの間に直接接触はなかった。中空線維表面に沿った0.2μMの孔により、細胞が通ることなく、分泌された因子の双方向の交換が可能になる。 図3Dは、流体フローの関数としての細胞数のグラフである。全ての値は平均+標準偏差である。データは3回の生物学的反復実験を代表する。*は、BM単独と比較したp値を示す。*p<0.05、**p<0.01および***p<0.0001。 図4A〜4Bは、高用量および低用量の3T3支持培養の結果を例示する。デバイス播種後の種々の時点で全BMCに対して分析を実施した。1時間の細胞数に対して細胞数を標準化した。図4Aは、経時的な、BMC単独と比較した高用量3T3支持BMCの細胞数のグラフである。図4Bは、経時的な、BMC単独と比較した低用量3T3支持BMCの細胞数のグラフである。全ての値は平均+標準偏差である。データは3回の生物学的反復実験を代表する。*は、BM単独と比較したp値を示す。*p<0.05、**p<0.01および***p<0.0001。 図5A〜5Dは、3T3媒介富化培養の結果を例示する。デバイス播種後の種々の時点で全BMCに対して分析を実施した。図5Aは、経時的な全生存BMCの割合としてのLSKプールのグラフである。1時間後の全ての時点で細胞は3T3支持により富化された。図5Bは、経時的なLSK数のグラフである。 図5Cは、経時的なLineagepositive集団のグラフである。図5Dは、経時的なLineagenegative集団のグラフである。全ての値は平均+標準偏差である。データは3回の生物学的反復実験を代表する。*は、BM単独と比較したp値を示す。*p<0.05、**p<0.01および***p<0.0001。 図6A〜6Dは、3T3媒介増強細胞循環培養の結果を例示する。分析は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)によりパルスした全BMCに対して実施した。細胞循環特性の種々の時点で細胞をサンプリングした。図6Aは、CFSElo集団内にあったLSKについての代表的なゲート戦略のグラフである。図6Bは、経時的なCFSEloであったLSKの集団のグラフである。 図6Cは、経時的なCFSE+であったLineagepositive細胞の集団のグラフである。図6Dは、経時的なCFSE+であったLineagenegativeの集団のグラフである。全ての値は平均+標準偏差である。データは3回の生物学的反復実験を代表する。*は、BM単独と比較したp値を示す。*p<0.05、**p<0.01および***p<0.0001。 図7は、高用量および低用量の間質の両方についての2-D Transwell(登録商標)(Corning)共培養中の散乱のLSK割合のグラフである。全ての値は平均+標準偏差である。データは3回の生物学的反復実験を代表する。*は、BM単独と比較したp値を示す。*p<0.05、**p<0.01および***p<0.0001。 図8Aは、3T3播種マイクロリアクター内での高間質用量についての生の(raw)細胞数および生存能力のグラフである。全ての値は平均+標準偏差である。データは3回の生物学的反復実験を代表する。*は、BM単独と比較したp値を示す。*p<0.05、**p<0.01および***p<0.0001。図8Bは、3T3播種マイクロリアクター内での低間質用量培養についての生の細胞数および生存能力のグラフである。全ての値は平均+標準偏差である。データは3回の生物学的反復実験を代表する。*は、BM単独と比較したp値を示す。*p<0.05、**p<0.01および***p<0.0001。 図9Aは、低間質用量モデルについてのLSK割合のグラフである。全ての値は平均+標準偏差である。データは3回の生物学的反復実験を代表する。*は、BM単独と比較したp値を示す。*p<0.05、**p<0.01および***p<0.0001。図9Bは、低間質用量モデルについてのLSK細胞数のグラフである。全ての値は平均+標準偏差である。データは3回の生物学的反復実験を代表する。*は、BM単独と比較したp値を示す。p<0.05、**p<0.01および***p<0.0001。 図10は、間葉間質細胞(MSC)との共培養による用量依存的様式において調節された場合の末梢血単核細胞(PBMC)の増殖のグラフである。 図11は、経時的な、MSCとインキュベートしたPBMCの増殖のグラフである。 図12は、種々の細胞型とインキュベートしたPBMCの増殖のグラフである。 図13は、ブレフェルジン(Brefeldin)A(BrefA)で処理したPBMCの増殖のグラフである。x軸は、以下の培養条件を示す：Stim(P+)=刺激されたPBMC w/ブレフェルジンA；Stim(P-)=刺激されたPBMC w/oブレフェルジンA；Ctrl (P+)=非刺激PBMC w/ブレフェルジンA；Ctrl(P-)=非刺激PBMC w/oブレフェルジンA；M+P+= MSCとの共培養における刺激されたPBMC w/ブレフェルジンA；M+P-=MSCSとの共培養における刺激されたPBMC w/oブレフェルジンA。 図14は、BrefAで処理したPBMC増殖のグラフである。x軸は、以下の培養条件を示す：Stim=刺激されたPBMCS w/oブレフェルジンA；No Stim=非刺激PBMC w/oブレフェルジンA +BA=MSCとの共培養における刺激されたPBMC w/ブレフェルジンA；-BA=MSCSとの共培養における刺激されたPBMC w/oブレフェルジンA。 図15は、経時的な、BrefAで処理したPBMCの増殖のグラフである。 図16は、動的フロー下でのPBMCの増殖のグラフである。 図17は、免疫抑制性能力についてのMSC前刺激の効果に対するPBMCの増殖のグラフである。MSCを、IFNy、IL-1b、TNFa、TLR3アゴニスト(ポリI:C)、TLR4アゴニスト(LPS)のいずれかで、1時間または24時間のいずれかの間前刺激した。次いでこれらの薬剤を洗浄し、刺激されたPBMCとの共培養を行った。X軸は培養条件を示し、y軸はPBMC増殖を示す。 図18A〜18Iは、MSC:PBMC共培養の増殖追跡についてのモデルを例示する。図18Aは、CFSEに基づく増殖追跡の例を例示するグラフである。倍率変化は、最大増殖能力と比較した、標的免疫集団(PBMC等)の増殖倍率変化を示す。図18Bは、薬力学的モデルのグラフである。 図18Cは、薬力学的モデルの管理式(governing equation)を例示するチャートである。図18Dは、MSC:PBMC比に対する倍率変化のグラフである。 図18Eは、MSC/ウェルに対する倍率変化のグラフである。図18Eは、MSC/mLに対する倍率変化のグラフである。 図18Gは、MSC:PBMC比についての経験的増殖に対する予想増殖のグラフである。図18Hは、MSC/ウェルについての経験的増殖に対する予想増殖のグラフである。 図18Iは、MSC/mLについての経験的増殖に対する予想増殖のグラフである。図18D〜18Iにおいて、緑がかった青色は1.5M PBMSを表し、ピンク色は3M PBMCを表す。 図19A〜19Fは、MSC:PBMC共培養実験からのフローサイトメトリーデータを例示する。上段は、前増殖性集団の発現を示す。下段は、それぞれ個々の増殖性生成の発現を示す。y軸は標準化された増殖である。図19Aは、種々のMSC:PBMC比についてのCD3増殖のグラフである。図19Bは、種々のMSC:PBMC比についてのCD3生成のグラフである。 図19CはCD4増殖のグラフである。図19DはCD4生成のグラフである。 図19EはCD8増殖のグラフである。図19FはCD8生成のグラフである。図19A〜19Fにおいて、St=stim、Ct=対照、A=1:10、B=1:20、C=1:100、D=1:200、E=1:1000、F=1:2000。 図20A〜20Hは、MSC:PBMC共培養実験からのフローサイトメトリーデータを例示する。上段(図20A、20C、20Eおよび20Gを含む)は、全増殖性集団の発現を示す。下段(図20B、20D、20Eおよび20Fを含む)は、それぞれ個々の増殖性生成の発現を示す。x軸は標準化された増殖であり、y軸は表面マーカー発現レベルである。図20Aは、種々のMSC:PBMC比についてのCD4増殖およびCD38発現のグラフである。図20Bは、高い直線性/相関を示すCD4増殖およびCD38発現のグラフである。 図20Cは、種々のMSC:PBMC比についてのCD4増殖およびCD25発現のグラフである。図20Dは、高い直線性/相関を示すCD4増殖およびCD25発現のグラフである。図20Eは、種々のMSC:PBMC比についてのCD8増殖およびCD38発現のグラフである。 図20Fは、高い直線性/相関を示すCD8増殖およびCD38発現のグラフである。図20Gは、種々のMSC:PBMC比についてのCD8増殖およびCD25発現のグラフである。 図20Hは、高い直線性/相関を示すCD8増殖およびCD38発現のグラフである。図20A〜20F20Hにおいて、St=stim、Ct=対照、A=1:10、B=1:20、C=1:100、D=1:200、E=1:1000、F=1:2000。 図21A〜21Kは、分泌されたサイトカインの多重用量応答を例示する。図21Aは種々のMSC:PBMC比についてのIFNaの応答を例示する。図21BはINFgの応答を例示する。図21CはIL1bの応答を例示する。図21DはIL1raの応答を例示する。 図21EはIL4の応答を例示する。図21FはIL10の応答を例示する。図21GはIL12p40の応答を例示する。図21HはIL17の応答を例示する。 図21IはIP10の応答を例示する。図21JはPGE2の応答を例示する。図21KはTNFaの応答を例示する。図21A〜21Kにおいて、St=stim、Ct=対照、A=1:10、B=1:20、C=1:100、D=1:200、E=1:1000、F=1:2000。 図22は、MSCへの暴露の時間に対するPBMCの標準化された増殖のグラフである。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。MSC Transwell(登録商標)挿入は、1、2および3日の共培養開始後、持続時間まで除去された。フローサイトメトリーおよびCFSE染色により増殖を測定した。 図23A〜23Kは、MSCへの暴露の時間に対する標準化されたサイトカイン分泌の棒グラフである。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。MSC Transwell挿入は、1、2および3日の共培養開始後、持続時間まで除去した。増殖はフローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定した。図23Aは、IFNaについての延長されたMSC暴露による増加を例示する。図23Bは、INFyについての延長されたMSC暴露による減少を例示する。図23Cは、IL1bについての延長されたMSC暴露による有意な変化がないことを例示する。図23Dは、IL1raについての延長されたMSC暴露によるわずかな増加を例示する。図23Eは、IL4についての延長されたMSC暴露による減少を例示する。図23Fは、IL10についての延長されたMSC暴露による減少を例示する。 図23Gは、IL12p40についての延長されたMSC暴露による有意な変化がないことを例示する。図23Hは、IL17についての延長されたMSC暴露による減少を例示する。図23Iは、IP10についての延長されたMSC暴露による有意な変化がないことを例示する。図23Jは、PGE2についての延長されたMSC暴露による増加を例示する。図23Kは、TNFaについての延長されたMSC暴露による減少を例示する。 図24は、培養体積条件に対する標準化された増殖のグラフである。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖はフローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定した。 図25A〜25Cは、培養体積条件に対する標準化されたサイトカイン分泌の棒グラフである。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定した。 図25D〜25Kは、培養体積条件に対する標準化されたサイトカイン分泌の棒グラフである。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定した。 図26は、ブレフェルジンA(BrefA)条件に対する標準化された増殖のグラフである。PBMCまたはMSCのいずれかをブレフェルジンAで24時間処理した後に共培養を開始した。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定した。 図27A〜27Cは、BrefA条件に対する標準化されたサイトカイン分泌の棒グラフである。PBMCまたはMSCのいずれかをブレフェルジンAで24時間処理した後、共培養を開始した。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定した。 図27D〜27Kは、BrefA条件に対する標準化されたサイトカイン分泌の棒グラフである。PBMCまたはMSCのいずれかをブレフェルジンAで24時間処理した後、共培養を開始した。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定した。 図28は、BrefA条件に対する標準化された増殖のグラフである。PBMCまたはMSCをブレフェルジンAで24時間処理した後に共培養を開始した。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定した。 図29A〜29Cは、BrefA条件に対する標準化されたサイトカイン分泌の棒グラフである。PBMCまたはMSCのいずれかをブレフェルジンAで24時間処理した後、共培養を開始した。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定した。 図29D〜29Kは、BrefA条件に対する標準化されたサイトカイン分泌の棒グラフである。PBMCまたはMSCのいずれかをブレフェルジンAで24時間処理した後、共培養を開始した。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定した。 図30A〜30Dは、種々のバイオリアクター培養条件からの分泌された細胞外小胞粒径分布を例示する。図30Aは、直径培養(diameterculture)に対する刺激されたPBMC PBMCsの細胞粒子数を例示する。図30Bは、直径培養に対する刺激されたPMBCの細胞粒子数を例示する。 図30Cは、直径に対する刺激されたPBMC:MSC培養およびMSCからの細胞粒子数を例示する。図30Dは、直径に対する刺激されたPBMC:MSC培養およびMSCからの細胞粒子数を例示する。NoMSC=刺激されたPBMC；B-M=刺激されたPBMC；PlusMSC=刺激されたPBMC+MSC；B+M=刺激されたPBMC+MSC。 図31は、PBMCS(停止および連続_3と標識された直線)および精製されたT細胞(連続_1および連続_3と標識された直線)の拡大結果のグラフである。 図32A〜32Bは、停止フロー培養の間の細胞の顕微鏡写真である。図32Aは細胞のプレフロー凝集を示す。 図32Bは細胞のポストフロー凝集を示す。スケールは1000μM。 図33は、磁性ポンプ(磁性と標識された直線)および蠕動ポンプ(蠕動と標識された直線)を使用した停止フロー培養におけるPBMCの拡大結果のグラフである。 図34A〜34Dは、共培養についての障壁構成を例示する模式図である。図34Aは、管腔内および管腔外構成要素の両方における細胞懸濁物を例示する。図34Bは、管腔外空間中の封入された細胞集団を例示する。図34Cは、管腔内空間中の封入された細胞集団を例示する。図34Dは、管腔外空間に播種される細胞生体材料ゲルを例示する。 図35は、培養プロセスを例示する模式図である。 図36は、HEK293T細胞を使用したレンチウイルス作り変えの一体化された小規模生成/形質導入プロセスおよび定量を例示する模式図である。 図37Aは、transwell系における形質導入戦略の模式図である。図37Bは、図37Aのtranswell系と重複するトランスフェクションおよび形質導入プロセスの両方のタイムラインである。 図37Cは、標的細胞形質導入群についてn=3の実験についてのプレート設定の模式図である。実験は2回試行した。図37Dは、transwell挿入の内部のGFP発現HEK293T細胞を示し、一過的トランスフェクション、およびそのためレンチウイルス粒子産生が生じたことが確認される。 図37Eは、Jurkat T細胞を含み、蛍光の面積を示すウェルの底を示し、遊離の浮遊レンチウイルス粒子からの標的細胞の形質導入が確認される。 図38Aは、挿入内のHEK293T細胞の播種密度を変化させた際のフローサイトメトリーにより決定される形質導入効率を例示する。図38Bは、ウェル内のJurkat T細胞の播種密度を変化させた際のフローサイトメトリーにより決定される形質導入効率を例示する。 図38Cは、過密のためにtranswellを通ってウェルの底に透過したHEK293T細胞を示す。図38Cは、45% HEK細胞挿入のウェルの底における形質導入されたJurkat細胞を示す。 図39A1は、200μmスケールでの1μm挿入ウェルからのZEISS蛍光画像を示す。図39A2は、50μmスケールでの1μm挿入ウェルからのZEISS蛍光画像を示す。 図39B1は、200μmスケールでの8μmウェルからのZEISS蛍光画像を示す。図39B2は、50μmスケールでの8μmウェルからのZEISS蛍光画像を示す。 図39Cは、それぞれの挿入の孔隙率を変化させた際のフローサイトメトリーの結果により決定されたJurkat T細胞の形質転換効率を例示する。 図40は、PBMC集団の試験についてのタイムラインを例示する模式図である。 図41は、MSC:PBMC用量応答を例示する。棒グラフは3試料の平均+/-SDを表す。図41は、MSC/NHDF:PBMC (1:5)用量応答を例示する。棒グラフは3試料の平均+/-SDを表す。 図42は、T細胞増殖に対する共培養の効果を例示する。棒グラフは3試料の平均+/-SDを表す。 図43は、T細胞増殖に対するEC表現型の効果を例示する。棒グラフは3試料の平均+/-SDを表す。 図44は、せん断応力により活性化される作り変えられたECの効果およびPBMC共培養のそれらの増殖性応答を例示する。棒グラフは3試料の平均+/-SDを表す。 図45は、NHDF(皮膚線維芽細胞)、HepG2(肝臓)およびEA.hy296(内皮)とのPBMC共培養の標準化された増殖性応答を例示する。棒グラフは3試料の平均+/-SDを表す。
詳細な説明
造血幹細胞(HSC)および他の治療的細胞型のエクソビボ維持および/または作り変えのためのバイオリアクターの使用は、種々の形式で適用されているが、かかるバイオリアクターの形態は、広いスケールでの使用、標準化された技術および/または再現性のある結果を防ぎ得、かかるバイオリアクターが臨床総合施設について有用となる能力を妨げ得るという問題を提示している。例えば、連続フローチャンバーは、高価な培地を消費するという要求の増加という犠牲を払って優れた栄養送達を可能にし(Koller et al., 1993a；Koller et al., 1993b；Palsson et al., 1993；Sandstrom et al., 1996)；撹拌槽はより大きな体積を支持してクローン性の成長および分化のモニタリングを可能にするが、HSC表現型および幹細胞能力は維持されず(De Leon et al., 1998；Levee et al., 1994；Sardonini and Wu, 1993；Zandstra et al., 1994)；充填床(packed bed)リアクターは、培養されたHSCと成長リガンドとの接触を可能にする体積割合まで表面積を拡大することを可能にするが、HSCを精製することは困難であり、より低い収率を有する(Liu et al., 2014；Meissner et al., 1999；Wang et al., 1995)。中空線維バイオリアクターは、HSCの連続リサイクルフロー培養のために使用されているが、かかるバイオリアクターは、HSC数を成功裡に支持しなかった(Sardonini and Wu, 1993；Schmelzer et al., 2015)。これらの系は利益を示しているが、下流の精製の容易さを伴ってHSC数および表現型を維持する一体化された系のための必要性が依然として残っている。
HSCのエクソビボ生体処理における1つの主要な課題は、培養中の経時的な幹細胞の成育能力および/または表現型の消失である。従来の培養方法は、適切なHSC表現型を維持しながら成長を駆動する培地製剤に大きく頼る。現在、培地補充物としては、高価で、臍帯血HSCをエクソビボで大部分拡大することが示されている幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-(IL)3、-6、Fms様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3-L)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、線維芽細胞成長因子-1、-2、デルタ-1およびトロンボポイエチンの種々の組合せが挙げられる(Bhatia et al., 1997；Conneally et al., 1997；Delaney et al., 2005；Himburg et al., 2010；Lui et al., 2014；Zhang et al., 2006)。これらのエクソビボ系を高めるために、細胞性HSCニッチは、線維芽細胞間質細胞(Pan et al., 2017；Perucca et al., 2017)または内皮細胞(Gori et al., 2017)との直接または間接的な共培養により部分的に反復され得る。間質および造血幹細胞始原細胞(HSPC)の空間的組織化をより容易に模倣する進歩した3-D培養系は、2-D培養と比較して拡大された細胞の長期間の植え付けを高めることが示されている(Futrega et al., 2017)。このように、HSCのエクソビボ維持および/または作り変えならびに他の治療細胞型に適用され得る向上されたバイオリアクター系のための必要性がある。
例示的な態様の説明を以下にする。
2つ以上の細胞集団の間接的な、動的共培養を提供する系が提供される。一態様において、該系は、障壁により分離される第1および第2の細胞集団を含む。該障壁は1つの細胞集団を別の細胞集団から物理的に分離するが、少なくとも1つの細胞集団の分泌された因子に対しては透過性である。さらなる態様において、3つ以上の細胞集団が含まれる。それぞれの細胞集団は、障壁により、系の他の細胞集団から分離され得る、なおさらなる態様において、系に単一の細胞集団が含まれ、該単一の細胞集団は、第2の細胞集団を含むように構成された構成要素から障壁により分離される。第1および第2の細胞集団は、異なる細胞型または同じ細胞型であり得る。
共培養系の例を図1に示す。特定の態様において、障壁は、中空線維膜120などの半透過性膜である。1つの細胞集団130は、中空線維膜の管腔内空間に配置され得、他の細胞集団140は管腔外空間に配置され得る。中空線維膜は容器100内に配置され、閉鎖共培養系を提供する。図34Aも参照。代替的に、障壁は、ヒドロゲルまたは他の生体材料などのゲルであり得、第1および第2の細胞集団の少なくとも1つはゲル内に配置される。図34D参照。さらに別の態様において、該障壁はカプセルであり得、第1および第2の細胞集団の少なくとも1つはカプセル内に配置される。図34Bおよび34C参照。封入された細胞集団(1つまたは複数)および/または生体材料はまた、閉鎖共培養系を提供するように容器内に配置され得、任意に透過性膜により分離され得る。
該系はさらに、第1および第2の細胞集団の少なくとも1つの懸濁液のフローを容器内または容器を通って誘導するように構成される流体フロー駆動体を含み得る。例えば、該系には、細胞懸濁物のフローを、中空線維膜の管腔内空間を通って提供するポンプが含まれ得る。代替的に、流体フロー駆動体は、槽内に配置された細胞懸濁物のフローを誘導するように構成される攪拌機であり得、該懸濁物は、例えば播種されるカプセルを含む。
2つの細胞集団は刺激体細胞および応答体細胞であり得る。物理的に分離されるが、該系は、分泌された因子を介して、これら2つの集団の動的および間接的な相互作用を容易にする。それにより該系は、刺激体細胞との連絡を介して、元の造血細胞集団などの応答体細胞の改変を提供し得る。改変された応答体細胞は、患者に送達され得る治療的医学生成物を提供するように改変され得る。形質転換された造血生成物は、疾患またはその症状を弱める能力を有することなどにより、開始または親の集団とは機能的に異なり得る。再プログラム化された細胞集団は、純度/同一性分析、機能的生体活性、分泌表現型、遺伝子およびDNA発現プロフィール、表面バイオマーカー発現、ならびに他の標準的な特徴付け技術に基づいて特徴付けられ得る。
刺激体および応答体細胞の物理的な分離は有利に、簡素化された下流の最終生成物の処理を提供する。2つの細胞集団の分離のために、応答体細胞の生成は簡易化され、さらなる不必要な生成物処理工程の必要性が不要になる。本発明の系は、臨床施設において現場でまたは認定された処理および取扱施設の外で配置され得る。
本発明の系(例えばバイオリアクター系)内で、刺激体細胞は、有効濃度で経時的に、半透過性膜を介して、患者の免疫細胞とエクソビボで連絡し得る。この方法で、刺激体細胞は、患者の体内に注射される必要なく、連続に動的に免疫細胞療法を条件づけ得る。例えば、バイオリアクター系は、病院に配置され得、カートリッジにより提供されるように一体化された刺激体細胞集団を有し得る。次いで、患者から得られる造血細胞のバッグを、特定の時間リアクターを通して循環させて、造血細胞を再プログラム化し得る。次いで、造血細胞を製剤化して、患者に戻して再投与し、疾患プロセスを解決し得る。
動的共培養系の構成要素の例を以下の表1に示す。
Figure 2021510510
該系は、細胞集団間のクロストークおよび細胞集団の少なくとも1つの物理的移動/撹拌に関して動的であり得る。細胞集団間のクロストークに関して、特定の細胞型の機能性が高められ得る。例えば、T細胞により分泌される炎症性サイトカイン(IL-1、TNF、IFNy)は、間葉間質細胞の免疫調節機能を高めることが知られる。分泌された因子の複雑な環境は、薬(例えば化学および/またはタンパク質)剤を用いて再現するのに非常にコストがかかる。刺激体細胞の分泌された因子への暴露と組み合わせた組織培養による細胞の自己更新特性は、経済的な細胞再プログラミング化を提供する。
共培養系内の物理的移動/撹拌に関して、物理的移動は気体および可溶性因子の培養への拡散を増加し、それにより向上された細胞全体の健康を提供し、細胞凝集をバラバラにするせん断を増加させるので、静的な培養よりも動的な培養が好ましい。さらに、動的な系は、有意に高い量の細胞も処理し得、臨床的および商業的規模の要求にこたえる能力を高める。非動的な系は、表面積により制限され得、細胞が接着性でない場合は、結果的な細胞の沈殿を生じ得、これらの系は、動的な系よりもかなり早く最終コンフルエントに到達する。細胞は、透過性膜(すなわちPES)または透過性基材(すなわちヒドロゲル封入)のいずれかにより分離され得る。動的系の形式は、以下：中空線維膜、撹拌フラスコ/槽、微小担体、揺れるもの(rocker)(波状リアクター)バッグまたはフラスコ、回転ボトル、封入されたビーズ/床(bed)および組織作り変え構築物のいずれか1つまたは任意の組合せを含み得る。
いくつかの態様において、共培養系は、静的条件下で一定時間維持され、応答体および刺激体細胞集団の少なくとも1つを含む細胞培養培地のフローは不連続である。例えば、静的または実質的に静的な条件は、応答体または刺激体細胞集団の少なくとも1つを播種する際に最初に維持され得、該系内で集団を確立させ、および/または分泌された因子が障壁を通ってかん流されて応答体細胞により吸着される時間を提供する。次いで、静的な共培養の期間の間に、細胞培養培地(1つまたは複数)が系内を流れる期間が散在し得る。フローは、細胞凝集をバラバラにするように流動フロー駆動体などにより誘導され得、系内での細胞成長および細胞分化の両方を補助し得る。誘導されたフローは、所定の時間および/または所定の間隔の間にフローが誘導されるようにパルス化され得る。例えば、パルス化されたフローは、少なくとも約10秒、例えば約10秒〜約30分、約10秒〜約5分または約10秒〜約1分のフロー持続時間を有し得る。細胞培養培地のフローが適用される時間の長さは、細胞凝集をバラバラにするためのせん断を誘導するのに十分であり得る。パルスはまた、設定頻度で適用され得る。例えば、パルスは、約2時間〜約40時間、約2時間〜約6時間、約6時間〜約12時間または約12時間〜約24時間の頻度で適用され得る。例えば、T細胞は、クローン性の凝集中で成長し得る。所定の時点または所定の時間で凝集をバラバラにするように構成された不連続なフローは、次いで、フローが停止されると、新規のクラスターの形成を可能にし得る。連続フロー条件下で成長する凝集は、連続せん断応力のために十分に形成され得ず、そのため、細胞数は不連続フロー条件下で成長する凝集よりも有意に低くなり得る。
刺激体細胞集団が播種された中空線維膜カプセル(図3B)などのカートリッジが提供され得る。次いで、カートリッジは、動的共培養系に挿入され得、患者の血液は、臨床的な位置で特定の刺激体細胞集団により再条件付けされ得る。
動的共培養系の障壁は、約30kDA〜約100,000kDA、または約5000kDAの分子量カットオフ(MWCO)を有し得る。代替的に、障壁は、約0.00001μm〜約0.65または約0.5μmの孔径を有し得る。
細胞条件付け、または細胞再プログラム化は、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間または少なくとも約3時間にわたり起こり得る。いくつかの態様において、細胞条件付けは、約21日までの時間にわたり起こる。特定の態様において、細胞条件付けは、約60時間〜約120時間の時間にわたり、または約96時間にわたり、または約24時間より長い時間にわたり起こる。応答体細胞の刺激体細胞への延長された暴露は、有利に、応答体細胞を再プログラム化するための適切な時間を提供し得る。再プログラム化された細胞は、条件づけプロトコルが停止した直後に患者に投与され得る。代替的に、その後の使用のために低温保存されているさらなる細胞「用量」により、細胞の大きなバッチが生成され得る。
細胞条件付けプロセスまたは細胞を再プログラム化するためのプロセスの例を図35に示す。第1のプロトコルまたはプロセス段階において、バイオリアクター(例えば障壁により分離される応答体細胞集団および刺激体細胞集団を収容するための容器)には、刺激体細胞が播種される。刺激体細胞集団は、細胞の懸濁液を、限外濾過流体入口を通してバイオリアクターに流すことによりバイオリアクターに導入され得る。次いで細胞を、例えば約6〜約24時間などの時間インキュベートし得る。刺激体細胞集団は、少なくとも1細胞/cm2、例えば約1〜約1,100,000細胞/cm2の密度でバイオリアクター中に播種され得る。刺激体細胞にはさらに、成長因子、血清、血小板溶解物および/または抗生物質の1つ以上が補充され得る。
刺激体細胞の播種の後、応答体細胞は第2のプロトコルにおいて系に導入される。特に、応答体細胞は、循環流体入口を通って導入され得、バイオリアクターの流体含有チャンバー内に維持され得る。流体含有チャンバーはまた、特に細胞培養バッグも使用される場合に、気体交換ツールとして働き得る。刺激体および応答体細胞を含む細胞は、播種および/または共培養の間に、約0.1〜約21%の酸素分圧で維持され得る。
第3のプロトコルにおいて、共培養系は、細胞再プログラム化が例えば約24時間以上起こるのに十分な時間に試行され得る。第3のプロトコルの間に、刺激体もしくは応答体細胞またはその両方のいずれかを含む細胞培養培地のフローが一定の時間に続いて実質的に静的な条件の期間に誘導される停止フロープロセスが起こり得る。いくつかの感受性(sensing)単位は、系のリアルタイムでのモニタリングを可能にするためおよび系のパラメーターを調整(すなわち新鮮な培地の添加)する能力を提供するためにフロー回路に沿って一体化され得る。センサーおよびモジュールは：酸素、二酸化炭素、グルコース、pH、細胞密度ツール、排出口および空気除去チャンバーを含み得る。
共培養期間の終わりに、応答体細胞集団および任意に刺激体細胞集団は、第4のプロトコルにおいて系から回収され得る。
系には、応答体細胞集団、刺激体細胞集団、新鮮な培地および/または試薬のいずれかのフローを、バイオリアクターに/バイオリアクターから誘導するための1つ以上のポンプが含まれ得る。該ポンプは例えば、蠕動ポンプまたは磁性ポンプであり得る(例えばLevitronix(登録商標) PuraLev(登録商標)ポンプ)。実施例3に示されるように、停止フロー条件は特に、連続共培養条件にわたり、応答体細胞の増殖を増加させることが示された。実施例4に示されるように、磁性ポンプにより誘導されるフローは、蠕動ポンプにより誘導されるフローと比較して、応答体細胞の増殖も増加することが示された。
バイオリアクターまたはバイオリアクターに/バイオリアクターから延びるチューブはさらに、そうでなければ閉鎖系からの気体の排出を提供するための空気除去チャンバーおよび/または排出口を含み得る。空気除去チャンバーおよび/または排出口はまた、細胞に有害である系内の泡を除去またはトラップするために提供され得る。
動的共培養系に含まれる刺激体細胞は、間質細胞、ウイルス封入細胞、抗原暴露細胞、未熟血液細胞、微生物細胞、内皮細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、癌細胞および/またはニューロンであり得る。刺激体細胞は組織内に配置され得る。
応答体細胞は、免疫細胞、骨髄細胞および/または赤血球細胞であり得る。特定の態様において、応答体細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である。別の特定の態様において、応答体細胞は白血球である。
別の態様において、刺激体細胞は間葉幹細胞であり、応答体細胞はT細胞である。
応答体細胞が暴露される分泌された因子は、核酸、例えばmRNA、マイクロRNA、環状RNA(circRNA)およびDNAであり得る。代替的に、分泌された因子は、成長因子、ケモカインおよび/またはサイトカインであり得る。分泌された因子は、刺激体細胞のエクソソームに含まれ得、次いで応答体細胞によりエンドサイトーシスによって取り込まれ得る。
刺激体および応答体細胞のペアの例を表2に示す。白血球は、免疫細胞の型であると考えられ得、表2に反映される免疫細胞の部類に含まれる。未熟細胞は、胚性期、胎児期または早期青年期、例えばヒト被験体において約18歳までの間に被験体から採取された細胞を含む。脂肪細胞としては、白色、褐色およびベージュ色の脂肪細胞が挙げられる。
Figure 2021510510
別の態様において、再プログラム化された細胞の集団を有する組成物が提供される。再プログラム化された細胞は、異なる細胞集団(例えば刺激体細胞)由来の生体分子(例えば核酸、タンパク質)を含む。再プログラム化された細胞は、それらの親集団とは異なる1つ以上のさらなるまたは改変された機能的活性を示し得る。本明細書において理解されるように、「親集団」は、異なる細胞集団の分泌された因子に暴露されていない細胞集団である。用語「再プログラム化された細胞」は、異なる細胞集団の分泌された因子に暴露された親細胞の集団をいう。再プログラム化された細胞は、親集団により発現されない細胞表面マーカーをさらに発現し得る。再プログラム化された細胞は、親細胞集団と比較して、インビトロにおける改変されたT細胞増殖活性などのさらなるまたは改変された活性を有し得る。
該組成物は、免疫学的疾患を有する被験体への投与のために、許容され得るビヒクル中で製剤化され得る。方法は、組成物を必要とする被験体に組成物を投与する工程を含み得る。例えば、該組成物は、1つ以上の抗炎症性細胞の産生を増加もしくは低下するため、または炎症に関連する疾患、障害もしくは状態を治療するために、治療計画に従って提供され得る。かかる疾患、障害および状態としては、例えば、関節リウマチ、I型およびII型糖尿病、強直性脊椎炎、筋萎縮性側索硬化症(amylotrophic lateral sclerosis)、強皮症、ベーチェット病、血球貪食リンパ組織球増多症(HLH)およびマクロファージ活性化症候群(MAS)、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病、多発性硬化症、心筋梗塞、新生物、慢性感染性疾患、全身性エリテマトーデス、骨髄不全、急性腎臓傷害、敗血症、多臓器不全症候群、急性肝不全、慢性肝不全、慢性腎不全、膵炎、ならびにグレーヴズ病が挙げられる。
バイオリアクター系の例を本明細書の実施例1および2に記載する。特に、造血幹および前駆細胞(HSPC)は、間接的な線維芽細胞フィーダー共培養により安定化および富化された(実施例1)。また、間葉間質細胞(MSC)を使用した免疫細胞の再プログラム化を示すデータが得られた(実施例2)。
免疫細胞を再プログラム化するための理論的な作用機構は、MSCにより分泌されるエクソソームである。エクソソームは、実施例2においてはMSCであるそれらの宿主細胞由来のRNAなどの遺伝子材料を含む。その後エクソソームは、実施例2においてはT細胞であるレシピエント細胞によりエンドサイトーシスにより取り込まれ得る。MSC由来材料を採用および組込むことにより、細胞はコンホメーション変化を経験し得る。測定されたエクソソームにおける明白なシフトは、対照と比較して、MSC:PBMC培養において観察された。実施例5も参照。この最初のデータは、バイオリアクター系においてMSCが実際に検出可能なエクソソームを放出することを示す。
実施例
実施例1. 中空線維バイオリアクター系
造血支持を提供することが知られるマウス胚性線維芽細胞株(Roberts et al., 1987)を、短期間生体処理のためにHSCを安定化および富化するために連続、濃縮およびリサイクルフローにおいてマウスHSCと共にフィーダー層として間接的に共培養した大規模化可能な中空線維バイオリアクター系を作製した。フィーダー細胞は本発明の系において中空線維膜によりHSCから分離され、循環フローに供されたので、HSCの単離は簡易化された。適切な精製された間質フィーダー細胞をスクリーニングして、マイクロリアクター系における共培養法ならびにマウス骨髄HSCの間接的な安定化および富化の評価を開発するために、考え証明(Proof-of-concept)試験を行った。
動物および骨髄細胞懸濁
6〜8週齢の雌C57 BL/6マウスの大腿骨および脛骨から、28ゲージの針および3mLシリンジを使用して中心骨髄を流す(flushing)ことにより、原発性のマウス全BM細胞を単離した。流した骨髄を、22ゲージの針および3mLシリンジを用いて単一細胞懸濁物に粉砕し、次いで70μMナイロンメッシュを通して濾過し、細胞調製物から組織残骸を排除した。細胞を培養培地で洗浄し、次いで塩化アンモニウムカリウム(ACK)溶出バッファ(Biolegend, CA, USA)処理に供して赤血球細胞を除去した。次いでBM細胞を、実験的使用のために細胞生存色素、トリパンブルー(ThermoFisher Scientific, USA)および血球計算板を使用して計数した。培養培地は、10% FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10mM HEPES (ThermoFisher Scientific, USA)および1mMピルビン酸ナトリウム(ThermoFisher Scientific, USA)を添加したRPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium; Gibco, USA)で作製した。
2-D Transwell共培養
2-D transwell共培養内で初期最適化実験を行い、より高い程度のスループットおよびパラメーター評価により最適培養基準：間質細胞型および用量を決定した。これらの培養には0.4μM孔を含むCorning 24ウェルプレートtranswell (Grenier Biosciences, Austria)を使用した。2E5(低間質用量：1:10)または4E5(高間質用量：1:2)細胞のいずれかで間質細胞を播種し、24時間後に全骨髄細胞(BMC)を添加した。BMCを2E6または8E5細胞のそれぞれのいずれかで播種し、次いで共培養物を37℃で72時間インキュベートした。細胞を数えてそれらのHSPC集団についてフローサイトメトリーにより分析した。上述のように、標準的RPMI細胞培養培地を用いて細胞を培養した。
3-Dマイクロリアクター設定
中空マイクロリアクターをSpectrum Labs (CA, USA)から購入した。マイクロリアクター中空線維のキャピラリー内および外の空間に滅菌濾過した0.5M水酸化ナトリウム(NaOH)を充填し、リアクター滅菌のために37℃で1〜2時間静置した。滅菌リン酸緩衝化食塩水(PBS) (Sigma, USA)を用いてNaOHを複数回洗い流した。全ての流動コネクタおよびチューブ(Masterflex PharMed(登録商標) BPT TubingおよびPlatinum-cured Silicone Tubing, IL, USA)を同様に浸漬して少なくとも1時間、0.5M NaOHにより洗い流し、滅菌濾過PBSにより洗浄した。図3Aは、共培養のためのデバイスの設定を例示する。
3-Dマイクロリアクター播種およびサンプリング
マイクロリアクターに、7E6(高間質用量：1:2)または3〜4E6(低間質用量：1:10)いずれかの3T3間質細胞を、共培養開始の24時間前に播種した。24時間で、播種したマイクロリアクターを培養培地により緩やかに洗浄し、14E6(高間質用量：1:2)または30〜40E6(低間質用量：1:10)のいずれかの全BMCのそれぞれを含む細胞培養バッグ(Origen)に付着させた。4mL/分で動くMasterflex (IL, USA)蠕動ポンプを使用してフローを導入した。細胞定量およびフローサイトメトリー分析のために250〜500μLの試料アリコートを1、24および48時間の時点で採取した。フローの投与の72時間後に共培養物を回収し、同様に分析した。
間質細胞培養
マウス間葉幹細胞をGibcoから購入した。10%熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS; Atlanta Biologicals, GA)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco, MA)、1%抗生物質-抗真菌物質(Gibco, MA)を添加した滅菌α-MEM (Gibco, MA)で構成される培地中で細胞を継代培養し、初期のベンダーストックから1〜3継代内に実験のために使用した。3T3細胞をATCC (American Type Culture Collection)から購入し、製造者の推奨の指示書の通りに、10% FBS (Atlanta Biologicals, GA)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco, MA)を添加したDMEM中で拡大させた。
フローサイトメトリー分析
CD11b-、CD11c-、Gr1-、CD3-、CD4-、CD8a-、CD19-、B220-、NK1.1およびビオチンにコンジュゲートしたTER119、cKit (CD117)-APC、Sca1-PECy7およびストレプトアビジンAPC Cy7 (BD Biosciences and eBiosciences, USA)に対する直接標識したヒトモノクローナル抗体により、細胞を、4℃、暗所で20〜30分間染色した。細胞を洗浄し、次いで2% FBSおよび2mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA; Gibco, USA)を添加したPBSで再懸濁した。FACS LSRII (BD Biosciences, USA)およびFlowJoソフトウェア(USA)を使用してフローサイトメトリー分析を行った。
共培養の開始時に、カルボキシフルオレセイン(CFSE)取り込みにより細胞循環を評価した。間質支持なしのマイクロリアクターに流したBMCの対照試料を用いてF0ピークを決定した。
統計分析
全ての統計試験は、GraphPad Prismを使用して行った。群間の差は、スチューデントt検定を使用して試験し、≦0.05のp値を統計的に有意とみなした。全ての比較はBM単独マイクロリアクター共培養に対して行った。全ての実験は少なくとも3回の生物学的反復により繰り返した。
結果：マウス胚性線維芽細胞株は2-D接触非依存的共培養におけるLSK富化を支持する。
間質細胞は、インビトロにおいて全BMCの造血支持を高めることが以前に示されている。本試験において、最適な間質細胞型を選択するための2つの基準：1)「既製の(off-the-shelf)」使用のための細胞の単離、維持および拡大の容易さ、ならびに2)HSPCの造血支持能力を適用した。どの間質細胞型がインビトロにおける全BM細胞の支持に利用されるかを決定するために、骨髄間葉間質細胞(MSC)の3T3マウス胚性皮膚線維芽細胞株に対するHSPC支持能力の比較を行った。対照として間質非含有群を含んだ。最適共培養条件のスクリーニングのために、より高いスループット実験上の利点を有する間接的な共培養を模倣する2-D接触非依存的Transwell設定を適用した。
間質支持のありおよび無しの共培養の72時間後に、全BMC区画を数えた。間質支持は、3日にわたり、それらの初期播種インプット細胞数2x106で全BMCの総数(図2A)を維持した。次いでBMCのサブ集団を、表現型的にLineagenegative Scapositive cKitpositive (LSK)と規定されるより治療的に関連のあるLSK集団について分析した(図2B)。興味深いことに、3T3線維芽細胞株は、Lineagenegativeおよび全BMCプールの両方において、LSK集団を富化するための優れた能力を発揮した(図2B〜Cおよび図7)。3T3間質支持BMCのLSKプロフィールにおいて表現型的な異常はなかった(図2C)。これらのLSK富化の所見は、全BMCに対して1:2および1:10の範囲の3T3細胞において観察され(図7)、大規模化するための動的作業範囲が示唆された。結果は、3T3線維芽細胞がマウスBM由来のマウスHSPCの富化を支持するための以前に発見されなかった能力を示す。「既成の」特性および優れた造血支持能力は、本発明者らの中空線維マイクロリアクターにおけるその後の全ての実験について3T3による大規模化をもたらした。
結果：中空線維マイクロリアクターにおける全骨髄接種および安定性。
図3A〜Cは、模式的に、中空線維バイオリアクター系を例示する。バイオリアクターは単一細胞型の大規模化のために従来的に使用される。中空線維系は、大規模細胞拡大を支持するための簡素化された新鮮な培地の交換および補充に使用された。この系は、作り変えられた組織層が連続懸濁培養の間にLSKを支持する能力を調べるために、間質細胞が管腔外空間に播種され、BMCが内部線維管腔を通って流れる共培養ツールとして改変された(図3A〜C)。
マイクロリアクター設定は、Masterflexポンプにより気体交換バッグから特殊なチューブを通って下流に流れる細胞からなり、該ポンプは、細胞を、キャピラリー内流入口を介して中空線維を通って駆動した(図3A〜B)。キャピラリー外表面に、印をつけた流入口を通って間質細胞を播種した(図3B)。中空線維膜は、親水性ポリエチレンスルホン(PES)で構成され、それぞれの線維は、細胞を含まない流体のみの双方向の交換を可能にする0.2μMの孔の分子量カットオフを有する(図3C)。高温および一定流体暴露への抵抗におけるその高度に耐性の性質のためにPESを選択した。Masterflex PharMed(登録商標) BPTチューブを使用して、Masterflexポンプヘッドを通って循環させることによりバッグからマイクロリアクターへとBMCを流した(図3A)。このPharMed BPTチューブは白金ケイ素で作製され、低レベルの破砕、酸およびアルカリに対する高い耐性を示し、高圧に抵抗して最小細胞せん断を有し得るので、このPharMed BPTチューブを使用した。14x106細胞の密度での造血細胞を、異なる流速(5mL/分、10mL/分および15mL/分)下でキャピラリー内区画に循環させながら、生存について試験した。全BMCを1時間のフローに供した後に、単核細胞の付着のために総細胞数は低下し、次いで72時間の培養期間中は比較的変化しないままであった。72時間後により低い流速でより高い細胞数が観察されたので、Masterflexポンプについて4mL/分の最低の流速を選択した(図3D)。
結果：間質細胞は、中空線維バイオリアクター内の細胞消失の救助を支持する。
静的な共培養は、3T3線維芽細胞がMSCおよび支持されないBMCに対して優れた造血支持を示したことを示した(図2参照)。マイクロリアクター系においてこの結果を検証するために、デバイスに原発性BMCを充填する24時間前に、中空線維の管腔外表面に、新たに融解した3T3を播種して、3T3を接着させて安定な機能を有させた。3T3含有共培養は、非間質支持骨髄と比較した場合にBMCに対して、統計的に有意な保護的利点を提供した(図4A)。これは72時間の時点まで一貫して見られた。高用量の間質支持は、LSK数を維持するために、2つのBMCに対して1つの3T3細胞を必要とした(図4A〜B)。経時的に検出された死細胞数に観察可能な差はなく、循環している細胞は、系構成要素に接着しやすく、懸濁細胞数に寄与しないことが示唆された(図8A〜8B)。
1時間の試料に対して標準化された数により見られるものと同様に、1、24、48および72時間の時点での生の数も、2つのBMCに対して1つの間質細胞の用量で3T3線維芽細胞は支持されないBMCにより見られる細胞数が減少する傾向を防ぎ得ることを示した(図9A〜B)。この結果に従って、マイクロリアクターからBMCの造血区画を切り離すための全てのその後の実験は、1:2の高間質用量モデルで行った。
結果：3T3線維芽細胞はLSKを富化する。
細胞数を48時間安定化する3T3を播種されたマイクロリアクターの能力は、BM由来細胞を拡大するためのその検査についての強力な基礎を形成するが、細胞のこのプール内の重要な治療的関心は、造血幹および前駆区画である。このHSPC集団を評価するために、LSK表現型についてサンプリング時点をフローサイトメトリーにより分析した(図5A〜B)。結果は、3T3播種マイクロリアクターから全BMC集団内のLSK細胞の富化に向かう非常に強力な傾向を示す(図5A)。LSK数は、非間質支持骨髄と比較して、3T3支持により同様の様式で拡大された(図5B)。低間質用量デバイスを用いても同様の分析を行った(図9A〜9B)。このLSK富化能力は、2つのBMCに対して1つの3T3細胞のより高い用量を用いた場合にのみ見られた(図9A〜9Bおよび図5A〜B)。
次いで、全BMCのプール内の間質集団：LineagepositiveおよびLineagenegative細胞を評価した。興味深いことに、全BMC集団中のLineagepositiveおよびLineagenegative造血支持細胞の数において検出可能な変化は見られなかった(図5C〜D)。
結果：LSKは、3T3支持により、高められた固有の細胞循環を示す。
3T3播種マイクロリアクターを通って流すために使用された全BMCの間質区画内で差異は検出されなかったので、LSK集団の観察された富化は固有の変化の結果であることが推定された。そのため、マイクロリアクターの負荷の前に、全BMCを、CFSEでパルス化して、3T3支持に関連する固有の細胞循環パターンを調べた。図6Aは、分析されたLSKのCFSloプールを例示する。予想されるように、0〜1時間の時点でより少ないLSKが循環していた(図6B)。48および72時間のより遅い時点で、3T3がBMCを支持している場合に、有意に(48時間の時点のみが統計的に有意であった)大きなCFSEloであるLSKのプールがあった(図6B)。
これが、3T3播種リアクター内で拡大した全BM細胞の結果のためだけであったかどうかを評価するために、間質LineagepositiveおよびLineagenegative細胞の循環特性をさらに分析した(図6C〜D)。マイクロリアクター内の時間の増加に伴って、これらの細胞型の両方においてCFSE取り込みの段階的な増加が見られたが、間質支持有りおよび無しでBMCの間に差は見られなかった(図6C〜D)。
実施例2. 間葉間質細胞を使用した免疫細胞の再プログラム化の例。
間葉間質細胞(MSC)が間接的な共培養によりT細胞を不活性化し、それにより新規の抗炎症細胞組成物を生じ得ることを示すために、一連の実験を行った。MSCの用量、培養のタイミング、共培養の体積およびT細胞に起こる表現型変化は、インビトロ系における実施まで減少した。インビトロ系は、Transwell挿入と組み合わせた標準的な組織培養マルチウェルプレートを含んだ。T細胞をウェルの底に配置し、MSCをTranswell挿入内に配置した。Transwell挿入により、2つの細胞集団の間での分泌された因子の移動が可能になるが、直接的な細胞接触および相互作用の可能性は排除される。
MSCと共培養した場合(Transwell挿入を介して直接的または間接的)に、MSCは、活性化したT細胞(マイトジェン、CD3/CD28)のCD3+ T細胞増殖を低下させることが知られる。これはさらに、生成の差において観察され得、増殖的な生成における明確な減少は、MSCの存在下で培養されるT細胞により検出可能である。この機能は、用量依存的な機能を有することが示された。T細胞活性化マーカーはまた、増殖レベルとの良好な相関を示した。MSCは、用量依存的な様式で共培養条件において、CD38およびCD25(中間および後期マーカー)を低下し得た。T細胞活性化および増殖に関連して、MSCはまた、刺激下でT細胞セクレトームを変化させた。間接的な共培養の間に、前炎症性サイトカイン(TNFa、IL1b、IL17)の用量依存的な減少が観察された。
用量応答および体積
図10は、MSC:PMBC相互作用の用量応答および体積を例示する。MSC/PBMC相互作用は、用量依存的な様式で直接的に調節され得る。培養体積の変化は、増殖の結果に大きく影響することが示された。図10Aの群は以下のとおりである：群A：1.5M PBMC、0.8mL；群B：1.5M PBMC、1.6mL；群C：3.0M PBMC、0.8mL；群D：3.0M PBMC、1.6mL；群E：0.75M PBMCS、0.8mL。
MSC:PBMCタイミング
図11に示されるように、MSC存在の持続はPBMC増殖に大きく影響することが示された。
さらに、免疫増殖性効果が高められたが、MSCに特異的ではなかった。図12に示されるように、他の細胞型とのインキュベーションにより増殖の増加も明らかになった。
24時間BrefA PBMC
PBMCのブレフェルジンA処理は、MSCの有効性を減少させることが示され、これはクロストーク機構を示す。PBMCに対して24時間BrefA処理を行い、その結果を図13に示す。さらに、MSCのブレフェルジンA処理は、MSCの有効性を減少させることが示され、分泌された因子の治療的性質が支持された。MSCに対して24時間BrefA処理を行って、その結果を図14に示す。
ブレフェルジンA処理したMSCは、対照に対して機能の増加を示した。共培養の3時間前および1、2、3日目にMSCを処理し、その結果を図15に示す。
MSC:PBMCバイオリアクター
動的培養において、PBMCの動的フロー下で免疫抑制効果の増強が観察された。PBMC刺激の24時間後に共培養を行い、MSCが炎症性発作を救出する能力が示された。結果を図16に示す。
MSC:PBMC前刺激
炎症性の合図を有するMSCの許可(licensing)は、機能を有意には高めないことが示された。結果を図17に示す。
IFN-γは、1:10で良好な効果を有するサイトカインであることだけが見られる。1:50では、支配的な要因は、許可により克服され得ない細胞の数であることが示された。
増殖追跡
標準的なCFSE色素を使用して増殖追跡を行った。共培養の開始前に、PBMC集団をこの色素で染色した。細胞分裂時に、この色素は親集団と娘集団の間で分割されるので、全体的なシグナルの減少が生じる。これは、生成の増加につれて、シグナル強度の左方向へのシフトに容易に見られる(図18A)。これは、標準的なフローサイトメトリーにより容易に検出され得、個々の生成の検出を可能にする。
薬力学的モデルの例を図18A〜18Iに示す。図18Aは、CFSEに基づく増殖追跡の例を例示する。薬力学的モデルおよび管理式を図18B〜18Cに示す。任意の単位(a.u.)における面積に影をつけて、モデル化の結果を図18D〜Fに示す。モデルの予想の能力を図18G〜Iに示す。
図19A〜19Fは、MSC:PBMC共培養実験からのフローサイトメトリーデータを例示する。上段は、全増殖集団の発現を示す。下段は、それぞれ個々の増殖性生成の発現を示す。y軸は、標準化された増殖である。図19Aは、種々のMSC:PBMC比についてのCD3増殖のグラフである。図19Bは、種々のMSC:PBMC比についてのCD3生成のグラフである。図19CはCD4増殖のグラフである。図19DはCD4生成のグラフである。図19EはCD8増殖のグラフである。図19FはCD8生成のグラフである。図19A〜19Fにおいて、St=stim、Ct=対照、A=1:10、B=1:20、C=1:100、D=1:200、E=1:1000、F=1:2000。
図20A〜20Hは、MSC:PBMC共培養実験からのフローサイトメトリーデータを例示する。上段(図20A、20C、20Eおよび20Gを含む)は、全増殖集団の発現を示す。下段(図20B、20D、20Eおよび20Fを含む)は、それぞれ個々の増殖性生成の発現を示す。x軸は標準化された増殖であり、y軸は表面マーカー発現レベルである。図20Aは、種々のMSC:PBMC比についてのCD4増殖およびCD38発現のグラフである。図20Bは、高い直線性/相関を示すCD4増殖およびCD38発現のグラフである。図20Cは、種々のMSC:PBMC比についてのCD4増殖およびCD25発現のグラフである。図20Dは、高い直線性/相関を示すCD4増殖およびCD25発現のグラフである。図20Eは、種々のMSC:PBMC比についてのCD8増殖およびCD38発現のグラフである。図20Fは、高い直線性/相関を示すCD8増殖およびCD38発現のグラフである。図20Gは、種々のMSC:PBMC比についてのCD8増殖およびCD25発現のグラフである。図20Hは、高い直線性/相関を示すCD8増殖およびCD38発現のグラフである。図20A〜20F20Hにおいて、St=stim、Ct=対照、A=1:10、B=1:20、C=1:100、D=1:200、E=1:1000、F=1:2000。
図21A〜21Kは、分泌されたサイトカインの多重用量応答を例示する。図21Aは、種々のMSC:PBMC比についてのIFNaの応答を例示する。図21BはINFgの応答を例示する。図21CはIL1bの応答を例示する。図21DはIL1raの応答を例示する。図21EはIL4の応答を例示する。図21FはIL10の応答を例示する。図21GはIL12p40の応答を例示する。図21HはIL17の応答を例示する。図21IはIP10の応答を例示する。図21JはPGE2の応答を例示する。図21KはTNFaの応答を例示する。図21A〜21Kにおいて、St=stim、Ct=対照、A=1:10、B=1:20、C=1:100、D=1:200、E=1:1000、F=1:2000。
図19A〜21Kにおいて、St=stim、Ct=対照、A=1:10、B=1:20、C=1:100、D=1:200、E=1:1000、F=1:2000。
図22は、MSCへの暴露の時間に対する標準化されたPBMCの増殖のグラフである。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。MSC Transwell(登録商標)挿入は、共培養の開始の1、2および3日後、持続時間まで除去した。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定した。治療的MSCについての有意な持続時間は十分な応答を発揮するのに必要であった。潜在的なMSC用量で、4日のうち3日が必要であることが見出された。1および2日目に顕著な免疫抑制があるが、有意に低いレベルである。
図23A〜23Kは、MSCへの暴露の時間に対する標準化されたサイトカイン分泌の棒グラフである。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。MSC Transwell挿入は、共培養開始の1、2および3日後、持続時間まで除去された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定された。サイトカインプロフィールを調べることで、先のセクションのように、一致した関係が見られた。MSCへのより長い暴露は炎症性サイトカインのより大きい抑制を生じ、短い暴露についてはその逆であった。図23Aは、IFNaについての延長されたMSC暴露による増加を例示する。図23Bは、INFyについての延長されたMSC暴露による減少を例示する。図23Cは、IL1bについて延長されたMSC暴露により有意な変化がないことを例示する。図23Dは、IL1raについての延長されたMSC暴露によるわずかな増加を例示する。図23Eは、IL4についての延長されたMSC暴露による減少を例示する。図23Fは、IL10についての延長されたMSC暴露による減少を例示する。図23Gは、IL12p40について延長されたMSC暴露により有意な変化がないことを例示する。図23Hは、IL17についての延長されたMSC暴露による減少を例示する。図23Iは、IP10について延長されたMSC暴露により有意な変化がないことを例示する。図23Jは、PGE2についての延長されたMSC暴露による増加を例示する。図23Kは、TNFaについての延長されたMSC暴露による減少を例示する。
図24は、培養体積条件に対して標準化された増殖のグラフである。図24に示されるように、体積は、MSC能力を駆動する暗示的な微小環境要因である。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定された。共培養の体積の倍加は、MSCの能力を大きく減少することが見出された。
図25A〜25Kは、培養体積条件に対して標準化されたサイトカイン分泌の棒グラフである。図25A〜25に示されるように、体積は、MSC能力を駆動する暗示的な微小環境要因である。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定された。明確に、この効果は、固有因子の希釈による薬理学的効果により駆動される。興味深いことに、MSC前支配的要因に対して効果は見られず、両方の体積での同様に分泌されたレベルのためにこれらの特定の要因および潜在的なオートクライン制御の有効性の欠如が示された。前支配的なPBMC因子は2xに上昇され、MSC効果の欠如が示された。これはまた、MSCを許可するのに十分な初期サイトカインレベルの欠如を反映し得る。
図24〜25Kにおいて、S1=stim 1x vol、S2=stim 2x vol、C1=ctrl 1x vol、C2=ctrl 2x vol、M1=共培養1x vol、M2=共培養2x vol
図26は、タンパク質輸送阻害剤の使用により示されるような決定的なMSC:PBMC交差連絡を示す。PBMCまたはMSCのいずれかを、共培養の開始前にブレフェルジンAで24時間処理した。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定された。予想されるように、BAを用いたMSCの処理は治療的機能を破壊することが見出された。
図27A〜Kは、タンパク質輸送阻害剤の使用により示されるように、MSC:PBMC交差連絡が決定的であることを例示する。PBMCまたはMSCのいずれかを、共培養の開始の前にブレフェルジンAで24時間処理した。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定された。予想されるように、結果は、大きく低下したMSC分泌因子を示す。前炎症性因子の有意な増加も観察され、これは直接的に、MSC免疫抑制機能に従う。
図28は、PBMC:MSC共培養に対するブレフェルジンA処理の結果を示す。PBMCまたはMSCのいずれかを、共培養の開始前にブレフェルジンAで24時間処理した。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定された。PBMCのBrefA処理は大きく低下したMSC機能を生じることがさらに見出され、これはMSC許可の必要性を支持する。
図29A〜Kは、PBMC:MSC共培養に対するブレフェルジンA処理の結果を示す。PBMCまたはMSCのいずれかを、共培養の開始前にブレフェルジンAで24時間処理した。PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成された。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定された。ブレフェルジンA条件に対して標準化されたサイトカイン分泌の棒グラフ。PBMC前支配的因子の有意な抑制が見られ、これは免疫抑制の欠如をもたらす不十分なMSC許可を生じる可能性がある。
図30A〜30Dは、種々のバイオリアクター培養条件からの分泌された粒径分布を示す。図30Aは、刺激されたPBMC培養の粒子数を例示する。図30Bは、刺激されたPMBC培養の粒子数を例示する。図30Cは、刺激されたPBMC:MSC培養からの粒子数を例示する。図30Dは、刺激されたPBMC:MSC培養からの粒子数を例示する。NoMSC=刺激されたPBMC；B-M=刺激されたPBMC；PlusMSC=刺激されたPBMC+MSC；B+M=刺激されたPBMC+MSC。
実施例3. 停止フロー培養
PBMC(停止および連続_3、図31)および精製されたT細胞(連続_1および連続2、図31)を、50ng/mL CD3、50ng/mL CD28および50ng/mL IL-2で、336時間(14日)まで気体透過性細胞培養バッグ中で刺激した。培養条件は、RPMI 1640および10% FBSを使用して標準的な培養インキュベーター中、37Cおよび5% CO2であった。連続フローの再循環を、連続フロー培養の全持続時間中50〜100mLs/分で保持した。停止フロー培養は、トリパンブルー排除細胞計測の日の50〜100mls/分で5分の持続時間以外は静的培養で保持した(青色の線/点)。
図32A〜Bに示されるように、静的培養により凝集が可能になったが、フローの短いパルスの追加により、細胞のせん断誘導分散が生じた。これは、1)栄養分散の制限になり、それにより理想的でない細胞培養条件を生じ得る大きな凝集を減少するため；および2)大きくインタクトな細胞凝集では可能でない細胞計測を可能にするために有利であることが見出された。
実施例4. 停止フロー培養のための磁性ポンプ
気体透過性細胞培養バッグ中240時間(10日)まで、PBMC(磁性、図33)を、50ng/mL CD3、50ng/mL CD28および50ng/mL IL-2で刺激し、PBMC(蠕動、図33)を5μg/mL PHA-Lおよび100ng/mL IL-2で刺激した。磁性フローを導入して蠕動ポンプフローと比較した。種々の時点で細胞培養バッグから細胞計測を行った。収率は、連続磁性フローを使用して10日間後により大きくなることが見出された。蠕動フローにおいて、蠕動機構に関連する機械的な破壊のための細胞死の指標である有意な残骸が観察された。
実施例5. MSCエクソソーム、および純粋なMSCエクソソームに暴露されたPBMCにおいて発現されたmiRNA。
中空線維バイオリアクター中、PBMCを4日間の培養期間にわたりMSCエクソソームに暴露した。MSCを管腔外表面に播種して、PBMCを、50〜100mLs/分の流速で管腔内空間内に流した。培養を刺激して、炎症性環境を誘導した。
MSCエクソソーム内および培養期間にわたりMSCエクソソームに暴露したPBMC内で発現されたmiRNAの結果を3に示す。両方の列に示される数字はアッセイからのMFI(平均蛍光強度)を表し、試料中に存在するmiRNAの量を表す。上清：系においてMSCのみを用いたバイオリアクター実験の濃縮された試料。ペレット：系においてMSCおよびPBMCの両方を用いたバイオリアクター実験のPBMCペレット試料。
Figure 2021510510
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実施例6. Transwell作り変え系におけるプロデューサー細胞によるレンチウイルス粒子の転移
レンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来であり、該ウイルスを効果的な送達系にする。しかしながら、遺伝子材料を目的の細胞に送達するために該ウイルスを使用する前に、これらのウイルスの産生の通常の工程は、長い回収および定量プロセスを含む。プロデューサーHEK293T細胞がレンチウイルス粒子を産生し、同時にtranswell系において標的細胞に形質導入する(感染する)能力が示され、別々のウイルス回収および定量プロセスの必要性が打消された。それぞれの実験について、HEK293Tおよび標的細胞型の密度ならびにtranswell挿入の孔隙率の変形を評価して、接着および懸濁細胞の型について粒子産生速度と感染動力学の間の重要な関係を確認した。実験は、RFP構築物を用いて6日間、この系の制御下でヒトPBMCを作り変える能力を成功裡に示した。これらの試験は、標的ヒト細胞型の時機を得たかつ費用効果的な形質導入を容易にするために、トランスフェクション/形質導入プロセスを組み合わせ、より緊密に自動化する能力を示唆する。かかる試験は、ウイルス産生およびその後の細胞療法工学のための向上された製造系の変遷を提供し得る。
遺伝子工学および遺伝子療法の分野は、キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞を使用してX関連重度複合免疫不全(X-Linked Severe Combined Immunodeficiency) (SCID-X1)、血友病Bおよび血液悪性疾患の範囲のいくつかの障害における成功を増加した3種類の原発性ウイルスベクター系(アデノ随伴ウイルス(AAV)、γ-レトロウイルスおよびレンチウイルス)を使用している(Rogers et al., 2015；Hacein-Bey-Abina et al., 2014；Porter et al., 2011)。特にレンチウイルスベクターは、原発性免疫不全および神経変性性貯蔵症を含むまれな疾患の治療の別の分野でも使用されている(Mukherjee et al., 2013；Aiuti et al., 2013；Cartier et al., 2009；Biffi et al., 2013)。レンチウイルスは過去数十年にわたり使用され、最適化されており、分裂および非分裂細胞の両方を形質導入するそれらの能力、それらのより安全な組込みプロフィールならびに高いベクター力価で産生されるそれらの能力のために好ましいウイルスベクター系であり得る(Merten et al., 2016)。レンチウイルスベクターは、HIV-1骨格に基づかないおよびVSV-Gエンベロープタンパク質を有する擬似の型(pseudotyping)による強力な感染性に寄与し、大部分の哺乳動物細胞型について向上された向性およびウイルスベクターと標的細胞表面の間の直接的な接触を介した遺伝子材料の転移を可能にする(Durand et al., 2011；Farley et al., 2007)。
小規模のレンチウイルスベクター粒子産生の通常の方法は、>90%コンフルエントのHEK293T細胞の2D培養系への3または4のプラスミド追加、次いで細胞培養上清の回収プロセス、さらなる精製、定量および-80℃での保存を含む(Ausubel et al., 2012)。図36に示されるように、HEK293T細胞の最初の播種から、標的細胞型のその後の形質導入のために使用され得る時点までのプロセスは、使用される好ましい定量方法に基づいて、7〜10日の順序を採る(Ausubel et al., 2012；Geraerts et al., 2006)。レンチウイルスベクターを使用する、より多くの臨床試験が臨床的な承認、常套手段への変遷を受けるので、長い産生時間、試薬消費の最小化および過剰な手動操作の必要性を制限する細胞療法のための大規模な製造法が望ましい(Merten et al., 2016；Geraerts et al., 2006；Sheu et al., 2015；Gandara et al., 2018；Merten et al., 2010)。使用される現在の系では、ウイルス粒子はトランスフェクション時にそのピーク力価にはならず、トランスフェクションおよび形質導入のプロセスは2つの異なる事象として処理されるので、ウイルスは、目的の遺伝子を送達するためにすぐには使用されないことが意味される。対照的に、粒子の産生および標的細胞の即時の形質導入を可能にした単一の低い程度の製造系は、別々のウイルス回収および処理工程のための必要性を最小化し得る。レンチウイルスの産生および細胞への遺伝子の送達のための現在のアプローチは、製造プロセスの間の最終生成物(標的細胞)の滅菌性を維持しながら、産生されるウイルスの力価および量を最大化するために最適化を要求する。この系の重要性は、大規模な閉鎖系細胞工学製造プラットフォームへのより簡素化された移行を可能にしながら、組合せの可能性を制限することである。
この試験は、transwellに基づく設定の組み込みによる1工程レンチウイルス粒子産生および標的細胞形質導入系の能力を示した。transwellに基づく系の操作は、標的細胞療法生成物パラメーターへのさらなる洞察を提供し得、ここで粒子出力の制御およびその後の感染の多重度(MOI)は、挿入孔隙率および細胞密度などの種々の系のパラメーターにより決定され得る。ここで回収されるデータは、粒子出力およびその後の感染の最適範囲が、細胞療法生成物の要求に適合するためにtranswellに基づく系において接着および懸濁細胞の型の両方について決定され得ることを示唆する。さらに、トランスフェクションおよび形質導入の2つの重要なプロセスの組合せは、レンチウイルスベクターを使用したより時機を得たおよびコスト効果的な細胞製造法に関連する現在の問題の多くに対処し得る(Milone et al., 2018)。
レンチウイルス粒子分泌HEK293T細胞は、Transwell系において標的細胞に感染し得る。
レンチウイルス粒子の製造のための全ての細胞株であるHEK293T細胞を、45%コンフルエントで、0.4μm挿入中で播種し、その24時間後に、トランスフェクションの開始時に90%の最適な密度を達成するために、レンチウイルス粒子封入プラスミドを添加した。最初の実験では接着膵臓癌細胞(患者1319)および懸濁Jurkat T細胞を使用して、transwellに基づく系の実行可能性を評価した。標的細胞を播種し、その24時間後に、HEK293T細胞がレンチウイルス粒子の産生を開始する時点(図37A〜Eに示されるように24〜48日目)で25〜30%の所望の形質導入コンフルエントを達成するために、1.8x105細胞/mLで、6ウェルにプラスミドを添加した。プラスミド添加後0日目に、プレートを37℃および5% CO2のインキュベーターに戻した。24時間後、transwell挿入内の培地を回収培地(DMEM/F12のみ)に交換し、その後HEK293T細胞が子孫レンチウイルス粒子の産生を開始した時点(図37A〜Eの24〜72時間)で標準的なトランスフェクションプロコルを行った。48時間で、全てのプレートに8ug/mLポリブレン形質導入試薬を添加して、25℃、600rpmで90分間震盪し、懸濁Jurkat T細胞の標準的な回転接種(spinoculation)プロトコルを模倣し、その後インキュベーターに8〜12時間移した。その後、各ウェル中の標的細胞型について培地を完全成長培地に交換し、さらに48時間成長させた。次いで、1319およびJurkat T細胞のそれぞれに対応する図27C〜Dに、以下に示されるGFP発現についてのZEISS顕微鏡を使用して各ウェル中の形質導入を評価した。
異なる密度のHEK293Tおよび標的Jurkat T細胞
transwell中の標的細胞の形質導入の1回の確認を行い、標的細胞およびHEK293T細胞についての播種密度の変化を評価した。HEK293T細胞を播種し、翌日、プラスミドを添加して、トランスフェクションの日に90%、75%、60%、45%および30%の標的コンフルエントを達成した。Jurkat T細胞を播種して6ウェルの各ウェル中で形質導入の開始時に30%の最適密度を達成した。フローサイトメトリー(FACS)分析を使用して、標的Jurkat T細胞の形質導入効率に対するそれぞれの挿入におけるHEK293T細胞密度に対する影響を決定した。
ウェル中のJurkat T細胞密度も10%、20%、30%、40%および50%から変化させ、形質導入効率に対する影響を評価し、一方でHEK293T細胞は最適90%コンフルエントで挿入中に維持した。図38AはHEK293T細胞密度の変化を比較し、図38BはJurkat T細胞密度の変化を比較する。
トランスフェクションの時点で、挿入中90%コンフルエントで播種したHEK293T細胞は、最も高いレベルの粒子産生を示したので、その後の標的Jurkat T細胞の形質導入はウェルの底で行った。本発明者らは最大のGFP陽性細胞を見たが、図38Cに示されるようにtranswellのウェルの底にはさらなるHEKがあり、これは望ましくない副作用である。そのため、下流の適用のためにより低い密度、例えば挿入中45% HEK293T細胞は、図38Dにおけるものなどのより適切なものとして機能し得る。Jurkat T細胞は最初に10%コンフルエントで播種し、その後、形質導入は最大のGFP陽性細胞を示した。
Transwell挿入孔径の変化
操作のために選択される別の変改は、transwell挿入孔径であった。種々の孔径の挿入を使用して、理想的な形質導入コンフルエントでのHEK293T細胞およびJurkat T細胞を使用したtranswell系での形質導入効率に対する影響を評価した。孔隙率を0.4、1、3および8μmから変化された挿入を選択した。フローサイトメトリー分析を使用して、それぞれの群についての形質導入効率を決定した。結果を図39A1〜Cに示す。
0.4および1μmなどのより小さな孔径について、ウイルス粒子が同時に産生される場合にウイルス粒子が孔に詰まる可能性があり、ウェルにおいてウイルス粒子が透過し標的細胞を形質導入する能力が制限される。8μmについて、より高い形質導入効率が見られたが、より大きな孔径は膜を通るHEK293T細胞の透過を可能にし、理想的ではない。
ヒトPBMCの形質導入
transwell系が標的ヒト細胞型を形質導入する有効性を評価するために、ドナーPM由来のヒト末梢血単核細胞(PBMC)をCellTraceTM CFSE細胞増殖染色で染色し、その後、材料および方法のセクションに記載されるように播種した。細胞を刺激し、1日後にトランスフェクションを開始し、3日後にPHAおよびIL-2を使用した形質導入を開始した。フローサイトメトリーを使用して、transwellに基づく系を使用したPMBCの形質導入効率および増殖能力を決定した。形質導入を増殖の蛍光と区別するためにRFP構築物を使用した。
議論
この作業において、本発明者らは、transwellに基づく細胞工学系が、HEK293T細胞に、レンチウイルス粒子を産生させ、同時に細胞操作および試薬使用が最小である1系様式において標的接着1319膵臓細胞癌細胞および懸濁Jurkat T細胞ならびにPBMCを形質導入し得るかどうかを調べた。
現在の精製プロトコルの多くはウイルスを濃縮するための超遠心分離の使用を含むが、これらの方法を用いると規模の制限があり、これは時間を消費し、しばしばウイルスと共に、その後に免疫原性反応を引き起こすかまたは形質導入を妨害し得る不純物が濃縮される。一連の微小ろ過工程はしばしば、濾過に関連する粒子の減衰を最小化するための一連のフィルターの孔径の減少に基づいて使用される。タンジェンシャルフロー濾過(TFF)は代替物を提供し、レンチウイルスを成功裡に濃縮および部分的に精製するために適用され得、これは以前に記載された方法よりも大規模化可能であり効率的である。この報告において、これらの戦略のいくつかは、1アプローチ系において取り扱われる。粒子力価消失に関連する影響および現在実行されるいくつかの処理条件のための損傷を完全に除去するために、HEK293T細胞を使用して連続的に高力価のレンチウイルス粒子を産生し、すぐに標的細胞と接触させた。多孔質transwell膜の使用により、粒子が透過する程度が制御され得、望ましくなくかつ固定され得る上部のHEK293T細胞も膜を透過することの原因となる孔隙率を特定した。
現在、さらなる下流の処理のためのウイルス回収は、プラスミドをHEK293T細胞に添加した後の2つの異なる時点でなされ得、これはトランスフェクションの48および72時間後に起こる。回収プロセスの間に、HEK293T細胞の多くは破壊されてプレートは上清を有したまま残り、FBSを培地から除去し、回収(DMEM/F12のみの培地)に交換することでHEK293T細胞は容易に除去されるので、そのために回収の第2ラウンドは、ウイルス粒子を産生している理想よりも少ないHEK293T細胞数を含む。3日後、上清は低い体積の乏しい質のウイルス粒子を含み得るので、さらなる回収をするべきでないことが推奨され得る。この試験により、形質導入のために標的細胞と即座に接触され得る高品質のレンチウイルスの連続的な産生のための方法が確立された。
この試験において、transwellに基づく系においてヒトJurkat T細胞の成功裡の形質導入が示された。さらに、PBMCを使用して、transwellに基づく系が、下流の臨床設定に使用され得る標的ヒト細胞を作り変える能力を評価した。
材料および方法
ベクター作製
レンチウイルスベクターの作製は、SV40大T抗原の変異型を発現するヒト293T腎臓線維芽細胞株(HEK293T)(ATCC: CRL-3216)を使用して達成し、それぞれの実験に応じて、細胞挿入物中およびウェル中に種々の密度で播種した。レンチウイルス転移ベクターpLVEC-EFNB1-Fc-IRBは、Rick Cohenからの贈り物であり、GFPまたはRFPレポーター遺伝子を含んだ。エンベローププラスミドpMD2.Gを発現する封入プラスミドpsPAX2およびVSV-Gを、DMEM/F12 (Gibco)+10% FBS (Gibco)+1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)の存在下でトランスフェクションのために使用した。形質導入は、対応する培地中(以下に詳述)、37□Cで特定の長さの時間、8ug/mLポリブレン(Millipore Sigma)の存在下で起こった。
細胞培養
HEK293Tおよび1319細胞を、10% FBS (Gibco)および1% Pen/Strep (Gibco)を添加したDMEM/F12 (Gibco)で成長させた。Jurkat細胞およびPBMCを、10% FBS (Gibco)および1% Pen/Strep (Gibco)を有するRPMI-1640培地(Gibco)で培養した。PBMCを、増殖についてCFSE染色を使用して染色し、PHAおよびIL-2を使用して刺激した。
PBMC染色
PBMCは、1mL当たり2〜4,000,000細胞の密度で2mL合計の細胞毎に1uL CFSE合計を合わせて、増殖についてCellTraceTM CFSEを使用して染色した。細胞を、15mL円錐形チューブ中、1700rpmで5分間遠心分離して落とし、5mLのPBSに再懸濁した。3uLのCFSEを添加して混合し、チューブを金属箔で覆い、室温で5分間インキュベートした。2mLの培地をチューブ内の細胞懸濁物の上部に添加して、再構成し、チューブを5分間、再度スピンダウンした。細胞ペレットから上清を除去した後5mLのPBSで1回、細胞を簡単にすすぎ、細胞を5分間、3回目のスピンダウンに供した。上清を培地で置き換え、細胞計測を行い、細胞を、3.3x10^6細胞で6ウェル中、3mL内にプレーティングした。
PBMC刺激
フィトヘムアグルチニン(PHA)およびIL-2を使用して、PBMCを刺激して、増殖させた。簡潔に、3uLのPHA(1000ng/mL)および6uLのIL-2(100ng/mL)を各ウェルに添加して、緩やかに混合し、同日にHEK293T細胞を各挿入中に播種した。
Transwell系
Transwell挿入はGrenier Bio-Oneから入手して、8、3、1および0.4μmの孔径のサイズの範囲であった。膜はポリエチレンテレフタレート(PET)で作製され、サイズに応じて半透明または透明のいずれかであった。挿入についての培養表面積は平均で456.05mm2であった。
フローサイトメトリー
標的細胞のレンチウイルス形質導入は、BDFacsCanto II (BD Biosciences)およびFlow Joソフトウェアを使用してGFP発現により分析した。各実験について1試料当たり10,000事象を回収した。非生存細胞は分析から排除した。
蛍光顕微鏡検査
ZEISS顕微鏡を使用して、緑色蛍光タンパク質(GFP)または赤色蛍光タンパク質(RFP)マーカーの発現について試料を定性的に分析した。
実施例7. PBMC増殖
PBMC増殖は、4日間のConAおよびIL2での刺激により達成した。試験のタイムラインを例示する模式図を図40に示す。増殖は、フローサイトメトリーおよびCFSE染色により測定した。
用量応答に関する結果を図41および42に示す。MSC:PBMC比は、用量応答様の曲線を示す。NHDFは免疫抑制性の能力を示すが、MSCより低い。
T細胞増殖に対する共培養の効果に関する結果を図43に示す。ECまたはMSCを、PBMCに対して1:10の比で150k/ウェルで培養した。用語EGM-2は、EGM-2 EC細胞培地を表す。略語50/50は、EGM-2+PBMC培地(50/50混合物)を表す。略語ECは、内皮細胞を表す。略語Mは、間葉幹細胞を表す。略語EC_Mは、150k ECSおよび150k MSCを表す。EC単独は、適度な免疫調節効果を示す。MSCは、有意な免疫抑制を示す。EC+MSCは、MSC単独に対してわずかな向上のみを示す。
T細胞増殖に対するEC表現型の効果に関する結果を図44に示す。ECを、PBMCに対して1:10の比で、150k/ウェルで培養した。粥状性(atheroprone)と粥状保護性(atheroprotective)のEC表現型の間で観察可能な差はなかった。両方は、免疫抑制性の表現型を示す。
NHDF(皮膚線維芽細胞)、HepG2(肝臓)およびEA.hy296(内皮)とのPBMC共培養の標準化された増殖性応答を示す結果を図45に示す。非MSC細胞は、MSCと比較して、PBMC増殖を抑制する有意に低減された能力を示す。HepG2およびEA.hy296細胞は、興味深いことに、高められた増殖を示す。
参照文献
Figure 2021510510
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本明細書に引用される全ての特許、公開出願および参照文献の教示は、それらの全体において参照により援用される。
例示態様が特に示され、記載されるが、添付の特許請求の範囲に包含される態様の範囲を逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更が本発明においてなされ得ることが当業者に理解される。

Claims (60)

  1. 応答体細胞集団；
    刺激体細胞集団、該応答体細胞集団および刺激体細胞集団は容器内に配置される；
    応答体細胞集団を刺激体細胞集団から物理的に分離するように構成される障壁、該障壁は、刺激体細胞集団の分泌された因子に対して透過性である；ならびに
    応答体細胞集団および刺激体細胞集団の少なくとも1つを含む懸濁液のフローを容器を通って誘導するように構成される流体フロー駆動体
    を含む、共培養系。
  2. 障壁が半透過性膜である、請求項１記載の系。
  3. 障壁がゲルである、請求項１記載の系。
  4. 応答体細胞集団および刺激体細胞集団の少なくとも1つがゲル内に配置される、請求項３記載の系。
  5. ゲルがヒドロゲルである、請求項３記載の系。
  6. 障壁がカプセルであり、応答体細胞集団および刺激体細胞集団の1つがカプセル内に配置される、請求項１記載の系。
  7. 障壁が中空線維膜を含む、請求項１記載の系。
  8. 応答体集団および刺激体集団の1つが中空線維膜の管腔内空間に配置される、請求項７記載の系。
  9. 刺激体細胞集団が、約1〜約1,000,000細胞/cm2の密度で中空線維膜の管腔外空間に配置される、請求項７記載の系。
  10. 流動フロー駆動体が、懸濁液の不連続フローを誘導するように構成される、請求項１〜９いずれか記載の系。
  11. 流体フロー駆動体が、懸濁液のパルスフロー(pulsed flow)を誘導するように構成される、請求項１〜１０いずれか記載の系。
  12. パルスフローが少なくとも約10秒の持続時間を有する、請求項１１記載の系。
  13. パルスフローが約10秒〜約5分の持続時間を有する、請求項１１記載の系。
  14. パルスフローが少なくとも約2時間の頻度で適用される、請求項１１〜１３いずれか記載の系。
  15. パルスフローが約2時間〜約24時間の頻度で適用される、請求項１１〜１３いずれか記載の系。
  16. 応答体細胞が約0.1%〜約21%の酸素分圧で維持される、請求項１〜１５いずれか記載の系。
  17. 障壁が約30kDA〜約100,000kDAの分子量カットオフ(MWCO)を有する、請求項１〜１６いずれか記載の系。
  18. 障壁が約5000kDAの分子量カットオフ(MWCO)を有する、請求項１７記載の系。
  19. 障壁が約0.00001μm〜約0.65μmの孔径を有する、請求項１〜１８いずれか記載の系。
  20. 障壁が約0.5μmの孔径を有する、請求項１９記載の系。
  21. 刺激体細胞が、間質細胞、ウイルス封入細胞、抗原暴露細胞、未熟血液細胞、微生物細胞、内皮細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、癌細胞およびニューロンからなる群より選択される、請求項１〜２０いずれか記載の系。
  22. 刺激体細胞が組織内に配置される、請求項１〜２１いずれか記載の系。
  23. 応答体細胞が、末梢血細胞、単核細胞、免疫細胞、骨髄細胞、血小板および赤血球細胞からなる群より選択される、請求項１〜２２いずれか記載の系。
  24. 応答体細胞が白血球である、請求項２３記載の系。
  25. 応答体細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項２３記載の系。
  26. 分泌された因子が核酸である、請求項１〜２５いずれか記載の系。
  27. 核酸が、mRNA、マイクロRNA、環状RNAおよびDNAからなる群より選択される、請求項２６記載の系。
  28. 分泌された因子が、成長因子、ケモカインおよびサイトカインからなる群より選択される、請求項１〜２５いずれか記載の系。
  29. 刺激体細胞が間葉幹細胞であり、応答体細胞がT細胞である、請求項１〜２３いずれか記載の系。
  30. 分泌された因子がエクソソームに含まれる、請求項１〜２９いずれか記載の系。
  31. エクソソームが応答体細胞によりエンドサイトーシスにより取り込まれる、請求項３０記載の系。
  32. 応答体細胞集団が、刺激体細胞集団の分泌された因子に少なくとも1時間暴露される、請求項１〜３１いずれか記載の系。
  33. 応答体細胞集団が、刺激体細胞集団の分泌された因子に約1時間〜約21日間暴露される、請求項１〜３１いずれか記載の系。
  34. 細胞を改変する方法であって、
    応答体細胞集団を、刺激体細胞集団の分泌された因子に暴露する工程、該応答体細胞集団および刺激体細胞集団は容器内に配置され、該分泌された因子は、応答体細胞集団と刺激体細胞集団を分離する障壁を通してかん流される；ならびに
    容器内の応答体細胞集団および刺激体細胞集団の少なくとも1つを含む細胞培養培地のフローを誘導する工程、ここで該応答体細胞集団は、分泌された因子への暴露後に改変され、それにより改変された細胞が産生される、
    を含む、方法。
  35. 暴露が少なくとも1時間起こる、請求項３４記載の方法。
  36. 暴露が約1時間〜約21日間起こる、請求項３４記載の方法。
  37. 曝露が約40時間〜約100時間起こる、請求項３４記載の方法。
  38. 細胞培養培地のフローの誘導が不連続に起こる、請求項３４〜３７いずれか記載の方法。
  39. 細胞培養培地のフローがパルス化される、請求項３８記載の方法。
  40. パルスが、少なくとも約10秒の持続時間を有する、請求項３９記載の方法。
  41. パルスが、約10秒〜約5分の持続時間を有する、請求項３９記載の方法。
  42. 実質的に静的な条件下での応答体細胞集団および刺激体細胞集団の少なくとも約2時間の維持の後にパルスを適用する工程をさらに含む、請求項３９記載の方法。
  43. 実質的に静的な条件下での応答体細胞集団および刺激体細胞集団の約2〜約24時間の維持の後にパルスを適用する工程をさらに含む、請求項３９記載の方法。
  44. 応答体細胞集団および刺激体細胞集団の少なくとも１つを中空線維膜の管腔内空間に配置する工程をさらに含む、請求項３４〜４３いずれか記載の方法。
  45. 約1〜約1,000,000細胞/cm2の密度で、刺激体細胞集団を中空線維の管腔外空間に配置する工程をさらに含む、請求項３４〜４４いずれか記載の方法。
  46. 応答体細胞を約0.1%〜約21%の酸素分圧で維持する工程をさらに含む、請求項３４〜４５いずれか記載の方法。
  47. 再プログラム化された細胞の集団を含む組成物であって、該再プログラム化された細胞が：
    a)異なる細胞集団に由来する生体分子を含む、
    b)再プログラム化された細胞の親集団とは異なる1つ以上のさらなるもしくは改変された機能的活性を発揮する、または
    c)それらの組合せ
    である、組成物。
  48. 再プログラム化された細胞が、親集団により発現されない細胞表面マーカーを発現する、請求項４７記載の組成物。
  49. 再プログラム化された細胞が、間質細胞の核酸を含む免疫細胞を含む、請求項４７または４８記載の組成物。
  50. 再プログラム化された細胞が、間質細胞の核酸を含む造血幹細胞を含む、請求項４７または４８記載の組成物。
  51. 再プログラム化された細胞が白血球を含む、請求項４７または４８記載の組成物。
  52. 再プログラム化された細胞が、インビトロにおいて改変されたT細胞集団活性を有する、請求項４７または４８記載の組成物。
  53. 組成物を必要とする患者に、請求項４７〜５２のいずれか規定の組成物を投与する工程を含む、方法。
  54. 患者が、表2に列挙される徴候を有する、請求項５３記載の方法。
  55. 患者が自己免疫障害を有する、請求項５３記載の方法。
  56. 患者が移植を受けたことがある、請求項５３記載の方法。
  57. 患者が炎症性疾患を有する、請求項５３記載の方法。
  58. 組成物が静脈内投与により送達される、請求項５３〜５７いずれか記載の方法。
  59. 組成物が局所投与により送達される、請求項５３〜５７いずれか記載の方法。
  60. 組成物が、約5,000,000〜約1,000,000,000の再プログラム化された細胞の用量を含む、請求項５３〜５９いずれか記載の方法。
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