JP2021168647A - 病原体検出法 - Google Patents
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Abstract
【課題】時間がかからず、制限のない、病原体検出のための方法を提供する。【解決手段】一態様として、相互作用剤２０７Ｂを含む培養室に生体試料を適用し、培養室内の生体試料に電気的に結合されたセンサを駆動し、センサからの電気信号を測定し、電気信号に基づいて生体試料の病原体関係情報を取得する動作を含む、病原体２０７Ａ検出のための方法であって、一実施形態では、センサからの電気信号を測定することが、所定の期間にわたってトランジスタのドレイン電流を測定することを含む、方法である。【選択図】図２
Description
相互参照
本出願は、２０２０年３月３０日に出願された出願番号６３／００１，９３８の先願の米国仮出願の利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
本出願は、２０２０年３月３０日に出願された出願番号６３／００１，９３８の先願の米国仮出願の利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
技術分野
本発明は、生体試料の検出と治療法の提案に関するもので、より詳細には、病原体検出のための方法、ならびに関連する治療法の開発および医師のための提案に関する。
本発明は、生体試料の検出と治療法の提案に関するもので、より詳細には、病原体検出のための方法、ならびに関連する治療法の開発および医師のための提案に関する。
微生物の同定は臨床的に重要である。微生物の同定の従来の手順は、培地を用いて試料を数日間培養し、微生物の形態ならびに組成を観察し、任意でより多くの試験を行うことである。さらに、薬物感受性および効果的な投与量の分析は、感染の治療において重要な役割を果たす。薬物感受性分析の従来の手順は、候補薬物を微生物培養物に適用し、増殖抑制が現れるかどうかを観察することであり、これは結果を得るのに数週間もかかる。現在、分光法は、培養培地の濁度に基づく微生物増殖観察を補助するために利用されている。スペクトルの感受性に起因して、シグナルは、微生物の数が１０８ｃｆｕ／ｍＬに達したとき、通常は培養の１６〜４８時間後にのみ検出され得る。別の局面において、ポリメラーゼ連鎖反応およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦはまた、正確な微生物同定に適用される。しかしながら、このような技術は、薬物感受性分析において使用することができない。
病原体同定および薬物感受性分析の現在の手順は、時間がかかり、そして制限される。
一態様では、本開示は、相互作用剤を含む培養室に生体試料を適用し、培養室内の生体試料に電気的に結合されたセンサを駆動し、センサからの電気信号を測定し、電気信号に基づいて生体試料の病原体関係情報を取得する動作を含む、病原体検出のための方法を提供する。
本開示の一実施形態では、センサからの電気信号を測定することは、所定の期間にわたってトランジスタのドレイン電流を測定することを含む。
本開示の一実施形態では、生体試料の病原体関係情報を取得することは、所定の期間中のドレイン電流における少なくとも１つの一過性の変化（a blip）の存在を判定することを含む。
本開示の一実施形態では、所定の期間は約１２時間未満である。
本開示の一実施形態では、複数の培養室に生体試料を適用することは、１００μＬ当たり１００未満のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有する生体試料を適用することを含む。
本開示の一実施形態では、上記一過性の変化は、ドレイン電流において統計的に区別可能な信号である。
本開示の一実施形態では、相互作用剤は、胞子発芽を引き起こす薬剤、酸化的ストレスを引き起こす薬剤、化学的損傷または酵素破壊を引き起こす薬剤、栄養欠乏を引き起こす薬剤、ＵＶ照射、バクテリオファージ、抗生物質、必須イオン欠乏を引き起こす薬剤、酵素、放射線、または加熱を含む。
本開示の一実施形態では、培養室のうちの２つは同一の相互作用剤を含み、異なる投与量または強度を有する。
本開示の一実施形態では、培養室のうちの２つは異なる相互作用剤を含む。
本開示の一実施形態では、病原体関係情報が病原体の存在、相互作用剤に対する病原体の感受性、病原体の耐性を誘導するのに充分な相互作用剤の投与量、病原体の活性を抑制するのに充分な相互作用剤の投与量、および病原体の指紋特性を含む。
本開示の一実施形態では、病原体の指紋特性には、病原体が、生きているか死亡んでいるか、活性であるか休眠しているか、伝染性であるか非伝染性であるか、または休眠、発芽、増殖、栄養、停滞、定常、または死亡を含む相のうちの１つにあることが含まれる。
本開示の一実施形態では、生体試料が体液、血液、またはそれらの組み合わせを含む。
本開示の一実施形態は、少なくとも１つの一過性変化が電流中に存在する場合、さらに、単調増加する相互作用剤投与量の広がりテストを実施すること、または、異なる相互作用剤を適用して、生体試料中の病原体が相互作用剤のうちの１つに対して耐性であるかもしくは感受性であるかを判定することを含む。
本開示の一実施形態は、一過性変化が電流中に存在しない場合、さらに、単調減少する相互作用剤投与量の広がりテストを実施すること、または、異なる相互作用剤を適用して、生体試料が病原体を含まないか、もしくは病原体が相互作用剤のうちの１つに感受性であるかどうかを判定することを含む。
本開示の一実施形態では、単調増加する相互作用剤投与量の広がりテストまたは単調減少する相互作用剤投与量の広がりテストはそれぞれ、相互作用剤のうちの１つの最小阻害濃度（ＭＩＣ：minimum inhibitory concentration）の投与量を含む。
一態様では、本開示はまた、生体試料を病原体検出チップに適用すること；ここで、チップは、生体試料を収容するように構成された培養室と、培養室に電気的に結合されたセンサと、センサから電気信号を取得するように構成されたリーダとを含む；センサを駆動すること；リーダを通してセンサからの電気信号を測定すること；電気信号に基づいて生体試料の病原体関係情報を取得することを含む、病原体検出のための方法を提供する。
本開示の一実施形態では、生体試料を病原体検出チップに適用することは、生体試料を、培養室に電気的に結合されたセンサの固体表面に接触させることを含む。
本開示の一実施形態では、病原体検出チップは、培養室へまたは培養室内で生体試料を接種し、濃縮し、希釈し、または濾過するように構成されたマイクロ流体構造をさらに含む。
本明細書で別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。用語の意味および範囲は明らかであるべきであるが、潜在的な曖昧さがある場合には本明細書で提供される定義が任意の辞書または外部定義よりも優先される。
文脈上別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。例えば、本明細書で使用される用語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上として定義される。
以下の説明では、特許請求される主題の理解を容易にするために、いくつかの用語が使用され、以下の定義が提供される。本明細書で明確に定義されていない用語は、それらの単純な意味および通常の意味に従って使用される。
本明細書で使用されるように、特許請求の範囲における「または」という用語は代替のみを指すことが明示的に示されない限り、「および／または」を意味するために使用されるか、または代替は相互に排他的である。
本明細書中で使用される場合、用語「病原体」は、感染または感染性疾患を引き起こす微生物をいう。好ましくは、病原体は単細胞生物である。より好ましくは、細胞は微生物である。微生物の例としては、古細菌、ウイルス、細菌および真核生物（例えば原生生物、真菌および植物）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本開示による病原体は培養可能である。別の態様において、本開示による病原体は、単離されるか、単離されないか、または部分的に単離される。
本明細書中で使用される場合、用語「病原体検出」は、病原体種を他のものから区別するための特定の特徴を検出するためのプロセスをいう。いかなる理論によっても限定されることを意図しないが、各病原体種は特定の成長パターンを有し、対応する代謝産物は検出可能で特異的な電気信号を生成し、培養過程中に電気信号を収集することによって、病原体を同定する指紋パターンを得ることができると考えられる。
本明細書中で使用される場合、用語「生体試料」は、病原体を含む試料をいう。本開示による生体試料は、天然に存在する起源に由来するか、または人工操作に由来する。好ましくは、生体試料は、被験体または患者、抽出物、体液、組織生検、液体生検、または細胞培養などの天然起源に由来する。好ましくは、生体試料は、培養培地または食品組成物のような人工操作に由来する。別の態様において、生体試料は、検出の反応に従って処理される。例えば、生体試料のｐＨ値やイオン強度を調整してもよい。本開示の１つの好ましい実施形態において、生体試料は、体液、血液、またはそれらの組み合わせである。
本明細書で使用されるように、用語「被験体」および「患者」は、本明細書で交換可能に使用され、温血動物、特に哺乳動物を指すと理解される。この用語の範囲および意味に含まれる動物の非限定的な例は、モルモット、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、動物園動物、非ヒト霊長類、およびヒトを含む。好ましくは、被検体は感染患者であると疑われる。より好ましくは、被検体は、敗血症（sepsis）の疑いのある患者である。
本明細書で使用するとき、用語「相互作用剤（an interacting agent）」は病原体と相互作用するか、または病原体の成長にストレスを引き起こす薬剤を指す。本明細書で使用するとき、用語「病原体の成長（growth of a pathogen）」は、培養期間の前後の病原体培養の差を指す。相違の例としては細胞数、細胞増殖速度、代謝量、相、または段階が挙げられるが、これらに限定されない。成長の例としては生存または死亡、活性または休眠、伝染性または非伝染性、成長相変化、休眠成長、発芽、増殖（outgrowth）、または栄養増殖（vegetative growth）が挙げられるが、これらに限定されない。本開示による方法は、病原体数または成長速度を検出することができるだけでなく、病原体増殖のいくつかの状態を検出することもできる。相互作用剤の例としては、胞子発芽を引き起こす薬剤、酸化的ストレスを引き起こす薬剤、化学的損傷または酵素破壊を引き起こす薬剤、栄養欠乏を引き起こす薬剤、ＵＶ照射、バクテリオファージ、抗生物質、必須イオン欠乏を引き起こす薬剤、酵素、放射線、または加熱が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の細菌は、環境破壊のような極度なストレスを受けた際に、細胞の遺伝物質を保存するために、休眠性で高度に耐性のある細胞をつくるため胞子を形成することがある。そして、用語「胞子発芽」は、胞子特有の性質の喪失をもたらす事象を意味する。酸化的ストレスを引き起こす薬剤の例としては、過剰な鉄またはフリーラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。栄養欠乏を引き起こす相互作用剤の例としては、リン酸塩欠乏を引き起こす薬剤またはアミノ酸欠乏を引き起こす薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。必須イオン欠乏を引き起こす薬剤の例としては、生体試料中のＣａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｎａ、またはＭｎを除去するためのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。抗生物質としての相互作用する薬剤の例としては、アモキシシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、ドキシサイクリン、セファレキシン、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、メトロニダゾール、アジスロマイシン、スルファメトキサゾール、トリメトプリム、クラブラン酸、またはレボフロキサシンが挙げられるが、これらに限定されない。
「病原体関係情報」の例には、病原体の存在、相互作用剤に対する病原体の感受性（susceptibility）または感受性（sensitivity）、病原体の耐性を誘導するのに充分な相互作用剤の投与量、病原体の活性を抑制するのに充分な相互作用剤の投与量、または病原体の指紋特性が含まれるが、これらに限定されない。病原体の指紋特性の例には、病原体が、生きているか死亡んでいるか、活性であるか休眠しているか、伝染性であるかまたは非伝染性であるか、休眠、発芽、増殖、栄養、停滞、定常、または死亡を含む相のうちの１つにあることが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、用語「相互作用剤に対する病原体の感受性」は、病原体の薬剤に対する感受性をいう。言い換えれば、本開示による方法は、相互作用剤が病原体の増殖に影響を及ぼす（例えば、病原体の増殖を抑制または阻害する）かどうかをスクリーニングするために提供される。
電気信号の測定を容易にするために、試料は、好ましくは固体表面と接触する。本明細書で使用される「固体表面」という用語は、シリコン、酸化ケイ素、ポリマー、紙、織物、またはガラスを含むが、これらに限定されない固体支持体を指す。好ましくは、固体表面は電気センサまたは電磁センサである。好ましくは、使用される固体表面は、以下に述べるように、電位変化検出素子に応じて変化する。例えば、方法が電気的変化を検出するために電界効果トランジスタを採用する場合、固体表面は電界効果トランジスタのトランジスタ表面であり、方法が表面プラズモン共鳴を採用する場合、固体表面は、表面プラズモン共鳴の金属表面である。
好ましくは、固体表面は、電気信号の変化を検出するための電気信号検出素子と結合される。いくつかの実施形態では、電気信号検出素子は、電界効果トランジスタ又は表面プラズモン共鳴装置、ＣＭＯＳイメージセンサ、裏面照明センサ、又は有機若しくは非有機小型化電極である。好ましくは、電界効果トランジスタは、ナノワイヤ電界効果トランジスタまたはナノプレート電界効果トランジスタである。
本発明の好ましい実施形態では、固体表面の材料は、シリコン、好ましくは多結晶シリコンまたは単結晶シリコン、より好ましくは多結晶シリコンである。多結晶シリコンは単結晶シリコンより安価であるが、多結晶シリコン中の粒界が電子伝達移動度を妨げる可能性がある。このような現象は、固体表面の不均一や定量化を困難にする。さらに、イオンが多結晶シリコンの粒界に侵入し、溶液中の検出不良を引き起こす可能性がある。さらに、多結晶シリコンは空気中では安定ではない。しかしながら、上述の欠点は、本開示による方法の機能を妨害しない。
本明細書中で使用される場合、用語「電気信号の変化」は、培養の過程の間の細胞培養物の電気信号の変化をいう。本開示による電気信号の変化は、電流または差動電流の変化を含むが、これらに限定されない。電気信号の変化は、適切な電子デバイスまたはシステムを使用して測定することができる。電気信号の変化は、電荷の変化、電流の変化、電気抵抗の変化、閾値電圧の変化、電気伝導率の変化、電場の変化、電気容量の変化を含むが、これらに限定されない。好ましくは、電気信号の変化は、電界効果トランジスタの閾値電圧の変化であり、したがって、差動ドレイン電流を測定することができる。
いかなる理論によっても限定されることを意図しないが、本明細書に記載される病原体検出のための方法を使用して病原体を検出する感度は、１００μＬあたり１００コロニー形成単位（ＣＦＵ）未満と低くてもよく、培養の数時間しかかからない（例えば、１２時間未満）と考えられる。病原体の増殖に対する相互作用剤の感受性は、比較的低濃度の病原体で迅速に同定できる。
図１を参照すると、図１は、本開示のいくつかの実施形態による病原体検出チップ１０の断面を示す。図１に示すように、病原体検出チップ１０は、担体１０３（例えば、回路基板または半導体製造に適合する任意の基板）上に配置された培養室１０１を含む。培養室１０１は、培養培地１０７と、培養培地１０７に浸漬または部分的に浸漬された検知チップ１０５とを収容するように構成されている。前述のように、培養培地１０７は、感知チップ１０５の固体表面と接触して、電気信号を生成する。いくつかの実施形態では、固体表面が、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）またはＢｉｏ−ＦＥＴのソース、ドレイン、チャネル、またはパッシベーション層を指すことができる。感知チップ１０５は、少なくとも生体試料および／または相互作用剤から構成される培養培地１０７と直接接触するように工夫される。参照電極１０９は、培養培地１０７に所望のバイアスを印加するために、参照電極１０９が培養培地１０７と接触し得るように一体化される。いくつかの実施形態では、参照電極１０９は、ＡｇまたはＡｇＣｌなどの金属から構成することができる。感知チップ１０５に電気的に接続されたリーダ１１０は、ＦＥＴの固体表面と培養培地１０７との間の相互作用の結果として感知チップ１０５によって生成された電気信号を所定の期間にわたって読み取るように構成される。いくつかの実施形態では、リーダ１１０は、担体１０３内の導電性接続（例えば、プリント回路基板内の導電性トレースまたは半導体製造に適した基板内の再分配層）を介して、感知チップ１０５に電気的に接続される。
図２を参照すると、図２は、本開示のいくつかの実施形態によるセンサ２０の概略図を示す。図２に示すように、センサ２０は、半導体層２００内にソース２０１及びドレイン２０２のような導電性領域を有するトランジスタ、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）又はバイオＦＥＴを含む。チャネル領域は、ソース２０１とドレイン２０２との間に配置されてもよい。本明細書に記載される第１のゲート２０９またはフロントゲートは、培養培地２０７と接触し、本明細書に記載される第２のゲート２０９’またはバックゲートは培養培地２０７と接触しない。図２に例示されるように、培養培地２０７は、生体試料２０７Ａと、生存ストレスまたは生命ストレスを生体試料２０７Ａに課す相互作用剤２０７Ｂとを含む。生体試料２０７Ａは、体液、血液、汗、尿、またはそれらの組み合わせの形態であり得る。生体試料２０７Ａは、少なくとも１つのタイプの細菌を含み得る。ある実施形態において、相互作用剤２０７Ｂは、抗生物質、酵素、鉄、フリーラジカル、リン酸塩、アミノ酸、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤を含み得る。いくつかの実施形態では、相互作用剤２０７Ｂは、化学物質ではなく、放射線または熱などのエネルギーの形態であってもよい。選択的に、パッシベーション層２０３は半導体層２００の表面の一部を覆い、培養培地２０７と接触する半導体層２００の別の部分を露出させるように配置されることができる。
図２に示すように、フロントゲート電圧Ｖｇｓ−ｆｇ及びバックゲート電圧Ｖｇｓ−ｂｇを設定することができる。ドレイン電圧Ｖｄｓは、電気信号としてドレイン電流Ｉｄｓを測定させることができる。いくつかの実施形態では生体試料２０７Ａを培養する過程の間に、相互作用剤２０７Ｂとの相互作用によって生成された生体試料２０７Ａの代謝産物および／またはイオンは、フロントゲート電圧Ｖｇｓ−ｆｇを変化させ、したがって、ドレイン電圧Ｖｄｓの変化ならびに測定されたドレイン電流Ｉｄｓを変化させ得る。差動ドレイン電流ΔＩｄｓの電気信号を分析することによって、生体試料２０７Ａのいくつかの特性を、短い時間枠内で、比較的低い試料濃度で判定することができる。いくつかの実施形態では、センサ２０が５μｍ×５μｍの拠点を占有することができる。約２００μＬの培養培地２０７を培養室（図１に示す）に装填することができる。ドレイン電流Ｉｄｓの測定中に、＋１．８Ｖのバイアスを第１のゲート２０９に印加し、−０．５Ｖのバイアスを第２のゲート２０９’に印加することができる。
２つのアプローチを使用して、差動ドレイン電流ΔＩｄｓを測定することができる。１つのアプローチは、培養培地２０７に生体試料が導入されていないセンサ２０の対照群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓを、培養中に生体試料が培養培地２０７に導入されたセンサ２０の実験群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓから差し引くことである。もう１つの手法は生体試料が培養中に培養培地２０７に導入されるセンサ２０の実験群から測定されたドレイン電流Ｉdsから、最初のドレイン電流Ｉds（例えば、ｔ＝０における）を差し引くことである。後者のアプローチはリアルタイム病原体検出のために採用することができ、前者のアプローチは、生体試料の濃度と培養培地２０７のｐＨ値とを同時に記録することができる、より系統的な研究において採用することができる。
図３を参照すると、図３は、本開示のいくつかの実施形態による病原体検出チップ３０の断面を示す。病原体検出チップ３０は、図２に記載されたセンサ２０と実質的に同一であり得るセンサ３２０に固定されたインキュベーションユニット３０１を含む。インキュベーションユニット３０１は、対応する培養室に生体試料を濃縮、希釈、または濾過するように構成されたマイクロ流体構造３０２を含むことができる。いくつかの実施形態では、病原体検出チップ３０は、それぞれ独立したセンサが内部に取り付けられた複数の培養室を含むことができる。病原体検出チップ３０の使用者は、生体試料が複数の培養室に均等に分配され得るように、生体試料をマイクロ流体構造３０２に接種し得る。生体試料接種の前に、スクリーニングされるべき生体試料の特性（例えば、病原体の存在、相互作用剤に対する病原体の感受性、病原体の薬物耐性を誘導するのに充分な相互作用剤の投与量、および病原体の指紋特性）に依存して、同一または異なる濃度を有する種々の相互作用剤が、複数の培養室の各々にセットされ得る。
本開示は、図１および図３に記載される病原体検出チップ１０および３０、ならびに本開示の図２に記載されるセンサ２０を利用する、病原体検出のための方法を提供する。図１、図２および図３を参照すると、該方法は（１）相互作用剤２０７Ｂを含む培養室１０１に生体試料２０７Ａを適用すること；（２）培養室１０１内の生体試料２０７Ａに電気的に結合されたセンサ２０を駆動すること；（３）センサ２０からの電気信号（例えば、ドレイン電流Ｉｄｓ）を測定すること；および（４）電気信号に基づいて生体試料２０７Ａの病原体関係情報を得ることを含む。以下の説明で述べるように、いくつかの実施形態で観測される電気信号は、差動ドレイン電流ΔＩｄｓとすることができる。検出の過程の間に電気信号パターンを分析することによって、生体試料２０７Ａの異なる特徴は短時間（例えば、１２時間未満）で、そして低い初期生体試料濃度（例えば、１００μＬあたり１００ＣＦＵ未満）で判定され得る。
実施例１Ａ
図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃを参照すると、図４Ａは、本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤に耐性である生体試料についての、時間（Ｈｒ）に対する電流変動の値（例えば、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ、または前述のΔＩｄｓと同等）を示し、図４Ｂは、図４Ａの生体試料に対応する、時間（Ｈｒ）に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示し、図４Ｃは、図４Ａの生体試料に対応する、時間に対する培養培地のｐＨ値を示す。クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）を生体試料として使用し、実施例１Ａでは相互作用剤を適用しない。
培養培地を調製するために、所定の投与量（ゼロ投与量を含む）の相互作用剤を有する２００μＬの非緩衝化ＬＢブロスに、所定の濃度のクレブシエラ・ニューモニエを接種し、３７℃の温度で培養した。試料は、所定の時点（例えば、毎時）でのドレイン電流Ｉｄｓ測定のために、＋１．８Ｖのフロントゲート電圧および−０．５Ｖのバックゲート電圧で、本明細書に記載される病原体検出チップおよびセンサを使用して病原体検出に供された。差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、前述の２つのアプローチを用いて判定することができ、これには、（１）対照群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓを、培養の過程で実験群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓから差し引くこと、および（２）最初のドレイン電流Ｉｄｓ（例えばｔ＝０で）を、培養の過程で実験群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓから差し引くことが含まれる。前者のアプローチをとる場合、生体試料の濃度は、同じ環境条件下で寒天培養することによって判定することができる。
図４Ａに示されるように、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ（または本明細書に記載されるΔＩ）は、その中に統計的に区別可能な信号を有するようには見えないか、または説明のみのためのいくつかの単純化された特定の例においては、培養の最初の７時間の間に、ベース値の３倍以上の極大値が存在しないので、差動ドレイン電流ΔＩｄｓにおいて一過性変化は確認できない。図４Ｂに示されるように、寒天培養から得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は、１ｓｔ時間後に単調に増加する傾向を示し、図４Ｃに示されるように、培養培地のｐＨ値は最初のｐＨ値（ｔ＝０）に対してほぼ変化しないか、または０．３未満の変動を有し、これは、図４Ａに示される電気信号パターンが、相互作用剤を含まない環境にある生体試料（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ）に対応することを示す。
実施例１Ｂ
図４Ｄ、図４Ｅ、および図４Ｆを参照すると、図４Ｄは、本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤に耐性である生体試料についての時間（Ｈｒ）に対する電流変動の値（例えば、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ、または前述のΔＩｄｓと同等）を示し、図４Ｅは、図４Ｄの生体試料に対応する時間（Ｈｒ）に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示し、図４Ｆは、図４Ｄの生体試料に対応する時間に対する培養培地のｐＨ値を示す。クレブシエラ・ニューモニエを生体試料として使用し、ゲンタマイシンを実施例１Ｂにおいて相互作用剤として使用する。
試料の調製および測定条件は、実施例１Ａのものを参照することができ、簡潔にするためにここでは繰り返さない。図４Ｄに示すように、培養の３ｒｄ時間において約０．１５μＡの一過性変化を確認することができる。極大ΔＩｄｓ値がベースΔＩｄｓ値（例えば、生体試料を含まない対照群で測定された対応するΔＩｄｓ値、またはｔ＝０で生体試料を有する実験群で測定された対応するΔＩｄｓ値）の約３倍以上である場合、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ測定において、一過性変化を確認することができる。いくつかの実施形態では、センサが信号処理システムの安定性に関連する有限の信号変動を有するので、約±０．０１μＡ〜約±０．０３μＡの差動ドレイン電流ΔＩｄｓを、バックグラウンドノイズとして観察することができる。当業者であれば、異なる信号処理システムを有するセンサは異なる程度の電気信号安定性を提供し、従って、前述のバックグラウンドノイズがそれに応じて変化し得ることを理解することができる。電気信号が一過性変化を構成するかどうかを判定することは、バックグラウンドノイズのような装置に敏感な因子を考慮に入れるべきである。例えば、実施例１Ｂでは０．０７μＡより大きい差動ドレイン電流ΔＩｄｓが電気信号の一過性変化と見なすことができ、０．０３μＡより大きいが０．０７μＡより小さい差動ドレイン電流ΔＩｄｓは電気信号のサブ一過性変化（a sub-blip）と見なすことができ、０．０３μＡより小さい差動ドレイン電流ΔＩｄｓは一過性変化またはサブ一過性変化を構成しない。図４Ｅに示されるように、寒天培養から得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は、１ｓｔ時間後に単調増加する傾向を示し、図４Ｆに示されるように、培養培地のｐＨ値は初期ｐＨ値（ｔ＝０）に対してほぼ変化しないか、または０．３未満の変動を有し、これは、図４Ｄに示される電気信号パターンが相互作用剤（例えば、ゲンタマイシン）に対して耐性である生体試料（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ）に対応することを示す。
実施例１Ｃ
図４Ｇ、図４Ｈ、および図４Ｉを参照すると、図４Ｇは、本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤に感受性である生体試料についての、時間（Ｈｒ）に対する電流変動の値（例えば、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ、または前述のΔＩｄｓと同等）を示し、図４Ｈは、図４Ｇの生体試料に対応する時間（Ｈｒ）に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示し、図４Ｉは、図４Ｇの生体試料に対応する時間に対する培養培地のｐＨ値を示す。クレブシエラ・ニューモニエを生体試料として使用し、テトラサイクリンを実施例１Ｃにおいて相互作用剤として使用する。
試料の調製および測定条件は、実施例１Ａのものを参照することができ、簡潔にするためにここでは繰り返さない。図４Ｇに示すように、差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、ベース値の３倍以上の極大値を有するようには見えないが、３ｒｄ時間および６ｔｈ時間のそれぞれにおいてベース値の３倍未満の２つの極大値を示す。例えば、実施例１Ｃでは、差動ドレイン流動ΔＩｄｓは０．０７μＡよりも低いが、３ｒｄ時間および６ｔｈ時間において０．０３μＡよりも大きいため、電気信号において２つのサブ一過性変化を確認することができる。図４Ｈに示されるように、寒天培養から得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は、増加または減少のいずれの傾向も示さず、そして図４Ｉに示されるように、培養培地のｐＨ値は初期ｐＨ値（ｔ＝０）に対してほぼ変化しないか、または０．３未満の変動を有し、これは、図４Ｇに示される電気信号パターンが相互作用剤（例えば、テトラサイクリン）に対して感受性である生体試料（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ)に対応することを示す。
実施例２Ａ
図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃを参照すると、図５Ａは本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤に耐性である生体試料についての、時間（Ｈｒ）に対する電流変動の値（例えば、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ、または前述のΔＩｄｓと同等）を示し、図５Ｂは、図５Ａの生体試料に対応する時間（Ｈｒ）に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示し、図５Ｃは、図５Ａの生体試料に対応する時間に対する培養培地のｐＨ値を示す。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を生体試料として使用し、実施例２Ａでは相互作用剤を適用しない。
培養培地を調製するために、所定の投与量（ゼロ投与量を含む）の相互作用剤を有する２００μＬの非緩衝化ＬＢブロスに、所定の濃度の黄色ブドウ球菌を接種し、３７℃の温度で培養した。試料は、所定の時点（例えば、毎時）でのドレイン電流Ｉｄｓ測定のために、＋１．８Ｖのフロントゲート電圧および−０．５Ｖのバックゲート電圧で、本明細書に記載される病原体検出チップおよびセンサを使用して病原体検出に供された。差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、前述の２つのアプローチを用いて判定することができ、これには、（１）対照群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓを、培養の過程で実験群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓから差し引くこと、および（２）最初のドレイン電流Ｉｄｓ（例えばｔ＝０で）を、培養の過程で実験群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓから差し引くことが含まれる。前者のアプローチをとる場合、生体試料の濃度は、同じ環境条件下で寒天培養することによって判定することができる。
図５Ａに示すように、培養の最初の８時間では、差動ドレイン電流ΔＩｄｓがベース値の３倍以上の極大値を有していないように見えるため、差動ドレイン電流ΔＩｄｓの一過性変化を確認することができない。図５Ｂに示すように、寒天培養から得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は、単調増加の傾向を示し、図５Ｃに示すように、培養培地のｐＨ値は初期ｐＨ値（ｔ＝０）に対してほぼ変化しないか、または０．３未満の変動を有し、これは、図５Ａに示す電気信号パターンが、相互作用剤を含まない環境にある生体試料（例えば、黄色ブドウ球菌）に対応することを示す。
実施例２Ｂ
図５Ｄ、図５Ｅ、および図５Ｆを参照すると、図５Ｄは本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤に耐性である生体試料についての、時間（Ｈｒ）に対する電流変動の値（例えば、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ、または前述のΔＩｄｓと同等）を示し、図５Ｅは、図５Ｄの生体試料に対応する時間（Ｈｒ）に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示し、図５Ｆは、図５Ｄの生体試料に対応する時間に対する培養培地のｐＨ値を示す。黄色ブドウ球菌を生体試料として使用し、ゲンタマイシンを実施例２Ｂにおいて相互作用剤として使用する。
試料の調製および測定条件は、実施例２Ａのものを参照することができ、簡潔にするためにここでは繰り返さない。図５Ｄに示すように、２つの極大は、それぞれ２ｎｄ時間および５ｔｈ時間において確認することができる。例えば、実施例２Ｂでは、０．０７μＡを超える差動ドレイン電流ΔＩｄｓは電気信号の一過性変化と考えることができ、０．０３μＡを超えるが０．０７μＡ未満の差動ドレイン電流ΔＩｄｓは電気信号のサブ一過性変化と考えることができ、０．０３μＡ未満の差動ドレイン電流ΔＩｄｓは一過性変化またはサブ一過性変化を構成しない。その結果、図５Ｄの差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、２ｎｄ時間に一過性変化を示し、５ｔｈ時間にサブ一過性変化を示す。
図５Ｅに示すように、寒天培養から得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は単調増加の傾向を示し、図５Ｆに示すように、培養培地のｐＨ値は初期ｐＨ値（ｔ＝０）に対してほぼ変化しないか、または０．３未満の変動を有し、これは、図５Ｄに示す電気信号パターンが相互作用剤（例えば、ゲンタマイシン）に対して耐性である生体試料（例えば、黄色ブドウ球菌）に対応することを示す。
実施例２Ｃ
図５Ｇ、図５Ｈ、および図５Ｉを参照すると、図５Ｇは、本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤に感受性である生体試料についての、時間（Ｈｒ）に対する電流変動の値（例えば、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ、または前述のΔＩｄｓと同等）を示し、図５Ｈは、図５Ｇの生体試料に対応する時間（Ｈｒ）に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示し、図５Ｉは、図５Ｇの生体試料に対応する時間に対する培養培地のｐＨ値を示す。黄色ブドウ球菌を生体試料として使用し、アンピシリンを実施例２Ｃにおいて相互作用剤として使用する。
試料の調製および測定条件は、実施例２Ａのものを参照することができ、簡潔にするためにここでは繰り返さない。図５Ｇに示すように、差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、ベース値の３倍以上の極大値を有するようには見えない。例えば、実施例２Ｃでは、差動ドレイン電流ΔＩｄｓが培養の最初の８時間を通して全て０．０３μＡ未満であり、したがって、一過性変化またはサブ一過性変化は電気信号において確認することはできない。図５Ｈに示されるように、寒天培養から得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は１ｓｔ時間後に単調減少する傾向を示し、図５Ｉに示されるように、培養培地のｐＨ値は初期ｐＨ値（ｔ＝０）に対してほぼ変化しないか、または０．３未満の変動を有し、これは、図５Ｇに示される電気信号パターンが相互作用剤（例えば、アンピシリン）に対して感受性である生体試料（例えば、黄色ブドウ球菌）に対応することを示す。
実施例３Ａ
図６Ａ、図６Ｂ、および図６Ｃを参照すると、図６Ａは、本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤に耐性である生体試料についての、時間（Ｈｒ）に対する電流変動の値（例えば、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ、または前述のΔＩｄｓと同等）を示し、図６Ｂは、図６Ａの生体試料に対応する時間（Ｈｒ）に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示し、図６Ｃは、図６Ａの生体試料に対応する時間に対する培養培地のｐＨ値を示す。緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を生体試料として使用し、実施例３Ａでは相互作用剤を適用しない。
培養培地を調製するために、所定の投与量（ゼロ投与量を含む）の相互作用剤を有する２００μＬの非緩衝ＬＢブロスに、所定の濃度の緑膿菌を接種し、３７℃の温度で培養した。試料は、所定の時点（例えば、毎時）でのドレイン電流Ｉｄｓ測定のために、＋１．８Ｖのフロントゲート電圧および−０．５Ｖのバックゲート電圧で、本明細書に記載される病原体検出チップおよびセンサを使用して病原体検出に供された。差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、前述の２つのアプローチを用いて判定することができ、これには、（１）対照群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓを、培養の過程で実験群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓから差し引くこと、および（２）最初のドレイン電流Ｉｄｓ（例えばｔ＝０で）を、培養の過程で実験群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓから差し引くことが含まれる。前者のアプローチをとる場合、生体試料の濃度は、同じ環境条件下で寒天培養することによって判定することができる。
図６Ａに示すように、差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、培養の最初の９時間の間、ベース値の３倍以上の極大値を有するようには見えない。しかしながら、差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、４ｔｈ時間および６ｔｈ時間において０．０７μＡより低いが０．０３μＡより大きい２つの極大を有するように見え、差動ドレイン電流ΔＩｄｓにおいて、一過性変化は確認できないが、２つのサブ一過性変化は確認することができる。図６Ｂに示すように、寒天培養から得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は２ｎｄ時間後に単調増加する傾向を示し、図６Ｃに示すように、培養培地のｐＨ値は初期ｐＨ値（ｔ＝０）に対してほぼ変化しないか、または０．３未満の変動を有し、これは、図６Ａに示す電気信号パターンが相互作用剤を含まない環境にある生体試料（例えば、緑膿菌）に対応することを示す。
実施例３Ｂ
図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆを参照すると、図６Ｄは、本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤に耐性である生体試料についての、時間（Ｈｒ）に対する電流変動の値（例えば、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ、または前述のΔＩｄｓと同等）を示し、図６Ｅは、図６Ｄの生体試料に対応する時間（Ｈｒ）に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示し、図６Ｆは、図６Ｄの生体試料に対応する時間に対する培養培地のｐＨ値を示す。緑膿菌を生体試料として使用し、アンピシリンを実施例３Ｂにおいて相互作用剤として使用する。
試料の調製および測定条件は、実施例３Ａのものを参照することができ、簡潔にするためにここでは繰り返さない。図６Ｄに示すように、差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、培養の１ｓｔ時間にベース値の３倍以上の極大値を有するように見える。例えば、実施例３Ｂでは、約０．１６μＡの差動ドレイン電流ΔＩｄｓを、電気信号の一過性変化として確認することができる。
図６Ｅに示すように、寒天培養から得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は、単調増加の傾向を示し、図６Ｆに示すように、培養培地のｐＨ値は初期ｐＨ値（ｔ＝０）に対してほぼ変化しないか、または０．３未満の変動を有し、これは、図６Ｄに示す電気信号パターンが相互作用剤（例えば、アンピシリン）に対して耐性である生体試料（例えば、緑膿菌）に対応することを示す。
実施例３Ｃ
図６Ｇ、図６Ｈ、および図６Ｉを参照すると、図６Ｇは、本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤に感受性である生体試料についての、時間（Ｈｒ）に対する電流変動の値（例えば、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ、または前述のΔＩｄｓと同等）を示し、図６Ｈは、図６Ｇの生体試料に対応する時間（Ｈｒ）に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示し、図６Ｉは、図６Ｇの生体試料に対応する時間に対する培養培地のｐＨ値を示す。緑膿菌を生体試料として使用し、ゲンタマイシンを実施例３Ｃにおいて相互作用剤として使用する。
試料の調製および測定条件は、実施例３Ａのものを参照することができ、簡潔にするためにここでは繰り返さない。図６Ｇに示すように、差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、ベース値の３倍以上の極大値を有するようには見えない。例えば、実施例３Ｃでは、差動ドレイン電流ΔＩｄｓが培養の最初の９時間を通して全て０．０３μＡ未満であり、したがって、一過性変化またはサブ一過性変化は電気信号において確認することはできない。図６Ｈに示すように、寒天培養から得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は、単調減少する傾向を示し、図６Ｉに示すように、培養培地のｐＨ値は初期ｐＨ値（ｔ＝０）に対してほぼ変化しないか、または０．３未満の変動を有し、これは、図６Ｇに示す電気信号パターンが相互作用剤（例えば、ゲンタマイシン）に感受性である生体試料（例えば、緑膿菌）に対応することを示す。
実施例４Ａ
図７Ａおよび図７Ｂを参照すると、図７Ａは、本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤に耐性である生体試料についての、時間（Ｈｒ）に対する電流変動の値（例えば、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ、または前述のΔＩｄｓと同等）を示し、図７Ｂは、図７Ａの生体試料に対応する、時間（Ｈｒ）に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。大腸菌（Escherichia coli）を生体試料として使用し、実施例４Ａでは相互作用剤を適用しない。
培養培地を調製するために、所定の投与量（ゼロ投与量を含む）の相互作用剤を有する２００μＬの非緩衝化ＬＢブロスに、所定の濃度の大腸菌を接種し、３７℃の温度で培養した。試料は、所定の時点（例えば、毎時）でのドレイン電流Ｉｄｓ測定のために、＋１．８Ｖのフロントゲート電圧および−０．５Ｖのバックゲート電圧で、本明細書に記載される病原体検出チップおよびセンサを使用して病原体検出に供された。差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、前述の２つのアプローチを用いて判定することができ、これには、（１）対照群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓを、培養の過程で実験群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓから差し引くこと、および（２）最初のドレイン電流Ｉｄｓ（例えばｔ＝０で）を、培養の過程で実験群から測定されたドレイン電流Ｉｄｓから差し引くことが含まれる。前者のアプローチをとる場合、生体試料の濃度は、同じ環境条件下で寒天培養することによって判定することができる。
図７Ａに示すように、差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、培養の最初の１１時間の間、ベース値の３倍以上の極大値を有するようには見えない。図７Ｂに示されるように、寒天培養から得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は、２ｎｄ時間後に実質的に単調増加する傾向を示し、これは、図７Ａに示される電気信号パターンが、相互作用剤を含まない環境にある生体試料（例えば、大腸菌）に対応することを示す。
実施例４Ｂ
図７Ｃおよび図７Ｄを参照すると、図７Ｃは、本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤に耐性である生体試料についての、時間（Ｈｒ）に対する電流変動の値（例えば、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ、または前述のΔＩｄｓと同等）を示し、図７Ｄは、図７Ｃの生体試料に対応する、時間（Ｈｒ）に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。大腸菌を生体試料として使用し、カナマイシンを実施例４Ｂにおいて相互作用剤として使用する。
試料の調製および測定条件は、実施例４Ａのものを参照することができ、簡潔にするためにここでは繰り返さない。図７Ｃに示すように、差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、培養の２ｎｄ時間において、ベース値の３倍以上の極大値を有するように見える。例えば、実施例４Ｂでは、０．０７μＡより大きい差動ドレイン電流ΔＩｄｓ（例えば、約０．０８μＡ）を、電気信号の一過性変化として確認することができる。さらに、約０．０４μＡの差動ドレイン電流ΔＩｄｓを、６ｔｈ時間においてサブ一過性変化として確認できる。前述のように、０．０３μＡ未満の電気信号は、いくつかの実施形態では一過性変化またはサブ一過性変化とは見なされない。その結果、図７Ｃでは、２ｎｄ時間の一過性変化と６ｔｈ時間においてサブ一過性変化を確認することができる。
図７Ｄに示されるように、寒天培養から得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は、３ｒｄ時間後に実質的に単調増加する傾向を示し、図７Ｃに示される電気信号パターンが、相互作用剤（例えば、カナマイシン）に対して耐性である生体試料（例えば、大腸菌）に対応することを示す。
実施例４Ｃ
図７Ｅおよび図７Ｆを参照すると、図７Ｅは、本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤に感受性である生体試料についての、時間（Ｈｒ）に対する電流変動の値（例えば、差動ドレイン電流ΔＩｄｓ、または前述のΔＩｄｓと同等）を示し、図７Ｆは、図７Ｅの生体試料に対応する時間（Ｈｒ）に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。大腸菌を生体試料として使用し、スペクチノマイシンを実施例４Ｃにおいて相互作用剤として使用する。
試料の調製および測定条件は、実施例４Ａのものを参照することができ、簡潔にするためにここでは繰り返さない。図７Ｅに示すように、差動ドレイン電流ΔＩｄｓは、ベース値の３倍以上の極大値を有するようには見えない。しかし、培養の２ｎｄ時間に極大を観察することができる。例えば、実施例４Ｃでは、差動ドレイン電流ΔＩｄｓが、培養の最初の９時間を通して全て０．０７μＡ未満であり、したがって、電気信号において一過性変化を確認することはできない。約０．０５μＡの極大は、電気信号におけるサブ一過性変化として確認することができる。図７Ｆに示されるように、寒天培養から得られたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は、増加または減少のいずれの傾向も示さず、これは、図７Ｅに示される電気信号パターンが相互作用剤（例えば、スペクチノマイシン）に対して感受性である生体試料（例えば、大腸菌）に対応することを示す。
図８を参照すると、図８は、実施例１Ａ〜実施例４Ｃで測定した電気信号をまとめた表を示す。前述したように、バックグラウンドノイズのような装置感応因子を考慮すると、０．０３μＡより小さい極大を示す差動ドレイン電流ΔＩｄｓは一過性変化またはサブ一過性変化として識別されず、０．０３μＡより大きく０．０７μＡより小さい極大を示す差動ドレイン電流ΔＩｄｓはサブ一過性変化として識別され、０．０７μＡより大きい極大を示す差動ドレイン電流ΔＩｄｓは一過性変化として識別される。一過性変化の列に示される０および１は、それぞれ、一過性変化／サブ一過性変化の不在および一過性変化／サブ一過性変化の存在を指す。強度の列に示されている０、１および２は、０．０７μＡより小さい差動ドレイン電流（「０」として示されている）、０．０７μＡより大きいが０．１μＡより小さい差動ドレイン電流（「１」として示されている）、及び０．１μＡより大きい差動ドレイン電流（「２」として示されている）を含む、３レベルの電気信号強度を指す。個数の列に示されている０、１および２は、一過性変化およびサブ一過性変化の総数を指す。
図８に示す参照番号は、以下の表１のように要約することができる。
表１
表１
本明細書中に記載される病原体検出のための方法を使用することによって、病原体（例えば、細菌）の特徴は電気信号から抽出され得、そして図９の表に示されるように、一連の数字に変換され得る。電気信号から抽出されたさらなる情報は、デジタル化され、表に含めることができる。例えば、１または２の強度は、対応する病原体が対応する相互作用剤（例えば、抗生物質）に対して薬物耐性であることを示し得る。例えば、０の強度は、対応する病原体が対応する相互作用剤（例えば、抗生物質）に対して薬物感受性であるか、または実質的に病原体がないことを示し得る。
さらに、患者の体液および／または血液中に保持される未知の病原体が、１つ以上の既知の相互作用剤を含む培養培地中に接種される場合、図９と同様のルックアップテーブル上のデジタル化された情報は、病原体の型を迅速に同定し得（例えば、６時間以内）、そして該病原体を保持する患者に有効な処置を提供し得る。
さらに、時間に関して記録された電気信号は、特定の相互作用剤に対する特定の病原体の指紋特性を提供することができる。例えば、記録された電気信号は、多数のコロニー形成単位（ＣＦＵ）に対応し得、そして病原体が培養の過程の間、生存しているかまたは死んでいるか、活性であるかまたは休眠しているか、伝染性であるかまたは非伝染性であるか、または休眠、発芽、増殖、または栄養を含む成長相のうちの１つにあることを示し得る。
図９Ａおよび図９Ｂは、本開示のいくつかの実施形態による、異なる投与量の相互作用剤下での時間に対する電気信号を示す。大腸菌Ｋ１２株（Escherichia coli K12）を病原体として使用し、カナマイシンを図９Ａおよび図９Ｂにおいて相互作用剤として使用する。試料の調製および測定条件は、実施例４Ａのものを参照することができ、簡潔にするためにここでは繰り返さない。図９Ａでは、２２．５μｇ／ｍＬの投与量を有するカナマイシンを培養培地に適用し、培養の２ｎｄ時間において１つの一過性変化を確認することができる。電気信号は、大腸菌Ｋ１２株のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数が培養の少なくとも数時間以内に、依然として一定のレベルを維持することを示す。あるいは、２２．５μｇ／ｍｌの投与量のカナマイシンは、大腸菌Ｋ１２株の成長を効果的に阻害することができない。しかし、図９Ｂでは、５０μｇ／ｍＬの投与量を有するカナマイシンが培養培地に適用され、培養の最初の数時間の間に一過性変化は確認することができない。電気信号は、大腸菌Ｋ１２株のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数が培養の少なくとも数時間以内に減少することを示す。あるいは、５０μｇ／ｍＬの投与量のカナマイシンは、大腸菌Ｋ１２株の増殖を効果的に阻害することができる。一過性変化の存在から一過性変化なしへの電気信号の遷移は、大腸菌Ｋ１２株に対するカナマイシンの最小阻害濃度（ＭＩＣ）が図９Ａの実験および図９Ｂの実験において使用されるカナマイシン投与量の間に存在し得ることを示す。
大腸菌Ｋ１２株に対するカナマイシンの最小阻害濃度（ＭＩＣ）テストに従い、２５μｇ／ｍＬの投与量のカナマイシンをＭＩＣとして決定することができる。図９Ａのより低い投与量実験においては、カナマイシンの投与量はＭＩＣの０．９倍に相当し、そのため、大腸菌Ｋ１２株の増殖を効果的に阻害することはできない。図９Ｂのより高い投与量実験においては、カナマイシンの投与量はＭＩＣの２倍に相当し、そのため、大腸菌Ｋ１２株の増殖を効果的に阻害することができる。
図１０Ａおよび図１０Ｂは、本開示のいくつかの実施形態による、相互作用剤の異なる投与量下での時間に対する電気信号を示す。大腸菌ｐｋｕ５７（Escherichia coli pku57）を病原体として使用し、カナマイシンを図１０Ａおよび図１０Ｂにおいて相互作用剤として使用する。試料の調製および測定条件は、実施例４Ａのものを参照することができ、簡潔にするためにここでは繰り返さない。図１０Ａにおいて、２５μｇ／ｍＬの投与量を有するカナマイシンを培養培地に適用し、培養の１ｓｔ時間および８ｔｈ時間において２つの一過性変化を確認することができる。電気信号は、大腸菌ｐｋｕ５７のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数が培養の少なくとも数時間以内に、依然として一定のレベルを維持することを示す。あるいは、２５μｇ／ｍＬの投与量のカナマイシンは、大腸菌ｐｋｕ５７の増殖を効果的に阻害することができない。図１０Ｂでは、５０μｇ／ｍＬの投与量のカナマイシンを培養培地に適用し、培養の２ｎｄ時間において一過性変化を確認することができる。電気信号は、大腸菌ｐｋｕ５７のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数が培養の少なくとも数時間以内に、依然として一定のレベルを維持することを示す。あるいは、５０μｇ／ｍＬの投与量のカナマイシンは、大腸菌ｐｋｕ５７の増殖を効果的に阻害することができない。両方の場合において電気信号内に少なくとも１つの一過性変化があることを示す一致を考えると、結果は、大腸菌ｐｋｕ５７に関するカナマイシンのＭＩＣが５０μｇ／ｍＬより低いので、図１０Ａの実験で使用されたより低い投与量２５μｇ／ｍＬおよび図１０Ｂの実験で使用されたより高い投与量５０μｇ／ｍＬの両方で、大腸菌ｐｋｕ５７がカナマイシンに対し薬物耐性があるものとして挙動することを示す。
図９Ａ、図９Ｂ、図１０Ａ、および図１０Ｂの結果を考慮して、本明細書に記載される差動ドレイン電流などの電気信号において一過性変化が確認される場合、単調増加広がりを適用して、対応する相互作用剤に対して病原体が薬物感受性であるか（例えば、図９Ａおよび図９Ｂ）、または薬物耐性であるか（例えば、図１０Ａおよび図１０Ｂ）を判定し得る。一過性変化が電気信号パターンにおいて確認され得ない場合、単調減少の広がりを適用して、対応する相互作用剤に対して病原体が薬物感受性であるか（例えば、図９Ａおよび図９Ｂ）、または培養培地中に病原体が実質的に存在しないかを判定し得る。
図１１を参照すると、図１１は本開示のいくつかの実施形態による、病原体検出チップの複数の培養ウェルまたは培養室を示し、３つの試料の各々は、異なる相互作用剤濃度の広がりを有する２つの培養ウェルに導入される。図１、図２、および図３で前述したように、病原体２０７Ａを、複数の個々の培養ウェルに接続するマイクロ流体構造３０２を介して病原体検出チップ３０に接種した後、病原体試料は、検出のために設計された培養環境に送られる。図１１に示すように、３つの結果のうちの１つは、本明細書に記載の電気信号測定から得ることができる。
病原体試料１１１を、２つの培養ウェル１１１Ｌ、１１１Ｈに接種する。培養ウェル１１１Ｌには、より低い量の相互作用剤が含まれ、培養ウェル１１１Ｈには、より高い量の同じ相互作用剤が含まれる。いくつかの実施形態では、培養ウェル１１１Ｌは、臨床・検査標準協会（Clinical and Laboratory Standards Institute、ＣＬＳＩ）によって提供される抗生物質感受性投与量よりも低い、またはＭＤ処方投与量よりも低い相互作用剤投与量を有してもよい。同様に、培養ウェル１１１Ｈは、ＣＬＳＩによって提供される抗生物質感受性投与量よりも多い、またはＭＤ処方投与量よりも多い相互作用剤投与量を有してもよい。培養ウェル１１１Ｌも培養ウェル１１１Ｈも、培養の最初の６時間において電気信号（すなわち、本明細書に記載される一過性変化）を示さない、これは、病原体試料１１１が実質的に病原体を含まないかもしれないことを示す。
病原体試料１１２を、２つの培養ウェル１１２Ｌ、１１２Ｈに接種する。培養ウェル１１２Ｌは、より低い投与量の相互作用剤を含み、培養ウェル１１２Ｈは、より高い投与量の同じ相互作用剤を含む。いくつかの実施形態では、培養ウェル１１２Ｌは、ＣＬＳＩによって提供される抗生物質感受性投与量よりも低い、またはＭＤ処方投与量よりも低い相互作用剤投与量を有してもよい。同様に、培養ウェル１１２Ｈは、ＣＬＳＩによって提供される抗生物質感受性投与量よりも多い、またはＭＤ処方投与量よりも多い相互作用剤投与量を有してもよい。電気信号（すなわち、本明細書に記載される一過性変化）は、培養ウェル１１２Ｌに存在するが、培養の最初の６時間では培養ウェル１１２Ｈには存在しない。この信号の組み合わせは、病原体試料１１２が病原体を含むことを示すだけでなく、病原体が相互作用剤に感受性であることも示す。
病原体試料１１３を、２つの培養ウェル１１３Ｌ、１１３Ｈに接種する。培養ウェル１１３Ｌは、より低い投与量の相互作用剤を含み、培養ウェル１１３Ｈは、より高い投与量の同じ相互作用剤を含む。いくつかの実施形態では、培養ウェル１１３Ｌは、ＣＬＳＩによって提供される抗生物質感受性投与量よりも低い、またはＭＤ処方投与量よりも低い相互作用剤投与量を有してもよい。同様に、培養ウェル１１３Ｈは、ＣＬＳＩによって提供される抗生物質感受性投与量よりも多い、またはＭＤ処方投与量よりも多い相互作用剤投与量を有してもよい。電気信号（すなわち、本明細書中に記載される一過性変化）は、培養の最初の６時間において、培養ウェル１１３Ｌおよび培養ウェル１１３Ｈの両方に存在する。この信号の組み合わせは、病原体試料１１３が病原体を含むだけでなく、病原体が相互作用剤に対して耐性であることを示す。
相互作用剤が放射線または熱などのエネルギーの形態である場合、培養ウェルまたは培養室１１１Ｌ、１１２Ｌ、または１１３Ｌは、より低い強度のエネルギーを受け取り、培養ウェルまたは培養室１１１Ｈ、１１２Ｈ、または１１３Ｈは、病原体の増殖に対する影響を研究したより高い強度のエネルギーを受け取る。
図１２を参照すると、図１２は、本開示のいくつかの実施形態による、病原体検出のための方法１２００のフローチャートを示す。方法１２００に記載の動作１２０１〜１２０５を行うことにより、抗生物質感受性テスト（ＡＳＴ）および無菌テストを行うことができる。動作１２０１において、電気信号（例えば、差動ドレイン電流）における少なくとも１つの一過性変化の存在が、所定の培養期間（例えば、６時間未満）の間に判定される。電気信号（Ｙ）に少なくとも１つの一過性変化が存在する場合、フローは動作１２０２に進む。動作１２０２において、単調増加する相互作用剤投与量の広がりテスト（以下、「増加広がりテスト」）が実施されるか、または異なる相互作用剤が適用される。増加広がりテストにおいて全ての培養ウェルの少なくとも１つの一過性変化の存在を判定する別の動作１２０４によって、相互作用剤に対して耐性１２０６または感受性１２０８である生体試料中の病原体を判定することができる。増加広がりテストは、図１３にさらに記載されている。
動作１２０１に戻って参照すると、電気信号（例えば、差動ドレイン電流）における少なくとも１つの一過性変化の存在が所定の培養期間（例えば、６時間未満）中に判定される。電気信号（Ｎ）に少なくとも１つの一過性変化が存在しない場合、フローは動作１２０３に進む。動作１２０３において、単調減少する相互作用剤投与量の広がりテスト（以下、「減少広がりテスト」）が実行されるか、または異なる相互作用剤が適用される。減少広がりテストにおいて全ての培養ウェルの少なくとも１つの一過性変化の存在を判定する別の動作１２０５によって、生体試料中の病原体が相互作用剤に対して感受性であるか１２０７、または生体試料が病原体を含まないか１２０９を判定することができる。減少広がりテストは、図１４にさらに記載されている。
図１３を参照すると、図１３は病原体検出チップの複数の培養ウェルを示し、２つの試料の各々は、本開示のいくつかの実施形態に従って、単調増加する相互作用剤濃度の広がりを有する６つの培養ウェルに導入される。相互作用剤の濃度または投与量は、培養ウェル１３０１から培養ウェル１３０６まで単調に増加し、いくつかの実施形態では、相互作用剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、その広がりの最低濃度と最高濃度との間である。培養ウェル１３０１内の相互作用剤濃度は、動作１２０１で適用された相互作用剤濃度と一致する。動作１２０１で一過性変化が少なくとも観察されたと判定された場合、動作１２０１で前に適用された病原体試料を培養ウェル１３０１〜１３０６に接種する。２つの条件１３０Ａ、１３０Ｂが期待できる。条件１３０Ａの下では、培養ウェル１３０１、１３０２、１３０３において電気信号（例えば、本明細書に記載される一過性変化）の存在、および培養ウェル１３０４、１３０５、１３０６において電気信号の不在が観察され、その結果は、病原体試料が病原体を含み、病原体が相互作用剤に感受性であることを示す。条件１３０Ｂの下では、６つの培養ウェル１３０１、１３０２、１３０３、１３０４、１３０５、１３０６の全てにおいて電気信号（例えば、本明細書に記載される一過性変化）の存在が観察され、その結果は、病原体試料が病原体を含み、病原体が相互作用剤に対して耐性であることを示す。
図１４を参照すると、図１４は病原体検出チップの複数の培養ウェルを示し、２つの試料の各々は、本開示のいくつかの実施形態に従って、単調減少する相互作用剤濃度の広がりを有する６つの培養ウェルに導入される。相互作用剤の濃度または投与量は、培養ウェル１４０１から培養ウェル１４０６まで単調に減少し、いくつかの実施形態では、相互作用剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、その広がりの最高濃度と最低濃度との間である。培養ウェル１４０１内の相互作用剤濃度は、動作１２０１で適用された相互作用剤濃度と一致する。動作１２０１で一過性変化が観察されないと判定された場合、動作１２０１で前に適用された病原体試料を培養ウェル１４０１〜１４０６に接種する。２つの条件１４０Ａ、１４０Ｂが期待できる。条件１４０Ａの下では、６つの培養ウェル１４０１、１４０２、１４０３、１４０４、１４０５、１４０６のすべてにおいて電気信号（例えば、本明細書に記載される一過性変化）が存在しないことが観察され、その結果は、生体試料の無菌状態を確認するために、病原体試料が病原体を含まないことを示す。条件１４０Ｂの下では、培養ウェル１４０４、１４０５、１４０６において電気信号（例えば、本明細書に記載される一過性変化）の存在、および培養ウェル１４０１、１４０２、１４０３において電気信号の不在が観察され、その結果は、病原体試料が病原体を含み、病原体が相互作用剤に感受性であることを示す。
図１３の増加広がりテストおよび図１４の減少広がりテストを参照すると、いくつかの実施形態では、増加広がりテストおよび減少広がりテストは、その特定の病原体に対する相互作用剤のＭＩＣが容易に知られていない場合、臨床・検査標準協会（ＣＬＳＩ）またはＭＤ処方投与量によって提供される抗生物質感受性投与量よりも高いおよび低い相互作用剤濃度を包含するように設計される。
図１２の方法１２００、図１３の増加広がりテスト、および図１４の減少広がりテストを考慮すると、本明細書に記載される病原体感知チップはいくつかのテスト動作を通してＡＳＴテストおよび無菌テストを実施することができ、各動作は、電気信号結果を得るために６時間未満の培養を要し得る。さらに、複数の培養ウェルまたは培養室を本明細書に記載の病原体検出チップに組み込むことができるので、異なる種類の相互作用剤およびその対応する増加または減少の広がりテストを１つのチップ内に設計して、最も効率的かつ費用節約的な方法で検出結果を得ることができる。
本発明は上述の特定の実施形態に関連して説明されてきたが、当業者にはそれに対する多くの代替形態およびその修正形態および変形形態が明らかであろう。全てのそのような代替、修正、および変形は、本発明の範囲内にあると見なされる。
１０ 病原体検出チップ
２０ センサ
３０ 病原体検出チップ
１０１ 培養室
１０３ 担体
１０５ 検知チップ
１０５ 感知チップ
１０７ 培養培地
１０９ 参照電極
１１０ リーダ
１１１ 病原体試料
１１１Ｌ、１１１Ｈ 培養ウェル
１１２ 病原体試料
１１２Ｌ、１１２Ｈ 培養ウェル
１１３ 病原体試料
１１３Ｌ、１１３Ｈ 培養ウェル
２００ 半導体層
２０１ ソース
２０２ ドレイン
２０３ パッシベーション層
２０７ 培養培地
２０７Ａ 病原体
２０７Ｂ 相互作用剤
２０９ 第１のゲート
２０９’ 第２のゲート
３０１ インキュベーションユニット
３０２ マイクロ流体構造
３２０ センサ
２０ センサ
３０ 病原体検出チップ
１０１ 培養室
１０３ 担体
１０５ 検知チップ
１０５ 感知チップ
１０７ 培養培地
１０９ 参照電極
１１０ リーダ
１１１ 病原体試料
１１１Ｌ、１１１Ｈ 培養ウェル
１１２ 病原体試料
１１２Ｌ、１１２Ｈ 培養ウェル
１１３ 病原体試料
１１３Ｌ、１１３Ｈ 培養ウェル
２００ 半導体層
２０１ ソース
２０２ ドレイン
２０３ パッシベーション層
２０７ 培養培地
２０７Ａ 病原体
２０７Ｂ 相互作用剤
２０９ 第１のゲート
２０９’ 第２のゲート
３０１ インキュベーションユニット
３０２ マイクロ流体構造
３２０ センサ
Claims (19)
- 以下を含む、病原体検出のための方法：
相互作用剤を含む培養室に生体試料を適用すること；
培養室内の生体試料に電気的に結合されたセンサを駆動すること；
センサからの電気信号を測定すること；および
電気信号に基づいて生体試料の病原体関係情報を取得すること。 - 前記センサからの前記電気信号を測定することは、所定の期間にわたってトランジスタのドレイン電流を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記生体試料の病原体関係情報を取得することが、前記所定の期間中の前記ドレイン電流における少なくとも１つの一過性変化の存在を判定することを含む、請求項２に記載の方法。
- 前記所定の期間が約１２時間未満である、請求項３に記載の方法。
- 前記生体試料を複数の培養室に適用することが、１００μＬ当たり１００未満のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有する前記生体試料を適用することを含む、請求項３に記載の方法。
- 前記一過性変化が、前記ドレイン電流において統計的に区別可能な信号である、請求項３に記載の方法。
- 前記相互作用剤が、胞子発芽を引き起こす薬剤、酸化的ストレスを引き起こす薬剤、化学的損傷または酵素破壊を引き起こす薬剤、栄養欠乏を引き起こす薬剤、ＵＶ照射、バクテリオファージ、抗生物質、必須イオン欠乏を引き起こす薬剤、酵素、放射線、または加熱を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記培養室のうちの２つが、同一の相互作用剤を含み、異なる投与量または強度を有する、請求項７に記載の方法。
- 前記培養室のうちの２つが、異なる相互作用剤を含む、請求項７に記載の方法。
- 病原体関係情報が、病原体の存在、相互作用剤に対する病原体の感受性、病原体の耐性を誘導するのに充分な相互作用剤の投与量、病原体の活性を抑制するのに充分な相互作用剤の投与量、および病原体の指紋特性を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記病原体の指紋特性が、病原体が、生きているか死亡んでいるか、活性であるか休眠しているか、伝染性であるか非伝染性であるか、または休眠、発芽、増殖、栄養、停滞、定常、または死亡を含む相のうちの１つにあることを含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記生体試料が、体液、血液、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも１つの一過性変化が電流中に存在する場合、さらに、単調増加する相互作用剤投与量の広がりテストを実施すること、または、異なる相互作用剤を適用して、生体試料中の病原体が相互作用剤のうちの１つに対して耐性であるかもしくは感受性であるかを判定することを含む、請求項３に記載の方法。
- 前記単調増加する相互作用剤投与量の広がりテストまたは前記単調減少する相互作用剤投与量の広がりテストが、それぞれ、前記相互作用剤のうちの１つの最小阻害濃度（ＭＩＣ）の投与量を含む、請求項１３に記載の方法。
- 一過性変化が電流中に存在しない場合、さらに、単調減少する相互作用剤投与量の広がりテストを実施すること、または、異なる相互作用剤を適用して、生体試料が病原体を含まないか、もしくは病原体が相互作用剤のうちの１つに感受性であるかどうかを判定することを含む、請求項３に記載の方法。
- 前記単調増加する相互作用剤投与量の広がりテストまたは前記単調減少する相互作用剤投与量の広がりテストが、それぞれ、前記相互作用剤のうちの１つの最小阻害濃度（ＭＩＣ）の投与量を含む、請求項１５に記載の方法。
- 以下を含む、病原体を検出するための方法：
生体試料を病原体検出チップに適用すること；ここで、前記チップは、前記生体試料を収容するように構成された培養室と、前記培養室に電気的に結合されたセンサと、前記センサから電気信号を取得するように構成されたリーダとを含む；
センサを駆動すること；および
リーダを介してセンサからの電気信号を測定し、電気信号に基づいて生体試料の病原体関係情報を取得すること。 - 前記生体試料を前記病原体検出チップに適用することが、前記生体試料を、前記培養室に電気的に結合された前記センサの固体表面に接触させることを含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記病原体検出チップが、さらに、前記培養室へまたは前記培養室内で前記生体試料を接種し、濃縮し、希釈し、または濾過するように構成されたマイクロ流体構造を含む、請求項１７に記載の方法。
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| Title |
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| LAB ON A CHIP, vol. 17, JPN6022015988, 2017, pages 4283 - 4293, ISSN: 0004947966 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP3889268A1 (en) | 2021-10-06 |
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| US20210302366A1 (en) | 2021-09-30 |
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