JP2021165292A - Hematologic malignancy therapeutic agent, and screening method - Google Patents

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俊朗 岡崎
Toshiaki Okazaki
真 谷口
Makoto Taniguchi
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Kanazawa Medical University
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Kanazawa Medical University
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Abstract

To provide a novel hematologic malignancy therapeutic agent that is useful for treating hematologic malignancies (in particular, acute leukemia such as AML or ALL).SOLUTION: One embodiment of the present invention is a hematologic malignancy therapeutic agent containing an SMS2 inhibitor, an anti-SMS2 antibody, or a human bone marrow cell or immune cell deficient in the SMS2 gene as an active ingredient. Such a hematologic malignancy therapeutic agent is useful for enhancing an antitumor immune activity and treating hematologic malignancies (in particular, acute leukemia).SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、造血器腫瘍治療剤、およびそのスクリーニング方法の技術分野に属する。本発明は、SMS(スフィンゴミエリン合成酵素)2の機能を抑制することができる薬物等(例えば、SMS2阻害薬、抗SMS2抗体)を有効成分として含有することを特徴とする造血器腫瘍治療剤、およびそのためのSMS2阻害薬を見出すためのスクリーニング方法に関するものである。 The present invention belongs to the technical field of hematopoietic tumor therapeutic agents and screening methods thereof. The present invention is a hematopoietic tumor therapeutic agent, which comprises a drug or the like capable of suppressing the function of SMS (sphingomyelin synthase) 2 (for example, SMS2 inhibitor, anti-SMS2 antibody) as an active ingredient. And a screening method for finding an SMS2 inhibitor for that purpose.

造血器腫瘍である白血病は、血液細胞の一種である白血球が腫瘍化し白血病細胞となり、無制限に増殖する白血病細胞が、正常の赤血球、白血球、血小板等の産生を抑制し、貧血、感染症、出血などを引き起こす疾患である。白血病には急性白血病と慢性白血病があるが、特に難治性白血病である急性白血病の進行は非常に早く、早期の治療が行われなければ、僅か数ヶ月で患者は死へ至る。急性白血病としては、急性骨髄腫白血病(AML)、急性リンパ性白血病(ALL)などが知られている。AMLは成人に多い予後不良な悪性の血液疾患であり、5年生存率は40%程度である。 Leukemia, which is a hematopoietic tumor, is a type of blood cell in which white blood cells become tumors and become leukemia cells, and leukemia cells that proliferate indefinitely suppress the production of normal red blood cells, white blood cells, platelets, etc., resulting in anemia, infection, and bleeding. It is a disease that causes such things as. Leukemia includes acute leukemia and chronic leukemia, but acute leukemia, which is a refractory leukemia, progresses very quickly, and if not treated early, the patient will die in just a few months. As acute leukemia, acute myeloid leukemia (AML), acute lymphocytic leukemia (ALL) and the like are known. AML is a malignant blood disease with a poor prognosis, which is common in adults, and has a 5-year survival rate of about 40%.

現在、最も一般的に行われている急性白血病の治療法は、TCK(Total cell kill)と言われる方法であり、例えば、AMLではキロサイド(登録商標)、ALLではアントラサイクリンなどの抗がん剤により白血病細胞を正常骨髄細胞とともに死滅させる方法である。白血病細胞は抗がん剤に感受性が高いため、当該治療を繰り返すことにより、白血病細胞を完全に根絶させることができる。このような化学療法は非常に有効であるが、抗がん剤の副作用のため、患者には非常に負担が大きい。 Currently, the most commonly used treatment for acute leukemia is a method called TCK (Total cell kill). For example, anticancer cancers such as kiloside (registered trademark) in AML and anthracycline in ALL. It is a method of killing leukemia cells together with normal bone marrow cells by an agent. Since leukemia cells are highly sensitive to anticancer drugs, leukemia cells can be completely eradicated by repeating the treatment. Although such chemotherapy is very effective, it is very burdensome for the patient due to the side effects of anticancer drugs.

特許文献1には、化合物N−[2−(2,1,3−ベンゾチアジアゾール−5−イルアミノ)−6−(2,6−ジクロロフェニル)ピリド[2,3−d]ピリミジン−7−イル]−N’−(1,1−ジメチルエチル)−尿素またはこの水和物、塩もしくは溶媒和物と、少なくとも1種の医薬として許容可能な賦形剤とを含む、AMLなどの骨髄性白血病の治療用の医薬組成物が開示されている。当該医薬組成物は、従来の抗がん剤の治療法の代替療法として開発されたものであるが、抗がん剤を含有する医薬組成物であるため、上記と同様の副作用が懸念される。 Patent Document 1 describes the compound N- [2- (2,1,3-benzothiadiazole-5-ylamino) -6- (2,6-dichlorophenyl) pyrido [2,3-d] pyrimidin-7-yl]. -N'-(1,1-dimethylethyl) -urea or a hydrate, salt or solvate thereof for myeloid leukemia such as AML, which comprises at least one pharmaceutically acceptable excipient. Therapeutic pharmaceutical compositions are disclosed. The pharmaceutical composition was developed as an alternative therapy to the conventional treatment method of an anticancer drug, but since it is a pharmaceutical composition containing an anticancer drug, there is a concern about the same side effects as described above. ..

ところで、MLL/AF9キメラ遺伝子は、MLL(mixed linkage leucemia)遺伝子とAF9(ALL1 fused gene from chromosome 9)遺伝子とが、染色体転座によって融合することにより生じたキメラ遺伝子である。かかるキメラ遺伝子は、造血器腫瘍、特にAMLにおいて遺伝子発現量の増加が観察される。
当該遺伝子を人為的に造血器細胞に過剰発現させることにより、造血器細胞を腫瘍化できることが知られている(非特許文献1)。
By the way, the MLL / AF9 chimeric gene is a chimeric gene generated by fusion of an MLL (mixed linkage leukemia) gene and an AF9 (ALL1 fused gene from chromosome 9) gene by a chromosomal translocation. Such chimeric genes are observed to have increased gene expression levels in hematopoietic tumors, especially AML.
It is known that hematopoietic cells can be made into tumors by artificially overexpressing the gene in hematopoietic cells (Non-Patent Document 1).

急性白血病の研究には、その病態モデル動物、主にマウスが使用されている。病態モデルマウスは、例えば、発がん作用を有する上記MLL/AF9キメラ遺伝子等を過剰発現させた白血病細胞を、レシピエントマウスに移植することにより作製されるが、移植による白血病細胞の免疫拒絶を回避するため、レシピエントは、例えば放射線照射された免疫不全マウスであることが一般的である。
しかしながら、免疫不全マウスは、骨髄微小環境を有する免疫応答性(immunocompetent)の動物ではないため、腫瘍免疫活性を活用した治療法の研究には適さない。
The pathological model animals, mainly mice, have been used in the study of acute leukemia. The pathological model mouse is produced, for example, by transplanting a leukemia cell overexpressing the above-mentioned MLL / AF9 chimeric gene having a carcinogenic effect into a recipient mouse, but avoids immune rejection of the leukemia cell by transplantation. Therefore, the recipient is generally, for example, a irradiated immunodeficient mouse.
However, immunodeficient mice are not immunocompetent animals having a bone marrow microenvironment, and are therefore not suitable for research on therapeutic methods utilizing tumor immunoactivity.

SMSは、ホスファチジルコリンのリン酸コリン部分をセラミドに転移してスフィンゴミエリンを生成するとともに、ジアシルグリセロールを生成する酵素である。SMSは、ヒトでは細胞内での局在の異なるSMS1とSMS2の2つのホモログが知られている。
腫瘍とSMSの関係については、SMS1の欠損状態ががん細胞増殖抑制や遊走促進などに関与するが、SMS2のがん細胞機能への関与は少ないという報告がある(非特許文献2、3)。また、動物個体におけるSMS1やSMS2の病理的意義については、様々なマウス疾患モデルがSMS1やSMS2の遺伝子欠損(KO)マウスで実験され、SMS1欠損による難聴、耐糖能異常などが報告され、SMS2欠損では動脈硬化症や脂肪肝の抑制が報告されている(非特許文献4)。
SMS is an enzyme that transfers the choline phosphate portion of phosphatidylcholine to ceramide to produce sphingomyelin and diacylglycerol. Two homologues of SMS, SMS1 and SMS2, which have different intracellular localizations, are known in humans.
Regarding the relationship between tumor and SMS, it has been reported that the deficient state of SMS1 is involved in the suppression of cancer cell growth and the promotion of migration, but the involvement of SMS2 in the cancer cell function is small (Non-Patent Documents 2 and 3). .. Regarding the pathological significance of SMS1 and SMS2 in individual animals, various mouse disease models were tested in SMS1 and SMS2 gene-deficient (KO) mice, and hearing loss and impaired glucose tolerance due to SMS1 deficiency were reported, and SMS2 deficiency. Has been reported to suppress arteriosclerosis and fatty liver (Non-Patent Document 4).

特表2010−514743号公報Special Table 2010-514743

Nature, Vol 442, 17 August 2006, doi:10.1038/nature04980Nature, Vol 442, 17 August 2006, doi: 10.1038 / nature04980 Molecular and Cell Biology, 32(16): 3242-52, 2012Molecular and Cell Biology, 32 (16): 3242-52, 2012 J. Biol. Chem., 286(41): 36053-62., 2011J. Biol. Chem., 286 (41): 36053-62., 2011 疾患モデルの作製とその利用−脂質代謝異常と関連疾患:下巻(モデル動物利用マニュアルシリーズ)、第6章第8節、谷口真、岡崎俊朗、p348-357、エル・アイ・シーCreation of disease models and their use-Dyslipidemia and related diseases: Volume 2 (Model Animal Use Manual Series), Chapter 6, Section 8, Makoto Taniguchi, Toshiro Okazaki, p348-357, LIC

難治性腫瘍の白血病の発症、進展の阻止には白血病細胞の増殖抑制のみならず、抗腫瘍活性を担う骨髄微小環境細胞(B細胞,T細胞,NK細胞や骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)など)の制御、特に細胞障害性T細胞(CTL)の活性化やMDSCの抑制が必須である。近年、CTLを抑制するPD1/PDL系を抗体により阻害する事で抗腫瘍活性を復活する治療法が、肺がんやメラノーマで臨床応用され、白血病においても腫瘍免疫療法の有用性が実証されている。
上述のTCKのように、白血病細胞と共に正常造血細胞を死滅させることで患者の免疫機能を抑制してしまう療法だけでなく、患者自身の抗腫瘍免疫を利用した、難治性白血病に対する新規の抗腫瘍活性を亢進した治療法の開発が不可欠である。
本発明は、造血器腫瘍(特にAMLやALL等の急性白血病)の治療に有効な新規な造血器腫瘍治療剤を提供すること、またはその治療薬を見出すためのスクリーニング方法を提供することを主な課題とする。
Bone marrow microenvironmental cells (B cells, T cells, NK cells, bone marrow-derived immunosuppressive cells (MDSC), etc.) that are responsible for antitumor activity as well as suppressing the growth of leukemia cells are used to prevent the onset and progression of leukemia in refractory tumors. ), Especially activation of cytotoxic T cells (CTL) and suppression of MDSC are essential. In recent years, a therapeutic method that restores antitumor activity by inhibiting the PD1 / PDL system that suppresses CTL with an antibody has been clinically applied in lung cancer and melanoma, and the usefulness of tumor immunotherapy in leukemia has been demonstrated.
Not only the therapy that suppresses the patient's immune function by killing normal hematopoietic cells together with leukemia cells like TCK mentioned above, but also a new antitumor for refractory leukemia using the patient's own antitumor immunity. It is essential to develop a therapeutic method with enhanced activity.
The present invention mainly provides a novel therapeutic agent for hematopoietic tumors effective for the treatment of hematopoietic tumors (particularly acute leukemia such as AML and ALL), or a screening method for finding a therapeutic agent thereof. It is an issue.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、SMS2が造血器腫瘍に関係すること、およびSMS2の機能を阻害することにより抗腫瘍免疫が亢進され、造血器腫瘍を治療し得ることを見出し、本発明に到達した。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventors have enhanced antitumor immunity by relating SMS2 to hematopoietic tumors and inhibiting the function of SMS2 to treat hematopoietic tumors. We have found that we can obtain it and have reached the present invention.

本発明として、例えば、以下のものを挙げることができる。
[1]MLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する造血幹細胞を移植された免疫応答性の病態モデル動物を用いて、造血器腫瘍の治療のためのSMS2阻害薬を見出すことを特徴とする、スクリーニング方法。
[2]前記造血幹細胞が、次の1〜4の工程を含む方法により樹立されたものである、上記[1]に記載のスクリーニング方法。
1:動物の骨髄細胞に含まれる造血幹細胞を採取し、かかる幹細胞にMLL/AF9キメラ遺伝子を移入し、当該遺伝子が過剰発現する細胞を作製する工程、
2:上記1の工程において作製された細胞を、放射線照射された動物に投与ないし移植し、後に当該動物の骨髄からMLL/AF9遺伝子が過剰発現する細胞を採取する工程、
3:上記2の工程において採取された細胞を、上記2の工程で動物に照射された放射線よりも弱い放射線を照射された動物に投与ないし移植し、後に当該動物の骨髄からMLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する細胞を採取する工程、および
4:必要に応じて、徐々に動物に照射する放射線量を弱めながら、免疫応答性の動物に投与ないし移植することができるまで上記3の工程を1回以上繰り返す工程。
[3]動物が、マウスまたは造血幹細胞の移植が可能な動物である、上記[1]または[2]に記載のスクリーニング方法。
[4]造血器腫瘍が急性白血病である、上記[1]〜[3]のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
Examples of the present invention include the following.
[1] A screening method comprising finding an SMS2 inhibitor for the treatment of hematopoietic tumors using an immune-responsive pathological model animal transplanted with hematopoietic stem cells overexpressing the MLL / AF9 chimeric gene. ..
[2] The screening method according to the above [1], wherein the hematopoietic stem cells are established by a method including the following steps 1 to 4.
1: A step of collecting hematopoietic stem cells contained in animal bone marrow cells, transferring the MLL / AF9 chimeric gene into the stem cells, and preparing cells in which the gene is overexpressed.
2: A step of administering or transplanting the cells prepared in the above step 1 to an irradiated animal, and then collecting cells overexpressing the MLL / AF9 gene from the bone marrow of the animal.
3: The cells collected in the above 2 steps are administered or transplanted to an animal irradiated with a radiation weaker than the radiation irradiated to the animal in the above 2 steps, and later, the MLL / AF9 chimeric gene is administered from the bone marrow of the animal. Steps of collecting cells overexpressing the above, and 4: as needed, while gradually reducing the amount of radiation applied to the animals, the above 3 steps are performed until it can be administered or transplanted to an immunoresponsive animal. A process that repeats more than once.
[3] The screening method according to the above [1] or [2], wherein the animal is a mouse or an animal capable of transplanting hematopoietic stem cells.
[4] The screening method according to any one of the above [1] to [3], wherein the hematopoietic tumor is acute leukemia.

[5]SMS2遺伝子がノックアウトされている免疫応答性の動物に、MLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する造血幹細胞が移植されていることを特徴とする、病態モデル動物。
[6]次の1〜5の工程を含む方法により作製される、上記[5]に記載の病態モデル動物。
1:動物の骨髄細胞に含まれる造血幹細胞を採取し、かかる幹細胞にMLL/AF9キメラ遺伝子を移入し、当該遺伝子が過剰発現する細胞を作製する工程、
2:上記1の工程において作製された細胞を、放射線照射された動物に投与ないし移植し、後に当該動物の骨髄からMLL/AF9遺伝子が過剰発現する細胞を採取する工程、
3:上記2の工程において採取された細胞を、上記2の工程で動物に照射された放射線よりも弱い放射線を照射された動物に投与ないし移植し、後に当該動物の骨髄からMLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する細胞を採取する工程、
4:必要に応じて、徐々に動物に照射する放射線量を弱めながら、免疫応答性の動物に投与ないし移植することができるまで上記3の工程を1回以上繰り返す工程、および
5:上記3または4の工程において採取された細胞を、SMS2遺伝子がノックアウトされた放射線照射されていない免疫応答性の動物に投与ないし移植する工程。
[7]動物が、マウスまたは造血幹細胞の移植が可能な動物である、上記[5]または[6]に記載の病態モデル動物。
[5] A pathological model animal characterized in that hematopoietic stem cells overexpressing the MLL / AF9 chimeric gene are transplanted into an immune-responsive animal in which the SMS2 gene is knocked out.
[6] The pathological model animal according to the above [5], which is produced by a method including the following steps 1 to 5.
1: A step of collecting hematopoietic stem cells contained in animal bone marrow cells, transferring the MLL / AF9 chimeric gene into the stem cells, and preparing cells in which the gene is overexpressed.
2: A step of administering or transplanting the cells prepared in the above step 1 to an irradiated animal, and then collecting cells overexpressing the MLL / AF9 gene from the bone marrow of the animal.
3: The cells collected in the above 2 steps are administered or transplanted to an animal irradiated with a radiation weaker than the radiation irradiated to the animal in the above 2 steps, and later, the MLL / AF9 chimeric gene is administered from the bone marrow of the animal. The process of collecting cells that overexpress
4: If necessary, while gradually reducing the amount of radiation applied to the animal, the step of repeating the above 3 steps one or more times until the animal can be administered or transplanted to an immune-responsive animal, and 5: the above 3 or The step of administering or transplanting the cells collected in step 4 to an immune-responsive animal in which the SMS2 gene has been knocked out and has not been irradiated.
[7] The pathological model animal according to the above [5] or [6], wherein the animal is a mouse or an animal capable of transplanting hematopoietic stem cells.

[8]上記[5]〜[6]のいずれか一項に記載の病態モデル動物を用いることを特徴とする、造血器腫瘍の治療のための候補薬物を見出すためのスクリーニング方法。
[9]造血器腫瘍が急性白血病である、上記[8]に記載のスクリーニング方法。
[8] A screening method for finding a candidate drug for the treatment of hematopoietic tumor, which comprises using the pathological model animal according to any one of the above [5] to [6].
[9] The screening method according to the above [8], wherein the hematopoietic tumor is acute leukemia.

[10]SMS2阻害薬、抗SMS2抗体、またはSMS2遺伝子を欠損させたヒト骨髄細胞もしくは免疫細胞を有効成分として含有することを特徴とする、造血器腫瘍治療剤。
[11]造血器腫瘍が急性白血病である、上記[10]に記載の造血器腫瘍治療剤。
[10] A therapeutic agent for hematopoietic tumors, which comprises an SMS2 inhibitor, an anti-SMS2 antibody, or a human bone marrow cell or immune cell lacking the SMS2 gene as an active ingredient.
[11] The therapeutic agent for hematopoietic tumor according to the above [10], wherein the hematopoietic tumor is acute leukemia.

[12]次の1〜4の工程を含むことを特徴とする、造血器腫瘍の治療方法。
1:ヒトの骨髄細胞または免疫細胞を採取する工程、
2:採取した骨髄細胞または免疫細胞のSMS2遺伝子を欠損させる工程、
3:当該遺伝子を欠損させた細胞を増殖する工程、および
4:増殖した細胞を患者に移植ないし投与する工程。
[13]造血器腫瘍が急性白血病である、上記[12]に記載の治療方法。
[12] A method for treating a hematopoietic tumor, which comprises the following steps 1 to 4.
1: The process of collecting human bone marrow cells or immune cells,
2: A step of deleting the SMS2 gene of the collected bone marrow cells or immune cells,
3: A step of proliferating cells lacking the gene, and 4: a step of transplanting or administering the proliferated cells to a patient.
[13] The treatment method according to the above [12], wherein the hematopoietic tumor is acute leukemia.

本発明に係るスクリーニング方法によれば、抗腫瘍免疫活性を亢進させ、造血器腫瘍を治療し得るSMS2阻害薬を見出すことができる。また、造血器腫瘍を治療し得る造血器腫瘍治療剤を得ることができる。
本発明に係る造血器腫瘍治療剤は、特に、AMLなどの急性白血病に有用である。
According to the screening method according to the present invention, it is possible to find an SMS2 inhibitor capable of enhancing antitumor immune activity and treating hematopoietic tumors. In addition, a hematopoietic tumor therapeutic agent capable of treating a hematopoietic tumor can be obtained.
The therapeutic agent for hematopoietic tumors according to the present invention is particularly useful for acute leukemia such as AML.

本発明に係る病態モデルマウスの作製法の一例を示した模式図である。It is a schematic diagram which showed an example of the manufacturing method of the pathological condition model mouse which concerns on this invention. 本発明に係る病態モデルマウスに関する試験結果を表す。A図は移植後の体重の変化率(%)を示す。B図は移植後の生存率(%)を示す。最薄実線は、腫瘍化された造血幹細胞(腫瘍化細胞)を1×10(個)投与した場合の結果を、中薄実線は、腫瘍化細胞を1×10(個)投与した場合の結果を、実線は、腫瘍化細胞を1×10(個)投与した場合の結果を、破線は、腫瘍化細胞を2×10(個)投与した場合の結果を、それぞれ示す。C図は脾臓の写真である。左写真は野生型マウスの脾臓を、右写真は本発明に係る病態モデルマウスの脾臓を、それぞれ示す。D図は脾臓重量/体重比(%)を表す。左カラムは野生型マウスの結果を、右カラムは本発明に係る病態モデルマウスの結果を、それぞれ示す。The test result about the pathological condition model mouse which concerns on this invention is shown. Figure A shows the rate of change (%) in body weight after transplantation. Figure B shows the survival rate (%) after transplantation. The thinnest solid line is the result of administration of 1 × 10 4 (tumorized cells) of tumorized hematopoietic stem cells, and the medium thin solid line is the result of administration of 1 × 10 5 (pieces) of tumorigenic cells. The solid line shows the result when 1 × 10 6 (pieces) of tumorigenic cells were administered, and the broken line shows the result when 2 × 10 6 (pieces) of tumorigenic cells were administered. Figure C is a photograph of the spleen. The left photograph shows the spleen of a wild-type mouse, and the right photograph shows the spleen of a pathological model mouse according to the present invention. Figure D represents the spleen weight / body weight ratio (%). The left column shows the results of wild-type mice, and the right column shows the results of pathological model mice according to the present invention. 腫瘍化細胞移植後15日目の末梢血における血液細胞を染色した写真である。上2つの顕微鏡写真は野生型マウスの結果(左:倍率×100、右:倍率×400)を、下2つの写真は本発明に係る病態モデルマウスの結果(左:倍率×100、右:倍率×400)を、それぞれ示す。It is a photograph which stained the blood cell in the peripheral blood 15 days after the tumorigenic cell transplantation. The upper two photographs show the results of wild-type mice (left: magnification x 100, right: magnification x 400), and the lower two photographs show the results of the pathological model mouse according to the present invention (left: magnification x 100, right: magnification). × 400) are shown respectively. 本発明に係る病態モデルマウスにおける白血病細胞の病態を試験した結果を表す。A図は骨髄(左)および脾臓細胞(右)における白血病細胞の数を示す。B図は各臓器の写真を示す。C図は各臓器における白血病細胞の数を示す。The results of testing the pathological condition of leukemia cells in the pathological condition model mouse according to the present invention are shown. Figure A shows the number of leukemic cells in the bone marrow (left) and spleen cells (right). Figure B shows a photograph of each organ. Figure C shows the number of leukemia cells in each organ.

本発明に係る、SMS2遺伝子をノックアウトした(SMS2−KO)病態モデルマウスに関する試験結果を表す。A図は移植後の体重の変化率(%)を示す。B図は移植後の生存率(%)を示す。破線は、本発明に係るSMS2正常病態モデルマウスの結果を、2つの実線は、本発明に係るSMS2−KO病態モデルマウスを、それぞれ示す。C図は脾臓の写真である。左写真は本発明に係るSMS2正常病態モデルマウスの移植後19日目の結果を、中写真は本発明に係るSMS2正常病態モデルマウスの移植後21日目の結果を、本発明に係るSMS2−KO病態モデルマウスの移植後41日目の結果を、それぞれ示す。D図は脾臓重量/体重比(%)を表すグラフである。左カラムは本発明に係るSMS2正常病態モデルマウスの結果を、中カラムと右カラムは本発明に係るSMS2−KO病態モデルマウスの結果を、それぞれ示す。The test result about the pathological model mouse which knocked out the SMS2 gene (SMS2-KO) which concerns on this invention is shown. Figure A shows the rate of change (%) in body weight after transplantation. Figure B shows the survival rate (%) after transplantation. The broken line shows the result of the SMS2 normal pathological condition model mouse according to the present invention, and the two solid lines show the SMS2-KO pathological condition model mouse according to the present invention. Figure C is a photograph of the spleen. The left photograph shows the results 19 days after transplantation of the SMS2 normal pathological model mouse according to the present invention, and the middle photograph shows the results 21 days after transplantation of the SMS2 normal pathological model mouse according to the present invention. The results 41 days after transplantation of KO pathological model mice are shown. FIG. D is a graph showing the spleen weight / body weight ratio (%). The left column shows the results of the SMS2 normal pathological model mouse according to the present invention, and the middle column and the right column show the results of the SMS2-KO pathological model mouse according to the present invention. 移植前にX線を照射し、腫瘍化細胞を移植したマウスと本発明に係るSMS2−KO病態モデルマウスの試験結果を表す。A図は放射線照射後の体重の変化率(%)を示す。B図は移植後の生存率(%)を示す。薄破線と中薄実線は、SMS2正常病態モデルマウスの結果を、破線と残りの実線は、SMS2−KO病態モデルマウスの結果を、それぞれ示す。C図は生存時間(日)の比較を示す。The test results of a mouse transplanted with tumorigenic cells by irradiating X-rays before transplantation and an SMS2-KO pathological model mouse according to the present invention are shown. Figure A shows the rate of change (%) of body weight after irradiation. Figure B shows the survival rate (%) after transplantation. The dashed line and the medium-thin solid line indicate the results of the SMS2 normal pathological model mouse, and the dashed line and the remaining solid lines indicate the results of the SMS2-KO pathological model mouse. Figure C shows a comparison of survival times (days).

本発明に係るSMS2−KO病態モデルマウスに関する試験結果を表す。A図は移植後の生存率(%)を示す。薄実線は、本発明に係るSMS2正常病態モデルマウスの結果を、実線は、本発明に係るSMS2−KO病態モデルマウスの結果を、それぞれ示す。B図は移植後24日目の各組織の写真である。左写真は、本発明に係るSMS2正常病態モデルマウスの結果を、右写真は、本発明に係るSMS2−KO病態モデルマウスの結果を、それぞれ示す。C図は、各組織における白血病細胞数を表す。上図は、本発明に係るSMS2正常病態モデルマウスの結果を、下図は、本発明に係るSMS2−KO病態モデルマウスの結果を、それぞれ示す。左の4つの図は移植後16日目の結果を、右の6つの図は死亡時または移植後24日目の結果を、それぞれ示す。The test result about the SMS2-KO pathological model mouse which concerns on this invention is shown. Figure A shows the survival rate (%) after transplantation. The thin solid line shows the result of the SMS2 normal pathological condition model mouse according to the present invention, and the solid line shows the result of the SMS2-KO pathological condition model mouse according to the present invention. Figure B is a photograph of each tissue 24 days after transplantation. The left photo shows the results of the SMS2 normal pathological model mouse according to the present invention, and the right photo shows the results of the SMS2-KO pathological model mouse according to the present invention. Figure C shows the number of leukemia cells in each tissue. The upper figure shows the results of the SMS2 normal pathological condition model mouse according to the present invention, and the lower figure shows the results of the SMS2-KO pathological condition model mouse according to the present invention. The four figures on the left show the results 16 days after transplantation, and the six figures on the right show the results at the time of death or 24 days after transplantation. フローサイトメトリーによる分析結果を表す。A図はMDSCの量を、B図はCTLの量を、それぞれ分析した結果を示す。上各図は、本発明に係るSMS2正常病態モデルマウスの結果を、下各図は、本発明に係るSMS2−KO病態モデルマウスの結果を、それぞれ示す。Shows the analysis result by flow cytometry. Figure A shows the results of analyzing the amount of MDSC, and Figure B shows the results of analyzing the amount of CTL. The upper figures show the results of the SMS2 normal pathological condition model mouse according to the present invention, and the lower figures show the results of the SMS2-KO pathological condition model mouse according to the present invention.

1 本発明に係るスクリーニング方法
本発明に係るスクリーニング方法(本発明スクリーニング方法)は、MLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する造血幹細胞を移植された免疫応答性の病態モデル動物(以下、「本発明モデル動物」という。)を用いて、造血器腫瘍の治療のためのSMS2阻害薬を見出すことを特徴とする。
1 Screening method according to the present invention The screening method according to the present invention (the screening method of the present invention) is an immune-responsive pathological model animal transplanted with hematopoietic stem cells overexpressing the MLL / AF9 chimeric gene (hereinafter, "model of the present invention"). It is characterized by finding an SMS2 inhibitor for the treatment of hematopoietic tumors using "animals").

1.1 MLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する造血幹細胞
本発明モデル動物に移植された造血幹細胞は、MLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する。当該遺伝子を人為的に骨髄細胞に過剰発現させることにより、造血幹細胞を腫瘍化することができる。本発明モデル動物を作製するためのMLL/AF9キメラ遺伝子は、通常、ヒトの当該遺伝子であるが、ヒト以外の動物(例えば、マウス、ラット、モルモット、フェレット、ウサギ、イヌ、ネコ、イタチ、サル等の哺乳動物)の相当する遺伝子であってもよい。
1.1 Hematopoietic stem cells overexpressing the MLL / AF9 chimeric gene The hematopoietic stem cells transplanted into the model animal of the present invention overexpress the MLL / AF9 chimeric gene. By artificially overexpressing the gene in bone marrow cells, hematopoietic stem cells can be tumorigenic. The MLL / AF9 chimeric gene for producing the model animal of the present invention is usually the human gene, but non-human animals (eg, mice, rats, guinea pigs, ferrets, rabbits, dogs, cats, weasels, monkeys). It may be a gene corresponding to (such as a mammal).

造血幹細胞は、骨髄細胞中の1万〜10万個に一つ程度の割合で存在する細胞であり、白血球(好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、マクロファージ)、赤血球、血小板、肥満細胞、樹状細胞等を生み出す細胞である。したがって、造血幹細胞は、モデル動物(ドナー)の骨髄から採取した骨髄細胞に含まれており、かかる骨髄細胞をそのまま移植して本発明モデル動物を作製することができる。また、骨髄細胞をフローサイトメトリー等の従来の手法で選別ソート(例えば、c−kit Sca−1 Lin)した造血幹細胞を移植して本発明モデル動物を作製することもできる。 Hematopoietic stem cells are cells that are present at a ratio of about 1 in 10,000 to 100,000 in bone mast cells, and are leukocytes (neutrophils, eosinophils, basal spheres, lymphocytes, monospheres, macrophages), It is a cell that produces red blood cells, white blood cells, mast cells, dendritic cells, and the like. Therefore, hematopoietic stem cells are contained in bone marrow cells collected from the bone marrow of a model animal (donor), and the bone marrow cells can be directly transplanted to prepare the model animal of the present invention. Moreover, sort sorted bone marrow cells in a conventional manner in the flow cytometry (e.g., c-kit + Sca-1 + Lin -) hematopoietic stem cells can also be made transplanted to the present invention an animal model.

ここで「過剰発現する」とは、ベクター等を用いて細胞に遺伝子を導入し、遺伝子発現量が遺伝子未導入細胞に比較して増加していることを意味し、発現量そのものの増加量の程度は問題としない。
上記ベクターとしては、通常、ウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクターが挙げられる。
Here, "overexpressing" means that a gene is introduced into a cell using a vector or the like and the gene expression level is increased as compared with a gene-unintroduced cell, and the expression level itself is increased. Degree does not matter.
As the vector, a viral vector is usually used. Examples of the viral vector include a retrovirus vector, a lentiviral vector, an adeno-associated virus vector, and an adenovirus vector.

本発明モデル動物は、MLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現すればよく、MLL/AF9キメラ遺伝子が単独発現するものでも、他の遺伝子も同時発現するものでもよいが、MLL/AF9キメラ遺伝子が単独発現するものが好ましい。 In the model animal of the present invention, the MLL / AF9 chimeric gene may be overexpressed, and the MLL / AF9 chimeric gene may be expressed alone or other genes may be co-expressed, but the MLL / AF9 chimeric gene is expressed alone. Is preferable.

1.2 免疫応答性の動物
本発明スクリーニング方法には、免疫応答性(immunocompetent)の動物が用いられる。免疫応答性の動物は、抗腫瘍活性を有する正常骨髄微小環境(B細胞,T細胞,NK細胞やMDSCなど)を保持する動物である。造血器腫瘍のモデル動物には、免疫不全動物を使用するのが一般的であるが、本発明スクリーニング方法においては免疫応答性の動物、例えば野生型の動物をレシピエントとして使用することができる。
1.2 Immune-responsive animals Immune-responsive animals are used in the screening method of the present invention. Immune-responsive animals are animals that retain a normal bone marrow microenvironment with antitumor activity (B cells, T cells, NK cells, MDSCs, etc.). Although immunodeficient animals are generally used as model animals for hematopoietic tumors, immune-responsive animals such as wild-type animals can be used as recipients in the screening method of the present invention.

ここで、本発明モデル動物の動物種としては、造血幹細胞の移植が可能な動物であれば特に制限されない。かかる動物としては、具体的には、例えば、マウス、ラット、モルモット、フェレット、ウサギ、イヌ、ネコ、イタチ、サル等の哺乳動物を挙げることができる。この中、マウスが好ましい。 Here, the animal species of the model animal of the present invention is not particularly limited as long as it is an animal capable of transplanting hematopoietic stem cells. Specific examples of such animals include mammals such as mice, rats, guinea pigs, ferrets, rabbits, dogs, cats, weasels, and monkeys. Of these, mice are preferred.

1.3 造血幹細胞の移植
MLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する腫瘍化された造血幹細胞(以下、「腫瘍化細胞」という。)は、免疫応答性の動物に移植される。当該腫瘍化細胞が移植される部位としては、例えば、骨髄、血管内、リンパ節が挙げられる。腫瘍化細胞は、移植されることにより、主として、レシピエントの骨髄に生着し、レシピエントは造血器腫瘍を発病する。
1.3 Transplantation of hematopoietic stem cells Tumorized hematopoietic stem cells (hereinafter referred to as “tumorized cells”) overexpressing the MLL / AF9 chimeric gene are transplanted into immunoresponsive animals. Sites where the tumorigenic cells are transplanted include, for example, bone marrow, intravascular, and lymph nodes. By transplantation, the tumorigenic cells engraft mainly in the bone marrow of the recipient, and the recipient develops a hematopoietic tumor.

1.4 造血器腫瘍の治療のためのSMS2阻害薬
本発明スクリーニング方法により、造血器腫瘍の治療のためのSMS2阻害薬を見出すことができる。当該スクリーニングは、通常、複数の候補薬物を本発明モデル動物に投与し、その効果効能を比較することにより行われ、有効性のあるSMS2阻害薬が選別される。
1.4 SMS2 Inhibitors for the Treatment of Hematopoietic Tumors According to the screening method of the present invention, SMS2 inhibitors for the treatment of hematopoietic tumors can be found. The screening is usually performed by administering a plurality of candidate drugs to the model animal of the present invention and comparing their efficacy and efficacy, and an effective SMS2 inhibitor is selected.

本発明スクリーニング方法が対象とする造血器腫瘍としては、造血器細胞の腫瘍であれば特に制限されないが、例えば、急性白血病を挙げることができる。急性白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ性白血病(ALL)、骨髄異形性症候群(MDS)、乳児白血病、二次性白血病が挙げられる。 The hematopoietic tumor targeted by the screening method of the present invention is not particularly limited as long as it is a tumor of hematopoietic cells, and examples thereof include acute leukemia. Examples of acute leukemia include acute myeloid leukemia (AML), acute lymphocytic leukemia (ALL), myelodysplastic syndrome (MDS), infantile leukemia, and secondary leukemia.

本発明スクリーニング方法によりスクリーニングされる候補薬物としては、SMS2の阻害作用を有しうるものであれば特に制限されないが、例えば、SMS2の阻害作用を有しうる、低分子化合物、抗体を挙げることができる。本発明スクリーニング方法においては、候補薬物を本発明モデル動物に投与し、SMS2の阻害作用、抗腫瘍免疫活性、造血器腫瘍の治療効果等を調べることにより、造血器腫瘍の治療に有効なSMS2阻害薬をスクリーニングすることができる。また、既知のSMS2阻害薬の中から、より有効な薬物を選別するために本発明スクリーニング方法を用いることもできる。
The candidate drug screened by the screening method of the present invention is not particularly limited as long as it can have an inhibitory effect on SMS2, and examples thereof include small molecule compounds and antibodies that can have an inhibitory effect on SMS2. can. In the screening method of the present invention, a candidate drug is administered to a model animal of the present invention, and SMS2 inhibition effective for the treatment of hematopoietic tumor is examined by examining the inhibitory effect of SMS2, antitumor immunoactivity, therapeutic effect of hematopoietic tumor, and the like. Drugs can be screened. In addition, the screening method of the present invention can also be used to select a more effective drug from among known SMS2 inhibitors.

2 本発明に係る腫瘍化細胞
腫瘍化細胞は、次の1〜4の工程を含む方法により樹立されたもの(以下、「本発明腫瘍化細胞」という。)であることが好ましい(図1参照)。なお、動物の定義等は、前述と同義である。
1:動物の骨髄細胞に含まれる造血幹細胞を採取し、かかる幹細胞にMLL/AF9キメラ遺伝子を移入し、当該遺伝子が過剰発現する細胞を作製する工程、
2:上記1の工程において作製された細胞を、放射線照射された動物に移植し、後に当該動物の骨髄からMLL/AF9遺伝子が過剰発現する細胞を採取する工程、
3:上記2の工程において採取された細胞を、上記2の工程で動物に照射された放射線よりも弱い放射線を照射された動物に投与ないし移植し、後に当該動物の骨髄からMLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する細胞を採取する工程、および
4:必要に応じて、徐々に動物に照射する放射線量を弱めながら、免疫応答性の動物に投与ないし移植することができるまで上記3の工程を1回以上繰り返す工程。
2 Tumorized cells according to the present invention Tumorized cells are preferably those established by a method including the following steps 1 to 4 (hereinafter, referred to as “tumorized cells of the present invention”) (see FIG. 1). ). The definition of animal is synonymous with the above.
1: A step of collecting hematopoietic stem cells contained in animal bone marrow cells, transferring the MLL / AF9 chimeric gene into the stem cells, and preparing cells in which the gene is overexpressed.
2: A step of transplanting the cells prepared in the above step 1 into an irradiated animal and then collecting cells overexpressing the MLL / AF9 gene from the bone marrow of the animal.
3: The cells collected in the above 2 steps are administered or transplanted to an animal irradiated with a radiation weaker than the radiation irradiated to the animal in the above 2 steps, and later, the MLL / AF9 chimeric gene is administered from the bone marrow of the animal. Steps of collecting cells overexpressing the above, and 4: as needed, while gradually reducing the amount of radiation applied to the animals, the above 3 steps are performed until it can be administered or transplanted to an immunoresponsive animal. A process that repeats more than once.

以下、それぞれの工程について詳述する。 Hereinafter, each step will be described in detail.

(1)第1工程
第1工程は、動物の骨髄細胞に含まれる造血幹細胞を採取し、かかる幹細胞にMLL/AF9キメラ遺伝子を移入し、当該遺伝子が過剰発現する細胞を作製する工程である。
第1工程として、具体的には、例えば、次のような方法を挙げることができる。MLL/AF9キメラ遺伝子を含むウイルスベクター(例、レトロウイルスベクター)をパッケージ細胞であるPLAT−Eで増産する。一方、ドナー動物の造血幹細胞が含まれる骨髄細胞を採取し、必要に応じて、フローサイトメトリー等の従来の手法で選別ソートし、当該造血幹細胞にMLL/AF9キメラ遺伝子を含む前記ウイルスベクターを感染させることにより、MLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する第1工程の細胞を作製することができる。
(1) First Step The first step is a step of collecting hematopoietic stem cells contained in animal bone marrow cells, transferring the MLL / AF9 chimeric gene into the stem cells, and producing cells in which the gene is overexpressed.
Specifically, as the first step, for example, the following method can be mentioned. Increase production of viral vectors containing the MLL / AF9 chimeric gene (eg, retroviral vectors) in PLAT-E packaged cells. On the other hand, bone marrow cells containing hematopoietic stem cells of donor animals are collected, and if necessary, sorted and sorted by a conventional method such as flow cytometry, and the hematopoietic stem cells are infected with the virus vector containing the MLL / AF9 chimeric gene. By allowing the cells to be overexpressed, the cells of the first step in which the MLL / AF9 chimeric gene is overexpressed can be prepared.

(2)第2工程
第2工程は、第1工程において作製された細胞を、放射線照射された動物に投与ないし移植し、後に当該動物の骨髄からMLL/AF9遺伝子が過剰発現する細胞を採取する工程である。
(2) Second step In the second step, the cells prepared in the first step are administered or transplanted to an irradiated animal, and then cells overexpressing the MLL / AF9 gene are collected from the bone marrow of the animal. It is a process.

レシピエント動物に放射線を照射することにより、当該動物の免疫機能が抑制され、免疫拒絶反応を引き起こすことなく、第1工程で得られた細胞を投与ないし移植することができ、定着させることができる。放射線としては、通常、X線が使用される。第2工程における放射線の照射量としては、レシピエント動物の種類などによって異なるが、致死量より少し低い量が好ましい。マウスの場合には、通常、X線量として10Gy(グレイ)または9.5Gy程度である。 By irradiating the recipient animal with radiation, the immune function of the animal is suppressed, and the cells obtained in the first step can be administered or transplanted without causing an immune rejection reaction, and can be established. .. X-rays are usually used as the radiation. The amount of radiation in the second step varies depending on the type of recipient animal and the like, but is preferably a little lower than the lethal dose. In the case of mice, the X-ray dose is usually about 10 Gy (gray) or 9.5 Gy.

投与ないし移植する当該細胞数としては、レシピエント動物の種類などによって異なるが、例えばマウスの場合、1×10〜1×10(個)の範囲内が適当であり、1×10〜5×10(個)の高容量投与により移植成功率が向上する。1×10(個)より少ないと、レシピエントマウスにおいて当該造血器腫瘍細胞が十分に増加しないおそれがあり、1×10(個)より多いと、血管内腫瘍血栓のおそれがあるので適当でない。 The number of cells to be administered or transplanted varies depending on the type of recipient animal, etc., but in the case of mice, for example, the range of 1 × 10 3 to 1 × 10 7 (cells) is appropriate, and 1 × 10 5 to 1 × 10 5 to High-dose administration of 5 × 10 6 (pieces) improves the success rate of transplantation. If it is less than 1 × 10 3 (pieces), the hematopoietic tumor cells may not increase sufficiently in the recipient mouse, and if it is more than 1 × 10 7 (pieces), there is a risk of intravascular tumor thrombus, so it is appropriate. Not.

続いて、第1工程で得られた細胞を、放射線照射したレシピエント動物に投与ないし移植した後、当該動物の骨髄からMLL/AF9遺伝子が過剰発現する細胞を採取する。当該投与ないし移植から第2工程の細胞の採取までの期間としては、レシピエント動物が死亡する直前が好ましく、レシピエント動物の種類などによって異なるが、例えばマウスの場合、ドナー細胞として1×10個のMML/AF9発現骨髄細胞を用いた場合には40〜70日間が好ましい細胞採取期間となる。 Subsequently, the cells obtained in the first step are administered or transplanted to the irradiated recipient animal, and then the cells overexpressing the MLL / AF9 gene are collected from the bone marrow of the animal. The as the period from administration to transplantation until harvesting of the cells in the second step, preferably immediately before the recipient animal is killed, varies depending on the type of the recipient animal, for example, in the case of mouse, 1 × 10 5 as donor cells When 100 MML / AF9 expressing bone marrow cells are used, 40 to 70 days is a preferable cell collection period.

(3)第3工程
第3工程は、第2工程において採取された細胞を、第2工程で動物に照射された放射線よりも弱い放射線を照射された動物に投与ないし移植し、後に当該動物の骨髄からMLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する細胞を採取する工程である。
(3) Third step In the third step, the cells collected in the second step are administered or transplanted to an animal irradiated with radiation weaker than the radiation irradiated to the animal in the second step, and later, the animal concerned. This is a step of collecting cells overexpressing the MLL / AF9 chimeric gene from the bone marrow.

第2工程で得られた細胞は、第2工程と比較して弱い放射線を照射したレシピエント動物であっても、免疫拒絶反応を引き起こすことなく、第2工程で得られた細胞を投与ないし移植することができ、定着させることができる。第3工程における放射線の照射量としては、レシピエント動物の種類などによって異なるが、例えばマウスの場合、第2工程の照射量の35〜85%程度が適当であり、45〜75%程度が好ましく、55〜65%程度がより好ましい。 The cells obtained in the second step are administered or transplanted with the cells obtained in the second step without causing immunorejection, even if the recipient animal is irradiated with weak radiation as compared with the second step. Can be done and can be fixed. The irradiation amount of radiation in the third step varies depending on the type of recipient animal and the like, but in the case of a mouse, for example, about 35 to 85% of the irradiation amount in the second step is appropriate, and about 45 to 75% is preferable. About 55 to 65% is more preferable.

投与ないし移植する当該細胞数としては、レシピエント動物の種類などによって異なるが、
例えばマウスの場合、1×10〜1×10(個)の範囲内が適当であり、1×10〜5×10(個)の高容量投与により移植成功率が向上する。1×10(個)より少ないと、レシピエントマウスにおいて当該造血器腫瘍細胞が十分に増加しないおそれがあり、1×10(個)より多いと、血管内腫瘍血栓のおそれがあるので適当でない。
The number of cells to be administered or transplanted varies depending on the type of recipient animal, etc.
For example, in the case of mice, the range of 1 × 10 3 to 1 × 10 7 (pieces) is appropriate, and the high-dose administration of 1 × 10 5 to 5 × 10 6 (pieces) improves the success rate of transplantation. If it is less than 1 × 10 3 (pieces), the hematopoietic tumor cells may not increase sufficiently in the recipient mouse, and if it is more than 1 × 10 7 (pieces), there is a risk of intravascular tumor thrombus, so it is appropriate. Not.

続いて、第2工程で得られた細胞を、放射線照射したレシピエント動物に投与ないし移植した後、当該動物の骨髄からMLL/AF9遺伝子が過剰発現する細胞を採取する。当該投与ないし移植から第3工程の細胞の採取までの期間としては、レシピエント動物が死亡する直前が好ましく、レシピエント動物の種類などによって異なるが、例えばマウスの場合、25〜60日間が適当であり、30〜50日間が好ましく、35〜45日間がより好ましい。 Subsequently, the cells obtained in the second step are administered or transplanted to the irradiated recipient animal, and then the cells overexpressing the MLL / AF9 gene are collected from the bone marrow of the animal. The period from the administration or transplantation to the collection of cells in the third step is preferably immediately before the death of the recipient animal, and varies depending on the type of recipient animal, for example, in the case of mice, 25 to 60 days is appropriate. There are, preferably 30 to 50 days, more preferably 35 to 45 days.

(4)第4工程
第4工程は、必要に応じて、徐々に動物に照射する放射線量を弱めながら第3工程を1回以上繰り返す工程である。
(4) Fourth Step The fourth step is a step of repeating the third step one or more times while gradually reducing the radiation dose irradiating the animal as needed.

第3工程において採取された細胞を、放射線照射しない免疫応答性のレシピエント動物に投与ないし移植すると、免疫拒絶反応を引き起こす場合には、第4工程、即ち、徐々に動物に照射する放射線量を弱めながら第3工程を1回以上、通常は1〜5回程度まで、好ましくは1、2回程度繰り返す。第3工程において採取された細胞を、放射線照射しない免疫応答性のレシピエント動物に投与ないし移植しても、免疫拒絶反応を引き起こさない場合には、本工程を行う必要はない。 If the cells collected in the third step are administered or transplanted to an immune-responsive recipient animal that is not irradiated to cause an immune rejection reaction, the fourth step, that is, the radiation dose to be gradually irradiated to the animal is applied. While weakening, the third step is repeated once or more, usually about 1 to 5 times, preferably about 1 or 2 times. If the cells collected in the third step are not induced to cause immunorejection even when administered or transplanted to an immune-responsive recipient animal that is not irradiated, this step does not need to be performed.

第4工程における放射線の照射量としては、レシピエント動物の種類などによって異なるが、例えばマウスの場合、第3工程または前工程の照射量の35〜85%程度が適当であり、45〜75%程度が好ましく、55〜65%程度がより好ましい。 The irradiation amount of radiation in the fourth step varies depending on the type of recipient animal and the like, but in the case of a mouse, for example, about 35 to 85% of the irradiation amount in the third step or the previous step is appropriate, and 45 to 75%. The degree is preferable, and about 55 to 65% is more preferable.

投与ないし移植する細胞数としては、レシピエント動物の種類などによって異なるが、例えばマウスの場合、1×10〜1×10(個)の範囲内が適当であり、1×10〜5×10(個)の高容量投与により移植成功率が向上する。1×10(個)より少ないと、レシピエントマウスにおいて当該造血器腫瘍細胞が十分に増加しないおそれがあり、1×10(個)より多いと、血管内腫瘍血栓のおそれがあるので適当でない。 The number of cells to be administered or transplanted varies depending on the type of recipient animal, etc., but in the case of mice, for example, the range of 1 × 10 3 to 1 × 10 7 (cells) is appropriate, and 1 × 10 5 to 5 The success rate of transplantation is improved by high-dose administration of × 10 6 (pieces). If it is less than 1 × 10 3 (pieces), the hematopoietic tumor cells may not increase sufficiently in the recipient mouse, and if it is more than 1 × 10 7 (pieces), there is a risk of intravascular tumor thrombus, so it is appropriate. Not.

第4工程を行う場合、第3工程または前工程で得られた細胞を、放射線照射したレシピエント動物に投与ないし移植した後、当該動物の骨髄からMLL/AF9遺伝子が過剰発現する細胞を採取する。当該投与ないし移植から第4工程の細胞の採取までの期間としては、レシピエント動物が死亡する直前が好ましく、レシピエント動物の種類などによって異なるが、例えば、マウスの場合、25〜60日間が適当であり、30〜50日間が好ましく、35〜45日間がより好ましい。 When the fourth step is performed, the cells obtained in the third step or the previous step are administered or transplanted to the irradiated recipient animal, and then the cells overexpressing the MLL / AF9 gene are collected from the bone marrow of the animal. .. The period from the administration or transplantation to the collection of cells in the fourth step is preferably immediately before the death of the recipient animal, and varies depending on the type of recipient animal, etc., but for example, in the case of mice, 25 to 60 days is appropriate. It is preferably 30 to 50 days, more preferably 35 to 45 days.

第3工程または本工程により、放射線を照射しない免疫応答性のレシピエント動物であっても、免疫拒絶反応を引き起こすことなく、投与ないし移植することができ、また定着させることができる本発明腫瘍化細胞を得ることができる。 By the third step or this step, even an immune-responsive recipient animal that is not irradiated with radiation can be administered or transplanted without causing immunorejection, and can be established as a tumor of the present invention. Cells can be obtained.

上述の方法により樹立された本発明腫瘍化細胞は、動物への移植に際して、免疫拒絶反応が抑制されており、免疫応答性の動物に移植することができる。また、本発明腫瘍化細胞が移植された動物は、MLL/AF9遺伝子が単独で過剰発現し、免疫応答性を有しながら白血病等の造血器腫瘍を発症させることができる。
したがって、本発明腫瘍化細胞を移植された動物は、造血器腫瘍の病態モデル動物として有用である。
なお、免疫応答性の動物への本発明腫瘍化細胞の投与ないし移植する細胞数としては、レシピエント動物の種類などによって異なるが、例えばマウスの場合、1×10〜1×10(個)の範囲内が適当であり、1×10〜1×10(個)の範囲内が好ましく、1×10〜5×10(個)の範囲内がより好ましい。1×10(個)より少ないと、レシピエントマウスにおいて当該造血器腫瘍細胞が十分に増加せず、造血器腫瘍を発病しないおそれがあり、1×10(個)より多いと、血管内腫瘍血栓のおそれがあるので適当でない。
The tumorigenic cells of the present invention established by the above-mentioned method have suppressed immune rejection when transplanted into animals, and can be transplanted into immunoresponsive animals. In addition, the animal into which the tumorigenic cells of the present invention have been transplanted can overexpress the MLL / AF9 gene alone and develop hematopoietic tumors such as leukemia while having immunoresponsiveness.
Therefore, the animal transplanted with the tumorigenic cells of the present invention is useful as a pathological model animal for hematopoietic tumors.
The number of cells to be administered or transplanted from the tumorigenic cells of the present invention to immune-responsive animals varies depending on the type of recipient animal, etc., but in the case of mice, for example, 1 × 10 3 to 1 × 10 7 (cells). ) Is appropriate, preferably in the range of 1 × 10 4 to 1 × 10 6 (pieces), and more preferably in the range of 1 × 10 5 to 5 × 10 6 (pieces). If it is less than 1 × 10 3 (pieces), the number of the hematopoietic tumor cells does not increase sufficiently in the recipient mouse, and hematopoietic tumors may not develop. If it is more than 1 × 10 7 (pieces), it is intravascular. Not suitable as there is a risk of tumor thrombus.

3 SMS2遺伝子がノックアウトされている病態モデル動物
本発明は、SMS2遺伝子がノックアウトされている免疫応答性の動物に、MLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する造血幹細胞が移植されていることを特徴とする病態モデル動物(以下、「本発明SMS2−KO動物」という。)を含む。
3 Pathological model animal in which the SMS2 gene is knocked out The present invention is characterized in that hematopoietic stem cells overexpressing the MLL / AF9 chimeric gene are transplanted into an immunoresponsive animal in which the SMS2 gene is knocked out. A pathological model animal (hereinafter, referred to as "SMS2-KO animal of the present invention") is included.

本発明SMS2−KO動物は、SMS2遺伝子がノックアウトされているだけで、免疫機能を保持している。しかも、後述する試験例から明らかな通り、腫瘍免疫が亢進しており、CTLの増強とMDSCの抑制が同時に確認され、その結果、腫瘍化細胞が移植されていても、SMS2遺伝子がノックアウトされていない動物と異なり、造血器腫瘍の発病が抑えられ、延命できることを本発明者らは見出した。したがって、SMS2の機能を、例えばSMS2阻害薬などで抑制することより、急性白血病等の造血器腫瘍を治療しうる。 The SMS2-KO animal of the present invention retains an immune function only by knocking out the SMS2 gene. Moreover, as is clear from the test examples described later, tumor immunity is enhanced, and enhancement of CTL and suppression of MDSC are confirmed at the same time. As a result, even if tumorigenic cells are transplanted, the SMS2 gene is knocked out. The present inventors have found that, unlike animals without hematopoietic tumors, the onset of hematopoietic tumors can be suppressed and their lives can be extended. Therefore, hematopoietic tumors such as acute leukemia can be treated by suppressing the function of SMS2 with, for example, an SMS2 inhibitor.

本発明SMS2−KO動物としては、例えば、次の1〜5の工程を含む方法により作製されるものが好ましい。なお、動物の定義等は、前述と同義である。
1:動物の骨髄細胞に含まれる造血幹細胞を採取し、かかる幹細胞にMLL/AF9キメラ遺伝子を移入し、当該遺伝子が過剰発現する細胞を作製する工程、
2:上記1の工程において作製された細胞を、放射線照射された動物に投与ないし移植し、後に当該動物の骨髄からMLL/AF9遺伝子が過剰発現する細胞を採取する工程、
3:上記2の工程において採取された細胞を、上記2の工程で動物に照射された放射線よりも弱い放射線を照射された動物に投与ないし移植し、後に当該動物の骨髄からMLL/AF9キメラ遺伝子が過剰発現する細胞を採取する工程、
4:必要に応じて、徐々に動物に照射する放射線量を弱めながら、免疫応答性の動物に投与ないし移植することができるまで上記3の工程を1回以上繰り返す工程、および
5:上記3または4の工程において採取された細胞を、SMS2遺伝子がノックアウトされた放射線照射されていない免疫応答性の動物に投与ないし移植する工程。
As the SMS2-KO animal of the present invention, for example, those produced by a method including the following steps 1 to 5 are preferable. The definition of animal is synonymous with the above.
1: A step of collecting hematopoietic stem cells contained in animal bone marrow cells, transferring the MLL / AF9 chimeric gene into the stem cells, and preparing cells in which the gene is overexpressed.
2: A step of administering or transplanting the cells prepared in the above step 1 to an irradiated animal, and then collecting cells overexpressing the MLL / AF9 gene from the bone marrow of the animal.
3: The cells collected in the above 2 steps are administered or transplanted to an animal irradiated with a radiation weaker than the radiation irradiated to the animal in the above 2 steps, and later, the MLL / AF9 chimeric gene is administered from the bone marrow of the animal. The process of collecting cells that overexpress
4: If necessary, while gradually reducing the amount of radiation applied to the animal, the step of repeating the above 3 steps one or more times until the animal can be administered or transplanted to an immune-responsive animal, and 5: the above 3 or The step of administering or transplanting the cells collected in step 4 to an immune-responsive animal in which the SMS2 gene has been knocked out and has not been irradiated.

上記第1工程〜第4工程までは、前述の項目2と同様である。第1工程〜第4工程までの動物は、SMS2遺伝子が正常発現していることが好ましい。
第1工程〜第4工程により樹立された腫瘍化細胞(本発明腫瘍化細胞)を、SMS2遺伝子がノックアウトされた放射線照射されていない免疫応答性の動物に投与ないし移植することにより、本発明SMS2−KO動物を作製することができる(第5工程)。
The first to fourth steps are the same as those in item 2 described above. It is preferable that the SMS2 gene is normally expressed in the animals from the first step to the fourth step.
By administering or transplanting the tumorigenic cells (tumorized cells of the present invention) established by the first to fourth steps into an immune-responsive animal in which the SMS2 gene has been knocked out and not irradiated, the SMS2 of the present invention -KO animals can be produced (5th step).

SMS2遺伝子がノックアウトされた放射線照射されていない免疫応答性の動物への投与ないし移植する細胞数としては、レシピエント動物の種類などによって異なるが、例えばマウスの場合、1×10〜1×10(個)の範囲内が適当であり、1×10〜1×10(個)の範囲内が好ましく、1×10〜5×10(個)の範囲内がより好ましい。 The number of cells to be administered or transplanted to an immune-responsive animal in which the SMS2 gene has been knocked out and not irradiated varies depending on the type of recipient animal, for example, in the case of mice, 1 × 10 3 to 1 × 10. The range of 7 (pieces) is appropriate, preferably the range of 1 × 10 4 to 1 × 10 6 (pieces), and more preferably the range of 1 × 10 5 to 5 × 10 6 (pieces).

本発明SMS2−KO動物は、造血器腫瘍の治療のための候補薬物をスクリーニングするために用いることができる。本発明には、本発明SMS2−KO動物を用いることを特徴とする、造血器腫瘍の治療のための候補薬物を見出すためのスクリーニング方法も含まれる。 The SMS2-KO animals of the present invention can be used to screen for candidate drugs for the treatment of hematopoietic tumors. The present invention also includes a screening method for finding candidate drugs for the treatment of hematopoietic tumors, which comprises using the SMS2-KO animals of the present invention.

本発明SMS2−KO動物と当該遺伝子がノックアウトされていない通常のモデル動物(例、非SMS2−KOの本発明モデル動物)を用いて、本発明スクリーニング方法の結果を比較することにより、SMS2阻害剤の候補薬物の効能効果が、SMS2の阻害によるものであるということを、より明確にすることができる。また、本発明SMS2−KO動物に、SMS2阻害剤以外の抗腫瘍剤を投与することにより、SMS2阻害剤と当該薬剤の併用効果を予測することもできる。
本発明SMS2−KO動物を用いた本発明スクリーニング方法は、SMS2阻害剤の実用化に向けた研究に有用である。
By comparing the results of the screening method of the present invention using the SMS2-KO animal of the present invention and a normal model animal in which the gene is not knocked out (eg, a model animal of the present invention of non-SMS2-KO), the SMS2 inhibitor It can be further clarified that the efficacy and effect of the candidate drug is due to the inhibition of SMS2. In addition, by administering an antitumor agent other than the SMS2 inhibitor to the SMS2-KO animal of the present invention, the combined effect of the SMS2 inhibitor and the drug can be predicted.
The screening method of the present invention using the SMS2-KO animal of the present invention is useful for research toward practical use of an SMS2 inhibitor.

4 造血器腫瘍治療剤
本発明は、SMS2阻害薬、抗SMS2抗体、またはSMS2遺伝子を欠損させたヒト骨髄細胞もしくは免疫細胞を有効成分として含有することを特徴とする造血器腫瘍治療剤(以下、「本発明治療剤」という。)を含む。
4 Hematopoietic tumor therapeutic agent The present invention is characterized by containing an SMS2 inhibitor, an anti-SMS2 antibody, or a human bone marrow cell or immune cell lacking the SMS2 gene as an active ingredient (hereinafter referred to as a hematopoietic tumor therapeutic agent). "Therapeutic agent of the present invention").

後述する試験結果から明らかな通り、本発明SMS2−KO動物は、造血器腫瘍(急性白血病)を十分に発症せず、延命することから、SMS2の機能を抑制することができる、例えば、SMS2阻害薬、抗SMS2抗体、またはSMS2遺伝子を欠損させたヒト骨髄細胞もしくは免疫細胞は、造血器腫瘍の治療に有用である。 As is clear from the test results described later, the SMS2-KO animal of the present invention does not sufficiently develop a hematopoietic tumor (acute leukemia) and prolongs the life, so that the function of SMS2 can be suppressed, for example, SMS2 inhibition. Drugs, anti-SMS2 antibodies, or human bone marrow cells or immune cells deficient in the SMS2 gene are useful in the treatment of hematopoietic tumors.

具体的なSMS2阻害薬としては、本発明スクリーニング方法で見出されるもの、in vitroでSMS2阻害活性が確認されるもの、または従来知られているものを挙げることができる。従来から知られているSMS2阻害薬としては、例えば、下の化学式に示すD609(Tricyclodecan−9−yl−xanthogenate)が挙げられる。 Specific examples of the SMS2 inhibitor include those found by the screening method of the present invention, those whose SMS2 inhibitory activity is confirmed in vitro, and those conventionally known. Conventionally known SMS2 inhibitors include, for example, D609 (Trickycodecan-9-yl-xanthogenate) represented by the chemical formula below.

Figure 2021165292
Figure 2021165292

本発明治療剤に使用される抗SMS2抗体としては、本発明スクリーニング方法で見出されるもの、in vitroでSMS2阻害活性が確認されるもの、または従来知られているものを挙げることができる。当該抗体は、SMS2の酵素活性を阻害する阻害抗体であることが好ましい。 Examples of the anti-SMS2 antibody used in the therapeutic agent of the present invention include those found by the screening method of the present invention, those whose SMS2 inhibitory activity is confirmed in vitro, and those conventionally known. The antibody is preferably an inhibitory antibody that inhibits the enzymatic activity of SMS2.

SMS2阻害薬、抗SMS2抗体、またはSMS2遺伝子を欠損させたヒト骨髄細胞もしくは免疫細胞を、例えば、いわゆるゲノム編集でSMS2遺伝子を欠損することにより得ることができる。患者自身から採取された骨髄細胞または免疫細胞を用いて、SMS2遺伝子を欠損したものが好ましい。
上記ゲノム編集の方法としては、例えば、ZEN(ジンクフィンガーヌクレアーゼ)、TALEN(転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ)、またはCRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR associated proteins)を用いた方法を挙げることができる。
Human bone marrow cells or immune cells lacking an SMS2 inhibitor, anti-SMS2 antibody, or SMS2 gene can be obtained, for example, by deleting the SMS2 gene by so-called genome editing. Bone marrow cells or immune cells collected from the patient himself are preferably deficient in the SMS2 gene.
Examples of the method for genome editing include ZEN (zinc finger nuclease), TALEN (transcriptional activation-like effector nuclease), or CRISPR / Cas9 (crustered regulatory interspaced short palindromic reports / CRISPR associated method). Can be done.

5 本発明に係る造血器腫瘍の治療方法
本発明は、以下の工程を含むことを特徴とする造血器腫瘍の治療方法(以下、「本発明治療方法」という。)を含む。本発明治療方法は、造血器腫瘍の中でも急性白血病(例、AML、ALL)の治療に用いることが好ましい。
1:ヒトの骨髄細胞または免疫細胞を採取する工程、
2:採取した骨髄細胞または免疫細胞のSMS2遺伝子を欠損させる工程、
3:当該遺伝子を欠損させた細胞を増殖する工程、および
4:増殖した細胞を患者に移植ないし投与する工程。
5. Therapeutic method for hematopoietic tumor according to the present invention The present invention includes a method for treating a hematopoietic tumor, which comprises the following steps (hereinafter, referred to as "therapeutic method of the present invention"). The therapeutic method of the present invention is preferably used for the treatment of acute leukemia (eg, AML, ALL) among hematopoietic tumors.
1: The process of collecting human bone marrow cells or immune cells,
2: A step of deleting the SMS2 gene of the collected bone marrow cells or immune cells,
3: A step of proliferating cells lacking the gene, and 4: a step of transplanting or administering the proliferated cells to a patient.

以下、それぞれの工程について詳述する。 Hereinafter, each step will be described in detail.

第1工程は、ヒトの骨髄細胞を採取する工程である。
骨髄細胞または免疫細胞は、常法により、ヒトの骨髄から採取することができる。当該ヒトは、患者自身であっても、他者であってもよい。患者自身であることが好ましい。
The first step is a step of collecting human bone marrow cells.
Bone marrow cells or immune cells can be harvested from human bone marrow by conventional methods. The person may be the patient himself or others. It is preferably the patient himself.

第2工程は、第1工程で採取した骨髄細胞または免疫細胞のSMS2遺伝子を欠損させる工程である。
本工程は、例えば、いわゆるゲノム編集により行うことができる。かかるゲノム編集の方法としては、例えば、ZEN(ジンクフィンガーヌクレアーゼ)、TALEN(転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ)、またはCRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR associated proteins)を用いた方法を挙げることができる。
The second step is a step of deleting the SMS2 gene of the bone marrow cells or immune cells collected in the first step.
This step can be performed, for example, by so-called genome editing. Examples of such genome editing methods include ZEN (zinc finger nuclease), TALEN (transcription activation-like effector nuclease), or CRISPR / Cas9 (crustered regulatory interspaced short palindromic reports / CRISPR associated method). Can be done.

第3工程は、第2工程でSMS2遺伝子を欠損させた細胞を増殖する工程である。
本工程は、生体外で常法により当該細胞を培養し、増殖することにより行うことができる。当該細胞の培養には、従来、骨髄細胞や免疫細胞の培養に使用されている方法を使用することができる。具体的には、例えば、免疫細胞を採取したヒト個体の血液から血清を分離して、約20%の濃度で細胞培養液であるRPMI1640などに混入した後、細胞増殖因子(IL2,IL6など)を追加添加してヒト免疫細胞培養液を調製し、腫瘍免疫作用をヒト体内で発現するために必要な細胞数を得るために培養を継続し、最終目標数の免疫細胞(例えば、1×10〜1×10個)を得る方法が挙げられる。
The third step is a step of proliferating cells lacking the SMS2 gene in the second step.
This step can be performed by culturing and proliferating the cells in vitro by a conventional method. For culturing the cells, a method conventionally used for culturing bone marrow cells or immune cells can be used. Specifically, for example, serum is separated from the blood of a human individual from which immune cells have been collected, mixed with RPMI1640, which is a cell culture medium, at a concentration of about 20%, and then cell growth factors (IL2, IL6, etc.). To prepare a human immune cell culture medium, continue culturing to obtain the number of cells required to express tumor immunity in the human body, and continue culturing to obtain the final target number of immune cells (for example, 1 × 10). 8 to 1 × 10 9 pieces) can be obtained.

第4工程は、第3工程で増殖した細胞を患者に移植ないし投与する工程である。
増殖した当該細胞の患者への移植ないし投与は、常法により行うことができる。患者における当該移植ないし投与部位としては、例えば、患者の骨髄、血管、リンパ管が挙げられる。
増殖した当該細胞の患者への移植量ないし投与量は、患者の状態、移植ないし投与部位などによって異なり、既知のDLI(ドナーリンパ球注入)法などに基づき適宜設定される。
The fourth step is a step of transplanting or administering the cells proliferated in the third step to the patient.
The proliferated cells can be transplanted or administered to a patient by a conventional method. The transplantation or administration site in the patient includes, for example, the patient's bone marrow, blood vessels, and lymphatic vessels.
The transplantation amount or dose of the proliferated cells to the patient varies depending on the patient's condition, transplantation or administration site, etc., and is appropriately set based on a known DLI (donor lymphocyte injection) method or the like.

上述のように、SMS2遺伝子を欠損させた骨髄細胞または免疫細胞を患者に移植ないし投与することにより、患者の抗腫瘍免疫活性が亢進し、抗腫瘍活性が発揮されるから、造血器腫瘍(特に急性白血病(例、AML、ALL))を治療することができる。
As described above, by transplanting or administering bone marrow cells or immune cells lacking the SMS2 gene to a patient, the antitumor immune activity of the patient is enhanced and the antitumor activity is exhibited. Therefore, hematopoietic tumors (particularly, hematopoietic tumors (particularly) Acute leukemia (eg, AML, ALL)) can be treated.

以下、実施例、試験例等を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, Test Examples and the like, but the present invention is not limited to these Examples and the like.

[実施例1]本発明腫瘍化細胞の作製
図1に示す手順のようにして、本発明腫瘍化細胞を作製した。
(1)MLL/AF9キメラ遺伝子レトロウイルスの産生
トランスフェクションする16〜24時間前に、パッケージング細胞PLAT−Eを10cm組織培養皿に3×10まいた。遺伝子導入用ベクターであるMLL/AF9キメラ遺伝子を持つレトロウイルスベクターpMSCV−MLL/AF9−IRES−GFPII 10μg、Lipofectamine3000(Thermo Fisher Scientific社製)30μL、P3000 reagent 20μLを1.0mLのOpti−MEM培地(Thermo Fisher Scientific社製)に混合し、20分おいた。その後、これを、パッケージング細胞をまいた10cm皿にゆっくり加えた。培養開始から48時間後に培養上清を10mLシリンジで回収し、0.45μmフィルターに通した。Retro−X Concentrator(タカラバイオ社製)1/3量を加え転倒混和後4℃に一晩置き、1,500×gで45分間遠心した。沈殿物をSF−03培地(エーディア社製)80〜100μLに懸濁し濃縮ウイルス液とした。
[Example 1] Preparation of tumorigenic cells of the present invention The tumorigenic cells of the present invention were prepared according to the procedure shown in FIG.
(1) Production of MLL / AF9 chimeric gene retrovirus 16 to 24 hours before transfection, packaging cells PLAT-E were sprinkled in a 10 cm tissue culture dish in a 3 × 10 6 manner. Retroviral vector pMSCV-MLL / AF9-IRES-GFPII 10 μg with MLL / AF9 chimeric gene, which is a gene transfer vector, Lipofectamine 3000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) 30 μL, P3000 reagent 20 μL 1.0 mL Op It was mixed with Thermo Fisher Scientific (manufactured by Thermo Scientific) and left for 20 minutes. This was then slowly added to a 10 cm dish sprinkled with packaging cells. Forty-eight hours after the start of the culture, the culture supernatant was collected with a 10 mL syringe and passed through a 0.45 μm filter. 1/3 amount of Retro-X Concentrator (manufactured by Takara Bio Inc.) was added, and after inversion and mixing, the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight and centrifuged at 1,500 × g for 45 minutes. The precipitate was suspended in 80 to 100 μL of SF-03 medium (manufactured by EIDIA Co., Ltd.) to prepare a concentrated virus solution.

(2)骨髄細胞回収とレトロウイルス感染
安楽死させた8〜10週齢マウスの大骸骨、脛骨、上腕骨を取り出し、26G注射針とシリンジを用いて、DMEMを骨内に5〜10回通すことで骨髄細胞を回収し、200μmメッシュを通した後、1,200rpmで5分間遠心した。上清を除き、DMEM培地4mLに懸濁後、Lymphoprep(コスモバイオ社製)4mLに重層し、1,800rpmで20分遠心した。中間層の単核球分画を回収し、D−PBS(−)13mLを加え、1,200rpmで5分間遠心し、1%BSA、0.1μg/mL rhTPO(和光純薬工業社製)および0.1μg/mLのSCF(和光純薬工業社製)を加えたSF−03培地に懸濁して骨髄細胞液とした。
(2) Bone marrow cell recovery and retrovirus infection Remove the skeleton, tibia, and humerus of euthanized 8-10 week old mice and pass DMEM into the bone 5 to 10 times using a 26G needle and syringe. The bone marrow cells were collected, passed through a 200 μm mesh, and then centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed, suspended in 4 mL of DMEM medium, layered on 4 mL of Lymphoprep (manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.), and centrifuged at 1800 rpm for 20 minutes. The mononuclear cell fraction of the intermediate layer was collected, 13 mL of D-PBS (-) was added, and the mixture was centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, 1% BSA, 0.1 μg / mL rhTPO (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and It was suspended in SF-03 medium containing 0.1 μg / mL SCF (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to prepare a bone marrow cell solution.

レトロウイルス感染を行う24時間以上前にRetroNectin(タカラバイオ社)20μg/mLを加えたD−PBS(−)100μLを96穴プレートに加え、室温で2時間静置後、上清を除き、2%BSAを加えたD−PBS(−)100μLを加え、室温で30分静置した。その後上清を除き、RetroNectinコートプレートとして4℃で遮光保存した。レトロウイルス感染を行う2時間以上前に、濃縮レトロウイルス液40〜100μLをRetroNectinコートプレートに加え、1,000×gで90分間遠心した。遠心後上清を除き、骨髄細胞1×10をまき、37℃で一晩培養することでレトロウイルス感染を行った。 Add 100 μL of D-PBS (-) containing 20 μg / mL of RetroNectin (Takara Bio Inc.) to a 96-well plate 24 hours or more before retrovirus infection, allow to stand at room temperature for 2 hours, remove the supernatant, and remove 2 100 μL of D-PBS (−) containing% BSA was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Then, the supernatant was removed, and the plate was stored in a light-shielded manner at 4 ° C. as a RetroNectin coated plate. More than 2 hours prior to retrovirus infection, 40-100 μL of concentrated retrovirus solution was added to the RetroNectin coated plate and centrifuged at 1,000 xg for 90 minutes. Except supernatant after centrifugation, plated bone marrow cells 1 × 10 7, subjected to retroviral infection by culturing overnight at 37 ° C..

(3)1stレシピエント病態モデルマウスの作製
骨髄移植を行う前日に、7〜10週齢1stレシピエントマウスへ9〜10Gy致死量放射線照射を行った。骨髄移植を行う当日に、安楽死させた8〜10週齢ドナーマウスの大骸骨、脛骨、上腕骨より上記と同様の方法で骨髄細胞を採取し、ドナー骨髄細胞とした。レトロウイルス感染を行ったMLL/AF9レトロウイルス感染骨髄細胞1×10をドナー骨髄細胞1×10とSF−03培地中で混ぜ、27G注射針とシリンジを用いてレシピエントマウスの尾静脈より注射を行った。
(3) Preparation of 1st Recipient Pathological Model Mouse The day before bone marrow transplantation, 9 to 10 Gy lethal dose irradiation was performed on 7 to 10 week old 1st recipient mice. On the day of bone marrow transplantation, bone marrow cells were collected from the skeleton, tibia, and humerus of euthanized 8- to 10-week-old donor mice by the same method as described above, and used as donor bone marrow cells. Retrovirus-infected MLL / AF9 retrovirus-infected bone marrow cells 1 × 10 6 were mixed with donor bone marrow cells 1 × 10 6 in SF-03 medium and used from the tail vein of a recipient mouse using a 27G needle and syringe. I made an injection.

(4)2nd、3rdレシピエント病態モデルマウスの作製
骨髄移植を行う前日に、7〜10週齢2ndレシピエントマウスへ6Gy半致死量放射線照射を行った。上記(3)と同様の方法により上記の骨髄移植を行った56日目の1stレシピエント病態モデルマウスより骨髄細胞を採取後、フローサイトメトリーにより導入遺伝子を有する細胞(GFP陽性)である腫瘍化細胞が存在することを確認した。回収した腫瘍化細胞を含む骨髄細胞をSF−03培地に懸濁し、2×10を2ndレシピエントマウスへ尾静脈注射により骨髄移植した。
(4) Preparation of 2nd and 3rd Recipient Pathological Model Mice The day before bone marrow transplantation, 6Gy median lethal dose irradiation was performed on 7 to 10 week old 2nd recipient mice. After collecting bone marrow cells from the 1st recipient pathological model mouse on the 56th day when the above bone marrow transplantation was performed by the same method as in (3) above, tumorigenesis is performed as cells having the introduced gene (GFP positive) by flow cytometry. It was confirmed that cells were present. Bone marrow cells containing the recovered tumorigenic cells were suspended in SF-03 medium was bone marrow transplantation by tail vein injection 2 × 10 6 to 2nd recipient mice.

骨髄移植を行う前日に、7〜10週齢3rdレシピエントマウスへ4.5Gy非致死量放射線照射を行った。上記(3)と同様の方法により骨髄移植を行った40日目の2ndレシピエント病態モデルマウスより骨髄細胞を採取後、フローサイトメトリーにより導入遺伝子を有する細胞(GFP陽性)である腫瘍化細胞が存在することを確認した。回収した腫瘍化細胞を含む骨髄細胞をSF−03培地に懸濁し、1×10を3rdレシピエントマウスへ尾静脈注射により骨髄移植した。 The day before bone marrow transplantation, 4.5 Gy non-lethal dose irradiation was performed on 7 to 10 week old 3rd recipient mice. After collecting bone marrow cells from the 2nd recipient pathological model mouse on the 40th day after bone marrow transplantation by the same method as in (3) above, tumorigenic cells which are cells having the introduced gene (GFP positive) are generated by flow cytometry. Confirmed to exist. Bone marrow cells containing the recovered tumorigenic cells were suspended in SF-03 medium, and 1 × 10 6 was transplanted into 3rd recipient mice by tail intravenous injection.

(5)腫瘍化細胞の作製
上記(3)と同様の方法により骨髄移植を行った40日目の3rdレシピエントマウスより骨髄細胞を採取し、フローサイトメトリーにより、導入遺伝子を有する細胞(GFP陽性)である腫瘍化細胞が存在することを確認した。回収した腫瘍化細胞を含む骨髄細胞をSF−03培地に懸濁することより、本発明腫瘍化細胞を作製した。
(5) Preparation of Tumorized Cells Bone marrow cells were collected from 3rd recipient mice on the 40th day after bone marrow transplantation by the same method as in (3) above, and cells having the introduced gene (GFP positive) were collected by flow cytometry. ) Was confirmed to be present. The tumorigenic cells of the present invention were prepared by suspending bone marrow cells containing the recovered tumorigenic cells in SF-03 medium.

[実施例2]本発明モデルマウスの作製
実施例1で作製した本発明腫瘍化細胞1×10〜2×10(個)を7〜10週齢4thレシピエントマウスへ尾静脈注射することにより本発明モデルマウス(AML−4th)を作製した。
作製した本発明モデルマウスの体重、脾臓の重量、脾臓/体重量比、体重(body weight)、脾臓重量(spleen)の解析、および血液検査(白血球数(WBC)、赤血球数(RBC)、血小板数(PLT)など)を行った。その結果を表1および図2〜図4に示す。
[Example 2] Preparation of the model mouse of the present invention The tumorigenic cells of the present invention prepared in Example 1 (1 × 10 4 to 2 × 10 6 ) are injected into a 7 to 10 week old 4th recipient mouse by tail vein injection. the present invention model mice (AML-4 th) prepared by.
Analysis of body weight, spleen weight, spleen / body weight ratio, body weight, spleen weight (splen), and blood test (white blood cell count (WBC), red blood cell count (RBC), platelets) of the prepared model mouse of the present invention. Number (PLT) etc.) was performed. The results are shown in Table 1 and FIGS. 2 to 4.

表1および図2〜図4に示したように、本発明モデルマウス(AML−4th、又はWTAML−4th)は、移植後の体重変化については、図2のように野生型コントロールマウスと比べて大差はないが、死亡前には急激な減少を認めた。MLL/AF9遺伝子発現ベクターを感染させた1×10個の骨髄細胞の移植15日後(WTAML−4th)に末梢血中の白血球数が野生型(WT)マウスの1040/μLから7万1700/μLへと著増した(表1参照)。白血病細胞はクラゲ蛍光タンパクであるGFP(緑色蛍光タンパク)を強制発現しており、細胞内の蛍光物質を測定できるフローサイトメーターを用いて、検体内の白血病細胞数を計測した。結果は、図4に示したように、移植15日後にはフローサイトメトリー法による解析で、骨髄、脾臓での白血病細胞の増殖が94%と69%にそれぞれ認められた。移植23日後には、腋窩リンパ節(axillar lymph node)においても95%の白血病細胞の増殖が認められ、脾臓(spleen)の増大(60mgから318mgへ)、貧血による骨の白色化が著明であった。これらの結果は、免疫応答性を有する野生型マウスでMLL/AF9過剰発現細胞の増殖によってヒト白血病発症モデルが作製できたことを示す。 Table 1 and as shown in FIGS. 2-4, the present invention model mice (AML-4 th, or WT AML-4th), for the change in body weight after transplantation, and wild-type control mice as shown in FIG. 2 There was no big difference in comparison, but a sharp decrease was observed before death. 15 days after transplantation of 1 × 10 6 bone marrow cells infected with the MLL / AF9 gene expression vector (WT AML-4th ), the white blood cell count in the peripheral blood increased from 1040 / μL to 71,700 in wild-type (WT) mice. It increased significantly to / μL (see Table 1). Leukemia cells forcibly express GFP (green fluorescent protein), which is a jellyfish fluorescent protein, and the number of leukemia cells in the sample was measured using a flow cytometer capable of measuring intracellular fluorescent substances. As a result, as shown in FIG. 4, 15 days after transplantation, the growth of leukemia cells in the bone marrow and spleen was observed in 94% and 69%, respectively, by the analysis by the flow cytometry method. Twenty-three days after transplantation, 95% of leukemic cell proliferation was also observed in the axillary lymph nodes, spleen growth (from 60 mg to 318 mg), and bone whitening due to anemia were prominent. there were. These results indicate that a human leukemia development model could be prepared by proliferation of MLL / AF9 overexpressing cells in immune-responsive wild-type mice.

Figure 2021165292
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[実施例3]本発明SMS2−KOマウスの作製
最後のレシピエントマウスがSMS2遺伝子をノックアウトしたマウスであること、また4thレシピエントマウスへの本発明腫瘍化細胞の投与量が5×10(個)であること以外は、実施例1、2と同様の手順で本発明SMS2−KOマウス(SMS2−KO#1、SMS2−KO#2)を作製した。そして、作製した本発明SMS2−KOマウスの体重、脾臓の重量、脾臓/体重量比などを解析、および血液検査を行った。その結果を表2、および図5に示す。
[Example 3] The present invention SMS2-KO mice produce final recipient mice to be a knockout mice SMS2 gene, also 4th dose of the present invention tumorigenesis cells into recipient mice 5 × 10 5 ( The MS2-KO mice of the present invention (SMS2-KO # 1, SMS2-KO # 2) were produced in the same procedure as in Examples 1 and 2 except that the mice were (pieces). Then, the body weight of the produced SMS2-KO mouse of the present invention, the weight of the spleen, the spleen / body weight ratio, and the like were analyzed, and a blood test was performed. The results are shown in Table 2 and FIG.

図5に示したように、造血器腫瘍(急性白血病)を発症する本発明モデルマウス(WT)では、SMS2−KOマウス(本発明SMS2−KOマウス)においても、野生型コントロールマウス(SMS2正常発現の本発明モデルマウス(WT))においても、体重の変化はなかった(図5A参照)。しかしながら、明らかに生存曲線がSMS2−KOマウスでは#1と#2の2グループ共に有意に延長しており(図5B参照)、脾臓の増大により判定される白血病の脾臓への浸潤増殖は、SMS2欠損状態で明らかに抑制されていた(図5C、D参照)。 As shown in FIG. 5, in the model mouse (WT) of the present invention that develops a hematopoietic tumor (acute leukemia), the wild-type control mouse (SMS2 normal expression) is also expressed in the SMS2-KO mouse (SMS2-KO mouse of the present invention). There was no change in body weight in the model mouse (WT) of the present invention (see FIG. 5A). However, the survival curve was clearly significantly prolonged in both groups # 1 and # 2 in SMS2-KO mice (see FIG. 5B), and the infiltration growth of leukemia into the spleen, as determined by spleen enlargement, was SMS2. It was clearly suppressed in the defective state (see FIGS. 5C and D).

表2に示したように、作製した血病発症モデルでは、野生型マウス(本発明モデルマウス:WTAML)に対してSMS2−KOマウス(SMS2−/−AML)の末梢血液中の白血球細胞数が3万6400/μLから2万800/μLに減少し、貧血の使用のヘモグロビンは11.6g/dLから13.6g/dLに回復し、血小板数は11.1万/μLから68.7万/μLに増加していた。これらの結果は、急性白血病がSMS2−KOマウスでは全く発症していないわけではなく、一旦発症後に時間経過と共に白血病状態が回復することを示唆している。 As shown in Table 2, in the prepared blood disease onset model, the number of leukocyte cells in the peripheral blood of the SMS2-KO mouse (SMS2 -/-AML ) relative to the wild-type mouse (model mouse of the present invention: WT AML). Decreased from 36,400 / μL to 20,800 / μL, hemoglobin used for anemia recovered from 11.6 g / dL to 13.6 g / dL, and white blood cell count increased from 111,000 / μL to 68.7. It had increased to 10,000 / μL. These results suggest that acute leukemia does not occur at all in SMS2-KO mice, and that the leukemia state recovers over time after the onset.

Figure 2021165292
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一方、4thレシピエントマウスへの移植前の、X線照射(4.5Gy)を施行した3thレシピエントマウスに本発明腫瘍化細胞を移植して白血病を発症させたところ、図6に示すように、SMS2遺伝子をノックアウトしていないコントロールマウス(SMS2正常マウス、WT4.5Gy(MLL/AF9非移植)又はWTAML−3rd+4.5Gy(MLL/AF9移植))とSMS2−KOマウス(SMS2−KO4.5Gy(MLL/AF9非移植)又はSMS2−KOAML−3rd+4.5Gy(MLL/AF9移植))との間で、生存期間の差異は見られなかった(図6B参照)。即ち、腫瘍免疫活性が抑制された放射線照射後には、免疫応答性(immunocompetent)のSMS2−KOマウスで見られた白血病細胞の増殖抑制が認められておらず、SMS2欠損状態での骨髄微小環境における抗腫瘍活性の亢進が、白血病の発症、進展に必須であることが確認された。言い換えれば、骨髄微小環境に起因する腫瘍に対する免疫応答性が、SMS2−KOによる白血病の抑制効果に重要であることが示された。 On the other hand, when the tumorigenic cells of the present invention were transplanted into the 3rd recipient mouse subjected to X-ray irradiation (4.5 Gy) before transplantation to the 4th recipient mouse to develop leukemia, as shown in FIG. , SMS2 gene not knocked out control mouse (SMS2 normal mouse, WT 4.5Gy (MLL / AF9 non-transplanted) or WT AML-3rd + 4.5Gy (MLL / AF9 transplanted)) and SMS2-KO mouse (SMS2-KO 4) No difference in survival was observed between .5 Gy (MLL / AF9 non-transplanted) or SMS2-KO AML-3rd + 4.5 Gy (MLL / AF9 transplanted) (see FIG. 6B). That is, after irradiation with suppressed tumor immunoactivity, the suppression of leukemic cell proliferation observed in immunocompetent SMS2-KO mice was not observed, and in the bone marrow microenvironment in the SMS2-deficient state. It was confirmed that enhanced antitumor activity is essential for the onset and progression of leukemia. In other words, it was shown that immune responsiveness to tumors caused by the bone marrow microenvironment is important for the suppressive effect of SMS2-KO on leukemia.

[試験例1]本発明SMS2−KOマウスにおける当該白血病細胞の骨髄への生着
本発明SMS2−KOマウスにおいて、本発明腫瘍化細胞が骨髄に生着しているか否かについて検討した。実験は、本発明腫瘍化細胞移植後に経時的に16日ごと24日後にマウスを安楽死することで、野生型とSMS2−KOマウスにおける白血病の進展程度を評価することをフローサイトメトリー法による白血病細胞の計測と腫瘍免疫細胞であるCTLと骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)の計測により行った。白血病細胞の骨髄(BMCs)と末梢血(blood)への浸潤は白血病細胞にタグ化したGFP(緑蛍光蛋白)の測定、またCTL(CD4陽性または非陽性(CD8陽性相当)細胞)とMDSC(CD11bとGr1陽性細胞)を各種抗体によって測定した。その結果を図7、図8に示す。
[Test Example 1] Engraftment of the leukemia cells in the bone marrow in the SMS2-KO mouse of the present invention In the SMS2-KO mouse of the present invention, it was examined whether or not the tumorigenic cells of the present invention were engrafted in the bone marrow. The experiment was to evaluate the degree of leukemia progression in wild-type and SMS2-KO mice by euthanizing the mice 16 days to 24 days after transplantation of the tumorigenic cells of the present invention. Leukemia by the flow cytometry method. The cells were measured and the tumor immune cells CTL and bone marrow-derived immunosuppressive cells (MDSC) were measured. Invasion of leukemia cells into bone marrow (BMCs) and peripheral blood (blood) is measured by GFP (green fluorescent protein) tagged with leukemia cells, and CTL (CD4 positive or non-positive (CD8 positive equivalent) cells) and MDSC ( CD11b and Gr1-positive cells) were measured with various antibodies. The results are shown in FIGS. 7 and 8.

移植16日後と24日後のマウスの白血病細胞の増殖を解析したところ、図7Cに示した通り、コントロール(SMS2正常発現の本発明モデルマウス、WT又はWTAML)群と本発明SMS2−KOマウス群(SMS2−KOAML、又は2KOAML)では、SMS2欠損状態での骨髄、末梢血、脾臓での白血病細胞浸潤の若干の低下が見られたが、移植したMLL/AF9過剰発現白血病細胞がSMS2欠損状態で生着不全を誘導する証拠は全く認められなかった。したがって、本発明SMS2−KOマウスにおいても、本発明腫瘍化細胞が骨髄に生着していることは明らかである。 When the proliferation of leukemia cells in mice 16 days and 24 days after transplantation was analyzed, as shown in FIG. 7C, the control (model mouse of the present invention with normal expression of SMS2, WT or WT AML ) group and the SMS2-KO mouse group of the present invention were analyzed. (SMS2-KO AML , or 2KO AML ) showed a slight decrease in leukemia cell infiltration in bone marrow, peripheral blood, and spleen in the SMS2-deficient state, but the transplanted MLL / AF9 overexpressing leukemia cells were SMS2-deficient. There was no evidence to induce engraftment failure in the condition. Therefore, it is clear that the tumorigenic cells of the present invention are engrafted in the bone marrow also in the SMS2-KO mice of the present invention.

[試験例2]本発明SMS2−KOマウスにおける骨髄微小環境の検討
試験例1で生存していた本発明SMS2−KOマウスから骨髄細胞を採取し、フローサイトメトリー法により骨髄微小環境を解析した。具体的な実験方法としては、各細胞に特異的な細胞表面抗原に対する選択的な蛍光化された抗体をフローサイトメーターで測定した。一般的には、CTL(細胞障害性T細胞)は抗CD4抗体陽性細胞、もしくは抗CD8陽性(抗CD4陰性)であり、MDSC(骨髄由来抑制性細胞)は、抗CD11b陽性とGr1陽性の二重陽性である。その結果を図8に示す。
[Test Example 2] Examination of bone marrow microenvironment in the SMS2-KO mouse of the present invention Bone marrow cells were collected from the SMS2-KO mouse of the present invention that survived in Test Example 1, and the bone marrow microenvironment was analyzed by a flow cytometry method. As a specific experimental method, selective fluorescent antibodies against cell surface antigens specific to each cell were measured with a flow cytometer. In general, CTL (cytotoxic T cells) are anti-CD4 antibody positive cells or anti-CD8 positive (anti-CD4 negative), and MDSC (bone marrow-derived inhibitory cells) are anti-CD11b positive and Gr1 positive. It is heavily positive. The result is shown in FIG.

図8に示したように、生存している本発明SMS2−KOマウス(SMS2−KOAML)においては、抗腫瘍免疫効果の重要な細胞であるCD8陽性CTL(CD4陰性)が明らかにコントロール群に比較して32%から62%へ増加していた。また、がん微小環境におけるMDSC(骨髄由来抑制性細胞)について、G−MDSC(CD11b陽性+Gr1強陽性細胞)が20%から3%へ、および、M−MDSC((CD11b陽性+Gr1弱陽性細胞)が29%から9%へと顕著に減少していた。
このことは、SMS2欠損状態で抗腫瘍免疫活性に必須のCTLの増強とMDSCの抑制が同時に確認されたことを示している。
As shown in FIG. 8, in the surviving SMS2-KO mice of the present invention (SMS2-KO AML ), CD8-positive CTL (CD4-negative), which is an important cell for anti-tumor immune effect, is clearly in the control group. In comparison, it increased from 32% to 62%. Regarding MDSCs (bone marrow-derived inhibitory cells) in the cancer microenvironment, G-MDSC (CD11b positive + Gr1 strong positive cells) increased from 20% to 3%, and M-MDSC ((CD11b positive + Gr1 weak positive cells)). Was significantly reduced from 29% to 9%.
This indicates that the enhancement of CTL and the suppression of MDSC, which are essential for anti-tumor immune activity, were confirmed at the same time in the SMS2-deficient state.

以上から、SMS2の機能が抑制された免疫応答性の動物(SMS2−KO野生型動物)においては、抗腫瘍免疫活性が増強され、造血器腫瘍の発病が抑制されることが明らかである。したがって、SMS2の活性を何らかの手段で阻害することにより、例えば、SMS2に対する低分子阻害剤や抗SMS2抗体を投与することにより、難治性の造血器腫瘍(急性白血病(例、AML、ALL))を治療しうることが明らかである。また、SMS2欠損により抗腫瘍活性が亢進したCTLを担がん個体(ヒト)に注入することにより、造血器腫瘍を治療しうることも明らかである。
From the above, it is clear that in immunoresponsive animals (SMS2-KO wild-type animals) in which the function of SMS2 is suppressed, the antitumor immune activity is enhanced and the onset of hematopoietic tumors is suppressed. Therefore, refractory hematopoietic tumors (acute leukemia (eg, AML, ALL)) can be treated by inhibiting the activity of SMS2 by some means, for example, by administering a small molecule inhibitor or anti-SMS2 antibody against SMS2. It is clear that it can be treated. It is also clear that hematopoietic tumors can be treated by injecting CTLs whose antitumor activity is enhanced by SMS2 deficiency into cancer-bearing individuals (humans).

本発明スクリーニング方法は、造血器腫瘍の治療のためのSMS2阻害薬を開発することにおいて有用である。また、SMS2阻害薬などを有効成分として含有する造血器腫瘍治療剤は、造血器腫瘍の治療、特にAMLなどの急性白血病の治療に有用である。 The screening method of the present invention is useful in developing SMS2 inhibitors for the treatment of hematopoietic tumors. In addition, a hematopoietic tumor therapeutic agent containing an SMS2 inhibitor or the like as an active ingredient is useful for the treatment of hematopoietic tumors, particularly acute leukemia such as AML.

Claims (2)

SMS2阻害薬、抗SMS2抗体、またはSMS2遺伝子を欠損させたヒト骨髄細胞もしくは免疫細胞を有効成分として含有することを特徴とする、造血器腫瘍治療剤。 A therapeutic agent for hematopoietic tumors, which comprises an SMS2 inhibitor, an anti-SMS2 antibody, or a human bone marrow cell or immune cell deficient in the SMS2 gene as an active ingredient. 造血器腫瘍が急性白血病である、請求項1に記載の造血器腫瘍治療剤。
The therapeutic agent for hematopoietic tumor according to claim 1, wherein the hematopoietic tumor is acute leukemia.
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