JP2005192537A - Sphingomyelin (sm) synthase gene and utilization of the same - Google Patents
Sphingomyelin (sm) synthase gene and utilization of the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005192537A JP2005192537A JP2004004849A JP2004004849A JP2005192537A JP 2005192537 A JP2005192537 A JP 2005192537A JP 2004004849 A JP2004004849 A JP 2004004849A JP 2004004849 A JP2004004849 A JP 2004004849A JP 2005192537 A JP2005192537 A JP 2005192537A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- polynucleotide
- base sequence
- polypeptide
- synthase activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 82
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 78
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 77
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 77
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 77
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 77
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 75
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 47
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 41
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 37
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 108020003486 sphingomyelin synthase Proteins 0.000 claims description 33
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 32
- 102000005993 Sphingomyelin synthase Human genes 0.000 claims description 32
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 25
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 24
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 24
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 22
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 18
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 14
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 13
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 13
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 claims description 12
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 claims description 12
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 claims description 12
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 claims description 11
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 claims description 9
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 9
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 9
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 claims description 9
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 9
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 9
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 claims description 8
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 7
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 claims description 7
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 4
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims 1
- 101710145835 Phosphatidylcholine:ceramide cholinephosphotransferase 3 Proteins 0.000 abstract description 36
- 101710145832 Phosphatidylcholine:ceramide cholinephosphotransferase 4 Proteins 0.000 abstract description 36
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 28
- 101000702720 Caenorhabditis elegans Phosphatidylcholine:ceramide cholinephosphotransferase 1 Proteins 0.000 abstract description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 20
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 abstract description 15
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 abstract description 15
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 15
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 15
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 abstract description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 11
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 abstract description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract description 7
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 187
- 101710174798 Lysenin Proteins 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 10
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 10
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 8
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 4
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 4
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- HZIRBXILQRLFIK-VPZZKNKNSA-N N-{6-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@H](CO)NC(=O)CCCCCNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C2=NON=C12 HZIRBXILQRLFIK-VPZZKNKNSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 125000001549 ceramide group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-IYHDLOSGSA-N (2S)-2-amino-3-hydroxy(214C)propanoic acid Chemical compound N[14C@@H](CO)C(=O)O MTCFGRXMJLQNBG-IYHDLOSGSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 2
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- -1 antisense Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000003134 dye exclusion method Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O phosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YZOUYRAONFXZSI-SBHWVFSVSA-N (1S,3R,5R,6R,8R,10R,11R,13R,15R,16R,18R,20R,21R,23R,25R,26R,28R,30R,31S,33R,35R,36R,37S,38R,39S,40R,41S,42R,43S,44R,45S,46R,47S,48R,49S)-5,10,15,20,25,30,35-heptakis(hydroxymethyl)-37,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49-dodecamethoxy-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29,32,34-tetradecaoxaoctacyclo[31.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26.228,31]nonatetracontane-36,38-diol Chemical compound O([C@@H]([C@H]([C@@H]1OC)OC)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H]([C@@H](O[C@@H]3[C@@H](CO)O[C@@H]([C@H]([C@@H]3O)OC)O[C@@H]3[C@@H](CO)O[C@@H]([C@H]([C@@H]3OC)OC)O[C@@H]3[C@@H](CO)O[C@@H]([C@H]([C@@H]3OC)OC)O[C@@H]3[C@@H](CO)O[C@@H]([C@H]([C@@H]3OC)OC)O3)O[C@@H]2CO)OC)[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@H]3[C@@H](CO)O1 YZOUYRAONFXZSI-SBHWVFSVSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- ZMZRKOASUWINDA-VEABSNGSSA-N (4s)-4-[[(2s)-2-amino-3-carboxypropanoyl]amino]-5-[[(2s)-1-[[(2s)-1-carboxy-3-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ZMZRKOASUWINDA-VEABSNGSSA-N 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-N 2-(trimethylazaniumyl)ethyl hydrogen phosphate Chemical group C[N+](C)(C)CCOP(O)([O-])=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HOMYIYLRRDTKAA-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-N-[3-hydroxy-1-[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoctadeca-4,8-dien-2-yl]hexadecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(C(O)C=CCCC=CCCCCCCCCC)COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HOMYIYLRRDTKAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- RZZPDXZPRHQOCG-OJAKKHQRSA-M CDP-choline(1-) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)O[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 RZZPDXZPRHQOCG-OJAKKHQRSA-M 0.000 description 1
- 101100348617 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) NIK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101100007329 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS1 gene Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010051758 aspartyl-glutamyl-valyl-aspartal Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000012200 cell viability kit Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001233061 earthworms Species 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 108010052621 fas Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000018823 fas Receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 208000013104 leukocyte disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 210000002284 membrane microdomain Anatomy 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 125000005642 phosphothioate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].COC1=CC([N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
本発明は、スフィンゴミエリン合成酵素遺伝子及びその新たな用途に関する。 The present invention relates to a sphingomyelin synthase gene and a new use thereof.
ジアシルグリセロール(DAG)、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジン酸のような多様なグリセロリン脂質が、細胞増殖及び生存についての生理活性分子と考えられている。また、スフィンゴ脂質は、細胞膜の構成成分であるとともに、細胞増殖、細胞分化及び細胞死などを調節することが知られるようになってきた。 A variety of glycerophospholipids such as diacylglycerol (DAG), phosphatidylinositol, phosphatidic acid are considered bioactive molecules for cell proliferation and survival. Sphingolipids are components of cell membranes and have been known to regulate cell proliferation, cell differentiation, cell death, and the like.
近年、スフィンゴ脂質の一種であるセラミドはアポトーシス、細胞分化、分泌のシグナルメディエーターと考えられるようになってきた。紫外線、放射線、ヒートショック、酸素欠乏のような種々のストレス;TNF-α、INF-γ及びFas抗体のような生物学的因子は、アポトーシスにセラミドの生成を要求する(Cell Signal 10,685-692(1998))。このことは、セラミドがアポトーシスを誘導するシグナルとして機能していることを示唆している。 In recent years, ceramide, a kind of sphingolipid, has come to be considered as a signal mediator of apoptosis, cell differentiation, and secretion. Various stresses such as UV, radiation, heat shock, oxygen deficiency; biological factors such as TNF-α, INF-γ and Fas antibody require ceramide production for apoptosis (Cell Signal 10,685-692 ( 1998)). This suggests that ceramide functions as a signal for inducing apoptosis.
セラミドの代謝には多くの酵素が関わっているが、その一つであるスフィンゴミエリン(以下、「SM」と略称する)合成酵素は、フォスファチジルコリンのリン酸コリン部分をセラミドに転移してスフィンゴミエリンを生成するとともに、ジアシルグリセロールを生成する。 Many enzymes are involved in the metabolism of ceramide, one of which is sphingomyelin (hereinafter abbreviated as “SM”) synthase, which transfers the choline phosphate part of phosphatidylcholine to ceramide. In addition to producing sphingomyelin, it produces diacylglycerol.
SM合成酵素の活性化により、アポトーシス誘導シグナルとされているセラミドレベルが低下し、続いてジアシルグリセロールのレベルが向上することが報告されている(Biochemistry 21,2753-2759)。またジアシルグリセロールは、プロテインキナーゼC(PKC)活性化を介した細胞増殖のための重要なシグナル因子であり(Science 246,1050)、セラミドに誘導されるアポトーシスに対して競合的に作用する(Cell Signal 10,685-692)。 It has been reported that the activation of SM synthase decreases the level of ceramide, which is regarded as an apoptosis-inducing signal, and subsequently increases the level of diacylglycerol (Biochemistry 21,2753-2759). Diacylglycerol is also an important signal factor for cell growth via protein kinase C (PKC) activation (Science 246,1050) and acts competitively against ceramide-induced apoptosis (Cell Signal 10,685-692).
セラミドと疾患との関係については、抗癌剤に耐性化した細胞ではセラミド量が低下していること、及び、抗癌剤耐性白血病患者から採種した白血病細胞では、抗癌剤感受性患者の献体に較べて、抗癌剤処理により認められるセラミドの増加が少ないことが知られている。このことは、アポトーシス誘導シグナルであるセラミドの細胞内量を増加させない仕組みが新たな薬剤耐性機構の一つであることを示唆している(タンパク質・核酸・酵素,Vol.47,No.4(2002))。 Regarding the relationship between ceramide and disease, the amount of ceramide decreased in cells resistant to anticancer drugs, and in leukemia cells collected from anticancer drug resistant leukemia patients, anticancer drug treatment compared to the dedication of anticancer drug sensitive patients. It is known that the increase in ceramide observed is small. This suggests that the mechanism that does not increase the intracellular level of ceramide, an apoptosis-inducing signal, is one of the new drug resistance mechanisms (protein, nucleic acid, enzyme, Vol.47, No.4 ( 2002)).
さらに、スフィンゴミエリンがデオキシコール酸が誘導するアポトーシスを容量依存的に阻害し、続いて結腸上皮細胞の過剰増殖が起こり、以上結腸陰窩の数が減少することが報告されている(Dig Dis Sci 48,1094-1101(2003))。 Furthermore, sphingomyelin has been reported to inhibit deoxycholic acid-induced apoptosis in a dose-dependent manner, followed by colon epithelial cell hyperproliferation, thus reducing the number of colon crypts (Dig Dis Sci 48,1094-1101 (2003)).
このように、セラミドがアポトーシスのシグナルメディエーターとして機能すること、スフィンゴミエリンがアポトーシスを阻害することが明らかにされつつある。しかし、スフィンゴミエリン合成酵素の具体的な役割は明瞭になっていないため、スフィンゴミエリン合成酵素の有用性は確定していなかった。 Thus, it has been clarified that ceramide functions as a signal mediator of apoptosis, and that sphingomyelin inhibits apoptosis. However, since the specific role of sphingomyelin synthase has not been clarified, the usefulness of sphingomyelin synthase has not been determined.
ここで、非特許文献1は、酵母細胞でSM合成及びその逆反応を触媒するポリペプチドのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を開示している。また、同文献には、ノーザンブロット法によりこのポリヌクレオチドがヒトの種々の組織で発現していること、及び、このポリペプチドがヒト細胞のゴルジ装置に局在していることが記載されている。
Here, Non-Patent
しかし、非特許文献1には、このポリペプチドの機能については、酵母細胞でSM合成及びその逆反応を触媒することしか記載されておらず、実際の哺乳類の細胞中での役割は明らかになっていない。
本発明は、SM合成酵素のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を提供することを第1の課題とする。また本発明は、このアミノ酸配列を有するポリペプチドの哺乳類での細胞増殖における役割を解明することにより、その新たな用途を提供することを第2の課題とする。 It is a first object of the present invention to provide an amino acid sequence of SM synthase and a base sequence encoding it. Another object of the present invention is to provide a new use of the polypeptide having this amino acid sequence by elucidating the role of cell growth in mammals.
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(1) SM合成が欠如しているマウスの白血病細胞変異体(WR19L/Fas(-))を用いた発現クローニング法により、SM合成酵素活性に対応するヒトcDNAを単離した。このcDNAクローンは、413アミノ酸をコードしており、SMS-1と命名した。
(2) WR19L/Fas-SM(-)細胞はSMを発現していないが、SMS-1 cDNA発現細胞(WR19L/Fas-SMS-1)は、WR19L/Fas-SM(+)細胞と同程度にSMを発現している。
(3) SMS-1発現細胞(WR19L/Fas-SMS-1)は、SMの発現にセラミド及びフォスファチジルコリンを要求することから、SMS-1 cDNAはSM合成酵素をコードしていると考えられる。
(4) WR19L/Fas-SM(-)細胞は増殖が抑制されているが、SMS-1 cDNA発現細胞(WR19L/Fas-SMS-1)は、WR19L/Fas-SM(+)細胞と同程度に増殖する。このことから、SMS-1 cDNA がコードするSM合成酵素は細胞増殖に必須である。
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted research and obtained the following knowledge.
(1) Human cDNA corresponding to SM synthase activity was isolated by expression cloning using a mouse leukemia cell mutant lacking SM synthesis (WR19L / Fas (-)). This cDNA clone encodes 413 amino acids and was named SMS-1.
(2) WR19L / Fas-SM (-) cells do not express SM, but SMS-1 cDNA expressing cells (WR19L / Fas-SMS-1) are similar to WR19L / Fas-SM (+) cells SM is expressed.
(3) Since SMS-1 expressing cells (WR19L / Fas-SMS-1) require ceramide and phosphatidylcholine for SM expression, it is considered that SMS-1 cDNA encodes SM synthase. It is done.
(4) Although growth of WR19L / Fas-SM (-) cells is suppressed, SMS-1 cDNA expressing cells (WR19L / Fas-SMS-1) are similar to WR19L / Fas-SM (+) cells To proliferate. Therefore, SM synthase encoded by SMS-1 cDNA is essential for cell growth.
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下のポリヌクレオチドなどを提供する。
項1. 以下の(1)又は(2)のポリペプチド。
(1) 配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(2) 配列番号1において1又は2以上のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチド。
項2. 項1に記載のポリペプチドを有効成分として含む細胞増殖促進剤。
項3. 項1に記載のポリペプチドを有効成分として含む、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
項4. 以下の(3)又は(4)のポリヌクレオチド。
(3) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(4) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項5. 項4に記載のポリヌクレオチドを有効成分として含む細胞増殖促進剤。
項6. 項4に記載のポリペプチドを有効成分として含む、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
項7. 項4に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
項8. 項7に記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
項9. 項8に記載の形質転換体を培養する工程と;培養物から項1に記載のポリペプチドを回収する工程とを含む項1に記載のポリペプチドの製造方法。
項10. 以下の(5)又は(6)のアンチセンスポリヌクレオチド。
(5) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも18塩基に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(6) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも18塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
項11. 項10に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含む細胞増殖阻害剤。
項12. 項10に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
項13. 以下の(7)又は(8)のsiRNA。
(7) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列の連続する少なくとも21塩基に相補的なRNA鎖とこれに相補的なRNA鎖との対を含むsiRNA。
(8) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも21塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする2本鎖RNAからなるsiRNA。
項14. 項13に記載のsiRNAを有効成分として含む細胞増殖阻害剤。
項15. 項13に記載のsiRNAを有効成分として含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
項16. 以下の(9)又は(10)のリボザイム。
(9) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の中の連続する少なくとも20塩基からなる二つの領域にそれぞれ相補的な二つの塩基配列部分を有し、かつ、項4のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム。
(10) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の中の連続する少なくとも20塩基からなる二つの領域にそれぞれストリンジェントな条件下でハイブリダイズする二つの塩基配列を有し、かつ、項4のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム。
項17. 項16に記載のsiRNAを有効成分として含む細胞増殖阻害剤。
項18. 項16に記載のsiRNAを有効成分として含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
項19. 項1に記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
項20. 項19に記載の抗体を有効成分として含む細胞増殖阻害剤。
項21. 項19に記載の抗体を有効成分として含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
項22. (a) 被験物質と項7に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c) スフィンゴミエリン合成酵素活性を低減させる被験物質を選択する工程と
を含む細胞増殖阻害剤のスクリーニング方法。
項23. (a) 被験物質と項7に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c) スフィンゴミエリン合成酵素活性を低減させる被験物質を選択する工程と
を含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤のスクリーニング方法。
項24. (a) 被験物質と項7に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c) スフィンゴミエリン合成酵素活性を増大させる被験物質を選択する工程と
を含む細胞増殖促進剤のスクリーニング方法。
項25. (a) 被験物質と項7に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c) スフィンゴミエリン合成酵素活性を増大させる被験物質を選択する工程と
を含む、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤のスクリーニング方法。
The present invention has been completed based on the above findings, and provides the following polynucleotides and the like.
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(2) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 1 and having sphingomyelin synthase activity.
Item 4. The following polynucleotide (3) or (4):
(3) A polynucleotide comprising the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
(4) A polypeptide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having the nucleotide sequence of nucleotide numbers 338 to 1576 or a nucleotide sequence complementary thereto in SEQ ID NO: 2 and has sphingomyelin synthase activity. Encoding polynucleotide.
Item 7. A recombinant vector comprising the polynucleotide according to Item 4.
Item 8. Item 8. A transformant having the recombinant vector according to Item 7.
Item 9.
(5) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to at least 18 consecutive bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
(6) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with at least 18 consecutive bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
Item 11. Item 11. A cell growth inhibitor comprising the antisense polynucleotide according to
Item 12. Item 11. A therapeutic or ameliorating agent for a disease selected from the group consisting of leukemia, cancer, and autoimmune disease, comprising the antisense polynucleotide according to
Item 13. The following (7) or (8) siRNA.
(7) An siRNA comprising a pair of an RNA strand complementary to at least 21 consecutive bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 and an RNA strand complementary thereto.
(8) An siRNA comprising a double-stranded RNA that hybridizes under stringent conditions with at least 21 consecutive base sequences of base numbers 338 to 1576 of SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
Item 14. Item 14. A cell growth inhibitor comprising the siRNA according to Item 13 as an active ingredient.
Item 15. Item 14. A therapeutic or ameliorating agent for a disease selected from the group consisting of leukemia, cancer, and autoimmune disease, comprising the siRNA according to Item 13 as an active ingredient.
Item 16. The following (9) or (10) ribozyme.
(9) having two base sequence portions complementary to each of two regions consisting of at least 20 consecutive bases in the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto And a ribozyme having an activity of degrading the polynucleotide of Item 4.
(10) Two of the base sequences of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or two regions that hybridize under stringent conditions to two regions consisting of at least 20 consecutive bases in the base sequence complementary thereto A ribozyme having a base sequence and having an activity of degrading the polynucleotide of Item 4.
Item 17. Item 17. A cell growth inhibitor comprising the siRNA according to Item 16 as an active ingredient.
Item 18. Item 17. A therapeutic or ameliorating agent for a disease selected from the group consisting of leukemia, cancer and autoimmune disease, comprising the siRNA according to Item 16 as an active ingredient.
Item 19. An antibody that specifically recognizes the polypeptide of
Item 20. Item 20. A cell growth inhibitor comprising the antibody according to Item 19 as an active ingredient.
Item 21. Item 20. A therapeutic or ameliorating agent for a disease selected from the group consisting of leukemia, cancer, and autoimmune disease, comprising the antibody according to Item 19 as an active ingredient.
Item 22. (a) contacting the test substance with a test cell carrying the recombinant vector according to Item 7,
(b) comparing the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell with the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell not contacted with the test substance;
(c) a method for screening a cell growth inhibitor, comprising a step of selecting a test substance that reduces sphingomyelin synthase activity.
Item 23. (a) contacting the test substance with a test cell carrying the recombinant vector according to Item 7,
(b) comparing the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell with the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell not contacted with the test substance;
(c) a method for screening a therapeutic or ameliorating agent for a disease selected from the group consisting of leukemia, cancer, and autoimmune disease, comprising a step of selecting a test substance that reduces sphingomyelin synthase activity.
Item 24. (a) contacting the test substance with a test cell carrying the recombinant vector according to Item 7,
(b) comparing the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell with the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell not contacted with the test substance;
(c) selecting a test substance that increases sphingomyelin synthase activity, and a method for screening a cell growth promoter.
(b) comparing the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell with the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell not contacted with the test substance;
(c) a group consisting of aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, suppression of hematopoiesis after bone marrow transplantation, cirrhosis, myocardial infarction, cerebral infarction, and wound, including a step of selecting a test substance that increases sphingomyelin synthase activity A method for screening for a therapeutic or ameliorating agent for a more selected disease.
本発明により、SM合成活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列が提供され、この塩基配列を有するポリヌクレオチドが細胞増殖に必須であることが初めて確認された。 According to the present invention, an amino acid sequence of a polypeptide having SM synthesis activity and a base sequence encoding the same are provided, and it was confirmed for the first time that a polynucleotide having this base sequence is essential for cell growth.
これにより、このポリヌクレオチドの発現阻害剤、このポリペプチドの活性阻害剤、アンチセンス、siRNA、リボザイム及び抗体などが、細胞増殖抑制を必要とする癌等の治療に有用であることが明らかになった。また、このポリヌクレオチド、これがコードするポリペプチド、このポリヌクレオチドの発現促進剤、及び、このポリペプチドの活性促進剤が、細胞増殖を必要とする骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制等の治療に有用であることが明らかになった。 As a result, it became clear that the expression inhibitor of this polynucleotide, the activity inhibitor of this polypeptide, antisense, siRNA, ribozyme, antibody and the like are useful for the treatment of cancers that require cell growth suppression. It was. In addition, the polynucleotide, the polypeptide encoded by the polynucleotide, the expression promoter for the polynucleotide, and the activity promoter for the polypeptide may be used for the myelodysplastic syndrome that requires cell proliferation, suppression of hematopoiesis after bone marrow transplantation, etc. It proved useful for treatment.
以下、本発明を詳細に説明する。
(I)ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、以下の(1)又は(2)のポリペプチドである。
(1) 配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(2) 配列番号1において1又は2以上のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチド。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(I) Polypeptide The polypeptide of the present invention is the following polypeptide (1) or (2).
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(2) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 1 and having sphingomyelin synthase activity.
本発明において、ポリペプチドには、そのポリペプチドの他に生物学的活性を損なわない範囲で、その塩及び誘導体が含まれる。誘導体としては、例えば、グリコシル化、アミド化、ホスホリル化、カルボキシル化、リン酸化、ホルミル化、アシル化等されたものが挙げられる。また、塩としては酸付加塩が好ましい。酸付加塩としては、塩酸、リン酸、硫酸等の無機酸との塩;蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酒席酸等の有機酸との塩が挙げられる。 In the present invention, the polypeptide includes salts and derivatives thereof in addition to the polypeptide as long as the biological activity is not impaired. Examples of the derivatives include those that have been glycosylated, amidated, phosphorylated, carboxylated, phosphorylated, formylated, acylated, and the like. As the salt, an acid addition salt is preferable. Examples of the acid addition salt include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid and sulfuric acid; salts with organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid and liquor acid.
(2)の改変されたポリペプチドとしては、例えば、配列番号1のヒトのポリペプチドに対応する他生物種のポリペプチドが挙げられる。他生物種の対応ポリペプチドは、例えば後述するNCBIのBlastサーチにより選抜された他生物種の対応遺伝子から演繹的に同定することができる。 Examples of the modified polypeptide of (2) include polypeptides of other species corresponding to the human polypeptide of SEQ ID NO: 1. The corresponding polypeptide of another species can be deductively identified from the corresponding gene of another species selected by, for example, NCBI Blast search described below.
(1)のポリペプチドのアミノ酸の置換により(2)のポリペプチドを得る場合は、タンパク質の構造保持の観点から、極性、電荷、可溶性、親水性/疎水性、極性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンは非極性アミノ酸に分類され;セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンは極性アミノ酸に分類され;フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは芳香族側鎖を有するアミノ酸に分類され;リジン、アルギニン、ヒスチジンは塩基性アミノ酸に分類され;アスパラギン酸、グルタミン酸は酸性アミノ酸に分類される。従って、同じ群のアミノ酸から選択して置換することができる。 When the polypeptide of (2) is obtained by amino acid substitution of the polypeptide of (1), from the viewpoint of maintaining the structure of the protein, from the standpoint of polarity, charge, solubility, hydrophilicity / hydrophobicity, polarity, etc. It can be substituted with an amino acid having properties similar to those of For example, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline are classified as nonpolar amino acids; serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine, glutamine are classified as polar amino acids; phenylalanine, tyrosine, tryptophan Lysine, arginine and histidine are classified as basic amino acids; aspartic acid and glutamic acid are classified as acidic amino acids. Accordingly, substitution can be made by selecting from the same group of amino acids.
(2)の変異体ポリペプチドは、SM合成酵素活性を有していればよくそれには制限されないが、配列番号1のアミノ酸配列において、好ましくは3個以下、より好ましくは1個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したものであればよい。
(II)ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、以下の(3)又は(4)のポリヌクレオチドである。
(3) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(4) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
The mutant polypeptide of (2) is not limited as long as it has SM synthase activity, but preferably 3 or less, more preferably 1 amino acid is missing in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Anything that has been lost, added or replaced may be used.
(II) Polynucleotide The polynucleotide of the present invention is the following polynucleotide (3) or (4).
(3) A polynucleotide comprising the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
(4) A polypeptide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having the nucleotide sequence of nucleotide numbers 338 to 1576 or a nucleotide sequence complementary thereto in SEQ ID NO: 2 and has sphingomyelin synthase activity. Encoding polynucleotide.
本発明において、ポリヌクレオチド(オリゴヌクレオチドを含む)には、特に言及しない限り、DNA及びRNAの双方が含まれる。また、DNAには、特に言及しない限り、cDNA、ゲノムDNA及び合成DNAが含まれる。RNAには、特に言及しない限り、totalRNA、mRNA、rRNA、tRNA及び合成RNAが含まれる。 In the present invention, polynucleotides (including oligonucleotides) include both DNA and RNA unless otherwise specified. DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA unless otherwise specified. Unless otherwise stated, RNA includes total RNA, mRNA, rRNA, tRNA and synthetic RNA.
(3)のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号2の塩基番号338〜1576の塩基配列に基づき合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてヒトcDNAライブラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングする方法により得ることができる。また、ヒトcDNAライブラリーをPCRの鋳型として用い、例えば配列番号2のの塩基番号338〜1576の塩基配列を基に設計したプライマーを用いて、常法に従いPCRを行うことによっても得ることができる。また、化学合成によっても得ることができる。 The polynucleotide of (3) can be obtained by, for example, a method of screening a human cDNA library by hybridization using an oligonucleotide synthesized based on the nucleotide sequence of nucleotide numbers 338 to 1576 of SEQ ID NO: 2 as a probe. It can also be obtained by performing PCR according to a conventional method using a human cDNA library as a template for PCR, for example, using a primer designed based on the nucleotide sequence of nucleotide numbers 338 to 1576 of SEQ ID NO: 2. . It can also be obtained by chemical synthesis.
(4)のポリヌクレオチドは、配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。「あるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, ら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年)等に記載の方法によって得ることができる。 The polynucleotide (4) hybridizes under stringent conditions with the polynucleotide having the nucleotide sequence of nucleotide numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence complementary thereto. “Polynucleotides that hybridize to a polynucleotide under stringent conditions” include, for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989) and the like.
本発明において、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、6×SSC、0.5% SDS及び50%ホルムアミドの溶液中で42℃で加温した後、0.1×SSC、0.5% SDSの溶液中で68℃で洗浄した場合に、陽性のハイブリタイズのシグナルが観察される条件が挙げられる。 In the present invention, “stringent conditions” include, for example, heating at 42 ° C. in a solution of 6 × SSC, 0.5% SDS and 50% formamide, and then in a solution of 0.1 × SSC, 0.5% SDS. Examples include conditions under which a positive hybridization signal is observed when washed at 0 ° C.
(4)のポリヌクレオチドには、例えば、配列番号2の塩基番号338〜1576のヒトのポリヌクレオチドに対応するマウスやラットのような他生物種のポリヌクレオチドや、天然又は非天然のアレル変異体などが含まれる。 Examples of the polynucleotide (4) include polynucleotides of other species such as mice and rats corresponding to the human polynucleotides of SEQ ID NO: 2 and nucleotide numbers 338 to 1576, and natural or non-natural allelic variants. Etc. are included.
他生物種のポリヌクレオチドは、例えばNCBIのblastサーチ(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)により選抜することができる。具体的には、例えば配列番号2の塩基番号338〜1576の一部の塩基配列をNCBIのblastサーチにかけて、他の生物種の塩基配列データベース及びESTデータベースより相同性の高い配列を検索する。検索により選択された配列の当該一部配列に相当する領域の相同性が例えば90%以上の塩基配列を選抜することにより、対応する他の生物種の対応遺伝子を選抜することができる。 Polynucleotides from other species can be selected, for example, by NCBI blast search (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Specifically, for example, a partial base sequence of base numbers 338 to 1576 of SEQ ID NO: 2 is subjected to NCBI blast search to search sequences having higher homology than base sequence databases and EST databases of other species. By selecting a base sequence having a homology of, for example, 90% or more in the region corresponding to the partial sequence selected by the search, a corresponding gene of another corresponding species can be selected.
(3)のポリヌクレオチドのヌクレオチドを置換して(4)のポリヌクレオチドを定めるに当たっては、翻訳後に得られるアミノ酸が、極性、電荷、可溶性、親水性/疎水性、極性などの点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するような塩基の置換を行うことができる。また、一つのアミノ酸が数個の翻訳コドンを有する場合、この翻訳コドン内での塩基の置換も勿論可能である。
(III)組み換えベクター
本発明の組み換えベクターは、本発明のポリヌクレオチド(ここではDNA)を含むベクターであり、本発明のポリヌクレオチドを適当なベクターDNAに組み込むことにより得られる。
ベクターDNAは、宿主の種類及び使用目的により適宜選択すればよい。ベクターDNAは、天然に存在するDNAであってもよく、天然DNAから増殖に必要な部分以外のDNA部分が一部欠落しているものでもよい。ベクターDNAとしては、例えば、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウィルス(例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、SV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等)等に由来するベクター及びそれらを組み合わせたベクター、プラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター(例えばコスミドおよびファージミド等)が挙げられる。
また、本発明のポリペプチドの製造のためには、発現ベクター又はクローニングベクター等を用いればよい。
(IV)形質転換体
本発明のポリヌクレオチドが組み込まれた組み換えベクターを、公知の宿主、例えば大腸菌(例えばK12)、バチルス属細菌(例えばMI114)のような細菌、酵母(例えばAH22)、昆虫細胞(例えばSf細胞)又は動物細胞(例えばCOS-7細胞、Vero細胞、CHO細胞等)等に公知の方法で導入することにより本発明の形質転換体が得られる。
ポリヌクレオチド導入方法は、公知の方法を制限なく使用できる。このような公知のポリヌクレオチド導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法及び感染等を例示できる。
(V)ポリペプチドの製造方法
本発明のポリペプチドは公知のペプチド合成法により合成することができる。このようなペプチド合成法としては、例えば「ペプチド合成」(丸善;1975年発行)に記載の方法が例示される。また、例えばアプライドバイオシステムズ社のペプチド合成装置のような公知の化学合成装置を用いて製造することもできる。
また本発明のポリペプチドは、上記説明した本発明の形質転換体を培養する工程と、この培養物から本発明のポリペプチドを回収する工程とを含む方法により製造することもできる。
In substituting the nucleotide of the polynucleotide of (3) to determine the polynucleotide of (4), the amino acid obtained after translation is pre-substitution in terms of polarity, charge, solubility, hydrophilicity / hydrophobicity, polarity, etc. Substitution of bases having properties similar to those of the amino acids can be performed. In addition, when one amino acid has several translation codons, it is of course possible to substitute a base within the translation codon.
(III) Recombinant Vector The recombinant vector of the present invention is a vector containing the polynucleotide of the present invention (here, DNA), and can be obtained by incorporating the polynucleotide of the present invention into an appropriate vector DNA.
Vector DNA may be appropriately selected depending on the type of host and intended use. The vector DNA may be a naturally occurring DNA or may be a DNA in which a portion of the DNA other than the portion necessary for growth is missing from the natural DNA. Examples of the vector DNA include, for example, bacterial plasmids, bacteriophages, transposons, yeast episomes, insertion elements, yeast chromosomal elements, viruses (eg, baculovirus, papovavirus, SV40, vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus and And vectors derived from genetic elements of bacteriophage (for example, cosmids and phagemids).
In addition, for the production of the polypeptide of the present invention, an expression vector or a cloning vector may be used.
(IV) Transformant A recombinant vector incorporating the polynucleotide of the present invention is transformed into a known host, for example, a bacterium such as Escherichia coli (for example, K12), a bacterium belonging to the genus Bacillus (for example, MI114), yeast (for example, AH22). ), Insect cells (for example, Sf cells), animal cells (for example, COS-7 cells, Vero cells, CHO cells, etc.) and the like by a known method, the transformant of the present invention can be obtained.
As the polynucleotide introduction method, a known method can be used without limitation. Examples of such known polynucleotide introduction methods include calcium phosphate method, DEAE-dextran method, microinjection method, electroporation method and infection.
(V) Polypeptide Production Method The polypeptide of the present invention can be synthesized by a known peptide synthesis method. Examples of such peptide synthesis methods include the method described in “Peptide Synthesis” (Maruzen; issued in 1975). Alternatively, it can be produced using a known chemical synthesizer such as a peptide synthesizer manufactured by Applied Biosystems.
The polypeptide of the present invention can also be produced by a method comprising the step of culturing the transformant of the present invention described above and the step of recovering the polypeptide of the present invention from this culture.
培養物から本発明のポリペプチドを回収し、さらにこれを精製することが好ましい。精製は、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等を組み合わせた公知の方法により行えばよい。
また、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき製造された、このアミノ酸配列に特異的なポリクローナル抗体又はモノクロ−ナル抗体を用いて、培養物中の本発明のポリペプチドを特異的に吸着回収することもできる。
(VI)アンチセンス
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、以下の(5)又は(6)のポリヌクレオチドである。
(5) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも18塩基に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(6) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも18塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
It is preferred to recover the polypeptide of the present invention from the culture and further purify it. Purification may be performed by a known method combining various chromatographies such as gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and affinity chromatography.
In addition, the polypeptide of the present invention in the culture is specifically adsorbed and recovered using a polyclonal antibody or a monoclonal antibody specific to this amino acid sequence produced based on the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention. You can also.
(VI) Antisense The antisense polynucleotide of the present invention is the following polynucleotide (5) or (6).
(5) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to at least 18 consecutive bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
(6) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with at least 18 consecutive bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
本発明のアンチセンスは、本発明のポリペプチドをコードするmRNAとハイブリダイズしてmRNAからポリペプチドへの翻訳を阻害すること、又は、mRNAを分解することにより、このポリペプチドの発現を阻害する。 The antisense of the present invention inhibits the expression of this polypeptide by hybridizing with the mRNA encoding the polypeptide of the present invention and inhibiting the translation from mRNA to polypeptide, or by degrading the mRNA. .
(5)のアンチセンスは、配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の、連続する少なくとも20塩基に相補的な塩基配列を含むことが好ましい。(6)のアンチセンスも、配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の、少なくとも20塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。 The antisense of (5) preferably includes a base sequence complementary to at least 20 consecutive bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto. The antisense of (6) is also preferably one that hybridizes under stringent conditions with at least 20 bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto. .
アンチセンスの塩基数の上限は特に限定されないが、通常30塩基程度もあれば十分に目的を達成できる。選択した配列が目的mRNAの発現のみを阻害するか否かは、例えばBLASTサーチで確認すればよい。 The upper limit of the number of antisense bases is not particularly limited, but usually about 30 bases can sufficiently achieve the object. Whether or not the selected sequence inhibits only the expression of the target mRNA may be confirmed by, for example, a BLAST search.
配列番号2の塩基番号338〜1576の塩基配列中の、(5)及び(6)のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域は、配列番号2の塩基番号338〜1576の5'末端に近いほど好ましい。 The region where the polynucleotides (5) and (6) hybridize in the base sequence of base numbers 338 to 1576 of SEQ ID NO: 2 is preferably closer to the 5 ′ end of base numbers 338 to 1576 of SEQ ID NO: 2.
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、1本鎖DNA、1本鎖RNA、2本鎖DNA又はDNA・RNAハイブリッドのいずれであってもよい。なお、2本鎖RNAは後述するsiRNAに該当する。 The antisense polynucleotide of the present invention may be any of single-stranded DNA, single-stranded RNA, double-stranded DNA, or DNA / RNA hybrid. Double-stranded RNA corresponds to siRNA described later.
また、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの発現を阻害する限り、これらのヌクレオチドの誘導体であってもよい。誘導体としては、ホスホロチオエートDNA、H-ホスホネートDNAなどを例示できる。 The antisense polynucleotide of the present invention may be a derivative of these nucleotides as long as it inhibits the expression of the polypeptide of the present invention. Examples of the derivatives include phosphorothioate DNA and H-phosphonate DNA.
本発明のアンチセンスによる本発明のポリペプチドの発現の阻害は、例えば以下の方法で確認できる。ヒトの白血病由来の細胞に、20〜50μg/ml程度のアンチセンスを、必要に応じてリポフェクション試薬、リポフェクタミン試薬、リポソーム等の公知の細胞内導入試薬とともに加える。次いで、この細胞から細胞抽出液を公知の方法で調製し、後述する本発明の抗体を用いて、ELISAやウェスタンブロット等の公知の方法で本発明のポリペプチドの発現量を測定すればよい。この発現量をアンチセンス非添加の場合と比較する。 Inhibition of the expression of the polypeptide of the present invention by the antisense of the present invention can be confirmed, for example, by the following method. Antisense of about 20 to 50 μg / ml is added to human leukemia-derived cells together with known intracellular introduction reagents such as lipofection reagent, lipofectamine reagent, liposome and the like, if necessary. Subsequently, a cell extract is prepared from the cells by a known method, and the expression level of the polypeptide of the present invention may be measured by a known method such as ELISA or Western blot using the antibody of the present invention described later. This expression level is compared with the case where no antisense was added.
本発明のアンチセンスは、公知の化学合成法により製造できる。
(VII)siRNA
本発明のsiRNAは、以下の(7)又は(8)のsiRNAである。
(7) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列の連続する少なくとも21塩基に相補的なRNA鎖とこれに相補的なRNA鎖との対を含むsiRNA。
(8) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも21塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする2本鎖RNAからなるsiRNA。
The antisense of the present invention can be produced by a known chemical synthesis method.
(VII) siRNA
The siRNA of the present invention is the following (7) or (8) siRNA.
(7) An siRNA comprising a pair of an RNA strand complementary to at least 21 consecutive bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 and an RNA strand complementary thereto.
(8) An siRNA comprising a double-stranded RNA that hybridizes under stringent conditions with at least 21 consecutive base sequences of base numbers 338 to 1576 of SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
本発明のsiRNAの作用機作は必ずしも明らかではないが、本発明のポリペプチドをコードするmRNAとハイブリダイズしてmRNAからポリペプチドへの翻訳を阻害すること、又は、mRNAを分解することにより、このポリペプチドの発現を阻害すると考えられる。 Although the mechanism of action of the siRNA of the present invention is not necessarily clear, by hybridizing with the mRNA encoding the polypeptide of the present invention and inhibiting translation from mRNA to polypeptide, or by degrading the mRNA, It is thought to inhibit the expression of this polypeptide.
(7)のsiRNAは、配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の、連続する少なくとも23塩基に相補的な塩基配列を含むことが好ましい。(6)のsiRNAも、配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の、少なくとも23塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。 The siRNA of (7) preferably includes a base sequence complementary to at least 23 consecutive bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto. The siRNA of (6) is also preferably one that hybridizes under stringent conditions with at least 23 bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
siRNAの塩基数の上限は特に限定されないが、通常30塩基程度もあれば十分に目的を達成できる。選択した配列が目的mRNAのみ発現阻害するか否かは、例えばBLASTサーチで確認すればよい。 The upper limit of the number of bases of siRNA is not particularly limited, but usually about 30 bases can sufficiently achieve the object. Whether or not the selected sequence inhibits the expression of only the target mRNA may be confirmed by, for example, a BLAST search.
また、配列番号2の塩基番号338〜1576の塩基配列中の(7)及び(8)のsiRNAがハイブリダイズする領域は、開始コドンの下流50〜100塩基程度の領域を含むことが好ましく、この領域に含まれることがより好ましい。 In addition, the region where the siRNAs (7) and (8) in the base sequence of base numbers 338 to 1576 of SEQ ID NO: 2 hybridize preferably includes a region of about 50 to 100 bases downstream of the start codon. More preferably, it is included in the region.
本発明のsiRNAによる本発明のポリペプチドの発現の阻害の確認は、アンチセンスの場合と同様にして行えばよい。 The inhibition of the expression of the polypeptide of the present invention by the siRNA of the present invention may be confirmed in the same manner as in the case of antisense.
本発明のsiRNAは、公知の化学合成法により製造できる。
(VIII)リボザイム
本発明のリボザイムは、以下の(9)又は(10)のリボザイムである。
(9) 配列番号2の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列中の連続する少なくとも20塩基からなる二つの領域にそれぞれ相補的な二つの塩基配列部分を有し、かつ、本発明のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム。
(10) 配列番号2の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも20塩基からなる二つの領域にそれぞれストリンジェントな条件下でハイブリダイズする二つの塩基配列を有し、かつ、本発明のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム。
The siRNA of the present invention can be produced by a known chemical synthesis method.
(VIII) Ribozyme The ribozyme of the present invention is the following ribozyme (9) or (10).
(9) having two base sequence portions complementary to each of two regions consisting of at least 20 consecutive bases in the base sequence of base numbers 338 to 1576 of SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto, and A ribozyme having an activity of degrading the polynucleotide of the present invention.
(10) There are two base sequences that hybridize under stringent conditions in two regions consisting of at least 20 consecutive base sequences of base numbers 338 to 1576 of SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto. And a ribozyme having an activity of degrading the polynucleotide of the present invention.
本発明のリボザイムの塩基数の上限は特に限定されないが、通常100塩基程度とすればよい。 Although the upper limit of the number of bases of the ribozyme of the present invention is not particularly limited, it is usually about 100 bases.
配列番号2の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列中の二つの領域は、隣接していても離れていてもよいが、それらの領域間には2〜6塩基程度の塩基が存在することが好ましい。例えばハンマーヘッド型リボザイムでは、2塩基が存在する場合が挙げられ、ヘアピン型リボザイムでは6塩基が存在する場合が挙げられる。 Two regions in the base sequence of base numbers 338 to 1576 of SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto may be adjacent or separated, but there are about 2 to 6 bases between these regions Preferably a base is present. For example, hammerhead ribozymes include cases where 2 bases are present, and hairpin ribozymes include cases where 6 bases are present.
リボザイムは、RNAの特定の部位を認識するアンチセンス配列を含むRNA分子であり、かつ、RNA切断酵素活性を有する。これによりリボザイムは、標的RNAを識別し、RNAの特定部位を特異的に切断する。 A ribozyme is an RNA molecule containing an antisense sequence that recognizes a specific site in RNA, and has RNA cleaving enzyme activity. As a result, the ribozyme identifies the target RNA and specifically cleaves a specific portion of the RNA.
本発明のリボザイムは、ハンマーヘッド型及びヘアピン型のいずれであってもよい。ハンマーヘッド型は、通常NUX(NはG、U、C又はAであり、XはC、U又はAである)を認識し、Xの3'側の位置でRNA(通常mRNA)を切断する。また、ヘアピン型は、通常NNNG/CN*GUCNNNNNNNN(NはG、U、C又はA)を認識し、N*G間でRNA(通常mRNA)を切断する。 The ribozyme of the present invention may be either a hammerhead type or a hairpin type. The hammerhead type usually recognizes NUX (N is G, U, C, or A, and X is C, U, or A), and cleaves RNA (usually mRNA) at a position 3 'to X. . The hairpin type usually recognizes NNNG / CN * GUCNNNNNNNN (N is G, U, C or A) and cuts RNA (usually mRNA) between N * G.
また本発明のリボザイムは、ヘリカーゼと相互作用するモチーフを有することが好ましく、これにより、RNA切断活性が向上する。 Moreover, it is preferable that the ribozyme of the present invention has a motif that interacts with helicase, thereby improving RNA cleavage activity.
本発明のリボザイムは、通常RNAからなるが、デオキシリボヌクレオチドを含むものや、生体内で分解され難いホスホチオエート修飾されたもの等の誘導体も本発明のリボザイムに含まれる。 The ribozyme of the present invention is usually composed of RNA, but derivatives such as those containing deoxyribonucleotides and those modified with phosphothioate which are hardly degraded in vivo are also included in the ribozyme of the present invention.
本発明のリボザイムは、周知の化学合成法等により製造できる。
(IX)抗体
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよい。また本発明の抗体には、本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸配列の連続す20アミノ酸、好ましくは30アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も含まれる。さらに、これらの抗体の誘導体(キメラ抗体等)やペルオキシダーゼのような酵素で標識したものも本発明の抗体に含まれる。
抗体の製造方法
これらの抗体は、周知の製造方法(例えばCurrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13)に従って製造することができる。
The ribozyme of the present invention can be produced by a known chemical synthesis method or the like.
(IX) Antibody The antibody of the present invention is an antibody that specifically recognizes the polypeptide of the present invention. The antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The antibody of the present invention also includes an antibody having an antigen binding property to a polypeptide consisting of 20 amino acids, preferably 30 amino acids, in the amino acid sequence constituting the polypeptide of the present invention. Furthermore, derivatives of these antibodies (chimeric antibodies, etc.) and those labeled with an enzyme such as peroxidase are also included in the antibodies of the present invention.
Methods for Producing Antibodies These antibodies can be produced according to well-known production methods (for example, Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Sections 11.12 to 11.13).
具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体である場合には、本発明のポリペプチドを用いて家兎等の非ヒト動物を免疫し、この免疫動物の血清から常法に従って得ることができる。また本発明の抗体がモノクローナル抗体である場合には、例えば、本発明のポリペプチド又はその部分配列を有するポリペプチドを用いてマウス等の非ヒト動物を免疫し、この免疫動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させることにより得られたハイブリドーマから得ることができる(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11)。
(X)医薬
ポリペプチド
後掲の実施例に示されるように、本発明のポリペプチドはSM合成酵素活性を有し、細胞増殖に必須であることから、細胞増殖を必要とする疾患、例えば再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷などの治療又は改善に好適に使用できる。中でも、リンパ球の増殖を必要とする骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制に好適に使用できる。
Specifically, when the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, a non-human animal such as a rabbit can be immunized using the polypeptide of the present invention, and can be obtained from the serum of this immunized animal according to a conventional method. . When the antibody of the present invention is a monoclonal antibody, for example, a non-human animal such as a mouse is immunized with the polypeptide of the present invention or a polypeptide having a partial sequence thereof, and the spleen cells and bone marrow of the immunized animal are immunized. It can be obtained from hybridomas obtained by cell fusion with tumor cells (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11).
(X) Pharmaceutical
As shown in the Examples below, the polypeptide of the present invention has SM synthase activity and is essential for cell growth, so that a disease requiring cell growth, such as aplastic anemia, It can be suitably used for the treatment or improvement of myelodysplastic syndrome, suppression of hematopoiesis after bone marrow transplantation, cirrhosis, myocardial infarction, cerebral infarction, wound and the like. Among them, it can be suitably used for myelodysplastic syndrome requiring lymphocyte proliferation and hematopoiesis suppression after bone marrow transplantation.
本発明のポリペプチドは、薬学的に許容される各種担体(賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤等が含まれる)と配合し、製剤とされる。製剤は慣用の添加剤を含んでいてよい。 The polypeptide of the present invention is blended with various pharmaceutically acceptable carriers (including excipients, binders, disintegrants, lubricants, etc.) to form a preparation. The formulation may contain conventional additives.
製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤;注射剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤等などの各種製剤形態を挙げることができる。 The form of the preparation is not particularly limited. For example, tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups and other oral administration agents; injections, drops, external preparations, parenteral administration agents such as suppositories, etc. Various preparation forms can be mentioned.
製剤中の本発明のポリペプチドの含有量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、ポリペプチドの1日投与量が通常10〜1000mg程度、より好ましくは100〜500mg程度になる量とすればよい。1日1回投与する場合は、1製剤中にこの量が含まれていればよく、1日3回投与する場合は、1製剤中にこの3分の1量が含まれていればよい。
ポリヌクレオチド
本発明のポリペプチドがSM合成酵素活性を有し、細胞増殖に必須であることから、これをコードするポリヌクレオチドも、例えば再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷などの治療又は改善に好適に使用できる。中でも、リンパ球の増殖を必要とする骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制に好適に使用できる。
これらの疾患の治療又は改善に当たっては、本発明のポリヌクレオチドをベクターに担持させ、直接体内に導入してもよく、又ヒトから細胞を採取してベクターを導入した後体内に戻すこともできる。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等の遺伝子治療に使用できることが知られているものを制限なく使用できるが、レトロウイルスが推奨される。
また、本発明のポリヌクレオチドをリポソームに封入して送達するマイクロインジェクションなどを使用して細胞に導入することもできる。
The content of the polypeptide of the present invention in the preparation varies depending on the administration route, patient age, weight, symptoms, etc., and cannot be defined unconditionally, but the daily dose of the polypeptide is usually about 10 to 1000 mg, more preferably 100. The amount may be about 500 mg. When it is administered once a day, it is sufficient that this amount is contained in one preparation, and when it is administered three times a day, it is sufficient that this one-third amount is contained in one preparation.
Polynucleotide Since the polypeptide of the present invention has SM synthase activity and is essential for cell proliferation, the polynucleotide encoding the same is also used in, for example, aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, suppression of hematopoiesis after bone marrow transplantation. It can be suitably used for the treatment or improvement of cirrhosis, myocardial infarction, cerebral infarction, wound and the like. Among them, it can be suitably used for myelodysplastic syndrome requiring lymphocyte proliferation and hematopoiesis suppression after bone marrow transplantation.
In treating or ameliorating these diseases, the polynucleotide of the present invention may be carried on a vector and directly introduced into the body, or cells may be collected from a human and introduced into the body and then returned to the body. As the vector, any of those known to be usable for gene therapy such as retrovirus, adenovirus, and vaccinia virus can be used without limitation, but a retrovirus is recommended.
Alternatively, the polynucleotide of the present invention can be introduced into cells using microinjection or the like in which liposomes are encapsulated and delivered.
本発明のポリヌクレオチドの投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、ポリヌクレオチド量として、血中濃度が10〜100ng/ml程度、好ましくは20〜50 ng/ml程度程度になるように投与すればよい。
アンチセンス・siRNA
本発明のアンチセンス及びsiRNAは、SM合成酵素遺伝子の発現を阻害することから、細胞増殖抑制を必要とする疾患、例えば白血病、各種癌、自己免疫疾患などの治療又は改善に好適に使用できる。中でも、白血病又は癌の治療又は改善に好適に使用できる。
これらの疾患の治療又は改善に当たっては、本発明のポリヌクレオチドをリポソームに封入して送達するマイクロインジェクションなどを使用して細胞に導入したり、細胞に直接注入もしくは経静脈的に投与すればよい。
The dose of the polynucleotide of the present invention varies depending on the administration method, patient age, body weight, symptoms, etc., and cannot be defined unconditionally, but the polynucleotide concentration is about 10-100 ng / ml in blood, preferably 20-50. What is necessary is just to administer so that it may be about ng / ml.
Antisense siRNA
Since the antisense and siRNA of the present invention inhibit the expression of the SM synthase gene, it can be suitably used for the treatment or improvement of diseases that require cell growth suppression, such as leukemia, various cancers, and autoimmune diseases. Among these, it can be suitably used for the treatment or improvement of leukemia or cancer.
In treating or ameliorating these diseases, the polynucleotide of the present invention may be introduced into cells using microinjection in which liposomes are encapsulated and delivered, or directly injected or intravenously administered to cells.
アンチセンス及びsiRNAの投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、アンチセンス及びsiRNA量として、血中濃度が10〜100ng/ml程度、好ましくは20〜50 ng/ml程度程度になるように投与すればよい。
抗体
本発明の抗体は、SM合成酵素に結合することによりその活性を阻害することから、細胞増殖抑制を必要とする疾患、例えば白血病、各種癌、自己免疫疾患などの治療又は改善に好適に使用できる。
The dosage of antisense and siRNA varies depending on the administration method, patient age, weight, symptoms, etc., and cannot be specified unconditionally, but as the amount of antisense and siRNA, the blood concentration is about 10 to 100 ng / ml, preferably 20 to What is necessary is just to administer so that it may be about 50 ng / ml.
Antibody Since the antibody of the present invention inhibits its activity by binding to SM synthase, it is suitably used for the treatment or improvement of diseases requiring suppression of cell proliferation, such as leukemia, various cancers, and autoimmune diseases. it can.
本発明の抗体は、通常、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射などの注射剤とすればよい。注射剤には、必要に応じて、食塩、湿潤剤、乳化剤などの慣用の添加剤が含まれていてよい。 The antibody of the present invention may be usually an injection such as intravenous injection, intramuscular injection, or subcutaneous injection. The injection may contain conventional additives such as salt, wetting agent and emulsifier, if necessary.
製剤中の抗体の含有量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、抗体の1日投与量が通常10〜1000mg程度、より好ましくは100〜500mg程度になる量とすればよい。
(XI)医薬のスクリーニング方法
本発明の細胞増殖抑制剤、又は、白血病、癌及び自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療若しくは改善剤のスクリーニング方法(第1の方法)は、
(a) 被験物質と本発明の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞におけるSM合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるSM合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c) SM合成酵素活性を低減させる被験物質を選択する工程と
を含む方法である。
The content of the antibody in the preparation varies depending on the administration route, patient age, weight, symptoms, etc., and cannot be generally specified, but the daily dose of the antibody is usually about 10 to 1000 mg, more preferably about 100 to 500 mg. It can be an amount.
(XI) Screening method for drug The cell growth inhibitor of the present invention, or a screening method for a therapeutic or ameliorating agent for a disease selected from the group consisting of leukemia, cancer and autoimmune disease (first method),
(a) contacting the test substance with a test cell carrying the recombinant vector of the present invention;
(b) comparing the SM synthase activity or its index value in the test cell with the SM synthase activity or its index value in the test cell not contacted with the test substance;
(c) selecting a test substance that reduces SM synthase activity.
また本発明の細胞増殖促進剤、又は、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷からなる群より選ばれる疾患の治療若しくは改善剤のスクリーニング方法(第2の方法)は、
(a) 被験物質と本発明の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b) 試験細胞におけるSM合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるSM合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c) SM合成酵素活性を増大させる被験物質を選択する工程と
を含む方法である。
The cell growth promoter of the present invention or a therapeutic or ameliorating agent for a disease selected from the group consisting of aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, hematopoiesis suppression after bone marrow transplantation, cirrhosis, myocardial infarction, cerebral infarction, and wound The screening method (second method) is:
(a) contacting the test substance with a test cell carrying the recombinant vector of the present invention;
(b) comparing the SM synthase activity or its index value in the test cell with the SM synthase activity or its index value in the test cell not contacted with the test substance;
(c) selecting a test substance that increases SM synthase activity.
本発明のスクリーニング方法によれば、細胞膜受容体等を介して間接的に本発明のポリヌクレオチドの発現又は本発明のポリペプチドの活性に影響を与える物質、細胞内に取り込まれて直接本発明のポリヌクレオチドに結合することによりその発現に影響を与える物質又は直接本発明のポリペプチドに結合することによりその活性に影響を与える物質、細胞内に取り込まれて他の細胞内タンパク質に作用することにより間接的に本発明のポリヌクレオチドの発現又は本発明のポリペプチドの活性に影響を与える物質等が選択される。 According to the screening method of the present invention, a substance that affects the expression of the polynucleotide of the present invention or the activity of the polypeptide of the present invention indirectly via a cell membrane receptor, etc., is directly taken into the cell and directly A substance that affects its expression by binding to a polynucleotide, or a substance that affects its activity by directly binding to a polypeptide of the present invention, by being taken into cells and acting on other intracellular proteins A substance or the like that indirectly affects the expression of the polynucleotide of the present invention or the activity of the polypeptide of the present invention is selected.
本発明のポリヌクレオチドの発現を阻害又は本発明のポリペプチドの活性を低減させる物質は、細胞増殖抑制剤として有用である。また、本発明のポリヌクレオチドの発現を促進又は本発明のポリペプチドの活性を増大させる物質は、細胞増殖促進剤として有用である。
試験細胞
本発明の組み換えベクターを保持させる試験細胞としては、それには限定されないが、哺乳動物細胞又は昆虫細胞などを用いることができる。
A substance that inhibits the expression of the polynucleotide of the present invention or reduces the activity of the polypeptide of the present invention is useful as a cell growth inhibitor. A substance that promotes the expression of the polynucleotide of the present invention or increases the activity of the polypeptide of the present invention is useful as a cell growth promoter.
Test Cell The test cell for retaining the recombinant vector of the present invention is not limited thereto, but a mammalian cell or an insect cell can be used.
哺乳動物細胞としては、例えばベロ細胞、Hela細胞、CV1細胞、ナマルバ細胞、COS1細胞、CHO細胞等の公知の細胞を使用できる。また、ヒト骨肉腫細胞株Saos-2(ATCC、HTB85)、大腸癌細胞株のDLD-1、ヒト乳癌細胞株MCF−7(国立医薬品食品衛生研究所 細胞バンク、JCRB0134)、ヒト腎上皮細胞株293(ATCC、CRL1573)、赤白血球病細胞株K562(ATCC、CCL243)等の癌細胞を使用することもできる。継代培養が容易であり、正常細胞の多くの性質を有していることから、一次スクリーニングの段階では癌細胞を用いてもよい。 Examples of mammalian cells that can be used include known cells such as Vero cells, Hela cells, CV1 cells, Namalva cells, COS1 cells, and CHO cells. In addition, human osteosarcoma cell line Saos-2 (ATCC, HTB85), colon cancer cell line DLD-1, human breast cancer cell line MCF-7 (National Food and Drug Institute Cell Bank, JCRB0134), human renal epithelial cell line Cancer cells such as 293 (ATCC, CRL1573) and red leukocyte disease cell line K562 (ATCC, CCL243) can also be used. Since subculture is easy and has many properties of normal cells, cancer cells may be used in the primary screening stage.
昆虫細胞としては、例えばSf細胞、MG1細胞、High FiveTM細胞等の公知の細胞を使用できる。
SM合成活性の評価
SM合成酵素活性の低減又は増大の確認方法は特に限定されないが、例えば、実施例6に示すように、ラジオラベルしたアミノ酸とともに細胞をインキュベートした後、抽出した脂質をTLCに供し、SMに相当するバンドの放射活性を比較する方法、蛍光基質NBD?セラミドのNBD?SMへの変化をTLC上でBAS?2000イメージアナライザー又は公知の蛍光量測定装置で測定する方法等を使用できる。
As insect cells, known cells such as Sf cells, MG1 cells, and High Five ™ cells can be used.
Evaluation of SM synthesis activity
The method for confirming the decrease or increase in SM synthase activity is not particularly limited. For example, as shown in Example 6, after incubating cells with radiolabeled amino acids, the extracted lipid is subjected to TLC and corresponds to SM. How to compare the radioactivity of bands, fluorescent substrate NBD? Ceramide NBD? Change to SM BAS on TLC? A method of measuring with a 2000 image analyzer or a known fluorescence measuring device can be used.
またSM合成酵素活性の指標値としては、例えばlysenin結合能等が挙げられる。非毒性の変異体lyseninを用いる場合は、実施例2に示すように、マルトース結合タンパク質(MBP)に融合させたlyseninとしてMBPに対する抗体を用いてlysenin結合能を測定すればよい。また天然型のlyseninを用いる場合は、実施例2に示すようにlyseninによる細胞死を測定することによりlysenin結合能を評価すればよい。
被験物質
被験物質の種類は特に限定されない。例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物(ヌクレオチド、アミン、糖質、脂質等)、有機低分子化合物、無機低分子化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。
接触・判定
試験細胞と被験物質との接触は、例えば以下のようにして行うことができる。すなわち、ベクターを保持する細胞は、その細胞に適した培地を用いて継代し、対数増殖期の状態になるように培養しておく。被験物質を接触させる際には、細胞を5x105/ml程度の細胞密度になるように播き、24時間程度培養する。次いで、被験物質を、その種類によって異なるが例えば10〜1000nM程度の濃度になるように細胞培養に添加する。次いで、37℃程度で、12〜48時間程度インキュベートする。なお、被験物質によりアポトーシスが誘導されてしまうのを防ぐために、アポトーシス阻害剤DEVD−CHOを200mM前後の濃度で添加することが好ましい。
Examples of the SM synthase activity index value include lysenin binding ability. When the non-toxic mutant lysenin is used, as shown in Example 2, lysenin binding ability may be measured using an antibody against MBP as lysenin fused to maltose binding protein (MBP). When natural lysenin is used, lysenin binding ability may be evaluated by measuring cell death by lysenin as shown in Example 2.
Test substance The type of test substance is not particularly limited. Examples include proteins, peptides, non-peptidic compounds (nucleotides, amines, carbohydrates, lipids, etc.), organic low molecular compounds, inorganic low molecular compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. It is done.
Contact between the contact / judgment test cell and the test substance can be performed, for example, as follows. That is, the cells carrying the vector are subcultured using a medium suitable for the cells and cultured so as to be in a logarithmic growth phase. When contacting the test substance, the cells are seeded to a cell density of about 5 × 10 5 / ml and cultured for about 24 hours. Next, the test substance is added to the cell culture so as to have a concentration of about 10 to 1000 nM, for example, depending on the type. Next, it is incubated at about 37 ° C. for about 12 to 48 hours. In order to prevent apoptosis from being induced by the test substance, it is preferable to add the apoptosis inhibitor DEVD-CHO at a concentration of about 200 mM.
この後、被験物質を接触させた試験細胞におけるSM合成酵素活性とと被験物質を接触させない試験細胞のSM合成酵素活性を比較する。比較は、両細胞のSM合成酵素活性を測定した後比較することもでき、又は、SM合成酵素活性を目視等により直接比較することにより定性的に確認することもできる。 Thereafter, the SM synthase activity in the test cell contacted with the test substance is compared with the SM synthase activity in the test cell not contacted with the test substance. The comparison can be made after measuring the SM synthase activity of both cells, or can be confirmed qualitatively by directly comparing the SM synthase activity visually or the like.
被験物質を接触させることにより、SM合成酵素活性が被験物質を接触させない対照の例えば75%以下、好ましくは50%以下になる場合には、SM合成酵素活性が低減したと判定すればよい。また、SM合成酵素活性が対照の例えば125%以上、好ましく150%以上になる場合には、SM合成酵素活性が増大したと判定すればよい。
(XII)実施例
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
細胞培養
各実施例において細胞は以下のようにして入手し、維持したものを用いた。
If the SM synthase activity is, for example, 75% or less, preferably 50% or less of the control in which the test substance is not contacted by bringing the test substance into contact, it may be determined that the SM synthase activity has decreased. Further, when the SM synthase activity is, for example, 125% or more, preferably 150% or more of the control, it may be determined that the SM synthase activity has increased.
(XII) Examples Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. However, the present invention is not limited to these examples.
Cell culture In each Example, cells obtained and maintained as follows were used.
WR19L/Fas細胞は、京都大学ウィルス研究所の米原博士から入手した。WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SM(+)細胞は、天然型のWR19L/Fas細胞から限界希釈法により単離した。 WR19L / Fas cells were obtained from Dr. Yonehara of Kyoto University Virus Research Institute. WR19L / Fas-SM (−) cells and WR19L / Fas-SM (+) cells were isolated from native WR19L / Fas cells by limiting dilution.
細胞は、常法に従い、10%牛胎児血清(FBS)、50μMの2-メルカプトエタノール及び75μg/mlのカナマイシンを添加したRPMI-1640培地中で5%CO2及び100%湿度の下37℃で維持した。 Cells were routinely treated at 37 ° C. under 5% CO 2 and 100% humidity in RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 50 μM 2-mercaptoethanol and 75 μg / ml kanamycin. Maintained.
血清フリー培地の培養のためには、細胞を洗浄し、1×105cells/mlで再播種し、5μg/mlのヒトインスィン及びウシholoタイプトランスフェリンを含むRPMI-1640培地中で5%CO2の下37℃で培養した。48時間の培養の後、0.25%トリパンブルーを用いたdye exclusion法により細胞数を測定した。 For culture of serum free medium, cells are washed, replated at 1 × 10 5 cells / ml, and 5% CO 2 in RPMI-1640 medium containing 5 μg / ml human insine and bovine holo type transferrin. The cells were cultured at 37 ° C. After culturing for 48 hours, the number of cells was measured by the dye exclusion method using 0.25% trypan blue.
各細胞のSM産生の有無の確認
(1) WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SM(+)細胞を、それぞれ2%FBS及びL-[14C]セリン(比活性;155mCi/mmol)を含むRPMI-1640培地中に、5×105cells/mlの密度になるように播種した。細胞を37℃の下5%CO2中で2時間培養することによりラベルした。
Confirmation of the presence or absence of SM production in each cell (1) WR19L / Fas-SM (-) cells and WR19L / Fas-SM (+) cells were respectively treated with 2% FBS and L- [ 14 C] serine (specific activity; 155 mCi / mmol) in RPMI-1640 medium so as to have a density of 5 × 10 5 cells / ml. Cells were labeled by culturing for 2 hours in 5% CO 2 at 37 ° C.
WR19L/Fas 細胞は、Fas抗原を過剰発現しているリンパ球細胞であり、WR19L/Fas-SM(+)細胞は、SMを発現している天然型WR19L/Fas細胞であり、WR19L/Fas-SM(-)細胞はそのSM欠損変異体である。 WR19L / Fas cells are lymphocyte cells overexpressing Fas antigen, WR19L / Fas-SM (+) cells are natural WR19L / Fas cells expressing SM, WR19L / Fas- SM (-) cells are the SM-deficient mutant.
両細胞の細胞脂質をBligh&Dyerの方法(J.Biol.Chem.264,19076-19080(1989))により抽出し、シリカゲル薄層クロマトグラフィー(TLC)プレート(Whatman Maidstone,UK)にアプライし、酢酸メチル/プロパノール/クロロフォルム/メタノール/0.25%KCl(25:25:25:10:9)で展開した。放射線活性を有するスポットが可視化されるため、この放射活性をBAS2000イメージアナライザー(Fuji Photo Film)を用いて定量した。 Cell lipids of both cells were extracted by the method of Bligh & Dyer (J. Biol. Chem. 264, 19076-19080 (1989)), applied to silica gel thin layer chromatography (TLC) plates (Whatman Maidstone, UK), and methyl acetate. /Propanol/chloroform/methanol/0.25% KCl (25: 25: 25: 10: 9). Since spots having radioactivity were visualized, the radioactivity was quantified using a BAS2000 image analyzer (Fuji Photo Film).
TLCの結果を図1Aに示す。図1A中、Cerはセラミドを示し、GCはグリコシルセラミドを示し、PEはフォスファチジルエタノールアミンを示し、PSはフォスファチジルセリンを示す。 The result of TLC is shown in FIG. 1A. In FIG. 1A, Cer represents ceramide, GC represents glycosylceramide, PE represents phosphatidylethanolamine, and PS represents phosphatidylserine.
WR19L/Fas-SM(-)細胞では、WR19L/Fas-SM(+)細胞において検出される[14C]セリンでラベルしたSMが検出されず、[14C]セリンでラベルしたSMを合成していないことが分かる。
(2) 上記各細胞の50μgのlysateを50μgのC6-NBD-セラミド及び500μgのフォスファチジルコリンの存在下で、20mM Tris/Hcl(Ph.7.5)反応液中で最終液量100μlとして、37℃にて30分間インキュベートし、上記と同様にしてTLCを行った。
In WR19L / Fas-SM (-) cells, [ 14C ] serine-labeled SM detected in WR19L / Fas-SM (+) cells was not detected, and [ 14C ] serine-labeled SM was not synthesized. I understand that.
(2) 50 μg lysate of each of the above cells in a 20 mM Tris / Hcl (Ph.7.5) reaction solution in the presence of 50 μg C6-NBD-ceramide and 500 μg phosphatidylcholine to give a final volume of 100 μl, 37 Incubation was performed at 0 ° C. for 30 minutes, and TLC was performed as described above.
蛍光脂質はFluorImager SI システム(Molecular Dynamics, Sunnyvale,U.S.A.)により励起波長475nm、発光波長525nmで可視化した。 Fluorescent lipids were visualized with a FluorImager SI system (Molecular Dynamics, Sunnyvale, U.S.A.) at an excitation wavelength of 475 nm and an emission wavelength of 525 nm.
図1Bに示すように、WR19L/Fas-SM(-)細胞では、WR19L/Fas-SM(+)細胞において検出されるC6-NBDを基質として蛍光ラベルしたC6-NBD-SMが検出されず、SMを合成せず、SM合成酵素活性のないことが分かる。 As shown in FIG.1B, in WR19L / Fas-SM (-) cells, C6-NBD-SM fluorescently labeled with C6-NBD detected in WR19L / Fas-SM (+) cells as a substrate was not detected, It can be seen that SM is not synthesized and there is no SM synthase activity.
FACS分析による形質膜の細胞表面側におけるSMの存在の有無の確認
(1) lyseninは、ミミズから単離されたSM特異的な細胞溶解性抗体であり、SMに結合することにより、形質膜に孔を空けて、細胞を死滅させることが知られている(J.Biol.Chem.273,33787-33794(1998))。
Confirmation of the presence of SM on the cell surface side of plasma membrane by FACS analysis (1) Lylyin is an SM-specific cytolytic antibody isolated from earthworms. It is known to make pores and kill cells (J. Biol. Chem. 273, 33787-33794 (1998)).
また、形質膜の外側にSMを発現しているCHO細胞は、lysenin誘導性細胞死に感受性であること、及び、細胞表面のSM量が低減しているCHO細胞変異体LY-A及びLY-Bは、lyseninに耐性であることが報告されている(J.Biol.Chem.273,33787-33794(1998))。 In addition, CHO cells expressing SM outside the plasma membrane are sensitive to lysenin-induced cell death, and CHO cell mutants LY-A and LY-B with reduced cell surface SM content. Has been reported to be resistant to lysenin (J. Biol. Chem. 273, 33787-33794 (1998)).
本実施例(1)では、細胞死を誘導することなくSMに特異的に結合する変異体(非毒性)lysenin(J.Biol.Chem 278,22762-22770(2003))を用いて、以下のようにして形質膜の細胞表面側の単分子層に局在するSMの存在を確認した。 In this Example (1), a mutant (non-toxic) lysenin (J. Biol. Chem 278, 22762-22770 (2003)) that specifically binds to SM without inducing cell death was used. Thus, the presence of SM localized in the monolayer on the cell surface side of the plasma membrane was confirmed.
両細胞を、100ng/mlのマルトース結合タンパク質に融合した非毒性lysenin(MBP-lysenin;RIKENの小林氏から供与)とともに氷上で30分間インキュベートした。 Both cells were incubated for 30 minutes on ice with non-toxic lysenin (MBP-lysenin; provided by Mr. Kobayashi of RIKEN) fused to 100 ng / ml maltose binding protein.
次いで、細胞を、1%FCS及び0.1%NaN3を添加した氷冷phosphate buffer saline(PBS)で洗浄し、ウサギ抗MBP抗血清(New England BioLabs,Berly,U.K.)とともに氷上で30分間インキュベートした。 The cells were then washed with ice-cold phosphate buffer saline (PBS) supplemented with 1% FCS and 0.1% NaN 3 and incubated with rabbit anti-MBP antiserum (New England BioLabs, Berly, UK) on ice for 30 minutes.
細胞を再度洗浄した後、細胞をphycoerythrin(PE)-複合抗ウサギIgG(Sigma-Aldrich)とともに30分間インキュベートし、fluorescence-activating cell-sorter(FACS)calibur(BD Bioscience,San Jose,U.S.A.)を用いたFACS分析に供した。データ分析は、Cell Quest software(Becton Dickinson)により行った。 After washing the cells again, the cells were incubated with phycoerythrin (PE) -conjugated anti-rabbit IgG (Sigma-Aldrich) for 30 minutes and using a fluorescence-activating cell-sorter (FACS) calibur (BD Bioscience, San Jose, USA) Were subjected to FACS analysis. Data analysis was performed with Cell Quest software (Becton Dickinson).
結果を図1Cに示す。WR19L/Fas-SM(-)細胞では、lysenin処理しない場合とlysenin処理した場合とで蛍光強度に差は認められなかった。一方、WR19L/Fas-SM(+)細胞では、lysenin処理することにより、蛍光強度が強くなった。このことから、WR19L/Fas-SM(-)細胞では、形質膜の細胞表面側のSM量が著しく低減していることが分かる。
(2) 細胞を、20μg/ml propidium iodide(PI; Molecular Probes,Eugene,U.S.A.)の存在下で、500ng/mlのlyseninとともに室温で15分間インキュベートし、FACScalibur(BD Bioscience,San Jose,U.S.A.)を用いたFACS分析に供した。
The results are shown in FIG. 1C. In WR19L / Fas-SM (−) cells, there was no difference in fluorescence intensity between the case where lysenin treatment was not performed and the case where lysenin treatment was not performed. On the other hand, in WR19L / Fas-SM (+) cells, the fluorescence intensity was increased by lysenin treatment. This shows that the amount of SM on the cell surface side of the plasma membrane is remarkably reduced in WR19L / Fas-SM (−) cells.
(2) Cells are incubated with 500 ng / ml lysenin for 15 minutes at room temperature in the presence of 20 μg / ml propidium iodide (PI; Molecular Probes, Eugene, USA) and FACScalibur (BD Bioscience, San Jose, USA) It was used for the FACS analysis used.
なお、propidium iodideは、形質膜に孔が空いた死細胞に取り込まれることにより、これを染色する試薬である。 In addition, propidium iodide is a reagent for staining by being taken up by dead cells having pores in the plasma membrane.
結果を図1Dに示す。WR19L/Fas-SM(+)細胞では、lysenin処理することにより、controlに較べてPIの取り込み量が増大した。一方、WR19L/Fas-SM(-)細胞では、lysenin処理しても、PIの取り込み量はcontrolと同程度であった。このように、R19L/Fas-SM(-)細胞は、lyseninに耐性であることから、形質膜の細胞表面側のSM量が著しく低減していることが分かる。 The results are shown in FIG. 1D. In WR19L / Fas-SM (+) cells, PI uptake increased by lysenin treatment compared to control. On the other hand, in the WR19L / Fas-SM (−) cells, the PI uptake amount was almost the same as that of the control even after lysenin treatment. Thus, since R19L / Fas-SM (−) cells are resistant to lysenin, it can be seen that the amount of SM on the cell surface side of the plasma membrane is significantly reduced.
共焦点顕微鏡観察による形質膜の細胞表面側におけるSMの存在の有無の確認
形質膜の細胞表面側の単分子層に局在したSMを可視化するため、両細胞をpoly-L-lysineをコートしたスライドグラスの上に載せ、4%フォルムアミドで固定し、lysenine-MBPで4℃で45分間、次いで抗MBP抗体で処理した。さらにPE複合抗ウサギIgGモノクローナル抗体で染色した後、Zeiss LSM-5Pascalレーザースキャン共焦点顕微鏡(Carl Zeiss、ドイツ)を用いて細胞を観察した。
Confirmation of the presence of SM on the cell surface side of the plasma membrane by confocal microscope observation To visualize SM localized in the monolayer on the cell surface side of the plasma membrane, both cells were coated with poly-L-lysine It was mounted on a slide glass, fixed with 4% formamide, treated with lysenine-MBP at 4 ° C. for 45 minutes, and then treated with anti-MBP antibody. After staining with PE-conjugated anti-rabbit IgG monoclonal antibody, cells were observed using a Zeiss LSM-5 Pascal laser scan confocal microscope (Carl Zeiss, Germany).
顕微鏡写真を図1Cに示す。WR19L/Fas-SM(+)細胞では、lysenin処理することにより、蛍光が観察された。このことから、WR19L/Fas-SM(+)細胞では、形質膜の細胞表面側にSMが存在していることが分かる。これに対して、WR19L/Fas-SM(-)細胞では、lysenin処理の有無に関わらず蛍光は観察されず、細胞表面のSM量が著しく低減していることが分かる。 A photomicrograph is shown in FIG. 1C. In WR19L / Fas-SM (+) cells, fluorescence was observed by lysenin treatment. This shows that SM is present on the cell surface side of the plasma membrane in WR19L / Fas-SM (+) cells. In contrast, in WR19L / Fas-SM (−) cells, no fluorescence was observed regardless of the presence or absence of lysenin treatment, indicating that the amount of SM on the cell surface was significantly reduced.
SMS-1 cDNAの発現クローニング
(1) SMは、生体膜及びモデル膜中のコレステロールと強く相互作用すること、及び、SMは、細胞死及び細胞増殖のような細胞機能に関連した膜マイクロドメイン(lipid rafts)の形成に必要とされることが報告されている。また、SMレベルが低減したLY-A細胞はメチル−β−シクロデキストリン(MβCD)誘導性細胞死に感受性であることも報告されている(以上、J.Biol.Chem 275,34028-34034(2000)等)。
Expression cloning of SMS-1 cDNA (1) SM interacts strongly with cholesterol in biological membranes and model membranes, and SM is a membrane microdomain related to cell functions such as cell death and cell proliferation ( It has been reported that it is required for the formation of lipid rafts). It has also been reported that LY-A cells with reduced SM levels are susceptible to methyl-β-cyclodextrin (MβCD) -induced cell death (J. Biol. Chem 275,34028-34034 (2000). etc).
このように、SMは形質膜のコレステロールと強く結合しているため、MβCD誘導性細胞死に対して耐性を与えると考えられる。 Thus, since SM is strongly bound to plasma membrane cholesterol, it is considered that SM is resistant to MβCD-induced cell death.
本実施例では、以下のようにして、pantropic レトロヴィールストランスフェクションシステムを用いて、WR19L/SM(-)細胞をヒトHela細胞のcDNAライブラリーをトランスフェクトし、MβCD耐性の変異体を選択した。 In this example, using the pantropic retrovirus transfection system, WR19L / SM (-) cells were transfected with a cDNA library of human Hela cells, and MβCD resistant mutants were selected.
即ち、vesicular stomatitis virus(VSV-G)のG 糖タンパク質を含むpantropic レトロヴィールス粒子を、ヒトHela cDNAレトロヴィールス発現ライブラリーキット及びGP2-293パッケージング細胞(BDBiosciences Clontech)を用いて調製した。 Specifically, pantropic retrovirus particles containing the vesicular stomatitis virus (VSV-G) G glycoprotein were prepared using a human Hela cDNA retrovirus expression library kit and GP2-293 packaging cells (BDBiosciences Clontech).
感染24時間後、WR19L/Fas-SM(-)細胞を、2%FBSを含むRPMI-1640培地中で終夜培養した。血清フリーRPMI-1640培地を用いて細胞を洗浄した後、細胞を1.5mM MβCDを含むRPMI-1640培地中で37℃で5分間インキュベートし、FBS濃度が最終5%になるように普通培地を補充し、次いで37℃で60時間培養した。 24 hours after infection, WR19L / Fas-SM (−) cells were cultured overnight in RPMI-1640 medium containing 2% FBS. After washing the cells with serum-free RPMI-1640 medium, the cells are incubated in RPMI-1640 medium containing 1.5 mM MβCD for 5 minutes at 37 ° C. and supplemented with normal medium so that the final FBS concentration is 5%. And then cultured at 37 ° C. for 60 hours.
細胞を2%FBSを含むRPMI-1640培地に再播種して終夜培養し、適当濃度のMβCDで再び処理した。1.5mMのMβCD処理を2回、3mMのMβCD処理を2回、5mMのMβCD処理を2回行うことにより、WR19L/SM(-)細胞のMβCD耐性変異体を限界希釈により単離した。 Cells were replated in RPMI-1640 medium containing 2% FBS, cultured overnight, and treated again with an appropriate concentration of MβCD. By performing 1.5 mM MβCD treatment twice, 3 mM MβCD treatment twice, and 5 mM MβCD treatment twice, WR19L / SM (−) cell MβCD resistant mutants were isolated by limiting dilution.
pLIB発現ベクター特異的なプライマー(5'及び3'pLIBプライマー、BD Biosciences Clontech)を用いたPCRにより、MβCD耐性細胞のゲノム中に挿入された2.0kbのcDNAを増幅し、pGEM-T easy vector(Promega,Madison,WI,U.S.A.)にクローニングした。 PCR using pLIB expression vector specific primers (5 'and 3' pLIB primers, BD Biosciences Clontech) was used to amplify a 2.0 kb cDNA inserted into the genome of MβCD resistant cells and pGEM-T easy vector ( Promega, Madison, WI, USA).
MβCD耐性細胞(WR19L/Fas-SMS-1細胞)の上記2.0kbのcDNA中のSM合成酵素をコードしていると考えられる領域の塩基配列をDNAシークエンサーを用いて決定し、それがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を推定した。 Using a DNA sequencer, determine the base sequence of the region considered to encode SM synthase in the above 2.0 kb cDNA of MβCD resistant cells (WR19L / Fas-SMS-1 cells) The amino acid sequence of the peptide was deduced.
塩基配列及びアミノ酸配列を図2Aに示す。MβCD耐性細胞は、413アミノ酸をコードする1967bpのヒトcDNAをゲノム中に取り込んでいた。また、図2A中に示したstrile alpha モチーフ(SAM)領域配列及び膜貫通(TM)領域配列は、それぞれBLASTアルゴリズム及びSOSUIプログラムを用いて予測したものである。 The base sequence and amino acid sequence are shown in FIG. 2A. MβCD resistant cells incorporated a 1967 bp human cDNA encoding 413 amino acids into the genome. The strile alpha motif (SAM) region sequence and the transmembrane (TM) region sequence shown in FIG. 2A are predicted using the BLAST algorithm and the SOSUI program, respectively.
また、Kyte&Doolittleの方法(J.Mol.Biol.157,105-132(1982))により解析されたSMS-1のアミノ酸配列のHydropathyプロットを図2Bに示す。SMS-1ペプチドは、推定48.6kDaの分子量を有している。また、BLASTアルゴリズム及びSOSUIプログラムから、SMS-1はN末端領域に1個のstrile alpha モチーフ(SAM)領域配列を有しており、4個の膜貫通(TM)領域配列を有することが分かる。
(2) WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SMS-1細胞から、それぞれ常法に従いDNAを抽出し、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲル写真を図2Cに示す。WR19L/Fas-SM(-)細胞では、WR19L/Fas-SMS-1細胞に見られない2kbのバンドが検出されており、SMS-1 cDNAがWR19L/Fas-SM(-)細胞に導入されたことが確認された。
Further, FIG. 2B shows a Hydropathy plot of the amino acid sequence of SMS-1 analyzed by the method of Kyte & Doolittle (J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)). The SMS-1 peptide has an estimated molecular weight of 48.6 kDa. From the BLAST algorithm and the SOSUI program, it can be seen that SMS-1 has one strile alpha motif (SAM) region sequence in the N-terminal region and four transmembrane (TM) region sequences.
(2) DNA was extracted from WR19L / Fas-SM (-) cells and WR19L / Fas-SMS-1 cells according to conventional methods, and subjected to agarose gel electrophoresis. A gel photograph is shown in FIG. 2C. In WR19L / Fas-SM (-) cells, a 2 kb band not detected in WR19L / Fas-SMS-1 cells was detected, and SMS-1 cDNA was introduced into WR19L / Fas-SM (-) cells. It was confirmed.
MβCDに暴露された細胞の生存能力の測定
配列決定及びコンピューター分析の後、cDNAをpLIB発現ベクターにサブクローニングし、VSV-Gレトロヴィールス粒子を用いてWR19L/Fas-SA(-)細胞にトランスフェクトした。得られた細胞は、MβCD耐性細胞(WR19L/Fas-SMS-1細胞)を富化するために以下のようにして5mM MβCDで処理した。
Measurement of viability of cells exposed to MβCD After sequencing and computer analysis, the cDNA was subcloned into a pLIB expression vector and transfected into WR19L / Fas-SA (-) cells using VSV-G retrovirus particles . The resulting cells were treated with 5 mM MβCD as follows to enrich for MβCD resistant cells (WR19L / Fas-SMS-1 cells).
即ち、1×106個のWR19L/Fas-SM(+)細胞、WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SMS-1細胞をそれぞれ洗浄し、血清フリーのRPMI-1640培地の1mlに懸濁し、適当濃度のMβCDで処理して、5%CO2中で37℃にて5分間インキュベートした。普通培養液を1ml添加した後、さらに細胞を12時間インキュベートした。細胞の生存数をWST-8を用いた細胞生存数キット(ナカライテスク)を用いて測定した。 That is, 1 × 10 6 WR19L / Fas-SM (+) cells, WR19L / Fas-SM (−) cells and WR19L / Fas-SMS-1 cells were washed, and 1 ml of serum-free RPMI-1640 medium was used. The suspension was treated with MβCD at an appropriate concentration and incubated at 37 ° C. for 5 minutes in 5% CO 2 . After adding 1 ml of normal culture solution, the cells were further incubated for 12 hours. The cell viability was measured using a cell viability kit (Nacalai Tesque) using WST-8.
結果を図2Dに示す。WR19L/Fas-SM(-)細胞にSMS-1 cDNAを導入したWR19L/Fas-SMS-1細胞では、MβCD誘導性細胞死に対する耐性を回復している。このことから、上記cDNAの導入によりSMが存在するようになったことが分かる。 The results are shown in FIG. 2D. In WR19L / Fas-SMS-1 cells in which SMS-1 cDNA is introduced into WR19L / Fas-SM (−) cells, the resistance to MβCD-induced cell death is restored. From this, it can be seen that SM was introduced by the introduction of the cDNA.
WR19L/Fas-SMS-1細胞のSM合成酵素活性測定
(1) 実施例1の(1)と同様にして、WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SMS-1細胞を、L-[14C]セリンとともにインキュベートした後、脂質を抽出してTLCに供した。結果を図3Aに示す。WR19L/Fas-SMS-1細胞では [14 C]セリンでラベルしたSMが検出されており、SM合成が回復していることが分かる。
(2) 実施例1の(2)と同様にして、WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SMS-1細胞のlysateをC6-NBD-セラミド及びフォスファチジルコリンの存在下でインキュベートした後、TLCを行った。結果を図3Bに示す。WR19L/Fas-SMS-1細胞では C6-NBD-SMが検出されており、SM合成が回復していることが分かる。
Measurement of SM synthase activity in WR19L / Fas-SMS-1 cells (1) In the same manner as in (1) of Example 1, WR19L / Fas-SM (-) cells and WR19L / Fas-SMS-1 cells were -After incubation with [ 14 C] serine, lipids were extracted and subjected to TLC. The results are shown in FIG. 3A. In WR19L / Fas-SMS-1 cells, SM labeled with [ 14 C] serine was detected, indicating that SM synthesis was restored.
(2) lysate of WR19L / Fas-SM (-) cells and WR19L / Fas-SMS-1 cells in the presence of C6-NBD-ceramide and phosphatidylcholine in the same manner as (2) of Example 1 After incubation, TLC was performed. The results are shown in FIG. 3B. C6-NBD-SM is detected in WR19L / Fas-SMS-1 cells, indicating that SM synthesis is restored.
以上の結果、SMS-1 cDNAは、哺乳動物細胞におけるSM合成に必須であることが分かる。
(3) WR19L/Fas-SMS-1細胞を、20mM Tris HCl(pH7.4),2mM EDTA,10mM EGTA,1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)及び2.5μg/ml leupeputinを含む氷冷バッファー中でホモジナイズした。細胞タンパク質の500μgを含むlysateを、10mM Tris HCl(pH7.5),1mM EDTA,20μM C6-NBD-セラミド、120μM の[N-メチル-14C]PC(比活性;57μCi/mmol)又は[メチル-14C]CDP-コリン(比活性;54μCi/mmol)を含む反応溶液に添加し、37℃で30分間インキュベートした。
From the above results, it can be seen that SMS-1 cDNA is essential for SM synthesis in mammalian cells.
(3) WR19L / Fas-SMS-1 cells were homogenized in an ice-cold buffer containing 20 mM Tris HCl (pH 7.4), 2 mM EDTA, 10 mM EGTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and 2.5 μg / ml leupeputin. Lysate containing 500 μg of cellular protein was added to 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 20 μM C6-NBD-ceramide, 120 μM [N-methyl- 14 C] PC (specific activity; 57 μCi / mmol) or [methyl − 14 C] CDP-choline (specific activity; 54 μCi / mmol) was added to the reaction solution and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
Bligh&Dyerの方法(J.Biol.Chem 264,19076-19080(1989))で脂質を抽出し、TLCプレートにアプライし、クロロフォルム/メタノール/12mM MgCl2水溶液(65:25:4)を含む溶液で展開した。放射活性をBAS2000システムを用いて可視化した。 Extract lipids by Bligh &Dyer's method (J.Biol.Chem 264,19076-19080 (1989)), apply to TLC plate, and develop with solution containing chloroform / methanol / 12mM MgCl 2 aqueous solution (65: 25: 4) did. Radioactivity was visualized using the BAS2000 system.
結果を図3Cに示す。WR19L/Fas-SMS-1細胞では、セラミド及びPCの存在下でインキュベートした場合にSMが合成されており、フォスファチジルコリンのドナーとしてPCを用いることが分かる。 The results are shown in FIG. 3C. In WR19L / Fas-SMS-1 cells, SM is synthesized when incubated in the presence of ceramide and PC, indicating that PC is used as a donor for phosphatidylcholine.
Biochemistry 21,2753-2759(1982)によれば、SM合成酵素はフォスフォコリンのドナーとしてフォスファチジルコリンを用いることが記載されており、上記結果は、SMS-1 cDNAがSM合成酵素をコードするものであることを裏付けている。 Biochemistry 21,2753-2759 (1982) describes that SM synthase uses phosphatidylcholine as a phosphocholine donor, and the above results indicate that SMS-1 cDNA encodes SM synthase. It confirms that it is something to do.
WR19L/Fas-SMS-1細胞の生存に対するlyseninの影響
7×105個のWR19L/Fas-SMS-1細胞を洗浄し、プレウオームしたPBS中に再懸濁し、0,100,500及び1000ng/mlのlyseninで処理し、5%CO2の中で37℃で1時間インキュベートした。FBSの添加後、生細胞数を0.25%トリパンブルーを用いてdye exclusion法でカウントした。
Effect of lysenin on survival of WR19L / Fas-SMS-1 cells 7 × 10 5 WR19L / Fas-SMS-1 cells were washed, resuspended in prewarmed PBS and treated with 0,100,500 and 1000 ng / ml lysenin And incubated for 1 hour at 37 ° C. in 5% CO 2 . After addition of FBS, the number of viable cells was counted by dye exclusion method using 0.25% trypan blue.
結果を図4Aに示す。WR19L/Fas-SMS-1細胞の生存数は、lysenin濃度依存的に減少している。このことから、SMS-1 cDNAの過剰発現により形質膜中のSM量が増大することが分かる。 The results are shown in FIG. 4A. The number of surviving WR19L / Fas-SMS-1 cells decreases in a lysenin concentration-dependent manner. This indicates that the amount of SM in the plasma membrane increases due to overexpression of SMS-1 cDNA.
SMS-1 cDNAの細胞生存に与える影響
WR19L/Fas-SM(+)細胞、WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SMS-1細胞をそれぞれ、血清フリーの培養液中で48時間培養した後、生細胞数を0.25%トリパンブルーを用いてdye exclusion法でカウントした。
Effect of SMS-1 cDNA on cell survival
After culturing WR19L / Fas-SM (+) cells, WR19L / Fas-SM (-) cells and WR19L / Fas-SMS-1 cells in serum-free medium for 48 hours, the number of viable cells is 0.25%. Counted by try exclusion method using trypan blue.
結果を図4Bに示す。WR19L/Fas-SM(-)細胞は増殖が抑制されているが、WR19L/Fas-SMS-1細胞はWR19L/Fas-SM(+)細胞と同程度に増殖している。このことから、SM合成酵素は細胞増殖に必須であることが分かる。 The results are shown in FIG. 4B. The growth of WR19L / Fas-SM (-) cells is suppressed, but WR19L / Fas-SMS-1 cells are proliferating to the same extent as WR19L / Fas-SM (+) cells. This shows that SM synthase is essential for cell growth.
Claims (25)
(1) 配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(2) 配列番号1において1又は2以上のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチド。 The following polypeptide (1) or (2).
(1) A polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(2) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 1 and having sphingomyelin synthase activity.
(3) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(4) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 The following polynucleotide (3) or (4):
(3) A polynucleotide comprising the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
(4) A polypeptide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having the nucleotide sequence of nucleotide numbers 338 to 1576 or a nucleotide sequence complementary thereto in SEQ ID NO: 2 and has sphingomyelin synthase activity. Encoding polynucleotide.
(5) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも18塩基に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(6) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも18塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 The following (5) or (6) antisense polynucleotide.
(5) A polynucleotide comprising a base sequence complementary to at least 18 consecutive bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
(6) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with at least 18 consecutive bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
(7) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列の連続する少なくとも21塩基に相補的なRNA鎖とこれに相補的なRNA鎖との対を含むsiRNA。
(8) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも21塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする2本鎖RNAからなるsiRNA。 The following (7) or (8) siRNA.
(7) An siRNA comprising a pair of an RNA strand complementary to at least 21 consecutive bases of the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 and an RNA strand complementary thereto.
(8) An siRNA comprising a double-stranded RNA that hybridizes under stringent conditions with at least 21 consecutive base sequences of base numbers 338 to 1576 of SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto.
(9) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の中の連続する少なくとも20塩基からなる二つの領域にそれぞれ相補的な二つの塩基配列部分を有し、かつ、請求項4のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム。
(10) 配列番号2に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の中の連続する少なくとも20塩基からなる二つの領域にそれぞれストリンジェントな条件下でハイブリダイズする二つの塩基配列を有し、かつ、請求項4のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム。 The following (9) or (10) ribozyme.
(9) having two base sequence portions complementary to each of two regions consisting of at least 20 consecutive bases in the base sequence of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto And the ribozyme which has the activity which decomposes | disassembles the polynucleotide of Claim 4.
(10) Two of the base sequences of base numbers 338 to 1576 described in SEQ ID NO: 2 or two regions that hybridize under stringent conditions to two regions consisting of at least 20 consecutive bases in the base sequence complementary thereto A ribozyme having a base sequence and having an activity of degrading the polynucleotide of claim 4.
(b) 試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c) スフィンゴミエリン合成酵素活性を低減させる被験物質を選択する工程と
を含む細胞増殖阻害剤のスクリーニング方法。 (a) contacting the test substance with a test cell carrying the recombinant vector according to claim 7;
(b) comparing the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell with the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell not contacted with the test substance;
(c) a method for screening a cell growth inhibitor, comprising a step of selecting a test substance that reduces sphingomyelin synthase activity.
(b) 試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c) スフィンゴミエリン合成酵素活性を低減させる被験物質を選択する工程と
を含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤のスクリーニング方法。 (a) contacting the test substance with a test cell carrying the recombinant vector according to claim 7;
(b) comparing the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell with the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell not contacted with the test substance;
(c) a method for screening a therapeutic or ameliorating agent for a disease selected from the group consisting of leukemia, cancer, and autoimmune disease, comprising a step of selecting a test substance that reduces sphingomyelin synthase activity.
(b) 試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c) スフィンゴミエリン合成酵素活性を増大させる被験物質を選択する工程と
を含む細胞増殖促進剤のスクリーニング方法。 (a) contacting the test substance with a test cell carrying the recombinant vector according to claim 7;
(b) comparing the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell with the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell not contacted with the test substance;
(c) selecting a test substance that increases sphingomyelin synthase activity, and a method for screening a cell growth promoter.
(b) 試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c) スフィンゴミエリン合成酵素活性を増大させる被験物質を選択する工程と
を含む、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤のスクリーニング方法。 (a) contacting the test substance with a test cell carrying the recombinant vector according to claim 7;
(b) comparing the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell with the sphingomyelin synthase activity or its index value in the test cell not contacted with the test substance;
(c) a group consisting of aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, suppression of hematopoiesis after bone marrow transplantation, cirrhosis, myocardial infarction, cerebral infarction, and wound, including a step of selecting a test substance that increases sphingomyelin synthase activity A method for screening for a therapeutic or ameliorating agent for a more selected disease.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004004849A JP2005192537A (en) | 2004-01-09 | 2004-01-09 | Sphingomyelin (sm) synthase gene and utilization of the same |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004004849A JP2005192537A (en) | 2004-01-09 | 2004-01-09 | Sphingomyelin (sm) synthase gene and utilization of the same |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005192537A true JP2005192537A (en) | 2005-07-21 |
Family
ID=34819341
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004004849A Pending JP2005192537A (en) | 2004-01-09 | 2004-01-09 | Sphingomyelin (sm) synthase gene and utilization of the same |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2005192537A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018162974A (en) * | 2017-03-24 | 2018-10-18 | 学校法人金沢医科大学 | Hematopoietic organ tumor therapeutic agent, and screening method |
-
2004
- 2004-01-09 JP JP2004004849A patent/JP2005192537A/en active Pending
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6009055914, EMBO. J., (2004), Vol. 23, p. 33−44 * |
JPN6009055917, 創薬科学総合研究事業 創薬科学研究報告書 第I期総合報告書 平成7年、p. 20−25 * |
JPN6009055921, 膜(Membrane), (1996), Vol. 21, No. 3, p. 191−196 * |
JPN6009055925, Yakugaku Zasshi, (1994), Vol. 11, p. 863−879 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018162974A (en) * | 2017-03-24 | 2018-10-18 | 学校法人金沢医科大学 | Hematopoietic organ tumor therapeutic agent, and screening method |
JP2021165292A (en) * | 2017-03-24 | 2021-10-14 | 学校法人金沢医科大学 | Hematologic malignancy therapeutic agent, and screening method |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7141417B1 (en) | Compositions, kits, and methods relating to the human FEZ1 gene, a novel tumor suppressor gene | |
JP5295243B2 (en) | Cell-permeable p18 recombinant protein, polynucleotide encoding the same, and anticancer composition containing the same as an active ingredient | |
CA2284131A1 (en) | 70 human secreted proteins | |
KR20160067219A (en) | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor | |
JP7312948B2 (en) | ATF5 peptide variants and their uses | |
EP1029916B1 (en) | Human lysophosphatidic acid receptor and use thereof | |
KR101161923B1 (en) | Atap peptides, nucleic acids encoding the same and associated methods of use | |
TW201243330A (en) | Method for analyzing sectretome, biomarker for lung cancer metastasis, and siRNA compound for inhibiting lung cancer metastasis | |
JP2001504681A (en) | Inhibition of protein interactions | |
EP1465927B1 (en) | Bag3 antibodies to be used in research, diagnostics and therapy for cell death-involving diseases | |
US8614300B2 (en) | Nucleic acids encoding a mut-T domain-containing polypeptide | |
JP2002526099A (en) | NLK1-interacting protein | |
JP2001517943A (en) | Human pancreatitis-related protein, PAP-2 | |
EP1163252A2 (en) | Compositions, kits, and methods relating to the human fez1 gene, a novel tumor suppressor gene | |
JP2006508659A (en) | CIZ1 replication protein | |
EP3768701B1 (en) | Wnt signaling agonist molecules | |
WO1999009152A1 (en) | Human frezzled-like protein | |
JP2005192537A (en) | Sphingomyelin (sm) synthase gene and utilization of the same | |
JP3749182B2 (en) | Human cervical cancer suppressor protein, polynucleotide encoding the protein, cell transformed with the polynucleotide, and method of suppressing cancer cell growth using the expression vector | |
JP5131751B2 (en) | Methods, systems and compositions for the diagnosis of small cell lung cancer and associated screening methods | |
US20220135971A1 (en) | Core master regulators of glioblastoma stem cells | |
CA3168560A1 (en) | Improved anti-senescence compounds and uses thereof | |
EP2032601B1 (en) | Peptides regulating the surface expression of the t cell receptor | |
JP4615230B2 (en) | Cancer cell metastasis inhibitor by C region of galactosylceramide expression factor-1 | |
EP1503780B1 (en) | Androgen-regulated pmepa1 gene and methods of using the same to inhibit cancer cell growth |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070109 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20070109 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070109 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20070501 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070501 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091028 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091222 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091228 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100127 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100414 |