JP2021147446A - Method for preparing hyaluronic acid and method for detecting hyaluronic acid, and kit therefor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒアルロン酸の調製方法及びキットに関する。また、ヒアルロン酸の検出方法及びキットに関する。より詳しくは、皮膚細胞に由来するヒアルロン酸の調製方法及びヒアルロン酸の検出方法、並びにこれらのキットに関する。 The present invention relates to a method and a kit for preparing hyaluronic acid. The present invention also relates to a method and a kit for detecting hyaluronic acid. More specifically, the present invention relates to a method for preparing hyaluronic acid derived from skin cells, a method for detecting hyaluronic acid, and a kit thereof.
ヒアルロン酸は、眼の硝子体、鶏のトサカ、ヘソの緒、皮膚、関節液等、動物の結合組織に広く存在している。体内で最も多くヒアルロン酸が含まれているのは皮膚であり、細胞外マトリックスとして重要な役割を果たしている。皮膚のヒアルロン酸は、加齢とともに減少することも知られており、肌荒れ、皮膚の弾力・ハリの低下、シワ、タルミなどの皮膚老化現象の一因になっていると考えられている。 Hyaluronic acid is widely present in animal connective tissues such as the vitreous of the eye, chicken tosaka, hemlock, skin, and synovial fluid. The skin contains the largest amount of hyaluronic acid in the body, and plays an important role as an extracellular matrix. Hyaluronic acid in the skin is also known to decrease with age, and is thought to contribute to skin aging phenomena such as rough skin, decreased elasticity and firmness of the skin, wrinkles, and tarmi.
そこで、減少したヒアルロン酸を補充するために、様々な方法が提案されている。例えば、ヒアルロン酸を直接摂取する方法や、ヒアルロン酸の産生を促す飲食物を摂取する方法などが挙げられる。これらの方法は、いずれも培養細胞を対象とした実験では効果が確認されているものの、人体に対しては効果が直接的に示されたわけではない。その理由として、皮膚からヒアルロン酸を検出しようとした場合、非侵襲的、かつ、直接的にヒアルロン酸を検出する方法が確立されていないためである。そのため、人体における効果の確認方法としては、インピーダンスなどを用いて皮膚水分量を測定し、間接的にヒアルロン酸の増減を推定する方法が一般的である(特許文献1参照)。 Therefore, various methods have been proposed to replace the decreased hyaluronic acid. For example, a method of directly ingesting hyaluronic acid and a method of ingesting foods and drinks that promote the production of hyaluronic acid can be mentioned. Although all of these methods have been confirmed to be effective in experiments on cultured cells, they have not been directly shown to be effective on the human body. The reason is that when an attempt is made to detect hyaluronic acid from the skin, a non-invasive and direct method for detecting hyaluronic acid has not been established. Therefore, as a method for confirming the effect on the human body, a method of measuring the amount of water in the skin using impedance or the like and indirectly estimating the increase or decrease of hyaluronic acid is common (see Patent Document 1).
しかしながら、皮膚の水分量は必ずしもヒアルロン酸量の増減によって決まるものではなく、様々な因子との相互関係によって決まるものである。そのため、インピーダンスなどでは本当にヒアルロン酸量が変化しているのか不明であり、正確なデータを求める場合には侵襲的な方法に頼らざるを得ないという問題がいまだ残っている。 However, the amount of water in the skin is not necessarily determined by the increase or decrease in the amount of hyaluronic acid, but is determined by the interrelationship with various factors. Therefore, it is unclear whether the amount of hyaluronic acid really changes in terms of impedance, etc., and there still remains the problem of having to rely on invasive methods when obtaining accurate data.
本発明は上記問題点を鑑みてなされたものである。すなわち、本発明の課題は、非侵襲的かつ直接的にヒアルロン酸を検出・測定できる方法及びキットを提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above problems. That is, an object of the present invention is to provide a method and a kit capable of detecting and measuring hyaluronic acid non-invasively and directly.
今回、出願人らは、非侵襲的かつ直接的にヒアルロン酸を検出できる方法がないか鋭意研究をおこなった。そして、従来ヒアルロン酸が含まれていないと考えられていた皮脂からヒアルロン酸が検出できることを新たに見出し、本発明を完成するに至った。 Now, the applicants have been diligently researching whether there is a non-invasive and direct method for detecting hyaluronic acid. Then, they have newly found that hyaluronic acid can be detected in sebum, which was conventionally considered to be free of hyaluronic acid, and have completed the present invention.
上記課題解決のため、本発明は、被験体から採取された皮膚表上脂質からヒアルロン酸を分離することを含む、被験体の皮膚細胞に由来するヒアルロン酸の調製方法を提供する。また、本発明は、被験体の皮膚細胞に由来するヒアルロン酸の検出方法であって、前記被験体の皮膚表上脂質を採取する採取工程と、採取した皮膚表上脂質を界面活性剤で処理する処理工程と、界面活性剤で処理したヒアルロン酸を検出する検出工程と、からなる、被験体の皮膚細胞に由来するヒアルロン酸の検出方法を提供する。さらに、被験体の皮膚表上脂質の採取用具を含む、被験体の皮膚細胞に由来するヒアルロン酸の調製用キット及び検出キットを提供する。 In order to solve the above problems, the present invention provides a method for preparing hyaluronic acid derived from the skin cells of a subject, which comprises separating hyaluronic acid from the superficial lipid on the skin collected from the subject. Further, the present invention is a method for detecting hyaluronic acid derived from the skin cells of a subject, in which a collection step of collecting the skin surface lipid of the subject and a treatment of the collected skin surface lipid with a surfactant. Provided is a method for detecting hyaluronic acid derived from the skin cells of a subject, which comprises a treatment step for detecting hyaluronic acid treated with a surfactant and a detection step for detecting hyaluronic acid treated with a surfactant. In addition, a kit for preparing and detecting hyaluronic acid derived from the skin cells of the subject, including a tool for collecting lipids on the skin surface of the subject, is provided.
本発明によれば、非侵襲的かつ直接的にヒアルロン酸を検出することができる。 According to the present invention, hyaluronic acid can be detected non-invasively and directly.
(ヒアルロン酸の調製方法)
一態様において、本発明は、被験体の皮膚細胞に由来するヒアルロン酸の調製方法を提供する。本発明による被験体の皮膚細胞に由来するヒアルロン酸の調製方法は、被験体から採取された皮膚表上脂質からヒアルロン酸を分離することを含む。
(Method of preparing hyaluronic acid)
In one aspect, the invention provides a method of preparing hyaluronic acid derived from a subject's skin cells. The method for preparing hyaluronic acid derived from the skin cells of a subject according to the present invention includes separating hyaluronic acid from the superficial lipids on the skin collected from the subject.
本発明の方法における被験体は、皮膚上に皮脂を有する生物であればよい。被験体の例としては、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物が挙げられる。 The subject in the method of the present invention may be an organism having sebum on the skin. Examples of subjects include humans and non-human mammals.
本発明でいう『非侵襲』とは、生体を傷つけたり痛みを与えたりしない、すなわち、身体に負担を与えないという意味である。 The term "non-invasive" as used in the present invention means that it does not hurt or cause pain to the living body, that is, it does not burden the body.
本発明でいう『皮膚表上脂質』とは、皮膚上の表上に存在する脂溶性画分のことであり、本明細書中では主に皮脂を指す。皮脂は皮脂腺の皮膚細胞から分泌されるエマルション様の液体であり、皮膚表面に薄い膜状に広がっている。皮脂の成分の多くはトリグリセリド、ワックスエステル、スクアレン、コレステロールなどから構成されることが知られている。 The "lipid on the surface of the skin" as used in the present invention is a fat-soluble fraction existing on the surface of the skin, and mainly refers to sebum in the present specification. Sebum is an emulsion-like liquid secreted by the skin cells of the sebaceous glands and spreads on the surface of the skin in the form of a thin film. It is known that most of the components of sebum are composed of triglycerides, wax esters, squalene, cholesterol and the like.
本発明でいう『皮膚』とは、表皮、真皮、毛包、汗腺、皮脂腺およびその他の腺などの組織を含む領域を意味する。 The term "skin" as used in the present invention means a region including tissues such as epidermis, dermis, hair follicles, sweat glands, sebaceous glands and other glands.
被験体から採取された皮脂は、該被験体の皮膚細胞で産生されたヒアルロン酸を含み、好ましくは該被験体の表皮、皮脂腺、毛包および汗腺のいずれかで産生されたヒアルロン酸を含む。 Sebum collected from a subject contains hyaluronic acid produced in the subject's skin cells, preferably hyaluronic acid produced in any of the subject's epidermis, sebaceous glands, hair follicles and sweat glands.
本発明の方法は、被験体の皮脂を採取することをさらに含んでいてもよい。皮脂が採取される皮膚の部位としては、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚などが挙げられる。また、アトピー、ニキビ、炎症、腫瘍等の疾患を有する皮膚、創傷を有する皮膚であってもよい。 The method of the present invention may further include collecting sebum from the subject. Examples of the skin part from which sebum is collected include the skin of any part of the body such as the head, face, neck, trunk, and limbs. Further, it may be skin having a disease such as atopy, acne, inflammation, or tumor, or skin having a wound.
被験体の皮膚からの皮脂の採取には、皮膚からの皮脂の回収または除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述する皮脂吸収性素材、皮脂接着性素材、または皮膚から皮脂をこすり落とす器具を使用することができる。皮脂吸収性素材又は皮脂接着性素材としては、皮脂に親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えば、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へ皮脂を吸収させる方法、ガラス板、テープ等へ皮脂を接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等により皮脂をこすり落として回収する方法、などが挙げられる。皮脂の吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませた皮脂吸収性素材を用いてもよい。 For the collection of sebum from the subject's skin, any means used to recover or remove sebum from the skin can be employed. Preferably, a sebum-absorbing material, a sebum-adhesive material, or a device for scraping sebum from the skin, which will be described later, can be used. The sebum-absorbing material or the sebum-adhesive material is not particularly limited as long as it is a material having an affinity for sebum. , A method of adhering sebum to a tape or the like, a method of scraping off sebum with a spartel, a scraper or the like, and collecting the sebum. In order to improve the adsorptivity of sebum, a sebum-absorbing material pre-impregnated with a highly fat-soluble solvent may be used.
(界面活性剤)
採取した皮脂からのヒアルロン酸を分離するためには、界面活性剤で処理することが必須となる。ヒアルロン酸の抽出に用いることができる界面活性としては、アニオン性、両性イオン性および非イオン性界面活性剤からなる群より選択することができる。
(Surfactant)
In order to separate hyaluronic acid from the collected sebum, it is essential to treat it with a surfactant. The surfactant that can be used for the extraction of hyaluronic acid can be selected from the group consisting of anionic, zwitterionic and nonionic surfactants.
アニオン界面活性剤としては特に限定はなく、例えば、炭素数10〜22の石鹸、炭素数14〜24のアルキルベンゼンスルホン酸塩、炭素数10〜22の高級アルコール硫酸エステル塩、アルキル基の炭素数10〜22でありポリオキシエチレン基のオキシエチレン単位の繰り返し数が1〜10のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、炭素数10〜22のα−スルホ脂肪酸エステル、炭素数8〜18のα−オレフィンスルホン酸塩、炭素数10〜22のアルカンスルホン酸塩、炭素数10〜22のモノアルキルリン酸エステル塩、デオキシコール酸ナトリウム等のコール酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)等が挙げられる。 The anionic surfactant is not particularly limited, and is, for example, a soap having 10 to 22 carbon atoms, an alkylbenzene sulfonate having 14 to 24 carbon atoms, a higher alcohol sulfate ester salt having 10 to 22 carbon atoms, and an alkyl group having 10 carbon atoms. A polyoxyethylene alkyl ether sulfate having a polyoxyethylene group repeating number of 1 to 10, an α-sulfo fatty acid ester having 10 to 22 carbon atoms, and an α-olefin sulfone having 8 to 18 carbon atoms. Examples thereof include acid salts, alkane sulfonates having 10 to 22 carbon atoms, monoalkyl phosphate esters having 10 to 22 carbon atoms, sulfonic acid salts such as sodium deoxycholate, and sodium dodecyl sulfate (SDS).
両性イオン性界面活性剤としては特に限定はなく、例えば、アルキルアミノ脂肪酸塩、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシド、ミリスチルスルホベタイン等が挙げられる。 The zwitterionic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include alkylamino fatty acid salts, alkyl betaines, alkyl amine oxides, and myristyl sulfobetaines.
非イオン性界面活性剤としては特に限定はなく、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、オクチルフェノールエトキシレート(商品名:Triton X−100)等が挙げられる。 The nonionic surfactant is not particularly limited, and is polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, alkyl glucoside, polyoxyethylene fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester. , Fatty acid alkanolamide, polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer, octylphenol ethoxylate (trade name: Triton X-100) and the like.
(調整されたヒアルロン酸の用途)
本発明の方法により調製された被験体の皮膚細胞に由来するヒアルロン酸は、ヒアルロン酸を用いる各種解析または診断に使用することができる。本発明により調製された皮脂中のヒアルロン酸を用いて行うことができる解析や診断の例としては、被験体の皮膚状態の解析、例えば、皮膚の健康状態の評価もしくは将来予測、皮膚疾患の診断もしくは予後診断、皮膚外用剤の効能評価、予後診断もしくは皮膚の微細変化の評価、などが挙げられる。
(Use of adjusted hyaluronic acid)
The hyaluronic acid derived from the skin cells of the subject prepared by the method of the present invention can be used for various analyzes or diagnoses using hyaluronic acid. Examples of analysis and diagnosis that can be performed using hyaluronic acid in sebum prepared by the present invention include analysis of the skin condition of a subject, for example, evaluation or future prediction of skin health condition, diagnosis of skin disease. Alternatively, prognosis diagnosis, efficacy evaluation of external skin preparations, prognosis diagnosis or evaluation of minute changes in the skin, etc. can be mentioned.
(ヒアルロン酸の検出方法)
本発明の方法により調整された被験体の皮膚細胞に由来するヒアルロン酸の測定方法は、従来から用いられている方法であればいかなる方法でもよく、特に限定されない。一例としては、イムノクロマト法、バインディングプロテインアッセイ法が挙げられる。バインディングプロテインアッセイ法としては、固相法、競合法、凝集法または比濁法を用いることができる。
(Hyaluronic acid detection method)
The method for measuring hyaluronic acid derived from the skin cells of a subject prepared by the method of the present invention may be any method as long as it has been conventionally used, and is not particularly limited. Examples include an immunochromatography method and a binding protein assay method. As the binding protein assay method, a solid phase method, a competitive method, an agglutination method or a turbidimetry method can be used.
本発明による測定方法について、サンドイッチバインディングプロテインアッセイを例にとって以下に説明する。サンドイッチバインディングプロテインアッセイ法によれば、反応固相に界面活性剤を含む緩衝液を添加し、該固相に固着されたヒアルロン酸結合性蛋白に検体ヒアルロン酸を含む試料を添加して該固着されたヒアルロン酸結合性蛋白と該検体ヒアルロン酸を結合せしめ、さらにヒアルロン酸結合性蛋白と標識物質とをそれぞれ添加するか、あるいは予め標識物質で標識されたヒアルロン酸結合性蛋白を添加して、該固相に固着されたヒアルロン酸結合性蛋白と該検体ヒアルロン酸と該標識されたヒアルロン酸結合性蛋白とのサンドイッチ状結合体を形成させ、該サンドイッチ状結合体中の標識物質により該検体ヒアルロン酸を定量する。 The measurement method according to the present invention will be described below by taking the sandwich binding protein assay as an example. According to the sandwich binding protein assay method, a buffer solution containing a surfactant is added to the reaction solid phase, and a sample containing the sample hyaluronic acid is added to the hyaluronic acid-binding protein adhered to the solid phase to be immobilized. The hyaluronic acid-binding protein and the sample hyaluronic acid are bound to each other, and the hyaluronic acid-binding protein and the labeling substance are added, respectively, or the hyaluronic acid-binding protein previously labeled with the labeling substance is added to the hyaluronic acid-binding protein. A sandwich-like conjugate of the hyaluronic acid-binding protein fixed to the solid phase, the sample hyaluronic acid, and the labeled hyaluronic acid-binding protein is formed, and the labeled substance in the sandwich-like conjugate forms the sample hyaluronic acid. Is quantified.
具体的には、先ず、反応プレートの固相上の表面にヒアルロン酸結合性蛋白を固着する。この際、該固相上にはさらにヒアルロン酸結合性蛋白または他の分子種が固着しうる表面部分が存在し、測定すべき試料を添加の際に試料中に含まれるその他の血中成分などが固着する恐れがある。このため、試料を添加する前にブロック体を添加してヒアルロン酸結合性蛋白が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロック体としては、例えば、牛等から採取できるγ−グロブリン、血清アルブミン、血清、あるいはTween20等の界面活性剤が挙げられる。 Specifically, first, the hyaluronic acid-binding protein is fixed on the surface of the reaction plate on the solid phase. At this time, there is a surface portion on the solid phase to which the hyaluronic acid-binding protein or other molecular species can adhere, and other blood components contained in the sample when the sample to be measured is added. May stick. Therefore, it is preferable to add a block body to cover the portion to which the hyaluronic acid-binding protein is not adhered before adding the sample. Examples of such a block include γ-globulin, serum albumin, serum, and a surfactant such as Tween 20 that can be collected from cows and the like.
次いで、上記ヒアルロン酸結合性蛋白が固着した固相に、界面活性剤で抽出されたヒアルロン酸を含む試料を添加する。ヒアルロン酸測定において、サンプルに含まれるヒアルロン酸は、そのほとんどが生体中で組織中のプロテオグリカンを形成しており、血清中でタンパク質や糖質等と結合していることが知られている。そのため、バインディングプロテインアッセイを行う際には、その結合を解離しなければ正確なヒアルロン酸を測定することができない。本発明の測定法においては、界面活性剤を基剤として添加することでヒアルロン酸に結合している蛋白質、糖類等を解離することができる。このようにして、固相に固着したヒアルロン酸結合性蛋白に高分子ヒアルロン酸を結合した後、固相表面を洗浄するのが好ましい。 Next, a sample containing hyaluronic acid extracted with a surfactant is added to the solid phase to which the hyaluronic acid-binding protein is fixed. In hyaluronic acid measurement, it is known that most of the hyaluronic acid contained in the sample forms proteoglycan in tissues in the living body and is bound to proteins, sugars and the like in serum. Therefore, when performing a binding protein assay, accurate hyaluronic acid cannot be measured without dissociating the binding. In the measurement method of the present invention, proteins, saccharides and the like bound to hyaluronic acid can be dissociated by adding a surfactant as a base. In this way, it is preferable to wash the surface of the solid phase after binding the high molecular weight hyaluronic acid to the hyaluronic acid-binding protein fixed to the solid phase.
次に、該サンドイッチ状の結合体の有する標識物質を測定してヒアルロン酸を定量する。この際、固相表面上の標識物質の濃度を測定することでヒアルロン酸のみが定量できる。標識物質の濃度の測定方法としては、標識物質により異なるが、例えば、標識物質に化学発光物質を使用する場合には該物質による反応後の溶液の発光強度を測定すればよい。この場合、予め使用する標識物質およびヒアルロン酸について、既知濃度の試料を用意し、信号強度と該既知濃度の関係について検量線を作成しておくことが好ましい。 Next, the labeling substance contained in the sandwich-like conjugate is measured to quantify hyaluronic acid. At this time, only hyaluronic acid can be quantified by measuring the concentration of the labeling substance on the surface of the solid phase. The method for measuring the concentration of the labeling substance differs depending on the labeling substance, but for example, when a chemiluminescent substance is used as the labeling substance, the luminescence intensity of the solution after the reaction with the substance may be measured. In this case, it is preferable to prepare a sample having a known concentration for the labeling substance and hyaluronic acid to be used in advance, and prepare a calibration curve for the relationship between the signal intensity and the known concentration.
上述したサンドイッチバインディングプロテインアッセイ法において使用する固相としては、プレート、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、ラテックス等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではなく、ヒアルロン酸結合性蛋白が固着しうる固相ならばいずれも使用可能である。また、上記サンドイッチバインディングプロテインアッセイ法において使用するヒアルロン酸結合性蛋白とは、プロテオグリカン、リンクプロティン、ヒアルロネクチン等が挙げられる。 Examples of the solid phase used in the sandwich binding protein assay method described above include, but are not limited to, plates, tubes, beads, membranes, gels, latex, etc., and hyaluronic acid-binding proteins adhere to them. Any solid phase can be used. Examples of the hyaluronic acid-binding protein used in the sandwich binding protein assay include proteoglycan, linkprotein, hyaluronectin and the like.
(ヒアルロン酸の調製用キット)
さらなる一態様において、本発明は、被験体の皮脂の採取用具を含む、被験体の皮膚細胞に由来するヒアルロン酸の調製用キットを提供する。皮脂の採取用具としては、例えば、皮脂吸収性もしくは接着性素材、皮膚から皮脂をこすり落とす器具、などが挙げられる。該皮脂吸収性素材は、好ましくはポリプロピレン等の材料から製造された、可撓性のシート状素材である。該皮脂吸収性素材の好ましい例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等が挙げられる。該皮脂吸収性素材は、水溶性溶媒や水分を含まない乾燥状態であることが好ましい。該皮脂接着性素材は、好ましくはシート状もしくは板状であり、必要に応じて、その表面に皮脂を接着させるためのpoly−L−lysine等の接着剤が塗布されていてもよい。該皮脂接着性素材の好ましい例としては、ガラス板、テープ等が挙げられる。該皮脂をこすり落とす器具の好ましい例としては、スパーテル、スクレイパー等が挙げられる。
(Hyaluronic acid preparation kit)
In a further aspect, the present invention provides a kit for preparing hyaluronic acid derived from a subject's skin cells, which comprises a tool for collecting the subject's sebum. Examples of the sebum collecting tool include a sebum-absorbing or adhesive material, a device for scraping sebum from the skin, and the like. The sebum-absorbing material is a flexible sheet-like material preferably manufactured from a material such as polypropylene. Preferred examples of the sebum-absorbing material include oil blotting paper, oil blotting film and the like. The sebum-absorbing material is preferably in a dry state that does not contain a water-soluble solvent or water. The sebum-adhesive material is preferably in the form of a sheet or a plate, and if necessary, an adhesive such as poly-L-lysine for adhering sebum may be applied to the surface thereof. Preferred examples of the sebum-adhesive material include glass plates, tapes and the like. Preferred examples of the device for scraping off the sebum include a spatula, a scraper and the like.
本発明によるヒアルロン酸の調製用キットは、上記採取用具で採取した皮脂からヒアルロン酸を分離するための試薬をさらに含んでいることが好ましい。例えば、測定方法がサンドイッチバインディングプロテインアッセイである場合には、基本的に、ヒアルロン酸結合性蛋白が固着された固相体と、界面活性剤を含む緩衝液と、添加用ヒアルロン酸結合性蛋白と、検体ヒアルロン酸定量用標識物質とによって構成され、これら4つの成分はそれぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に処方に従って使えるキットとして保存しておくことができる。上記キットにヒアルロン酸結合性蛋白が固着していない部分を被覆するブロック体や、通常容易に入手可能な固相表面の洗浄液等をさらに追加することも可能である。また、上記添加用ヒアルロン酸結合性蛋白は予め上記標識物質で標識したものでもよい。さらに、上記ヒアルロン酸結合性蛋白を固着した固相の表面の該ヒアルロン酸結合性蛋白が固着していない部分をブロック体により被覆しておくこともできる。このブロック体としては、γ−グロブリン、血清アルブミン、血清、Tween20からなる群より選択した1種にすることができる。上記固相体としては、プレート、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、ラテックスからなる群より選択することができ、上記標識物質は、アイソトープ、蛍光色素、アビジン、ビオチン、化学発光物質、酵素から選択することができる。 The kit for preparing hyaluronic acid according to the present invention preferably further contains a reagent for separating hyaluronic acid from the sebum collected by the above-mentioned collection tool. For example, when the measurement method is a sandwich binding protein assay, basically, a solid phase substance to which a hyaluronic acid-binding protein is fixed, a buffer solution containing a surfactant, and a hyaluronic acid-binding protein for addition are used. , Specimen Hyaluronic acid quantification labeling substance, and these four components can be stored in separate containers and stored as a kit that can be used according to the prescription at the time of use. It is also possible to further add a block body that covers the portion to which the hyaluronic acid-binding protein is not adhered, a cleaning solution for the solid phase surface that is usually easily available, and the like to the above kit. Further, the hyaluronic acid-binding protein for addition may be previously labeled with the above-mentioned labeling substance. Further, the portion of the surface of the solid phase to which the hyaluronic acid-binding protein is fixed may be covered with a block body to which the hyaluronic acid-binding protein is not fixed. The block can be one selected from the group consisting of γ-globulin, serum albumin, serum, and Tween20. The solid phase can be selected from the group consisting of plates, tubes, beads, membranes, gels and latex, and the labeling substance can be selected from isotopes, fluorescent dyes, avidin, biotin, chemiluminescent substances and enzymes. be able to.
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
(1)皮脂を試料としたヒアルロン酸の調製
採取条件をそろえるため、まず本採取の1時間前に一度あぶら取りフィルムで被験者5名の顔面皮脂除去を行った。1時間経過後、再度あぶら取りフィルムを用いて各被験者の顔面から皮脂の採取を行った。次に、顔面皮脂の付着したあぶら取りフィルムを適当な大きさに裁断し、コーニングチューブに入れた。さらに、界面活性剤を含む緩衝液(RIPA buffer)をあぶら取りフィルムが浸漬する程度まで加えた。そして、コーニングチューブを強く攪拌振盪し、ヒアルロン酸の抽出を行った。なお、コントロールとして未使用のあぶら取りフィルムからも同様の調製作業を行った。また、採取した脂質量は、採取前後のあぶら取りフィルム重量から算出した。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on Examples, but the present invention is not limited thereto.
(1) Preparation of hyaluronic acid using sebum as a sample In order to prepare the collection conditions, first, one hour before the main collection, the facial sebum of 5 subjects was removed with an oil removal film. After 1 hour, sebum was collected from the face of each subject using the oil removal film again. Next, the oil-removing film to which facial sebum was attached was cut into an appropriate size and placed in a Corning tube. Further, a buffer solution containing a surfactant (RIPA buffer) was added to the extent that the oil-removing film was immersed. Then, the Corning tube was vigorously stirred and shaken to extract hyaluronic acid. The same preparation work was performed from an unused oil-removing film as a control. The amount of collected lipid was calculated from the weight of the oil-removing film before and after collection.
(2)ヒアルロン酸の測定
続いて、Hyaluronan Duoset ELISA(R&D Systems,Inc.)を用いて、ヒアルロン酸の測定を行った。添付のプロトコルに従い、先ほど調製したヒアルロン酸抽出液に含まれるヒアルロン酸の定量を行った。結果を図1に示す。
(2) Measurement of hyaluronic acid Subsequently, hyaluronic acid was measured using Hyaluronan Duoset ELISA (R & D Systems, Inc.). According to the attached protocol, the amount of hyaluronic acid contained in the hyaluronic acid extract prepared earlier was quantified. The results are shown in FIG.
図1に示すように、いずれの被験者からもヒアルロン酸が検出された。一方、未使用のあぶら取りフィルムからは皮脂が検出されなかった。このことから、皮脂にヒアルロン酸が含まれることが示唆された。また、検出されたヒアルロン酸量は被検者間で最大4倍の差が認められた。被験者間のバラつき原因についてははっきりしないが、個人差が寄与しているのではないかと考えられる。 As shown in FIG. 1, hyaluronic acid was detected in all the subjects. On the other hand, no sebum was detected in the unused oil removal film. This suggests that sebum contains hyaluronic acid. In addition, the amount of hyaluronic acid detected was up to 4 times different among the subjects. The cause of the variation among the subjects is not clear, but it is thought that individual differences may have contributed.
次に、ヒアルロン酸の抽出が可能な溶媒について検討を行った。試験は、先ほどの試験でヒアルロン酸検出量の多かった被験者Eの皮脂を用いて行った。RIPA bufferに代えて、水、有機溶媒(エタノール、アセトン、ヘキサン、ヘキサン−メタノール、アセトン−ジエチルエーテル、クロロホルム−エタノール)、界面活性剤(SDS、Triton X−100、デオキシコール酸ナトリウム、ミリスチルスルホベタイン)を用いたこと以外は、先ほどと同様である。なお、Bligh−Dyer法についても併せて検討を行った。結果を図2に示す。 Next, a solvent capable of extracting hyaluronic acid was examined. The test was performed using the sebum of subject E, which had a large amount of hyaluronic acid detected in the previous test. Instead of RIPA buffer, water, organic solvents (ethanol, acetone, hexane, hexane-methanol, acetone-diethyl ether, chloroform-ethanol), surfactants (SDS, Triton X-100, sodium deoxycholate, myristyl sulfobetaine) ) Is used, but it is the same as before. The Bright-Dyer method was also examined. The results are shown in FIG.
図2から明らかなように、水、有機溶媒からではヒアルロン酸は検出できなかった。一方、界面活性剤を用いた場合には、いずれの界面活性剤においてもヒアルロン酸の抽出が可能であった。また、用いた界面活性剤のうち、SDSとデオキシコール酸ナトリウムはRIPA Bufferと同等の抽出が、Triton X−100とミリスチルスルホベタインはRIPA Bufferよりもさらに多くのヒアルロン酸の抽出が可能であった。なお、水溶性画分を採取可能なBligh−Dyer法でも水で抽出を行った場合と同程度の検出しかできなかったことから、界面活性剤のみを用いたほうが、抽出効率が高まることが示唆された。 As is clear from FIG. 2, hyaluronic acid could not be detected in water or an organic solvent. On the other hand, when a surfactant was used, hyaluronic acid could be extracted with any of the surfactants. Of the surfactants used, SDS and sodium deoxycholate were capable of extracting the same amount of hyaluronic acid as RIPA Buffer, while Triton X-100 and myristyl sulfobetaine were capable of extracting more hyaluronic acid than RIPA Buffer. .. The Blich-Dyer method, which can collect a water-soluble fraction, could only detect the same level as when extracting with water, suggesting that the extraction efficiency will be higher if only the surfactant is used. Was done.
以上説明したように、本発明によれば、従来ヒアルロン酸が含有されていないと思われていた皮脂からヒアルロン酸を簡便な方法で検出できることが明らかとなった。これにより、非侵襲的かつ直接的にヒアルロン酸を検出することができため、経時的な皮膚の変化等を観測することができる。 As described above, according to the present invention, it has been clarified that hyaluronic acid can be detected by a simple method from sebum which was conventionally thought to contain no hyaluronic acid. As a result, hyaluronic acid can be detected non-invasively and directly, so that changes in the skin over time can be observed.
Claims (7)
前記被験体の皮膚表上脂質を採取する採取工程と、
採取した皮膚表上脂質を界面活性剤で処理する処理工程と、
界面活性剤で処理したヒアルロン酸を検出する検出工程と、
からなる、被験体の皮膚細胞に由来するヒアルロン酸の検出方法。 A method for detecting hyaluronic acid derived from the skin cells of a subject.
A collection step of collecting lipids on the skin surface of the subject, and
A treatment process for treating the collected lipids on the surface of the skin with a surfactant,
A detection process for detecting hyaluronic acid treated with a surfactant,
A method for detecting hyaluronic acid derived from the skin cells of a subject.
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