JP2021145548A - ＥＮＧａｓｅまたはその変異体を用いた４本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 コアフコ−スの有無にかかわらず、４本鎖糖鎖が結合したＩｇＧ抗体を簡便に調製する方法を提供すること。【解決手段】 ４本鎖糖鎖を持つＩｇＧ抗体の調製方法であって、ＩｇＧ抗体をアクセプター基質として、４本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＦ３またはその変異体、あるいはＥｎｄｏＳ２またはその変異体を作用させて、４本鎖糖鎖を抗体アクセプターに転移させることを特徴とするＩｇＧ抗体の調製方法。【選択図】図２

Description

本発明は、４本鎖糖鎖を有することを特徴とするＩｇＧ抗体の調製方法に関する。本発明で表している４本鎖糖鎖とは、複合型糖鎖において、Ｎ，Ｎ‘−ジアセチルキトビオースユニット（ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）の非還元末端側に結合したマンノース（Ｍａｎ）からα１−３またはα１−６の結合様式で結合したマンノース残基に、それぞれβ１−２結合とβ１−４結合、およびβ１−２結合とβ１−６結合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を４分子有する糖鎖（ＧＮ４）、またはその非還元末端にガラクトース（Ｇａｌ）が４分子結合した糖鎖（Ｇ４）である。

糖タンパク質のＮ結合型糖鎖には、高マンノース型糖鎖（Ｎ，Ｎ‘−ジアセチルキトビオースユニットにマンノースのオリゴマーが結合している糖鎖）；複合型糖鎖（Ｎ，Ｎ‘−ジアセチルキトビオースユニットにマンノースおよびＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース（Ｇａｌ）、シアル酸（Ｓｉａ）の少なくとも１つが結合した糖鎖）；並びに混合（ｈｙｂｒｉｄ）型糖鎖（Ｎ，Ｎ‘−ジアセチルキトビオースユニットに高マンノース型糖鎖と複合型糖鎖が混成している糖鎖）が存在する。構成糖、鎖長、結合様式等の違いによって様々な種類の糖鎖が存在し得る。

Ｎ結合型糖鎖の中には、糖タンパク質の機能発現に関わるものがあり、特に、糖鎖構造の違いが機能発現に重大な影響を及ぼす場合がある。例えば、免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ， ＩｇＧ）抗体の場合、２９７番目のアスパラギン残基にＮ結合型糖鎖が付加しているが、このアスパラギン残基に直接結合するＮ−アセチルグルコサミンに、コアフコースとよばれるα１−６結合したフコース（Ｆｕｃ）が付加していない複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体は、非常に高い抗体依存性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ， ＡＤＣＣ）を示すが、コアフコースが付加した複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体は、低いＡＤＣＣ活性を示すことが報告されている（非特許文献１）。

通常、抗体分子には様々な糖鎖が不均一に結合している。現在、がんなどの疾患治療薬（抗体医薬品）として多くの抗体が開発されているが、糖鎖に由来する抗体分子の不均一性は、医薬品としての力価や安定性にも影響を及ぼすことが考えられ、医薬品として十分な品質管理をする上で問題である。

抗体の機能解明の観点から、ＩｇＧ抗体に均一の糖鎖を結合させる糖鎖リモデリング法が試みられている（非特許文献２，３、特許文献１）。この方法は、最初にＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合しているＮ結合型糖鎖を、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）の一種であり、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域の糖鎖を特異的に切断する活性を有するＥｎｄｏＳという酵素（非特許文献４）を用いて切断する。この際、ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位である２９７番目のアスパラギンにはＮ−アセチルグルコサミンが一残基、あるいはコアフコースが結合した二残基が結合している（抗体アクセプター）。次に、このＩｇＧ抗体をアクセプター基質として、糖鎖の還元末端をオキサゾリン体にした糖鎖オキサゾリンをドナー基質として、ＥｎｄｏＳの糖鎖切断活性を抑制し、かつ糖鎖転移活性を発揮するグライコシンターゼ化した変異体（ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ａ変異体、またはＤ２３３Ｑ変異体）を作用させる事によって、ＩｇＧ抗体へ均一の糖鎖を付加させる。

抗体機能の増強や新規機能の付与などを目指して、上記方法のような糖鎖改変技術を利用して、既存の抗体とは異なる構造をした糖鎖をもつ抗体を創製する試みが行われている（非特許文献５）。例えば、抗体医薬品として利用されているＩｇＧ抗体は、おもに２本鎖複合型糖鎖が結合しているが、均一なコアフコースつき３本鎖複合型糖鎖が結合したＩｇＧ抗体が調製されている（非特許文献６）。

この調製方法は、まずエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの一種であるＥｎｄｏＦ３をリツキシマブに作用させて、ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位であるアスパラギンにコアフコースの結合したＮ−アセチルグルコサミンが残ったＩｇＧ抗体を調製する。つぎに、このＩｇＧ抗体をアクセプター基質として、均一な３本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＦ３の糖鎖切断活性を抑制し、かつ糖鎖転移活性を発揮するグライコシンターゼ化した変異体（ＥｎｄｏＦ３ Ｄ１６５Ａ変異体）を作用させて、３本鎖複合型糖鎖が結合したリツキシマブを調製している。

上記方法による抗体アクセプターへの糖鎖転移については、これまでに２本鎖および３本鎖複合型糖鎖の転移反応が実施されているが、４本鎖複合型糖鎖の転移反応については報告されていない。一般に、ＥｎｄｏＦ３やＥｎｄｏＳ、およびその類似酵素のＥｎｄｏＳ２（非特許文献７）といった酵素には４本鎖複合型糖鎖の切断活性がなく、同様にこの糖鎖は、これら酵素の水解反応の逆反応である転移反応の基質にもならないと考えられている。

一方、４本鎖複合型糖鎖が結合したＩｇＧ抗体の調製法としては、特定構造の２本鎖複合型糖鎖が結合した抗体に対し、ＧｎＴ−ＩＶおよびＧｎＴ−ＶといったＮ−アセチルグルコサミン転移酵素を連続的に作用させて、抗体上に４本鎖糖鎖を形成させる方法があるが（特許文献２）、この方法では反応に数十から数百時間を要するとともに、反応条件が至適化されていないと反応が完全に進まず、必ずしも均一構造をした４本鎖糖鎖を形成できない場合がある。従ってこの方法にかわり、短時間で効率よく４本鎖糖鎖を有する抗体を調製できる方法が求められている。

国際公開公報ＷＯ２０１３／１２００６６号 特開２０１９−８３５３７２号 特開２０２０−２２４４０号

Ｔｏｙｏｈｉｄｅ Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８， ３４６６−３４７３ （２００３） Ｗｅｉ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １３４， １２３０８−１２３１８ （２０１２） Ｍａｓａｋｉ Ｋｕｒｏｇｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０， ｅ０１３２８４８ （２０１５） Ｍａｔｔｉａｓ Ｃｏｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ２０， ３０４６−３０５５ （２００１） Ｆｅｎｇ Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．ｐｒｏｔｏｃ． １２， １７０２−１７２１ （２０１７） Ｊｏｈｎ Ｐ． Ｇｉｄｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２９１， ９３５６−９３７０ （２０１６） Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｓｊｏｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ４５５， １０７−１１８ （２０１３） Ｍｉｃｈｉｈｉｋｏ Ａｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， ＭＡＢＳ． １１， ８２６−８３６ （２０１９） Ｃｈｉｎ−Ｗｅｉ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １１２， １０６１１−１０６１６ （２０１５） Ｔｉｅｚｈｅｎｇ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２９１， １６５０８−１６５１８ （２０１６）

本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、前記問題点を解決し、４本鎖複合型糖鎖が結合したＩｇＧ抗体を簡便に調製する方法を提供することである。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位であるアスパラギンにコアフコースの付加したＮ−アセチルグルコサミンが結合したＩｇＧ抗体をアクセプター基質とし、ＧＮ４型またはＧ４型の４本鎖複合型糖鎖（図１）のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＦ３またはその変異体を作用させることによって、４本鎖複合型糖鎖が結合したＩｇＧ抗体を調製できることを見出した。さらに、経時的にオキサゾリン基質を反応系に追加すると、転移効率が改善されることを見出した。またＧＮ４型糖鎖の転移については、ＥｎｄｏＳ２を作用させると、コアフコースが付加していない抗体アクセプターに対しても４本鎖糖鎖の転移がおこることを見出し、本発明を完成するに至った。

また、ＩｇＧ抗体上にＧＮ４型の４本鎖複合型糖鎖を形成させた後に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体としてＧｎＴ−ＩＸ（ＧｎＴ−ＶＢ）、またはＧｎＴ−ＶＩを作用させることによって、ＩｇＧ抗体上に５本鎖複合型糖鎖（ＧＮ５）が形成されると考えられる。また、５本鎖複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体を調製する際、ＧｎＴ−ＩＸ（ＧｎＴ−ＶＢ）を用いた場合には、つぎにＧｎＴ−ＶＩを作用させることによって、ＩｇＧ抗体上に６本鎖複合型糖鎖（ＧＮ６）が形成されると考えられる。同様に、５本鎖複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体を調製する際、ＧｎＴ−ＶＩを用いた場合には、つぎにＧｎＴ−ＩＸ（ＧｎＴ−ＶＢ）を作用させることによって、ＩｇＧ抗体上に６本鎖複合型糖鎖が形成されると考えられる。また、ＧＮ４型の４本鎖複合型糖鎖が結合したＩｇＧ抗体に対し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体としてＧｎＴ−ＩＩＩを作用させることによって、ＩｇＧ抗体上にｂｉｓｅｃｔｉｎｇ ＧｌｃＮＡｃ構造をもつ複合型糖鎖を形成することもできる。

上記のようにＩｇＧ抗体上にＧＮ４〜ＧＮ６型の複合型糖鎖を形成させた後に、ＵＤＰ−Ｇａｌを糖供与体としてガラクトース（Ｇａｌ）転移酵素を作用させる事によって、糖鎖の非還元末端側に存在しているＧｌｃＮＡｃにＧａｌを結合させて糖鎖を伸長することができる。また、付加したＧａｌに対して、ＣＭＰ−シアル酸（Ｓｉａ）を糖供与体としてシアル酸転移酵素を作用させる事によって、糖鎖の非還元末端側に存在しているＧａｌにＳｉａを結合させて糖鎖を伸長することができる。さらに、アセチル基転移酵素や硫酸転移酵素を作用させることによって、伸長したシアル酸やガラクトースを修飾することもできる。また、ＧＤＰ−Ｆｕｃを糖供与体としてフコース（Ｆｕｃ）転移酵素を作用させる事によって、Ｆｕｃを結合させた糖鎖を伸長することができる。

すなわち、本発明は、４本鎖複合型糖鎖を持つＩｇＧ抗体の調製方法であって、以下の工程（１）、工程（２）、工程（３）のいずれかを行うことを特徴とするＩｇＧ抗体の調製方法を提供するものである。
（１）ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位であるアスパラギンにコアフコースの付加したＮ−アセチルグルコサミンが結合したＩｇＧ抗体をアクセプター基質とし、ＧＮ４型またはＧ４型の４本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＦ３またはその変異体を作用させて４本鎖糖鎖を抗体アクセプターに転移させる工程
（２）ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位であるアスパラギンにコアフコースの付加した、あるいは付加していないＮ−アセチルグルコサミンが結合したＩｇＧ抗体をアクセプター基質とし、ＧＮ４型の４本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＳ２またはその変異体を作用させて４本鎖糖鎖を抗体アクセプターに転移させる工程
（３）工程（１）または（２）を実施する際に、経時的にオキサゾリン基質を反応系に追加して転移効率を向上させる工程
また、本発明は、上記ＩｇＧ抗体の調製方法によって調製した４本鎖複合型糖鎖を持つＩｇＧ抗体を提供するものである。

本発明によれば、前記問題点を解決し、酵素による糖転移反応という簡単なステップにより、短時間で効率よく、４本鎖複合型糖鎖が結合したＩｇＧ抗体を調製することができる。また、ここで調製されたＩｇＧ抗体に、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、ガラクトース転移酵素、シアル酸転移酵素などを糖供与体とともに作用させて、さらに分岐した、あるいは伸長した糖鎖構造を有するＩｇＧ抗体を調製することもできる。このようにして調製されたＩｇＧ抗体は、「特定の糖鎖構造を有するＩｇＧ抗体の機能および安定性」等の検討に利用することができる。

ＧＮ４型糖鎖およびＧ４型糖鎖の構造を示した図である。 ４本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法の概念図である。 ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位であるアスパラギンにコアフコースの付加したＮ−アセチルグルコサミンが結合したリツキシマブをアクセプター基質とし、ＧＮ４型またはＧ４型の４本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＦ３ Ｄ１６５Ａ変異体、またはＥｎｄｏＳ２を作用させて転移反応を実施し、その反応産物をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にて解析した結果である。 図３の各酵素によるＧＮ４型糖鎖転移反応の３時間時における反応産物を質量分析で解析した結果を示した図である。転移産物に由来するＧＮ４Ｆ型糖鎖のシグナル、コアフコースが付加したＮ−アセチルグルコサミンが結合したペプチド由来のシグナル（Ｐｅｐ＋ＧｎＦ）、Ｎ−アセチルグルコサミンが結合したペプチド由来のシグナル（Ｐｅｐ＋Ｇｎ）が検出されている。 図３の各酵素によるＧ４型糖鎖転移反応の３時間時における反応産物を質量分析で解析した結果を示した図である。転移産物に由来するＧ４Ｆ型糖鎖のシグナル、コアフコースが付加したＮ−アセチルグルコサミンが結合したペプチド由来のシグナル（Ｐｅｐ＋ＧｎＦ）、Ｎ−アセチルグルコサミンが結合したペプチド由来のシグナル（Ｐｅｐ＋Ｇｎ）が検出されている。 ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位であるアスパラギンにＮ−アセチルグルコサミンが結合したトラスツズマブをアクセプター基質とし、ＧＮ４型の４本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＳ２またはＥｎｄｏＳ２ Ｄ１８４Ｍ変異体を作用させて転移反応を実施し、その反応産物をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にて解析した結果と、反応３時間時における反応産物を質量分析で解析した結果を示した図である。 リツキシマブをアクセプター基質とし、ＧＮ４型またはＧ４型の４本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＦ３を作用させて転移反応を実施した。その際、１時間おきにそれぞれの反応において４本鎖糖鎖オキサゾリンを追加した。その反応産物を経時的にサンプリングしてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にて解析した結果である。 上段は図７のＧＮ４型糖鎖転移反応の４時間時における反応産物を、下段は図７のＧ４型糖鎖転移反応の５時間時における反応産物を、それぞれ質量分析で解析した結果を示した図である。

以下、本発明の実施態様および実施方法について詳細に説明するが、本発明は、以下の具体的形態に限定されるものでなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。

＜本発明の４糖鎖複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法＞
本発明の多分岐糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法は、以下の工程（１）、工程（２）、工程（３）のいずれかを行うことを特徴とする。
（１）ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位であるアスパラギンにコアフコースの付加したＮ−アセチルグルコサミンが結合したＩｇＧ抗体をアクセプター基質とし、ＧＮ４型またはＧ４型の４本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＦ３またはその変異体を作用させて４本鎖糖鎖を抗体アクセプターに転移させる工程
（２）ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位であるアスパラギンにコアフコースの付加した、あるいは付加していないＮ−アセチルグルコサミンが結合したＩｇＧ抗体をアクセプター基質とし、ＧＮ４型の４本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＳ２またはその変異体を作用させて４本鎖糖鎖を抗体アクセプターに転移させる工程
（３）工程（１）または（２）を実施する際に、経時的にオキサゾリン基質を反応系に追加して転移効率を向上させる工程

上記の４本鎖複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法の例として、ＧＮ４型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＦ３またはその変異体、あるいはＥｎｄｏＳ２またはその変異体を作用させて、コアフコースを含有した抗体アクセプターに４本鎖糖鎖を転移させる工程の概念図を図２に示すが、本発明はこの概念図の例に限定されるものではない。

本明細書中において、「４本鎖糖鎖」とは、複合型糖鎖において、Ｎ，Ｎ‘−ジアセチルキトビオースユニット（ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）の非還元末端側に結合したマンノースからα１−３またはα１−６の結合様式で結合したマンノース残基に、それぞれβ１−２結合とβ１−４結合、およびβ１−２結合とβ１−６結合したＮ−アセチルグルコサミンを４分子有する糖鎖（ＧＮ４）、またはその非還元末端にガラクトースが４分子結合した糖鎖（Ｇ４）である（図１）。このほかに、ＧＮ４型糖鎖の非還元末端にガラクトースが１分子、２分子、または３分子結合したＧ１ＧＮ４型糖鎖、Ｇ２ＧＮ４型糖鎖、あるいはＧ３ＧＮ４型糖鎖も存在し得るが、いずれも本明細書において記載される「４本鎖糖鎖」の範疇に属するものである。

糖鎖のオキサゾリン体の調製法、および抗体アクセプターの調製法は、特許文献１、非特許文献２、３などに開示されている。

エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）は、酵素番号ＥＣ３．２．１．９６に分類される酵素で、Ｎ結合型糖鎖の基本骨格を構成するＮ，Ｎ‘−ジアセチルキトビオースユニット構造を切断する活性を有するが、この加水分解反応の逆反応である糖転移活性を同時に有する酵素も存在する。本発明の４本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製の際に工程（１）において用いるＥｎｄｏＦ３、または工程（２）において用いるＥｎｄｏＳ２は、加水分解活性と糖転移活性を有する微生物由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの一種である。これらの酵素については、非特許文献６、７などに開示されている。また、工程（１）あるいは工程（２）において用いる両酵素の変異体は、糖転移活性は発揮するものの、加水分解活性が抑制されている酵素である。本明細書では、これらの酵素は大腸菌で発現させた組換え酵素を用いるが、同様の活性を示す酵素であれば、当該酵素を生産する菌から精製した酵素や、動植物あるいは大腸菌以外の微生物に発現させた組換え酵素を用いても構わない。

本発明では、上記の工程（３）において、反応系にオキサゾリン基質を追加するが、追加する量や追加するタイミングは、糖転移反応の効率が向上されるのであれば、適宜変更されても構わない。

上記工程（１）、（２）または（３）ののちに、最終生成物を分離する工程には、一般的なクロマトグラフィ−操作によって、基質由来のアクセプター抗体や、抗体分子を形成する２分子のモノマー（モノマー１分子は重鎖と軽鎖からなる）のうち、一方のモノマーにしか４本鎖糖鎖が転移されなかったＩｇＧ抗体（ヘミ体）と、最終生成物である２分子のモノマーの両方に４本鎖糖鎖が転移されたＩｇＧ抗体（フル体）を分離し、これを精製取得する工程が含まれる。一般的なクロマトグラフィ−操作とは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロ−ス等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ−法、スルホプロピル（ＳＰ）セファロ−ス等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィ−法、ブチルセファロ−ス、フェニルセファロ−ス等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィ−法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティ−クロマトグラフィ−法、クロマトフォ−カシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法のことであり、これらを単独あるいは組み合わせて用い、最終生成物である「４本鎖糖鎖を持つＩｇＧ抗体」の精製標品を得ることができる。

本発明で提供される調製方法により調製される４本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体には、コアフコ−スを有さないＩｇＧ抗体およびコアフコ−スを有するＩｇＧ抗体が含まれる。また４本鎖糖鎖がＧＮ４型糖鎖であるＩｇＧ抗体、及びその非還元末端にガラクトースが１から４分子結合したＧ１ＧＮ４型糖鎖、Ｇ２ＧＮ４型糖鎖、Ｇ３ＧＮ４型糖鎖、およびＧ４型糖鎖が結合したＩｇＧ抗体が含まれる。さらに上記抗体が非キメラ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であるＩｇＧ抗体が含まれる。さらに具体的には、トラスツズマブ、リツキシマブ、モガムリズマブといった抗体医薬品として利用されているＩｇＧ抗体が含まれる。

以下に記載する実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞４本鎖糖鎖のオキサゾリン体を用いた糖転移反応により、４本鎖糖鎖を有するリツキシマブを調製する方法

リツキシマブはＣＤ２０陽性の非ホジキンリンパ腫などの治療に用いられる抗体医薬品である。リツキシマブに結合する糖鎖の大部分（９５％以上）にはコアフコ−スが付加している（ｗｗｗ．ａｆｉｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ．ｉｔ／ａｌｌ／ＢＥＲＮＡＲＥＧＧＩ ＳＥＳＳＩＯＮＥ ＩＩ．ｐｄｆ）。このコアフコ−スを有するリツキシマブに、３本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体とＥｎｄｏＦ３変異体を用いた糖転移反応によって、３本鎖複合型糖鎖結合させる方法は公知である（非特許文献６）。一方、ＥｎｄｏＦ３は３本鎖複合型糖鎖の切断活性はもつものの、４本鎖複合型糖鎖の切断活性はもたないため、同様の糖転移反応によって４本鎖複合型糖鎖を有するＩｇＧ抗体が調製できるかは不明である。本発明ではこの課題の克服のため、４本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法の確立に取り組んだ。

リツキシマブにＥｎｄｏＳなどのエンドグリコシダーゼを作用させて、リツキシマブの抗体アクセプタ−を調製する方法が開示されている（非特許文献８，９）。この方法を参考にして、本発明者らもコアフコースを含有するリツキシマブの抗体アクセプタ−を調製した。

４本鎖糖鎖のオキサゾリン体の調製に際し、ヒトのＮ−アセチルグルコサミントランスフェラ−ゼ（ＧｎＴ）−ＩＶ、ＧｎＴ−Ｖ、およびガラクトース転移酵素Ｂ４ＧａｌＴ１は、各酵素の発現ベクターをヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞に導入し、本細胞に生産させた酵素をアフィニティー精製したものを使用した。

非特許文献３に開示されている方法に従い、シアル酸が結合した２本鎖複合型糖鎖を含有するシアリルグリコペプチド（伏見製薬所）に酸処理を施してシアル酸を除去したのち、ガラクトシダーゼ処理を施してガラクトースを除去したＧ０型糖鎖が結合した糖ペプチド（Ｇ０−ペプチド）を調製した。２．５ｍＭのこの糖ペプチド（９．７９４ｍｇ／２ｍＬ）とＧｎＴ−Ｖ（４０μｇ）を２５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、２５ｍＭ ＮａＣｌ、および１００μｇの牛血清アルブミンを含む溶液中（２ｍＬ）で３７℃、７３．５時間、振盪しながら反応させた。この際、少量の反応液を質量分析に供し、反応状況を確認した。

上記反応により、ＧＮ３ａ型の３本鎖糖鎖が形成されたことを確認したのち、反応液にＧｎＴ−ＩＶ（４０μｇ／２０μＬ）と０．２Ｍ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ５０μＬを加え、さらに３７℃で２２１時間反応させた。ここで少量の反応液を質量分析に供し、ＧＮ４型の４本鎖糖鎖がペプチド上に形成されたことを確認した。

ＧＮ４型糖鎖に４分子のガラクトースが結合したＧ４型糖鎖をもつ糖ペプチドについては、まず２．５ｍＭのＧ０−ペプチド（０．９７９４ｍｇ／０．２ｍＬ）とＧｎＴ−Ｖ（６μｇ）を２５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、２５ｍＭ ＮａＣｌ、および１０μｇの牛血清アルブミンを含む溶液中（０．２ｍＬ）で３７℃、１３７時間、振盪しながら反応させた。その後、反応液にＧｎＴ−ＩＶ（６μｇ）と０．２Ｍ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ５μＬを加え、さらに３７℃で１２６時間反応させた。この反応液に、さらにガラクトース転移酵素Ｂ４ＧａｌＴ１（１１．４μｇ）と、ＵＤＰ−Ｇａｌを１７．６ｍＭになるように加え、３７℃で９４時間反応させた。ここで少量の反応液を質量分析に供し、Ｇ４型の４本鎖糖鎖がペプチド上に形成されたことを確認した。

ＧＮ４型およびＧ４型の４本鎖糖鎖をもつ糖ペプチドからエンドグリコシダーゼを用いて糖鎖を切り出したのち、非特許文献３に開示されている方法に従って、これらの４本鎖糖鎖をオキサゾリン体にした。なお、ＧＮ４型糖鎖をもつ糖ペプチドに対しては、エンドグリコシダーゼとして特許文献３に記載されているＥｎｄｏ−Ｔｓｐ１２６３を作用させた。またＧ４型糖鎖をもつ糖ペプチドに対しては、エンドグリコシダーゼとして特許文献３に記載されているＥｎｄｏ−Ｂａｃ１００８を作用させた。

ＥｎｄｏＦ３およびＥｎｄｏＦ３ Ｄ１６５Ａ変異体は、非特許文献６，８などに開示されている方法を参考にして、大腸菌で発現させたそれぞれの組換え酵素を調製した。また、ＥｎｄｏＳ２およびＥｎｄｏＳ２ Ｄ１８４Ｍ変異体は、非特許文献７，１０などに開示されている方法を参考にして、大腸菌で発現させたそれぞれの組換え酵素を調製した。

４本鎖糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＦ３ Ｄ１６５Ａ変異体、およびＥｎｄｏＳ２によるリツキシマブの抗体アクセプターへの糖転移反応を実施した。リツキシマブアクセプター（１０μｇ）と酵素（５から６μｇ）、および１．８３５ｍＭの４本鎖糖鎖オキサゾリンを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液中（２．５μＬ）で混合し、３７℃で３時間反応させた。この間、１時間おきに反応液をサンプリングし、それらをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析した結果を図３に示す。ＧＮ４型の４本鎖糖鎖の場合、いずれの酵素の反応でも泳動パターン上でＩｇＧ重鎖より高分子側に転移産物が検出された。一方、Ｇ４型糖鎖の場合は、泳動パターン上ではＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＦ３ Ｄ１６５Ａ変異体による反応では同様の転移産物が検出できたが、ＥｎｄｏＳ２による反応ではほとんど検出できなかった。

反応３時間時の反応液を質量分析に供した結果を図４、５に示す。質量分析による解析は、抗体（５μｇ）を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３７．５μｌ）に溶かして、１００℃で１５分間加熱した後に、シ−クエンスグレ−ドのトリプシン（Ｒｏｃｈｅ社製、０．５μｇ）を加えて、３７℃で１２時間反応させた。その反応溶液を、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８ １．０×１５０ｍｍ カラムを繋げたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００＋ＶｅｌｏｓＰｒｏ）を用いてＭＳ測定を行い、ペプチド鎖（ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）及びそのペプチド鎖に糖鎖（ＧＮ４およびＧ４）が結合した糖ペプチドのイオンをモニタリングして、イオン量より各種のモル量を計算した。

ＧＮ４型糖鎖の転移反応の場合、リツキシマブアクセプター上の糖鎖付加部位にあるコアフコースが結合したＮ−アセチルグルコサミンにＧＮ４型糖鎖のオキサゾリン体が転移した結果、質量分析ではコアフコースを含んだＧＮ４Ｆ型糖鎖のシグナルが検出される。このシグナルをもとに反応３時間時におけるＧＮ４型糖鎖が転移された抗体分子の割合を算出した結果、ＥｎｄｏＦ３による反応では３１．８％、ＥｎｄｏＦ３ Ｄ１６５Ａ変異体による反応では２５．５％、ＥｎｄｏＳ２による反応では３０．５％だった（図４）。

また、Ｇ４型糖鎖の転移反応の場合、リツキシマブアクセプター上の糖鎖付加部位にあるコアフコースが結合したＮ−アセチルグルコサミンにＧ４型糖鎖のオキサゾリン体が転移した結果、質量分析ではコアフコースを含んだＧ４Ｆ型糖鎖のシグナルが検出される。このシグナルをもとに反応３時間時におけるＧ４型糖鎖が転移された抗体分子の割合を算出した結果、ＥｎｄｏＦ３による反応では２３．６％、ＥｎｄｏＦ３ Ｄ１６５Ａ変異体による反応では１５．５％、また泳動パターン上では転移産物がほとんど検出できなかったＥｎｄｏＳ２による反応では、その割合は２．２５％だった（図５）。以上の結果により、コアフコースが結合したＮ−アセチルグルコサミンを有する抗体アクセプターに、上記の酵素を用いてＧＮ４型およびＧ４型の４本鎖糖鎖が転移できることが明らかになった。

＜実施例２＞４本鎖糖鎖のオキサゾリン体を用いた糖転移反応により、４本鎖糖鎖を有するトラスツズマブ（コアフコース非含有）を調製する方法
トラスツズマブはＨＥＲ２過剰発現が確認された乳がんおよび胃がんの治療に用いられる抗体医薬品である。本抗体はそのエフェクター機能としてＡＤＣＣ活性を示すことが知られているが、高ＡＤＣＣ活性を発揮させるためには、抗体に結合している糖鎖にコアフコースが存在しないことが望まれる。＜実施例１＞では、コアフコースを含有するリツキシマブアクセプター対する４本鎖糖鎖の転移反応を実施したが、ここでは、コアフコースを含有しないトラスツズマブアクセプターを調製し、それに対する４本鎖糖鎖の転移反応を実施することにした。

フコシダーゼを作用させてコアフコースを含有しない抗体アクセプターを調製する方法が、非特許文献９に開示されている。そこでまず、コアフコースを含有するトラスツズマブアクセプターを、リツキシマブアクセプターを調製したときと同様にして調製し、これに対してフコシダーゼを作用させて、コアフコースを含有しないトラスツズマブアクセプターを調製した。

つぎに、ＧＮ４型４本鎖糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＳ２およびＥｎｄｏＳ２ Ｄ１８４Ｍ変異体によるコアフコースを含有しないトラスツズマブアクセプターへの糖転移反応を実施した。トラスツズマブアクセプター（１０μｇ）と酵素（６から８μｇ）、および１．８３５ｍＭの４本鎖糖鎖オキサゾリンを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液中（２．５μＬ）で混合し、３７℃で３時間反応させた。この間、１時間おきに反応液をサンプリングし、それらをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析した結果と、反応３時間時の反応液を＜実施例１＞のときと同様にして質量分析に供した結果を図６に示す。上段はＥｎｄｏＳ２、下段はＥｎｄｏＳ２ Ｄ１８４Ｍ変異体による反応産物の解析結果を示すが、いずれの酵素の反応でも泳動パターン上でＩｇＧ重鎖より高分子側に転移産物が検出された。なお、ＥｎｄｏＦ３やその変異体は、コアフコースを含有する糖鎖を基質として特に好むが、コアフコースを含有しないトラスツズマブアクセプターはこれらの酵素の基質にならないため、転移反応は実施しなかった。

ＧＮ４型糖鎖の転移反応の場合、トラスツズマブアクセプター上の糖鎖付加部位にあるＮ−アセチルグルコサミンにＧＮ４型糖鎖のオキサゾリン体が転移した結果、質量分析ではＧＮ４型糖鎖のシグナルが検出される。このシグナルをもとに反応３時間時におけるＧＮ４型糖鎖が転移された抗体分子の割合を算出した結果、ＥｎｄｏＳ２による反応では２０．０％、ＥｎｄｏＳ２ Ｄ１８４Ｍ変異体による反応では２．８１％だった（図６）。以上の結果より、コアフコースを含有しない抗体アクセプターにも４本鎖糖鎖を転移できることが明らかになった。

＜実施例３＞４本鎖糖鎖のオキサゾリン体を用いた糖転移反応において、転移効率を向上させる方法
これまでの実施例で示した４本鎖糖鎖の転移反応では、その転移効率は最も高いものでも３１．８％であった。抗体分子は重鎖と軽鎖からなるモノマーが二量体を形成した形で存在するため、重鎖上の糖鎖付加部位は１分子の抗体分子中、実質２カ所存在する。そのため、転移効率が低いと、両方の糖鎖付加部位に４本鎖糖鎖が結合した抗体の割合が低くなり、その単離精製による取得においても収率が低くなると考えられる。ここでは、４本鎖糖鎖の転移反応の転移効率を向上させる方法について検討することにした。

ＧＮ４型およびＧ４型の４本鎖糖鎖オキサゾリン体をドナー基質として、ＥｎｄｏＦ３によるリツキシマブの抗体アクセプター（コアフコース含有）への糖転移反応を実施した。リツキシマブアクセプター（１０μｇ）と酵素（ＧＮ４転移、５．３μｇ；Ｇ４転移、１０μｇ）、および１．８３５ｍＭの４本鎖糖鎖オキサゾリンを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液中（２．５μＬ）で混合し、３７℃で４から５時間まで反応させた。この間、１時間おきに反応液０．３μＬをサンプリングするとともに、残りの反応液に５０ｍＭの４本鎖糖鎖オキサゾリン溶液０．０９１７５μＬを追加した（最終サンプリング時には追加せず）。サンプリングした反応液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析した結果を図７に示す。

その結果、経時的にオキサゾリン基質を追加するとともに、反応時間を延長し、場合によっては反応に使用する酵素量を増加させたことで、最終的な転移産物では、これまでの転移反応とくらべて転移効率の向上が認められた。ＧＮ４型糖鎖の転移の場合、反応４時間時での転移効率を質量分析により算出したところ、８１．９％であった（図８上段）。また、Ｇ４型糖鎖の転移の場合、反応５時間時での転移効率を質量分析により算出したところ、７７．２％であった（図８下段）。すなわち、本法により４本鎖糖鎖の転移反応の転移効率を向上できることが明らかとなった。

本発明は、４本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体を簡便に調製、製造することができる。したがって、４本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の機能や安定性の検討、およびそれらの改善、純品の標品としての使用が可能になるので、医薬品業界等において利用可能である。

Claims (3)

1. ４本鎖複合型糖鎖を持つＩｇＧ抗体の調製方法であって、ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位であるアスパラギンにコアフコースの付加したＮ−アセチルグルコサミンが結合したＩｇＧ抗体をアクセプター基質とし、ＧＮ４型またはＧ４型の４本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、（１）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するＥｎｄｏＦ３、または（２）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列を有し、糖転移活性を発揮するＥｎｄｏＦ３変異体を作用させて、４本鎖糖鎖を抗体アクセプターに転移させることを特徴とするＩｇＧ抗体の調製方法。
2. ４本鎖複合型糖鎖を持つＩｇＧ抗体の調製方法であって、ＩｇＧ抗体の糖鎖付加部位であるアスパラギンにコアフコースの付加した、あるいは付加していないＮ−アセチルグルコサミンが結合したＩｇＧ抗体をアクセプター基質とし、ＧＮ４型の４本鎖複合型糖鎖のオキサゾリン体をドナー基質として、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するＥｎｄｏＳ２、または配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列を有し、糖転移活性を発揮するＥｎｄｏＳ２変異体を作用させて、４本鎖糖鎖を抗体アクセプターに転移させることを特徴とするＩｇＧ抗体の調製方法。
3. 請求項１ないし請求項２に記載のＩｇＧ抗体の調製方法において、経時的にオキサゾリン基質を反応系に追加して、転移反応の効率を向上させる方法。
   
   

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