JP2021136905A - Mutant isoprene synthase and screening method therefor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、変異型イソプレン合成酵素及びそのスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to mutant isoprene synthase and a screening method thereof.
テルペン、テルペノイド、カロテノイドなど、イソプレンユニットからなる化合物は7万にのぼるが、これらの生合成酵素は非常に活性が低い。その改良の必要性が広く認識されている。 There are 70,000 compounds consisting of isoprene units such as terpenes, terpenoids, and carotenoids, but these biosynthetic enzymes have very low activity. The need for improvement is widely recognized.
しかし、いずれのテルペン・イソプレノイド合成でも、その生産物は無色かつ揮発性があり、テルペン・イソプレン合成酵素の活性を簡便に見る方法はなかった。HPLC、GC-MSなど、クロマトグラフィーを用いた方法を数万の変異体ライブラリを一つ一つ調べ、活性の高い変異体を取得した例がある（特許文献1）。テルペン・イソプレノイドの生合成酵素の改良のためには、ハイスループットな活性検出技術が必要である（非特許文献１）。 However, in any terpene / isoprenoid synthesis, the product was colorless and volatile, and there was no convenient way to see the activity of the terpene / isoprene synthase. There is an example in which tens of thousands of mutant libraries were examined one by one by a method using chromatography such as HPLC and GC-MS to obtain highly active mutants (Patent Document 1). In order to improve the biosynthetic enzyme of terpene isoprenoid, a high-throughput activity detection technique is required (Non-Patent Document 1).
本発明者らは以前、「基質消費」を可視化する方法を開発した（特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５）。これらは、「カロテノイド生合成経路をもつ大腸菌株を作製し、その細胞の中にテルペン合成酵素の遺伝子群を導入する」という方法である。テルペン酵素の活性が高いほど、同居するカロテノイド生合成経路から基質を奪うため、その基質消費力が高いものほどカロテノイド生合成量が減ることになる。結果として、コロニー色の薄いクローンを選抜することによって、活性の高いテルペン酵素変異体が得られた。
The present inventors have previously developed a method for visualizing "substrate consumption" (
真核生物などの持つイソプレノイド前駆体経路であるメバロン酸経路にも、培地添加できる中間体であるメバロン酸がある。メバロン酸を培地に入れすぎると、同じようにDMAPP（ジメチルアリル二リン酸）を過剰蓄積して細胞増殖阻害が起きることは、知られていた（非特許文献２）。最近、それを用いてイソプレン合成酵素を改良できた例も報告されている（非特許文献３）。この報告では、酵母内在のメバロン酸経路の律速酵素、HMG1の過剰発現によって増殖低下状態をつくり、その増殖回復をもとにイソプレン合成酵素（IspS）の活性変異体を取得している。ただしこの方法で得られる細胞毒性は大変低く、一晩で創り出せる細胞密度差はわずか2倍であった。スクリーニング・セレクション技術としては実用化は困難である。 The mevalonate pathway, which is an isoprenoid precursor pathway possessed by eukaryotes, also has mevalonic acid, which is an intermediate that can be added to the medium. It has been known that when mevalonic acid is added too much to the medium, DMAPP (dimethylallyl diphosphate) is similarly excessively accumulated and cell proliferation is inhibited (Non-Patent Document 2). Recently, there have been reports of cases in which isoprene synthase could be improved using it (Non-Patent Document 3). In this report, overexpression of HMG1, the rate-limiting enzyme of the mevalonate pathway in yeast, creates a growth-reduced state, and based on the recovery of growth, an active variant of isoprene synthase (IspS) is obtained. However, the cytotoxicity obtained by this method was very low, and the difference in cell density that could be created overnight was only double. It is difficult to put it into practical use as a screening selection technology.
イソプレン合成酵素の活性改良の例は、特許文献１のほかは、非特許文献３が報告されている。この論文では、F340L、I478V、A570Tの3つの活性変異が見出されており、このうちF340L+A570TのW-mutantsが最良とされていると報告されている。
しかし、本発明で得られた変異型イソプレン合成酵素は、先で報告された変異体とは明らかに構造が異なる。
In addition to
However, the mutant isoprene synthase obtained in the present invention has a distinctly different structure from the mutants reported above.
本発明は、変異型イソプレン合成酵素及びそのスクリーニング方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a mutant isoprene synthase and a screening method thereof.
本発明者らは鋭意検討した結果、ランダム変異を導入したイソプレン合成酵素遺伝子をジメチルアリルアルコール（DMAOH）のリン酸化活性を有する酵素の遺伝子を発現する細胞に導入し、DMAOH感受性を指標とする、変異型イソプレン合成酵素のスクリーニング方法を完成し、さらに該方法により変異型イソプレン合成酵素が得られることを確認して本発明を完成した。 As a result of diligent studies, the present inventors introduced an isoprene synthase gene into which a random mutation was introduced into a cell expressing a gene of an enzyme having a phosphorylating activity of dimethylallyl alcohol (DMAOH), and used DMAOH sensitivity as an index. The present invention was completed by completing a screening method for mutant isoprene synthase and confirming that a mutant isoprene synthase can be obtained by the method.
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．配列番号７で示されるアミノ酸配列における１位〜５２位にアミノ酸欠失を有し、並びに、２１８位、５８７位及び５９３位からなる群より選択される１、２又は３つの部位にアミノ酸置換を有することを特徴とする、変異型イソプレン合成酵素又はその誘導体。
２．前記変異型イソプレン合成酵素は、野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成量が高いことを特徴とする、前項１に記載の変異型イソプレン合成酵素又はその誘導体。
３．前記アミノ酸置換は、以下の群より選択される少なくとも１以上からなる前項１又は２に記載の変異型イソプレン合成酵素又はその誘導体、
H218R、T587A及びF593L。
４．前記アミノ酸置換は、以下の（１）又は（２）から選択される１からなる前項１〜３のいずれか１項に記載の変異型イソプレン合成酵素又はその誘導体、
（１）H218R、T587A、及び
（２）F593L。
５．配列番号７で示されるアミノ酸配列において、１位〜５２位にアミノ酸欠失を有し、並びに、H218R及びT587Aのアミノ酸置換を有することを特徴とする、変異型イソプレン合成酵素又はその誘導体。
６．配列番号７で示されるアミノ酸配列において、１位〜５２位にアミノ酸欠失を有し、並びに、F593Lのアミノ酸置換を有することを特徴とする、変異型イソプレン合成酵素又はその誘導体。
７．以下の（１）〜（７）のいずれか１である遺伝子からなる変異型イソプレン合成酵素遺伝子、
（１）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
（２）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（３）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（４）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
（５）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（６）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子、及び、
（７）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAと相同性が90%以上のDNAからなる遺伝子。
８．以下の（１）〜（３）のいずれか１であるアミノ酸配列からなる変異型イソプレン合成酵素、
（１）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性を有するアミノ酸配列、及び、
（３）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性を有するアミノ酸配列。
９．変異を導入したイソプレン合成酵素遺伝子ライブラリを、ジメチルアリルアルコールからジメチルアリル二リン酸を合成可能な細胞に導入し、該細胞の細胞増殖速度の増加又は低下を指標とする、変異型イソプレン合成酵素のスクリーニング方法。
１０．前記細胞の細胞増殖速度の増加が、ジメチルアリル二リン酸を基質とするイソプレン合成量の増加である、前項９に記載のスクリーニング方法。
１１．前記細胞の細胞増殖速度が、ジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度である、前項９又は１０に記載のスクリーニング方法。
１２．前記細胞が大腸菌である、前項９〜１１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
１３．前記細胞が配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子により形質転換された細胞である、前項９〜１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
１４．ジメチルアリルアルコールを、ジメチルアリルアルコールからジメチルアリル二リン酸を合成可能な細胞に導入又は添加する工程を含む、ジメチルアリル二リン酸を含む細胞の作製方法であって、
該細胞は変異型イソペンテニルホスフェートキナーゼにより形質転換された細胞であることを特徴とする作製方法。
１５．前記細胞は、野生型細胞と比較して、ジメチルアリル二リン酸を多く含むことを特徴とする前項１４に記載の作製方法。
That is, the present invention is as follows.
1. 1. There is an amino acid deletion at
2. The mutant isoprene synthase according to
3. 3. The mutant isoprene synthase or a derivative thereof according to
H218R, T587A and F593L.
4. The mutant isoprene synthase or a derivative thereof according to any one of the
(1) H218R, T587A, and (2) F593L.
5. A mutant isoprene synthase or a derivative thereof, which has an amino acid deletion at
6. A mutant isoprene synthase or a derivative thereof, which has an amino acid deletion at
7. A mutant isoprene synthase gene consisting of a gene according to any one of (1) to (7) below.
(1) A gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12.
(2) A polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12 in which 1 to 20 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to that of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate.
(3) Isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate, which has 90% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12 and is contained in a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. A gene encoding a polypeptide, which has substantially the same activity as the activity that produces
(4) A gene consisting of DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14.
(5) A poly that hybridizes under stringent conditions with a DNA having a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14, and has an amino acid sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate possessed by the peptide as a substrate.
(6) In the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14, a gene consisting of DNA in which 1 to 50 base sequences are substituted, deleted, inserted and / or added, and
(7) A gene consisting of DNA having 90% or more homology with the DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14.
8. A mutant isoprene synthase consisting of an amino acid sequence according to any one of (1) to (3) below.
(1) The amino acid sequence according to SEQ ID NO: 11 or 12,
(2) A polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12 in which 1 to 20 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. Amino acid sequence having an activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate, and
(3) Isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate, which has 90% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12 and is contained in a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. An amino acid sequence having the activity of producing.
9. A mutant isoprene synthase in which a mutant-introduced isoprene synthase gene library is introduced into a cell capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol, and an increase or decrease in the cell proliferation rate of the cell is used as an index. Screening method.
10. 9. The screening method according to item 9, wherein the increase in the cell proliferation rate of the cells is an increase in the amount of isoprene synthesized using dimethylallyl diphosphate as a substrate.
11. 9. The screening method according to
12. The screening method according to any one of items 9 to 11 above, wherein the cells are Escherichia coli.
13. The screening method according to any one of items 9 to 12 above, wherein the cell is a cell transformed with a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
14. A method for producing cells containing dimethylallyl diphosphate, which comprises a step of introducing or adding dimethylallyl alcohol to cells capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol.
A production method, wherein the cell is a cell transformed with mutant isopentenyl phosphate kinase.
15. The production method according to
本発明は、野生型イソプレン合成酵素と比較してイソプレン合成量が高い変異型イソプレン合成酵素並びに該酵素の変異体のスクリーニング方法を提供することができた。 The present invention has been able to provide a mutant isoprene synthase having a higher amount of isoprene synthesis than a wild-type isoprene synthase, and a method for screening a variant of the enzyme.
（本発明の概要）
本発明は、「変異型イソプレン合成酵素」、並びに「変異型イソプレン合成酵素のスクリーニング方法」に関する。
(Outline of the present invention)
The present invention relates to "mutant isoprene synthase" and "screening method for mutant isoprene synthase".
本発明は、イソプレン合成酵素の活性を改良するための方法、加えて、変異型イソプレン合成酵素（IspS）に関するものである。
本発明では、（１）異性体IPPの蓄積による毒性ではなくIspSの直接基質DMAPP（ジメチルアリル二リン酸）の蓄積による毒性回避をもとにしたセレクション系を確立して、（２）単独酵素で実現する前駆体供給経路であり、そして（３）基質過剰状態が内在経路ではなく、培地に添加する前駆体（DMAOH）の量によって変えることができたので、高活性の変異型IspSを効率的に取得できるスクリーニング方法を確立した。
本発明では、人工の一酵素で実現する低ステップ数（2ステップ）の酵素をつかってDMAPP過剰を創り出す。以下に示すように、この方式では、選択率1000〜10,000倍のセレクション・選抜系が簡単に実現する。さらに、その選択圧は培地添加するDMAOH溶液によって自由に設定できる。
The present invention relates to a method for improving the activity of isoprene synthase, as well as a mutant isoprene synthase (IspS).
In the present invention, a selection system is established based on (1) avoidance of toxicity due to accumulation of the direct substrate DMAPP (dimethylallyl diphosphate) of IspS rather than toxicity due to accumulation of isomer IPP, and (2) a single enzyme. It is a precursor supply pathway realized in, and (3) the substrate excess state can be changed by the amount of precursor (DMAOH) added to the medium, not by the intrinsic pathway, so that the highly active mutant IspS is efficient. We have established a screening method that can be obtained as a target.
In the present invention, a DMAPP excess is created by using an enzyme having a low number of steps (2 steps) realized by one artificial enzyme. As shown below, this method easily realizes a selection / selection system with a selection rate of 1000 to 10,000 times. Further, the selective pressure can be freely set by the DMAOH solution added to the medium.
また、本発明は、上記スクリーニング方法で使用する「大量のDMAPPを含む細胞の作製方法（細胞中のDMAOHのリン酸化によってDMAPP異常蓄積を引き起こす方法）」も対象とする。 The present invention also covers "a method for producing cells containing a large amount of DMAPP (a method for causing abnormal accumulation of DMAPP by phosphorylation of DMAOH in cells)" used in the above screening method.
（変異型イソプレン合成酵素又はその誘導体）
本発明の変異型イソプレン合成酵素又はその誘導体は、野生型イソプレン合成酵素と比較して、アミノ酸又は塩基が１以上異なる酵素を意味する。
野生型イソプレン合成酵素（IspS）は、Populus属等の植物で産出され、ジメチルアリル二リン酸（DAMPP）を基質としてイソプレンを生成する酵素として知られている。
特に、本発明の変異型イソプレン合成酵素又はその誘導体は、野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成量が高い（合成活性が高い）ことが好ましい。
また、本発明の誘導体とは、変異型イソプレン合成酵素の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体を対象とする。
なお、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体は、自体公知の方法で得ることができる。
また、本発明の変異体は、発現酵素の酵素活性、発現量又は安定性が高くなる変異体が好ましい。また基質特異性を高めるような変異体も好ましい。特に、酵素活性を高める変異体が好ましい。
本発明のスクリーニング方法では、変異体のライブラリ（野生型に置換、欠損、挿入及び／又は付加が導入された遺伝子ライブラリ）を作成し、そのライブラリから、その宿主において酵素活性、発現量又は安定性が高い変異体を取得することができる。
天然の細胞から抽出した遺伝子、作製したライブラリの遺伝子、化学合成遺伝子、ＰＣＲ増幅遺伝子など由来は問わない。本発明のスクリーニング方法は、発現する酵素の基質消費能を指標とするため、未同定の遺伝子もスクリーニングすることができる。
イソプレン合成酵素遺伝子（野生型に置換、欠損、挿入及び／又は付加が導入された遺伝子ライブラリ）の、ジメチルアリルアルコールからジメチルアリル二リン酸を合成可能な細胞への導入は、遺伝子組み換え技術で用いられている常法によることができる。例えば、ベクターにスクリーニング対象の遺伝子を組み込み、細胞を形質転換する等である。
(Mutant isoprene synthase or its derivative)
The mutant isoprene synthase of the present invention or a derivative thereof means an enzyme having one or more amino acids or bases different from that of wild-type isoprene synthase.
Wild-type isoprene synthase (IspS) is produced in plants of the genus Populus and is known as an enzyme that produces isoprene using dimethylallyl diphosphate (DAMPP) as a substrate.
In particular, the mutant isoprene synthase of the present invention or a derivative thereof preferably has a higher amount of isoprene synthesis (higher synthetic activity) than the wild-type isoprene synthase.
The derivative of the present invention is a protected derivative of mutant isoprene synthase, a modified sugar chain, an acylated derivative, or an acetylated derivative.
The protected derivative, sugar chain modified product, acylated derivative, or acetylated derivative can be obtained by a method known per se.
Further, the mutant of the present invention is preferably a mutant having high enzyme activity, expression level or stability of the expressing enzyme. Mutants that enhance substrate specificity are also preferred. In particular, mutants that enhance enzyme activity are preferred.
In the screening method of the present invention, a library of mutants (gene library into which substitutions, deletions, insertions and / or additions have been introduced into the wild type) is prepared, and the enzyme activity, expression level or stability in the host is prepared from the library. Can be obtained with high mutants.
The origin of genes extracted from natural cells, genes of the prepared library, chemically synthesized genes, PCR amplification genes, etc. does not matter. Since the screening method of the present invention uses the substrate consumption capacity of the expressed enzyme as an index, unidentified genes can also be screened.
The introduction of the isoprene synthase gene (a gene library into which a wild-type substitution, deletion, insertion and / or addition has been introduced) into cells capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol is used in gene recombination technology. It can be done according to the conventional method. For example, a gene to be screened is incorporated into a vector to transform cells.
本発明の変異型イソプレン合成酵素又はその誘導体は、Populus alba由来のイソプレン合成酵素（配列番号７）と比較して、アミノ酸配列に以下で示される変異を有する。
１位〜５２位の欠失、並びに、２１８位、５８７位及び／又は５９３位の置換。
また、本発明の変異型イソプレン合成酵素は、Populus alba由来のイソプレン合成酵素（配列番号７）と比較して、アミノ酸配列に以下で示される変異を有する。
M1-T52del、並びに、H218R、T587A及び／又はF593L。
The mutant isoprene synthase of the present invention or a derivative thereof has the mutation shown below in the amino acid sequence as compared with the isoprene synthase derived from Populus alba (SEQ ID NO: 7).
Deletions at positions 1-52 and substitutions at positions 218, 587 and / or 593.
In addition, the mutant isoprene synthase of the present invention has the following mutations in the amino acid sequence as compared with the isoprene synthase derived from Populus alba (SEQ ID NO: 7).
M1-T52del, and H218R, T587A and / or F593L.
本発明の変異型イソプレン合成酵素は、Populus alba由来のイソプレン合成酵素（配列番号７）と比較して、アミノ酸配列に以下のいずれか１で示される変異を有する。
（１）M1-T52del、H218R、T587A（配列番号１１）
（２）M1-T52del、F593L（配列番号１２）
The mutant isoprene synthase of the present invention has a mutation shown by any one of the following in the amino acid sequence as compared with the isoprene synthase derived from Populus alba (SEQ ID NO: 7).
(1) M1-T52del, H218R, T587A (SEQ ID NO: 11)
(2) M1-T52del, F593L (SEQ ID NO: 12)
本発明の変異型イソプレン合成酵素は、Populus alba由来のイソプレン合成酵素（配列番号７）と比較して、以下のいずれか１以上のアミノ酸変異を有することにより、Populus alba由来の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成量が高いことを下記の実施例で確認している。
（１）M1-T52del、H218R、T587A（配列番号１１）
（２）M1-T52del、F593L（配列番号１２）
The mutant isoprene synthase of the present invention has a wild isoprene synthase derived from Populus alba by having one or more of the following amino acid mutations as compared with the isoprene synthase derived from Populus alba (SEQ ID NO: 7). It is confirmed in the following examples that the amount of isoprene synthesis is higher than that of the above.
(1) M1-T52del, H218R, T587A (SEQ ID NO: 11)
(2) M1-T52del, F593L (SEQ ID NO: 12)
イソプレン合成量（イソプレン合成活性）が高いとは、Populus alba由来の野生型イソプレン合成酵素（配列番号７）と比較して、1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、2.0倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上、2.5倍以上、2.6倍以上、2.7倍以上、2.8倍以上、2.9倍以上、3.0倍以上、約4.0倍（以上）、約5.0倍（以上）、約6.0倍（以上）、約7.0倍（以上）、約8.0倍（以上）、約9.0倍（以上）、約10倍（以上）、約11倍（以上）、約12倍（以上）、約13倍（以上）、約14倍（以上）、約15倍（以上）、約16倍（以上）、約17倍（以上）、約18倍（以上）、約19倍（以上）、約20倍（以上）、約21倍（以上）、約22倍（以上）、約23倍（以上）、約24倍（以上）、約25倍（以上）、約26倍（以上）、約27倍（以上）、約28倍（以上）、約29倍（以上）、約30倍（以上）、約31倍（以上）、約35倍（以上）、約40倍（以上）のイソプレン合成量を例示することができる。 High isoprene synthesis amount (isoprene synthase activity) means 1.1 times or more, 1.2 times or more, 1.3 times or more, 1.4 times or more, 1.5 times that of wild-type isoprene synthase derived from Populus alba (SEQ ID NO: 7). Above, 2.0 times or more, 2.1 times or more, 2.2 times or more, 2.3 times or more, 2.4 times or more, 2.5 times or more, 2.6 times or more, 2.7 times or more, 2.8 times or more, 2.9 times or more, 3.0 times or more, about 4.0 times ( Approximately 5.0 times (or more), Approximately 6.0 times (or more), Approximately 7.0 times (or higher), Approximately 8.0 times (or higher), Approximately 9.0 times (or higher), Approximately 10 times (or higher), Approximately 11 times (or higher) ), Approximately 12 times (or more), Approximately 13 times (or more), Approximately 14 times (or more), Approximately 15 times (or more), Approximately 16 times (or more), Approximately 17 times (or more), Approximately 18 times (or more) , Approximately 19 times (or more), Approximately 20 times (or more), Approximately 21 times (or more), Approximately 22 times (or more), Approximately 23 times (or more), Approximately 24 times (or more), Approximately 25 times (or more), Approximately 26 times (or more), approximately 27 times (or more), approximately 28 times (or more), approximately 29 times (or more), approximately 30 times (or more), approximately 31 times (or more), approximately 35 times (or more), approximately A 40-fold (or more) isoprene synthesis amount can be exemplified.
（変異型イソプレン合成酵素遺伝子）
本発明の変異型イソプレン合成酵素遺伝子は、（１）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、（２）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（３）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（４）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、（５）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（６）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子、（７）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAと90%以上の相同性を有するDNAからなる遺伝子を、含む。
上記（１）の遺伝子は、好ましくは、本発明の変異型イソプレン合成酵素のスクリーニング方法から得られた変異型イソプレン合成酵素をコードする遺伝子である。該変異型イソプレン合成酵素は、ジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性を持つ。
上記（２）の遺伝子は、本発明の変異型イソプレン合成酵素に対して酵素活性を失わせない程度の変異を導入したポリペプチドをコードする遺伝子である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10,6487-6500, 1982）などを挙げることができる。変異したアミノ酸の数は、通常は、20アミノ酸以内であり、好ましくは10アミノ酸以内であり、更に好ましくは５アミノ酸以内であり、最も好ましくは3アミノ酸である。変異を導入したポリペプチドが酵素活性を保持しているかどうかは、例えば、変異を導入したポリペプチドをコードする遺伝子を大腸菌等に導入し、発現させ、その大腸菌等がジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成することができるかどうか調べることによりわかる。これらのアミノ酸の位置・部位に変異が導入されると酵素活性が失われる可能性が高いので、変異はこれらのアミノ酸以外のアミノ酸に導入されることが好ましい。
上記（２）、（３）及び／又は（５）の「配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と実質的同等の活性」とは、その活性程度が、配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列のジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と比較して強くても弱くてもよい。例えば、0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍の活性を例示することができる。
また、相同性は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the NationalCenter forBiological Information）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算することができる。
上記（３）の遺伝子は、配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列と90%以上、好ましくは93％以上、より好ましくは95％以上、更に好ましくは98％以上の相同性、最も好ましくは99％以上の相同性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。
上記（５）の遺伝子は、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる遺伝子である。この遺伝子における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の37℃でのハイブリダイゼーション及び1×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による37℃での洗浄処理といった条件であり、好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の42℃でのハイブリダイゼーション及び0.5×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理といった条件であり、更に好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の65℃でのハイブリダイゼーション及び0.2×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理といった条件である。ハイブリダイゼーションを利用することにより得られたDNAが、活性を有するポリペプチドをコードするかどうかは、例えば、そのDNAを大腸菌等に導入し、発現させ、その大腸菌等がジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成することができるかどうか調べることによりわかる。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、上記（４）の遺伝子（配列番号１３又は１４）と通常、高い相同性を有する。高い相同性とは、90％以上の相同性、好ましくは95％以上の相同性、更に好ましくは98％以上の相同性、最も好ましくは99％以上の相同性を指す。
上記（６）の遺伝子は、配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜20個、特に好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子である。
上記（７）の遺伝子は、配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAと90%以上、好ましくは93％以上、より好ましくは95％以上、更に好ましくは98％以上の相同性、最も好ましくは99％以上の相同性を有するDNAからなる遺伝子を、含む。
(Mutant isoprene synthase gene)
The mutant isoprene synthase gene of the present invention has 1 to 1 in (1) a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12, and (2) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. Twenty amino acids, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, most preferably 1 to 5, are substituted, deleted, inserted and / or added, and according to SEQ ID NO: 11 or 12. A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate contained in a polypeptide consisting of an amino acid sequence as a substrate, and (3) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. A polypeptide having 90% or more homology and having an activity substantially equivalent to the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. , (4) A gene consisting of the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14, (5) A DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14. A poly that hybridizes under stringent conditions and has an activity substantially equivalent to the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. A gene encoding a peptide, (6) a gene consisting of DNA in which 1 to 50 base sequences are substituted, deleted, inserted and / or added in the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14, ( 7) Contains a gene consisting of DNA having 90% or more homology with the DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14.
The gene (1) is preferably a gene encoding a mutant isoprene synthase obtained from the method for screening a mutant isoprene synthase of the present invention. The mutant isoprene synthase has an activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate.
The gene (2) above is a gene encoding a polypeptide in which a mutation is introduced into the mutant isoprene synthase of the present invention to the extent that the enzyme activity is not lost. Such mutations include artificial mutations as well as those that occur in nature. As a means for causing an artificial mutation, a site-directed mutagenesis method (Nucleic Acids Res. 10,6487-6500, 1982) and the like can be mentioned. The number of mutated amino acids is usually 20 amino acids or less, preferably 10 amino acids or less, more preferably 5 amino acids or less, and most preferably 3 amino acids. Whether or not the mutated polypeptide retains enzymatic activity is determined, for example, by introducing a gene encoding the mutated polypeptide into Escherichia coli or the like and expressing it, and the Escherichia coli or the like uses dimethylallyl diphosphate as a substrate. It can be found by examining whether isoprene can be produced as. When a mutation is introduced at the position / site of these amino acids, there is a high possibility that the enzyme activity is lost. Therefore, it is preferable that the mutation is introduced into an amino acid other than these amino acids.
Substantially equivalent to the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12 in (2), (3) and / or (5) above. The “activity” may be stronger or weaker than the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12 as a substrate. For example, 0.1 times, 0.2 times, 0.3 times, 0.4 times, 0.5 times, 0.6 times, 0.7 times, 0.8 times, 0.9 times, 1.0 times, 1.1 times, 1.2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2.0 times, 2.1 times, 2.2 times, 2.3 times, 2.4 times, 2.5 times, 2.6 times, 2.7 times, 2.8 times, 2.9 times, 3.0 times, 4.0 times, 5.0 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times , 50 times more active can be exemplified.
Homology can also be calculated using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the NationalCenter for Biological Information) and the like (eg, using default or default parameters).
The gene of (3) is 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12, most preferably 99. Contains a gene encoding a polypeptide having% or more homology.
The gene (5) above is a gene obtained by utilizing hybridization between DNAs. The "stringent condition" in this gene means a condition in which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur. Such conditions are usually conditions such as hybridization at 37 ° C. in a buffer solution containing 5 × SSC and 1% SDS and washing treatment at 37 ° C. with a buffer solution containing 1 × SSC and 0.1% SDS. , Preferably, hybridization at 42 ° C. in a buffer solution containing 5 × SSC and 1% SDS and washing treatment at 42 ° C. with a buffer solution containing 0.5 × SSC and 0.1% SDS, more preferably. , Hybridization at 65 ° C. in a buffer solution containing 5 × SSC, 1% SDS and washing treatment at 65 ° C. with a buffer solution containing 0.2 × SSC, 0.1% SDS. Whether or not the DNA obtained by utilizing hybridization encodes an active polypeptide is determined, for example, by introducing the DNA into Escherichia coli or the like and expressing it, and the Escherichia coli or the like uses dimethylallyl diphosphate as a substrate. It can be found by examining whether isoprene can be produced as. The DNA obtained by hybridization usually has high homology with the gene (SEQ ID NO: 13 or 14) of (4) above. High homology refers to 90% or more homology, preferably 95% or more homology, more preferably 98% or more homology, and most preferably 99% or more homology.
The gene of (6) is 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, and particularly preferably 1 to 10 in the DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14. , Most preferably a gene consisting of DNA in which 1 to 5 base sequences are substituted, deleted, inserted and / or added.
The gene (7) has 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more homology with the DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14. It preferably comprises a gene consisting of DNA having 99% or more homology.
（変異型イソプレン合成酵素）
本発明の変異型イソプレン合成酵素は、（１）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列、（２）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と実質的同等の活性を有するアミノ酸配列、（３）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と実質的同等の活性を有するアミノ酸配列を、含む。
なお、ペプチドの変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性又は免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸及び芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。
(Mutant isoprene synthase)
The mutant isoprene synthase of the present invention has 1 to 20, preferably 1 to 15, in (1) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12, and (2) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. , More preferably 1 to 10, most preferably 1 to 5 amino acids substituted, deleted, inserted and / or added, and dimethyl contained in the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. An amino acid sequence having substantially the same activity as the activity of producing isoprene using allyldiphosphate as a substrate, (3) having 90% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12, and having SEQ ID NO: An amino acid sequence having substantially the same activity as the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate contained in the polypeptide consisting of the amino acid sequence according to 11 or 12 is included.
From the viewpoint of not changing the basic properties (physical properties, function, physiological activity, immunological activity, etc.) of the peptide when introducing a mutation in the peptide, for example, homologous amino acids (polar amino acids, non-polar amino acids, etc.) Mutual substitutions between hydrophobic amino acids, hydrophilic amino acids, positively charged amino acids, negatively charged amino acids, aromatic amino acids, etc.) are easily assumed.
（本発明のスクリーニング方法）
本発明の変異型イソプレン合成酵素のスクリーニング方法は、変異型イソプレン合成酵素の探索を行うため、ジメチルアリルアルコール（DMAOH）からジメチルアリル二リン酸（DAMPP）を合成可能な細胞（好ましくはイソペンテニルホスフェートキナーゼ（IPK）を導入した細胞、より好ましくは変異型イソペンテニルホスフェートキナーゼを導入した大腸菌）に、変異型イソプレン合成酵素遺伝子（好ましくはイソプレン合成酵素遺伝子ライブラリ、特に、ランダム変異を導入したイソプレン合成酵素遺伝子ライブラリ）を導入し、該導入細胞の段階的濃度のジメチルアリルアルコール存在下（DMAOHが細胞内に存在すればどのような方法でもよい。例えば、DMAOHを細胞に添加する、DMAOHを培地に添加する等を例示することができる）における細胞増殖速度の増加又は低下（好ましくは細胞増殖の可否）を指標とする、変異型イソプレン合成酵素のスクリーニング方法に関する。
さらに、本発明は、該導入細胞の段階的濃度のジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度を、野生型イソプレン合成酵素を導入した細胞と比較して、細胞増殖速度が高い細胞（又は細胞増殖の停止に要するジメチルアリルアルコール濃度が高い細胞）を選抜することにより、野生型イソプレン合成酵素と比較して活性の高い変異型イソプレン合成酵素遺伝子のスクリーニング方法に関する。
さらに、本発明は、イソプレン合成酵素遺伝子ライブラリ、好ましくはランダム変異を導入したイソプレン合成酵素遺伝子ライブラリを導入して得られた２種以上のクローン由来細胞の段階的濃度のジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度を比較して、細胞増殖速度が少なくとも１の他のクローン由来細胞よりも高い細胞（又は細胞増殖の停止に要するジメチルアリルアルコール濃度が少なくとも１の他のクローン由来細胞よりも高い細胞）、好ましくは細胞増殖速度が１〜５番目に高い細胞、１〜１０番目に高い細胞若しくは１〜５０番目に高い細胞（又は細胞増殖の停止に要するジメチルアリルアルコール濃度が１〜５番目に高い細胞、１〜１０番目に高い細胞若しくは１〜５０番目に高い細胞）のうちいずれか１以上の細胞、より好ましくは細胞増殖速度が最も高い細胞（又は細胞増殖の停止に要するジメチルアリルアルコール濃度が最も高い細胞）を選抜することにより、イソプレン合成酵素遺伝子ライブラリ、好ましくはランダム変異を導入したイソプレン合成酵素遺伝子ライブラリ導入細胞の中で、イソプレン合成酵素活性の高い変異型イソプレン合成酵素遺伝子を得ることができるスクリーニング方法に関する。
(Screening method of the present invention)
In the screening method for the mutant isoprene synthase of the present invention, cells capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate (DAMPP) from dimethylallyl alcohol (DMAOH) (preferably isopentenyl phosphate) for searching for the mutant isoprene synthase. A mutant isoprene synthase gene (preferably an isoprene synthase gene library, particularly an isoprene synthase in which a random mutation is introduced) into a kinase (IPK) -introduced cell, more preferably a mutant isopentenyl phosphate kinase-introduced Escherichia coli). (Gene library) is introduced, and any method may be used as long as DMAOH is present in the cells in the presence of dimethylallyl alcohol at a gradual concentration of the introduced cells. For example, DMAOH is added to the cells, DMAOH is added to the medium. The present invention relates to a method for screening a mutant isoprene synthase, which uses an increase or decrease in the cell proliferation rate (preferably whether or not cell proliferation is possible) as an index.
Furthermore, the present invention compares the cell proliferation rate of the introduced cells in the presence of dimethylallyl alcohol at a gradual concentration to that of cells into which wild-type isoprene synthase has been introduced, and that of cells with a higher cell proliferation rate (or cell proliferation). The present invention relates to a method for screening a mutant isoprene synthase gene having higher activity than wild-type isoprene synthase by selecting cells (cells having a high concentration of dimethylallyl alcohol required for arrest).
Furthermore, the present invention is a cell in the presence of dimethylallyl alcohol at a gradual concentration of two or more clone-derived cells obtained by introducing an isoprene synthase gene library, preferably an isoprene synthase gene library into which a random mutation has been introduced. A cell having a higher cell growth rate than at least one other clone-derived cell (or a cell having a higher dimethylallyl alcohol concentration required to stop cell growth than at least one other clone-derived cell), comparing the growth rates. Preferably, cells having the 1st to 5th highest cell growth rate, 1st to 10th highest cells, or 1st to 50th highest cells (or cells having the 1st to 5th highest dimethylallyl alcohol concentration required to stop cell growth). One or more of the 1st to 10th highest cells or the 1st to 50th highest cells, more preferably the cell having the highest cell growth rate (or the highest concentration of dimethylallyl alcohol required to stop cell growth). By selecting cells), a screening capable of obtaining a mutant isoprene synthase gene having high isoprene synthase activity in isoprene synthase gene library, preferably isoprene synthase gene library-introduced cells into which random mutations have been introduced. Regarding the method.
（変異型イソペンテニルホスフェートキナーゼ）
野生型イソペンテニルホスフェートキナーゼ（IPK）は、Thermoplasma acidophilum属等の古細菌で産出され、イソペンテニル化合物の基本的な構成要素であるリン酸イソペンテニル（IP）またはリン酸ジメチルアリル（DMAP）を触媒して、イソペンテニル二リン酸（IPP）またはジメチルアリル二リン酸（DAMPP）を生成する。
同様に、IPKの3つのアミノ酸変異V73I、Y141V、K204Gを導入した変異型イソペンテニルホスフェートキナーゼは、ジメチルアリルアルコール（DMAOH、DMAともいう）のモノリン酸化活性を獲得し、DMAOHをDMAPに変換することが報告されている（LIU, Ying, et al. Scientific reports, 2016, 6: 24117.）。
本発明での「変異型イソペンテニルホスフェートキナーゼ」とは、ジメチルアリルアルコールの消費に関与する酵素（複数の酵素群も含む）である。特に、変異型イソペンテニルホスフェートキナーゼは、ジメチルアリルアルコール（DMAOH）を直接又は間接的にジメチルアリル二リン酸（DAMPP）に転換する作用を有すれば特に限定されない。
(Mutant isopentenyl phosphate kinase)
Wild isopentenyl phosphate kinase (IPK) is produced in paleontology such as Thermoplasma acidophilum and catalyzes isopentenyl phosphate (IP) or dimethylallyl phosphate (DMAP), which are the basic components of isopentenyl compounds. To produce isopentenyl diphosphate (IPP) or dimethylallyl diphosphate (DAMPP).
Similarly, mutant isopentenyl phosphate kinase introduced with the three amino acid mutations V73I, Y141V, and K204G of IPK acquires the monophosphorylation activity of dimethylallyl alcohol (also called DMAOH, DMA) and converts DMAOH to DMAP. Has been reported (LIU, Ying, et al. Scientific reports, 2016, 6: 24117.).
The "variant isopentenyl phosphate kinase" in the present invention is an enzyme (including a plurality of enzyme groups) involved in the consumption of dimethylallyl alcohol. In particular, the mutant isopentenyl phosphate kinase is not particularly limited as long as it has an action of directly or indirectly converting dimethylallyl alcohol (DMAOH) to dimethylallyl diphosphate (DAMPP).
（ジメチルアリルアルコールからジメチルアリル二リン酸を合成可能な細胞）
本発明での「ジメチルアリルアルコールからジメチルアリル二リン酸を合成可能な細胞」は、ジメチルアリルアルコールからジメチルアリル二リン酸を生合成することができる細胞であれば制限されない。天然の細胞でも、遺伝子組み換えにより形質転換されている細胞でもよい。遺伝子組み換え細胞は、遺伝子組み換えの操作に簡便な細胞である、大腸菌、枯草菌、酵母などが挙げられる。
(Cells capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol)
The "cell capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol" in the present invention is not limited as long as it is a cell capable of biosynthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol. It may be a natural cell or a cell transformed by genetic recombination. Examples of the recombinant cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast and the like, which are cells that are convenient for the operation of gene recombination.
（ジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度の増加又は低下）
本発明での「ジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度の増加又は低下」は、細胞におけるジメチルアリル二リン酸（DAMPP）を基質とするイソプレン合成活性が増加又は低下することによって、ジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度が増加又は低下することである。
すなわち、本発明のスクリーニング方法では、変異型イソプレン合成酵素遺伝子を導入したジメチルアリルアルコールからジメチルアリル二リン酸を合成可能な細胞のジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度（又は、ランダム変異を導入したイソプレン合成酵素遺伝子を導入したジメチルアリルアルコールからジメチルアリル二リン酸を合成可能な細胞におけるジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度）を指標として、変異型イソプレン合成酵素遺伝子を取得する。
また、本発明のスクリーニング方法では、変異型イソプレン合成酵素遺伝子を導入したジメチルアリルアルコールからジメチルアリル二リン酸を合成可能な細胞のジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度を、野生型イソプレン合成酵素遺伝子を導入したジメチルアリルアルコールからジメチルアリル二リン酸を合成可能な細胞におけるジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度と比較し、ジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度の増加した細胞を選択し、その細胞に導入された該遺伝子を野生型イソプレン合成酵素と比較して活性の高い変異型イソプレン合成酵素遺伝子であると決定する。
また、本発明のスクリーニング方法では、イソプレン合成酵素遺伝子ライブラリ、好ましくはランダム変異を導入したイソプレン合成酵素遺伝子ライブラリを導入して得られた２種以上のクローン由来のメチルアリルアルコールからジメチルアリル二リン酸を合成可能な細胞のジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度を比較し、ジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度の増加した（速い）細胞を選択し、その細胞に導入された該遺伝子をイソプレン合成酵素活性の高い変異型イソプレン合成酵素遺伝子であると決定する。
変異型イソプレン合成酵素のジメチルアリル二リン酸（DAMPP）を基質とするイソプレン合成活性が高いほど、ジメチルアリル二リン酸をより多く消費できるため、ジメチルアリル二リン酸による細胞増殖抑制作用をより打ち消すことができる。
したがって、変異型イソプレン合成酵素遺伝子を導入された、ジメチルアリルアルコール（DMAOH）からジメチルアリル二リン酸を合成可能な細胞は、イソプレン合成活性が高いほど、ジメチルアリルアルコール存在下における細胞増殖速度が増加し、より高い濃度のジメチルアリルアルコール存在下で細胞増殖できる。
(Increase or decrease cell proliferation rate in the presence of dimethylallyl alcohol)
The "increase or decrease in cell proliferation rate in the presence of dimethylallyl alcohol" in the present invention means the presence of dimethylallyl alcohol by increasing or decreasing the isoprene synthesis activity using dimethylallyl diphosphate (DAMPP) as a substrate in cells. The rate of cell proliferation underneath is increased or decreased.
That is, in the screening method of the present invention, the cell proliferation rate (or random mutation) of cells capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol into which the mutant isoprene synthase gene was introduced was introduced in the presence of dimethylallyl alcohol. A mutant isoprene synthase gene is obtained using the cell growth rate in the presence of dimethylallyl alcohol in cells capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol into which the isoprene synthase gene has been introduced as an index.
Further, in the screening method of the present invention, the cell proliferation rate of cells capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol into which a mutant isoprene synthase gene has been introduced is determined by determining the cell proliferation rate in the presence of dimethylallyl alcohol. Compared with the cell proliferation rate in the presence of dimethylallyl alcohol in cells capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol into which dimethylallyl alcohol was introduced, cells having an increased cell proliferation rate in the presence of dimethylallyl alcohol were selected and the cells were selected. The gene introduced into is determined to be a mutant isoprene synthase gene having high activity as compared with wild-type isoprene synthase.
Further, in the screening method of the present invention, dimethylallyl diphosphate is derived from methylallyl alcohol derived from two or more clones obtained by introducing an isoprene synthase gene library, preferably an isoprene synthase gene library into which a random mutation has been introduced. The cell proliferation rate of cells capable of synthesizing the gene was compared in the presence of dimethylallyl alcohol, cells having an increased (fast) cell proliferation rate in the presence of dimethylallyl alcohol were selected, and the gene introduced into the cell was synthesized into isoprene. It is determined to be a mutant isoprene synthase gene with high enzymatic activity.
The higher the isoprene synthase activity using the mutant isoprene synthase dimethylallyl diphosphate (DAMPP) as a substrate, the more dimethylallyl diphosphate can be consumed, so that the cell proliferation inhibitory effect of dimethylallyl diphosphate is further counteracted. be able to.
Therefore, in cells capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol (DMAOH) into which the mutant isoprene synthase gene has been introduced, the higher the isoprene synthase activity, the higher the cell proliferation rate in the presence of dimethylallyl alcohol. However, cells can proliferate in the presence of higher concentrations of dimethylallyl alcohol.
（DMAOHのリン酸化によって高濃度のDMAPP蓄積方法）
本発明では、ジメチルアリルアルコールからジメチルアリル二リン酸を合成可能な細胞にジメチルアリルアルコールを添加することにより、該細胞にDMAPPを高濃度に蓄積させる方法（多量のDMAPPを含む細胞の作製方法）も対象である。詳しくは、上記で述べたイソペンテニルホスフェートキナーゼ遺伝子（特に、変異型イソペンテニルホスフェートキナーゼ遺伝子）を細胞に導入し、さらにジメチルアリルアルコールを該細胞に導入すれば、高濃度のDMAPP蓄積が達成することができる。該細胞は、変異型イソペンテニルホスフェートキナーゼにより形質転換された細胞であることが好ましい。
さらに、該細胞は、野生型細胞と比較して、DMAPPを多く含むことを特徴としている。「DMAPPを多く含む」とは、野生型と比較して、1.05倍以上、1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、2.0倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上、2.5倍以上、2.6倍以上、2.7倍以上、2.8倍以上、2.9倍以上、3.0倍以上、約4.0倍（以上）、約5.0倍（以上）、約6.0倍（以上）、約7.0倍（以上）、約8.0倍（以上）、約9.0倍（以上）、約10倍（以上）、約11倍（以上）、約12倍（以上）、約13倍（以上）、約14倍（以上）、約15倍（以上）、約16倍（以上）、約17倍（以上）、約18倍（以上）、約19倍（以上）、約20倍（以上）、約21倍（以上）、約22倍（以上）、約23倍（以上）、約24倍（以上）、約25倍（以上）、約26倍（以上）、約27倍（以上）、約28倍（以上）、約29倍（以上）、約30倍（以上）、約31倍（以上）、約35倍（以上）、約40倍（以上）の細胞中のDMAPP量を例示することができる。
(High-concentration DMAPP accumulation method by phosphorylation of DMAOH)
In the present invention, by adding dimethylallyl alcohol to cells capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol, DMAPP is accumulated in the cells at a high concentration (method for producing cells containing a large amount of DMAPP). Is also the target. Specifically, if the above-mentioned isopentenyl phosphate kinase gene (particularly, the mutant isopentenyl phosphate kinase gene) is introduced into a cell and then dimethylallyl alcohol is introduced into the cell, a high concentration of DMAPP accumulation can be achieved. Can be done. The cells are preferably cells transformed with mutant isopentenyl phosphate kinase.
Furthermore, the cells are characterized by being rich in DMAPP as compared to wild-type cells. "Contains a lot of DMAPP" means 1.05 times or more, 1.1 times or more, 1.2 times or more, 1.3 times or more, 1.4 times or more, 1.5 times or more, 2.0 times or more, 2.1 times or more, 2.2 times compared to the wild type. Above, 2.3 times or more, 2.4 times or more, 2.5 times or more, 2.6 times or more, 2.7 times or more, 2.8 times or more, 2.9 times or more, 3.0 times or more, about 4.0 times (or more), about 5.0 times (or more), about 6.0 Double (or more), about 7.0 times (or more), about 8.0 times (or more), about 9.0 times (or more), about 10 times (or more), about 11 times (or more), about 12 times (or more), about 13 times (Or more), about 14 times (or more), about 15 times (or more), about 16 times (or more), about 17 times (or more), about 18 times (or more), about 19 times (or more), about 20 times (more than) Approx. 21 times (or more), Approx. 22 times (or more), Approx. 23 times (or more), Approx. 24 times (or more), Approx. 25 times (or more), Approx. ), Approximately 28 times (or more), approximately 29 times (or more), approximately 30 times (or more), approximately 31 times (or more), approximately 35 times (or more), approximately 40 times (or more) the amount of DMAPP in cells It can be exemplified.
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
［IPKmut発現株のDMAOH感受性］
１．発現系の構築
学名（Thermoplasma acidophilum）由来のIPKの遺伝子を大腸菌にコドン最適化したかたちで合成した（全長260アミノ酸、783-bases：配列番号６）。このとき、報告に従って、天然の配列からN末端の2個のアミノ酸「MM」を取り除き、17個のアミノ酸「MRGSHHHHHHTDPALRA」を付加し（M1-M2delinsMRGSHHHHHHTDPALRA）、3つのアミノ酸変異V73I、Y141V、K204Gを導入している。報告によれば、これらの変異の導入によって、DMAOHのモノリン酸活性を獲得する。これをJ23119-promoter下流に、制限酵素BamHI、XhoIによって挿入し、pJ211-J23119-IPKmutを得た（RBSスコアは2048に設定）（参考：LIU, Ying, et al. Scientific reports, 2016, 6: 24117.）。
プラスミドMAP（pJ211-J23119-IPKmut：配列番号１）を図１に示す。
[DMAOH sensitivity of IPK mut expression strain]
1. 1. Construction of expression system The IPK gene derived from the scientific name (Thermoplasma acidophilum) was synthesized in the form of codon-optimized Escherichia coli (total length 260 amino acids, 783-bases: SEQ ID NO: 6). At this time, according to the report, the two N-terminal amino acids "MM" were removed from the natural sequence, 17 amino acids "MRGSHHHHHHTDPALRA" were added (M1-M2delinsMRGSHHHHHHTDPALRA), and three amino acid mutations V73I, Y141V, and K204G were introduced. doing. Reportedly, the introduction of these mutations acquires the monophosphate activity of DMAOH. This was inserted downstream of J23119-promoter with restriction enzymes BamHI and XhoI to obtain pJ211-J23119-IPK mut (RBS score set to 2048) (Reference: LIU, Ying, et al. Scientific reports, 2016, 6) : 24117.).
The plasmid MAP (pJ211-J23119-IPK mut : SEQ ID NO: 1) is shown in FIG.
２．IPKmut変異体の発現株のDMAOH感受性（寒天培地）
pJ211-J23119-IPKmutを用いて大腸菌XL1 Blueを形質転換し、コロニーを形成させた。これをつつき、LB培地にて一晩培養したのち、希釈して300細胞相当をさまざまな濃度のジメチルアリルアルコール（DMAOH）を含むLB寒天培地に撒いた。37℃で24時間静置し、形成されたコロニーの数を数えた（図２）。
IPK変異体（IPKmut）を発現させた大腸菌は、それを発現しない株にくらべると、明らかに高いDMAOH感受性を示した。IPKmut発現株は、DMAOHを添加するとcfuが低下し、10 mM以上ではもはや生存率は0％となった（図２の青の線）。DMAOHそのものに毒性は少なく、IPK発現をしていない（かわりにGFPを発現させた）大腸菌は、20 mMまで添加してもコロニー数が減ることはなかった（図２の緑線）。
2. DMAOH-sensitive strains expressing the IPK mut mutant (agar medium)
Escherichia coli XL1 Blue was transformed with pJ211-J23119-IPK mut to form colonies. This was pecked, cultured overnight in LB medium, diluted, and equivalent to 300 cells were sprinkled on LB agar medium containing various concentrations of dimethylallyl alcohol (DMAOH). The cells were allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours, and the number of colonies formed was counted (Fig. 2).
Escherichia coli expressing the IPK mutant (IPK mut ) showed clearly higher DMAOH sensitivity than the strain not expressing it. In the IPK mut expression strain, cfu decreased when DMAOH was added, and the survival rate was no longer 0% above 10 mM (blue line in FIG. 2). The toxicity of DMAOH itself was low, and the number of colonies of Escherichia coli that did not express IPK (instead of expressing GFP) did not decrease even when added up to 20 mM (green line in FIG. 2).
３．IPKmut変異体の発現株のDMAOH感受性（液体培地）
DMAOH感受性が、液体培養系でも発現するかどうかを調べた（図３）。
詳しくは、PJ211-IPKmutを導入した大腸菌株（XL1 blue：図３の青線）とPJ211-emptyを導入した大腸菌株（図３の黄線）を、さまざまなDMAOH濃度のLB培地に入れて、37℃で12時間震盪培養した。それぞれの細胞密度（OD）を測定した。
液体培養系では、IPKmutの発現株の示すDMAPP感受性は、固体培地上よりもはるかに顕著であった。すなわち、わずか2 mMのDMAOH濃度で、細胞密度の増加は実質的には完全に停止している。この濃度では、IPKmutを発現していない対照株では、まったく増殖に影響がない。
3. 3. DMAOH-sensitive (liquid medium) of strains expressing the IPK mut mutant
It was investigated whether DMAOH sensitivity was also expressed in the liquid culture system (Fig. 3).
Specifically, the Escherichia coli strain introduced with PJ211-IPK mut (XL1 blue: blue line in Fig. 3) and the Escherichia coli strain introduced with PJ211-empty (yellow line in Fig. 3) were placed in LB medium having various DMAOH concentrations. , 37 ° C. for 12 hours with shaking culture. Each cell density (OD) was measured.
In the liquid culture system, the DMAPP sensitivity exhibited by the expression strain of IPK mut was much more remarkable than that on the solid medium. That is, at a DMAOH concentration of only 2 mM, the increase in cell density was virtually completely stopped. At this concentration, control strains that do not express IPK mut have no effect on growth.
４．IPKmut変異体の発現株のDMAOH感受性（固体培地）
本方法でおこすDMAPP過剰によって、どれほどの効率で細胞増殖を抑えられるかを調べるために、プレートに播く細胞の数を200〜200万までふって、各種濃度（0-20mM）におけるDMAOH添加での生菌数を調べた（図４）。
DMAOH濃度が高いほど、その生菌数が低下することを確認した。DMAOH濃度5 mM、10 mM、20 mMでの生菌数比は、それぞれ、DMAOHのない培地に比べ、555分の1,670分の1、20,000分の1であった。これはメバロン酸経路の強化がもたらす弱い制菌効果（菌密度が半減する）とは明らかに異なり、単純に計算して、1000〜20,000倍の濃縮効率である。
4. DMAOH-sensitive (solid medium) of strains expressing the IPK mut mutant
In order to investigate how efficiently cell proliferation can be suppressed by the DMAPP excess caused by this method, the number of cells seeded on the plate was increased to 2 to 2 million, and DMAOH was added at various concentrations (0-20 mM). The viable cell count was examined (Fig. 4).
It was confirmed that the higher the DMAOH concentration, the lower the viable cell count. The viable cell count ratios at DMAOH concentrations of 5 mM, 10 mM, and 20 mM were 1 / 1,670 and 1 / 20,000, respectively, as compared with the medium without DMAOH. This is clearly different from the weak bacteriostatic effect (halving the bacterial density) brought about by the enhancement of the mevalonate pathway, which is a concentration efficiency of 1000 to 20,000 times by simple calculation.
以上の実験によって、該発現株において、IPKmutを発現すると培地に添加したDMAOH濃度に応じて、漸進的にDMAPP濃度が高まることを確認した。すなわち、毒性の少ないDMAOHを出発物質として、IPKmutが2ステップのリン酸化によってDMAPPを過剰蓄積させることによって細胞の増殖が非常に効率よく止まることが明らかになった。このDMAPPの「異常蓄積」は、DMAPPを消費する強い酵素活性によってのみ解消される。より高い酵素活性をもつDMAPP消費酵素を持つ宿主細胞だけを選択的に増殖させることが可能になった。 Through the above experiments, it was confirmed that when IPK mut was expressed in the expression strain, the DMAPP concentration gradually increased according to the DMAOH concentration added to the medium. That is, it was clarified that using the less toxic DMAOH as a starting material, IPK mut excessively accumulates DMAPP by two-step phosphorylation, thereby stopping cell proliferation very efficiently. This "abnormal accumulation" of DMAPP is eliminated only by the strong enzymatic activity that consumes DMAPP. It has become possible to selectively proliferate only host cells having DMAPP consuming enzyme with higher enzyme activity.
本発明の方法の優れた点は、1) DMAOHを与えなければ、DMAPPの異常蓄積は起こらないことにある（その細胞毒性が常時発現しておらず、DMAOHというプロドラッグ添加してはじめて発揮される「条件付き」のものであること）、2）極めて高い増殖阻害効果（〜20,000倍）である。
本発明の方法は、IPP（イソプレン族骨格形成における付加ユニット）ではなく、DMAPP（イソプレン類の直接の原料）の消費活性をスクリーニングできる点で従来の方法とは異なり、さらにDMAOH添加によって3桁にもおよぶ生菌数低下を生み出すことができた。
The advantages of the method of the present invention are that 1) abnormal accumulation of DMAPP does not occur unless DMAOH is given (its cytotoxicity is not always expressed, and it is exhibited only when a prodrug called DMAOH is added. (It must be "conditional"), 2) It has an extremely high growth inhibitory effect (up to 20,000 times).
The method of the present invention is different from the conventional method in that it can screen the consumption activity of DMAPP (direct raw material of isoprenes) instead of IPP (additional unit in isoprene skeleton formation), and further, by adding DMAOH, it is reduced to 3 digits. It was possible to produce a significant decrease in the viable cell count.
［IspSの進化工学］
１．発現系の構築
Populus alba由来のIspS（全長595アミノ酸（1815-bases）（配列番号７）のN末端52アミノ酸を切除した573アミノ酸（M1-T52del）および終止コドン、計1722-bases）の遺伝子（配列番号１０）をPT5/LacO下流に、制限酵素BamHI、XhoIによって挿入した。RBScalculator（https://salislab.net/software/predict_rbs_calculator）によって計算されたRBSスコアは17,091であった。
プラスミドMAP（pT5/lacO-IspS：配列番号２）を図５に示す。
[IspS evolutionary engineering]
1. 1. Construction of expression system
Gene (SEQ ID NO: 10) of IspS derived from Populus alba (total length 595 amino acids (1815-bases) (SEQ ID NO: 7) with the N-terminal 52 amino acids removed, 573 amino acids (M1-T52del) and stop codons, total 1722-bases) Was inserted downstream of PT5 / LacO by restriction enzymes BamHI and XhoI. The RBS score calculated by the RBScalculator (https://salislab.net/software/predict_rbs_calculator) was 17,091.
The plasmid MAP (pT5 / lacO-IspS: SEQ ID NO: 2) is shown in FIG.
２．ライブラリ（第一世代）
IspS遺伝子をepPCR法によって増幅した。
反応条件は以下のとおりである。
テンプレートplamsid 量：5 ng/ 反応体積50 μL
PCRバッファNEB 10×Thermo Pol Reaction Buffer
dNTP濃度0.2 mM each、Mg濃度0.2 mM、Mn濃度10、20、および50 μM
NEB Taq DNA Polymerase、5 units
最終収量5000 ng、増幅率1000倍
プライマー配列1：Fwd：5-CTCGAAAATAATAAAGGGAAAATCAG-3（配列番号８）
プライマー配列2：Rev：5- GTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATA-3（配列番号９）
2. Library (1st generation)
The IspS gene was amplified by the epPCR method.
The reaction conditions are as follows.
Template plamsid amount: 5 ng / reaction volume 50 μL
dNTP concentration 0.2 mM each, Mg concentration 0.2 mM,
NEB Taq DNA Polymerase, 5 units
Primer sequence 2: Rev: 5- GTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATA-3 (SEQ ID NO: 9)
得られたDNAをゲル抽出、さらに精製して、以下の反応条件でベクターにライゲーションした。
vector：100 ng、insert：122 ng、反応体積10 μL
反応時間16時間、反応温度16℃、NEB T4 DNA Ligase、40 units
The obtained DNA was gel-extracted, further purified, and ligated into a vector under the following reaction conditions.
vector: 100 ng, insert: 122 ng,
Reaction time 16 hours, reaction temperature 16 ° C, NEB T4 DNA Ligase, 40 units
得られたLigation液を脱塩し、大腸菌株BW25113にエレクトポレーションした。コンピテントセル60 μLにSOC 1440 μL加えて37度で1hキュレーション培養した（総量1.5 mL）。うち10 μL（150分の1）をAgar Plateにまいた。残り1490 μLは40 mLのLBに希釈して一晩（12h）37度で震盪培養した。得られた菌体懸濁液のうち2 mLをミニプレップした。
翌日、寒天プレート上にMn10：196個、Mn20個：512、Mn50：396個のコロニーを得たことから、それぞれのライブラリサイズは、Mn10：2.9×104、Mn20：7.7×104、Mn50：5.9×104であると決定した。
The obtained Ligation solution was desalted and electorated to Escherichia coli strain BW25113. SOC 1440 μL was added to 60 μL of competent cells and cultured at 37 ° C for 1 h (total volume 1.5 mL). Of this, 10 μL (1/150) was sprinkled on the Agar Plate. The remaining 1490 μL was diluted to 40 mL LB and cultured overnight (12 h) at 37 ° C with shaking. 2 mL of the obtained bacterial cell suspension was miniprepped.
The next day, Mn10: 196, Mn20: 512, Mn50: 396 colonies were obtained on the agar plate, so the library sizes were Mn10: 2.9 × 10 4 , Mn20: 7.7 × 10 4 , Mn50: It was decided to be 5.9 × 10 4.
３．高活性クローンの選抜（1次スクリーニング）
得たIspSライブラリを、IPKmut発現株（pJ211-IPKmutを導入したXL1-Blue株）に導入した。具体的には、IspSライブラリplasmid 5 μLとコンピテントセル100 μLを混合し、氷上に15分静置した。SOC 1150 μLを加えて37度で1時間キュレーション培養した（総量1250 μL）。
プラスミドMAP（PJ211-pJ23119-IPKmut：配列番号３）を図６に示す。
得た形質転換体を、0mM、 12mM、 14 mM (0、 0.86 g/L、1.01 g/L）のDMAOHを含むLB-Agar Plate (9 cm直径）に、それぞれ、およそ500細胞/plates程度になるように播いた（それぞれ5枚ずつ播いたので、スクリーニングサイズは、それぞれおよそ2,500）。全スクリーニングサイズ：2500×2条件×3ライブラリ＝1.5×104であった。
37度で24h静置してコロニーを形成させた。表1に示すように、12 mM DMAOHを含むプレートからは12、 14 mM DMAOHを含むプレートでは1個のコロニーが生えてきた（一次スクリーニングのヒット率は：13÷1.5×104×100＝0.087%）。
3. 3. Selection of highly active clones (primary screening)
The obtained IspS library was introduced into an IPK mut expression strain (XL1-Blue strain into which pJ211-IPK mut was introduced). Specifically, 5 μL of the IspS library plasmid and 100 μL of competent cells were mixed and allowed to stand on ice for 15 minutes. SOC 1150 μL was added and curated at 37 ° C for 1 hour (total volume 1250 μL).
The plasmid MAP (PJ211-pJ23119-IPK mut : SEQ ID NO: 3) is shown in FIG.
The obtained transformants were placed on an LB-Agar Plate (9 cm diameter) containing 0 mM, 12 mM, and 14 mM (0, 0.86 g / L, 1.01 g / L) DMAOH to about 500 cells / plates, respectively. (Since 5 sheets were sown each, the screening size was about 2,500 each). The total screening size was 2500 × 2 conditions × 3 libraries = 1.5 × 10 4 .
It was allowed to stand at 37 degrees for 24 hours to form a colony. As shown in Table 1, 12 colonies grew from the plate containing 12 mM DMAOH, and 1 colony grew from the plate containing 14 mM DMAOH (the hit rate of the primary screening was: 13 ÷ 1.5 × 10 4 × 100 = 0.087). %).
４．セカンドスクリーニング
上記で得た合計13個のクローンを単離・ミニプレした。これらに制限酵素Hind IIIおよびEcoRIで処理して混入しているIPKmutプラスミドを選択切断した。単離した13個のクローンおよび野生型をそれぞれフレッシュなIPKmut発現株（pJ211-IPKmutを導入したXL1-Blue株）に再び導入した。
形質転換体を、0、11、12、13又は14 mol/LのDMAOHを含むLB-Agar Plate (9cm直径）に、それぞれ2000細胞/platesに播き、37度で24h静置してコロニーを形成させた。れぞれの変異体について、DMAOH（11、12、13、14 mM）含有培地上の生菌数比（対DMAOHを含まない培地）を図７に示す。
13個のうち9個（図中灰色で示すもの）は、野生型と比べて顕著なDMAOH耐性を示さなかった。しかし、4つの変異体を発現する株は、親（野生型、wt）よりも明らかに高いDMAOH耐性を示した（図７）。
4. Second screening A total of 13 clones obtained above were isolated and minipresed. The IPK mut plasmids contaminated with these were treated with restriction enzymes Hind III and Eco RI and selectively cleaved. The 13 isolated clones and wild-type strains were reintroduced into fresh IPK mut expression strains (XL1-Blue strain introduced with pJ211-IPK mut).
Transformants were seeded on LB-Agar Plates (9 cm diameter) containing 0, 11, 12, 13 or 14 mol / L DMAOH, respectively, at 2000 cells / plates and allowed to stand at 37 ° C for 24 hours to form colonies. I let you. For each mutant, the viable cell count ratio (medium without DMAOH) on the medium containing DMAOH (11, 12, 13, 14 mM) is shown in FIG.
Nine of the thirteen (shown in gray in the figure) did not show significant DMAOH resistance compared to the wild type. However, strains expressing the four mutants showed significantly higher DMAOH resistance than their parents (wild type, wt) (Fig. 7).
５．シーケンシング
上記で活性亢進と判断された4個（Mn10-12A、Mn10-12B、Mn20-12E、Mn50-12A）の配列を表2に示す。
5. Sequencing Table 2 shows the sequences of the four (Mn10-12A, Mn10-12B, Mn20-12E, Mn50-12A) that were judged to be hyperactive.
Mn10-12A、Mn50-12Aの2個はispSの構造遺伝子には変異が見出されなかったが、LacOに塩基置換が導入されていた。これらは、lacIへの親和性低下によって転写レベルが高まった「発現変異体」である。一方、発現変異体と考えづらい変異体は2個であった。そこに見出された変異の中にみつかったアミノ酸置換は、Mn10-12B（H218R、T587A）、Mn20-12E（F593L）にはアミノ酸置換が見つかった。これらは、構造（PDB 3N0G）上、図８の位置にMapされた。いずれも反応ポケットの中というよりは表面に位置する残基であった。 No mutations were found in the structural genes of ispS in Mn10-12A and Mn50-12A, but base substitutions were introduced into LacO. These are "expression mutants" whose transcriptional levels have increased due to reduced affinity for lacI. On the other hand, there were two mutants that were difficult to consider as expression mutants. As for the amino acid substitutions found in the mutations found there, amino acid substitutions were found in Mn10-12B (H218R, T587A) and Mn20-12E (F593L). These were mapped to the position shown in FIG. 8 on the structure (PDB 3N0G). All were residues located on the surface rather than in the reaction pocket.
６．プラスミドの載せ替え（発現系の変換）
Mn10-12BおよびMn20-12E酵素が、酵素活性が高い発現変異体ではなく、大腸菌活性を高める性質を有するかを調べるために、Reading Frameを、制限酵素BamHI、XhoIによって切り出し、lacOのない定常プロモータ（PT5）下流に載せ替えた。
プラスミドMAP（pT5-IspS：配列番号４）を図９に示す。
6. Transfection of plasmid (conversion of expression system)
To investigate whether the Mn10-12B and Mn20-12E enzymes are not expression mutants with high enzyme activity but have the property of enhancing E. coli activity, the Reading Frame was cut out with restriction enzymes BamHI and XhoI, and a stationary promoter without lacO. (PT5) It was replaced downstream.
The plasmid MAP (pT5-IspS: SEQ ID NO: 4) is shown in FIG.
７．GC-解析によるプロダクト特性の比較
pMEV-idi（配列番号５）によって前駆体供給路（メバロン酸経路）を導入した大腸菌株XL1 BlueにpT5-IspS(wt)、pT5-IspS(Mn10-12B)、pT5-IspS(Mn10-12E)を、それぞれ導入した。
プラスミドMAP（pMEV-idi）を図１０に示す。
7. Comparison of product characteristics by GC-analysis
PT5-IspS (wt), pT5-IspS (Mn10-12B), pT5-IspS (Mn10-12E) in Escherichia coli strain XL1 Blue into which a precursor supply pathway (mevalonate pathway) was introduced by pMEV-idi (SEQ ID NO: 5). Was introduced respectively.
The plasmid MAP (pMEV-idi) is shown in FIG.
７−１．ドデカン上層解析
こうして得られた形質転換体のイソプレン生産能を測定した。具体的には、形質転換体（OD2のプレ培液を50 μL：5×107cells相当）を5 mLのTB培地に植菌し、培地体積の5分の1のドデカン（1 mL）を培地に上層したのち、37度で24時間震盪培養した。その後、ドデカン（0.25 mL）を回収し、うち0.5 μL（1/500: 培地上層したドデカン総量の1/2000）をGC-FIDにインジェクトした。
GC分析条件：Rtx-5（Shimadzu）、オーブン温度250℃
昇温プロトコル35℃5min、30℃/minで150℃、20℃/minで200℃まで昇温した。
Mn10-12B、Mn20-12Eを発現する大腸菌は、ともにIspS(wt)を発現する大腸菌よりも高いイソプレン生産量を示した（図１１）。
7-1. Dodecane upper layer analysis The isoprene-producing ability of the transformant thus obtained was measured. Specifically, a transformant (50 μL of OD2 preculture solution equivalent to 5 × 10 7 cells) was inoculated into 5 mL of TB medium, and dodecane (1 mL), which was 1/5 of the medium volume, was added. After layering on the medium, the cells were shake-cultured at 37 ° C for 24 hours. Then, dodecane (0.25 mL) was recovered, of which 0.5 μL (1/500: 1/2000 of the total amount of dodecane layered on the medium) was injected into the GC-FID.
GC analysis conditions: Rtx-5 (Shimadzu), oven temperature 250 ° C
Temperature temperature protocol The temperature was raised to 150 ° C at 35 ° C for 5 min and 30 ° C / min, and to 200 ° C at 20 ° C / min.
Escherichia coli expressing Mn10-12B and Mn20-12E both showed higher isoprene production than Escherichia coli expressing IspS (wt) (Fig. 11).
７−２．ヘッドスペース解析
顕著な活性を示したMn10-12B変異体について、上記とは異なる培養・測定プロトコルで再評価した。具体的には、形質転換体（OD〜2のプレ培液を100 μL：1×108 cells相当）を50 mLのフラスコ内の10 mL TB培地に植菌し、30度で48時間震盪培養した。培養中は、一貫して、フラスコはアルミホイルと輪ゴムで硬く縛り気密状態を保持した。その後、それぞれのサンプルのヘッドスペース部の空気を10 mL分、ガス採取器（NeedlEx、信和化工）で回収した。回収気体から、固相吸着材に吸着した成分を、GC-FIDにインジェクトした。
GC分析条件： Rtx-5（Shimadzu）、オーブン温度250℃
昇温プロトコル：30℃ 5min、20℃/minで200℃まで昇温した。
結果を図１２に示す。
Mn10-12Bを発現する大腸菌は、IspS(wt)を発現する大腸菌よりも高いイソプレン生産量を示した（図１２）。
以上の結果から、IPKmutによるDMAOHのリン酸化が与えるDMAPPの過剰蓄積からのレスキュー能を指標とすることによって、活性の高い変異型イソプレン合成酵素が得られた。
7-2. Headspace analysis Mn10-12B mutants that showed remarkable activity were re-evaluated using a culture / measurement protocol different from the above. Specifically, the transformant (100 μL of OD-2 preculture solution equivalent to 1 × 10 8 cells) was inoculated into a 10 mL TB medium in a 50 mL flask and cultured with shaking at 30 ° C. for 48 hours. bottom. During culturing, the flask was consistently tied tightly with aluminum foil and rubber bands to maintain airtightness. Then, 10 mL of air in the headspace of each sample was collected with a gas sampler (NeedlEx, Shinwa Kako). From the recovered gas, the components adsorbed on the solid phase adsorbent were injected into the GC-FID.
GC analysis conditions: Rtx-5 (Shimadzu), oven temperature 250 ° C
Temperature temperature protocol: The temperature was raised to 200 ° C at 30 ° C for 5 min and 20 ° C / min.
The results are shown in FIG.
Escherichia coli expressing Mn10-12B showed higher isoprene production than Escherichia coli expressing IspS (wt) (Fig. 12).
From the above results, a highly active mutant isoprene synthase was obtained by using the rescue ability from the excessive accumulation of DMAPP given by phosphorylation of DMAOH by IPK mut as an index.
８．DMAOH抵抗性の進化
得られた変異体プラスミドをIPKmut発現させた大腸菌XL1 Blueに導入し、そのDMAOH感受性を調べた（図１３）。変異体は、野生型よりも明らかに高いDMAOH抵抗性を示した。再び、IPKmut発現株の、DMAOH感受性をしらべた。DMAOHの添加量に従って細胞の生存能力は急速に落ちてゆき、この発現系の場合、5 mMのDMAOHで完全に死滅した（図１３濃青線）、野生型IspSの発現している株は、DMAPPの除去活性を持っているので、生存性は高まる（図１３薄青線）。そして今回得られた変異体は（図１３紫・赤線）を発現する株は、明らかにDMAOH耐性を獲得しており、これらの高いDMAOH消費活性（イソプレン合成活性：図１３）を反映している。
活性変異体でも、さらに多くのDMAOHを与えると、細胞増殖は止まってしまう（IC99〜12mM）。DMAOH=12 mMに設定すれば、この変異体を親（出発点）にして、より活性の高い2nd generation変異体が得られる。
8. Evolution of DMAOH resistance The obtained mutant plasmid was introduced into Escherichia coli XL1 Blue expressing IPK mut , and its DMAOH sensitivity was examined (Fig. 13). The mutant showed significantly higher DMAOH resistance than the wild type. Again, the DMAOH susceptibility of the IPK mut expression strain was examined. The viability of the cells declined rapidly according to the amount of DMAOH added, and in the case of this expression system, the strain expressing wild-type IspS was completely killed by 5 mM DMAOH (dark blue line in FIG. 13). Since it has the activity of removing DMAPP, its survivability is enhanced (Fig. 13, light blue line). The mutants obtained this time clearly acquired DMAOH resistance in the strains expressing (Fig. 13, purple / red line), reflecting their high DMAOH consumption activity (isoprene synthesis activity: Fig. 13). There is.
Even with active mutants, cell proliferation ceases when more DMAOH is given (IC99-12 mM). If DMAOH = 12 mM is set, this mutant can be used as a parent (starting point) to obtain a more active 2nd generation mutant.
本発明は、野生型イソプレン合成酵素と比較してイソプレン合成量が高い変異型イソプレン合成酵素並びに該酵素の変異体のスクリーニング方法を提供することができる。 The present invention can provide a mutant isoprene synthase having a higher amount of isoprene synthesis than a wild-type isoprene synthase, and a method for screening a variant of the enzyme.
Claims (15)
There is an amino acid deletion at positions 1 to 52 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and amino acid substitutions are made at 1, 2 or 3 sites selected from the group consisting of positions 218, 587 and 593. A mutant isoprene synthase or a derivative thereof, which is characterized by having.
The mutant isoprene synthase according to claim 1, wherein the mutant isoprene synthase has a higher amount of isoprene synthesis as compared with a wild-type isoprene synthase.
H218R、T587A及びF593L。
The mutant isoprene synthase or a derivative thereof according to claim 1 or 2, wherein the amino acid substitution comprises at least one selected from the following group.
H218R, T587A and F593L.
（１）H218R、T587A、及び
（２）F593L。
The mutant isoprene synthase or a derivative thereof according to any one of claims 1 to 3, wherein the amino acid substitution comprises 1 selected from the following (1) or (2).
(1) H218R, T587A, and (2) F593L.
A mutant isoprene synthase or a derivative thereof, which has an amino acid deletion at positions 1 to 52 and amino acid substitutions of H218R and T587A in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
A mutant isoprene synthase or a derivative thereof, which has an amino acid deletion at positions 1 to 52 and an amino acid substitution of F593L in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
（１）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
（２）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（３）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（４）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
（５）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（６）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子、及び、
（７）配列番号１３又は１４に記載の塩基配列からなるDNAと相同性が90%以上のDNAからなる遺伝子。
A mutant isoprene synthase gene consisting of a gene according to any one of (1) to (7) below.
(1) A gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12.
(2) A polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12 in which 1 to 20 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to that of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate.
(3) Isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate, which has 90% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12 and is contained in a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. A gene encoding a polypeptide, which has substantially the same activity as the activity that produces
(4) A gene consisting of DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14.
(5) A poly that hybridizes under stringent conditions with a DNA having a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14, and has an amino acid sequence consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to the activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate possessed by the peptide as a substrate.
(6) In the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14, a gene consisting of DNA in which 1 to 50 base sequences are substituted, deleted, inserted and / or added, and
(7) A gene consisting of DNA having 90% or more homology with the DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 14.
（１）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性を有するアミノ酸配列、及び、
（３）配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号１１又は１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するジメチルアリル二リン酸を基質としてイソプレンを生成する活性を有するアミノ酸配列。
A mutant isoprene synthase consisting of an amino acid sequence according to any one of (1) to (3) below.
(1) The amino acid sequence according to SEQ ID NO: 11 or 12,
(2) A polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12 in which 1 to 20 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. Amino acid sequence having an activity of producing isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate, and
(3) Isoprene using dimethylallyl diphosphate as a substrate, which has 90% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12 and is contained in a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12. An amino acid sequence having the activity of producing.
A mutant isoprene synthase in which a mutant-introduced isoprene synthase gene library is introduced into a cell capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol, and an increase or decrease in the cell proliferation rate of the cell is used as an index. Screening method.
The screening method according to claim 9, wherein the increase in the cell proliferation rate of the cells is an increase in the amount of isoprene synthesized using dimethylallyl diphosphate as a substrate.
The screening method according to claim 9 or 10, wherein the cell proliferation rate of the cells is the cell proliferation rate in the presence of dimethylallyl alcohol.
The screening method according to any one of claims 9 to 11, wherein the cells are Escherichia coli.
The screening method according to any one of claims 9 to 12, wherein the cell is a cell transformed with a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
該細胞は変異型イソペンテニルホスフェートキナーゼにより形質転換された細胞であることを特徴とする作製方法。
A method for producing cells containing dimethylallyl diphosphate, which comprises a step of introducing or adding dimethylallyl alcohol to cells capable of synthesizing dimethylallyl diphosphate from dimethylallyl alcohol.
A production method, wherein the cell is a cell transformed with mutant isopentenyl phosphate kinase.
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