JP2021136867A5 - - Google Patents
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Claims (19)
- 以下の工程を含む酵素活性のスクリーニング方法:
(1)酵素Eの全部又は一部をコードする遺伝子配列及びアクチュエーターAをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異、挿入、及び/又は欠失を導入して得られた酵素EとアクチュエーターAの融合変異体の核酸ライブラリ、並びに、アクチュエーターAによって制御されるプロモータPをコードする遺伝子配列及び該プロモータPと機能的に連結されたレポーターRをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(2)代謝物Mを(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、及び
(3)前記アクチュエータAの制御下にあるレポーターRの発現量を指標として、酵素E変異体を選抜する工程。
- さらに、上記(3)で選抜した酵素E変異体の変異箇所を同定する工程を含む、請求項1に記載の酵素活性のスクリーニング方法。
- 前記(3)において、前記酵素E変異体のレポーターRのM濃度依存的な変化量が野生型酵素EのレポーターRのM濃度依存的な変化量と比較して高い場合には、酵素E変異体は野生型酵素Eよりも酵素活性又は基質親和性が高いと判定する工程を含む、請求項1又は2に記載の酵素活性のスクリーニング方法。
- 以下の工程を含む野生型酵素Eよりも酵素活性又は基質親和性が高い酵素E変異体の構造の決定方法;
(1)酵素Eの全部又は一部をコードする遺伝子配列及びアクチュエータAをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異、挿入、及び/又は欠失を導入して得られた酵素EとアクチュエーターAの融合変異体の核酸ライブラリ、並びに、アクチュエーターAによって制御されるプロモータPをコードする遺伝子配列及び該プロモータPと機能的に連結されたレポーターRをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(2)代謝物Mを(1)の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
(3)前記アクチュエーターAの制御下にあるレポーターRの発現量を指標として、酵素E変異体を選抜する工程、
(4)前記(3)において、前記酵素E変異体のレポーターRの濃度依存的な変化量が野生型酵素EのレポーターRの濃度依存的な変化量と比較して高い場合には、酵素E変異体は野生型酵素Eよりも酵素活性が高いと判定する工程、及び
(5)上記(4)で酵素活性が高いと判定した酵素E変異体の変異箇所を同定する工程。
- 請求項4の(5)で同定した酵素E変異体の配列を基にして、酵素E変異体の作製方法。
- 請求項5の作製方法で得られた酵素E変異体の使用方法。
- 以下の(1)~(7)のいずれか1のアミノ酸配列又は遺伝子で特定されるCODM変異体:
(1)配列番号51で示されるアミノ酸配列において、121位及び346位にアミノ酸置換を有する、
(2)配列番号51で示されるアミノ酸配列において、Q121LおよびR346Hのアミノ酸置換を有する、
(3)配列番号51で示されるアミノ酸配列において、Q121L又はR346Hのアミノ酸置換を有し、かつ、上記(2)と実質的同等のデバイン及び/又はコデイン検出活性を有する、(4)配列番号51で示されるアミノ酸配列において、Q121L及びR346Hのアミノ酸置換を有し、さらに、121位及び346位以外の箇所において、1~20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ上記(2)と実質的同等のデバイン及び/又はコデイン検出活性を有する、
(5)配列番号51で示されるアミノ酸配列において、Q121L及びR346H のアミノ酸置換を有し、配列番号51に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記(2)と実質的同等のデバイン及び/又はコデイン検出活性を有する、
(6)上記(2)のアミノ酸配列において、1~20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ上記(2)と実質的同等のデバイン及び/又はコデイン検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び
(7)上記(2)のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記(2)と実質的同等のデバイン及び/又はコデイン検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
- デバイン及び/又はコデイン検出用である、請求項7に記載のCODM変異体。
- 以下の(1)~(7)のいずれか1のアミノ酸配列又は遺伝子で特定されるIDI変異体:
(1)配列番号76で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか1で表される位置でアミノ酸置換を有する、
〇19
〇28、19
〇66、82、28、19
〇85、82、28、19
(2)配列番号76で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか1で表されるアミノ酸置換を有する、
〇L19P
〇D28H、L19P
〇V66A、G82C、D28H、L19P
〇R85C、G82C、D28H、L19P
(3)配列番号76で示されるアミノ酸配列において、R85C、V66A、G82C、D28H及びL19Pから選ばれる2、3、4又は5のアミノ酸置換を有し、かつ、上記(2)と実質的同等のメバロン酸検出活性を有する、
(4)配列番号76で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか1で表されるアミノ酸置換を有し、さらに、85、66、82、28及び19以外の箇所において、1~20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ上記(2)と実質的同等のメバロン酸検出活性を有する、
〇L19P
〇D28H、L19P
〇V66A、G82C、D28H、L19P
〇R85C、G82C、D28H、L19P
(5)配列番号76で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか1で表されるアミノ酸置換を有し、配列番号76に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記(2)と実質的同等のメバロン酸検出活性を有する、
〇L19P
〇D28H、L19P
〇V66A、G82C、D28H、L19P
〇R85C、G82C、D28H、L19P
(6)上記(2)のアミノ酸配列において、1~20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ上記(2)と実質的同等のメバロン酸検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び
(7)上記(2)のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記(2)と実質的同等のメバロン酸検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
- ジメチル2リン酸(DMAOH)又はイソペンテニル2リン酸(IOH)検出用である、請求項9に記載のIDI変異体変異体。
- 以下の(1)~(11)のいずれか1のアミノ酸配列又は遺伝子で特定されるLuxR変異体:
(1)配列番号11で示されるアミノ酸配列において、N86K及びC245Wのアミノ酸置換を有し、さらに、33位及び57位にアミノ酸置換を有する、
(2)配列番号11で示されるアミノ酸配列において、N86K及びC245Wのアミノ酸置換を有し、さらに、T33A及びS57Tのアミノ酸置換を有する、
(3)配列番号11で示されるアミノ酸配列において、N86K、C245W 、T33A及びS57Tから選択される3又は4のアミノ酸置換を有し、かつ、上記(2)と実質的同等の転写亢進活性又はAHL検出感度を有する、
(4)配列番号11で示されるアミノ酸配列において、N86K、C245W 、T33A及びS57Tのアミノ酸置換を有し、さらに、86位、245位、33位及び57位以外の箇所において、1~20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ上記(2)と実質的同等の転写亢進活性又はAHL検出感度を有する、
(5)配列番号11で示されるアミノ酸配列において、N86K、C245W 、T33A及びS57Tのアミノ酸置換を有し、配列番号11に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記(2)と実質的同等の転写亢進活性又はAHL検出感度を有する、
(6)上記(2)のアミノ酸配列において、1~20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ上記(2)と実質的同等の転写亢進活性又はAHL検出感度を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
(7)上記(2)のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記(2)と実質的同等の転写亢進活性又はAHL検出感度を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
(8)配列番号77に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
(9)配列番号77に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記(2)と実質的同等の転写亢進活性又はAHL検出感度を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
(10)配列番号77に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1~50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び/又は付加されているDNAからなる遺伝子、及び
(11)配列番号77に記載の塩基配列からなるDNAと相同性が90%以上のDNAからなる遺伝子。
- 前記LuxR変異体は、野生型LuxRと比較して、転写亢進活性又はAHL検出感度が高いことを特徴とする請求項11に記載のLuxR変異体。
- 以下の(1)~(11)のいずれか1のアミノ酸配列又は遺伝子で特定されるLuxR変異体:
(1)配列番号11で示されるアミノ酸配列において、N86K、C245W 、T33A及びS57Tのアミノ酸置換を有し、さらに、42位、93位、99位及び100位にアミノ酸置換を有する、
(2)配列番号11で示されるアミノ酸配列において、N86K、C245W 、T33A及びS57Tのアミノ酸置換を有し、さらに、L42S、N93K、N99D及びN100Sのアミノ酸置換を有する、
(3)配列番号11で示されるアミノ酸配列において、N86K、C245W 、T33A、S57T及び L42S、N93K、N99D及びN100Sから選択される5、6、7又は8のアミノ酸置換を有し、かつ、上記(2)と実質的同等の転写亢進活性を有する、
(4)配列番号11で示されるアミノ酸配列において、86K、C245W 、T33A、S57T及び L42S、N93K、N99D及びN100Sのアミノ酸置換を有し、さらに、86位、245位、33位、57位、42位、93位、99位及び100位以外の箇所において、1~20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ上記(2)と実質的同等の転写亢進活性を有する、
(5)配列番号11で示されるアミノ酸配列において、86K、C245W 、T33A、S57T及び L42S、N93K、N99D及びN100Sのアミノ酸置換を有し、配列番号11に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記(2)と実質的同等の転写亢進活性を有する、
(6)上記(2)のアミノ酸配列において、1~20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ上記(2)と実質的同等の転写亢進活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
(7)上記(2)のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記(2)と実質的同等の転写亢進活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
(8)配列番号78に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
(9)配列番号78に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記(2)と実質的同等の転写亢進活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
(10)配列番号78に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1~50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び/又は付加されているDNAからなる遺伝子、及び
(11)配列番号78に記載の塩基配列からなるDNAと相同性が90%以上のDNAからなる遺伝子。
- 前記LuxR変異体は、AHL非添加条件下で転写亢進活性を有することを特徴とする請求項13に記載のLuxR変異体。
- 以下の(1)~(7)のいずれか1のアミノ酸配列又は遺伝子で特定されるCOR変異体:
(1)配列番号50で示されるアミノ酸配列において、11位及び276位にアミノ酸置換を有する、
(2)配列番号50で示されるアミノ酸配列において、S11G及びF276Y のアミノ酸置換を有する、
(3)配列番号50で示されるアミノ酸配列において、S11G又はF276Yのアミノ酸置換を有し、かつ、上記(2)と実質的同等のレチクリン検出活性を有する、
(4)配列番号50で示されるアミノ酸配列において、S11G及びF276Yのアミノ酸置換を有し、さらに、11位及び276位以外の箇所において、1~20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ上記(2)と実質的同等のレチクリン検出活性を有する、
(5)配列番号50で示されるアミノ酸配列において、S11G及びF276Y のアミノ酸置換を有し、配列番号50に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記(2)と実質的同等のレチクリン検出活性を有する、
(6)上記(2)のアミノ酸配列において、1~20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ上記(2)と実質的同等のレチクリン検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び
(7)上記(2)のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記(2)と実質的同等のレチクリン検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
- レチクリン検出用である、請求項15に記載のCOR変異体。
- 以下の(1)~(7)のいずれか1のアミノ酸配列又は遺伝子で特定されるDXR変異体:
(1)配列番号75で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか1で表される位置でアミノ酸置換を有する、
〇111、297
〇120、144、283、295
〇362
〇58、118、279
〇15、254、362
〇279
〇362
(2)配列番号75で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか1で表されるアミノ酸置換を有する、
〇L111F、L297P
〇I120T、A144E、T283S、K295R
〇S362T
〇D58H、K118R、P279T
〇C15R、S254T、S362T
〇P279T
〇S362T
(3)配列番号75で示されるアミノ酸配列において、C15R、D58H、L111F、I120T、K118R、A144E、P279T、L297P、T283S、K295R、S362T及びS254Tから選ばれる2、3、4,5,6,7,8,9、10、11又は12のアミノ酸置換を有し、かつ、上記(2)と実質的同等のDOXP検出活性を有する、
(4)配列番号75で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか1で表されるアミノ酸置換を有し、さらに、15、58、111、120、118、144、279、297、283、295、362及び254以外の箇所において、1~20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ上記(2)と実質的同等のDOXP検出活性を有する、
〇L111F、L297P
〇I120T、A144E、T283S、K295R
〇S362T
〇D58H、K118R、P279T
〇C15R、S254T、S362T
〇P279T
〇S362T
(5)配列番号75で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか1で表されるアミ
ノ酸置換を有し、配列番号75に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上
記(2)と実質的同等のDOXP検出活性を有する、
〇L111F、L297P
〇I120T、A144E、T283S、K295R
〇S362T
〇D58H、K118R、P279T
〇C15R、S254T、S362T
〇P279T
〇S362T
(6)上記(2)のアミノ酸配列において、1~20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び/又は付加しており、かつ上記(2)と実質的同等のDOXP検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び
(7)上記(2)のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記(2)と実質的同等のDOXP検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
- DOXP検出用である、請求項17に記載のDXR変異体。
- 前記アクチュエーターAは、請求項11~14のいずれか1に記載のLuxR変異体である請求項1~3のいずれか1に記載のスクリーニング方法。
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