JP2021136867A5

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Publication number: JP2021136867A5
Application number: JP2020034548A
Authority: JP
Filing date: 2020-02-29
Publication date: 2023-05-29

Claims

以下の工程を含む酵素活性のスクリーニング方法：
（１）酵素Ｅの全部又は一部をコードする遺伝子配列及びアクチュエーターＡをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異、挿入、及び／又は欠失を導入して得られた酵素ＥとアクチュエーターＡの融合変異体の核酸ライブラリ、並びに、アクチュエーターＡによって制御されるプロモータＰをコードする遺伝子配列及び該プロモータＰと機能的に連結されたレポーターＲをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
（２）代謝物Ｍを（１）の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、及び
（３）前記アクチュエータＡの制御下にあるレポーターＲの発現量を指標として、酵素Ｅ変異体を選抜する工程。
さらに、上記（３）で選抜した酵素Ｅ変異体の変異箇所を同定する工程を含む、請求項１に記載の酵素活性のスクリーニング方法。
前記（３）において、前記酵素Ｅ変異体のレポーターＲのＭ濃度依存的な変化量が野生型酵素ＥのレポーターＲのＭ濃度依存的な変化量と比較して高い場合には、酵素Ｅ変異体は野生型酵素Ｅよりも酵素活性又は基質親和性が高いと判定する工程を含む、請求項１又は２に記載の酵素活性のスクリーニング方法。
以下の工程を含む野生型酵素Ｅよりも酵素活性又は基質親和性が高い酵素E変異体の構造の決定方法；
（１）酵素Ｅの全部又は一部をコードする遺伝子配列及びアクチュエータＡをコードする遺伝子配列を担持する遺伝子構築物に変異、挿入、及び／又は欠失を導入して得られた酵素ＥとアクチュエーターＡの融合変異体の核酸ライブラリ、並びに、アクチュエーターＡによって制御されるプロモータＰをコードする遺伝子配列及び該プロモータＰと機能的に連結されたレポーターＲをコードする遺伝子配列を担持したレポーター用発現ベクターを、細胞に導入する又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
（２）代謝物Ｍを（１）の細胞又は無細胞タンパク質合成系に添加する工程、
（３）前記アクチュエーターＡの制御下にあるレポーターＲの発現量を指標として、酵素Ｅ変異体を選抜する工程、
（４）前記（３）において、前記酵素Ｅ変異体のレポーターＲの濃度依存的な変化量が野生型酵素ＥのレポーターＲの濃度依存的な変化量と比較して高い場合には、酵素Ｅ変異体は野生型酵素Ｅよりも酵素活性が高いと判定する工程、及び
（５）上記（４）で酵素活性が高いと判定した酵素Ｅ変異体の変異箇所を同定する工程。
請求項４の（５）で同定した酵素Ｅ変異体の配列を基にして、酵素Ｅ変異体の作製方法。
請求項５の作製方法で得られた酵素Ｅ変異体の使用方法。
以下の（１）～（７）のいずれか１のアミノ酸配列又は遺伝子で特定されるCODM変異体：
（１）配列番号５１で示されるアミノ酸配列において、１２１位及び３４６位にアミノ酸置換を有する、
（２）配列番号５１で示されるアミノ酸配列において、Q121LおよびR346Hのアミノ酸置換を有する、
（３）配列番号５１で示されるアミノ酸配列において、Q121L又はR346Hのアミノ酸置換を有し、かつ、上記（２）と実質的同等のデバイン及び／又はコデイン検出活性を有する、（４）配列番号５１で示されるアミノ酸配列において、Q121L及びR346Hのアミノ酸置換を有し、さらに、１２１位及び３４６位以外の箇所において、1～20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記（２）と実質的同等のデバイン及び／又はコデイン検出活性を有する、
（５）配列番号５１で示されるアミノ酸配列において、Q121L及びR346H のアミノ酸置換を有し、配列番号５１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記（２）と実質的同等のデバイン及び／又はコデイン検出活性を有する、
（６）上記（２）のアミノ酸配列において、1～20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記（２）と実質的同等のデバイン及び／又はコデイン検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び
（７）上記（２）のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記（２）と実質的同等のデバイン及び／又はコデイン検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
デバイン及び／又はコデイン検出用である、請求項７に記載のCODM変異体。
以下の（１）～（７）のいずれか１のアミノ酸配列又は遺伝子で特定されるIDI変異体：
（１）配列番号７６で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか１で表される位置でアミノ酸置換を有する、
〇19
〇28、19
〇66、82、28、19
〇85、82、28、19
（２）配列番号７６で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか１で表されるアミノ酸置換を有する、
〇L19P
〇D28H、L19P
〇V66A、G82C、D28H、L19P
〇R85C、G82C、D28H、L19P
（３）配列番号７６で示されるアミノ酸配列において、R85C、V66A、G82C、D28H及びL19Pから選ばれる２、３、４又は５のアミノ酸置換を有し、かつ、上記（２）と実質的同等のメバロン酸検出活性を有する、
（４）配列番号７６で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか１で表されるアミノ酸置換を有し、さらに、85、66、82、28及び19以外の箇所において、1～20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記（２）と実質的同等のメバロン酸検出活性を有する、
〇L19P
〇D28H、L19P
〇V66A、G82C、D28H、L19P
〇R85C、G82C、D28H、L19P
（５）配列番号７６で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか１で表されるアミノ酸置換を有し、配列番号７６に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記（２）と実質的同等のメバロン酸検出活性を有する、
〇L19P
〇D28H、L19P
〇V66A、G82C、D28H、L19P
〇R85C、G82C、D28H、L19P
（６）上記（２）のアミノ酸配列において、1～20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記（２）と実質的同等のメバロン酸検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び
（７）上記（２）のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記（２）と実質的同等のメバロン酸検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
ジメチル2リン酸（DMAOH）又はイソペンテニル2リン酸（IOH）検出用である、請求項９に記載のIDI変異体変異体。
以下の（１）～（１１）のいずれか１のアミノ酸配列又は遺伝子で特定されるLuxR変異体：
（１）配列番号１１で示されるアミノ酸配列において、N86K及びC245Wのアミノ酸置換を有し、さらに、３３位及び５７位にアミノ酸置換を有する、
（２）配列番号１１で示されるアミノ酸配列において、N86K及びC245Wのアミノ酸置換を有し、さらに、T33A及びS57Tのアミノ酸置換を有する、
（３）配列番号１１で示されるアミノ酸配列において、N86K、C245W 、T33A及びS57Tから選択される３又は４のアミノ酸置換を有し、かつ、上記（２）と実質的同等の転写亢進活性又はAHL検出感度を有する、
（４）配列番号１１で示されるアミノ酸配列において、N86K、C245W 、T33A及びS57Tのアミノ酸置換を有し、さらに、８６位、２４５位、３３位及び５７位以外の箇所において、1～20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記（２）と実質的同等の転写亢進活性又はAHL検出感度を有する、
（５）配列番号１１で示されるアミノ酸配列において、N86K、C245W 、T33A及びS57Tのアミノ酸置換を有し、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記（２）と実質的同等の転写亢進活性又はAHL検出感度を有する、
（６）上記（２）のアミノ酸配列において、1～20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記（２）と実質的同等の転写亢進活性又はAHL検出感度を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（７）上記（２）のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記（２）と実質的同等の転写亢進活性又はAHL検出感度を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（８）配列番号７７に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
（９）配列番号７７に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記（２）と実質的同等の転写亢進活性又はAHL検出感度を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（１０）配列番号７７に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1～50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加されているDNAからなる遺伝子、及び
（１１）配列番号７７に記載の塩基配列からなるDNAと相同性が90%以上のDNAからなる遺伝子。
前記LuxR変異体は、野生型LuxRと比較して、転写亢進活性又はAHL検出感度が高いことを特徴とする請求項１１に記載のLuxR変異体。
以下の（１）～（１１）のいずれか１のアミノ酸配列又は遺伝子で特定されるLuxR変異体：
（１）配列番号１１で示されるアミノ酸配列において、N86K、C245W 、T33A及びS57Tのアミノ酸置換を有し、さらに、４２位、９３位、９９位及び１００位にアミノ酸置換を有する、
（２）配列番号１１で示されるアミノ酸配列において、N86K、C245W 、T33A及びS57Tのアミノ酸置換を有し、さらに、L42S、N93K、N99D及びN100Sのアミノ酸置換を有する、
（３）配列番号１１で示されるアミノ酸配列において、N86K、C245W 、T33A、S57T及び L42S、N93K、N99D及びN100Sから選択される５、６、７又は８のアミノ酸置換を有し、かつ、上記（２）と実質的同等の転写亢進活性を有する、
（４）配列番号１１で示されるアミノ酸配列において、86K、C245W 、T33A、S57T及び L42S、N93K、N99D及びN100Sのアミノ酸置換を有し、さらに、８６位、２４５位、３３位、５７位、４２位、９３位、９９位及び１００位以外の箇所において、1～20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記（２）と実質的同等の転写亢進活性を有する、
（５）配列番号１１で示されるアミノ酸配列において、86K、C245W 、T33A、S57T及び L42S、N93K、N99D及びN100Sのアミノ酸置換を有し、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記（２）と実質的同等の転写亢進活性を有する、
（６）上記（２）のアミノ酸配列において、1～20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記（２）と実質的同等の転写亢進活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（７）上記（２）のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記（２）と実質的同等の転写亢進活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（８）配列番号７８に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
（９）配列番号７８に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記（２）と実質的同等の転写亢進活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（１０）配列番号７８に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1～50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加されているDNAからなる遺伝子、及び
（１１）配列番号７８に記載の塩基配列からなるDNAと相同性が90%以上のDNAからなる遺伝子。
前記LuxR変異体は、AHL非添加条件下で転写亢進活性を有することを特徴とする請求項１３に記載のLuxR変異体。
以下の（１）～（７）のいずれか１のアミノ酸配列又は遺伝子で特定されるCOR変異体：
（１）配列番号５０で示されるアミノ酸配列において、１１位及び２７６位にアミノ酸置換を有する、
（２）配列番号５０で示されるアミノ酸配列において、S11G及びF276Y のアミノ酸置換を有する、
（３）配列番号５０で示されるアミノ酸配列において、S11G又はF276Yのアミノ酸置換を有し、かつ、上記（２）と実質的同等のレチクリン検出活性を有する、
（４）配列番号５０で示されるアミノ酸配列において、S11G及びF276Yのアミノ酸置換を有し、さらに、１１位及び２７６位以外の箇所において、1～20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記（２）と実質的同等のレチクリン検出活性を有する、
（５）配列番号５０で示されるアミノ酸配列において、S11G及びF276Y のアミノ酸置換を有し、配列番号５０に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記（２）と実質的同等のレチクリン検出活性を有する、
（６）上記（２）のアミノ酸配列において、1～20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記（２）と実質的同等のレチクリン検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び
（７）上記（２）のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記（２）と実質的同等のレチクリン検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
レチクリン検出用である、請求項１５に記載のCOR変異体。
以下の（１）～（７）のいずれか１のアミノ酸配列又は遺伝子で特定されるDXR変異体：
（１）配列番号７５で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか１で表される位置でアミノ酸置換を有する、
〇111、297
〇120、144、283、295
〇362
〇58、118、279
〇15、254、362
〇279
〇362
（２）配列番号７５で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか１で表されるアミノ酸置換を有する、
〇L111F、L297P
〇I120T、A144E、T283S、K295R
〇S362T
〇D58H、K118R、P279T
〇C15R、S254T、S362T
〇P279T
〇S362T
（３）配列番号７５で示されるアミノ酸配列において、C15R、D58H、L111F、I120T、K118R、A144E、P279T、L297P、T283S、K295R、S362T及びS254Tから選ばれる２、３、４，５，６，７，８，９、１０、１１又は１２のアミノ酸置換を有し、かつ、上記（２）と実質的同等のDOXP検出活性を有する、
（４）配列番号７５で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか１で表されるアミノ酸置換を有し、さらに、15、58、111、120、118、144、279、297、283、295、362及び254以外の箇所において、1～20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記（２）と実質的同等のDOXP検出活性を有する、
〇L111F、L297P
〇I120T、A144E、T283S、K295R
〇S362T
〇D58H、K118R、P279T
〇C15R、S254T、S362T
〇P279T
〇S362T
（５）配列番号７５で示されるアミノ酸配列において、以下のいずれか１で表されるアミ
ノ酸置換を有し、配列番号７５に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上
記（２）と実質的同等のDOXP検出活性を有する、
〇L111F、L297P
〇I120T、A144E、T283S、K295R
〇S362T
〇D58H、K118R、P279T
〇C15R、S254T、S362T
〇P279T
〇S362T
（６）上記（２）のアミノ酸配列において、1～20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ上記（２）と実質的同等のDOXP検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び
（７）上記（２）のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ上記（２）と実質的同等のDOXP検出活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
DOXP検出用である、請求項１７に記載のDXR変異体。
前記アクチュエーターＡは、請求項１１～１４のいずれか１に記載のLuxR変異体である請求項１～３のいずれか１に記載のスクリーニング方法。