JP2021134144A - Artificial microtubule involving protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、外因性タンパク質を内包した微小管及びその製造方法に関する。 The present invention relates to microtubules containing an exogenous protein and a method for producing the same.
生体内に存在する細胞骨格の一種である微小管は、チューブリンタンパク質から構成される内径約１５ｎｍのチューブ状タンパク質集合体である。微小管の長さは、数μｍ〜数十μｍにもおよび、その形成・解離は、ＧＴＰ、ＧＤＰの結合によって制御されている。また、微小管は、モータータンパク質が動くためのレールとして機能することが知られている。そのユニークな性質から、微小管を用いたナノマテリアルが数多く開発されている。 Microtubules, which are a type of cytoskeleton existing in the living body, are tubular protein aggregates having an inner diameter of about 15 nm and composed of tubulin proteins. The length of microtubules ranges from several μm to several tens of μm, and their formation and dissociation are controlled by the binding of GTP and GDP. Microtubules are also known to function as rails for motor proteins to move. Due to its unique properties, many nanomaterials using microtubules have been developed.
発明者らの以前の研究では、微小管の内部空間に着目した材料開発を目指して、微小管の内部表面に結合する微小管関連タンパク質Ｔａｕ由来のペプチドを基に微小管結合性ペプチドを開発した（非特許文献１）。 In our previous research, we developed a microtubule-binding peptide based on a peptide derived from the microtubule-related protein Tau, which binds to the inner surface of microtubules, with the aim of developing materials focusing on the internal space of microtubules. (Non-Patent Document 1).
本発明は、外因性タンパク質を内包する人工微小管を製造することを目的とする。 An object of the present invention is to produce artificial microtubules containing exogenous proteins.
本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｔａｕ由来ペプチドを含む微小管結合性ペプチドを用いて緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を内包した微小管を構築することに成功し、さらに、驚くべきことに、微小管内部にタンパク質を導入することにより微小管を安定化させることができることを見出した。かくして、本発明が完成された。 As a result of diligent research, the present inventors have succeeded in constructing a microtubule containing a green fluorescent protein (GFP) using a microtubule-binding peptide containing a Tau-derived peptide, and surprisingly, We have found that microtubules can be stabilized by introducing proteins into microtubules. Thus, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は下記の態様を提供する。
［１］（１）チューブリン、（２）微小管に結合するペプチドであって、配列番号１で示されるアミノ酸配列、または配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し１〜７個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されているアミノ酸配列を含む微小管結合性ペプチド、および（３）外因性タンパク質を含み、該外因性タンパク質が該微小管結合性ペプチドに連結しており、該微小管結合性ペプチドが微小管の内部表面に結合している、タンパク質を内包した人工微小管、
［２］外因性タンパク質がリンカーを介して微小管結合性ペプチドに連結している、［１］記載の人工微小管、
［３］外因性タンパク質が緑色蛍光タンパク質である、［１］または［２］記載の人工微小管、
［４］微小管に結合するペプチドであって、配列番号１で示されるアミノ酸配列、または配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し１〜７個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されているアミノ酸配列を含む微小管結合性ペプチド（ＴＰ）と、外因性タンパク質とが連結した、ＴＰ−タンパク質を作製すること、
ＴＰ−タンパク質とチューブリンを複合体化すること、および
ＴＰ−タンパク質とチューブリンの複合体を、ＧＴＰまたはＧＭＰＣＰＰと混合して重合させること
を含む、タンパク質を内包した人工微小管の製造方法、
［５］微小管結合性ペプチドと外因性タンパク質とがリンカーを介して連結した、ＴＰ−タンパク質を作製することを含む、［４］記載の方法、および
［６］外因性タンパク質が緑色蛍光タンパク質である、［４］または［５］記載の方法。
That is, the present invention provides the following aspects.
[1] (1) Tubulin, (2) Peptide that binds to microtubules and has 1 to 7 amino acid residues relative to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Contains a microtubule-binding peptide containing an amino acid sequence in which is deleted, substituted, inserted and / or added, and (3) an exogenous protein, the exogenous protein linked to the microtubule-binding peptide. , An artificial microtube containing a protein, wherein the microtubule-binding peptide is bound to the inner surface of the microtube.
[2] The artificial microtubule according to [1], wherein the exogenous protein is linked to a microtubule-binding peptide via a linker.
[3] The artificial microtubule according to [1] or [2], wherein the exogenous protein is green fluorescent protein.
[4] A peptide that binds to a microtube, in which 1 to 7 amino acid residues are deleted, substituted, inserted, and / or from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Alternatively, to prepare a TP-protein in which a microtubule-binding peptide (TP) containing an added amino acid sequence and an exogenous protein are linked.
A method for producing a protein-encapsulating artificial microtubule, which comprises synthesizing a TP-protein and tubulin, and polymerizing the TP-protein and tubulin complex by mixing with GTP or GMPCPP.
[5] The method according to [4], which comprises producing a TP-protein in which a microtubule-binding peptide and an exogenous protein are linked via a linker, and [6] the exogenous protein is a green fluorescent protein. The method according to [4] or [5].
本発明のタンパク質内包微小管は、驚くべきことに、通常の微小管と比べて、全長、剛直性、および運動性が増加し、さらに、高い安定性を有する。本発明の方法は、ＧＦＰをはじめ、様々なタンパク質を微小管に内包させるのに適用することが可能である。かくして、本発明の技術を用いれば、外因性タンパク質の輸送・放出が可能な微小管を作製でき、デバイスやドラッグデリバリーに利用することができる。また、本発明により得られる安定化された微小管は、ナノ材料応用のスキャフォールドとして有用である。 Surprisingly, the protein-encapsulating microtubules of the present invention have increased overall length, rigidity, and motility, and are more stable than ordinary microtubules. The method of the present invention can be applied to encapsulate various proteins such as GFP in microtubules. Thus, by using the technique of the present invention, microtubules capable of transporting and releasing exogenous proteins can be produced and used for devices and drug delivery. In addition, the stabilized microtubules obtained by the present invention are useful as scaffolds for nanomaterial applications.
微小管は、チューブリンタンパク質が重合して形成される内径約１５ｎｍのチューブ状タンパク質集合体であり、通常、αチューブリンおよびβチューブリンからなるヘテロ２量体を基本単位として構成される。本発明では、チューブリンタンパク質に結合する微小管結合性ペプチド（以下、「ＴＰ」ともいう）を利用することより、外因性タンパク質を内包した微小管を製造することに成功した。したがって、本発明は、外因性タンパク質を内包した人工微小管および該人工微小管の製造方法を提供する。 Microtubules are tubular protein aggregates having an inner diameter of about 15 nm formed by polymerizing tubulin proteins, and are usually composed of a heterodimer composed of α-tubulin and β-tubulin as a basic unit. In the present invention, we have succeeded in producing microtubules containing an exogenous protein by using a microtubule-binding peptide (hereinafter, also referred to as “TP”) that binds to a tubulin protein. Therefore, the present invention provides an artificial microtubule containing an exogenous protein and a method for producing the artificial microtubule.
１．外因性タンパク質を内包した人工微小管
本願のタンパク質を内包した人工微小管は、そのチューブ状構造の中空内に、微小管結合性ペプチドと連結した外因性タンパク質を含み、該外因性タンパク質は該微小管結合性ペプチドを介して微小管内表面に連結されている。
1. 1. Artificial microtubules containing exogenous proteins The artificial microtubules containing the proteins of the present application contain exogenous proteins linked to microtubule-binding peptides in the hollow of the tubular structure, and the exogenous proteins are the microtubules. It is linked to the inner surface of microtubules via a tube-binding peptide.
本明細書において、「微小管結合性ペプチド」（以下、「ＴＰ」ともいう）とは、微小管関連タンパク質Ｔａｕの繰り返し配列に由来するペプチド（以下、「Ｔａｕ由来ペプチド」という）またはその変異体ペプチドを含み、かつ、微小管に結合するペプチドをいう。本願で使用される微小管結合性ペプチドに含まれるＴａｕ由来ペプチドまたはその変異体ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列（ＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬ）、または配列番号１のアミノ酸配列に対し１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されているアミノ酸配列で示されるペプチドである。また、該Ｔａｕ由来ペプチドの変異体の別の例としては、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８４％、少なくとも９０％、少なくとも９４％同一性を有するアミノ酸配列で示されるペプチドであってもよい。本明細書において、「数個」とは、２〜７個程度をいい、例えば、３個、４個、５個または６個であってもよい。配列番号１のアミノ酸配列からなるＴａｕ由来ペプチドを含む微小管結合性ペプチドは、微小管の内部に位置するβチューブリンのタキソール結合ポケットに結合することが知られている。したがって、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、得られるペプチドが微小管に結合する能力を保持するかぎり、上記の１〜数個のいずれであってもよい。また、配列番号１のアミノ酸配列は、得られるペプチドが微小管に結合する能力を保持するかぎり、上記の同一性の範囲内で欠失、置換、挿入および／または付加変異を有していてもよい。例えば、上記Ｔａｕ由来ペプチド変異体は、微小管に結合する能力を保持するかぎり、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に１〜数個のアミノ酸残基が付加されているか、または上記の同一性の範囲内でアミノ酸残基が付加されているアミノ酸配列で示されるペプチドであってもよい。かかるＴａｕ由来ペプチド変異体の例として、限定するものではないが、配列番号２のアミノ酸配列（ＫＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬ）、および配列番号３のアミノ酸配列（ＫＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＣ）で示されるペプチドが挙げられる。 In the present specification, the “microtubule-binding peptide” (hereinafter, also referred to as “TP”) is a peptide derived from the repeating sequence of the microtubule-related protein Tau (hereinafter, referred to as “Tau-derived peptide”) or a variant thereof. A peptide containing a peptide and binding to microtubules. The Tau-derived peptide or its variant peptide contained in the microtubule-binding peptide used in the present application contains one to several amino acid residues with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (KHVPGGGSVQIVYKPVDL) or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Is a peptide represented by the amino acid sequence in which is deleted, substituted, inserted and / or added. Further, as another example of the variant of the Tau-derived peptide, an amino acid sequence having at least 70%, at least 80%, at least 84%, at least 90%, and at least 94% identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It may be a peptide represented by. In the present specification, "several pieces" means about 2 to 7, and may be, for example, 3, 4, 5, or 6. A microtubule-binding peptide containing a Tau-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is known to bind to the taxol-binding pocket of β-tubulin located inside the microtubule. Therefore, the number of amino acid residue deletions, substitutions, insertions and / or additions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be any of one to several above, as long as the resulting peptide retains the ability to bind to microtubules. May be. In addition, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may have deletions, substitutions, insertions and / or additional mutations within the above-mentioned range of identity as long as the resulting peptide retains the ability to bind to microtubules. good. For example, the Tau-derived peptide variant has one to several amino acid residues added to the N-terminal and / or C-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as long as it retains the ability to bind to microtubules. Alternatively, it may be a peptide represented by an amino acid sequence to which an amino acid residue is added within the range of the above-mentioned identity. Examples of such Tau-derived peptide variants include, but are not limited to, the peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (KKHVPGGGSVQIVYKPVDL) and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (KKHVPGGGSVQIVYKPVDLC).
本願で使用される微小管結合性ペプチドは、線状であってもよく、または環化されていてもよい。線状の微小管結合性ペプチドは、そのＮ末端で、外因性タンパク質と連結される。微小管結合性ペプチドの環化は、例えば、Ｃ末端にシステインを有するペプチドを用い、該ペプチドのＮ末端にクロロアセチル基を導入し、該クロロアセチル基とＣ末端のシステインとの間にチオエーテルを形成させることによって行ってもよい。該クロロアセチル基は、例えば、微小管結合性ペプチドの末端に付加されたシステイン残基、好ましくはリンカーを介して微小管結合性ペプチドの末端に付加されたシステイン残基に導入されていてもよい。該システインは、アセトアミドメチル基等の適当な官能基で保護されていてもよい。環状の微小管結合性ペプチドは、例えば該環状ペプチドがシステインを有する場合、外因性タンパク質のシステインとのジスルフィド結合形成や、クロスリンカー（ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳなど）を介する外因性タンパク質のリジンへの連結によって外因性タンパク質と連結することができる。 The microtubule-binding peptides used in the present application may be linear or cyclized. The linear microtubule-binding peptide is linked to an exogenous protein at its N-terminus. For cyclization of a microtube-binding peptide, for example, a peptide having a cysteine at the C-terminal is used, a chloroacetyl group is introduced at the N-terminal of the peptide, and a thioether is inserted between the chloroacetyl group and the C-terminal cysteine. It may be done by forming. The chloroacetyl group may be introduced into, for example, a cysteine residue added to the end of the microtubule-binding peptide, preferably a cysteine residue added to the end of the microtubule-binding peptide via a linker. .. The cysteine may be protected with a suitable functional group such as an acetamide methyl group. Cyclic microtubule-binding peptides, for example, when the cyclic peptide has cysteine, can be obtained by forming a disulfide bond of the exogenous protein with cysteine or by linking the exogenous protein to lysine via a crosslinker (such as sulfo-GMBS). Can be linked to exogenous proteins.
微小管結合性ペプチドと外因性タンパク質は、好ましくは、リンカーを介して連結される。該リンカーは、好ましくはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーとしては、例えば、システイン、グリシン、セリン、アラニン、および／またはグルタミン酸を含むペプチドが挙げられる。ペプチドリンカーは、限定するものではないが、例えば１〜３０個、好ましくは２〜２０個、さらに好ましくは３〜１５個のアミノ酸からなるペプチドであってもよい。ペプチドリンカーの例として、限定するものではないが、ＣＧ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＣＧＧＧ（配列番号４）、ＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＧＧＧＳ（配列番号６）、ＧＧＧＳおよび／またはＧＧＧＧＳが複数連結したもの、ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号８）、ＡＥＡＡＡＫＡ（配列番号９）、ＡＥＡＡＡＫＡが複数連結したもの等が挙げられる。 The microtubule-binding peptide and the exogenous protein are preferably linked via a linker. The linker is preferably a peptide linker. Peptide linkers include, for example, peptides containing cysteine, glycine, serine, alanine, and / or glutamic acid. The peptide linker is not limited, but may be, for example, a peptide consisting of 1 to 30, preferably 2 to 20, and more preferably 3 to 15 amino acids. Examples of peptide linkers include, but are not limited to, CG, GG, GGG, CGGG (SEQ ID NO: 4), GGGS (SEQ ID NO: 5), GGGGS (SEQ ID NO: 6), GGGS and / or multiple linkages of GGGGS. , GGGSGGG (SEQ ID NO: 7), GGGSGGGGSGGGS (SEQ ID NO: 8), AEAAAKA (SEQ ID NO: 9), a plurality of AEAAAKA linked together, and the like.
本願において、「外因性タンパク質」とは、微小管が本来有する内因性タンパク質（例えば、微小管インナータンパク質等）ではないタンパク質であり、いずれのタンパク質であってもよく、特に限定されない。外因性タンパク質としては、例えば、限定するものではないが、生理活性タンパク質［例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、トランスフェリン、ミオグロビン等］、薬理活性タンパク質、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰやＡｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ等）等の機能性タンパク質が挙げられる。しかしながら、本願の人工微小管をナノ材料として用いる場合は、外因性タンパク質は、微小管の安定性向上のために内包されるため、特に有用な活性を有していなくてもよい。外因性タンパク質は、負の電荷を有するものであってもよい。負の電荷を有するタンパク質としては、例えば、ＢＳＡ、ＨＳＡ等が挙げられる。 In the present application, the "exogenous protein" is a protein that is not an endogenous protein inherent in microtubules (for example, an inner protein of microtubules), and may be any protein, and is not particularly limited. The extrinsic protein includes, for example, but not limited to, physiologically active proteins [eg, BSA (bovine serum albumin), HSA (human serum albumin), transferase, myoglobin, etc.], pharmacologically active proteins, fluorescent proteins (eg, for example). Functional proteins such as GFP, YFP, RFP, Azami Green, DsRed, mCherry, etc.) can be mentioned. However, when the artificial microtubules of the present application are used as nanomaterials, the exogenous protein may not have particularly useful activity because it is included in order to improve the stability of the microtubules. The exogenous protein may have a negative charge. Examples of the negatively charged protein include BSA, HSA and the like.
本願によれば、驚くべきことに、外因性タンパク質を微小管内部に内包させることにより、得られる微小管が、外因性タンパク質を内包していない通常の微小管と比べて、高い安定性および剛直性を有することが見出された。本願のタンパク質を内包した人工微小管は、タンパク質を内包していない通常の微小管と比べて、高い安定性を有し、かつ、通常の微小管と比べて、増加した全長、持続長（剛直性）および運動速度を有する。本明細書において、微小管の安定性とは、微小管がその構造を長時間維持することを意味し、または、ＧＴＰ添加により形成される微小管の量が多く、低温でも解離しにくいことを意味する。微小管の安定性は、例えば、濁度アッセイによって測定することができる。微小管の持続長は、各微小管の全長の長さ（contour length）および同じ微小管の端から端までの距離から求められ、微小管の剛直性の指標である。微小管の運動速度は、モータータンパク質（キネシン）を固定した基板上で測定した。モータータンパク質を固定した基板上では微小管が一方向に運動することが知られている。一例において、本願のタンパク質内包微小管は、通常の微小管と比べて、全長が約１．７倍、剛直性が約４倍、および運動速度が約１．２倍増加した。 According to the present application, surprisingly, by encapsulating exogenous proteins inside microtubules, the resulting microtubules are more stable and rigid than normal microtubules that do not contain exogenous proteins. It was found to have sex. The artificial microtubule containing the protein of the present application has higher stability than the normal microtubule containing no protein, and has an increased total length and duration (rigidity) as compared with the normal microtubule. Sex) and speed of movement. As used herein, the stability of microtubules means that the microtubules maintain their structure for a long period of time, or that the amount of microtubules formed by the addition of GTP is large and it is difficult to dissociate even at low temperatures. means. The stability of microtubules can be measured, for example, by a turbidity assay. The duration of microtubules is determined from the total length of each microtubule and the distance from end to end of the same microtubule, and is an index of the rigidity of microtubules. The motion velocity of microtubules was measured on a substrate on which a motor protein (kinesin) was fixed. It is known that microtubules move in one direction on a substrate on which a motor protein is fixed. In one example, the protein-encapsulating microtubules of the present application had a total length of about 1.7 times, a rigidity of about 4 times, and a movement speed of about 1.2 times, as compared with a normal microtubule.
２．外因性タンパク質を内包した人工微小管の製造方法
本願のタンパク質を内包した人工微小管は、
上記の微小管結合性ペプチド（ＴＰ）と、外因性タンパク質とが連結した、ＴＰ−タンパク質を作製すること、
ＴＰ−タンパク質とチューブリンを複合体化すること、および
ＴＰ−タンパク質とチューブリンの複合体を、ＧＴＰまたはＧＭＰＣＰＰと混合して重合させること
を含む方法によって製造することができる。
2. Method for Manufacturing Artificial Microtubules Containing Extrinsic Proteins The artificial microtubules containing the proteins of the present application are
To prepare a TP-protein in which the above-mentioned microtubule-binding peptide (TP) and an exogenous protein are linked,
It can be produced by a method comprising synthesizing a TP-protein and tubulin, and mixing and polymerizing the TP-protein and tubulin complex with GTP or GMPCPP.
ＴＰおよび外因性タンパク質は、常法にしたがって調製することができる。例えば、限定するものではないが、ＴＰおよび外因性タンパク質をコードするアミノ酸配列または塩基配列情報に基づき、化学合成してもよく、またはコード遺伝子を微生物宿主中に導入して微生物により産生させてもよい。また、外因性タンパク質は、天然から単離してもよい。 TP and exogenous proteins can be prepared according to conventional methods. For example, without limitation, chemical synthesis may be performed based on amino acid sequence or base sequence information encoding TP and exogenous protein, or the coding gene may be introduced into a microbial host and produced by a microorganism. good. The exogenous protein may also be isolated from nature.
ＴＰ−タンパク質は、例えば、ＴＰと外因性タンパク質を適当な溶媒中で混合し、適当な条件下でインキュベートすることによって作製することができる。適当な溶媒としては、例えば、限定するものではないが、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー等の緩衝液が挙げられる。インキュベーション条件は、当業者が適宜決定することができるが、例えば室温〜３０℃、好ましくは２３℃〜２７℃の暗所で、例えば１時間〜３日、好ましくは３時間〜２日程度であってもよい。ＴＰおよび外因性タンパク質の混合比は、当業者が適宜決定することができるが、例えば、外因性タンパク質に対しＴＰのモル比が１〜５倍であってもよい。ＴＰ−タンパク質はまた、ＴＰ−タンパク質全体をコードするアミノ酸配列または塩基配列情報に基づき、化学合成してもよく、またはコード遺伝子を微生物宿主中に導入して、融合タンパク質として微生物により産生させてもよい。 TP-protein can be prepared, for example, by mixing TP and exogenous protein in a suitable solvent and incubating under suitable conditions. Suitable solvents include, for example, but not limited to, buffer solutions such as Tris-HCl buffer, HEPES buffer. Incubation conditions can be appropriately determined by those skilled in the art, and are, for example, in a dark place at room temperature to 30 ° C., preferably 23 ° C. to 27 ° C., for example, 1 hour to 3 days, preferably about 3 hours to 2 days. You may. The mixing ratio of TP and exogenous protein can be appropriately determined by those skilled in the art, and for example, the molar ratio of TP to exogenous protein may be 1 to 5 times. The TP-protein may also be chemically synthesized based on the amino acid sequence or base sequence information encoding the entire TP-protein, or the coding gene may be introduced into a microbial host and produced by the microbial as a fusion protein. good.
ＴＰ−タンパク質とチューブリンの複合体化は、ＴＰ−タンパク質とチューブリンを適当な溶媒中で混合し、適当な条件下でインキュベートすることによって実施することができる。適当な溶媒としては、限定するものではないが、ＰＩＰＥＳバッファー等の緩衝液が挙げられる。インキュベーション条件は、当業者が適宜決定することができるが、例えば室温〜３０℃、好ましくは２３℃〜２７℃の暗所で、例えば１０分間〜２４時間、好ましくは２０分間〜２時間程度維持すればよい。ＴＰ−タンパク質およびチューブリンの混合比は、特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。 Complexation of TP-protein and tubulin can be carried out by mixing TP-protein and tubulin in a suitable solvent and incubating under suitable conditions. Suitable solvents include, but are not limited to, buffers such as PIPES buffer. Incubation conditions can be appropriately determined by those skilled in the art, but should be maintained, for example, in a dark place at room temperature to 30 ° C., preferably 23 ° C. to 27 ° C., for example, for 10 minutes to 24 hours, preferably about 20 minutes to 2 hours. Just do it. The mixing ratio of TP-protein and tubulin is not particularly limited and can be appropriately determined by those skilled in the art.
ＴＰ−タンパク質とチューブリンの複合体を重合させることによって、微小管が製造される。該重合は、適当な溶媒中、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）またはＧＴＰアナログの存在下で実施する。該ＧＴＰアナログとしては、加水分解速度が遅いＧＴＰアナログが好ましく、例えばＧＭＰＣＰＰが用いられる。例えば、ＴＰ−タンパク質とチューブリンの複合体化後の反応溶液中に、ＧＴＰまたはＧＴＰアナログを添加すればよい。インキュベーション条件は、当業者が適宜決定することができるが、例えば３０℃〜４５℃、好ましくは３５℃〜４０℃の暗所で、例えば１０分間〜２４時間、好ましくは２０分間〜２時間程度維持すればよい。ＧＴＰまたはＧＴＰアナログの添加量は、特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。 Microtubules are produced by polymerizing a complex of TP-protein and tubulin. The polymerization is carried out in a suitable solvent in the presence of guanosine triphosphate (GTP) or GTP analog. As the GTP analog, a GTP analog having a slow hydrolysis rate is preferable, and for example, GMPCPP is used. For example, GTP or GTP analog may be added to the reaction solution after the complexation of TP-protein and tubulin. Incubation conditions can be appropriately determined by those skilled in the art, and are maintained in a dark place of, for example, 30 ° C. to 45 ° C., preferably 35 ° C. to 40 ° C., for example, for 10 minutes to 24 hours, preferably about 20 minutes to 2 hours. do it. The amount of GTP or GTP analog added is not particularly limited and can be appropriately determined by those skilled in the art.
本願の方法によって得られる外因性タンパク質内包微小管は、驚くべきことに、外因性タンパク質を内包していない通常の微小管と比べて、高い安定性ならびに増加した全長、持続長（剛直性）および運動速度を有する。したがって、本願の方法によって、安定性、全長、持続長、または運動速度を変化させた、用途に応じた微小管を製造することができる。 The exogenous protein-encapsulating microtubules obtained by the methods of the present application are surprisingly more stable and have increased overall length, duration (rigidity) and compared to normal microtubules that do not contain exogenous proteins. Has a speed of movement. Therefore, according to the method of the present application, microtubules with varying stability, overall length, duration, or kinetic velocity can be produced according to the application.
以下に、実施例を用いて本願発明をより詳細に説明するが、本願発明は実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the Examples.
材料および装置
実施例において、以下の装置および材料を用いた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｃ１８カラム（分析用４．６×２５０ｍｍ、精製用２０×２５０ｍｍ）を用いるＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−６ＡＤ液体クロマトグラフィーを用いて行った。マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）マススペクトルは、α−シアノ―４−ヒドロキシ桂皮酸（α―ＣＨＣＡ）をマトリックスとして用いるＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＴＩＩを用いて取得した。ＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、Ｊａｓｃｏ Ｖ−６３０を用いて取得した。蛍光測定は、Ｊａｓｃｏ ＦＰ−８２００を用いて行った。超遠心分離は、ローターを用いるＴＬＡ １２０．２Ｏｐｔｉｍａ ＭＡＸ−ＴＬ超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。ＣＤスペクトルは、１ｍｍの石英セルを用いて、ＪＡＳＣＯ Ｊ−８２０スペクトロフォトメーターを用いて記録した。共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）測定は、ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０ｉ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて行った。運動性アッセイにおいて、サンプルは、１００Ｗ水銀ランプで照射し、ｏｉｌ−ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｎ Ａｐｏ ６０×１．４０ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ（Ｎｉｋｏｎ）を用いるエピ蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ； Ｎｉｋｏｎ）によって視覚化した。チューブリンは、文献（M. Castoldi and A. V. Popov, Protein Expr. Purif., 2003, 32, 83.）に記載の方法によって、ブタ脳から精製した。ヒトキネシン−１の最初の５７３アミノ酸残基からなる組み換えキネシン−１は、文献（R. B. Case, D. W. Pierce, N. Hom-Booher, C. L. Hart and R. D. Vale, Cell, 1997, 90, 959）に記載の方法によって調製した。
Materials and Equipment In the examples, the following equipment and materials were used. High performance liquid chromatography (HPLC) was performed using Shimadzu LC-6AD liquid chromatography using a GL Science Inertsil WP300 C18 column (4.6 x 250 mm for analysis, 20 x 250 mm for purification). Matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectra were obtained using a Bruker Daltonics Autoflex TII using α-cyano-4-hydroxycinnolic acid (α-CHCA) as a matrix. UV-vis spectra were acquired using Jasco V-630. Fluorescence measurement was performed using Jasco FP-8200. Ultracentrifugation was performed using a TLA 120.2 Optima MAX-TL ultracentrifuge (Beckman Coulter) using a rotor. The CD spectrum was recorded using a JASCO J-820 spectrophotometer using a 1 mm quartz cell. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) measurements were performed using a FluoView FV10i (Olympus). In the motility assay, samples were irradiated with a 100 W mercury lamp and visualized by an epifluorescence microscope (Eclipse Ti; Nikon) using an oil-coupled
実施例１：ＧＦＰを内包した微小管の製造
ＴＰ−ＧＦＰを構築するために、スプリットＧＦＰシステム（Waldo et al, Nat. Biotechnol., 2006, 24, 79、およびWaldo et al, Nat. Biotechnol., 2005, 23, 102）を利用した。スプリットＧＦＰシステムでは、スーパーフォールダーＧＦＰのβ−ストランド１１（ＧＦＰ１１）のＣ末端フラグメントおよび末端切断型のＮ末端ＧＦＰ１−１０が自然にアセンブルして、蛍光性成熟ＧＦＰを形成する。ＧＦＰ１１およびＴＰが４アミノ酸リンカー（配列番号７：ＧＧＧＳＧＧＧ）によって連結されたＴＰ−ＧＦＰ１１を合成した。ＴＰとしては、配列番号２（ＫＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬ）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いた。得られたＴＰ−ＧＦＰ１１の構造は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて確認した。ＧＦＰ１−１０は、可溶性マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と融合することによって、大腸菌の可溶性フラクションとして発現させ、ＴＥＶプロテアーゼ処理によってＭＢＰを除去後に精製した。
Example 1: Production of Microtubules Containing GFP To construct TP-GFP, split GFP systems (Waldo et al, Nat. Biotechnol., 2006, 24, 79, and Waldo et al, Nat. Biotechnol., 2005, 23, 102) was used. In the split GFP system, the C-terminal fragment of β-strand 11 (GFP11) of superfolder GFP and the terminal-cleaving N-terminal GFP1-10 naturally assemble to form a fluorescent mature GFP. TP-GFP11 in which GFP11 and TP were linked by a 4-amino acid linker (SEQ ID NO: 7: GGGSGGG) was synthesized. As the TP, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (KKHVPGGGSVQIVYKPVDL) was used. The structure of the obtained TP-GFP11 was confirmed using MALDI-TOF-MS. GFP1-10 was expressed as a soluble fraction of E. coli by fusing with soluble maltose-binding protein (MBP) and purified after removal of MBP by TEV protease treatment.
（１）ＴＰ−ＧＦＰ１１およびＧＦＰ１１ペプチドの合成
ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチド（配列番号１０）のために、Ｈ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｙｒ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ樹脂を、標準的なＦｍｏｃに基づく固相化学（４当量、Ｆｍｏｃ−アミノ酸）を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ樹脂（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄ． Ｌｔｄ）上に合成した。１−［（１−（シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）−ジメチルアミノ−モルホリノメチレン）］メタンアニミウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ，４当量）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ， ４当量）のＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）溶液をカップリング試薬として用いた。各縮合反応を室温で９０分間行った。樹脂からのＦｍｏｃ基の脱保護は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の４０％および２０％ピペリジンを用いて行った。該ペプチジル樹脂をＮＭＰおよびＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、次いで真空乾燥した。ペプチドを脱保護し、切断カクテル（トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水／エタンジチオール／トリイソプロピルシラン＝９４／２．５／２．５／１，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）での処理によって樹脂から切断した。混合物を室温で３時間維持した。濾過後、氷冷したｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを加えて沈殿させた。遠心分離後、ペプチドをｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで３回洗浄した。沈殿したペプチドを真空乾燥した。祖生成物を、水／アセトニトリル（どちらも、０．１％ＴＦＡを含有している、８０／２０から６０／４０，ｖ／ｖで１００分、直線勾配、１０ｍＬ／分，２２０ｎｍで検出）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。単離収率は５６％であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ： ｍ／ｚ 実測値：４２５６（［Ｍ＋Ｈ］＋），計算値４２６０
(1) Synthesis of TP-GFP11 and GFP11 peptide For TP-GFP11 peptide (SEQ ID NO: 10), H-Arg (Pbb) -Asp (OtBu) -His (Trt) -Met-Val-Leu-His (Trt) ) -Glu (OtBu) -Tyr (Boc) -Val-Asn (Trt) -Ala-Ala-Gly-Ile-Thr (tBu) -Gly-Gly-Gly-Ser (Trt) -Gly-Gly-Gly-Lys (Boc) -Lys (Boc) -His (Trt) -Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser (Trt) -Val-Gln (Trt) -Ile-Val-Tyr (Boc) -Lys (Boc)- Pro-Val-Asp (OtBu) -Leu-Alko-PEG resin, using standard Fmoc-based solid phase chemistry (4 equivalents, Fmoc-amino acid), Fmoc-Leu-Alko-PEG resin (Watanabe Chemical Ind). . Ltd) was synthesized on top. 1-[(1- (Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylideneaminooxy) -dimethylamino-morpholinomethylene)] methaneanimium hexafluorophosphate (COMU, 4 eq) and diisopropylethylamine (DIPEA, 4 eq) A solution of N-methylpyrrolidone (NMP) was used as the coupling reagent. Each condensation reaction was carried out at room temperature for 90 minutes. Deprotection of the Fmoc group from the resin was performed with 40% and 20% piperidine in N, N-dimethylformamide (DMF). The peptidyl resin was washed with NMP and CH 2 Cl 2 and then vacuum dried. Deprotect the peptide and resin by treatment with a cleavage cocktail (trifluoroacetic acid (TFA) / water / ethanedithiol / triisopropylsilane = 94 / 2.5 / 2.5 / 1, v / v / v / v). Disconnected from. The mixture was maintained at room temperature for 3 hours. After filtration, ice-cooled tert-butyl methyl ether was added and precipitated. After centrifugation, the peptides were washed 3 times with tert-butyl methyl ether. The precipitated peptide was vacuum dried. The ancestral product was subjected to water / acetonitrile (both containing 0.1% TFA, detected at 80/20 to 60/40, v / v for 100 minutes, linear gradient, 10 mL / min, 220 nm). Purified by RP-HPLC used. The isolated yield was 56%. MALDI-TOF-MS: m / z Measured value: 4256 ([M + H] + ), calculated value 4260
ＧＦＰ１１ペプチド（Ｈ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−ＯＨ（配列番号１１））は、上記と同様の手法で、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｌｋｏ−ＰＥＧ樹脂を用いて調製した。単離収率は４５％であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：ｍ／ｚ実測値：１８２７（［Ｍ＋Ｈ］＋），計算値１８２７ The GFP11 peptide (H-Arg-Asp-His-Met-Val-Leu-His-Glu-Tyr-Val-Asn-Ala-Ala-Gly-Ile-Thr-OH (SEQ ID NO: 11)) is similar to the above. The procedure was prepared using Fmoc-Thr (tBu) -Alko-PEG resin. The isolated yield was 45%. MALDI-TOF-MS: m / z measured value: 1827 ([M + H] + ), calculated value 1827
（２）ＧＦＰ−１０の設計
大腸菌でＧＦＰ１−１０を可溶性フラクションとして発現させるために、ＧＦＰ１−１０を、ＴＥＶプロテアーゼによって切断可能なリンカーによって連結された可溶性マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と融合させた（図１）。ＭＢＰは、ＴＥＶプロテアーゼ処理によって除去され、得られたＧＦＰ１−１０は下記のように精製した。
(2) Design of GFP-10 In order to express GFP1-10 as a soluble fraction in Escherichia coli, GFP1-10 was fused with a soluble maltose-binding protein (MBP) linked by a linker cleavable by TEV protease (MBP). Figure 1). MBP was removed by TEV protease treatment and the resulting GFP1-10 was purified as follows.
（３）ＭＢＰ−ＧＦＰ１−１０プラスミドの構築
ＧＦＰ１−１０のヌクレオチドフラグメントをＰＣＲ法により、合成したヌクレオチドフラグメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）から増幅した。ＧＦＰ１−１０フラグメントを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）を用いて、Ｎ末端にＭＢＰが位置し、続いてＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するｐＭａｌ−ｃ２Ｘベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中にクローン化した。
(3) Construction of MBP-GFP1-10 plasmid The nucleotide fragment of GFP1-10 was amplified from the synthesized nucleotide fragment (Thermo Fisher) by the PCR method. The GFP1-10 fragment was cloned into a pMal-c2X vector (New England Biolabs) with an MBP located at the N-terminus followed by a TEV protease cleavage site using the In-Fusion HD cloning kit (TaKaRa Bio). ..
（４）ＧＦＰ１−１０の発現および精製
ＧＦＰ１−１０をコードするｐＭａｌ−ｃ２Ｘベクターを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。細菌細胞を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢＡ寒天上に広げ、３７℃で一晩生育させた。単一の形質転換コロニーをＬＢＡ培地中３７℃で一晩生育させた。新鮮なＬＢＡ培地を添加して培養物を１００倍に希釈し、ＯＤ ６００ｎｍで０．５まで生育させ、次いで、培養物を０．１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）とともに３７℃でインキュベートした。３時間インキュベーション後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を回収した。細胞ペレットを氷上のＮｉ−アフィニティー結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中に懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解させた。１３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、上清を１ｍＬ Ｎｉ−アフィニティーカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。同じバッファーで洗浄後、Ｎｉ−アフィニティー溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ，５００ｍＭイミダゾール、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を用いて、タンパク質をカラムから溶出させた。溶出したサンプルを１ｍＬ ＭＢＰ Ｔｒａｐカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。ＭＢＰ Ｔｒａｐ結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、ＭＢＰ Ｔｒａｐ溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭマルトース）を用いて、タンパク質をカラムから溶出させた。溶出サンプルとＴＥＶプロテアーゼの２８０ｎｍでの吸光度比が５対１になるまで、ＴＥＶプロテアーゼを溶出サンプルに加えた。ＤＴＴ（１ｍＭ）を混合物に加え、２５℃で一晩インキュベートした。次いで、ＧＦＰ１−１０を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含まないＮｉ−アフィニティー結合および溶出バッファーを用いて、上記のＮｉ−アフィニティーカラムによって精製した。ＧＦＰ１−１０の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。ＧＦＰ１−１０の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。
(4) Expression and purification of GFP1-10 The pMal-c2X vector encoding GFP1-10 was transformed into Escherichia coli strain BL21 (DE3). Bacterial cells were spread on LBA agar containing 100 μg / mL ampicillin and grown overnight at 37 ° C. Single transformed colonies were grown overnight at 37 ° C. in LBA medium. Fresh LBA medium was added to dilute the culture 100-fold and grow to 0.5 at OD 600 nm, then the culture was subjected to 0.1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). ) And incubated at 37 ° C. After incubation for 3 hours, cells were collected by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes. Cell pellets were suspended in Ni-affinity binding buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, 1% Triton X-100) on ice. Cells were lysed by sonication. After centrifugation at 13000 rpm for 10 minutes, the supernatant was loaded onto a 1 mL Ni-affinity column (GE healthcare). After washing with the same buffer, proteins were eluted from the column using Ni-affinity elution buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 200 mM NaCl, 500 mM imidazole, 0.1% Triton X-100). The eluted sample was loaded onto a 1 mL MBP Trap column (GE healthcare). After washing with MBP Trap binding buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA), MBP Trap elution buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10 mM EDTA) is added. The protein was eluted from the column using. TEV protease was added to the elution sample until the absorbance ratio of the elution sample to TEV protease at 280 nm was 5: 1. DTT (1 mM) was added to the mixture and incubated overnight at 25 ° C. GFP1-10 was then purified by the Ni-affinity column described above using Triton X-100-free Ni-affinity binding and elution buffer. The purity of GFP1-10 was evaluated by SDS-PAGE. The concentration of GFP1-10 was measured by the Bradford method.
（５）ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチドのＧＦＰ１−１０への結合アフィニティーの評価
２μＭ ＧＦＰ１−１０および０、２、１０、２０、および５０μＭ ＴＰ−ＧＦＰ１１またはＧＦＰ１１ペプチド（以下、単に「ペプチド」という）を含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ中の水溶液を２５℃で５時間、暗所でインキュベートした。次いで、得られた溶液の蛍光スペクトルを２５℃で、４８０ｎｍの励起光によって測定した。再構成したＧＦＰに由来する５１０ｎｍの蛍光強度から、ΔＩ＝Ｉ−Ｉ０を計算した（式中、Ｉは、各濃度のペプチドの存在下での溶液の蛍光強度であり、Ｉ０は、ペプチド不在下での蛍光強度である）。ΔＩをペプチド濃度の関数としてプロットし、ＥｘｃｅｌおよびＳｏｌｖｅｒを用いて、下記の等式（１）に二次結合関数を適合させることによってＫｄおよびΔＩｍａｘを決定した。ここで、ΔＩｍａｘは、飽和蛍光差である。
上記の通り、ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチドをＧＦＰ１−１０と一緒に５時間インキュベーションした後、成熟ＴＰ−ＧＦＰのアッセンブリーを蛍光発光を用いてモニターした結果、蛍光滴定を用いて測定した成熟アッセンブリーについての解離定数（Ｋｄ）は、１．１±０．７０μＭであった。該Ｋｄ値は、非修飾ＧＦＰ１１を用いた場合の解離定数（０．８３±０．４４μＭ）と類似していた。したがって、ＴＰの導入により成熟ＧＦＰの再構成に与えられる影響は最小限であることが分かった。 As described above, after incubating the TP-GFP11 peptide with GFP1-10 for 5 hours, the mature TP-GFP assembly was monitored using fluorescence emission, and as a result, the dissociation constant for the mature assembly measured using fluorescence titration. (Kd) was 1.1 ± 0.70 μM. The Kd value was similar to the dissociation constant (0.83 ± 0.44 μM) when unmodified GFP11 was used. Therefore, it was found that the effect of introducing TP on the reconstruction of mature GFP was minimal.
（６）テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）−標識チューブリンの調製
ＴＭＲ−標識チューブリン（チューブリン−ＴＭＲ）は、５−カルボキシテトラメチルローダミンスクシニミジルエステルを用いて標準的な方法にしたがって調製した。ＴＭＲ修飾チューブリンの標識比率は、該タンパク質とＴＭＲの吸光度をそれぞれ２８０および５５５ｎｍで測定することによって決定した。
(6) Preparation of Tetramethylrhodamine (TMR) -labeled tubulin TMR-labeled tubulin (Tubulin-TMR) was prepared according to a standard method using 5-carboxytetramethylrhodamine succinimidyl ester. The labeling ratio of TMR-modified tubulin was determined by measuring the absorbance of the protein and TMR at 280 and 555 nm, respectively.
（７）ＣＬＳＭ測定
ガラス底皿（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を１ｍｇ／ｍＬポリ−Ｌ−リジン（Ｍｗ：３００００−７００００，Ｓｉｇｍａ）によって室温で１時間コートし、次いで、除去および乾燥した。微小管サンプルをプレート上に置き、室温で０．５〜１時間維持し、ＣＬＳＭによって観察した。チューブリンの−ＴＭＲは、５５０ｎｍで励起し、５７４ｎｍ発光バンド−パスフィルター（赤色）によって観察された。ＧＦＰは、４８９ｎｍで励起し、５１０ｎｍ発光バンド−パスフィルター（緑色）によって観察された。ＡＴＴＯ ６４７Ｎ−標識抗−ＧＦＰシングルドメイン抗体（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ）は、６４７ｎｍで励起し、６６４ｎｍ発光バンド−パスフィルター（Ｍａｇｅｎｔａ）によって観察された。微小管あたりのＴＭＲ、ＧＦＰ、およびＡＴＴＯ ６４７Ｎ蛍光強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてバックグラウンド強度を引き算することによって、蛍光イメージから測定された。各微小管（Ｎ＝２０）につき、ＧＦＰ蛍光強度あたりのバックグラウンドを引き算したＡＴＴＯ６４７Ｎ蛍光強度、およびＴＭＲ蛍光強度あたりのＧＦＰ蛍光強度は、少なくとも６つのイメージから算出した。
(7) CLSM measurement A glass bottom dish (Massunami, Osaka, Japan) was coated with 1 mg / mL poly-L-lysine (Mw: 30,000-70000, Sigma) for 1 hour at room temperature, and then removed and dried. Microtubule samples were placed on plates, maintained at room temperature for 0.5-1 hours and observed by CLSM. Tubulin-TMR was excited at 550 nm and observed by a 574 nm emission band-pass filter (red). GFP was excited at 489 nm and observed by a 510 nm emission band-pass filter (green).
（８）ＴＰ−ＧＦＰ結合微小管の構築
典型的に、ＴＰ−ＧＦＰは、ＧＦＰ１−１０（２５μＭ）および５当量のＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチド（１２５μＭ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ中、２５℃で５時間、暗所でインキュベートすることによって調製した。該混合物を２５μＭ ＴＰ−ＧＦＰとして用いた。ＴＰを用いずに再構成されたＧＦＰは、ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチドの代わりにＧＦＰ１１を用いて同じ方法で調製された。典型的な“Ｂｅｆｏｒｅ”法において、ＴＰ−ＧＦＰ溶液（３μＬ）を、ＢＲＢ８０バッファー（８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．９、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ＥＧＴＡ）中のチューブリン溶液（５μＬ）に加えた。混合物を２５℃で３０分間、暗所で維持した。２μＬのＧＭＰＣＰＰプレミックス（１ｍＭ ＧＭＰＣＰＰ、８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．９、２１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ＥＧＴＡ）を該混合物に加え、重合のために３７℃で３０分間、暗所で維持した（最終濃度：［チューブリン］＝２．５μＭ、［ＧＦＰ１−１０］＝５μＭ、［ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチド］＝２５μＭ）。典型的な“Ａｆｔｅｒ”法において、ＧＭＰＣＰＰプレミックス（２μＬ）をＢＲＢ８０バッファー中のチューブリン（５μＬ）に加えた。重合のために、混合物を３７℃で３０分間、暗所で維持した。次いで、ＴＰ−ＧＦＰ（３μＬ）を混合物に加え、２５℃で３０分間、暗所で維持した（最終濃度：［チューブリン］＝２．５μＭ、［ＧＦＰ１−１０］＝５μＭ、［ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチド］＝２５μＭ）。どちらの方法も、微小管のモニタリングのために、チューブリンおよびチューブリン−ＴＭＲを４：１の比率で、合計濃度２．５μＭで用いた。ＴＰ−ＧＦＰの調製、およびＢｅｆｏｒｅ法によるＴＰ−ＧＦＰ結合微小管の構築を図２ａおよび図２ｂに示す。
(8) Construction of TP-GFP-binding microtubules TP-GFP typically contains GFP1-10 (25 μM) and 5 equivalents of TP-GFP11 peptide (125 μM) in 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4, 200 mM NaCl. Prepared by incubating in the dark at 25 ° C. for 5 hours. The mixture was used as 25 μM TP-GFP. GFP reconstituted without TP was prepared in the same manner using GFP11 instead of the TP-GFP11 peptide. In a typical "Before" method, TP-GFP solution (3 μL) was added to tubulin solution (5 μL) in BRB80 buffer (80 mM PIPES pH 6.9, 1.0 mM MgCl 2, 1.0 mM EGTA). The mixture was maintained at 25 ° C. for 30 minutes in the dark. 2 μL of GMPCPP premix (1 mM GMPCPP, 80 mM PIPES pH 6.9, 21 mM MgCl 2 , 1.0 mM EGTA) was added to the mixture and maintained in the dark at 37 ° C. for 30 minutes for polymerization (final concentration: [. Tubulin] = 2.5 μM, [GFP1-10] = 5 μM, [TP-GFP11 peptide] = 25 μM). In a typical "After" method, GMPCPP premix (2 μL) was added to tubulin (5 μL) in BRB80 buffer. For polymerization, the mixture was maintained at 37 ° C. for 30 minutes in the dark. TP-GFP (3 μL) was then added to the mixture and maintained in the dark at 25 ° C. for 30 minutes (final concentration: [tubulin] = 2.5 μM, [GFP1-10] = 5 μM, [TP-GFP11 peptide]. ] = 25 μM). Both methods used tubulin and tubulin-TMR in a 4: 1 ratio for a total concentration of 2.5 μM for microtubule monitoring. The preparation of TP-GFP and the construction of TP-GFP binding microtubules by the Before method are shown in FIGS. 2a and 2b.
（９）微小管上でのＴＰ−ＧＦＰの結合の評価
赤色蛍光および緑色蛍光による評価
ＴＰ−ＧＦＰの微小管への結合は、共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって特徴づけた。微小管をモニターするために、赤色蛍光性テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）をチューブリンにコンジュゲートした「チューブリン−ＴＭＲ」を用い、Ｂｅｆｏｒｅ法によって、上記の通りにＴＰ−ＧＦＰ結合微小管を調製した。すなわち、チューブリンとチューブリン−ＴＭＲをＴＰ−ＧＦＰと共にプレインキュベーションし、次いで、ＧＭＰＣＰＰとインキュベーションして、重合を誘導して微小管を形成させた。得られた微小管の蛍光を上記の通りＣＬＳＭによって観察した。
(9) Evaluation of TP-GFP binding on microtubules
Evaluation by Red and Green Fluorescence Binding of TP-GFP to microtubules was characterized by confocal laser scanning microscopy (CLSM). To monitor microtubules, TP-GFP bound microtubules were prepared as described above by the Before method using "tubulin-TMR" conjugated to tubulin with red fluorescent tetramethylrhodamine (TMR). .. That is, tubulin and tubulin-TMR were pre-incubated with TP-GFP and then incubated with GMPCPP to induce polymerization to form microtubules. The fluorescence of the obtained microtubules was observed by CLSM as described above.
その結果、緑色のＴＰ−ＧＦＰと赤色の微小管の共局在化により、ＴＰ−ＧＦＰの微小管への結合が成功したことが示された（図３ａ）。さらに、予め形成させた微小管にＴＰ−ＧＦＰを添加した場合（Ａｆｔｅｒ法）でも、ＴＰ−ＧＦＰの微小管への結合がまだ観察された。さらに、ＴＰを用いずにＧＦＰ１−１０とＧＦＰ１１ペプチドから構築したＧＦＰは、微小管に結合しなかった。これは、ＧＦＰの微小管への結合にＴＰ部分が必要なことを示す。 As a result, it was shown that the co-localization of green TP-GFP and red microtubules succeeded in binding TP-GFP to microtubules (Fig. 3a). Furthermore, even when TP-GFP was added to the preformed microtubules (After method), binding of TP-GFP to the microtubules was still observed. Furthermore, GFP constructed from GFP1-10 and GFP11 peptides without TP did not bind to microtubules. This indicates that the TP moiety is required for binding of GFP to microtubules.
抗−ＧＦＰ抗体による評価
ＴＰ−ＧＦＰ結合微小管を上記の通りに調製した。次いで、５μＭ 蛍光性ＡＴＴＯ ６４７Ｎ−標識 抗−ＧＦＰシングルドメイン抗体（２μＬ、Ｎａｎｏｔａｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＴＰ−ＧＦＰ結合微小管溶液（８μＬ）に加え、２５℃で１時間、暗所でインキュベートした（最終濃度：［チューブリン］＝２．５μＭ、［ＧＦＰ１−１０］＝５μＭ、［ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチド］＝２５μＭ、［抗−ＧＦＰ抗体］＝１μＭ）。混合物をＣＬＳＭイメージングに用いた。これにより、Ｂｅｆｏｒｅ法を用いるＴＰ−ＧＦＰの微小管への結合の性質を解明した（図３ｂ）。
Evaluation with anti-GFP antibody TP-GFP binding microtubules were prepared as described above. A 5
その結果、ＴＰ−ＧＦＰ結合微小管をＢｅｆｏｒｅ法によって調製した場合、抗−ＧＦＰ抗体由来の低い蛍光が観察された。これは、おそらく、抗−ＧＦＰ抗体は、微小管内部へアクセスするのが困難なため、内包されたＴＰ−ＧＦＰに結合しないためと考えられる。対照的に、抗−ＧＦＰ抗体由来の強い蛍光が、Ａｆｔｅｒ法を用いた場合に観察された。抗−ＧＦＰ抗体処理した各ＴＰ−ＧＦＰ結合微小管のＩＡＴＴＯ６４Ｎ／ＩＧＦＰをＣＬＳＭイメージから決定した（図３ｃ）。ここで、ＩＡＴＴＯ６４Ｎは、抗−ＧＦＰ抗体由来の蛍光強度を示し、ＩＧＦＰは、ＧＦＰ由来の蛍光強度を示す。Ｂｅｆｏｒｅ法を用いて調製された微小管における、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ蛍光強度のＴＰ−ＧＦＰ蛍光強度に対する低い比率は、ＴＰ−ＧＦＰの大部分が微小管内部に結合したことを示す。一方、Ａｆｔｅｒ法では、微小管の外側へのＴＰ−ＧＦＰの結合をもたらしたため、抗−ＧＦＰ抗体を用いて検出できた（図３ｃ）。
As a result, when TP-GFP-bound microtubules were prepared by the Before method, low fluorescence derived from the anti-GFP antibody was observed. This is probably because the anti-GFP antibody does not bind to the encapsulated TP-GFP because it is difficult to access the inside of microtubules. In contrast, strong fluorescence from the anti-GFP antibody was observed when using the After method. I ATTO64N / I GFP of each TP-GFP binding microtubule treated with anti-GFP antibody was determined from CLSM images (Fig. 3c). Here, I ATTO64N shows the fluorescence intensity derived from the anti-GFP antibody, and I GFP shows the fluorescence intensity derived from GFP. A low ratio of
抗−チューブリン抗体による評価
ＴＰ−ＧＦＰの結合特異性をさらに確認するために、微小管の外表面に位置するチューブリンのＣ末端領域に選択的に結合する抗−チューブリン抗体を用いて置換実験を行った。微小管の外側に結合したＴＰ−ＧＦＰは、抗−チューブリン抗体を用いて置換することができる。ＴＰ−ＧＦＰ−結合微小管を上記の通りに調製した。次いで、０．５ｍｇ／ｍＬの抗−チューブリンモノクローナル抗体（３μＬ、Ｗａｋｏ）をＴＰ−ＧＦＰ−結合微小管溶液（７μＬ）に加え、２５℃で１時間、暗所でインキュベートした（最終濃度：［チューブリン］＝２μＭ、［チューブリン−ＴＭＲ］＝０．５μＭ、［ＧＦＰ１-１０］＝５μＭ、［ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチド］＝２５μＭ、［抗−チューブリン抗体］＝０．１５ｍｇ／ｍＬ）。混合物をＣＬＳＭイメージングに用いた。
Evaluation by anti-tubulin antibody To further confirm the binding specificity of TP-GFP, it was replaced with an anti-tubulin antibody that selectively binds to the C-terminal region of tubulin located on the outer surface of microtubules. An experiment was conducted. TP-GFP bound to the outside of microtubules can be replaced with anti-tubulin antibody. TP-GFP-bound microtubules were prepared as described above. A 0.5 mg / mL anti-tubulin monoclonal antibody (3 μL, Wako) was then added to the TP-GFP-linked microtubule solution (7 μL) and incubated at 25 ° C. for 1 hour in the dark (final concentration: [. Tubulin] = 2 μM, [Tubulin-TMR] = 0.5 μM, [GFP1-10] = 5 μM, [TP-GFP11 peptide] = 25 μM, [Anti-tubulin antibody] = 0.15 mg / mL). The mixture was used for CLSM imaging.
その結果、Ｂｅｆｏｒｅ法を用いて調製されたＴＭＲ−標識微小管に結合したＴＰ−ＧＦＰの蛍光は、該抗体の添加によって有意に影響されなかった。したがって、ＴＰ−ＧＦＰの主要な結合部位が微小管の外表面にないことが示された。対照的に、Ａｆｔｅｒ法を用いて調製された微小管では、抗チューブリン抗体処理により、ＴＰ−ＧＦＰ由来の蛍光の大きな減少がもたらされた。したがって、Ａｆｔｅｒ法では、ＴＰ−ＧＦＰの結合が主に外表面で起こったことが示された。 As a result, the fluorescence of TP-GFP bound to TMR-labeled microtubules prepared using the Before method was not significantly affected by the addition of the antibody. Therefore, it was shown that the major binding site for TP-GFP is not on the outer surface of microtubules. In contrast, in microtubules prepared using the After method, anti-tubulin antibody treatment resulted in a large reduction in fluorescence from TP-GFP. Therefore, the After method showed that the binding of TP-GFP occurred mainly on the outer surface.
（１０）微小管上に結合したＴＰ−ＧＦＰの量の評価
ＴＰ−ＧＦＰ結合微小管を上記の通りに調製した（最終濃度：［チューブリン］＝２．５μＭ、［ＧＦＰ１−１０］＝１、５、１０μＭ、［ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチド］＝５，２５，５０μＭ（ＧＦＰ１−１０に対し５当量））。ＴＰ−ＧＦＰ結合微小管および遊離ＴＰ−ＧＦＰを５００００ｒｐｍで３７℃で５分間超遠心分離後、上清を回収し、ＢＲＢ８０バッファーで１７倍希釈した。次いで、該溶液の蛍光スペクトルを２５℃で、４８０ｎｍでの励起光によって測定した。微小管に結合したＴＰ−ＧＦＰの濃度を下記の等式（２）にしたがって概算した。
上記の通り、Ｂｅｆｏｒｅ法を用いて調製された微小管上に結合したＴＰ−ＧＦＰの量は、超遠心によるＴＰ−ＧＦＰ微小管の沈殿後、上清中の遊離ＴＰ−ＧＦＰの蛍光を測定することによって評価された。２．５μＭチューブリンおよび５μＭ ＴＰ−ＧＦＰを用いる典型的な内包化条件下で、結合したＴＰ−ＧＦＰ 対 チューブリン二量体の比率は、０．３１であった。これらの条件下で多くのＴＰ−ＧＦＰは、恐らく微小管の内部に結合したので（図３ｃ）、チューブリン二量体の約３０％が結合したＴＰ−ＧＦＰを有したと結論付けられる。微小管内部へのＴＰ−ＧＦＰの結合は外部への結合よりも強いと考えられるので、ＴＰ−ＧＦＰは、低濃度で内部に選択的に結合する。ＴＰ−ＧＦＰの濃度が１０μＭに増加したとき、結合したＴＰ−ＧＦＰ 対 チューブリン二量体の比率は、１．２６に増加した（表１）。該結果は、ＴＰ−ＧＦＰの濃度を上げると、微小管の外表面へも結合しうることを示す。 As described above, the amount of TP-GFP bound on microtubules prepared using the Before method measures the fluorescence of free TP-GFP in the supernatant after precipitation of TP-GFP microtubules by ultracentrifugation. It was evaluated by that. Under typical encapsulation conditions with 2.5 μM tubulin and 5 μM TP-GFP, the ratio of bound TP-GFP to tubulin dimer was 0.31. Since many TP-GFPs were bound to the interior of microtubules under these conditions (Fig. 3c), it can be concluded that about 30% of the tubulin dimer had bound TP-GFP. Since the binding of TP-GFP to the inside of microtubules is considered to be stronger than the binding to the outside, TP-GFP selectively binds to the inside at a low concentration. When the concentration of TP-GFP increased to 10 μM, the ratio of bound TP-GFP to tubulin dimer increased to 1.26 (Table 1). The results show that increasing the concentration of TP-GFP can also bind to the outer surface of microtubules.
（１１）ＴＰ−ＧＦＰ結合微小管の特性
次に、微小管の長さ、剛直性(持続長）およびキネシンで被覆した基体上での運動速度がＴＰ−ＧＦＰの結合によってどのように影響されるかを調べた（図４）。
(11) Characteristics of TP-GFP-bound microtubules Next, how the length, rigidity (duration) of microtubules, and kinetic velocity on a kinesin-coated substrate are affected by TP-GFP binding. Was investigated (Fig. 4).
運動性アッセイ
ＴＰ−ＧＦＰ−内包微小管を上記の通りに調製した（最終濃度：［チューブリン］＝２μＭ、［チューブリン−ＴＭＲ］＝０．５μＭ、［ＧＦＰ１−１０］＝５μＭ、［ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチド］＝２５μＭ）。ＴＰ−ＧＦＰの濃度は、実験条件にしたがって変化させた。コントロールとして、ＴＰ−ＧＦＰを混合しない以外は同様に微小管を調製した（非結合微小管）。別のコントロールとして、ＴＭＲで標識したＴＰ（ＴＰ−ＴＭＲ）を有する微小管を調製した。ＴＰ−ＴＭＲは、ＴＰとして配列番号２に示されるペプチドを用い、リンカーを介してＮ末端にシステインを導入してＴＭＲ標識を付加した（ＴＭＲ−ＣＧＧＧＫＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬ(配列番号１８））。Ａｌｅｘａ４８８標識したチューブリンとＴＰ−ＴＭＲを用いて、また別のコントロールとして、Ａｌｅｘａ４８８標識したチューブリンのみを用いて、Ｂｅｆｏｒｅ法によって微小管を調製した（それぞれ、ＴＰ−ＴＭＲ−ＭＴｓ、および非結合ＭＴｓ）。
Motility Assay TP-GFP-encapsulated microtubules were prepared as described above (final concentration: [tubulin] = 2 μM, [tubulin-TMR] = 0.5 μM, [GFP1-10] = 5 μM, [TP- GFP11 peptide] = 25 μM). The concentration of TP-GFP was changed according to the experimental conditions. As a control, microtubules were prepared in the same manner except that TP-GFP was not mixed (unbound microtubules). As another control, microtubules with TMR-labeled TP (TP-TMR) were prepared. For TP-TMR, the peptide shown in SEQ ID NO: 2 was used as TP, and cysteine was introduced at the N-terminal via a linker to add a TMR label (TMR-CGGGKKHVPGGGSVQIVYKPVDL (SEQ ID NO: 18)). Microtubules were prepared by the Before method using Alexa488-labeled tubulin and TP-TMR and, as another control, only Alexa488-labeled tubulin (TP-TMR-MTs and unbound MTs, respectively). ).
運動性アッセイは、サイズ（５×７）ｍｍ２および（４０×５０）ｍｍ２の２つのカバーガラスから構成される、５．０×５．０×０．１５ｍｍ３（ｗ×ｌ×ｈ）の寸法を有するフローセル（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）中で行い、両面テープをスペーサーとして用いた。まず、ＢＲＢ８０バッファー中の０．５ｍｇ／ｍＬカゼインをフローセル上に導入し、３分間インキュベートした。次いで、該溶液を、０．６μＭキネシンを含有する洗浄バッファー（ＢＲＢ８０バッファー中、０．５ｍｇ／ｍＬカゼイン、４．５ｍｇ／ｍＬ Ｄ−グルコース、５０Ｕ／ｍＬグルコースオキシダーゼ、５０Ｕ／ｍＬカタラーゼ、１．０ｍＭ ＤＴＴ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２）と交換し、３分間インキュベートした。洗浄バッファーで洗浄後、該溶液を微小管溶液と交換し、３分間インキュベートした。洗浄バッファーで洗浄後、該溶液を、５．０ｍＭ ＡＴＰおよび１．０ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘを含有する洗浄バッファーと交換すること（ＡＴＰの添加）によって微小管の運動を開始させた。次いで、微小管の運動性を蛍光顕微鏡下でモニターし、画像化した。すべての実験は室温で行った。 The motility assay consists of two coverslips of size (5 x 7) mm 2 and (40 x 50) mm 2 5.0 x 5.0 x 0.15 mm 3 (w x l x h). It was carried out in a flow cell (MATSUNAMI) having the dimensions of, and a double-sided tape was used as a spacer. First, 0.5 mg / mL casein in BRB80 buffer was introduced onto the flow cell and incubated for 3 minutes. The solution was then added to a wash buffer containing 0.6 μM kinesin (0.5 mg / mL casein, 4.5 mg / mL D-glucose, 50 U / mL glucose oxidase, 50 U / mL catalase, 1.0 mM in BRB80 buffer). It was replaced with DTT, 1.0 mM MgCl 2 ) and incubated for 3 minutes. After washing with wash buffer, the solution was replaced with a microtubule solution and incubated for 3 minutes. After washing with wash buffer, microtubule movement was initiated by exchanging the solution with wash buffer containing 5.0 mM ATP and 1.0 mM Trolox (addition of ATP). The motility of the microtubules was then monitored and imaged under a fluorescence microscope. All experiments were performed at room temperature.
運動性アッセイのイメージ分析
微小管の運動性アッセイの動画および蛍光顕微鏡によって得られた画像を分析して、画像分析ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いることにより、各微小管の運動速度、端から端までの長さ、および全長（contour length）を決定した。持続長（Ｌｐ）を決定するために、各微小管に沿った全長および同じ微小管の端から端までの距離の両方を測定した。Ｌｐは、ＥｘｃｅｌおよびＳｏｌｖｅｒを用いて、データを下記の等式（３）にフィットさせることによって決定した。
その結果、５μＭ ＴＰ−ＧＦＰが微小管内部へ結合した場合、ＴＰ−ＧＦＰを含まない非結合微小管と比べて、全長（約１．７倍）および持続長（Ｌｐ、約４．０倍）を劇的に増加させた（図５ａおよびｂ）。なお、持続長は、剛直性の測定値として用いられる。特に、ＴＰ−ＧＦＰを用いる微小管の運動速度は、非結合微小管と比べて２２％増加した（０．８４±０．０２ 対 ０．６９±０．０３μｍ ｓ−１、図５ｃ）。金属ナノ粒子の外表面へのコンジュゲーションは微小管運動を低下させることが知られているので、本願のＧＦＰ内包微小管の運動速度増加は興味深い。 As a result, when 5 μM TP-GFP is bound to the inside of microtubules, the total length (about 1.7 times) and the duration (Lp, about 4.0 times) are compared with the unbound microtubules not containing TP-GFP. Was dramatically increased (Fig. 5a and b). The duration is used as a measured value of rigidity. In particular, the rate of motion of microtubules using TP-GFP increased by 22% compared to unbound microtubules (0.84 ± 0.02 vs. 0.69 ± 0.03 μm s -1 , FIG. 5c). Since the conjugation of metal nanoparticles to the outer surface is known to reduce microtubule motion, the increase in kinesthetic velocity of GFP-encapsulated microtubules of the present application is interesting.
ＧＭＰＣＰＰの存在下での微小管重合が、ＧＴＰの存在下で重合した微小管よりも高い曲げ剛直性を有することはよく知られており、これらの剛直性微小管は、より柔軟な誘導体よりも速く移動することが知られている。さらに、キネシンは、剛直性ＧＭＰＣＰＰ−微小管に沿って、柔軟性ＧＴＰ−微小管より迅速に移動する。したがって、ＴＰ−ＧＦＰの内包化により本願の微小管の剛直性が増加したことが、運動速度の増加をもたらしたと考えるのが合理的である。逆に言えば、ＴＭＲ標識ＴＰを有する微小管（ＴＰ−ＴＭＲ−ＭＴｓ）の運動速度は、非結合微小管（非結合ＭＴｓ）のそれと類似していたので（図６）、ＧＦＰスキャフォールドがＴＰ−ＧＦＰ結合微小管の運動速度増加に重要な役割を有することが示唆される。 It is well known that microtubule polymerization in the presence of GMPCPP has higher bending rigidity than microtubules polymerized in the presence of GTP, and these rigid microtubules are more flexible than derivatives. It is known to move fast. In addition, kinesin moves along rigid GMPCPP-microtubules faster than flexible GTP-microtubules. Therefore, it is reasonable to consider that the increase in the rigidity of the microtubules of the present application due to the inclusion of TP-GFP resulted in the increase in the kinetic velocity. Conversely, the velocity of motion of microtubules with TMR-labeled TP (TP-TMR-MTs) was similar to that of unbound microtubules (unbound MTs) (FIG. 6), so the GFP scaffold was TP. It is suggested that it has an important role in increasing the kinetic rate of -GFP-bound microtubules.
本願のＧＦＰ内包微小管の特性は、ＴＰ−ＧＦＰの濃度に依存した（図７ａ−ｃ）。微小管の全長およびＬｐは、ＴＰ−ＧＦＰの濃度の増加と共に増加したが（図７ａ）、ＴＰ−ＧＦＰの濃度が５μＭから１０μＭに増加すると、運動速度が減少した（図７ｃ）。ＴＰ−ＧＦＰはおそらく、高濃度では微小管の内部と外部表面の両方に結合するので、これらの条件下において、微小管外部へのその結合がその運動を低下させる可能性がある。 The properties of the GFP-encapsulating microtubules of the present application depended on the concentration of TP-GFP (Fig. 7ac). The total length and Lp of microtubules increased with increasing concentration of TP-GFP (Fig. 7a), but as the concentration of TP-GFP increased from 5 μM to 10 μM, the rate of movement decreased (Fig. 7c). Since TP-GFP probably binds to both the inner and outer surfaces of microtubules at high concentrations, its binding to the outside of microtubules can reduce its motility under these conditions.
（１２）濁度測定
ＴＰ−ＧＦＰ結合微小管の安定性を評価するために、濁度測定を行った。濁度の増加は、微小管の形成率を示す。ＴＰ−ＧＦＰは、ＧＦＰ１−１０（２５μＭ）および５当量のＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチド（１２５μＭ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ中、２５℃で５時間、暗所でインキュベートすることによって調製した。ＢＲＢ８０バッファー中のＴＰ−ＧＦＰおよびチューブリンを混合し、３７℃でプレインキュベーションし、次いで、ＧＴＰプレミックス（ＢＲＢ８０バッファー中、５ｍＭ ＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５％ＤＭＳＯ、２０μＬ）を混合物（８０μＬ）に３７℃で添加することによって、濁度実験を行った（最終濃度：［チューブリン］＝２．５μＭ、［ＧＦＰ１−１０］＝５μＭ、［ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチド］＝２５μＭ、［ＧＴＰ］＝１ｍＭ）。コントロールとして、タキソールおよびＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチド（最終濃度：２５μＭ）をＴＰ−ＧＦＰの代わりに加えた。３５０ｎｍでの光学密度を、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトロメーターで６０分間、１分のインターバルでモニターした。６０分の実験後、サンプルを４℃で１５分間冷却し、光学密度を再度測定した。ＴＰ−ＧＦＰは３５０ｎｍで吸光度を有するので、ＴＰ−ＧＦＰを用いた場合は、濁度アッセイにおいてその吸光度を引き算した。２つの独立測定の平均を図８に示す。
(12) Turbidity measurement In order to evaluate the stability of TP-GFP-bound microtubules, turbidity measurement was performed. Increased turbidity indicates the rate of microtubule formation. TP-GFP is obtained by incubating GFP1-10 (25 μM) and 5 equivalents of TP-GFP11 peptide (125 μM) in 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4, 200 mM NaCl at 25 ° C. for 5 hours in the dark. Prepared. TP-GFP and tubulin in BRB80 buffer are mixed and preincubated at 37 ° C., then GTP premix (5 mM GTP, 20 mM MgCl 2 , 25% DMSO, 20 μL in BRB80 buffer) is added to the mixture (80 μL). Turbidity experiments were performed by addition at 37 ° C. (final concentration: [tubulin] = 2.5 μM, [GFP1-10] = 5 μM, [TP-GFP11 peptide] = 25 μM, [GTP] = 1 mM). .. As a control, taxol and TP-GFP11 peptide (final concentration: 25 μM) were added in place of TP-GFP. The optical density at 350 nm was monitored with a UV-Vis spectrometer for 60 minutes at 1 minute intervals. After the 60 minute experiment, the sample was cooled at 4 ° C. for 15 minutes and the optical density was measured again. Since TP-GFP has an absorbance at 350 nm, when TP-GFP was used, its absorbance was subtracted in the turbidity assay. The average of the two independent measurements is shown in FIG.
その結果、３７℃でＧＴＰの存在下でのチューブリンへのＴＰ−ＧＦＰの添加は、ＴＰと同じ部位に結合する抗ガン剤であるタキソールの添加と同様に、劇的に濁度を増加させた。濁度の増加は、チューブリン重合の増加を示す。注目すべきことに、ＧＦＰ１０を伴わないＴＰ−ＧＨＰ１１ペプチドの添加が、チューブリン重合の中程度の増加のみをもたらした。したがって、ＴＰ−ＧＦＰのＴＰおよび完全なＧＦＰスキャフォールドの両方が高い微小管重合率を安定化するのに必要であることが分かった。 As a result, the addition of TP-GFP to tubulin in the presence of GTP at 37 ° C. dramatically increased turbidity, similar to the addition of taxol, an anticancer agent that binds to the same site as TP. rice field. An increase in turbidity indicates an increase in tubulin polymerization. Notably, the addition of the TP-GHP11 peptide without GFP10 resulted in only a moderate increase in tubulin polymerization. Therefore, it was found that both TP of TP-GFP and complete GFP scaffold were required to stabilize high microtubule polymerization rates.
温度が４℃に減少して脱重合が開始したとき、ＴＰ−ＧＦＰ結合微小管は、非修飾微小管と比べて、部分的に安定なままであり、タキソール処理した微小管に類似していた（図８）。これらの結果は、おそらくＧＦＰスキャフォールドの微小管内面への結合のおかげで、ＴＰ−ＧＦＰの結合が脱重合に対する微小管の安定性を増加したことを示す。 When the temperature decreased to 4 ° C. and depolymerization began, the TP-GFP-bound microtubules remained partially stable compared to unmodified microtubules and resembled taxol-treated microtubules. (Fig. 8). These results indicate that TP-GFP binding increased the stability of microtubules to depolymerization, probably due to the binding of GFP scaffolds to the inner surface of microtubules.
（１３）ＴＰ−ＧＦＰ−微小管の温度安定性の評価
ＴＰ−ＧＦＰ内包微小管を上記の通りに調製した（最終濃度：［チューブリン］＝２．５μＭ，［ＧＦＰ１−１０］＝５μＭ、［ＴＰ−ＧＦＰ１１］＝２５μＭ）。５００００ｒｐｍで３７℃で５分間の超遠心分離後、上清を除去し、得られたペレットをＢＲＢ８０バッファー中に懸濁した。サンプルを２５、４０、５０、および６０℃で１日間インキュベートした。該溶液を２５℃に冷却し、ＣＬＳＭイメージングのために使用した。
(13) Evaluation of Temperature Stability of TP-GFP-Microtubules TP-GFP-encapsulating microtubules were prepared as described above (final concentration: [tubulin] = 2.5 μM, [GFP1-10] = 5 μM, [ TP-GFP11] = 25 μM). After ultracentrifugation at 50,000 rpm at 37 ° C. for 5 minutes, the supernatant was removed and the resulting pellet was suspended in BRB80 buffer. Samples were incubated at 25, 40, 50, and 60 ° C. for 1 day. The solution was cooled to 25 ° C. and used for CLSM imaging.
その結果、微小管に内包されたＴＰ−ＧＦＰは、５０−６０℃で凝集体を形成したので、ＴＰ−ＧＦＰ内包微小管は高温で不安定であると予測された。該結果は、微小管は５５℃で不安定であるとした以前の報告に一致する。したがって、ＴＰ−ＧＦＰ内包微小管の安定性は非結合微小管に類似していることが示唆された。 As a result, the TP-GFP contained in the microtubules formed aggregates at 50-60 ° C., so that the TP-GFP-encapsulated microtubules were predicted to be unstable at high temperatures. The results are consistent with previous reports that microtubules are unstable at 55 ° C. Therefore, it was suggested that the stability of TP-GFP-encapsulated microtubules is similar to that of unbound microtubules.
（１４）ＣＤ測定
ＴＰ−ＧＦＰ溶液をＢＲＢ８０バッファー中のチューブリン溶液に添加し、該混合物を２５℃で３０分間、暗所で維持した（最終濃度：［チューブリン］＝２．５μＭ、［ＧＦＰ１−１０］＝５μＭ、［ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチド］＝２５μＭ）。チューブリンとＴＰ−ＧＦＰの複合体のＣＤスペクトルを２５℃で記録した。ＴＰ−ＧＦＰ単独およびチューブリン単独を同条件下でコントロールとして用いた。チューブリンとＴＰ−ＧＦＰの複合体からチューブリンおよびＴＰ−ＧＦＰを引き算したＣＤスペクトルの差は、有意なピークを伴わない弱い強度を示した。このことは、チューブリンおよびＴＰ−ＧＦＰの二次構造がそれらの結合によって最小限に影響を受けたのみであったことを示す。
(14) CD measurement A TP-GFP solution was added to the tubulin solution in BRB80 buffer and the mixture was maintained at 25 ° C. for 30 minutes in the dark (final concentration: [tubulin] = 2.5 μM, [GFP1]. -10] = 5 μM, [TP-GFP11 peptide] = 25 μM). The CD spectrum of the tubulin-TP-GFP complex was recorded at 25 ° C. TP-GFP alone and tubulin alone were used as controls under the same conditions. The difference in the CD spectrum obtained by subtracting tubulin and TP-GFP from the tubulin and TP-GFP complex showed weak intensity without significant peaks. This indicates that the secondary structures of tubulin and TP-GFP were only minimally affected by their binding.
（１５）分子モデリング
分子力学計算は、デフォルト設定した、液体シミュレーションの最適化ポテンシャル（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｉｑｕｉｄ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ（ＯＰＬＳ））２００５力場を用いるＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ １０．４（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）を用いて行った。リガンドとして、ＴＰ−ＧＦＰを下記の通りに調製した。ＴＰ−ＧＦＰ１１ペプチドのモデル構造は、スーパーフォールダーＧＦＰ（ＰＤＢ ＩＤ： ２Ｂ３Ｐ）から抽出したＧＦＰ１１構造およびＴＰ構造をリンカー（ＧＧＧＳ）によって手動で連結することによって調製した。ＴＰ−ＧＦＰ１１のリンカー部分は、Ｍａｅｓｔｒｏ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｖｅｒ．１０．４（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ）を用いてエネルギーを最小限にした。ＴＰ−ＧＦＰ１１を、スーパーフォールダーＧＦＰ（ＰＤＢ ＩＤ： ２Ｂ３Ｐ）から抽出したＧＦＰ１−１０に置き、エネルギーを最小限にした。ＴＰ−ＧＦＰ１１とＧＦＰ１−１０の複合体をＴＰ−ＧＦＰとして用いた。ＧＭＰＣＰＰで安定化した微小管（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｊ６Ｅ）の３つの隣接するチューブリンの構造を分子モデリングおよびリガンドドッキングとして用いた。失われた水素原子の該モデルへの付加は、明白な全原子モデルに基づいて行われた。ＴＰ−ＧＦＰを、該３つの隣接するチューブリンの中央のβ−チューブリンのタキソール結合ポケットに置いた。ＴＰ−ＧＦＰおよび約１０．０オングストロームの周囲の残基は、エネルギーを最小限にされた。
(15) Molecular modeling The molecular mechanics calculation is performed by MacroModel 10.4 (Schroedinger, Inc., New York) using the optimized potentials for liquid simulations (OPLS) 2005 force field of liquid simulation, which is set by default. Was used. As a ligand, TP-GFP was prepared as follows. The model structure of the TP-GFP11 peptide was prepared by manually linking the GFP11 structure and the TP structure extracted from Superfolder GFP (PDB ID: 2B3P) with a linker (GGGS). The linker portion of TP-GFP11 is described in Maestro interface ver. Energy was minimized using 10.4 (Schroedinger). TP-GFP11 was placed on GFP1-10 extracted from Superfolder GFP (PDB ID: 2B3P) to minimize energy. A complex of TP-GFP11 and GFP1-10 was used as TP-GFP. The structure of three adjacent tubulins of GMPCPP-stabilized microtubules (PDB ID: 3J6E) was used for molecular modeling and ligand docking. The addition of lost hydrogen atoms to the model was based on an obvious all-atomic model. TP-GFP was placed in the taxol binding pocket of β-tubulin in the center of the three adjacent tubulins. TP-GFP and residues around about 10.0 angstroms were energy minimized.
分子力学計算を用いると、ＴＰ−ＧＦＰのＴＰ部分が微小管のタキソール結合ポケットに結合するとき、ＴＰ−ＧＦＰのＧＦＰスキャフォールドもまた、静電相互作用および水素結合を介して微小管壁と相互作用すると推測された。したがって、この協同的結合は、天然の微小管インナータンパク質（microtubule inner protein）と同様に、微小管の安定性および剛直性を増加することができる。 Using molecular mechanics calculations, when the TP portion of TP-GFP binds to the taxol binding pocket of microtubules, the GFP scaffold of TP-GFP also interacts with the microtubule wall via electrostatic interactions and hydrogen bonds. It was speculated to work. Thus, this cooperative binding can increase the stability and rigidity of microtubules, similar to the natural microtubule inner protein.
実施例２：負電荷のＧＦＰを内包した微小管の製造
本願の方法により、大きい負電荷を有するタンパク質を微小管に内包させることが可能かを調べた。
Example 2: Production of Microtubules Containing Negatively Charged GFP It was investigated whether it is possible to enclose a protein having a large negative charge in microtubules by the method of the present application.
（１）ＧＦＰ１−１０（−１５）の大腸菌での発現および精製
実施例１（２）〜（４）に記載の方法によって、負電荷（形式電荷：−１５）を有するようにアニオン性のアミノ酸を変異導入したＧＦＰ（以下、「ＧＦＰ１−１０（−１５）」という）を大腸菌で発現させ、精製した。ただし、ＧＦＰ１−１０フラグメントとして、ＧＦＰ１−１０（−１５）をコードするヌクレオチド配列をベクター中に組み込んだ。ＧＦＰ１−１０（−１５）およびオリジナルのＧＦＰ１−１０のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を図９−１および図９−２に示す。
(1) Expression and purification of GFP1-10 (-15) in Escherichia coli By the method described in Examples 1 (2) to (4), an anionic amino acid having a negative charge (formal charge: -15). GFP (hereinafter referred to as "GFP1-10 (-15)") mutated and introduced into Escherichia coli was expressed in Escherichia coli and purified. However, as a GFP1-10 fragment, a nucleotide sequence encoding GFP1-10 (-15) was incorporated into the vector. The amino acid and nucleotide sequences of GFP1-10 (-15) and the original GFP1-10 are shown in FIGS. 9-1 and 9-2.
（２）ＴＰ−ＧＦＰ（−１５）の構築
実施例１（１）に記載の方法によって、ＴＰ−ＧＦＰ１１を調製した。ＧＦＰ１−１０（−１５）とＴＰ−ＧＦＰ１１をモル比１：１で混合し、２５℃で一晩静置して、ＴＰ−ＧＦＰ（−１５）を構築した。溶媒として、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌを使用した。
(2) Construction of TP-GFP (-15) TP-GFP11 was prepared by the method described in Example 1 (1). GFP1-10 (-15) and TP-GFP11 were mixed at a molar ratio of 1: 1 and allowed to stand overnight at 25 ° C. to construct TP-GFP (-15). As a solvent, 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 200 mM NaCl was used.
（３）ＴＰ−ＧＦＰ（−１５）の微小管への内包
１０μＭ ＴＰ−ＧＦＰ（−１５）および２．５μＭチューブリン（チューブリン：ＴＭＲ標識チューブリン＝４：１）を１×ＢＲＢ８０バッファー（８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．９、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ＥＧＴＡ）中で混合し、２５℃で３０分間静置した。その後、ＧＭＰＣＰＰプレミックス（１ｍＭ ＧＭＰＣＰＰ、８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．９、２１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ＥＧＴＡ）を添加し、３７℃で３０分間静置した。次いで、ＣＬＳＭ観察に使用した。
(3) Encapsulation of TP-GFP (-15) in
（４）ＣＬＳＭ観察
ＣＬＳＭにより、ＴＭＲ由来の蛍光およびＧＦＰ由来の蛍光を観察したところ、微小管へのＧＦＰの局在が確認された（図１０）。したがって、大きい負電荷を有するタンパク質であっても、本願の方法により微小管の内包できることが分かった。
(4) Observation of CLSM When fluorescence derived from TMR and fluorescence derived from GFP were observed by CLSM, localization of GFP in microtubules was confirmed (FIG. 10). Therefore, it was found that even a protein having a large negative charge can be encapsulated in microtubules by the method of the present application.
（５）濁度測定
５０μＬの１×ＢＲＢ８０バッファー、１０μＬの２×ＢＲＢ８０バッファー（１６０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．９、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ ＥＧＴＡ）、１×ＢＲＢ８０バッファー１０μＬ中の２５μＭチューブリン、および１０μＬの１００μＭ ＴＰ−ＧＦＰ（−１５）を混合し、ＵＶ測定セルに加えて３７℃で１０分間静置した。５ｍＭ ＧＴＰ２０μＬを加え、３７℃で３５０ｎｍにおける吸光度の時間変化を測定した。その結果、ＴＰ−ＧＦＰ（−１５）はオリジナルのＴＰ−ＧＦＰと同程度に微小管を安定化することが分かった（図１１）。
(5)
実施例３：環状の微小管結合性ペプチドの微小管への結合
（１）環状微小管結合性ペプチドの調製
配列番号３のアミノ酸配列（ＫＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＣ）で示されるペプチドのＮ末端に、（Ｇ）ｎペプチドリンカー（ｎ＝１または３）を介して、クロロアセチル基で修飾し、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）基で保護したシステイン（Ｃ）を導入し、該ＴＰのＮ末端の該クロロアセチル基とＣ末端のシステイン基との間にチオエーテルを形成させることにより、環化したＴＰ（以下、ＴＣＰという）を製造した。次いで、酸化によりＡｃｍ基を脱保護した後、ＴＭＲで標識して、ＴＭＲ−ＴＣＰ１（ｎ＝１）およびＴＭＲ−ＴＣＰ３（ｎ＝３）を製造した。反応スキームを図１２に示す。
Example 3: Binding of a cyclic microtube-binding peptide to a microtube (1) Preparation of a cyclic microtube-binding peptide At the N-terminus of the peptide represented by the amino acid sequence (KKHVPGGGSVQIVYKPVDLC) of SEQ ID NO: 3, (G) n A cysteine (C) modified with a chloroacetyl group and protected with an acetamide methyl (Acm) group is introduced via a peptide linker (n = 1 or 3), and the chloroacetyl group and C-terminal at the N-terminal of the TP are introduced. A cyclized TP (hereinafter referred to as TCP) was produced by forming a thioether with the cysteine group of. The Acm group was then deprotected by oxidation and then labeled with TMR to produce TMR-TCP1 (n = 1) and TMR-TCP3 (n = 3). The reaction scheme is shown in FIG.
（２）ＣＬＳＭ観察
７５μＭ ＴＭＲ−ＴＣＰ１またはＴＭＲ−ＴＣＰ３、４０μＭチューブリン（チューブリン：Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ４３０標識チューブリン＝１：１）を１×ＢＲＢ８０バッファー（８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．９、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ＥＧＴＡ）中で混合し、２５℃で３０分間静置した。その後、ＧＭＰＣＰＰプレミックス（１ｍＭ ＧＭＰＣＰＰ、８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．９、２１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ＥＧＴＡ）を添加し、３７℃で３０分間静置して微小管を形成させた。Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ４３０標識チューブリンは、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ４３０ ＮＨＳエステルを用いて標準的な方法にしたがって調製した。コントロールとして、いずれのＴＭＲ−ＴＣＰも混合せずに、同様に微小管を形成させた。得られた微小管を１×ＢＲＢ８０バッファーで１０倍希釈後、ＣＬＳＭ測定に付し、ＴＭＲ由来の蛍光を観察したところ、微小管へのＴＣＰの結合が確認された。なお、ＣＬＳＭ測定は実施例１（７）の記載に準じて行った。ただし、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ４３０標識由来の緑色蛍光は、４２８ｎｍで励起し、５３０ｎｍ発光バンド−パスフィルター（緑色）によって観察した。
(2) CLSM observation 75 μM TMR-TCP1 or TMR-TCP3, 40 μM tubulin (tubulin: Alexa Fluor TM 430 labeled tubulin = 1: 1) 1 × BRB80 buffer (80 mM PIPES pH 6.9, 1.0 mM MgCl 2) , 1.0 mM EGTA) and allowed to stand at 25 ° C. for 30 minutes. Then, GMPCPP premix (1 mM GMPCPP, 80 mM PIPES pH 6.9, 21 mM MgCl 2 , 1.0 mM EGTA) was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes to form microtubules. Alexa Fluor TM 430 labeled tubulin was prepared according to standard methods using Alexa Fluor TM 430 NHS ester. As a control, microtubules were formed in the same manner without mixing any TMR-TCP. The obtained microtubules were diluted 10-fold with 1 × BRB80 buffer, subjected to CLSM measurement, and fluorescence derived from TMR was observed. As a result, TCP binding to the microtubules was confirmed. The CLSM measurement was performed according to the description of Example 1 (7). However, the green fluorescence derived from the Alexa Fluor TM 430 label was excited at 428 nm and observed with a 530 nm emission band-pass filter (green).
（３）濁度測定
ＴＭＲ−ＴＣＰ１またはＴＭＲ−ＴＣＰ３をＢＲＢ８０バッファー中、チューブリンおよびＧＴＰを氷上で混合した。ＵＶ測定セルに加えて３７℃で３５０ｎｍにおける吸光度の時間変化を測定した（最終濃度：［チューブリン］＝４μＭ、［ＴＭＲ−ＴＣＰ１］または［ＴＭＲ−ＴＣＰ３］＝１０μＭ、［ＧＴＰ］＝１ｍＭ）。コントロールとして、タキソール、ＴＭＲ標識した線状ＴＰ（ＴＭＲ−ＣＧＧＧＫＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬ）、またはＴＰもタキソールも加えずに（チューブリンのみ）、同様の実験を行った。その結果、環状ＴＰは線状ＴＰよりも微小管に対する結合力が強く、微小管を安定化することが分かった（図１３）。また、ＴＰに外因性タンパク質を連結させていないこの実施例では、いずれのＴＰを用いても、タキソールに類似する結果は得られなかった。したがって、この結果からも、外因性タンパク質を内包させることによる、微小管の安定性向上効果が実証された。
(3) Turbidity measurement TMR-TCP1 or TMR-TCP3 was mixed in BRB80 buffer, and tubulin and GTP were mixed on ice. In addition to the UV measurement cell, the time change of absorbance at 37 ° C. at 350 nm was measured (final concentration: [tubulin] = 4 μM, [TMR-TCP1] or [TMR-TCP3] = 10 μM, [GTP] = 1 mM). As controls, similar experiments were performed with no taxol, TMR-labeled linear TP (TMR-CGGGKKHVPGGGGSVQIVYKPVDL), or no TP or taxol (tubulin only). As a result, it was found that the annular TP has a stronger binding force to microtubules than the linear TP and stabilizes the microtubules (FIG. 13). Moreover, in this example in which the exogenous protein was not linked to TP, no result similar to taxol was obtained with any of the TPs. Therefore, this result also demonstrated the effect of improving the stability of microtubules by including exogenous proteins.
SEQ ID NO:1; An amino acid sequence of a Tau-derived peptide
SEQ ID NO:2; An amino acid sequence of a Tau-derived peptide mutant
SEQ ID NO:3; An amino acid sequence of a Tau-derived peptide mutant
SEQ ID NO:4; A linker sequence
SEQ ID NO:5; A linker sequence
SEQ ID NO:6; A linker sequence
SEQ ID NO:7; A linker sequence
SEQ ID NO:8; A linker sequence
SEQ ID NO:9; A linker sequence
SEQ ID NO:10; An amino acid sequence of a GFP11-linker-TP
SEQ ID NO:11; GFP11 peptide
SEQ ID NO:12; An amino acid sequence of MBP
SEQ ID NO:13; An amino acid sequence of TEV cleavage site
SEQ ID NO:14; An amino acid sequence of a GFP1-10
SEQ ID NO:15; An amino acid sequence of a GFP1-10(-15)
SEQ ID NO:16; A nucleotide sequence of GFP1-10 comprising promoter, SD sequence
SEQ ID NO:17; A nucleotide sequence of GFP1-10(-15) comprising promoter, SD sequence
SEQ ID NO:18; An amino acid sequence of a cysteine-linker-TP
SEQ ID NO: 1; An amino acid sequence of a Tau-derived peptide
SEQ ID NO: 2; An amino acid sequence of a Tau-derived peptide mutant
SEQ ID NO: 3; An amino acid sequence of a Tau-derived peptide mutant
SEQ ID NO: 4; A linker sequence
SEQ ID NO: 5; A linker sequence
SEQ ID NO: 6; A linker sequence
SEQ ID NO: 7; A linker sequence
SEQ ID NO: 8; A linker sequence
SEQ ID NO: 9; A linker sequence
SEQ ID NO: 10; An amino acid sequence of a GFP11-linker-TP
SEQ ID NO: 11; GFP11 peptide
SEQ ID NO: 12; An amino acid sequence of MBP
SEQ ID NO: 13; An amino acid sequence of TEV cleavage site
SEQ ID NO: 14; An amino acid sequence of a GFP1-10
SEQ ID NO: 15; An amino acid sequence of a GFP1-10 (-15)
SEQ ID NO: 16; A nucleotide sequence of GFP1-10 comprising promoter, SD sequence
SEQ ID NO: 17; A nucleotide sequence of GFP1-10 (-15) comprising promoter, SD sequence
SEQ ID NO: 18; An amino acid sequence of a cysteine-linker-TP
Claims (6)
ＴＰ−タンパク質とチューブリンを複合体化すること、および
ＴＰ−タンパク質とチューブリンの複合体を、ＧＴＰまたはＧＭＰＣＰＰと混合して重合させること
を含む、タンパク質を内包した人工微小管の製造方法。 A peptide that binds to a microtube, in which 1 to 7 amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. To prepare a TP-protein in which a microtubule-binding peptide (TP) containing an amino acid sequence containing an amino acid is linked to an exogenous protein.
A method for producing a protein-encapsulating artificial microtubule, which comprises synthesizing a TP-protein and tubulin, and polymerizing the TP-protein and tubulin complex by mixing with GTP or GMPCPP.
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Applications Claiming Priority (1)
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