JP2021098660A - Affinity carrier, chromatography column, and method for isolating antibody or fragment thereof - Google Patents

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Abstract

To provide an affinity carrier having a large dynamic binding capacity to an antibody or a fragment thereof.SOLUTION: An affinity carrier has a porous particle, and immunoglobulin-binding protein bound to the porous particle. The affinity carrier has a porosity of 70-95%(v/v) in a wet state. The immunoglobulin-binding protein has a polypeptide chain, the polypeptide chain consisting of an amino acid sequence selected from a specific amino acid sequence and a variant sequence thereof, the number of the polypeptide chains in the immunoglobulin-binding protein being 2-10.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、アフィニティ担体、クロマトグラフィーカラム、及び抗体又はその断片の単離方法に関する。 The present invention relates to an affinity carrier, a chromatography column, and a method for isolating an antibody or a fragment thereof.

アフィニティクロマトグラフィーは、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー等の他のクロマトグラフィーに比べて、高収率且つ高速で経済的な単離が可能なため、抗体等の単離に広く用いられている。 Affinity chromatography enables high-yield, high-speed, and economical isolation compared to other chromatography such as ion chromatography, gel filtration chromatography, and reverse-phase liquid chromatography. Therefore, isolation of antibodies and the like is possible. Widely used in.

アフィニティクロマトグラフィーを用いて抗体やその断片を単離する場合、アフィニティクロマトグラフィーに使用されるアフィニティ担体には、抗体やその断片に対する動的結合容量を備えることが求められる。例えば、メジアン粒径を特定範囲に調整するなどすることで、抗体に対する動的結合容量を大きくした担体が知られているが（特許文献１）、動的結合容量の更なる改善が要求されている。 When an antibody or a fragment thereof is isolated by affinity chromatography, the affinity carrier used for the affinity chromatography is required to have a dynamic binding capacity for the antibody or the fragment thereof. For example, a carrier having an increased dynamic binding capacity to an antibody by adjusting the median particle size to a specific range is known (Patent Document 1), but further improvement of the dynamic binding capacity is required. There is.

特表２００８−５２３１４０号公報Japanese Patent Publication No. 2008-523140

本発明の課題は、抗体又はその断片に対する動的結合容量が大きいアフィニティ担体を提供することにある。 An object of the present invention is to provide an affinity carrier having a large dynamic binding capacity to an antibody or a fragment thereof.

そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、特定のポリペプチド鎖を２〜１０個含むイムノグロブリン結合タンパク質が多孔質粒子に結合され、且つ湿潤状態での空孔率が７０〜９５％（ｖ／ｖ）であるアフィニティ担体が、抗体又はその断片に対する動的結合容量が大きいものであることを見出し、本発明を完成した。 Therefore, as a result of diligent studies by the present inventors, an immunoglobulin-binding protein containing 2 to 10 specific polypeptide chains is bound to the porous particles, and the porosity in a wet state is 70 to 95% (v). We have found that the affinity carrier of / v) has a large dynamic binding capacity to an antibody or a fragment thereof, and completed the present invention.

すなわち、本発明は、以下の＜１＞〜＜７＞を提供するものである。
＜１＞ 多孔質粒子と、当該多孔質粒子に結合されたイムノグロブリン結合タンパク質とを備えるアフィニティ担体であって、湿潤状態での空孔率が７０〜９５％（ｖ／ｖ）であり、前記イムノグロブリン結合タンパク質が、ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、及びそれらの変異体配列から選ばれるアミノ酸配列であり、前記イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる前記ポリペプチド鎖の数が２〜１０個である、アフィニティ担体（以下、本発明のアフィニティ担体とも称する）。 That is, the present invention provides the following <1> to <7>.
<1> An affinity carrier comprising porous particles and an immunoglobulin-binding protein bound to the porous particles, which has a porosity of 70 to 95% (v / v) in a wet state. The immunoglobulin-binding protein comprises a polypeptide chain, and the polypeptide chain is an amino acid sequence selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a variant sequence thereof. An affinity carrier (hereinafter, also referred to as the affinity carrier of the present invention) in which the number of the polypeptide chains contained in the immunoglobulin-binding protein is 2 to 10.

＜２＞ 前記ポリペプチド鎖の数が３〜１０個である、＜１＞に記載の担体。
＜３＞ 湿潤状態での平均細孔径が２２〜３５ｎｍである、＜１＞又は＜２＞に記載の担体。
＜４＞ 前記空孔率が８０〜９０％（ｖ／ｖ）である、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の担体。
＜５＞ 平均粒子径が３０〜１００μｍである、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の担体。 <2> The carrier according to <1>, wherein the number of the polypeptide chains is 3 to 10.
<3> The carrier according to <1> or <2>, which has an average pore diameter of 22 to 35 nm in a wet state.
<4> The carrier according to any one of <1> to <3>, wherein the porosity is 80 to 90% (v / v).
<5> The carrier according to any one of <1> to <4>, which has an average particle size of 30 to 100 μm.

＜６＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の担体を含む、クロマトグラフィーカラム（以下、本発明のクロマトグラフィーカラムとも称する）。
＜７＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の担体又は＜６＞に記載のクロマトグラフィーカラムを用いる、抗体又はその断片の単離方法（以下、本発明の抗体又はその断片の単離方法とも称する）。 <6> A chromatography column containing the carrier according to any one of <1> to <5> (hereinafter, also referred to as a chromatography column of the present invention).
<7> A method for isolating an antibody or a fragment thereof using the carrier according to any one of <1> to <5> or the chromatography column according to <6> (hereinafter, simply the antibody of the present invention or a fragment thereof). Also called the separation method).

本発明のアフィニティ担体は、抗体又はその断片に対する動的結合容量が大きい。したがって、本発明によれば、抗体又はその断片に対する動的結合容量が大きいクロマトグラフィーカラムを提供できる。 The affinity carrier of the present invention has a large dynamic binding capacity to an antibody or a fragment thereof. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a chromatography column having a large dynamic binding capacity to an antibody or a fragment thereof.

＜アフィニティ担体＞
本発明のアフィニティ担体は、多孔質粒子と、当該多孔質粒子に結合されたイムノグロブリン結合タンパク質とを備えるアフィニティ担体であって、湿潤状態での空孔率が７０〜９５％（ｖ／ｖ）であり、前記イムノグロブリン結合タンパク質が、ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、及びそれらの変異体配列から選ばれるアミノ酸配列であり、前記イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる前記ポリペプチド鎖の数が２〜１０個であることを特徴とするものである。
なお、本明細書において、数値範囲を表すａ〜ｂ等の記載は、ａ以上、ｂ以下と同義であり、ａ及びｂを数値範囲内に含む。また、本明細書において、「アフィニティ担体」とは、担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質に、単離の標的物質である抗体（イムノグロブリン）又はその断片が、特異的な分子間の親和力（アフィニティ）に基づいて結合することを利用した担体をいう。 <Affinity carrier>
The affinity carrier of the present invention is an affinity carrier comprising porous particles and an immunoglobulin-binding protein bound to the porous particles, and has a porosity of 70 to 95% (v / v) in a wet state. The immunoglobulin-binding protein comprises a polypeptide chain, and the polypeptide chain is derived from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a variant sequence thereof. It is an amino acid sequence of choice, and is characterized in that the number of the polypeptide chains contained in the immunoglobulin-binding protein is 2 to 10.
In this specification, the description of a to b and the like representing the numerical range is synonymous with a or more and b or less, and a and b are included in the numerical range. Further, in the present specification, the term "affinity carrier" means that an antibody (immunoglobulin) or a fragment thereof, which is a target substance for isolation, has an affinity (affinity) between specific molecules for an immunoglobulin-binding protein contained in the carrier. Refers to a carrier utilizing binding based on.

（空孔率）
本発明のアフィニティ担体の湿潤状態での空孔率は、７０〜９５％（ｖ／ｖ）である。湿潤状態での空孔率をこのような範囲とすることによって、抗体及びその断片に対する動的結合容量が大きくなる。
湿潤状態での空孔率は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは７５％（ｖ／ｖ）以上、より好ましくは７８％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは８０％（ｖ／ｖ）以上、特に好ましくは８４％（ｖ／ｖ）以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは９３％（ｖ／ｖ）以下、より好ましくは９２％（ｖ／ｖ）以下、特に好ましくは９０％（ｖ／ｖ）以下である。具体的な範囲としては、７５〜９３％（ｖ／ｖ）が好ましく、７８〜９２％（ｖ／ｖ）がより好ましく、８０〜９０％（ｖ／ｖ）が更に好ましく、８４〜９０％（ｖ／ｖ）が特に好ましい。
本明細書において、湿潤状態での空孔率は、湿潤状態で測定したときの多孔質粒子の非空孔部と多孔質粒子の空孔部とイムノグロブリン結合タンパク質との合計体積に対する多孔質粒子の空孔部の体積の割合を意味し、例えば、カラム容器に充填したときのアフィニティ担体の容積、担体の容積を求めたカラムに５００ｍＭ 塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときの塩化ナトリウムの溶出体積、及び担体の容積を求めたカラムにデキストランを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときのデキストランの溶出体積から求めることができる。具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定すればよい。 (Porosity)
The porosity of the affinity carrier of the present invention in a wet state is 70 to 95% (v / v). By setting the porosity in the wet state within such a range, the dynamic binding capacity to the antibody and its fragments is increased.
The porosity in the wet state is preferably 75% (v / v) or more, more preferably 78% (v / v) or more, still more preferably 78% (v / v) or more, in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and fragments thereof. 80% (v / v) or more, particularly preferably 84% (v / v) or more, and preferably 93% (v / v) or less in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and fragments thereof. , More preferably 92% (v / v) or less, and particularly preferably 90% (v / v) or less. As a specific range, 75 to 93% (v / v) is preferable, 78 to 92% (v / v) is more preferable, 80 to 90% (v / v) is further preferable, and 84 to 90% (v / v) is preferable. v / v) is particularly preferable.
In the present specification, the porosity in the wet state is the porosity of the porous particles with respect to the total volume of the non-pores of the porous particles, the pores of the porous particles, and the immunoglobulin-binding protein when measured in the wet state. It means the ratio of the volume of the pores, for example, the volume of the affinity carrier when filled in the column container, the elution volume of sodium chloride when 50 μL of a 500 mM sodium chloride aqueous solution is poured into the column for which the volume of the carrier is determined, And the volume of the carrier can be determined from the elution volume of dextran when 50 μL of a 20 mM sodium phosphate / 150 mM sodium chloride aqueous solution containing dextran is charged into the column. Specifically, the measurement may be performed according to the method described in Examples described later.

（平均細孔径）
本発明のアフィニティ担体の湿潤状態での平均細孔径は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは１５ｎｍ以上、より好ましくは１８ｎｍ以上、更に好ましくは２２ｎｍ以上、特に好ましくは２３ｎｍ以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは４５ｎｍ以下、より好ましくは４０ｎｍ以下、更に好ましくは３５ｎｍ以下、更に好ましくは２７ｎｍ以下であり、特に好ましくは２６ｎｍ以下である。具体的な範囲としては、１５〜４５ｎｍが好ましく、１８〜４０ｎｍがより好ましく、２２〜３５ｎｍが更に好ましく、２２〜２７ｎｍが更に好ましく、２３〜２６ｎｍが特に好ましい。
本明細書において、アフィニティ担体の湿潤状態での平均細孔径は、“Ｈａｇｅｌ，ｅｔ．ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．７４３（１９９６）３２−４２”に記載の方法を用いて湿潤状態で測定したときの平均細孔径を意味し、例えば、カラム容器に充填したときのアフィニティ担体の容積、担体の容積を求めたカラムに５００ｍＭ 塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときの塩化ナトリウムの溶出体積、担体の容積を求めたカラムにデキストランを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときのデキストランの溶出体積、及びプルランのスタンダードサンプルを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときのプルランの溶出体積から求めることができる。具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定すればよい。 (Average pore size)
The average pore size of the affinity carrier of the present invention in a wet state is preferably 15 nm or more, more preferably 18 nm or more, still more preferably 22 nm or more, particularly preferably 22 nm or more, in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and fragments thereof. It is 23 nm or more, and in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and its fragments, it is preferably 45 nm or less, more preferably 40 nm or less, further preferably 35 nm or less, still more preferably 27 nm or less, and particularly preferably 27 nm or less. It is 26 nm or less. As a specific range, 15 to 45 nm is preferable, 18 to 40 nm is more preferable, 22 to 35 nm is further preferable, 22 to 27 nm is further preferable, and 23 to 26 nm is particularly preferable.
In the present specification, the average pore size of the affinity carrier in a wet state is measured in a wet state using the method described in "Hagel, et. Al, Journal of Chromatography A, Vol. 743 (1996) 32-42". It means, for example, the volume of the affinity carrier when it is filled in a column container, the elution volume of sodium chloride when 50 μL of a 500 mM sodium chloride aqueous solution is poured into a column for which the volume of the carrier is determined, and the volume of the carrier. The elution volume of dextran when 50 μL of 20 mM sodium phosphate / 150 mM sodium chloride aqueous solution containing dextran was charged into the column for which the volume was determined, and 50 μL of 20 mM sodium phosphate / 150 mM sodium chloride aqueous solution containing a standard sample of purulan were implanted. It can be obtained from the elution volume of purulan at that time. Specifically, the measurement may be performed according to the method described in Examples described later.

（体積平均粒子径）
本発明のアフィニティ担体の平均粒子径は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは３０μｍ以上、より好ましくは３５μｍ以上、特に好ましくは４０μｍ以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは９０μｍ以下、特に好ましくは８０μｍ以下である。具体的な範囲としては、３０〜１００μｍが好ましく、３５〜９０μｍがより好ましく、４０〜８０μｍが特に好ましい。
本明細書において、アフィニティ担体の平均粒子径は、ＪＩＳ Ｚ ８８２５（２０１３）に従いレーザ回折散乱法で測定される体積平均粒子径をいう。具体的には、後述する実施例に記載の方法のようにして、ＪＩＳ Ｚ ８８２５（２０１３）に従って、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（例えば、ベックマン・コールター社製 ＬＳ１３３２０等）により体積基準の粒径分布を測定することで求めることができる。
また、体積平均粒子径の変動係数は、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下である。変動係数は、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置で測定される値をいう。 (Volume average particle size)
The average particle size of the affinity carrier of the present invention is preferably 30 μm or more, more preferably 35 μm or more, particularly preferably 40 μm or more, and the antibody and its fragments, in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and its fragments. In order to increase the dynamic binding capacity to the fragment, it is preferably 100 μm or less, more preferably 90 μm or less, and particularly preferably 80 μm or less. As a specific range, 30 to 100 μm is preferable, 35 to 90 μm is more preferable, and 40 to 80 μm is particularly preferable.
In the present specification, the average particle size of the affinity carrier refers to the volume average particle size measured by the laser diffraction / scattering method according to JIS Z 8825 (2013). Specifically, according to JIS Z 8825 (2013), a volume-based grain is used by a laser diffraction / scattering type particle size distribution measuring device (for example, LS13320 manufactured by Beckman Coulter) as in the method described in Examples described later. It can be obtained by measuring the diameter distribution.
The coefficient of variation of the volume average particle size is preferably 40% or less, more preferably 30% or less. The coefficient of variation is a value measured by a laser diffraction / scattering type particle size distribution measuring device.

（見掛密度）
本発明のアフィニティ担体の湿潤状態での見掛密度は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは８０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは９０ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは１００ｇ／Ｌ以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは４００ｇ／Ｌ以下、より好ましくは３００ｇ／Ｌ以下、更に好ましくは２５０ｇ／Ｌ以下、特に好ましくは２００ｇ／Ｌ以下である。具体的な範囲としては、８０〜４００ｇ／Ｌが好ましく、９０〜３００ｇ／Ｌがより好ましく、１００〜２５０ｇ／Ｌが更に好ましく、１００〜２００ｇ／Ｌが特に好ましい。
本明細書において、アフィニティ担体の湿潤状態での見掛密度は、例えば、粒子状のアフィニティ担体を水に分散させたスラリーを加えたメスシリンダー内でアフィニティ担体を沈降させ、アフィニティ担体の重量をアフィニティ担体の沈降体積で割ることにより求めることができる。具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定すればよい。 (Apparent density)
The apparent density of the affinity carrier of the present invention in a wet state is preferably 80 g / L or more, more preferably 90 g / L or more, and particularly preferably 100 g / L in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and fragments thereof. L or more, and preferably 400 g / L or less, more preferably 300 g / L or less, still more preferably 250 g / L or less, particularly preferably 200 g / L or less, in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and fragments thereof. It is L or less. As a specific range, 80 to 400 g / L is preferable, 90 to 300 g / L is more preferable, 100 to 250 g / L is further preferable, and 100 to 200 g / L is particularly preferable.
In the present specification, the apparent density of the affinity carrier in a wet state is determined by, for example, precipitating the affinity carrier in a graduated cylinder to which a slurry in which the particulate affinity carrier is dispersed in water is added, and adjusting the weight of the affinity carrier. It can be determined by dividing by the sedimented volume of the carrier. Specifically, the measurement may be performed according to the method described in Examples described later.

（多孔質粒子）
本発明のアフィニティ担体は、多孔質粒子を備える。
多孔質粒子としては、合成高分子系多孔質粒子、天然高分子系多孔質粒子等の有機系多孔質粒子；無機系多孔質粒子；これらを組み合わせた有機−有機複合系多孔質粒子や有機−無機複合系多孔質粒子等が挙げられる。天然高分子系多孔質粒子としては、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類系多孔質粒子（好ましくは架橋多糖類系多孔質粒子）が挙げられる。多糖類の中では、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、アガロースが特に好ましい。無機系多孔質粒子としては、ガラス、シリカゲル、金属、金属酸化物等で構成されるものが挙げられる。
これら多孔質粒子の中では、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、有機系多孔質粒子が好ましく、高分子系多孔質粒子がより好ましく、合成高分子系多孔質粒子が特に好ましい。また、多孔質粒子は、好ましくは水不溶性多孔質粒子である。 (Porous particles)
The affinity carrier of the present invention comprises porous particles.
Examples of the porous particles include organic porous particles such as synthetic polymer-based porous particles and natural polymer-based porous particles; inorganic porous particles; and organic-organic composite porous particles and organic-that combine these. Examples thereof include inorganic composite porous particles. Examples of the natural polymer-based porous particles include polysaccharide-based porous particles such as cellulose, agarose, and dextran (preferably crosslinked polysaccharide-based porous particles). Among the polysaccharides, agarose is particularly preferred in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and fragments thereof. Examples of the inorganic porous particles include those composed of glass, silica gel, metal, metal oxide and the like.
Among these porous particles, organic porous particles are preferable, polymer-based porous particles are more preferable, and synthetic polymer-based porous particles are particularly preferable, in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and its fragments. preferable. Further, the porous particles are preferably water-insoluble porous particles.

なお、多孔質粒子は、ＷＯ２０１９／０３９５４５、特開２０１１−２５２９２９号公報、ＷＯ２０１７／１５５１０５、特開昭６２−２５１０２号公報等に記載の架橋構造の導入や表面変性を行ったものであってもよい。
架橋構造を与える架橋剤としては、例えば、オキサリルジヒドラジド、マロン酸ジヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド、２，３−ジヒドロキシコハク酸ジヒドラジド、グルタル酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、ピメリン酸ジヒドラジド、オクタン二酸ジヒドラジド、ノナン二酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド、ドデカン二酸ジヒドラジド、フタル酸ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド、テレフタル酸ジヒドラジド、キノリン酸ジヒドラジド等のジカルボン酸ジヒドラジド類；シクロヘキサントリカルボン酸トリヒドラジド等のトリカルボン酸トリヒドラジド類；Ｎ１，Ｎ１−（エタン−１，２−ジイル）ビス（コハク酸モノアミド）等の（アルキレンビスイミノ）ビス（オキソアルカン酸）類；エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリン等のハロヒドリン類；レゾルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、ジグリシジルテレフタレート、ジグリシジルオルトフタレート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル等のビスオキシラン類；３官能以上のポリオキシラン類等が挙げられる。
また、表面変性としては、例えば、多孔質粒子の表面に、水酸基を有するポリマーによりグラフト層を設ける手法が挙げられる。 Even if the porous particles are those to which the crosslinked structure described in WO2019 / 039545, JP-A-2011-252929, WO2017 / 155105, JP-A-62-25102, etc. has been introduced or surface-modified. Good.
Examples of the cross-linking agent that gives a cross-linking structure include oxalyl dihydrazide, malonic acid dihydrazide, succinic acid dihydrazide, 2,3-dihydroxysuccinic acid dihydrazide, glutaric acid dihydrazide, adipic acid dihydrazide, pimelic acid dihydrazide, octanedioic acid dihydrazide, and nonanedi. Dicarboxylic acid dihydrazides such as acid dihydrazide, sebacic acid dihydrazide, dodecanedioic acid dihydrazide, phthalic acid dihydrazide, isophthalic acid dihydrazide, terephthalic acid dihydrazide, quinophosphate dihydrazide; tricarboxylic acid tricarboxylic acid trihydrazides such as cyclohexanetricarboxylic acid trihydrazide (Alkylene bisimino) bis (oxoalkanoic acid) such as- (ethane-1,2-diyl) bis (succinic acid monoamide); halohydrins such as epichlorohydrin, epibromohydrin, dichlorohydrin; resorcinol Diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, 1,6-hexanediol diglycidyl ether, hydrogenatobisphenol A diglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether, trimethylpropane diglycidyl ether, diglycidyl terephthalate, diglycidyl orthophthalate , Bisoxylanes such as ethylene glycol diglycidyl ether, diethylene glycol diglycidyl ether, and propylene glycol diglycidyl ether; and polyoxylanes having trifunctionality or higher can be mentioned.
Further, as the surface modification, for example, a method of providing a graft layer with a polymer having a hydroxyl group on the surface of the porous particles can be mentioned.

また、合成高分子系多孔質粒子に含まれるポリマーとしては、例えば、（メタ）アクリレート系モノマー由来の構造単位、（メタ）アクリル酸由来の構造単位、（メタ）アクリルアミド系モノマー由来の構造単位、（メタ）アクリロニトリル系モノマー由来の構造単位、芳香族ビニル系モノマー由来の構造単位、ビニルアルコール系モノマー由来の構造単位、オレフィン系モノマー（例えばエチレン等）由来の構造単位、ビニルエーテル系モノマー由来の構造単位、ビニルケトン系モノマー由来の構造単位、Ｎ−ビニルアミド系モノマー由来の構造単位、ビニルアルキレンオキシド系モノマー由来の構造単位、三重結合を有するアルキレンオキシド系モノマー（例えば２，３−エポキシプロピルプロパルギルエーテル等）由来の構造単位、アリル系モノマー由来の構造単位、不飽和ジカルボン酸無水物系モノマー由来の構造単位、及び不飽和ポリアルキレングリコールエーテル系モノマー由来の構造単位から選ばれる１種又は２種以上を有するポリマーが挙げられる。
上記ポリマーとしては、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、（メタ）アクリレート系モノマー由来の構造単位、（メタ）アクリル酸由来の構造単位、（メタ）アクリルアミド系モノマー由来の構造単位及び芳香族ビニル系モノマー由来の構造単位から選ばれる１種又は２種以上を有するポリマーが好ましく、（メタ）アクリレート系モノマー由来の構造単位及び芳香族ビニル系モノマー由来の構造単位から選ばれる１種又は２種以上を有するポリマーがより好ましく、（メタ）アクリレート系モノマー由来の構造単位及び芳香族ビニル系モノマー由来の構造単位を少なくとも有するポリマーが特に好ましい。 Examples of the polymer contained in the synthetic polymer-based porous particles include a structural unit derived from a (meth) acrylate-based monomer, a structural unit derived from (meth) acrylic acid, and a structural unit derived from a (meth) acrylamide-based monomer. (Meta) Structural unit derived from acrylonitrile-based monomer, structural unit derived from aromatic vinyl-based monomer, structural unit derived from vinyl alcohol-based monomer, structural unit derived from olefin-based monomer (for example, ethylene, etc.), structural unit derived from vinyl ether-based monomer , Structural unit derived from vinyl ketone monomer, structural unit derived from N-vinylamide monomer, structural unit derived from vinyl alkylene oxide monomer, derived from alkylene oxide monomer having triple bond (for example, 2,3-epoxypropylpropargyl ether, etc.) A polymer having one or more selected from the structural unit derived from the allyl-based monomer, the structural unit derived from the unsaturated dicarboxylic acid anhydride-based monomer, and the structural unit derived from the unsaturated polyalkylene glycol ether-based monomer. Can be mentioned.
The polymer has a structural unit derived from a (meth) acrylate-based monomer, a structural unit derived from (meth) acrylic acid, and a structure derived from a (meth) acrylamide-based monomer in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and its fragments. A polymer having one or more selected from units and structural units derived from aromatic vinyl-based monomers is preferable, and structural units derived from (meth) acrylate-based monomers and structural units derived from aromatic vinyl-based monomers are selected. A polymer having seeds or two or more kinds is more preferable, and a polymer having at least a structural unit derived from a (meth) acrylate-based monomer and a structural unit derived from an aromatic vinyl-based monomer is particularly preferable.

また、合成高分子系多孔質粒子に含まれるポリマーとしては、多官能ビニルモノマー由来の構造単位及びモノビニルモノマー由来の構造単位から選ばれる構造単位を有するポリマーが好ましく、多官能ビニルモノマー由来の構造単位及びモノビニルモノマー由来の構造単位を有するポリマーがより好ましい。 Further, as the polymer contained in the synthetic polymer-based porous particles, a polymer having a structural unit selected from a structural unit derived from a polyfunctional vinyl monomer and a structural unit derived from a monovinyl monomer is preferable, and a structural unit derived from the polyfunctional vinyl monomer is preferable. And polymers with structural units derived from monovinyl monomers are more preferred.

（多官能ビニルモノマー）
多官能ビニルモノマーは、１分子内に重合性ビニル基を２個以上有するビニルモノマーである。
多官能ビニルモノマーとしては、（メタ）アクリレート系多官能ビニルモノマー、（メタ）アクリルアミド系多官能ビニルモノマー、芳香族系多官能ビニルモノマーの他、フタル酸ジアリル、イソフタル酸ジアリル、テレフタル酸ジアリル、マレイン酸ジアリル、フマル酸ジアリル、イタコン酸ジアリル、トリメリット酸ジアリル、トリメリット酸トリアリル、シアヌル酸トリアリル、イソシアヌル酸ジアリル、イソシアヌル酸トリアリル等のポリアリル系モノマーや、ジアミノプロパノール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グルコサミン等のアミノアルコールと（メタ）アクリル酸との脱水縮合反応物、ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィン等が挙げられる。
これらの中では、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、（メタ）アクリレート系多官能ビニルモノマー、（メタ）アクリルアミド系多官能ビニルモノマー及び芳香族系多官能ビニルモノマーから選ばれる１種又は２種以上のモノマーが好ましく、（メタ）アクリレート系多官能ビニルモノマー及び芳香族系多官能ビニルモノマーから選ばれる１種又は２種以上のモノマーがより好ましく、芳香族系多官能ビニルモノマーが特に好ましい。
また、多官能ビニルモノマーに含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子内に、２〜５個が好ましく、２又は３個がより好ましい。 (Polyfunctional vinyl monomer)
The polyfunctional vinyl monomer is a vinyl monomer having two or more polymerizable vinyl groups in one molecule.
Examples of the polyfunctional vinyl monomer include (meth) acrylate-based polyfunctional vinyl monomer, (meth) acrylamide-based polyfunctional vinyl monomer, aromatic polyfunctional vinyl monomer, diallyl phthalate, diallyl isophthalate, diallyl terephthalate, and malein. Polyallyl-based monomers such as diallyl acid, diallyl fumarate, diallyl itaconic acid, diallyl trimellitic acid, triallyl trimellitic acid, triallyl cyanurate, diallyl isocyanurate, and triallyl isocyanurate, diaminopropanol, trishydroxymethylaminomethane, glucosamine, etc. Examples thereof include a dehydration condensation reaction product of aminoalcohol and (meth) acrylic acid, and conjugated diolefins such as butadiene and isoprene.
Among these, in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and its fragments, it is selected from (meth) acrylate-based polyfunctional vinyl monomer, (meth) acrylamide-based polyfunctional vinyl monomer and aromatic polyfunctional vinyl monomer. One or more kinds of monomers are preferable, and one kind or two or more kinds of monomers selected from (meth) acrylate-based polyfunctional vinyl monomer and aromatic polyfunctional vinyl monomer are more preferable, and aromatic polyfunctional vinyl monomer is more preferable. Is particularly preferable.
The number of polymerizable vinyl groups contained in the polyfunctional vinyl monomer is preferably 2 to 5 in one molecule, more preferably 2 or 3.

（メタ）アクリレート系多官能ビニルモノマーとしては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、グルコースジ（メタ）アクリレート、マンニトールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート系モノマー；トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、グルコーストリ（メタ）アクリレート、マンニトールトリ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリレート系モノマー；ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレート、グルコーステトラ（メタ）アクリレート、マンニトールテトラ（メタ）アクリレート等のテトラ（メタ）アクリレート系モノマー；ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、マンニトールペンタ（メタ）アクリレート等のペンタ（メタ）アクリレート系モノマー等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。 Examples of the (meth) acrylate-based polyfunctional vinyl monomer include ethylene glycol di (meth) acrylate, diethylene glycol di (meth) acrylate, triethylene glycol di (meth) acrylate, tetraethylene glycol di (meth) acrylate, and polyethylene glycol di. (Meta) acrylate, propylene glycol di (meth) acrylate, dipropylene glycol di (meth) acrylate, tripropylene glycol di (meth) acrylate, tetrapropylene glycol di (meth) acrylate, polypropylene glycol di (meth) acrylate, 1, 4-Butanediol di (meth) acrylate, 1,6-hexanedioldi (meth) acrylate, glycerindi (meth) acrylate, trimethylol ethanedi (meth) acrylate, trimethylpropanedi (meth) acrylate, butanetrioldi Di (meth) acrylates such as (meth) acrylate, pentaerythritol di (meth) acrylate, dipentaerythritol di (meth) acrylate, inositol di (meth) acrylate, glucose di (meth) acrylate, and mannitol di (meth) acrylate. Monomer: Trimethylol propantri (meth) acrylate, pentaerythritol tri (meth) acrylate, dipentaerythritol tri (meth) acrylate, inositol tri (meth) acrylate, glucose tri (meth) acrylate, mannitol tri (meth) acrylate, etc. Tri (meth) acrylate-based monomers; tetra (meth) acrylates such as pentaerythritol tetra (meth) acrylate, dipentaerythritol tetra (meth) acrylate, inositol tetra (meth) acrylate, glucose tetra (meth) acrylate, and mannitol tetra (meth) acrylate. ) Acrylate-based monomer; Examples thereof include penta (meth) acrylate-based monomer such as dipentaerythritol penta (meth) acrylate and mannitol penta (meth) acrylate. In addition, one of these can be used alone or in combination of two or more.

芳香族系多官能ビニルモノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニルナフタレン等の芳香族系ジビニルモノマー；トリビニルベンゼン等の芳香族系トリビニルモノマー等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。 Examples of the aromatic polyfunctional vinyl monomer include aromatic divinyl monomers such as divinylbenzene, divinyltoluene, divinylxylene, divinylethylbenzene and divinylnaphthalene; and aromatic trivinyl monomers such as trivinylbenzene. In addition, one of these can be used alone or in combination of two or more.

多官能ビニルモノマー由来の構造単位の含有量は、ポリマー中の全構造単位に対して、１〜９０質量％が好ましく、２．５〜８０質量％がより好ましく、５〜７０質量％が更に好ましく、１０〜６０質量％が特に好ましい。
なお、ポリマー中の各構造単位の含有量は、ＮＭＲ等により測定すればよい。 The content of the structural unit derived from the polyfunctional vinyl monomer is preferably 1 to 90% by mass, more preferably 2.5 to 80% by mass, still more preferably 5 to 70% by mass, based on the total structural units in the polymer. , 10-60% by mass is particularly preferable.
The content of each structural unit in the polymer may be measured by NMR or the like.

（モノビニルモノマー）
モノビニルモノマーは、１分子内に重合性ビニル基を１個有するビニルモノマーである。
モノビニルモノマーは、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有するモノビニルモノマーと、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有さないモノビニルモノマーとに大別でき、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよいが、スペーサーを介さずに多孔質粒子をイムノグロブリン結合タンパク質と結合させるためには、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有するモノビニルモノマーが好ましい。
イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基としては、例えば、環状エーテル基、カルボキシ基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｎ−スクシンイミジル基、ホルミル基、イソシアネート基、アミノ基、ヒドラジド基等が挙げられる。これらの中では、環状エーテル基が好ましく、環を構成する原子数が３〜７個の環状エーテル基がより好ましい。環状エーテル基は、置換基としてアルキル基を有していてもよい。環状エーテル基の具体例としては、以下の式（１）〜（６）で表される環状エーテル基が挙げられるが、式（１）、（５）又は（６）で表される環状エーテル基が好ましく、式（１）で表される環状エーテル基がより好ましい。 (Monovinyl monomer)
The monovinyl monomer is a vinyl monomer having one polymerizable vinyl group in one molecule.
The monovinyl monomer is divided into a monovinyl monomer having a reactive functional group reactive with the immunoglobulin-binding protein in the molecule and a monovinyl monomer having no reactive functional group reactive with the immunoglobulin-binding protein in the molecule. It can be roughly divided into two types, one of which may be used alone or two or more of them may be used in combination. However, in order to bind the porous particles to the immunoglobulin-binding protein without using a spacer, immunoglobulin binding is performed. A monovinyl monomer having a reactive functional group reactive with the protein in the molecule is preferable.
Examples of the reactive functional group having reactivity with the immunoglobulin-binding protein include a cyclic ether group, a carboxy group, -C (= O) -OC (= O)-, N-succinimidyl group, formyl group, and isocyanate. Examples include a group, an amino group, a hydrazide group and the like. Among these, a cyclic ether group is preferable, and a cyclic ether group having 3 to 7 atoms constituting the ring is more preferable. The cyclic ether group may have an alkyl group as a substituent. Specific examples of the cyclic ether group include cyclic ether groups represented by the following formulas (1) to (6), and the cyclic ether group represented by the formulas (1), (5) or (6). Is preferable, and the cyclic ether group represented by the formula (1) is more preferable.

Figure 2021098660
Figure 2021098660

〔式中、Ｒ1〜Ｒ4は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基を示し、＊は、結合手を示す。〕 [In the formula, R 1 to R 4 independently represent a hydrogen atom or an alkyl group, and * indicates a bond. ]

Ｒ1〜Ｒ4で示されるアルキル基の炭素数は、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１又は２である。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。また、Ｒ1〜Ｒ4としては、水素原子が好ましい。 The alkyl group represented by R 1 to R 4 preferably has 1 to 4 carbon atoms, and more preferably 1 or 2 carbon atoms. The alkyl group may be linear or branched, and examples thereof include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, and a tert-butyl group. Further, as R 1 to R 4 , a hydrogen atom is preferable.

イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有するモノビニルモノマーとしては、例えば、エポキシ基を分子内に有するモノビニルモノマー；（メタ）アクリル酸等のカルボキシ基を分子内に有するモノビニルモノマー；イソシアナトエチル（メタ）アクリレート等のイソシアネート基を分子内に有するモノビニルモノマー；マレイン酸無水物、メチルマレイン酸無水物、グルタコン酸無水物等の不飽和ジカルボン酸無水物系モノマーの他、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート等が挙げられる。 Examples of the monovinyl monomer having a reactive functional group reactive with the immunoglobulin-binding protein in the molecule include a monovinyl monomer having an epoxy group in the molecule; and a monovinyl having a carboxy group such as (meth) acrylic acid in the molecule. Monomer: Monovinyl monomer having an isocyanate group such as isocyanatoethyl (meth) acrylate in the molecule; unsaturated dicarboxylic acid anhydride-based monomer such as maleic acid anhydride, methylmaleic acid anhydride, glutaconic acid anhydride, and tetrahydro Examples include full frill (meth) acrylate.

エポキシ基を分子内に有するモノビニルモノマーとしては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、３−オキシラニルプロピル（メタ）アクリレート、４−オキシラニルブチル（メタ）アクリレート、５−オキシラニルペンチル（メタ）アクリレート、６−オキシラニルヘキシル（メタ）アクリレート、７−オキシラニルヘプチル（メタ）アクリレート、８−オキシラニルオクチル（メタ）アクリレート、（３−メチルオキシラニル）メチル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート、３，４−エポキシシクロヘキシルエチル（メタ）アクリレート、３，４−エポキシシクロヘキシルプロピル（メタ）アクリレート、α−（メタ）アクリル−ω−グリシジルポリエチレングリコール、グリセリンモノ（メタ）アクリレートグリシジルエーテル等のエポキシ基含有（メタ）アクリレート系モノビニルモノマー；ビニルベンジルグリシジルエーテル、イソプロペニルベンジルグリシジルエーテル、ビニルフェネチルグリシジルエーテル、ビニルフェニルブチルグリシジルエーテル、ビニルベンジルオキシエチルグリシジルエーテル、ビニルフェニルグリシジルエーテル、イソプロペニルフェニルグリシジルエーテル、１，２−エポキシ−３−（４−ビニルベンジル）プロパン等のエポキシ基含有芳香族系モノビニルモノマー；アリルグリシジルエーテル等のエポキシ基含有アリルエーテル系モノビニルモノマー；３，４−エポキシ−１−ブテン、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブテン等のビニルアルキレンオキシド系モノビニルモノマー等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。 Examples of the monovinyl monomer having an epoxy group in the molecule include glycidyl (meth) acrylate, 3-oxylanylpropyl (meth) acrylate, 4-oxylanylbutyl (meth) acrylate, and 5-oxylanylpentyl (meth). ) Acrylic, 6-oxylanylhexyl (meth) acrylate, 7-oxylanylheptyl (meth) acrylate, 8-oxylanyloctyl (meth) acrylate, (3-methyloxylanyl) methyl (meth) acrylate, 4 -Hydroxybutyl (meth) acrylate glycidyl ether, 3,4-epoxycyclohexylmethyl (meth) acrylate, 3,4-epoxycyclohexylethyl (meth) acrylate, 3,4-epoxycyclohexylpropyl (meth) acrylate, α- (meth) ) Epoxy group-containing (meth) acrylate-based monovinyl monomers such as acrylic-ω-glycidyl polyethylene glycol and glycerin mono (meth) acrylate glycidyl ether; vinylbenzyl glycidyl ether, isopropenylbenzyl glycidyl ether, vinylphenethyl glycidyl ether, vinylphenylbutyl glycidyl Epoxy group-containing aromatic monovinyl monomers such as ether, vinylbenzyloxyethyl glycidyl ether, vinylphenylglycidyl ether, isopropenylphenylglycidyl ether, 1,2-epoxy-3- (4-vinylbenzyl) propane; allyl glycidyl ether and the like. Epoxy group-containing allyl ether-based monovinyl monomers; vinyl alkylene oxide-based monovinyl monomers such as 3,4-epoxy-1-butene and 3,4-epoxy-3-methyl-1-butene can be mentioned. In addition, one of these can be used alone or in combination of two or more.

イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有さないモノビニルモノマーとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、４−ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリレート系モノビニルモノマー；（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロイルモルホリン、ダイアセトン（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド系モノビニルモノマー；スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、４−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、２，４，６−トリメチルスチレン、エチルビニルベンゼン、４−イソプロピルスチレン、４−ｎ−ブチルスチレン、４−イソブチルスチレン、４−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン等の芳香族系モノビニルモノマー；エチルビニルケトン、プロピルビニルケトン、イソプロピルビニルケトン等のビニルケトン系モノビニルモノマー；アクリロニトリル、メタクリロニトリル等の（メタ）アクリロニトリル系モノビニルモノマー；Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニルプロピオンアミド等のＮ−ビニルアミド系モノビニルモノマー等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。 Examples of the monovinyl monomer having no reactive functional group reactive with the immunoglobulin-binding protein in the molecule include methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, n-butyl (meth) acrylate, and 4-tert. -Butyl (meth) acrylate, isobutyl (meth) acrylate, cyclohexyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, n-octyl (meth) acrylate, glycerol mono (meth) acrylate, trimethylolethanemono (meth) acrylate , Trimethylol propane mono (meth) acrylate, butane triol mono (meth) acrylate, pentaerythritol mono (meth) acrylate, dipentaerythritol mono (meth) acrylate, inositol mono (meth) acrylate, methoxyethyl (meth) acrylate, hydroxy (Meta) acrylate-based monovinyl monomers such as ethyl (meth) acrylate, hydroxypropyl (meth) acrylate, polyethylene glycol mono (meth) acrylate, methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate; (meth) acrylamide, dimethyl (meth) acrylamide, hydroxy (Meta) acrylamide monovinyl monomers such as ethyl (meth) acrylamide, (meth) acryloylmorpholine, diacetone (meth) acrylamide; styrene, α-methylstyrene, halogenated styrene, 4-methylstyrene, 2,4-dimethylstyrene , 2,4,6-trimethylstyrene, ethylvinylbenzene, 4-isopropylstyrene, 4-n-butylstyrene, 4-isobutylstyrene, 4-tert-butylstyrene, 1-vinylnaphthalene, 2-vinylnaphthalene and other fragrances. Group monovinyl monomer; Vinyl ketone monovinyl monomer such as ethyl vinyl ketone, propyl vinyl ketone, isopropyl vinyl ketone; (meth) acrylonitrile monovinyl monomer such as acrylonitrile and methacrylonitrile; N-vinylacetamide, N-vinylpropionamide and the like Examples thereof include N-vinylamide-based monovinyl monomers. In addition, one of these can be used alone or in combination of two or more.

モノビニルモノマー由来の構造単位の含有量は、ポリマー中の全構造単位に対して、１０〜９９質量％が好ましく、２０〜９７．５質量％がより好ましく、３０〜９５質量％が更に好ましく、４０〜９０質量％が特に好ましい。 The content of the structural unit derived from the monovinyl monomer is preferably 10 to 99% by mass, more preferably 20 to 97.5% by mass, further preferably 30 to 95% by mass, and 40 by mass, based on the total structural units in the polymer. ~ 90% by mass is particularly preferable.

また、ポリマー中に含まれる多官能ビニルモノマー由来の構造単位（Ｐ）とモノビニルモノマー由来の構造単位（Ｍ）との含有割合〔（Ｐ）：（Ｍ）〕としては、質量比で、１：９９〜９０：１０が好ましく、２．５：９７．５〜８０：２０がより好ましく、５：９５〜７０：３０が更に好ましく、１０：９０〜６０：４０が特に好ましい。 Further, the content ratio [(P): (M)] of the structural unit (P) derived from the polyfunctional vinyl monomer and the structural unit (M) derived from the monovinyl monomer contained in the polymer is 1: 1 in mass ratio. 99 to 90:10 is preferable, 2.5: 97.5 to 80:20 is more preferable, 5:95 to 70:30 is further preferable, and 10:90 to 60:40 is particularly preferable.

（イムノグロブリン結合タンパク質）
本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質は、ポリペプチド鎖を含むものであり、また、当該ポリペプチド鎖は、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、及びそれらの変異体配列から選ばれるアミノ酸配列である。このポリペプチド鎖は、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖であり、イムノグロブリン結合ドメインとして機能する。以下、このポリペプチド鎖を「特定イムノグロブリン結合ドメイン」とも称する。また、上記イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる特定イムノグロブリン結合ドメインの数は２〜１０個である。
なお、本明細書において、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる、抗体（イムノグロブリン）又はその断片に対する結合活性を単独で有するポリペプチドの機能単位をいう。また、特定イムノグロブリン結合ドメインのうち、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖は、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン（Ｃドメイン）であり、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖は、プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン（Ｃ４ドメイン）であり、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖は、プロテインＧのイムノグロブリン結合ドメイン（β１ドメイン）である。 (Immunoglobulin binding protein)
The immunoglobulin-binding protein provided in the affinity carrier of the present invention contains a polypeptide chain, and the polypeptide chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. , And an amino acid sequence selected from their variant sequences. This polypeptide chain is a polypeptide chain having immunoglobulin binding activity and functions as an immunoglobulin binding domain. Hereinafter, this polypeptide chain is also referred to as a "specific immunoglobulin binding domain". The number of specific immunoglobulin-binding domains contained in the above-mentioned immunoglobulin-binding protein is 2 to 10.
In the present specification, the "immunoglobulin-binding domain" refers to a functional unit of a polypeptide contained in an immunoglobulin-binding protein that has a single binding activity to an antibody (immunoglobulin) or a fragment thereof. Further, among the specific immunoglobulin binding domains, the polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the immunoglobulin binding domain (C domain) of protein A, and the polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is The polypeptide chain consisting of the immunoglobulin binding domain (C4 domain) of protein L and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is the immunoglobulin binding domain (β1 domain) of protein G.

ここで、本明細書において、アミノ酸配列やヌクレオチド配列の「同一性」は、カーリンとアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０：５８７３−５８７７）を用いて決定することができる。このＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５：４０３−４１０）。これらのプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いることができる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（[www.ncbi.nlm.nih.gov]参照）。 Here, in the present specification, the "identity" of an amino acid sequence or a nucleotide sequence is determined using the algorithm BLAST (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-5877) by Carlin and Arthur. can do. Based on this BLAST algorithm, programs called BLASTN, BLASTX, BLASTP, BLASTN and TBLASTX have been developed (J. Mol. Biol., 1990, 215: 403-410). When using these programs, the default parameters of each program can be used. Specific methods for these analysis methods are known (see [www.ncbi.nlm.nih.gov]).

また、本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも８５％の同一性」とは、８５％以上の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、特に好ましくは９９％以上の同一性をいう。 Further, in the present specification, "at least 85% identity" with respect to an amino acid sequence and a nucleotide sequence means 85% or more identity, preferably 90% or more identity, and more preferably 95% or more identity. More preferably, it means 97% or more identity, further preferably 98% or more identity, and particularly preferably 99% or more identity.

また、本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列又はヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基又はヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/index.html]）のウェブサイト上で利用することができる。 Further, in the present specification, the "corresponding position" on the amino acid sequence and the nucleotide sequence is a preservation in which the target sequence and the reference sequence (for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) are present in each amino acid sequence or the nucleotide sequence. It can be determined by aligning the amino acid residues or nucleotides to give maximum homology. Alignment can be performed using known algorithms and the procedure is known to those of skill in the art. For example, alignment can be done by using the Clustal W Multiple Alignment Program (Thompson, J.D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680) with default settings. Clustal W is, for example, the European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and the DNA Data Bank of Japan (DDBJ [www. It can be used on the website of ddbj.nig.ac.jp/index.html]).

また、本明細書において、アミノ酸残基は次の略号でも記載される：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、及び任意のアミノ酸残基（Ｘａａ又はＸ）。また、本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、常法に従って、アミノ末端（以下Ｎ末端という）が左側、カルボキシル末端（以下Ｃ末端という）が右側に位置するように記載される。 Also herein, amino acid residues are also described by the following abbreviations: alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), aspartic acid (Asn or N), aspartic acid (Asp or D), cysteine ( Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamic acid (Glu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L), lysine (Lys) Or K), methionine (Met or M), phenylalanine (Phe or F), proline (Pro or P), serine (Ser or S), threonine (Thr or T), tryptophan (Trp or W), tyrosine (Tyr or Y), valine (Val or V), and any amino acid residue (Xaa or X). Further, in the present specification, the amino acid sequence of a peptide is described so that the amino terminal (hereinafter referred to as N-terminal) is located on the left side and the carboxyl terminal (hereinafter referred to as C-terminal) is located on the right side according to a conventional method.

また、本明細書において、アミノ酸配列の特定の位置に対する「前」及び「後」の位置とは、それぞれ、該特定の位置のＮ末端側及びＣ末端側に隣接する位置をいう。例えば、特定の位置の「前」及び「後」の位置へアミノ酸残基を挿入する場合、該特定の位置のＮ末端側及びＣ末端側に隣接する位置に、挿入後のアミノ酸残基が配置される。 Further, in the present specification, the "front" and "rear" positions of the amino acid sequence with respect to a specific position refer to positions adjacent to the N-terminal side and the C-terminal side of the specific position, respectively. For example, when an amino acid residue is inserted at a specific position "before" or "after", the inserted amino acid residue is placed at a position adjacent to the N-terminal side and the C-terminal side of the specific position. Will be done.

本明細書において、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、抗体又はその断片に対する結合活性を有するタンパク質をいう。
また、本明細書において、「抗体」は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びこれらのサブクラス等の任意のクラスのイムノグロブリン、それらの変異体を包含する概念である。また、本明細書において「抗体」は、ヒト化抗体等のキメラ抗体、抗体複合体、及び抗原認識部位を含む他のイムノグロブリン修飾体などであってもよい。
また、本明細書において、「抗体の断片」は、抗原認識部位を含む抗体の断片であっても、抗原認識部位を含まない抗体の断片であってもよい。抗原認識部位を含まない抗体の断片としては、例えば、イムノグロブリンのＦｃ領域のみからなるタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、及びそれらの変異体や修飾体などが挙げられる。 As used herein, the term "immunoglobulin-binding protein" refers to a protein having binding activity to an antibody or a fragment thereof.
Further, in the present specification, "antibody" is a concept including, for example, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, and any class of immunoglobulins such as subclasses thereof, and variants thereof. Further, in the present specification, the “antibody” may be a chimeric antibody such as a humanized antibody, an antibody complex, or another immunoglobulin modified product containing an antigen recognition site.
Further, in the present specification, the "antibody fragment" may be an antibody fragment containing an antigen recognition site or an antibody fragment not containing an antigen recognition site. Examples of the antibody fragment containing no antigen recognition site include a protein consisting only of the Fc region of immunoglobulin, an Fc fusion protein, and variants and modifications thereof.

ここで、特定イムノグロブリン結合ドメインにおける上記「変異体配列」について詳細に説明する。変異体配列の親ドメインとしては、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分であるプロテインＡ（以下、ＳｐＡとも称する）のイムノグロブリン結合ドメインであるＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、及びＢドメインの改変型ドメインであるＺドメイン；Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ３１２株又は３３１６株が産生するプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインであるＢ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ４ドメイン、Ｂ５ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ３ドメイン、及びＣ４ドメイン；Ｇグループの連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の細胞壁成分であるプロテインＧのイムノグロブリン結合ドメインであるβ１ドメイン、β２ドメイン、及びβ３ドメインが挙げられる。これらの中でも、ポリペプチド鎖が上記変異体配列からなる場合における親ドメインとしては、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、ＳｐＡのＣドメイン、プロテインＬのＣ４ドメイン、プロテインＧのβ１ドメインが好ましく、ＳｐＡのＣドメインがより好ましい。 Here, the above-mentioned "mutant sequence" in a specific immunoglobulin binding domain will be described in detail. The parent domain of the mutant sequence includes A domain, B domain, C domain, and D domain, which are immunoglobulin binding domains of protein A (hereinafter, also referred to as SpA), which is a cell wall component of Staphylococcus aureus. , E domain, and Z domain, which is a modified domain of B domain; B1 domain, B2 domain, B3 domain, B4 domain, B5 domain, which are immunoglobulin binding domains of protein L produced by Finegoldia magna 312 or 3316 strains. C1 domain, C2 domain, C3 domain, and C4 domain; β1 domain, β2 domain, and β3 domain, which are immunoglobulin binding domains of protein G, which is a cell wall component of G group Streptococci, can be mentioned. Among these, as the parent domain when the polypeptide chain consists of the above mutant sequence, in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and its fragment, the C domain of SpA, the C4 domain of protein L, and protein G are used. The β1 domain is preferred, and the SpA C domain is more preferred.

ＳｐＡのＣドメイン、プロテインＬのＣ４ドメイン、及びプロテインＧのβ１ドメインは、上記変異体配列からなるポリペプチド鎖の親ドメインとして使用され得る。
ＳｐＡのＣドメインは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該Ｃドメインの変異体としては、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。プロテインＬのＣ４ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該Ｃ４ドメインの変異体としては、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。プロテインＧのβ１ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該β１ドメインの変異体としては、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。
したがって、上記変異体配列からなるポリペプチド鎖の親ドメインの例としては、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が挙げられる。この中でも、親ドメインとしては、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が好ましい。 The C domain of SpA, the C4 domain of protein L, and the β1 domain of protein G can be used as the parent domain of the polypeptide chain consisting of the above mutant sequence.
The C domain of SpA is a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Examples of the mutant of the C domain include a polypeptide chain having an amino acid sequence having at least 85% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having immunoglobulin binding activity. The C4 domain of protein L is a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Examples of the mutant of the C4 domain include a polypeptide chain having an amino acid sequence having at least 85% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having immunoglobulin binding activity. The β1 domain of protein G is a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. Examples of the variant of the β1 domain include a polypeptide chain having an amino acid sequence having at least 85% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and having immunoglobulin binding activity.
Therefore, as an example of the parent domain of the polypeptide chain consisting of the above mutant sequence, a polypeptide chain consisting of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 can be mentioned. Among these, as the parent domain, a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is preferable in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and its fragment.

上記変異体配列からなるポリペプチド鎖としては、ＳｐＡのＣドメインに対して、配列番号１のアミノ酸配列の１位に相当する位置及び２９位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換若しくは欠失、又は当該位置の前若しくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入をして得られるポリペプチド鎖が挙げられ、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、且つ配列番号１のアミノ酸配列の１位に相当する位置及び２９位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換若しくは欠失、又は当該位置の前若しくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入を変異として有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が好ましい。
１位に相当する位置において、置換前のアミノ酸残基はＡｌａであり、これと置換される他のアミノ酸残基は、Ａｌａ以外のアミノ酸残基であればよく、好ましくはＶａｌである。また、２９位に相当する位置において、置換前のアミノ酸残基はＧｌｙであり、これと置換される他のアミノ酸残基は、Ｇｌｙ以外のアミノ酸残基であればよいが、好ましくはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＭｅｔであり、より好ましくはＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり、特に好ましくはＡｌａである。
ＳｐＡのＣドメインに対する上記変異は、配列番号１のアミノ酸配列の１位又は２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の単独変異であっても、上記１位及び２９位に相当する位置における２つのアミノ酸残基が変異した多重変異であってもよい。例えば、ＳｐＡのＣドメインに対する上記変異は、配列番号１のアミノ酸配列の１位又は２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の単独置換であっても、上記１位及び２９位に相当する位置における２つのアミノ酸残基を置換した多重置換であってもよい。 The polypeptide chain consisting of the above mutant sequence is at least one selected from the group consisting of a position corresponding to the 1st position and a position corresponding to the 29th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with respect to the C domain of SpA. Examples thereof include polypeptide chains obtained by substituting or deleting an amino acid residue at a position with another amino acid residue, or inserting another amino acid residue at a position before or after the position. Amino acid at least 85% identical to the amino acid sequence of No. 1 and at least one position selected from the group consisting of the position corresponding to the 1st position and the position corresponding to the 29th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A poly consisting of an amino acid sequence having an amino acid sequence in which a residue is substituted or deleted with another amino acid residue or an insertion of another amino acid residue at a position before or after the position as a mutation, and has immunoglobulin binding activity. Peptide chains are preferred.
At the position corresponding to the 1-position, the amino acid residue before substitution is Ala, and the other amino acid residue substituted with this may be an amino acid residue other than Ala, preferably Val. Further, at the position corresponding to the 29th position, the amino acid residue before substitution is Gly, and the other amino acid residue substituted with this may be an amino acid residue other than Gly, but Ala and Val are preferable. , Leu, Ile, Ph, Tyr, Trp, Thr, Ser, Asp, Glu, Arg, His or Met, more preferably Ala, Glu or Arg, and particularly preferably Ala.
The above mutation of SpA with respect to the C domain is a single mutation of an amino acid residue at the position corresponding to the 1st or 29th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but two mutations at the positions corresponding to the 1st and 29th positions. It may be a multiple mutation in which amino acid residues are mutated. For example, the above mutation of SpA with respect to the C domain is a single substitution of an amino acid residue at the position corresponding to the 1st or 29th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but at the position corresponding to the 1st or 29th position. It may be a multiple substitution in which two amino acid residues are substituted.

上記のような変異体配列からなるポリペプチド鎖の中でも、形質転換体におけるタンパク質発現量を増加させるために（ＰＮＡＳ，１９８９，８６：８２４７−８２５１，Ｆｉｇ．２）、また、複数のドメインを連結したイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの作製を容易にするために（ＷＯ２０１０／１１０２８８）、配列番号１のアミノ酸配列の１位に相当する位置におけるＡｌａをＶａｌとする置換を含むものが好ましい。また、上記変異体配列からなるポリペプチド鎖としては、イムノグロブリン結合タンパク質の化学的安定性及びアルカリ耐性を改善させるために（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００７，８４８（１）：４０−４７）、配列番号１のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＧｌｙをＡｌａとする置換をさらに含むものが特に好ましい。 Among the polypeptide chains consisting of the above mutant sequences, in order to increase the protein expression level in the transformant (PNAS, 1989, 86: 8247-8251, Fig. 2), a plurality of domains are linked. In order to facilitate the preparation of the polynucleotide encoding the immunoglobulin-binding protein (WO2010 / 110288), it is preferable to include a substitution in which Ala is Val at the position corresponding to the 1st position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, as a polypeptide chain consisting of the above mutant sequence, in order to improve the chemical stability and alkali resistance of the immunoglobulin binding protein (Journal of Chromatography B, 2007, 848 (1): 40-47), the sequence Those further comprising a Gly-Ala substitution at the position corresponding to the 29th position of the amino acid sequence of No. 1 are particularly preferable.

また、上記変異体配列からなるポリペプチド鎖は、イムノグロブリン結合活性を有する限りにおいて、タンパク質構造の安定性を高めるために（ＷＯ２０１３／１０９３０２、ＷＯ２０１７／１９４５９６等）、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端から少なくとも２残基（例えば、２残基、４残基、６残基又は７残基）に相当するアミノ酸残基を欠失した変異イムノグロブリン結合ドメインであってもよい。このような変異体としては、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から２〜７残基を欠失した変異イムノグロブリン結合ドメインが挙げられる。 In addition, the polypeptide chain consisting of the above variant sequence is any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 in order to enhance the stability of the protein structure as long as it has immunoglobulin binding activity (WO2013 / 109302, WO2017 / 194596, etc.). It may be a mutant immunoglobulin binding domain in which at least 2 residues (for example, 2 residues, 4 residues, 6 residues or 7 residues) corresponding to amino acid residues are deleted from the N-terminal of the amino acid sequence of. .. Examples of such a mutant include a mutant immunoglobulin binding domain in which 2 to 7 residues are deleted from the N-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

上記変異体配列からなるポリペプチド鎖において、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列の１位に相当する位置にＶａｌを含むか、及び／又は配列番号１のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＡｌａを含んでいてもよい。
変異体配列からなるポリペプチド鎖の中では、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が特に好ましい。 In the polypeptide chain consisting of the above variant sequence, the amino acid sequence having at least 85% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 contains Val at the position corresponding to the 1st position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. / Or Ala may be contained at the position corresponding to the 29th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
Among the polypeptide chains consisting of the mutant sequence, the polypeptide chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is particularly preferable.

上記変異体配列からなるポリペプチド鎖は、ＳｐＡのＣドメイン、プロテインＬのＣ４ドメイン、プロテインＧのβ１ドメインのアミノ酸配列に対して、アミノ酸残基の挿入、削除、置換又は欠失や、アミノ酸残基の化学的修飾等の改変を施すことによって作製することができる。アミノ酸残基の挿入、削除、置換又は欠失の手段としては、そのドメインをコードするポリヌクレオチドに対する部位特異的突然変異等の公知の手段が挙げられる。 The polypeptide chain consisting of the above mutant sequence contains amino acid residues inserted, deleted, substituted or deleted, and amino acid residues in the amino acid sequences of the C domain of SpA, the C4 domain of protein L, and the β1 domain of protein G. It can be produced by subjecting modifications such as chemical modification of the group. Means for inserting, deleting, substituting or deleting amino acid residues include known means such as site-specific mutations to the polynucleotide encoding the domain.

本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質に含まれる特定イムノグロブリン結合ドメインの数は２〜１０個である。
イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる特定イムノグロブリン結合ドメインの数は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、特に好ましくは５個以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは８個以下、より好ましくは７個以下である。具体的な範囲としては、３〜１０個が好ましく、４〜１０個がより好ましく、４〜８個が更に好ましく、４〜７個が更に好ましく、５〜７個が更に好ましく、６個が特に好ましい。なお、イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる２〜１０個の特定イムノグロブリン結合ドメインは、同種のものでも異種のものでもよいが、好ましくは同種である。 The number of specific immunoglobulin-binding domains contained in the immunoglobulin-binding protein contained in the affinity carrier of the present invention is 2 to 10.
The number of specific immunoglobulin-binding domains contained in the immunoglobulin-binding protein is preferably 3 or more, more preferably 4 or more, and particularly preferably 5 or more in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and its fragments. In addition, in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and its fragment, the number is preferably 8 or less, more preferably 7 or less. As a specific range, 3 to 10 pieces are preferable, 4 to 10 pieces are more preferable, 4 to 8 pieces are further preferable, 4 to 7 pieces are further preferable, 5 to 7 pieces are further preferable, and 6 pieces are particularly preferable. preferable. The 2 to 10 specific immunoglobulin-binding domains contained in the immunoglobulin-binding protein may be of the same type or different types, but are preferably the same type.

また、本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質は、特定イムノグロブリン結合ドメイン以外のイムノグロブリン結合ドメインを含んでいてもよい。このようなドメインとしては、例えば、Ｃドメイン以外の天然型ＳｐＡのイムノグロブリン結合ドメイン（例えば、ＳｐＡのＡドメイン、Ｂドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン）、ＳｐＡのＢドメインの改変型ドメインであるＺドメイン、Ｃ４ドメイン以外の天然型プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン（Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ４ドメイン、Ｂ５ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ３ドメイン）、β１ドメイン以外の天然型プロテインＧのイムノグロブリン結合ドメイン（β２ドメイン、β３ドメイン）、これらの変異体等が挙げられる。 In addition, the immunoglobulin-binding protein contained in the affinity carrier of the present invention may contain an immunoglobulin-binding domain other than the specific immunoglobulin-binding domain. Examples of such a domain include a native SpA immunoglobulin binding domain other than the C domain (for example, SpA A domain, B domain, D domain, and E domain), and Z which is a modified domain of SpA B domain. Domain, Immunoglobulin binding domain of natural protein L other than C4 domain (B1 domain, B2 domain, B3 domain, B4 domain, B5 domain, C1 domain, C2 domain, C3 domain), Natural protein G other than β1 domain Immunoglobulin binding domains (β2 domain, β3 domain), variants thereof and the like can be mentioned.

イムノグロブリン結合タンパク質としては、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、特定イムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列が直鎖状に２〜１０個（好ましくは３〜１０個、より好ましくは４〜１０個、更に好ましくは４〜８個、更に好ましくは４〜７個、更に好ましくは５〜７個、特に好ましくは６個）連結されたポリペプチドが好ましく、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、及びそれらの変異体配列から選ばれるアミノ酸配列のうちいずれか１種のアミノ酸配列が直鎖状に２〜１０個（好ましくは３〜１０個、より好ましくは４〜１０個、更に好ましくは４〜８個、更に好ましくは４〜７個、更に好ましくは５〜７個、特に好ましくは６個）連結されたポリペプチドがより好ましい。
なお、本明細書において、アミノ酸配列が「直鎖状に連結された」とは、２〜１０個のアミノ酸配列がリンカーを介して又はリンカーを介さずに直列に連結されていることを意味する。例えば、リンカーを介する場合、「直鎖状に連結された」とは、１つのアミノ酸配列のＣ末端と別のアミノ酸配列のＮ末端とがリンカーを介して直列に連結された構造を意味し、一方、リンカーを介さない場合、「直鎖状に連結された」とは、１つのアミノ酸配列のＣ末端と別のアミノ酸配列のＮ末端とがペプチド結合によって直列に連結された構造を意味する。 As the immunoglobulin binding protein, in order to increase the dynamic binding capacity to the antibody and its fragment, the amino acid sequence of the specific immunoglobulin binding domain is linearly arranged in 2 to 10 (preferably 3 to 10, more preferably). 4-10, more preferably 4-8, even more preferably 4-7, even more preferably 5-7, particularly preferably 6) linked polypeptides are preferred, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence of any one of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence selected from their mutant sequences is linearly 2 to 10 (preferably 3 to 10). , More preferably 4 to 10, more preferably 4 to 8, still more preferably 4 to 7, still more preferably 5 to 7, and particularly preferably 6) linked polypeptides.
In addition, in this specification, "the amino acid sequence is linearly linked" means that 2 to 10 amino acid sequences are linked in series with or without a linker. .. For example, when via a linker, "linearly linked" means a structure in which the C-terminal of one amino acid sequence and the N-terminal of another amino acid sequence are linked in series via a linker. On the other hand, when not mediated by a linker, "linearly linked" means a structure in which the C-terminal of one amino acid sequence and the N-terminal of another amino acid sequence are linked in series by a peptide bond.

なお、本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質は、特定イムノグロブリン結合ドメインのＮ末端、Ｃ末端及びドメイン間のうちいずれか１箇所以上に、任意のアミノ酸残基又はペプチドが付加又は挿入されていてもよい。当該付加又は挿入されるアミノ酸残基又はペプチドとしては、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、（Ｐｒｏ）ｍ、（Ａｌａ−Ｐｒｏ）ｎ、（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ）ｐが挙げられる。なお、ｍは、２〜３００の整数、好ましくは１２〜２４の整数であり、ｎは、４以上の整数、好ましくは４〜１０の整数であり、ｐは、２以上の整数、好ましくは２〜６の整数である。 The immunoglobulin-binding protein of the affinity carrier of the present invention has an arbitrary amino acid residue or peptide added or inserted at any one or more of the N-terminal, C-terminal and between domains of a specific immunoglobulin-binding domain. May be. Examples of the amino acid residue or peptide to be added or inserted include Cys, Lys, Pro, (Pro) m, (Ala-Pro) n, and (Glu-Ala-Ala-Ala-Lys) p. Note that m is an integer of 2 to 300, preferably an integer of 12 to 24, n is an integer of 4 or more, preferably an integer of 4 to 10, and p is an integer of 2 or more, preferably 2. It is an integer of ~ 6.

本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質は、例えば、アミノ酸配列に基づく化学合成法や、リコンビナント法などで製造できる。例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． ＡｕｓｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）等に記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用して製造することができる。
すなわち、本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを大腸菌等の宿主に形質転換し、得られた組換え体を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、目的のタンパク質を大量且つ経済的に取得することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができる。例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１）等に記載されているプラスミドが挙げられる。また、形質転換のための宿主としては、大腸菌等のバクテリア、真菌類、昆虫細胞、哺乳類細胞等の組換えタンパク質を発現させるために用いられる公知の宿主を用いることができる。宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）等に記載されている公知の方法を利用することができる。なお、得られた形質転換体（好ましくは細菌等の細胞）を培養して発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。また、イムノグロブリン結合タンパク質は、無細胞タンパク質合成系を用いて発現させてもよい。 The immunoglobulin-binding protein contained in the affinity carrier of the present invention can be produced, for example, by a chemical synthesis method based on an amino acid sequence, a recombinant method, or the like. For example, Frederick M. et al. It is known that Ausbel et al.'S Molecular Protocols In Molecular Biology, Sambrook et al. Edited Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) and the like can be used for recombination.
That is, by transforming an expression vector containing a polynucleotide encoding an immunoglobulin-binding protein provided in the affinity carrier of the present invention into a host such as Escherichia coli, and culturing the obtained recombinant in an appropriate liquid medium, the result is obtained. The target protein can be obtained in large quantities and economically from the cultured cells. As the expression vector, any known vector that can replicate in the host cell can be used. For example, the plasmid described in US Pat. No. 5,151,350 and the plasmid described in Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) edited by Sambrook et al. Can be mentioned. Further, as the host for transformation, a known host used for expressing recombinant proteins such as bacteria such as Escherichia coli, fungi, insect cells, and mammalian cells can be used. In order to transform a host by introducing nucleic acid into the host, any method known in the art may be used depending on each host, for example, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor) edited by Sambrook et al. A known method described in Laboratory Press, 3rd edition, 2001) and the like can be used. A method for recovering the expressed protein by culturing the obtained transformant (preferably cells such as bacteria) is well known to those skilled in the art. In addition, the immunoglobulin binding protein may be expressed using a cell-free protein synthesis system.

本発明のアフィニティ担体は、上記のようなイムノグロブリン結合タンパク質が多孔質粒子に結合されたものであるが、当該結合は、直接的な化学結合でもスペーサー分子を介した間接的な結合でもよい。直接的な化学結合としては、例えば、多孔質粒子に含まれる「イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基」の残基（開環エポキシ基等）とイムノグロブリン結合タンパク質との共有結合が挙げられる。なお、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基としては、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有するモノビニルモノマーが有するものとして挙げた反応性官能基と同様のものが挙げられる。 The affinity carrier of the present invention is obtained by binding an immunoglobulin-binding protein as described above to porous particles, and the binding may be a direct chemical bond or an indirect bond via a spacer molecule. As a direct chemical bond, for example, a covalent bond between a residue (ring-opening epoxy group, etc.) of a "reactive functional group having reactivity with an immunoglobulin-binding protein" contained in porous particles and an immunoglobulin-binding protein. Can be mentioned. The reactive functional group having reactivity with the immunoglobulin-binding protein is the same as the reactive functional group mentioned as having a monovinyl monomer having a reactive functional group reactive with the immunoglobulin-binding protein in the molecule. Can be mentioned.

また、イムノグロブリン結合タンパク質の多孔質粒子に対する結合量は、空孔率を所望の範囲にしやすくするために、多孔質粒子の乾燥重量１ｇに対して、好ましくは３０〜１５０ｍｇ、より好ましくは４０〜１２０ｍｇである。
なお、イムノグロブリン結合タンパク質の結合量は、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＢＣＡ）を用いたアッセイ（ＢＣＡアッセイ）等で測定できる。 The amount of the immunoglobulin-binding protein bound to the porous particles is preferably 30 to 150 mg, more preferably 40 to 40 to 1 g of dry weight of the porous particles in order to facilitate the porosity within a desired range. It is 120 mg.
The amount of immunoglobulin-binding protein bound can be measured by an assay using Bicinchoninic acid (BCA) (BCA assay) or the like.

＜アフィニティ担体の製造方法＞
本発明のアフィニティ担体は、アフィニティ担体の湿潤状態での空孔率が７０〜９５％（ｖ／ｖ）となるように、（工程１）原料となる多孔質粒子の調製と（工程２）当該多孔質粒子への上記イムノグロブリン結合タンパク質の結合を行うことにより、製造することができる。 <Manufacturing method of affinity carrier>
The affinity carrier of the present invention comprises (step 1) preparation of porous particles as a raw material and (step 2) so that the porosity of the affinity carrier in a wet state is 70 to 95% (v / v). It can be produced by binding the above-mentioned immunoglobulin-binding protein to the porous particles.

（工程１）
原料となる多孔質粒子は公知の方法を参考にして適宜調製すればよいが、天然高分子系多孔質粒子を多孔質粒子として備えるアフィニティ担体を製造する場合、原料となる天然高分子系多孔質粒子は、例えば、Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３−３９８（１９６４）、ＷＯ９７／３８０１８、特開２０１２−８７２０２号公報、特開２０１２−１２６７９６号公報等に記載されている逆相懸濁ゲル化法やイオン液体に溶解させて懸濁させる方法等の常法により調製すればよい。このとき、原料天然高分子の使用量やゲル化温度やゲル化時間を調節することによって、空孔率が所望の範囲になりやすくなる。なお、懸濁に用いる有機溶媒としては、多孔化剤として後述する有機溶媒が挙げられる。また、空孔率を所望の範囲にしやすくするために、工程２に先立って、上記で得られた天然高分子系の原料多孔質粒子に分級処理を行うのが好ましい。
また、架橋化及び／又はエポキシ基導入をする場合は、エピハロヒドリン、ビスエポキシド、１，２，３−トリハロ置換された低級炭化水素類等と反応させてもよい。なお、この反応は、分級処理前に行っても分級処理後に行ってもよい。 (Step 1)
The raw material porous particles may be appropriately prepared with reference to known methods, but when an affinity carrier containing natural polymer-based porous particles as porous particles is produced, the raw material is natural polymer-based porous particles. The particles are described in, for example, Hjerten, Biochim Biophys Acta 79 (2), 393-398 (1964), WO97 / 38018, JP2012-87202A, JP2012-126996A, and the like. It may be prepared by a conventional method such as a turbid gelation method or a method of dissolving and suspending in an ionic liquid. At this time, by adjusting the amount of the raw material natural polymer used, the gelation temperature, and the gelation time, the porosity tends to be in a desired range. Examples of the organic solvent used for suspension include organic solvents described later as the porosifying agent. Further, in order to facilitate the porosity within a desired range, it is preferable to perform a classification treatment on the natural polymer-based raw material porous particles obtained above prior to the step 2.
Further, in the case of cross-linking and / or introduction of an epoxy group, it may be reacted with epihalohydrin, bisepoxide, lower hydrocarbons substituted with 1,2,3-trihalo and the like. This reaction may be carried out before the classification treatment or after the classification treatment.

一方、合成高分子系多孔質粒子を多孔質粒子として備えるアフィニティ担体を製造する場合、原料となる合成高分子系多孔質粒子は、例えば、ＷＯ２０１５／８０１７４、ＷＯ２０１５／１１９２５５等に記載の公知の方法を参考にして適宜調製すればよい。具体的には、モノマーを、重合開始剤及び多孔化剤を用いて懸濁重合させる方法が挙げられる。懸濁重合に用いるモノマーとしては、合成高分子系多孔質粒子を与えるモノマーとして上記で述べたものが挙げられる。 On the other hand, when producing an affinity carrier containing synthetic polymer-based porous particles as porous particles, the synthetic polymer-based porous particles used as a raw material are, for example, known methods described in WO2015 / 80174, WO2015 / 119255 and the like. It may be prepared appropriately with reference to. Specifically, a method of suspend-polymerizing a monomer using a polymerization initiator and a porosity agent can be mentioned. Examples of the monomer used for suspension polymerization include those described above as a monomer that gives synthetic polymer-based porous particles.

重合開始剤としてはラジカル重合開始剤が好ましい。ラジカル重合開始剤としては、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤、レドックス系開始剤等が挙げられる。より具体的には、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、過酸化ベンゾイル−ジメチルアニリン等が挙げられる。 A radical polymerization initiator is preferable as the polymerization initiator. Examples of the radical polymerization initiator include an azo-based initiator, a peroxide-based initiator, and a redox-based initiator. More specifically, azobisisobutyronitrile, methyl azobisisobutyrate, azobis-2,4-dimethylvaleronitrile, benzoyl peroxide, di-tert-butyl peroxide, benzoyl peroxide-dimethylaniline and the like can be mentioned.

多孔化剤は、油滴内でモノマーと共に存在し、非重合成分として孔を形成する作用を有する。多孔化剤は、モノマーの種類やその使用量等に応じて適宜選択すればよいが、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、ノナン、デカン、ウンデカン等の脂肪族炭化水素類；シクロペンタン、シクロヘキサン等の脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、テトラクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ヘキサノール等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール等の脂環式アルコール類；２−フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、アセトフェノン、２−オクタノン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、アニソール、エトキシベンゼン等のエーテル類；酢酸イソペンチル、酢酸ブチル、酢酸−３−メトキシブチル、マロン酸ジエチル等のエステル類の他、非架橋性ビニルモノマーのホモポリマー等の線状重合物が挙げられる。なお、このうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
多孔化剤の使用量は、モノマーの種類やその使用量、多孔化剤の種類等に応じて適宜調整すればよいが、空孔率を所望の範囲にしやすくするために、モノマー総量１００質量部に対して、好ましくは１００〜６００質量部、より好ましくは１５０〜５５０質量部、特に好ましくは２５０〜５００質量部である。 The porosifying agent exists together with the monomer in the oil droplet and has an action of forming pores as a non-polymerizing component. The porosifying agent may be appropriately selected depending on the type of monomer and the amount used thereof, and for example, aliphatic hydrocarbons such as hexane, heptane, octane, isooctane, nonane, decane and undecane; cyclopentane and cyclohexane. Alicyclic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene, naphthalene, ethylbenzene and other aromatic hydrocarbons; carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, tetrachloroethane, chlorobenzene and other halogenated hydrocarbons; butanol, Alicyclic alcohols such as pentanol, hexanol, heptanol, 4-methyl-2-pentanol, 2-ethyl-1-hexanol; alicyclic alcohols such as cyclohexanol; 2-phenylethyl alcohol, benzyl alcohol and the like Aromatic alcohols; ketones such as diethyl ketone, methyl isobutyl ketone, diisobutyl ketone, acetophenone, 2-octanone, cyclohexanone; ethers such as dibutyl ether, diisobutyl ether, anisole, ethoxybenzene; ethers such as isopentyl acetate, butyl acetate, acetate- In addition to esters such as 3-methoxybutyl and diethyl malonate, linear polymers such as homopolymers of non-crosslinkable vinyl monomers can be mentioned. Of these, one type may be used alone or two or more types may be used in combination.
The amount of the porosity agent used may be appropriately adjusted according to the type of the monomer, the amount used thereof, the type of the porosity agent, etc., but in order to facilitate the porosity within a desired range, the total amount of the monomer is 100 parts by mass. On the other hand, it is preferably 100 to 600 parts by mass, more preferably 150 to 550 parts by mass, and particularly preferably 250 to 500 parts by mass.

なお、上記懸濁重合は、上記各成分に加えて必要に応じて、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン等の水溶性高分子；分散安定剤；各種界面活性剤；重合禁止剤；重合調整剤等を用いて行ってもよい。なお、このうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。 In addition to the above components, the suspension polymerization may be carried out as necessary, water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol, hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, starch, gelatin; dispersion stabilizers; various surfactants; A polymerization inhibitor; a polymerization modifier or the like may be used. Of these, one type may be used alone or two or more types may be used in combination.

懸濁重合の重合温度は、重合開始剤の種類等に応じて適宜決定すればよいが、通常２〜１００℃程度であり、アゾビスイソブチロニトリルを重合開始剤として用いる場合は、６５〜９５℃が好ましい。また、重合時間は、通常５分間〜４８時間である。なお、得られた多孔質粒子には、ＷＯ２０１９／０３９５４５、特開２０１１−２５２９２９号公報、ＷＯ２０１７／１５５１０５、特開昭６２−２５１０２号公報等に記載の上記の架橋構造の導入や表面変性を行ってもよい。
また、天然高分子系多孔質粒子の場合と同様、空孔率を所望の範囲にしやすくするために、工程２に先立って、上記で得られた合成高分子系の原料多孔質粒子に分級処理を行うのが好ましい。 The polymerization temperature of suspension polymerization may be appropriately determined depending on the type of polymerization initiator, etc., but is usually about 2 to 100 ° C., and when azobisisobutyronitrile is used as the polymerization initiator, it is 65 to 50 ° C. 95 ° C. is preferable. The polymerization time is usually 5 minutes to 48 hours. The obtained porous particles are subjected to the introduction of the above-mentioned crosslinked structure and surface modification described in WO2019 / 039545, JP-A-2011-252929, WO2017 / 155105, JP-A-62-25102 and the like. You may.
Further, as in the case of the natural polymer-based porous particles, in order to facilitate the porosity within a desired range, prior to step 2, the synthetic polymer-based raw material porous particles obtained above are classified. It is preferable to do.

（工程２）
工程１で得た多孔質粒子に上記イムノグロブリン結合タンパク質を結合させる方法は、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００７，８，６，１７７５−１７８９等に記載の一般的な方法でよい。例えば、工程１で得た多孔質粒子が、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を有する場合は、当該反応性官能基にイムノグロブリン結合タンパク質を結合させる方法が挙げられる。工程１で得た多孔質粒子が環状エーテル基を有する場合は、当該環状エーテル基に、イムノグロブリン結合タンパク質のアミノ基、ヒドロキシ基又はチオール基を反応させればよい。また、工程１で得た多孔質粒子がカルボキシ基を有する場合は、当該カルボキシ基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミド等で活性化させ、イムノグロブリン結合タンパク質のアミノ基と反応させる方法や、水溶性カルボジイミド等の脱水縮合剤存在下でイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ基と反応させる方法が挙げられる。
また、特開２０１７−８３３６３号公報、ＷＯ２０１５／１１９２８８等に記載の公知の手法を参考にして、ポリアルキレングリコール鎖や糖類等のスペーサー分子を介して、工程１で得た多孔質粒子に上記イムノグロブリン結合タンパク質を結合させてもよい。 (Step 2)
The method for binding the immunoglobulin-binding protein to the porous particles obtained in step 1 may be the general method described in Biomacromolecules 2007, 8, 6, 1775-1789 and the like. For example, when the porous particles obtained in step 1 have a reactive functional group that is reactive with the immunoglobulin-binding protein, a method of binding the immunoglobulin-binding protein to the reactive functional group can be mentioned. When the porous particles obtained in step 1 have a cyclic ether group, the cyclic ether group may be reacted with an amino group, a hydroxy group or a thiol group of an immunoglobulin-binding protein. When the porous particles obtained in step 1 have a carboxy group, a method of activating the carboxy group with N-hydroxysuccinimide or the like and reacting it with the amino group of an immunoglobulin-binding protein, or a water-soluble carbodiimide. Examples thereof include a method of reacting with an amino group of an immunoglobulin binding protein in the presence of a dehydration condensing agent such as.
Further, with reference to the known methods described in JP-A-2017-83363, WO2015 / 119288, etc., the above-mentioned immunono is added to the porous particles obtained in step 1 via spacer molecules such as polyalkylene glycol chains and saccharides. A globulin-binding protein may be bound.

また、工程１で得た多孔質粒子が環状エーテル基を有する場合、これに由来する環状エーテル基が、工程２を行った後も残存することがあるが、この残存した環状エーテル基は公知の手法で開環させてもよい。例えば、酸又はアルカリ；メルカプトエタノール、チオグリセロール等のメルカプト基を有するアルコール；グリセロール等の多価アルコール；モノエタノールアミン等を用いて開環させることができる。 Further, when the porous particles obtained in step 1 have a cyclic ether group, the cyclic ether group derived from the porous ether group may remain even after the step 2 is performed, but the remaining cyclic ether group is known. The ring may be opened by a method. For example, the ring can be opened using an acid or alkali; an alcohol having a mercapto group such as mercaptoethanol or thioglycerol; a polyhydric alcohol such as glycerol; monoethanolamine or the like.

＜クロマトグラフィーカラム＞
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明のアフィニティ担体を含むものである。
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明のアフィニティ担体を含む以外は、通常のクロマトグラフィーカラムと同様である。具体的には、カラム容器と当該カラム容器に充填された本発明のアフィニティ担体とを備えるクロマトグラフィーカラムが挙げられる。 <Chromatography column>
The chromatography column of the present invention contains the affinity carrier of the present invention.
The chromatography column of the present invention is the same as a normal chromatography column except that it contains the affinity carrier of the present invention. Specifically, a chromatography column including a column container and the affinity carrier of the present invention filled in the column container can be mentioned.

＜抗体又はその断片の単離方法＞
本発明の抗体又はその断片の単離方法は、本発明のアフィニティ担体又は本発明のクロマトグラフィーカラムを用いるものである。
本発明の抗体又はその断片の単離方法は、本発明のアフィニティ担体又は本発明のクロマトグラフィーカラムを用いること以外は、抗体又はその断片の一般的な単離方法と同様にして行えばよい。具体的には、本発明のアフィニティ担体と、抗体又はその断片を含む試料とを接触させる工程を含む方法が挙げられる。また、この工程によって抗体又はその断片をアフィニティ担体に捕捉させて抗体又はその断片から夾雑物（例えば、抗体又はその断片以外のタンパク質等）を分離した後、アフィニティ担体に捕捉された抗体又はその断片を溶出させる溶出工程を行うことが好ましい。この溶出液を回収することで、試料から抗体又はその断片を単離することができる。溶出工程には、イムノグロブリン結合タンパク質と抗体又はその断片とを解離させる解離液が通常使用される。解離液のｐＨ（２５℃）は、好ましくは２〜７の範囲、より好ましくは３〜５の範囲である。
また、単離は、本発明のクロマトグラフィーカラムを用いて行ってもよい。このような方法としては、本発明のクロマトグラフィーカラムに、抗体又はその断片を含む試料を通液する工程を含む方法が挙げられ、この工程によって抗体又はその断片をアフィニティ担体に捕捉させて抗体又はその断片から夾雑物を分離した後、上記と同様に溶出工程を行うことが好ましい。 <Method of isolating antibody or fragment thereof>
The method for isolating the antibody or fragment thereof of the present invention uses the affinity carrier of the present invention or the chromatography column of the present invention.
The method for isolating the antibody or fragment thereof of the present invention may be the same as the general method for isolating the antibody or fragment thereof, except that the affinity carrier of the present invention or the chromatography column of the present invention is used. Specifically, a method including a step of contacting the affinity carrier of the present invention with a sample containing an antibody or a fragment thereof can be mentioned. Further, in this step, an antibody or a fragment thereof is captured by an affinity carrier to separate impurities (for example, a protein other than the antibody or a fragment thereof) from the antibody or fragment thereof, and then the antibody or fragment thereof captured by the affinity carrier is used. It is preferable to carry out an elution step of eluting. By collecting this eluate, an antibody or a fragment thereof can be isolated from the sample. A dissociation solution that dissociates an immunoglobulin-binding protein from an antibody or a fragment thereof is usually used in the elution step. The pH (25 ° C.) of the dissociation solution is preferably in the range of 2 to 7, more preferably in the range of 3 to 5.
In addition, isolation may be performed using the chromatography column of the present invention. Examples of such a method include a method in which a sample containing an antibody or a fragment thereof is passed through a chromatography column of the present invention, and the antibody or a fragment thereof is captured by an affinity carrier by this step to capture the antibody or a fragment thereof. After separating the contaminants from the fragment, it is preferable to carry out the elution step in the same manner as described above.

なお、抗体又はその断片を含む試料は特に限定されないが、例えば、全血、血清、血漿、各種血球、血餅、血小板等の血液組成成分、尿、精液、母乳、汗、間質液、間質性リンパ液、骨髄液、組織液、唾液、胃液、関節液、胸水、胆汁、腹水、羊水等の体液、菌体液、細胞培養の培地、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体試料が挙げられる。 The sample containing the antibody or a fragment thereof is not particularly limited, but for example, blood composition components such as whole blood, serum, plasma, various blood cells, blood clots, and platelets, urine, semen, breast milk, sweat, interstitial fluid, and interstitial fluid. Various liquid samples such as qualitative lymph fluid, bone marrow fluid, tissue fluid, saliva, gastric fluid, joint fluid, pleural fluid, bile, ascites, sheep fluid and other body fluids, bacterial cell fluid, cell culture medium, cell culture supernatant, tissue cell disruption fluid, etc. Can be mentioned.

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

（実施例１）
（１）４４８ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製 ＰＶＡ−２１７）２．６９ｇを添加し、加熱撹拌することでポリビニルアルコールを溶解させ、水溶液Ｓを調製した。
一方、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）２．９７ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）１１．９ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン２３．４ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、前記水溶液Ｓを、セパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．３８ｇを添加し、内温を８６℃にした。 (Example 1)
(1) 2.69 g of polyvinyl alcohol (PVA-217 manufactured by Kuraray Co., Ltd.) was added to 448 g of pure water, and the polyvinyl alcohol was dissolved by heating and stirring to prepare an aqueous solution S.
On the other hand, a monomer composition consisting of 2.97 g of divinylbenzene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 11.9 g of glycidyl methacrylate (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 23.4 g of 2-octanone to form a monomer solution. Was prepared.
Next, the entire amount of the aqueous solution S was put into a separable flask, a thermometer, a stirring blade and a cooling tube were attached, and the solution was set in a hot water bath to start stirring in a nitrogen atmosphere. Put the entire amount of the monomer solution into a separable flask, heat it with a hot water bath, and when the internal temperature reaches 85 ° C, 2,2'-azoisobutyronitrile (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 .38 g was added to bring the internal temperature to 86 ° C.

（２）その後、８６℃に温度を維持したまま、１時間撹拌を行った。次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。
（３）次に、洗浄後の粒子を、篩目開き３２μｍ及び篩目開き７５μｍの試験篩にて湿式分級した。この分級後の多孔質粒子を多孔質粒子（Ｐ１）ともいう。 (2) After that, stirring was performed for 1 hour while maintaining the temperature at 86 ° C. Then, after cooling the reaction solution, the reaction solution was filtered and washed with pure water and ethanol.
(3) Next, the washed particles were wet-classified with a test sieve having a sieve mesh opening of 32 μm and a sieve mesh opening of 75 μm. The porous particles after this classification are also referred to as porous particles (P1).

（４）次に、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモテトラマーからなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：４個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製は以下のようにして行った。すなわち、ＰｒＡｔをコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）を形質転換し、得られた形質転換体を富栄養培地中３７℃で対数増殖期まで培養した。その後、培地にイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を終濃度１ｍＭで添加して、さらに３７℃で４時間培養することにより、目的タンパク質を発現させた。続いて培養液を遠心分離して上清を除き、得られた菌体に、卵白由来リゾチーム（和光純薬工業社製）及びポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業社製）を含むｐＨ９．５の３０ｍＭトリス緩衝液を添加して菌体を破砕した。得られた細胞破砕液から、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）及び陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によって、組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を精製した。精製したイムノグロブリン結合タンパク質を、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度を確認したところ、９５％以上であった。 (4) Next, the immunoglobulin binding protein PrAt was obtained. The immunoglobulin-binding protein PrAt is an immunoglobulin-binding protein (number of domains: number of domains:) consisting of a homotetramer in which an A1V / G29A variant (SEQ ID NO: 4) of the C domain (SEQ ID NO: 1) of protein A is linked in series by a peptide bond. 4).
The expression and purification of the immunoglobulin-binding protein PrAt was carried out as follows. That is, Escherichia coli BL21 (DE3) (manufactured by NEW ENGLAND BIOLABBS) was transformed with a plasmid encoding PrAt, and the obtained transformant was cultured in a eutrophic medium at 37 ° C. until the logarithmic growth phase. Then, isopropyl-β-thiogalactopyranoside (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the medium at a final concentration of 1 mM, and the mixture was further cultured at 37 ° C. for 4 hours to express the target protein. Subsequently, the culture solution was centrifuged to remove the supernatant, and the obtained bacterial cells were subjected to egg white-derived lysozyme (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). A 30 mM Tris buffer having a pH of 9.5 was added to disrupt the cells. Recombinant from the obtained cell disruption solution by cation exchange chromatography (SP-Sepharose FF, manufactured by GE Healthcare Bioscience) and anion exchange chromatography (Q-Sepharose FF, manufactured by GE Healthcare Bioscience). The type immunoglobulin binding protein was purified. The purified immunoglobulin binding protein was dialyzed against 10 mM citrate buffer (pH 6.0). When the purity of the recombinant immunoglobulin-binding protein was confirmed by SDS-PAGE, it was 95% or more.

（５）次いで、１．１Ｍ硫酸ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．８）４５０μＬに、上記（４）で得たイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを１．１６ｍｇ溶解させ、これを上記（３）で得た多孔質粒子（Ｐ１）８ｍｇに加え、混合液を２５℃で５時間振とうすることで、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを多孔質粒子（Ｐ１）に結合させた。粒子に残存するエポキシ基をチオグリセロールで開環させた後、０．５Ｍ ＮａＯＨ及び０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．２）を用いて洗浄することで、アフィニティ担体を得た。 (5) Next, 1.16 mg of the immunoglobulin-binding protein PrAt obtained in (4) above was dissolved in 450 μL of 0.1 M carbonate buffer (pH 8.8) containing 1.1 M sodium sulfate, and this was dissolved in (3) above. In addition to 8 mg of the porous particles (P1) obtained in (1), the mixed solution was shaken at 25 ° C. for 5 hours to bind the immunoglobulin-binding protein PrAt to the porous particles (P1). The epoxy group remaining on the particles was ring-opened with thioglycerol and then washed with 0.5 M NaOH and 0.1 M citrate buffer (pH 3.2) to obtain an affinity carrier.

（実施例２〜７、１９、比較例４、５）
各モノマー及び有機溶媒（多孔化剤）の仕込量を、表１、３、５に記載の量とした以外は、実施例１と同様にして、アフィニティ担体を得た。 (Examples 2 to 7, 19, Comparative Examples 4, 5)
An affinity carrier was obtained in the same manner as in Example 1 except that the amounts of each monomer and organic solvent (porous agent) charged were the amounts shown in Tables 1, 3 and 5.

（調製例１ イムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：２個）の調製）
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｉを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｉは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモダイマーからなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：２個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｉの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。 (Preparation Example 1 Preparation of immunoglobulin-binding protein (number of domains: 2))
The immunoglobulin binding protein PrAdi was obtained. The immunoglobulin-binding protein PrAdi is an immunoglobulin-binding protein (number of domains: 2) consisting of a homodimer in which an A1V / G29A variant (SEQ ID NO: 4) of the C domain (SEQ ID NO: 1) of protein A is linked in series by a peptide bond. Pieces).
The expression and purification of the immunoglobulin-binding protein PrAdi was carried out in the same manner as the expression and purification of the immunoglobulin-binding protein PrAt. The purity of the recombinant immunoglobulin-binding protein confirmed by SDS-PAGE was 95% or higher.

（調製例２ イムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：６個）の調製）
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモヘキサマーからなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：６個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。 (Preparation Example 2 Preparation of immunoglobulin-binding protein (number of domains: 6))
The immunoglobulin binding protein PrAh was obtained. The immunoglobulin-binding protein PrAh is an immunoglobulin-binding protein (number of domains: 6) consisting of a homohexamar in which an A1V / G29A variant (SEQ ID NO: 4) of the C domain (SEQ ID NO: 1) of protein A is linked in series by a peptide bond. Pieces).
The expression and purification of the immunoglobulin-binding protein PrAh was carried out in the same manner as the expression and purification of the immunoglobulin-binding protein PrAt. The purity of the recombinant immunoglobulin-binding protein confirmed by SDS-PAGE was 95% or higher.

（調製例３ イムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１０個）の調製）
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｅを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｅは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモデカマー（１０量体）からなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１０個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｅの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。 (Preparation Example 3 Preparation of immunoglobulin-binding protein (number of domains: 10))
The immunoglobulin binding protein PrAde was obtained. The immunoglobulin-binding protein PrAde is an immunoglobulin-binding protein consisting of a homodecomer (10-mer) in which an A1V / G29A variant (SEQ ID NO: 4) of the C domain (SEQ ID NO: 1) of protein A is linked in series by a peptide bond. (Number of domains: 10).
The expression and purification of the immunoglobulin-binding protein PrAde was carried out in the same manner as the expression and purification of the immunoglobulin-binding protein PrAt. The purity of the recombinant immunoglobulin-binding protein confirmed by SDS-PAGE was 95% or higher.

（調製例４ イムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１個）の調製）
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｍを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｍは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）を１個含むイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｍの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。 (Preparation Example 4 Preparation of immunoglobulin-binding protein (number of domains: 1))
The immunoglobulin binding protein PrAm was obtained. The immunoglobulin-binding protein PrAm is an immunoglobulin-binding protein (number of domains: 1) containing one A1V / G29A variant (SEQ ID NO: 4) of the C domain (SEQ ID NO: 1) of protein A.
The expression and purification of the immunoglobulin-binding protein PrAm was carried out in the same manner as the expression and purification of the immunoglobulin-binding protein PrAt. The purity of the recombinant immunoglobulin-binding protein confirmed by SDS-PAGE was 95% or higher.

（調製例５ イムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１２個）の調製）
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｄを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｄは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモドデカマー（１２量体）からなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１２個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｄの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。 (Preparation Example 5 Preparation of immunoglobulin-binding protein (number of domains: 12))
The immunoglobulin binding protein PrAdd was obtained. The immunoglobulin-binding protein PrAdd is an immunoglobulin-binding protein consisting of a homododecamer (12-mer) in which an A1V / G29A variant (SEQ ID NO: 4) of the C domain (SEQ ID NO: 1) of protein A is linked in series by a peptide bond. (Number of domains: 12).
The expression and purification of the immunoglobulin-binding protein PrAdd was carried out in the same manner as the expression and purification of the immunoglobulin-binding protein PrAt. The purity of the recombinant immunoglobulin-binding protein confirmed by SDS-PAGE was 95% or higher.

（実施例８〜１８、２０、比較例１〜３、６〜８）
各モノマー及び有機溶媒（多孔化剤）の仕込量を、表２、３及び５に記載の量とし、且つイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを、Ａ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体ドメイン数が表２、３及び５に記載の数であるイムノグロブリン結合タンパク質（イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｉ、ＰｒＡｈ、ＰｒＡｄｅ、ＰｒＡｍ又はＰｒＡｄｄ）に変更した以外は、実施例１と同様にして、アフィニティ担体を得た。 (Examples 8 to 18, 20, Comparative Examples 1 to 3, 6 to 8)
The amount of each monomer and organic solvent (porous agent) charged is the amount shown in Tables 2, 3 and 5, and the immunoglobulin-binding protein PrAt is shown in Tables 2, 3 and 5 for the number of A1V / G29A mutant domains. Affinity carriers were obtained in the same manner as in Example 1 except that the number was changed to the number of immunoglobulin-binding proteins (immunoglobulin-binding proteins PrAdi, PrAh, PrAde, PrAm or PrAdd).

（実施例２１）
アガロース（株式会社日本ジーン社製Ａｇａｒｏｓｅ Ｈ）２４ｇ及び精製水４００ｇをバッフル付きセパラブルフラスコに投入し、温水バスにセットし９５℃で２時間加熱することによりアガロース水溶液を調製した。
アガロース水溶液を６０℃まで冷却した後、イソオクタン（和光純薬社製）４４０ｇ及び界面活性剤（三洋化成社製Ｓ−８０）２４ｇを投入し撹拌することによってアガロース水溶液の懸濁液を調製した。その後、この懸濁液を２時間かけて２５℃まで冷却し、その後４時間保持した。
次に、水−エタノール溶液にて粒子を洗浄後、水で回収した。この洗浄後の粒子を、篩目開き３２μｍ及び篩目開き１００μｍの試験篩にて湿式分級し、３２〜１００μｍの間の粒子を水で回収し分級後粒子を得た。
次いで、分級後粒子の５０％（ｖ／ｖ）スラリー１００ｍＬに硫酸ナトリウム５０ｇを加え、さらに５０％（ｗ／ｖ）水酸化ナトリウム溶液（和光純薬社製）及びエピクロロヒドリン（和光純薬社製）をそれぞれ１０ｍＬ投入し、４５℃で８時間反応させることにより、アガロースにエポキシ基を導入した。
その後、実施例１の（３）で得た多孔質粒子（Ｐ１）を、上記で得たエポキシ基導入アガロース粒子に変更する以外は、実施例１の（５）と同様の操作を行うことでイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを結合させ、アフィニティ担体を得た。 (Example 21)
An aqueous agarose solution was prepared by putting 24 g of agarose (Agarose H manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) and 400 g of purified water into a separable flask with a baffle, setting it in a warm water bath, and heating it at 95 ° C. for 2 hours.
After cooling the agarose aqueous solution to 60 ° C., 440 g of isooctane (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 24 g of a surfactant (S-80 manufactured by Sanyo Chemical Industries, Ltd.) were added and stirred to prepare a suspension of the agarose aqueous solution. The suspension was then cooled to 25 ° C. over 2 hours and then retained for 4 hours.
Next, the particles were washed with a water-ethanol solution and then recovered with water. The washed particles were wet-classified with a test sieve having a sieve mesh of 32 μm and a sieve mesh of 100 μm, and the particles between 32 and 100 μm were recovered with water to obtain particles after classification.
Next, 50 g of sodium sulfate was added to 100 mL of a 50% (v / v) slurry of particles after classification, and a 50% (w / v) sodium hydroxide solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and epichlorohydrin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added. The epoxy group was introduced into agarose by adding 10 mL each (manufactured by the company) and reacting at 45 ° C. for 8 hours.
After that, the same operation as in (5) of Example 1 was performed except that the porous particles (P1) obtained in (3) of Example 1 were changed to the epoxy group-introduced agarose particles obtained above. The immunoglobulin binding protein PrAt was bound to obtain an affinity carrier.

（実施例２２）
１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）６０ｇ及びセルロース粉末（フナコシ株式会社製）３．５ｇを、バッフル付きセパラブルフラスコに投入し、温水バスにセットし９５℃に加熱し、２時間撹拌を行うことで、セルロース溶液を得た。
別のセパラブルフラスコ内で、トルエン（和光純薬工業社製）２００ｍＬにエチルセルロース４５（平均分子量１５００００）（和光純薬工業社製）１６ｇを加え、温水バスにセットし８０℃で２時間撹拌を行い溶解させた。この溶液を「エチルセルロース４５含有溶液Ｘ」とも称する。
さらに別のセパラブルフラスコ内で、トルエン１５０ｍＬにエチルセルロース４５を１２ｇ加え、温水バスにセットし８０℃で２時間撹拌を行い溶解させた後、０．２Ｍ硫酸ナトリウム水溶液６２．５ｍＬを加え、３０分間撹拌を行うことでＷ／Ｏ型エマルジョンを得た。
次に、エチルセルロース４５含有溶液Ｘを、上記セルロース溶液に加えて、４００ｒｐｍ、９０℃で１０分間撹拌し、セルロース溶液の液滴分散液（ＩＬ／Ｏ型エマルジョン（ここで、ＩＬはイオン液体））を調製した後、上記で得られたＷ／Ｏ型エマルジョンを加えて、４００ｒｐｍで撹拌しながら２５℃に冷却し、３時間保持した。その後、エタノール１５００ｍＬ中に注ぎ、撹拌後静置しデカンテーションにより上澄み液を除去した。
その後、水とエタノールで濾過洗浄を行い、セルロース粒子を得た。この洗浄後の粒子を、篩目開き３２μｍ及び篩目開き１００μｍの試験篩にて湿式分級し、３２〜１００μｍの間の粒子を水で回収し分級後粒子を得た。
分級後のセルロース粒子に、実施例２１と同様の手法でエポキシ基導入を行うことで、エポキシ基導入セルロース粒子を得た。
その後、実施例１の（３）で得た多孔質粒子（Ｐ１）を、上記で得たエポキシ基導入セルロース粒子に変更する以外は、実施例１の（５）と同様の操作を行うことでイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを結合させ、アフィニティ担体を得た。 (Example 22)
60 g of 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate (manufactured by Aldrich) and 3.5 g of cellulose powder (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) were placed in a separable flask with a baffle, set in a warm water bath, and heated to 95 ° C. A cellulose solution was obtained by stirring for 2 hours.
In another separable flask, add 16 g of ethyl cellulose 45 (average molecular weight 150,000) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to 200 mL of toluene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), set it in a warm water bath, and stir at 80 ° C. for 2 hours. And dissolved. This solution is also referred to as "ethyl cellulose 45-containing solution X".
In yet another separable flask, 12 g of ethyl cellulose 45 was added to 150 mL of toluene, set in a warm water bath, stirred at 80 ° C. for 2 hours to dissolve, and then 62.5 mL of a 0.2 M aqueous sodium sulfate solution was added for 30 minutes. A W / O type emulsion was obtained by stirring.
Next, the ethyl cellulose 45-containing solution X is added to the above cellulose solution, and the mixture is stirred at 400 rpm and 90 ° C. for 10 minutes to obtain a droplet dispersion of the cellulose solution (IL / O type emulsion (where IL is an ionic liquid)). Was prepared, the W / O type emulsion obtained above was added, and the mixture was cooled to 25 ° C. with stirring at 400 rpm and held for 3 hours. Then, it was poured into 1500 mL of ethanol, and after stirring, it was allowed to stand and the supernatant was removed by decantation.
Then, it was filtered and washed with water and ethanol to obtain cellulose particles. The washed particles were wet-classified with a test sieve having a sieve mesh of 32 μm and a sieve mesh of 100 μm, and the particles between 32 and 100 μm were recovered with water to obtain particles after classification.
Epoxy group-introduced cellulose particles were obtained by introducing epoxy groups into the classified cellulose particles in the same manner as in Example 21.
After that, the same operation as in Example 1 (5) was performed except that the porous particles (P1) obtained in Example 1 (3) were changed to the epoxy group-introduced cellulose particles obtained above. The immunoglobulin binding protein PrAt was bound to obtain an affinity carrier.

（実施例２３）
３６０ｇの純水にポリビニルアルコール２．１５ｇを添加し、加熱撹拌することでポリビニルアルコールを溶解させ、水溶液Ｓ２を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）４．５６ｇ及びエチレンジメタクリレート（東京化成社製）６．８４ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）１２．３ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、上記水溶液Ｓ２を、セパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、攪拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．６５ｇを添加し、８６℃に温度を維持しながら２時間撹拌を行った。
その後、純水とエタノールで多孔質粒子を洗浄した。この洗浄後の粒子を、篩目開き３２μｍ及び篩目開き１００μｍの試験篩にて湿式分級し、３２〜１００μｍの間の粒子を水で回収し分級後粒子を得た。
その後、実施例１の（３）で得た多孔質粒子（Ｐ１）を、上記で得た分級後粒子に変更する以外は、実施例１の（５）と同様の操作を行うことでイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを結合させ、アフィニティ担体を得た。 (Example 23)
2.15 g of polyvinyl alcohol was added to 360 g of pure water, and the polyvinyl alcohol was dissolved by heating and stirring to prepare an aqueous solution S2.
On the other hand, a monomer composition consisting of 4.56 g of glycidyl methacrylate (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company) and 6.84 g of ethylene dimethacrylate (manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd.) was dissolved in 12.3 g of 2-octanone (manufactured by Toyo Gosei Co., Ltd.). To prepare a monomer solution.
Next, the entire amount of the aqueous solution S2 was put into a separable flask, a thermometer, a stirring blade and a cooling tube were attached, and the solution was set in a hot water bath to start stirring in a nitrogen atmosphere. Put the entire amount of the above monomer solution into a separable flask, heat it with a warm water bath, and when the internal temperature reaches 85 ° C, 2,2'-azoisobutyronitrile (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0 .65 g was added, and the mixture was stirred for 2 hours while maintaining the temperature at 86 ° C.
Then, the porous particles were washed with pure water and ethanol. The washed particles were wet-classified with a test sieve having a sieve mesh of 32 μm and a sieve mesh of 100 μm, and the particles between 32 and 100 μm were recovered with water to obtain particles after classification.
After that, the same operation as in Example 1 (5) is performed except that the porous particles (P1) obtained in Example 1 (3) are changed to the post-classification particles obtained above. The binding protein PrAt was bound to obtain an affinity carrier.

（実施例２４〜２６）
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを、調製例２で取得したイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈに変更した以外は、実施例２１〜２３と同様にして、アフィニティ担体を得た。 (Examples 24-26)
An affinity carrier was obtained in the same manner as in Examples 21 to 23, except that the immunoglobulin-binding protein PrAt was changed to the immunoglobulin-binding protein PrAh obtained in Preparation Example 2.

試験例１ （空孔率及び平均細孔径の測定）
２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を用いて、各実施例及び比較例で得られたアフィニティ担体４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）をカラム容器に充填した。５００ｍＭ 塩化ナトリウム水溶液、プルランのスタンダードサンプル（昭和電工社製Ｐ−８２）を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液、及びデキストラン（分子量：５，０００，０００〜４０，０００，０００（和光純薬社製））を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液それぞれをカラムに５０μＬずつ打ち込み、溶出体積を記録した。カラム容積からデキストランの溶出体積（粒子空隙容積）を引いた値を「粒子容積」とし、塩化ナトリウムの溶出体積からデキストランの溶出体積を引いた値を「細孔容積」とした。得られた細孔容積を粒子容積で割った値を「湿潤状態での空孔率」として算出した。湿潤状態での空孔率を表１〜５に示す。
さらに湿潤状態での平均細孔径を、“Ｈａｇｅｌ，ｅｔ．ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．７４３（１９９６）３２−４２”に記載の方法で算出した。すなわち、プルランの分子サイズと分配係数Ｋｄのプロットを作成し、近似直線を引き、Ｋｄ＝ε（１−分子サイズ／平均ポアサイズ）＾（１／２）が成り立つことから、切片と傾きから平均細孔径を算出した。湿潤状態での平均細孔径を表１〜５に示す。なお、分配係数Ｋｄは、Ｋｄ＝（プルランの溶出体積−デキストランの溶出体積）／（塩化ナトリウムの溶出体積−デキストランの溶出体積）で表される値である。 Test Example 1 (Measurement of porosity and average pore diameter)
Using a 20 mM sodium phosphate / 150 mM sodium chloride aqueous solution, 4 mL (5 mmφ × 200 mm length) of the affinity carrier obtained in each Example and Comparative Example was filled in a column container. 500 mM sodium chloride aqueous solution, 20 mM sodium phosphate / 150 mM sodium chloride aqueous solution containing a standard sample of Pulran (P-82 manufactured by Showa Denko Co., Ltd.), and dextran (molecular weight: 5,000,000 to 40,000,000 (Wako Jun) 50 μL of each of 20 mM sodium phosphate aqueous solution / 150 mM sodium chloride aqueous solution containing)) was poured into the column, and the elution volume was recorded. The value obtained by subtracting the elution volume of dextran (particle void volume) from the column volume was defined as the "particle volume", and the value obtained by subtracting the elution volume of dextran from the elution volume of sodium chloride was defined as the "pore volume". The value obtained by dividing the obtained pore volume by the particle volume was calculated as the "porosity in a wet state". The porosities in the wet state are shown in Tables 1-5.
Further, the average pore diameter in the wet state was calculated by the method described in "Hagel, et. Al, Journal of Chromatography A, Vol. 743 (1996) 32-42". That is, a plot of the molecular size of pullulan and the partition coefficient Kd is created, an approximate straight line is drawn, and Kd = ε (1-molecular size / average pore size) ^ (1/2) holds. The hole diameter was calculated. The average pore diameter in the wet state is shown in Tables 1-5. The partition coefficient Kd is a value represented by Kd = (pullulan elution volume-dextran elution volume) / (sodium chloride elution volume-dextran elution volume).

試験例２ （平均粒子径の測定）
各実施例及び比較例で得られたアフィニティ担体の体積平均粒子径を、ＪＩＳ Ｚ ８８２５（２０１３）に従って、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製 ＬＳ１３３２０）により測定した。なお、溶媒（水）の屈折率は１．３３３に、粒子（アフィニティ担体）の屈折率は１．５０に、それぞれ設定した。
結果を表１〜５に示す。なお、表中の数値は、小数点以下を四捨五入した値である。 Test Example 2 (Measurement of average particle size)
The volume average particle size of the affinity carrier obtained in each Example and Comparative Example was measured by a laser diffraction / scattering type particle size distribution measuring device (LS13320 manufactured by Beckman Coulter) according to JIS Z 8825 (2013). The refractive index of the solvent (water) was set to 1.333, and the refractive index of the particles (affinity carrier) was set to 1.50.
The results are shown in Tables 1-5. The values in the table are rounded off to the nearest whole number.

試験例３ （見掛密度の測定）
実施例１で得られたアフィニティ担体を水に分散させ、スラリーを得た。このスラリーをメスシリンダーに測りとった後、２４時間以上静置することにより、メスシリンダー内で担体を完全に沈降させた。沈降した粒子層の容積をメスシリンダー内で読み取り、アフィニティ担体の湿潤状態での見掛密度を下記式により算出した。
（メスシリンダー内に投入したスラリー重量×スラリー中の固形分濃度［質量％］（Ｔｏｔａｌ ｓｏｌｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ））／沈降した粒子層の容積 × １００
なお、スラリーの固形分濃度は、アルミカップにスラリーを秤量した後、アルミカップを２００℃で１０分間加熱することで水を除去し、残った固形分の重量から算出した。
また、実施例２〜７のアフィニティ担体の湿潤状態での見掛密度についても、上記と同様にして測定した。
その結果、実施例１の担体の湿潤状態での見掛密度は１８２ｇ／Ｌ、実施例２の担体の湿潤状態での見掛密度は１５２ｇ／Ｌ、実施例３の担体の湿潤状態での見掛密度は１４５ｇ／Ｌ、実施例４の担体の湿潤状態での見掛密度は１８０ｇ／Ｌ、実施例５の担体の湿潤状態での見掛密度は１５５ｇ／Ｌ、実施例６の担体の湿潤状態での見掛密度は１３５ｇ／Ｌ、実施例７の担体の湿潤状態での見掛密度は１３０ｇ／Ｌであった。 Test Example 3 (Measurement of apparent density)
The affinity carrier obtained in Example 1 was dispersed in water to obtain a slurry. After measuring this slurry in a graduated cylinder, the carrier was completely settled in the graduated cylinder by allowing it to stand for 24 hours or more. The volume of the precipitated particle layer was read in a measuring cylinder, and the apparent density of the affinity carrier in a wet state was calculated by the following formula.
(Weight of slurry charged into the graduated cylinder x Solid content concentration in the slurry [mass%] (Total solid content)) / Volume of sedimented particle layer x 100
The solid content concentration of the slurry was calculated from the weight of the remaining solid content after weighing the slurry in an aluminum cup and then heating the aluminum cup at 200 ° C. for 10 minutes to remove water.
Further, the apparent density of the affinity carriers of Examples 2 to 7 in a wet state was also measured in the same manner as described above.
As a result, the apparent density of the carrier of Example 1 in the wet state was 182 g / L, the apparent density of the carrier of Example 2 in the wet state was 152 g / L, and the apparent density of the carrier of Example 3 in the wet state. The apparent density of the carrier of Example 4 was 145 g / L, the apparent density of the carrier of Example 4 in the wet state was 180 g / L, the apparent density of the carrier of Example 5 in the wet state was 155 g / L, and the wet state of the carrier of Example 6 was wet. The apparent density of the carrier in the state was 135 g / L, and the apparent density of the carrier of Example 7 in the wet state was 130 g / L.

試験例４ （ＤＢＣの測定）
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ Ｂｉｏ社製 ＨＧＧ−１０００）に対する実施例及び比較例の各アフィニティ担体のＤＢＣを測定した。カラム容器は容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）にタンパク質を５ｍｇ／ｍＬ溶解したものをそれぞれ使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求め、以下の基準で評価した。結果を表１〜５に示す。 Test Example 4 (Measurement of DBC)
Using GE Healthcare's AKTA prime plus, the DBC of each affinity carrier of Examples and Comparative Examples for a protein (human IgG antibody, HGG-1000 manufactured by Equitech Bio) at a linear flow rate of 300 cm / hr was measured. The column container has a volume of 4 mL (5 mmφ x 200 mm length), and the protein uses 5 mg / mL of protein dissolved in 20 mM sodium phosphate / 150 mM sodium chloride aqueous solution (pH 7.5), and the elution tip breaks by 10%. DBC was determined from the amount of protein trapped during slewing and the column packing volume, and evaluated according to the following criteria. The results are shown in Tables 1-5.

（ＤＢＣの評価基準）
ＡＡＡ：６５ｍｇ／ｍＬ以上
ＡＡ ：６０ｍｇ／ｍＬ以上６５ｍｇ／ｍＬ未満
Ａ ：５３ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ未満
Ｂ ：５０ｍｇ／ｍＬ以上５３ｍｇ／ｍＬ未満
Ｃ ：５０ｍｇ／ｍＬ未満 (DBC evaluation criteria)
AAA: 65 mg / mL or more AA: 60 mg / mL or more and less than 65 mg / mL A: 53 mg / mL or more and less than 60 mg / mL B: 50 mg / mL or more and less than 53 mg / mL C: 50 mg / mL or less

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表中の記号は、それぞれ以下を示す。
ＧＭＡ：グリシジルメタクリレート
ＤＶＢ：ジビニルベンゼン
ＭＨＫ：２−オクタノン
ＡｃＰｈ：アセトフェノン
ＧＭＡ＋ＥＤＭＡ：グリシジルメタクリレートとエチレンジメタクリレートとの重合体 The symbols in the table indicate the following.
GMA: Glycidyl methacrylate DVB: Divinylbenzene MHK: 2-Octanone AcPh: Acetophenone GMA + EDMA: Polymer of glycidyl methacrylate and ethylene dimethacrylate

Claims (7)

多孔質粒子と、当該多孔質粒子に結合されたイムノグロブリン結合タンパク質とを備えるアフィニティ担体であって、
湿潤状態での空孔率が７０〜９５％（ｖ／ｖ）であり、
前記イムノグロブリン結合タンパク質が、ポリペプチド鎖を含み、
前記ポリペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、及びそれらの変異体配列から選ばれるアミノ酸配列であり、
前記イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる前記ポリペプチド鎖の数が２〜１０個である、アフィニティ担体。 An affinity carrier comprising porous particles and an immunoglobulin-binding protein bound to the porous particles.
The porosity in the wet state is 70-95% (v / v).
The immunoglobulin binding protein contains a polypeptide chain and contains
The polypeptide chain is an amino acid sequence selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a mutant sequence thereof.
An affinity carrier in which the number of the polypeptide chains contained in the immunoglobulin-binding protein is 2 to 10. 前記ポリペプチド鎖の数が３〜１０個である、請求項１に記載の担体。 The carrier according to claim 1, wherein the number of the polypeptide chains is 3 to 10. 湿潤状態での平均細孔径が２２〜３５ｎｍである、請求項１又は２に記載の担体。 The carrier according to claim 1 or 2, wherein the average pore diameter in a wet state is 22 to 35 nm. 前記空孔率が８０〜９０％（ｖ／ｖ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の担体。 The carrier according to any one of claims 1 to 3, wherein the porosity is 80 to 90% (v / v). 平均粒子径が３０〜１００μｍである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の担体。 The carrier according to any one of claims 1 to 4, which has an average particle size of 30 to 100 μm. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の担体を含む、クロマトグラフィーカラム。 A chromatography column comprising the carrier according to any one of claims 1 to 5. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の担体又は請求項６に記載のクロマトグラフィーカラムを用いる、抗体又はその断片の単離方法。 A method for isolating an antibody or a fragment thereof using the carrier according to any one of claims 1 to 5 or the chromatography column according to claim 6.
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