JP2021078464A - Primer sets - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、プライマーセット、LAMP法反応用組成物、チクングニア熱の検査方法等に関する。 The present invention relates to a primer set, a composition for LAMP reaction, a method for testing Chikungunya heat, and the like.
チクングニア熱は、未だにワクチンや治療薬が開発されていない蚊媒介性のウイルス疾患であり、強い関節痛を主症状とするため、患者のQOLを著しく低下させる。過去に、世界各地でチクングニア熱の大流行が起きているが、そのリスクを軽減させるためには、二次感染拡大を防ぐための早期診断が必須である。 Chikungunya fever is a mosquito-borne viral disease for which vaccines and therapeutic agents have not yet been developed, and its main symptom is strong arthralgia, which significantly reduces the QOL of patients. In the past, chikungunya outbreaks have occurred around the world, but early diagnosis to prevent the spread of secondary infections is essential to reduce the risk.
現状ではチクングニア熱の検査は血清を用いたRT-PCR法が標準的である。しかし、RT-PCR法はRNAの抽出、PCRでの3段階における温度変化、電気泳動などのステップが必要であるため、診断には最低5-6時間必要である。さらに、高価な機器（サーマルサイクラー）や試薬の冷蔵設備、熟練した技術などが必要となる。しかし、多くの流行地ではこれらの設備が不十分であったり、技術者が不足していたりといった問題がある。 At present, the RT-PCR method using serum is the standard test for chikungunya fever. However, the RT-PCR method requires steps such as RNA extraction, temperature change in three stages of PCR, and electrophoresis, so a minimum of 5-6 hours is required for diagnosis. In addition, expensive equipment (thermal cycler), reagent refrigeration equipment, and skilled technology are required. However, in many endemic areas, there are problems such as insufficient equipment and lack of engineers.
Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)システムは遺伝子増幅法の一種であり、迅速、簡便、精確なシステムである。標的領域に対して4種類または6種類のプライマーを設定し、反応させるが、システムの感度や精度はプライマーに大きく依存する。非特許文献１には、チクングニアウイルスに対するLAMPシステムについて報告されている。
The Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) system is a kind of gene amplification method, which is a quick, convenient, and accurate system. Four or six types of primers are set for the target region and reacted, but the sensitivity and accuracy of the system largely depend on the primers. Non-Patent
本発明は、簡便且つ効率的にチクングニア熱を検査することができる技術を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a technique capable of inspecting Chikungunya fever easily and efficiently.
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、特定の塩基配列を含むプライマーセットを用いて、チクングニアウイルスの標的核酸領域の増幅の有無をLAMP法により検出することにより、上記課題を解決できることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。 As a result of intensive research, the present inventor has found that the above problem can be solved by detecting the presence or absence of amplification of the target nucleic acid region of chikungunya virus by the LAMP method using a primer set containing a specific base sequence. .. The present inventor has completed the present invention as a result of further research based on this finding.
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。 That is, the present invention includes the following aspects.
項１． （A）5’側から配列番号1で示される塩基配列、リンカー配列、配列番号2で示される塩基配列が順に配置されてなる塩基配列を含むフォワードインナープライマー、
（B）5’側から配列番号4で示される塩基配列、リンカー配列、配列番号5で示される塩基配列が順に配置されてなる塩基配列を含むバックワードインナープライマー、
（C）配列番号7で示される塩基配列を含むフォワードアウタープライマー、及び
（D）配列番号8で示される塩基配列を含むバックワードアウタープライマー
を含む、プライマーセット。
(B) A backward inner primer containing a base sequence in which the base sequence shown by SEQ ID NO: 4, the linker sequence, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 are arranged in order from the 5'side.
A primer set containing (C) a forward outer primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and (D) a backward outer primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8.
項２． さらに、
（E）配列番号9で示される塩基配列を含むフォワードループプライマー、及び
（F）配列番号10で示される塩基配列を含むバックワードループプライマー
を含む、項１に記載のプライマーセット。
項３． 項１又は２に記載のプライマーセット、及びトレハロースを含有する、乾燥形態のLAMP法反応用組成物。
項４． 項１又は２に記載のプライマーセット、又は項３に記載の反応用組成物を含む、チクングニア熱の検査キット。
項５． 項１又は２に記載のプライマーセット、又は項３に記載の反応用組成物を用いて、チクングニアウイルスの標的核酸領域の増幅の有無をLAMP法により検出することを含む、チクングニア熱の検査方法。
本発明によれば、簡便且つ効率的にチクングニア熱を検査することができる技術、具体的には、LAMP法によりチクングニアウイルスの標的核酸領域を増幅するために使用することができるプライマーセット、乾燥形態のLAMP法反応用組成物、チクングニア熱の検査キット等を提供することができる。 According to the present invention, a technique capable of easily and efficiently testing chikungunya fever, specifically, a primer set that can be used to amplify a target nucleic acid region of chikungunya virus by the LAMP method, a dry form. The composition for the reaction of the LAMP method, the test kit for Chikungunya fever, and the like can be provided.
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。 In the present specification, the expressions "contains" and "contains" include the concepts of "contains", "contains", "substantially consists" and "consists of only".
1．プライマーセット
本発明は、その一態様において、フォワードインナープライマー（A）、バックワードインナープライマー（B）、フォワードアウタープライマー（C）、及びバックワードアウタープライマー（D）を含む、プライマーセット（本明細書において、「本発明のプライマーセット」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
1. 1. Primer Set The present invention, in one embodiment, comprises a primer set (the present specification) comprising a forward inner primer (A), a backward inner primer (B), a forward outer primer (C), and a backward outer primer (D). In the above, it may be referred to as "the primer set of the present invention"). This will be described below.
本発明のプライマーセットは、LAMP法によりチクングニアウイルスの標的核酸領域を増幅するために使用することができる。LAMP法（ループ媒介等温増幅法）は、PCR法で不可欠とされる温度制御が不要な核酸増幅法（国際公開第00/28082号パンフレット）である。当該方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の3'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、LAMP法では、プライマーの3'末端が常にサンプルに由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するため、その結果として、高感度に且つ特異性の高い核酸増幅反応を可能としている。 The primer set of the present invention can be used to amplify the target nucleic acid region of chikungunya virus by the LAMP method. The LAMP method (loop-mediated isothermal amplification method) is a nucleic acid amplification method (International Publication No. 00/28082 pamphlet) that does not require temperature control, which is indispensable in the PCR method. In this method, the 3'end of itself is annealed to a nucleotide as a template to serve as a starting point for complementary strand synthesis, and a primer to be annealed to the loop formed at this time is combined to carry out an isothermal complementary strand synthesis reaction. This is a nucleic acid amplification method that has been made possible. In addition, in the LAMP method, since the 3'end of the primer is always annealed to the region derived from the sample, the check mechanism by complementary binding of the base sequence functions repeatedly, and as a result, it is highly sensitive and specific. It enables a highly potent nucleic acid amplification reaction.
チクングニアウイルスは、トガウイルス科アルファウイルス属に属する節足動物媒介性ウイルスであり、プラス一本鎖RNAをゲノムとする。カプシドは直径60-70 nmである。58℃程度で失活し、また乾燥に弱い。ウイルス株はアフリカ西部、アフリカ南部から東部、アジアの3系統に大別される。本発明のプライマーセットは、チクングニアウイルスのRNAゲノムの塩基配列（例えば、配列番号13）（アンチセンス鎖）を含む核酸（例えばRNA）又は該ゲノムの相補塩基配列（センス鎖）を含む核酸（例えばcDNA、DNA等）を鋳型核酸とする。 Chikungunya virus is a arthropod-borne virus belonging to the genus Alphavirus of the Togaviridae family, and has a positive single-strand RNA as its genome. Capsids are 60-70 nm in diameter. It is inactivated at about 58 ° C and is vulnerable to drying. Virus strains are roughly divided into three strains: West Africa, southern Africa to eastern Africa, and Asia. The primer set of the present invention includes a nucleic acid (eg RNA) containing the base sequence (eg, SEQ ID NO: 13) (antisense strand) of the RNA genome of Chikungunia virus or a nucleic acid (eg, sense strand) containing a complementary base sequence (sense strand) of the genome. cDNA, DNA, etc.) is used as a template nucleic acid.
LAMP反応で使用される必須のプライマーは、鋳型核酸の計6領域、すなわち3'末端側からF3c、F2c、F1cという領域と、5'末端側からB3、B2、B1という領域の塩基配列、或いはその相補配列を認識する少なくとも4種類のプライマーであって、各々フォワードインナープライマー（FIP）及びバックワードインナープライマー（BIP）とフォワードアウタープライマー（F3）及びバックワードアウタープライマー（B3）と呼ぶ。また、F1c、F2c、F3cの相補配列をそれぞれF1、F2、F3、またB1、B2、B3の相補鎖をB1c、B2c、B3cと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、且つ合成起点を与える塩基配列を3'末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を5'末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F2より選ばれた塩基配列」及び「F1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをフォワードインナープライマー（FIP）、そして「B2より選ばれた塩基配列」と「B1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをバックワードインナープライマー（BIP）と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の3'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識し、且つ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをフォワードアウタープライマー（F3）、「B3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをバックワードアウタープライマー（B3）と呼ぶ。ここで、各プライマーにおける「フォワード（F）」とは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方、「バック（B）」とは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。 The essential primers used in the LAMP reaction are the base sequences of a total of 6 regions of the template nucleic acid, that is, the regions F3c, F2c, F1c from the 3'end side and the regions B3, B2, B1 from the 5'end side, or At least four types of primers that recognize the complementary sequence are called forward inner primer (FIP), backward inner primer (BIP), forward outer primer (F3), and backward outer primer (B3), respectively. The complementary sequences of F1c, F2c and F3c are called F1, F2 and F3, respectively, and the complementary strands of B1, B2 and B3 are called B1c, B2c and B3c. An inner primer is a nucleic acid synthesis reaction product that recognizes a "certain nucleotide sequence region" on a target base sequence and has a base sequence at the 3'end that gives a starting point for synthesis, and at the same time, uses this primer as the starting point. An oligonucleotide having a base sequence complementary to an arbitrary region at the 5'end. Here, a primer containing the "base sequence selected from F2" and the "base sequence selected from F1c" was selected from the forward inner primer (FIP), and the "base sequence selected from B2" and "base sequence selected from B1c" were selected. A primer containing a "base sequence" is called a backward inner primer (BIP). On the other hand, the outer primer is an oligo having a base sequence that recognizes "a specific nucleotide sequence region existing on the 3'terminal side of" a specific nucleotide sequence region "" on the target base sequence and gives a synthesis starting point. It is a nucleotide. Here, a primer containing a "base sequence selected from F3" is called a forward outer primer (F3), and a primer containing a "base sequence selected from B3" is called a backward outer primer (B3). Here, "forward (F)" in each primer is a primer display that complementarily binds to the sense strand of the target base sequence and provides a starting point for synthesis, while "back (B)" is a target. It is a primer display that binds complementarily to the antisense strand of the base sequence and provides a starting point for synthesis.
フォワードインナープライマー（A）は、5’側から配列番号1で示される塩基配列（F1c）、リンカー配列、配列番号2で示される塩基配列（F2）が順に配置されてなる塩基配列（塩基配列A）を含む。塩基配列Aは、配列番号1で示される塩基配列、リンカー配列、及び配列番号2で示される塩基配列からなり、これらが5’側からこの順で並んで配置されてなる塩基配列である。 The forward inner primer (A) is a base sequence (base sequence A) in which the base sequence (F1c) shown by SEQ ID NO: 1, the linker sequence, and the base sequence (F2) shown by SEQ ID NO: 2 are arranged in this order from the 5'side. )including. The base sequence A consists of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1, the linker sequence, and the base sequence shown by SEQ ID NO: 2, and is a base sequence in which these are arranged in this order from the 5'side.
リンカー配列としては、LAMP法において使用されるFIPにおけるリンカー配列として使用し得る塩基配列である限り、特に制限されない。リンカー配列の塩基数は、例えば1〜50、好ましくは2〜20、より好ましくは2〜10、さらに好ましくは3〜6、よりさらに好ましくは4である。リンカー配列を構成する塩基は、特に制限されない。塩基には、RNA、DNA等の天然核酸中の典型的な塩基（アデニン（A）、チミン（T）、ウラシル（U）、グアニン（G）、シトシン（C）等）のみならず、これ以外の塩基、例えばヒポキサンチン（I）、修飾塩基等も包含される。修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、3-メチルウラシル、ジヒドロウラシル、5-アルキルシトシン（例えば、5-メチルシトシン）、5-アルキルウラシル（例えば、5-エチルウラシル）、5-ハロウラシル（5-ブロモウラシル）、6-アザピリミジン、6-アルキルピリミジン（6-メチルウラシル）、2-チオウラシル、4-チオウラシル、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5’-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、1-メチルアデニン、1-メチルヒポキサンチン、2，2-ジメチルグアニン、3-メチルシトシン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メチルカルボニルメチルウラシル、5-メチルオキシウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、2-チオシトシン、プリン、2，6-ジアミノプリン、2-アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン等が挙げられる。リンカー配列を構成する塩基は、好ましくはピリミジン塩基であり、より好ましくはチミンである。リンカー配列を構成する塩基中の、ピリミジン塩基（好ましくはチミン塩基）の割合は、例えば50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、特に好ましくは100％である。 The linker sequence is not particularly limited as long as it is a base sequence that can be used as a linker sequence in FIP used in the LAMP method. The number of bases in the linker sequence is, for example, 1 to 50, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10, still more preferably 3 to 6, and even more preferably 4. The bases constituting the linker sequence are not particularly limited. Bases include not only typical bases in natural nucleic acids such as RNA and DNA (adenine (A), thymine (T), uracil (U), guanine (G), cytosine (C), etc.), but also other bases. Bases such as hypoxanthine (I), modified bases and the like are also included. Modified bases include, for example, pseudouracil, 3-methyluracil, dihydrouracil, 5-alkylcytocin (eg, 5-methylcitosin), 5-alkyluracil (eg, 5-ethyluracil), 5-halouracil (5-halouracil). Bromouracil), 6-azapyrimidine, 6-alkylpyrimidine (6-methyluracil), 2-thiouracil, 4-thiouracil, 4-acetylcitosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5'-carboxymethylaminomethyl- 2-thiouracil, 5-carboxymethylaminomethyluracil, 1-methyladenine, 1-methylhypoxanthin, 2,2-dimethylguanine, 3-methylcytosine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, N6-methyladenine, 7-Methylguanine, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, 5-methylaminomethyluracil, 5-methylcarbonylmethyluracil, 5-methyloxyuracil, 5-methyl-2-thiouracil, 2-methylthio-N6-iso Examples thereof include pentenyl adenine, uracil-5-oxyacetic acid, 2-thiocitosine, purine, 2,6-diaminopurine, 2-aminopurine, isoguanine, indol, imidazole, xanthin and the like. The base constituting the linker sequence is preferably a pyrimidine base, more preferably thymine. The proportion of pyrimidine bases (preferably thymine bases) in the bases constituting the linker sequence is, for example, 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and particularly preferably 100. %.
塩基配列Aは、好ましくは、配列番号3で示される塩基配列である。 The base sequence A is preferably the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
フォワードインナープライマー（A）は、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、塩基配列A以外の他の配列（塩基配列A1）を含むことができる。塩基配列A1を含む場合は、塩基配列A1は、塩基配列Aの5’末端側及び3’末端側のいずれか一方にのみ付加されていてもよいし、5’末端側及び3’末端側の両方に付加されていてもよい。塩基配列A1の総塩基数は、例えば0〜5、好ましくは0〜3、より好ましくは0〜2、さらに好ましくは0〜1、特に好ましくは0（すなわち、フォワードインナープライマー（A）が塩基配列Aからなる）である。 The forward inner primer (A) can contain a sequence other than the base sequence A (base sequence A1) as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably under stringent conditions. .. When the base sequence A1 is contained, the base sequence A1 may be added only to either the 5'end side or the 3'end side of the base sequence A, or the 5'end side and the 3'end side. It may be added to both. The total number of bases of the base sequence A1 is, for example, 0 to 5, preferably 0 to 3, more preferably 0 to 2, still more preferably 0 to 1, particularly preferably 0 (that is, the forward inner primer (A) is the base sequence. (Consists of A).
なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような塩濃度及び／又は温度条件のことをいい、例えばKCl、MgSO4及び／又は(NH4)2SO4をそれぞれ5〜15mM含む増幅反応液を55〜70℃でインキュベートするという条件であってもよい。 In the present specification, the “stringent condition” refers to a salt concentration and / or temperature condition in which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur, for example, KCl. , DDL 4 and / or (NH4) 2 SO 4 may be incubated at 55-70 ° C. with an amplified reaction solution containing 5-15 mM each.
フォワードインナープライマー（A）は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The forward inner primer (A) may be used alone or in combination of two or more.
バックワードインナープライマー（B）は、5’側から配列番号4で示される塩基配列（B1c）、リンカー配列、配列番号5で示される塩基配列（B2）が順に配置されてなる塩基配列（塩基配列B）を含む。塩基配列Bは、配列番号4で示される塩基配列、リンカー配列、及び配列番号5で示される塩基配列からなり、これらが5’側からこの順で並んで配置されてなる塩基配列である。 The backward inner primer (B) is a base sequence (base sequence) in which the base sequence (B1c) shown in SEQ ID NO: 4, the linker sequence, and the base sequence (B2) shown in SEQ ID NO: 5 are arranged in this order from the 5'side. B) is included. The base sequence B consists of the base sequence shown by SEQ ID NO: 4, the linker sequence, and the base sequence shown by SEQ ID NO: 5, and is a base sequence in which these are arranged in this order from the 5'side.
リンカー配列については、フォワードインナープライマー（A）におけるリンカー配列と同様である。 The linker sequence is the same as the linker sequence in the forward inner primer (A).
塩基配列Bは、好ましくは、配列番号6で示される塩基配列である。 The base sequence B is preferably the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
バックワードインナープライマー（B）は、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、塩基配列B以外の他の配列（塩基配列B1）を含むことができる。塩基配列B1を含む場合は、塩基配列B1は、塩基配列Bの5’末端側及び3’末端側のいずれか一方にのみ付加されていてもよいし、5’末端側及び3’末端側の両方に付加されていてもよい。塩基配列B1の総塩基数は、例えば0〜5、好ましくは0〜3、より好ましくは0〜2、さらに好ましくは0〜1、特に好ましくは0（すなわち、バックワードインナープライマー（B）が塩基配列Bからなる）である。 The backward inner primer (B) may contain a sequence other than the base sequence B (base sequence B1) as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably under stringent conditions. it can. When the base sequence B1 is included, the base sequence B1 may be added only to either the 5'end side or the 3'end side of the base sequence B, or the 5'end side and the 3'end side. It may be added to both. The total number of bases in the base sequence B1 is, for example, 0 to 5, preferably 0 to 3, more preferably 0 to 2, still more preferably 0 to 1, particularly preferably 0 (that is, the backward inner primer (B) is a base. It consists of sequence B).
バックワードインナープライマー（B）は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The backward inner primer (B) may be used alone or in combination of two or more.
フォワードアウタープライマー（C）は、配列番号7で示される塩基配列（塩基配列C）を含む。 The forward outer primer (C) contains the base sequence (base sequence C) shown in SEQ ID NO: 7.
フォワードアウタープライマー（C）は、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、塩基配列C以外の他の配列（塩基配列C1）を含むことができる。塩基配列C1を含む場合は、塩基配列C1は、塩基配列Cの5’末端側及び3’末端側のいずれか一方にのみ付加されていてもよいし、5’末端側及び3’末端側の両方に付加されていてもよい。塩基配列C1の総塩基数は、例えば0〜5、好ましくは0〜3、より好ましくは0〜2、さらに好ましくは0〜1、特に好ましくは0（すなわち、フォワードアウタープライマー（C）が塩基配列Cからなる）である。 The forward outer primer (C) can contain a sequence other than the base sequence C (base sequence C1) as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably under stringent conditions. .. When the base sequence C1 is included, the base sequence C1 may be added only to either the 5'end side or the 3'end side of the base sequence C, or the 5'end side and the 3'end side. It may be added to both. The total number of bases of the base sequence C1 is, for example, 0 to 5, preferably 0 to 3, more preferably 0 to 2, still more preferably 0 to 1, particularly preferably 0 (that is, the forward outer primer (C) is the base sequence. (Consists of C).
フォワードアウタープライマー（C）は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The forward outer primer (C) may be used alone or in combination of two or more.
バックワードアウタープライマー（D）は、配列番号8で示される塩基配列（塩基配列D）を含む。 The backward outer primer (D) contains the base sequence (base sequence D) shown in SEQ ID NO: 8.
バックワードアウタープライマー（D）は、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、塩基配列D以外の他の配列（塩基配列D1）を含むことができる。塩基配列D1を含む場合は、塩基配列D1は、塩基配列Dの5’末端側及び3’末端側のいずれか一方にのみ付加されていてもよいし、5’末端側及び3’末端側の両方に付加されていてもよい。塩基配列D1の総塩基数は、例えば0〜5、好ましくは0〜3、より好ましくは0〜2、さらに好ましくは0〜1、特に好ましくは0（すなわち、バックワードアウタープライマー（D）が塩基配列Dからなる）である。 The backward outer primer (D) may contain a sequence other than the base sequence D (base sequence D1) as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably under stringent conditions. it can. When the base sequence D1 is included, the base sequence D1 may be added only to either the 5'end side or the 3'end side of the base sequence D, or the 5'end side and the 3'end side. It may be added to both. The total number of bases in the base sequence D1 is, for example, 0 to 5, preferably 0 to 3, more preferably 0 to 2, still more preferably 0 to 1, particularly preferably 0 (that is, the backward outer primer (D) is a base. (Consists of sequence D).
バックワードアウタープライマー（D）は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The backward outer primer (D) may be used alone or in combination of two or more.
本発明のプライマーセットは、さらにフォワードループプライマー及びバックワードループプライマーを含むことが好ましい。フォワードループプライマー及びバックワードループプライマーは、ダンベル構造の5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる。ループプライマーの塩基配列は上述のダンベル構造の5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列又はその相補鎖から選ばれても良く、他の塩基配列でも良い。 The primer set of the present invention preferably further contains a forward loop primer and a backward loop primer. The forward loop primer and the backward loop primer are primers having a base sequence complementary to the base sequence of the single-stranded portion of the loop structure on the 5'end side of the dumbbell structure. When this primer is used, the starting point of nucleic acid synthesis is increased, the reaction time can be shortened, and the detection sensitivity can be increased. As long as the base sequence of the loop primer is complementary to the base sequence of the single-stranded portion of the loop structure on the 5'end side of the above-mentioned dumbbell structure, it may be selected from the base sequence of the target gene or its complementary strand. It may be the base sequence of.
フォワードループプライマーとしては、（E）配列番号9で示される塩基配列を含むフォワードループプライマーが特に好ましい。 As the forward loop primer, a forward loop primer containing the nucleotide sequence shown in (E) SEQ ID NO: 9 is particularly preferable.
フォワードループプライマー（E）は、配列番号9で示される塩基配列（塩基配列E）を含む。 The forward loop primer (E) contains the base sequence (base sequence E) shown in SEQ ID NO: 9.
フォワードループプライマー（E）は、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、塩基配列E以外の他の配列（塩基配列E1）を含むことができる。塩基配列E1を含む場合は、塩基配列E1は、塩基配列Eの5’末端側及び3’末端側のいずれか一方にのみ付加されていてもよいし、5’末端側及び3’末端側の両方に付加されていてもよい。塩基配列E1の総塩基数は、例えば0〜5、好ましくは0〜3、より好ましくは0〜2、さらに好ましくは0〜1、特に好ましくは0（すなわち、フォワードループプライマー（E）が塩基配列Eからなる）である。 The forward loop primer (E) can contain a sequence other than the base sequence E (base sequence E1) as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably under stringent conditions. .. When the base sequence E1 is included, the base sequence E1 may be added only to either the 5'end side or the 3'end side of the base sequence E, or the 5'end side and the 3'end side. It may be added to both. The total number of bases of the base sequence E1 is, for example, 0 to 5, preferably 0 to 3, more preferably 0 to 2, still more preferably 0 to 1, particularly preferably 0 (that is, the forward loop primer (E) is the base sequence. It consists of E).
フォワードループプライマー（E）は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The forward loop primer (E) may be used alone or in combination of two or more.
バックワードループプライマーとしては、（F）配列番号10で示される塩基配列を含むバックワードループプライマーが特に好ましい。 As the backward loop primer, a backward loop primer containing the nucleotide sequence shown in (F) SEQ ID NO: 10 is particularly preferable.
バックワードループプライマー（F）は、配列番号10で示される塩基配列（塩基配列F）を含む。 The backward loop primer (F) contains the base sequence (base sequence F) shown in SEQ ID NO: 10.
バックワードループプライマー（F）は、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な限りにおいて、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、塩基配列F以外の他の配列（塩基配列F1）を含むことができる。塩基配列F1を含む場合は、塩基配列F1は、塩基配列Fの5’末端側及び3’末端側のいずれか一方にのみ付加されていてもよいし、5’末端側及び3’末端側の両方に付加されていてもよい。塩基配列F1の総塩基数は、例えば0〜5、好ましくは0〜3、より好ましくは0〜2、さらに好ましくは0〜1、特に好ましくは0（すなわち、バックワードループプライマー（F）が塩基配列Fからなる）である。 The backward loop primer (F) contains a sequence other than the base sequence F (base sequence F1) as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably as long as it can hybridize under stringent conditions. be able to. When the base sequence F1 is included, the base sequence F1 may be added only to either the 5'end side or the 3'end side of the base sequence F, or the 5'end side and the 3'end side. It may be added to both. The total number of bases in the base sequence F1 is, for example, 0 to 5, preferably 0 to 3, more preferably 0 to 2, still more preferably 0 to 1, particularly preferably 0 (that is, the backward loop primer (F) is a base. It consists of the sequence F).
バックワードループプライマー（F）は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The backward loop primer (F) may be used alone or in combination of two or more.
本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーを構成するポリヌクレオチドは、通常DNAであるが、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な限りにおいて、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、公知の化学修飾が施されていてもよい。各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。 The polynucleotide constituting each primer contained in the primer set of the present invention is usually DNA, but is known as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably as long as it can hybridize under stringent conditions. May be chemically modified. The phosphate residue (phosphate) of each nucleotide can be replaced with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, or phosphorodithionate. In addition, the hydroxyl group at the 2-position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is changed to -OR (R is, for example, CH3 (2'-O-Me), CH2CH2OCH3 (2'-O-MOE), CH2CH2NHC (NH) NH2, It may be replaced with CH2CONHCH3, CH2CH2CN, etc.). Further, the base moiety (pyrimidine, purine) may be chemically modified, for example, introduction of a methyl group or a cationic functional group at the 5-position of the pyrimidine base, or substitution of the carbonyl group at the 2-position with thiocarbonyl. Can be mentioned. Further, examples thereof include those in which the phosphoric acid moiety and the hydroxyl moiety are modified with a biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group and the like, but the present invention is not limited thereto. Further, BNA (LNA) or the like in which the formation of the sugar portion is fixed to N type by cross-linking the 2'oxygen and 4'carbon of the sugar part of the nucleotide can also be preferably used.
本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーにおいては、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な限りにおいて、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、少なくとも1つのヌクレオチドが標識されていてもよい。ポリヌクレオチドは、公知の方法に従って、例えば標識物質を用いて標識することができる。 Each primer contained in the primer set of the present invention may be labeled with at least one nucleotide as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably under stringent conditions. .. The polynucleotide can be labeled according to known methods, for example with a labeling substance.
標識物質は、核酸の標識物質として公知のものであれば特に限定されない。標識物質としては、例えば蛍光標識が挙げられる。蛍光標識としては、後述の融解温度解析に適しているという観点から、例えば、蛍光標識されたポリヌクレオチドが1本鎖の場合は蛍光を発し、2本鎖の場合は蛍光が減少（例えば消光）するようなものが好ましい。蛍光標識としては、例えばフルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられ、市販の蛍光標識としては、例えばBODIPY FL（商標名、モレキュラー核酸プローブ社製）、FluorePrime（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Fluoredite（商品名、ミリポア社製）、FAM（ABI社製）、Cy3およびCy5（アマシャムファルマシア社製）、TAMRA(モレキュラー核酸プローブ社製)等が挙げられる。 The labeling substance is not particularly limited as long as it is known as a labeling substance for nucleic acids. Examples of the labeling substance include fluorescent labels. As the fluorescent label, from the viewpoint of being suitable for the melting temperature analysis described later, for example, when the fluorescently labeled polynucleotide is single-stranded, it emits fluorescence, and when it is double-stranded, the fluorescence is reduced (for example, quenching). It is preferable to do something like this. Examples of the fluorescent label include fluorescein, phosphor, rhodamine, and polymethine dye derivative. Examples of commercially available fluorescent labels include BODIPY FL (trade name, manufactured by Molecular Nucleic Probe Co., Ltd.) and FluorePrime (trade name, Amersham Pharmacia). Fluoredite (trade name, manufactured by Millipore), FAM (manufactured by ABI), Cy3 and Cy5 (manufactured by Amersham Pharmacia), TAMRA (manufactured by Molecular Nucleic Probe) and the like.
標識部位は、核酸の標識部位として公知のものであれば特に限定されない。標識部位は、例えば3’末端及び／又は5’末端のヌクレオチドであることができる。 The labeling site is not particularly limited as long as it is known as a nucleic acid labeling site. Labeling sites can be, for example, 3'end and / or 5'end nucleotides.
LAMP反応の核酸増幅産物の検出の一態様としては、蛍光標識プローブを用いる方法が挙げられる。例えば、蛍光消光プローブ（Quenching Probe：Qprobe（登録商標））と称される3'末端または5'末端に蛍光標識されたプローブは、標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素がその発光を減少させることで、増幅産物を検出又は定量することができる（特開2001-286300号公報）。また末端部分において、ハイブリダイゼーションの塩基対がG（グアニン）とC（シトシン）のペアを形成するように設計されることを特徴としている。ここで使用される蛍光標識としては、例えば、BODIPY-FL、カルボキシローダミン6G（CR6G）、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、Pacific Blue、フルオレセイン-4-イソチオシアネート（FITC）等が挙げられる。 One embodiment of the detection of the nucleic acid amplification product of the LAMP reaction includes a method using a fluorescently labeled probe. For example, a probe labeled fluorescently at the 3'end or 5'end, called a Quenching Probe (Qprobe®), has a fluorescent dye that reduces its luminescence when hybridized to the target nucleic acid. Therefore, the amplification product can be detected or quantified (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-286300). It is also characterized in that the base pair of hybridization is designed to form a pair of G (guanine) and C (cytosine) at the terminal portion. Examples of the fluorescent label used here include BODIPY-FL, carboxyrhodamine 6G (CR6G), carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), Pacific Blue, fluorescein-4-isothiocyanate (FITC) and the like.
本発明のプライマーセットの形態は特に制限されない。本発明のプライマーセットは、例えば、各プライマーが1つの容器に収容されてなる形態（例えば組成物）の形態、各プライマーが複数の容器に分かれて収容されてなる形態（例えばキット）の形態、又は担体に担持されてなる形態である。容器の種類としては、化合物ライブラリに使用されるものであれば特に制限されず、例えばマルチウェルプレート、マイクロチューブ等が挙げられる。担体としては、プライマーを保持できるものであれば特に制限されず、例えばセルロース繊維等の繊維質の担体（例えば紙、ろ紙）等が挙げられる。また、各プライマーは、乾燥状態であっても、（溶液中に）溶解状態であってもよい。また、本発明のプライマーセットには、緩衝剤などの他の成分が含まれていてもよい。 The form of the primer set of the present invention is not particularly limited. The primer set of the present invention is, for example, a form in which each primer is contained in one container (for example, a composition), a form in which each primer is divided into a plurality of containers (for example, a kit), and the like. Alternatively, it is in the form of being supported on a carrier. The type of container is not particularly limited as long as it is used for a compound library, and examples thereof include a multi-well plate and a microtube. The carrier is not particularly limited as long as it can retain a primer, and examples thereof include a fibrous carrier such as cellulose fiber (for example, paper or filter paper). Also, each primer may be in a dry state or in a dissolved state (in solution). In addition, the primer set of the present invention may contain other components such as a buffer.
本発明のプライマーセットは、公知の核酸合成方法に従って又は準じて、製造することができる。 The primer set of the present invention can be produced according to or according to a known nucleic acid synthesis method.
2．LAMP法反応用組成物
本発明は、その一態様において、本発明のプライマーセットを含有する、LAMP法反応用組成物（本明細書において、「本発明のLAMP法反応用組成物」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
2. Composition for LAMP method reaction In one aspect of the present invention, the composition for LAMP method reaction containing the primer set of the present invention (in the present specification, it is referred to as "the composition for LAMP method reaction of the present invention". There is also.). This will be described below.
本発明のLAMP法反応用組成物は、本発明のプライマーセットを含有し、且つLAMP法反応液に含まれ得るに成分を少なくとも1種含むものである限り、特に制限されない。 The composition for the LAMP method reaction of the present invention is not particularly limited as long as it contains the primer set of the present invention and contains at least one component that can be contained in the LAMP method reaction solution.
LAMP法反応液に含まれ得るに成分としては、例えば核酸合成酵素、逆転写酵素、dNTPs、RNaseインヒビター、核酸検出試薬（指示薬）、安定化剤、緩衝剤、イオン又は溶液中で該イオンを遊離する化合物、界面活性剤、被検サンプル、溶媒（水等）等が挙げられる。 The components that can be contained in the LAMP reaction solution include, for example, nucleic acid synthase, reverse transcriptase, dNTPs, RNase inhibitor, nucleic acid detection reagent (indicator), stabilizer, buffer, ion or release of the ion in solution. Examples include compounds, surfactants, test samples, solvents (water, etc.) and the like.
核酸合成酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えばBst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、Csa DNAポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはBst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。 The nucleic acid synthase is not particularly limited as long as it is a template-dependent nucleic acid synthase having a strand substitution activity. Examples of such an enzyme include Bst DNA polymerase (large fragment), Bca (exo-) DNA polymerase, Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I, Csa DNA polymerase and the like, and Bst DNA polymerase (large fragment) is preferable. Can be mentioned.
逆転写酵素としては、RNAを鋳型としてDNAを合成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えばAMV、Cloned AMV、MMLV、Recombinant HIVの逆転写酵素、SuperscriptII/III/IV、ReverTraAce、Thermoscript、Ominiscript、Sensiscript等が挙げられ、好ましくは、AMV又はCloned AMV逆転写酵素が挙げられる。またBca DNAポリメラーゼのように、逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素を用いると、RT-LAMP反応を1つの酵素で行うことができる。 The reverse transcriptase is not particularly limited as long as it has an activity of synthesizing DNA using RNA as a template. Examples of such an enzyme include AMV, Cloned AMV, MMLV, Recombinant HIV reverse transcriptase, SuperscriptII / III / IV, ReverTraAce, Thermoscript, Ominiscript, Sensiscript and the like, and preferably AMV or Cloned AMV reverse transcriptase. Can be mentioned. In addition, if an enzyme having both reverse transcriptase activity and DNA polymerase activity, such as Bca DNA polymerase, is used, the RT-LAMP reaction can be carried out with one enzyme.
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウイルスや細菌等から精製されたものでも良く、遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換等の改変をされたものでもよい。 The enzyme or reverse transcriptase used in nucleic acid synthesis may be purified from a virus, a bacterium, or the like, or may be produced by a gene recombination technique. Further, these enzymes may be modified such as fragmentation and amino acid substitution.
核酸検出試薬としては、LAMP反応後の核酸増幅産物の検出に使用できるものである限り特に制限されず、公知の試薬を採用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター（特開2001-242169号公報）を用いたり、また、LAMP法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなる。このため、マグネシウム指示薬（マグネシウム濃度により発色が変化する指示薬）を、核酸検出試薬として使用することができる。 The nucleic acid detection reagent is not particularly limited as long as it can be used for detecting a nucleic acid amplification product after a LAMP reaction, and a known reagent can be used. For example, labeled oligonucleotides and fluorescent intercalators (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-242169) that specifically recognize the amplified base sequence are used, and in the LAMP method, a large amount of substrate is consumed by nucleic acid synthesis. By-product pyrophosphate reacts with coexisting magnesium to form magnesium pyrophosphate. Therefore, a magnesium indicator (an indicator whose color development changes depending on the magnesium concentration) can be used as a nucleic acid detection reagent.
安定化剤は、酵素や核酸等の安定化に寄与するものである限り、特に制限されない。本発明では、トレハロースを使用することにより、乾燥状態の本発明のLAMP法反応用組成物を使用してLAMP法による核酸増幅を行う、乾燥RT-LAMPシステムが可能であることを見出した。この観点から、安定化剤として、トレハロースを使用することが特に好ましい。また、本発明の好ましい一態様において、本発明のLAMP法反応用組成物は、本発明のプライマーセット、及びトレハロースを含有する、乾燥形態のLAMP法反応用組成物、である。 The stabilizer is not particularly limited as long as it contributes to the stabilization of enzymes, nucleic acids and the like. In the present invention, it has been found that by using trehalose, a dry RT-LAMP system capable of amplifying nucleic acid by the LAMP method using the composition for the reaction of the LAMP method of the present invention in a dry state is possible. From this point of view, it is particularly preferable to use trehalose as a stabilizer. Further, in a preferred embodiment of the present invention, the LAMP method reaction composition of the present invention is a dry form of the LAMP method reaction composition containing the primer set of the present invention and trehalose.
緩衝剤は、特に制限されず、例えばTris緩衝剤等を使用することができる。 The buffer is not particularly limited, and for example, a Tris buffer can be used.
イオンとしては、プライマーのアニーリングの安定性の調整に使用し得るイオンや、核酸合成酵素等の酵素の補因子として機能するイオン等が使用される。前者のイオンとしては、例えばカリウムイオン、マグネシウムイオン等が挙げられる。後者のイオンと しては、例えばマグネシウムイオン等が挙げられる。 As the ion, an ion that can be used for adjusting the annealing stability of the primer, an ion that functions as a cofactor of an enzyme such as a nucleic acid synthase, and the like are used. Examples of the former ion include potassium ion and magnesium ion. Examples of the latter ion include magnesium ion and the like.
被検サンプルとしては、チクングニアウイルス感染が疑われるヒト又は他の動物の生体由来のサンプル、例えば喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、精液および羊水等の体液、糞便、組織等が挙げられる。また、感染実験等に用いられた細胞やその培養液、あるいは生体由来の検体や培養細胞等から分離したウイルスを含む検体等も被検サンプルとなりうる。これらの被検サンプルは分離、抽出、濃縮、精製等の前処理を経て得られたものであってもよい。 Samples to be tested include living body-derived samples of humans or other animals suspected of having Chikungunia virus infection, such as sputum, bronchoalveolar lavage fluid, nasal discharge, nasal aspirate, nasal lavage fluid, nasal swab, pharyngeal swab, and mouthwash. , Saliva, blood, serum, plasma, nasal cavity, urine, semen, body fluids such as amniotic fluid, feces, tissues and the like. In addition, cells used in infection experiments and their culture solutions, or samples containing viruses isolated from living body-derived samples and cultured cells can also be test samples. These test samples may be obtained through pretreatment such as separation, extraction, concentration, and purification.
上記成分は、終濃度（LAMP法の反応を開始する際のLAMP法反応液における濃度）が、LAMP法の反応が適切に行われる濃度となるように、本発明のLAMP法反応用組成物に添加される。特に、トレハロースの終濃度は、感度、特異性等の観点から、好ましくは0.1〜0.3M、より好ましくは0.15〜0.25M、特に好ましくは0.18〜0.22Mである。また、マグネシウムイオンの終濃度は、感度、特異性等の観点から、好ましくは3〜12mM、より好ましくは5〜9mM、さらに好ましくは6〜8mM、特に好ましくは6.5〜7.5mMである。 The above components are added to the composition for LAMP method reaction of the present invention so that the final concentration (concentration in the LAMP method reaction solution at the start of the reaction of the LAMP method) is the concentration at which the reaction of the LAMP method is appropriately carried out. Is added. In particular, the final concentration of trehalose is preferably 0.1 to 0.3 M, more preferably 0.15 to 0.25 M, and particularly preferably 0.18 to 0.22 M from the viewpoint of sensitivity, specificity and the like. The final concentration of magnesium ions is preferably 3 to 12 mM, more preferably 5 to 9 mM, still more preferably 6 to 8 mM, and particularly preferably 6.5 to 7.5 mM from the viewpoint of sensitivity, specificity and the like.
フォワードインナープライマー（A）及びバックワードインナープライマー（B）のそれぞれの終濃度は、好ましくは0.8〜3.2μM、より好ましくは1.2〜2.0μM、さらに好ましくは1.4〜1.8μMである。 The final concentrations of the forward inner primer (A) and the backward inner primer (B) are preferably 0.8 to 3.2 μM, more preferably 1.2 to 2.0 μM, and even more preferably 1.4 to 1.8 μM.
フォワードアウタープライマー（C）及びバックワードアウタープライマー（D）のそれぞれの終濃度は、好ましくは0.1〜0.4μM、より好ましくは0.15〜0.3μM、さらに好ましくは0.18〜0.25μMである。 The final concentrations of the forward outer primer (C) and the backward outer primer (D) are preferably 0.1 to 0.4 μM, more preferably 0.15 to 0.3 μM, and even more preferably 0.18 to 0.25 μM.
ループプライマーを含む場合、フォワードループプライマー及びバックワードループプライマーのそれぞれの終濃度は、好ましくは0.2〜0.8μM、より好ましくは0.3〜0.6μM、さらに好ましくは0.35〜0.5μMである。 When the loop primer is included, the final concentration of each of the forward loop primer and the backward loop primer is preferably 0.2 to 0.8 μM, more preferably 0.3 to 0.6 μM, and further preferably 0.35 to 0.5 μM.
本発明のLAMP法反応用組成物は、乾燥状態であってもよいし、溶液状態であってもよい。保存安定性に優れるという観点から、乾燥状態が好ましい。乾燥状態の場合、好ましくは、常温で保存可能である。 The composition for the LAMP method reaction of the present invention may be in a dry state or in a solution state. A dry state is preferable from the viewpoint of excellent storage stability. In the dry state, it can be preferably stored at room temperature.
本発明の一態様において、本発明のLAMP法反応用組成物は、互いに混合されない状態で存在する、2つの乾燥物（乾燥物1及び乾燥物2）を含むことが好ましい。乾燥物1は、好ましくは核酸合成酵素、逆転写酵素、dNTPs、及びトレハロースを含有する。乾燥物2は、好ましくは本発明のプライマーセット、及びトレハロースを含有する。トレハロースは、終濃度が上記した範囲になるように、乾燥物1と乾燥物2に、分けて添加される。乾燥物1と乾燥物2とにおけるトレハロースの含有比は、それぞれに含まれる成分の量、種類等に応じて適宜調節することができる。本発明の好ましい一態様においては、乾燥物2中のトレハロース含有量に対する乾燥物1中のトレハロース含有量（乾燥物1中のトレハロース含有量／乾燥物2中のトレハロース含有量）は、好ましくは1〜3.5、より好ましくは1.3〜2.5、さらに好ましくは1.5〜2である。乾燥物1及び乾燥物2は、例えば容器の別々の場所（例えば一方はチューブの蓋の裏側、他方はチューブの底）に付着させておくことができる。
In one aspect of the present invention, the LAMP method reaction composition of the present invention preferably contains two dried products (dried
本発明のLAMP法反応用組成物は、そのまま、或いは必要に応じて他の成分を添加して、LAMP法反応液として使用される。 The composition for LAMP method reaction of the present invention is used as it is or by adding other components as needed as a reaction solution for LAMP method.
3．チクングニア熱の検査キット
本発明は、その一態様において、本発明のプライマーセット、又は本発明の反応用組成物を含む、チクングニア熱の検査キット（本明細書において、「本発明の検査キット」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
3. 3. Chikungunya fever test kit In one aspect of the present invention, the chikungunya fever test kit (in the present specification, "test kit of the present invention") containing the primer set of the present invention or the reaction composition of the present invention. It may be shown.) This will be described below.
本発明の検査キットは、本発明のプライマーセット、又は本発明の反応用組成物に加えて、必要に応じて、LAMP法反応液に含まれ得る成分、LAMP法の実行に使用され得る器具等を含むことができる。 In addition to the primer set of the present invention or the reaction composition of the present invention, the test kit of the present invention includes components that can be contained in the reaction solution of the LAMP method, instruments that can be used to carry out the LAMP method, and the like, if necessary. Can be included.
LAMP法反応液に含まれ得る成分については、上記「2．LAMP法反応用組成物」における説明の通りである。 The components that can be contained in the LAMP method reaction solution are as described in "2. Composition for LAMP method reaction" above.
LAMP法の実行に使用され得る器具としては、例えば被検サンプルの採取器具、反応容器等が挙げられる。 Examples of instruments that can be used to carry out the LAMP method include instruments for collecting test samples, reaction vessels, and the like.
本発明のプライマーセット、又は本発明の反応用組成物に、必要に応じて他の成分を添加して、LAMP法反応液として使用し、チクングニア熱を検査することができる。 If necessary, other components can be added to the primer set of the present invention or the reaction composition of the present invention and used as a reaction solution of the LAMP method to test Chikungunya heat.
4．チクングニア熱の検査方法
本発明は、その一態様において、本発明のプライマーセット、又は本発明の反応用組成物を用いて、チクングニアウイルスの標的核酸領域の増幅の有無をLAMP法により検出することを含む、チクングニア熱の検査方法（本明細書において、「本発明の検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
Four. Chikungunya fever test method In one aspect of the present invention, the presence or absence of amplification of the target nucleic acid region of chikungunya virus is detected by the LAMP method using the primer set of the present invention or the reaction composition of the present invention. The present invention relates to a method for inspecting Chikungunya fever, which includes, and may be referred to as "inspection method for the present invention" in the present specification. This will be described below.
本発明のプライマーセット、又は本発明の反応用組成物に、必要に応じて他の成分を添加して、LAMP法反応液として使用する。 If necessary, other components are added to the primer set of the present invention or the reaction composition of the present invention, and the reaction solution is used as a LAMP reaction solution.
LAMP法反応温度は、感度、特異性等の観点から、好ましくは57〜61℃、より好ましくは58〜60℃、特に好ましくは58.5〜59.5℃である。 The reaction temperature of the LAMP method is preferably 57 to 61 ° C, more preferably 58 to 60 ° C, and particularly preferably 58.5 to 59.5 ° C from the viewpoint of sensitivity, specificity and the like.
LAMP法反応時間は、チクングニアウイルスの標的核酸領域の増幅が起こる限りにおいて特に制限されず、例えば1〜180分間、好ましくは5〜120分間、より好ましくは10〜90分間、さらに好ましくは15〜70分間である。 The LAMP reaction time is not particularly limited as long as amplification of the target nucleic acid region of the chikungunya virus occurs, for example, 1 to 180 minutes, preferably 5 to 120 minutes, more preferably 10 to 90 minutes, still more preferably 15 to 70 minutes. Minutes.
LAMP法反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。反応液に核酸検出試薬が含まれている場合は、そのシグナルを検出することにより、増幅産物を検出することができる。また、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけたりしても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、LAMP増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。また、LAMP法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。従って、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば400nmの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することで、核酸増幅反応を検出することも可能である。 Known techniques can be applied to the detection of nucleic acid amplification products after the LAMP reaction. When the reaction solution contains a nucleic acid detection reagent, the amplification product can be detected by detecting the signal. In addition, the reaction solution after completion of the reaction can be easily detected by subjecting it to agarose gel electrophoresis as it is. In agarose gel electrophoresis, a large number of bands with different base lengths are detected in a ladder shape in the LAMP amplification product. Further, in the LAMP method, a large amount of substrate is consumed by the synthesis of nucleic acid, and pyrophosphoric acid, which is a by-product, reacts with coexisting magnesium to become magnesium pyrophosphate, and the reaction solution becomes cloudy to the extent that it can be visually confirmed. Therefore, the nucleic acid amplification reaction is carried out by confirming this white turbidity with a measuring device capable of optically observing the increase in turbidity after the reaction or during the reaction, for example, the change in absorbance at 400 nm using a normal spectrophotometer. It is also possible to detect.
チクングニアウイルスの標的核酸領域の増幅が認められた場合は、LAMP法に使用した被検サンプルの由来する被検体が、チクングニアウイルスに感染している、チクングニア熱に罹患している、チクングニア熱を発症している、又はチクングニア熱を発症する可能性があると判定することができる。 If amplification of the target nucleic acid region of chikungunya virus is observed, the subject from which the test sample used in the LAMP method is derived is infected with chikungunya virus, suffers from chikungunya fever, or develops chikungunya fever. It can be determined that the virus has or may develop chikungunya fever.
本発明の検査方法の好ましい一態様よれば、RNAの抽出ステップがなく、等温で反応が進むことに加え、結果をサンプルの色の変化で判定できる、電気泳動不要の検査方法を提供することができる。この態様の一部においては、トータルで必要な時間は50分、乾燥RT-LAMP法であっても65分程度であり、また、高価な機器や試薬、熟練した技術、さらに乾燥RT-LAMP法の場合には冷蔵設備も不要である。 According to a preferred embodiment of the inspection method of the present invention, it is possible to provide an electrophoresis-free inspection method in which the reaction proceeds at an isothermal temperature without an RNA extraction step and the result can be judged by a change in the color of the sample. it can. In some of these embodiments, the total time required is about 50 minutes, even with the dry RT-LAMP method, about 65 minutes, and expensive equipment and reagents, skilled techniques, and the dry RT-LAMP method. In the case of, refrigeration equipment is not required.
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
実験方法
特に断りの無い限り、各試験例は以下の方法に従って行った。
Experimental method Unless otherwise specified, each test example was carried out according to the following method.
RT-LAPM システムに用いるプライマーは、チクングニアウイルスのS27-African prototype系統（GenBank accession number AF369024）の遺伝子配列データを用いてenvelope protein 1 (E1) 領域内に設計した。6種類のプライマーの内訳は、２種類のinner primer (FIPおよびBIP)、2種類のouter primer (F3およびB3) および２種類のloop primer (FLPおよびBLP)である。また、FIPとBIPにはTTTT spacerを設けた。プライマー配列の詳細は表１に記載する。 The primers used in the RT-LAPM system were designed within the envelope protein 1 (E1) region using the gene sequence data of the Chikungunya virus S27-African prototype strain (GenBank accession number AF369024). The breakdown of the 6 types of primers is 2 types of inner primers (FIP and BIP), 2 types of outer primers (F3 and B3), and 2 types of loop primers (FLP and BLP). In addition, TTTT spacers were provided for FIP and BIP. Details of the primer sequences are shown in Table 1.
RT-LAMPの反応は、 1チューブにつき総量25μLにて59℃で60分間行った。反応液中の2μLがウイルスサンプルである。試薬の組成は、1μLの25X LAMP buffer (500 mM Tris-HCl [pH 8.8], 250 mM KCl, 25 mM MgSO4)、1.5μLの100mM MgSO4、1.4μLの25mM dNTPs、1μLのBst DNA Polymerase (8 U/μL) 、0.1μLのRNase inhibitor (40 U/μL)、0.03μLのAMV reverse transcriptase (20 U/μL) 、2.5μLの2 Mトレハロース、1μLの40μM FIPとBIP、1μLの5μM F3とB3、1μLの10μM FLPとBLP、1μの指示薬 (3mM hydroxynaphthol blue [HNB; MP Biomedicals], 0.35% v/v GelGreen [10,000X in DMSO])、最後に0.1% TritonX-100を含有するDDWで25μLにした。表２に、添加した試薬の濃度、添加量、及び終濃度をまとめたものを示す。
The reaction of RT-LAMP was carried out at 59 ° C. for 60 minutes in a total volume of 25 μL per tube. 2 μL in the reaction solution is the virus sample. The composition of the reagent was 1 μL of 25 X LAMP buffer (500 mM Tris-HCl [pH 8.8], 250 mM KCl, 25 mM DDL 4 ), 1.5 μL of 100 mM DDL 4 , 1.4 μL of 25 mM dNTPs, 1 μL of Bst DNA Polymerase ( 8 U / μL), 0.1 μL RNase inhibitor (40 U / μL), 0.03 μL AMV reverse transcriptase (20 U / μL), 2.5 μL 2 M trehalose, 1
反応液にはGelGreenとHNBの指示薬が含まれており、2通りの方法でDNAの増幅が起こったことを確認できる。GelGreenは、PCR産物である2本鎖DNAが増幅されると、2本鎖DNA分子の空隙に侵入し可逆反応を起こし（インターカレーション）、波長470 nmの青色光を当てると波長500 nmの黄色の蛍光を発する。RT-LAMPの反応チューブは、青色LEDライトで照射し、オレンジ色フィルターを介して撮影した。一方、HNBは、マグネシウム測定の指示薬であり、PCR反応が進行してチューブ内のマグネシウム濃度が低下すると、紫色から水色に変色する。RT-LAMPの反応チューブは、可視光下で撮影した。 The reaction solution contains Gel Green and HNB indicators, and it can be confirmed that DNA amplification occurred in two ways. When double-stranded DNA, which is a PCR product, is amplified, GelGreen invades the voids of double-stranded DNA molecules and causes a reversible reaction (intercalation). When exposed to blue light with a wavelength of 470 nm, GelGreen has a wavelength of 500 nm. It emits yellow fluorescence. The reaction tube of RT-LAMP was irradiated with a blue LED light and photographed through an orange filter. On the other hand, HNB is an indicator for magnesium measurement, and when the PCR reaction progresses and the magnesium concentration in the tube decreases, the color changes from purple to light blue. The reaction tube of RT-LAMP was photographed under visible light.
乾燥RT-LAMPの反応チューブは、試薬をキャップ、底部の2箇所に分けて乾燥化させた。乾燥RT-LAMPシステムの詳細：1.6μLの2Mトレハロース、1.4μLの25 mM dNTPs、0.05μLの120 U/μL Bst DNA Polymerase、0.25μLの8 U/μL Bst DNA Polymerase、0.1μLの40 U/μL RNase inhibitor、0.04μLの20 U/μL AMV reverse transcriptase、0.5μLのindicatorを混ぜてチューブキャップの中心に付着させた。さらに、0.4μLの100μM FIPとBIP、0.05μLの100μM F3とB3、0.2μLの100μM FLPとBLP、0.9μLの2 Mトレハロース、0.14μLの50% glycerol、0.5μLのindicatorを混ぜてチューブキャップの底に付着させた。その後、これを乾燥化させた。各プライマーの最終濃度は1.6μM (FIP and BIP)、0.2μM (F3 and B3)、 0.4μM (FLP and BLP)である。試薬の乾燥化はclean airを用いて6時間行った。その後、チューブをさらに一晩phosphorus oxide (P2O5)とsilica gelを備えたデシケーターに入れ、真空状態で乾燥させた。ここへ、2 μLのテンプレート（ウイルスサンプル）、1 μLの25X LAMP buffer、1.5 μLの100 mM MgSO4、19.5μL の0.1% TritonX-100 in DDWを加えて、転倒混和し、反応を開始した。 Dry The reaction tube of RT-LAMP was dried by dividing the reagent into two parts, a cap and a bottom. Details of the dry RT-LAMP system: 1.6 μL 2M trehalose, 1.4 μL 25 mM dNTPs, 0.05 μL 120 U / μL Bst DNA Polymerase, 0.25 μL 8 U / μL Bst DNA Polymerase, 0.1 μL 40 U / μL RNase inhibitor, 0.04 μL of 20 U / μL AMV reverse transcriptase, and 0.5 μL of indicator were mixed and attached to the center of the tube cap. In addition, mix 0.4 μL of 100 μM FIP and BIP, 0.05 μL of 100 μM F3 and B3, 0.2 μL of 100 μM FLP and BLP, 0.9 μL of 2 M trehalose, 0.14 μL of 50% glycerol, and 0.5 μL of indicator in the tube cap. It was attached to the bottom. Then it was dried. The final concentration of each primer is 1.6 μM (FIP and BIP), 0.2 μM (F3 and B3), 0.4 μM (FLP and BLP). The reagents were dried using clean air for 6 hours. The tubes were then placed in a desiccator equipped with phosphorus oxide (P 2 O 5) and silica gel overnight and dried in vacuum. To this, 2 μL template (virus sample), 1 μL 25X LAMP buffer, 1.5 μL 100 mM DDL 4 , and 19.5 μL 0.1% TritonX-100 in DDW were added, mixed by inversion, and the reaction was started.
Templateとして用いたサンプルは4 種のチクングニアウイルス株(SL11131, SL10571, BaH306, and S27), ジカウイルス, デングウイルスセロタイプ 4, 日本脳炎ウイルス, ロスリバーウイルスである。
The samples used as Templates are four chikungunya virus strains (SL11131, SL10571, BaH306, and S27), Zika virus,
RT-LAMPのリアルタイムモニタリングはreal-time PCR engine (LightCyclerTM96; Roche Diagnostics, Mannhein, Germany)を用いて実施した。反応温度は59℃で、 1分ごとに90分にわたってGelGreenによる蛍光を測定した。 Real-time monitoring of RT-LAMP was performed using a real-time PCR engine (LightCycler TM 96; Roche Diagnostics, Mannhein, Germany). The reaction temperature was 59 ° C., and the fluorescence by Gel Green was measured every minute for 90 minutes.
10μL のウイルスストック、マウス血清より、a QuickGene RNA Tissue Kit SIIを用いて終量100μLのelution bufferでRNAを抽出した。5.6μLの抽出RNA をサンプルとし、a SuperScript III One-Step RT-PCR System、Platinum Taq、CHIKV E1 specific primers (表１)、を用いてRT-PCRを実施した。反応条件は、50℃ 30 分、94℃ 2 分、[94℃ 30 秒、53℃ 30 秒、68℃ 1 分]を35 サイクル、68℃ 2 分でDNA増幅を行った。増幅産物は1% agarose gel を用いて電気泳動し、UV下で300 bpのバンドを観察した。 RNA was extracted from 10 μL of virus stock and mouse serum using a QuickGene RNA Tissue Kit SII with a final volume of 100 μL of elution buffer. RT-PCR was performed using 5.6 μL of extracted RNA as a sample using a SuperScript III One-Step RT-PCR System, Platinum Taq, and CHIKV E1 specific primers (Table 1). The reaction conditions were 50 ° C. for 30 minutes, 94 ° C. for 2 minutes, [94 ° C. for 30 seconds, 53 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 1 minute] for 35 cycles, and DNA amplification was performed at 68 ° C. for 2 minutes. The amplification product was electrophoresed on a 1% agarose gel and a band of 300 bp was observed under UV.
試験例1
はじめにRT-LAMPの感度を調べた。それぞれのチューブには段階的に希釈したウイルスサンプルが含まれている。具体的には、1チューブに1000, 200, 40, 8 PFU（プラーク形成単位：ウイルス粒子の数を表す）のウイルスサンプルと陰性対照として滅菌蒸留水を用いた。RT-LAMPを開始し、10, 20, 30, 60分後にサンプルの色を確認した（図１A）。図１Aの左はGelGreen、右はHNBによる判定結果を示す。RT-LAMPを開始し、20分後には40 PFUが陽性に、30分後には8 PFUが陽性になった。その後、60分まで反応時間を延ばしても陰性対照（Negative control）に偽陽性反応は確認されなかった。GelGreenとHNBによる判定は完全に一致していた。Supplementaly dataのSet13およびSet16はPrimerExplorer V5 softwareを用いて設計したその他のプライマーセットである。Set13は感度が低く、60分で偽陽性反応が確認された。Set16は20分ですでに偽陽性反応が確認された。図１Bは、図１Aと同様のRT-LAMP反応をリアルタイムPCRで解析した結果である。4サンプル共に反応開始10分程度でGelGreenの蛍光上昇が認められ、反応開始30分後には蛍光はプラトーに達した。90分後においても4つのネガティブコントロールいずれも反応は起こっていなかった。また、図１Aの60分後の反応サンプルを1% agarose gel で電気泳動した結果を図１Cに示す。RT-LAMP陽性サンプルでは梯子状のバンドが確認された。さらに、RT-LAMPとRT-PCRの感度の比較をするため、RT-LAMP法と同量のウイルスサンプルからRNAを抽出し RT-PCR を行い1% agarose gel で電気泳動した結果が図１Dである。RT-PCRでは、1000, 200 PFU で強いバンドが確認された。しかし、40 , 8 PFUでは非常に薄いバンドしか検出されなかった。
Test example 1
First, the sensitivity of RT-LAMP was investigated. Each tube contains a serially diluted virus sample. Specifically, a virus sample of 1000, 200, 40, 8 PFU (plaque forming unit: representing the number of virus particles) was used in one tube, and sterile distilled water was used as a negative control. RT-LAMP was started, and the color of the sample was confirmed 10, 20, 30, and 60 minutes later (Fig. 1A). The left side of FIG. 1A shows the judgment result by Gel Green, and the right side shows the judgment result by HNB. After starting RT-LAMP, 40 PFU became positive 20 minutes later and 8 PFU became positive 30 minutes later. After that, even if the reaction time was extended to 60 minutes, no false positive reaction was confirmed in the negative control (Negative control). The judgments by Gel Green and HNB were in perfect agreement.
以上の結果より、本RT-LAMPシステムは感度が高いが、偽陽性反応はおこらないことが分かった。また、本RT-LAMPシステムは、従来法であるRT-PCR法に比べてより感度が高いと言える。 From the above results, it was found that this RT-LAMP system has high sensitivity but does not cause false positive reactions. Moreover, it can be said that this RT-LAMP system has higher sensitivity than the conventional RT-PCR method.
試験例2
RT-LAMPの反応の特異性を調べるために、チクングニアウイルスの4種の株（SL11131, SL10571, BaH306, S27）とその他のアルボウイルス（ジカウイルスZIKV、デングウイルス4型DENV4、日本脳炎ウイルスJEV、ロスリバーウイルスRRV）を1チューブ当たり200 PFUを用いて、図1と同様の条件でRT-LAMPを行った。20分の反応で、チクングニアウイルスの4種の株は全て陽性反応を示した（図２A）。一方、20分の反応でも、その他のアルボウイルスおよびNCは偽陽性反応を示さなかった（図２A）。GelGreenとHNBによる判定は完全に一致していた。上記サンプルを60分反応させた後に1% agarose gel で電気泳動したところ、RT-LAMP陽性サンプルでは梯子状のバンドが確認された（図２B）。
Test example 2
To investigate the specificity of the RT-LAMP response, four strains of Chikungunia virus (SL11131, SL10571, BaH306, S27) and other arboviruses (Zika virus ZIKV,
以上より、本RT-LAMPシステムはチクングニアウイルス特異的に反応することが分かった。 From the above, it was found that this RT-LAMP system reacts specifically with chikungunya virus.
試験例3
次に血液中のチクングニアウイルスの検出にRT-LAMP システムが有効か否かを調べた。野生型マウスはチクングニアウイルス感染に対して耐性であり感染が成立しない。そこで、ウイルス感染防御に重要なType1インターフェロンのシグナルが障害されるIFNAR1-ノックアウトマウスが様々なウイルス感染に高感受性を示すことに着目し、このマウスがチクングニアウイルスにも感受性を示し感染約6日後には死亡することを確認した。5匹のIFNAR1-ノックアウトマウスにチクングニアウイルスを104PFU皮下投与し、5匹の非感染IFNAR1-ノックアウトマウスをコントロール群として、感染4日後に血清を回収した。
Test example 3
Next, we investigated whether the RT-LAMP system was effective in detecting chikungunya virus in the blood. Wild-type mice are resistant to chikungunya virus infection and cannot be infected. Therefore, we focused on the fact that IFNAR1-knockout mice, in which the signal of
2 μLの血清サンプルを図1と同様の条件で直接RT-LAMP 反応にかけたところ、反応開始後30分で全ての感染マウスサンプルが陽性反応を示した（図３A）。また、60分の反応でも偽陽性反応は観察されなかった。また、2 μLの血清からRNAを抽出し、RT-PCR反応後、1%アガロースゲルで電気泳動を行ったところ、感染マウス5匹中3匹が陽性反応を示した（図３B）。さらに、lysis buffer（0.1% TritonX-100 in RNase free water）で10倍希釈した血液を図1と同様の条件でRT-LAMP 反応にかけたところ、反応が早いものは 20分で陽性反応を示し、90分後には全ての感染マウスサンプルが陽性反応を示した（図３C）。
When 2 μL of serum sample was directly subjected to the RT-LAMP reaction under the same conditions as in FIG. 1, all infected mouse samples showed a
以上より、本RT-LAMPシステムは血清や全血といった生体材料をサンプルに用いた場合でも、高感度でチクングニアウイルスを検出できることが分かった。 From the above, it was found that this RT-LAMP system can detect chikungunya virus with high sensitivity even when biomaterials such as serum and whole blood are used as samples.
試験例4
次に乾燥RT-LAMPシステムを作製した。乾燥RT-LAMPシステムを使用する際は、2 μLのサンプル、1 μLの25X LAMP buffer、1.5 μLの100 mM MgSO4、19.5μL の0.1% TritonX-100 in DDWを加えて、転倒混和し、反応を開始した。反応条件は図１と同様である。
Test example 4
Next, a dry RT-LAMP system was prepared. When using the dry RT-LAMP system, add 2 μL sample, 1 μL 25X LAMP buffer, 1.5 μL 100 mM DDL 4 , 19.5 μL 0.1% TritonX-100 in DDW, mix by inversion and react. Started. The reaction conditions are the same as in FIG.
はじめに、乾燥RT-LAMPシステムの感度を調べた。それぞれのチューブには1000、200、40、8 PFUが含まれている。陰性対象には滅菌蒸留水を用いた。1000 PFUが60分で、200 PFUが80分で陽性反応を示した。陰性対象に偽陽性反応は観察されなかった（図４A）。同様の乾燥RT-LAMP反応でのGelGreenの蛍光をリアルタイムPCRで解析したところ、50分程度で反応が開始した（図４B）。さらに、IFNAR1-ノックアウトマウスに104PFUのチクングニアウイルスを皮下投与し、感染4日後に血清を回収し、乾燥RT-LAMPシステムにかけた。最も反応が早いものは30分で陽性反応を示した。70分後には チクングニア感染個体5匹中4匹が陽性反応を示した。非感染個体のサンプルに偽陽性反応は観察されなかった（図４C）。 First, the sensitivity of the dry RT-LAMP system was investigated. Each tube contains 1000, 200, 40 and 8 PFU. Sterilized distilled water was used for negative subjects. 1000 PFU tested positive in 60 minutes and 200 PFU in 80 minutes. No false positive reactions were observed in the negative subjects (Fig. 4A). When the fluorescence of Gel Green in the same dry RT-LAMP reaction was analyzed by real-time PCR, the reaction started in about 50 minutes (Fig. 4B). In addition, IFNAR1-knockout mice were subcutaneously administered 10 4 PFU of chikungunya virus, and 4 days after infection, serum was collected and subjected to a dry RT-LAMP system. The fastest reaction showed a positive reaction in 30 minutes. After 70 minutes, 4 out of 5 Chikungunya-infected individuals tested positive. No false positive reaction was observed in the sample of uninfected individuals (Fig. 4C).
以上より、乾燥RT-LAMPシステムは生体材料を用いた場合においても偽陽性反応が起きないことが明らかになった。 From the above, it was clarified that the dry RT-LAMP system does not cause a false positive reaction even when a biomaterial is used.
試験例5
最後にバングラデシュのヒト患者サンプルを用いてRT-LAMPシステムおよび乾燥RT-LAMPシステムの有効性を評価した。患者サンプルは、バングラデシュのInstitute of Epidemiology, Disease Control and Research (IEDCR)でRT-PCR法で陽性反応が確認された血清から抽出したRNAを用いた。
Test example 5
Finally, the effectiveness of the RT-LAMP system and the dry RT-LAMP system was evaluated using human patient samples from Bangladesh. For the patient sample, RNA extracted from serum that was confirmed to be positive by RT-PCR at the Institute of Epidemiology, Disease Control and Research (IEDCR) in Bangladesh was used.
2μLの上記サンプルを用いて図１と同様の反応条件でRT-LAMP反応を行ったところ、20分の反応で、10サンプル中9サンプル (90%) が陽性を示した（図５A）。一方、乾燥RT-LAMP システムは、20分の反応で10サンプル中6サンプル (60%) が陽性を示し、30分では10サンプル中7サンプル (70%)、 40分では10サンプル中8サンプル (80%) 、60 分では10サンプル中9サンプル(90%) が陽性となった。一方、Nagasaki’s primer set（非特許文献１）を用いると60分で全てのサンプルが陽性反応を示したが、陽性対象が陽性にならなかった（図５B）。このように、Nagasaki’s primer set（非特許文献１）を用いた場合は、結果が安定しなかった。 When the RT-LAMP reaction was carried out using 2 μL of the above sample under the same reaction conditions as in FIG. 1, 9 out of 10 samples (90%) were positive in the reaction for 20 minutes (FIG. 5A). On the other hand, the dry RT-LAMP system was positive in 6 of 10 samples (60%) in the 20 minute reaction, 7 of 10 samples (70%) in 30 minutes, and 8 of 10 samples in 40 minutes ( 80%), and at 60 minutes, 9 out of 10 samples (90%) were positive. On the other hand, when Nagasaki's primer set (Non-Patent Document 1) was used, all the samples showed a positive reaction in 60 minutes, but the positive subjects did not become positive (Fig. 5B). As described above, when the Nagasaki's primer set (Non-Patent Document 1) was used, the results were not stable.
本発明のRT-LAMPシステムおよび乾燥RT-LAMPシステムに用いているプライマーセットは感度、特異性、正確性に優れており、本システムは流行地におけるスクリーニングキットとしての使用が期待される。 The primer set used in the RT-LAMP system and the dry RT-LAMP system of the present invention has excellent sensitivity, specificity, and accuracy, and this system is expected to be used as a screening kit in endemic areas.
Claims (5)
（B）5’側から配列番号4で示される塩基配列、リンカー配列、配列番号5で示される塩基配列が順に配置されてなる塩基配列を含むバックワードインナープライマー、
（C）配列番号7で示される塩基配列を含むフォワードアウタープライマー、及び
（D）配列番号8で示される塩基配列を含むバックワードアウタープライマー
を含む、プライマーセット。 (A) A forward inner primer containing a base sequence in which the base sequence shown by SEQ ID NO: 1, the linker sequence, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are arranged in order from the 5'side.
(B) A backward inner primer containing a base sequence in which the base sequence shown by SEQ ID NO: 4, the linker sequence, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 are arranged in order from the 5'side.
A primer set containing (C) a forward outer primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and (D) a backward outer primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8.
（E）配列番号9で示される塩基配列を含むフォワードループプライマー、及び
（F）配列番号10で示される塩基配列を含むバックワードループプライマー
を含む、請求項１に記載のプライマーセット。 further,
The primer set according to claim 1, further comprising (E) a forward loop primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, and (F) a backward loop primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10.
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