JP2021078432A

JP2021078432A - アンドロゲン受容体遺伝子スプライシングバリアント検出プローブおよび当該プローブを用いた前記バリアントの検出方法

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Publication number: JP2021078432A
Application number: JP2019209342A
Authority: JP
Inventors: 勇一熊木; Yuichi Kumaki
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2019-11-20
Publication date: 2021-05-27
Anticipated expiration: 2039-11-20
Also published as: JP7500956B2

Abstract

【課題】アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアントのうちバリアント３（ＡＲ−Ｖ３）を特異的に検出するためのプローブおよびそれを用いたＡＲ−Ｖ３の検出方法を提供すること。【解決手段】ＡＲ−Ｖ３のうち、ｅｘｏｎ２の３’末端側からｃｒｙｐｔｉｃｅｘｏｎ４の５’末端側の領域の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な配列を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブにより、前記課題を解決する。【選択図】なし

Description

本発明は、試料中に含まれるアンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアントを特異的に検出するためのプローブおよび当該プローブを用いた前記バリアントの検出方法に関する。特に本発明は、ＡＲ遺伝子スプライシングバリアントのうちバリアント３（ＡＲ−Ｖ３）を特異的に検出するためのプローブおよび当該プローブを用いたＡＲ−Ｖ３の検出方法に関する。

前立腺がんは、中高年の男性において注意すべきがんである。前立腺がんは初期には自覚症状がほとんどないため、発見が遅れることがある。また発見が遅れ、がんが進行すると骨やほかの臓器に転移することがある。したがって早期にがんを診断し、適切な治療を施すことが必要である。

前立腺がんの増殖および生存は男性ホルモンであるアンドロゲンのシグナルに依存する。転写因子であるアンドロゲン受容体（ＡＲ）は、アンドロゲンが結合することで、転写活性を発揮する。ヒトＡＲ遺伝子はＸ染色体上に存在し、８つのエクソン（ｅｘｏｎ）から構成されている。イントロンを含むヒトＡＲ遺伝子の全長は約１８５ｋｂにおよぶ（図１）。全長ヒトＡＲタンパク質は、主にＮＴＤ（ＮＨ２末端ドメイン）、ＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）、ＬＢＤ（リガンド結合ドメイン）、ＤＢＤとＬＢＤをつなぐヒンジ、の４つのドメインで構成されている。ＮＴＤはエクソン１によってコードされている。ＤＢＤはエクソン２およびエクソン３によってコードされている。ヒンジはエクソン３およびエクソン４によってコードされている。ＬＢＤはエクソン５、エクソン６、エクソン７およびエクソン８によってコードされている（非特許文献１）。リガンドであるアンドロゲンがＡＲのＬＢＤドメインに結合すると、ＡＲが活性型となって細胞質から細胞核に移行し、ゲノムＤＮＡに結合することで、アンドロゲン応答遺伝子の転写を活性化する。

ＡＲは８つのエクソンから構成される全長ＡＲ以外にも、複数のスプライシングバリアントが存在することが報告されている（非特許文献１および非特許文献２）。スプライシングバリアントの中でも、図２に示すＡＲ−Ｖ３、ＡＲ−Ｖ４、ＡＲ−Ｖ７およびＡＲ−Ｖ９は恒常活性型であることが報告されており、リガンドであるアンドロゲンが無い状態でも、アンドロゲン応答遺伝子活性を有すると考えられている。実際、恒常活性型であるＡＲ−Ｖ７が発現している去勢抵抗性前立腺がん患者では、アンドロゲンのシグナルを阻害する薬剤であるアビラテロン（Ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ）およびエンザルタミド（Ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ）に抵抗性を示し、予後が不良であることが報告されている（非特許文献３、特許文献１）。したがって前立腺がん患者に対し、恒常活性型ＡＲ（ＡＲ−Ｖ３、ＡＲ−Ｖ４、ＡＲ−Ｖ７、ＡＲ−Ｖ９）発現の有無およびその発現量を測定することは重要である。

Ｗａｒｅｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−ＲｅｌａｔｅｄＣａｎｃｅｒ，２１，Ｔ８７−Ｔ１０３（２０１４）Ｌｕｅｔａｌ．，ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＡｎｄｒｏｌｏｇｙａｎｄＵｒｏｌｏｇｙ，２（３），１７８−１８６（２０１３）Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓｅｔａｌ．，ＴｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，３７１（１１），１０２８−１０３８（２０１４）

特表２０１７−５３４２４８号公報

本発明の課題は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアントのうちバリアント３（ＡＲ−Ｖ３）を特異的に検出するためのプローブおよびそれを用いたＡＲ−Ｖ３の検出方法を提供することにある。

本発明者らは、上記目的に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアント３（ＡＲ−Ｖ３）（図２）のうち、ｅｘｏｎ２の３’末端側からｃｒｙｐｔｉｃｅｘｏｎ（ＣＥ）４の５’末端側の領域に、オリゴヌクレオチドプローブを設計することで前記課題を解決し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下の通り例示できる。

［１］試料中に含まれるアンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアントを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、
前記スプライシングバリアントがＡＲ遺伝子のスプライシングバリアント３（ＡＲ−Ｖ３）であり、
前記プローブの塩基配列が配列番号１から４のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な配列を含む、
前記プローブ。

［２］オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列が配列番号１から４のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列からなる、前記［１］に記載のプローブ。

［３］試料中に含まれるＡＲ遺伝子スプライシングバリアントの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとを用いて前記特定塩基配列を増幅する工程と、
増幅した特定核酸配列の一部とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて前記特定核酸配列を検出する工程とを含む、
試料中に含まれるＡＲ遺伝子スプライシングバリアントの検出方法であって、
前記スプライシングバリアントがＡＲ−Ｖ３であり、
前記第一のプライマーがｅｘｏｎ２領域の一部と相同的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、
前記第二のプライマーがｃｒｙｐｔｉｃｅｘｏｎ４領域の一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、
前記プローブが前記［１］または［２］に記載のプローブである、前記検出方法。

［４］第一のプライマーが配列番号５に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、前記［３］に記載の検出方法。

［５］第一のプライマーが配列番号６から８のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号１０または１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記［４］に記載の検出方法。

［６］試料中に含まれるＡＲ遺伝子スプライシングバリアントを検出するための試薬であって、
前記スプライシングバリアントがＡＲ−Ｖ３であり、
配列番号６から８のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０または１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１から４のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブとを少なくとも含む、前記試薬。

［７］去勢抵抗性前立腺がんの検査方法であって、
前記［１］または［２］に記載のオリゴヌクレオチドプローブを用いて試料中に含まれるＡＲ−Ｖ３を検出する工程を含む、前記検査方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において試料とは、患者などから採取される腫瘍細胞を含む組織や全血、腹水等に限定されるものではなく、当該組織や全血、腹水等を適切な緩衝液で希釈した試料、血清、血漿、臍帯血、成分採血液などの全血由来の成分、肝臓、肺、脾臓、腎臓、腫瘍、リンパ節などの血液を含む組織の一片を適切な緩衝液で懸濁させた懸濁液も含まれる。さらにこれらの試料や懸濁液を遠心分離などにより分離回収して得られた、腫瘍細胞を含む画分も、本発明における試料に含まれる。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブ（以下、単に本発明のプローブとも表記する）の塩基配列は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアントのうちバリアント３（ＡＲ−Ｖ３）特異的に見出される塩基配列であり、かつ、他のＡＲ遺伝子スプライシングバリアントに存在しない塩基配列である。具体的には、ＡＲ−Ｖ３（図２）のうちｅｘｏｎ２の３’末端側からｃｒｙｐｔｉｃｅｘｏｎ（ＣＥ）４の５’末端側の領域に位置する、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６４３３９４番目から６７６４３４０７番目および６７６８０７２０番目から６７６８０７３１番目までの領域）、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６４３３９８番目から６７６７３４０７番目までの領域および６７６８０７２０番目から６７６８０７３４番目までの領域の相補鎖）、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６４３３８８番目から６７６４３４０７番目および６７６８０７２０番目から３７３８０７２６番目までの領域の相補鎖）および配列番号４（ＮＣ＿００００２３．１１の６７６４３３８８番目から６７６４３４０７番目および６７６８０７２０番目から６７６８０７３０番目までの領域の相補鎖）のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な配列である。

本発明における「ストリンジェントな条件」の例としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性（例えば、同一性や類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。限定されないが、具体的には、ハイブリダイゼーション条件として、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件や、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．１％（ｗ／ｖ）フィコール、０．１％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件があげられる。また、洗浄条件として、６０℃、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは６８℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ等のストリンジェントな条件に相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件等が挙げられる。さらに、当業者であれば、本明細書の記載、および、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ３ｒｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，ＮＹ（２００１））等を参照し、本発明のプローブ（配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）を容易に取得することができる。

また、前述したストリンジェントな条件下で、前記特定塩基配列またはその相補配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であり、かつ、前記特定塩基配列またはその相補配列を増幅可能であれば、プローブの塩基配列は、前記特定塩基配列またはその相補配列と比較して、１または数個程度（例えば、プローブ配列の塩基数の１０％以下程度）の置換、欠失、挿入、付加および／または修飾があってもよい。

本発明のプローブの好ましい塩基配列の一例として、配列番号１から４のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列を少なくとも含む配列があげられ、さらに好ましい配列として、配列番号１から４のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列があげられる。これらプローブは単独で用いてもよく、２種以上を用いることもできる。

本発明のプローブを用いたＡＲ−Ｖ３の検出は、例えば本発明のプローブを構成するオリゴヌクレオチドに標識物質と結合させた後、当該標識物質に基づきハイブリダイゼーション法により検出を行なえばよい。前記標識物質として例えば、酵素、蛍光色素、放射性同位元素、発光色素等、公知のものを使用できる。標識物質と結合した本発明のプローブの好ましい態様として、検出操作を簡便に行なえる、ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ（米国特許５９２５５１７号、米国特許６１０３４７６号）、ＴａｑＭａｎプローブ（米国特許５２１００１５号、米国特許５４８７９７２号）、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（特許３４３７８１６号）、サイクリングプローブ（米国特許５０１１７６９号、米国特許５４０３７１１号）、インターカレーター性蛍光色素標識プローブ（特開２０００−０１４４００号公報）があげられる。なお前記ハイブリダイゼーション法による検出に、電気泳動や液体クロマトグラフィーなどを組み合わせてもよい。

通常、試料中にＡＲ−Ｖ３が存在したとしても、その存在量は僅かである。そのため、前述した本発明のプローブを用いたＡＲ−Ｖ３の検出工程に加え、ＡＲ−Ｖ３の特定塩基配列を増幅する工程も実施すると好ましい。なお本発明において特定塩基配列とは、ＡＲ−Ｖ３遺伝子のうち、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列のことをいう。すなわち本発明では前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が増幅されることになる。

前述した通り、本発明のプローブはｅｘｏｎ２の３’末端側からＣＥ４の５’末端側の領域に位置している。したがって、第一のプライマーはＡＲ−Ｖ３のうちｅｘｏｎ２の一部と相同的な塩基配列を有するプライマーであり、第二のプライマーはＡＲ−Ｖ３のうちＣＥ４の一部と相補的な塩基配列を有するプライマーである。

本発明における第一のプライマーの好ましい態様として、配列番号５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６４３３１７番目から６７６４３３８５番目までの領域の相補鎖）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられ、より好ましい態様として配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６４３３６７番目から６７６４３３８５番目までの領域）、配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６４３３１７番目から６７６４３３３８番目までの領域）および配列番号８（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６４３３５４番目から６７６４３３７５番目までの領域）のいずれかに記載の塩基配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドがあげられ、さらにより好ましい態様として配列番号６から８のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

なおプライマーにおける「ストリンジェントな条件」についても前述のプローブにおける「ストリンジェントな条件」が適用される。

本発明における第二のプライマーの好ましい態様として、配列番号９に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８０７５６番目から６７６８０７８２番目までの領域）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられ、より好ましい態様として配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８０７５６番目から６７６８０７７６番目までの領域の相補鎖）または配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７６８０７６２番目から６７６８０７８２番目までの領域の相補鎖）に記載の塩基配列を少なくとも含むオリゴヌクレオチドがあげられ、さらにより好ましい態様として配列番号１０または１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

ＡＲ−Ｖ３の特定塩基配列を増幅する工程に採用し得る核酸増幅方法としては、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ＭｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＲｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＣｏｎｃｅｒｔｅｄ）法、ＮＡＳＢＡ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＭｅｄｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が例示できる。

本発明のプローブで検出できるＡＲ−Ｖ３は恒常活性型ＡＲである。したがって本発明のプローブを用いて試料中に含まれるＡＲ−Ｖ３を検出することで、去勢抵抗性前立腺がんを検査できる。例えば、患者由来の試料に対し、本発明のプローブを用いてＡＲ−Ｖ３を検出できた場合、当該患者が去勢抵抗性前立腺がんに罹患していると判断できる（定性的な検出）。また別の例として、患者由来の試料に対し、本発明のプローブを用いてＡＲ−Ｖ３存在量を測定し、その量が閾値を超えた場合、当該患者が去勢抵抗性前立腺がんに罹患していると判断できる（定量的な検出）。前記閾値は例えば、本発明のプローブを用いて、去勢抵抗性前立腺がんに罹患していない複数の健常者由来の試料中に含まれるＡＲ−Ｖ３存在量をそれぞれ測定し、その平均値、または当該平均値にＳＤ（標準偏差）値の１倍、２倍もしくは３倍加算した値を閾値とすればよい。

本発明は、ＡＲ−Ｖ３のうち、ｅｘｏｎ２の３’末端側からｃｒｙｐｔｉｃｅｘｏｎ（ＣＥ）４の５’末端側の領域の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な配列を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブに関する発明であり、当該プローブにより試料中に含まれるＡＲ−Ｖ３を特異的に検出できる。

さらに前記プローブによるＡＲ−Ｖ３の検出工程に、ｅｘｏｎ２の一部と相同的な塩基配列を有する第一のプライマーとＣＥ４の一部と相補的な塩基配列を有する第二のプライマーを用いたＡＲ−Ｖ３特定塩基配列の増幅工程を追加することで、試料中に含まれるＡＲ−Ｖ３存在量が僅かであったとしても、ＡＲ−Ｖ３を特異的に検出できる。

アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＮＣ＿００００２３．１１の６７５４４０２１番目から６７７３０６１９番目までの領域）におけるｅｘｏｎおよびｃｒｙｐｔｉｃｅｘｏｎ（ＣＥ）の位置を示した図（模式図）である。ＡＲ全長および主要なスプライシングバリアントの構造を示した図である。なおＣＥはｃｒｙｐｔｉｃｅｘｏｎを意味する。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。

実施例１前立腺がん細胞株におけるアンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアント３（ＡＲ−Ｖ３）のリアルタイムＰＣＲによる検出（その１）
ヒト前立腺癌細胞２２Ｒｖ１を試料として用い、リアルタイムＰＣＲによるＡＲ−Ｖ３の検出を試みた。２２Ｒｖ１は完全長ＡＲおよびＡＲ−Ｖ３の両方を発現する癌細胞株である。

（１）癌細胞株２２Ｒｖ１を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、５％ＣＯ_２環境下３７℃で培養した。培養後、ＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて培養皿から細胞を剥離することで癌細胞を回収した。

（２）回収した細胞を、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを回収した。ＴｏｔａｌＲＮＡ１０ｎｇからＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑｖ４ＵｌｔｒａＬｏｗＩｎｐｕｔＲＮＡＫｉｔｆｏｒＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によりｃＤＮＡを合成した。

（３）（２）で合成した２２Ｒｖ１ｃＤＮＡを鋳型として、第一および第二のプライマーを用いたＡＲ−Ｖ３特定塩基配列の増幅、およびオリゴヌクレオチドプローブによる当該増幅した特定塩基配列の検出を、リアルタイムＰＣＲで行なった。なお各ｃＤＮＡ量に対し、ｎ＝３で行なった。
反応試薬：ＴａｑＭａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
第一のプライマー：配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを最終濃度３００ｎＭで使用
第二のプライマー：配列番号１０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを最終濃度３００ｎＭで使用
オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＦＡＭ蛍光色素およびクエンチャーで標識したＴａｑＭａｎプローブ）を最終濃度２５０ｎＭで使用
鋳型ｃＤＮＡ量：４０ｐｇ、８ｐｇ、１．６ｐｇ、０．３２ｐｇ、０．０６４ｐｇ、０．０１２８ｐｇのいずれか
検出機器：７３００Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
反応条件：５０℃２分、９５℃１０分の後、９５℃１５秒と６０℃１分を４０回繰り返すＰＣＲ反応において、リアルタイムにＦＡＭ蛍光シグナルを検出した。

実施例２前立腺がん細胞株におけるＡＲ−Ｖ３のリアルタイムＰＣＲによる検出（その２）
第一のプライマーを配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに、第二のプライマーを配列番号１０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに、それぞれ変更した他は、実施例１と同様な方法で２２Ｒｖ１ｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ−Ｖ３特定塩基配列の増幅および検出を行なった。

実施例３前立腺がん細胞株におけるＡＲ−Ｖ３のリアルタイムＰＣＲによる検出（その３）
第一のプライマーを配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに、第二のプライマーを配列番号１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに、鋳型ｃＤＮＡ量を２００ｐｇ、４０ｐｇ、８ｐｇ、１．６ｐｇ、０．３２ｐｇ、０．０６４ｐｇのいずれかに、それぞれ変更した他は、実施例１と同様な方法で２２Ｒｖ１ｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ−Ｖ３特定塩基配列の増幅および検出を行なった。

実施例１から３の結果をまとめて表１に示す。なお表中のＣｔ値はＴｈｒｅｓｈｏｌｄＣｙｃｌｅを意味する。配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで２２Ｒｖ１ｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ−Ｖ３を検出できた。なお検出感度は、ＡＲ−Ｖ３特定塩基配列の増幅に用いた第一および第二のプライマーの組み合わせによって異なった。具体的には、実施例１および２では１．６ｐｇ以上の２２Ｒｖ１ｃＤＮＡからＡＲ−Ｖ３が検出でき、実施例３では０．３２ｐｇ以上の２２Ｒｖ１ｃＤＮＡからＡＲ−Ｖ３が検出できた。

実施例４前立腺がん細胞株におけるＡＲ−Ｖ３のドロップレットデジタルＰＣＲによる検出（その１）
ヒト前立腺癌細胞２２Ｒｖ１およびＶＣａＰを試料として用い、ドロップレットデジタルＰＣＲによるＡＲ−Ｖ３の検出を試みた。なおＶＣａＰも２２Ｒｖ１と同様、完全長ＡＲおよびＡＲ−Ｖ３の両方を発現する癌細胞株である。

（１）癌細胞株をそれぞれ以下に示す培地を用いて、５％ＣＯ_２環境下３７℃で培養した。培養後、ＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて培養皿から細胞を剥離することで癌細胞を回収した。
２２Ｒｖ１：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地
ＶＣａＰ：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）培地
（２）回収した各細胞を、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを回収した。ＴｏｔａｌＲＮＡ１０ｎｇからＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑｖ４ＵｌｔｒａＬｏｗＩｎｐｕｔＲＮＡＫｉｔｆｏｒＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によりｃＤＮＡを合成した。

（３）（２）で合成した２２Ｒｖ１ｃＤＮＡおよびＶＣａＰｃＤＮＡを鋳型として、第一および第二のプライマーを用いたＡＲ−Ｖ３特定塩基配列の増幅、およびオリゴヌクレオチドプローブによる当該増幅した特定塩基配列の検出を、ドロップレットデジタルＰＣＲで行なった。
反応試薬：ｄｄＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘｆｏｒＰｒｏｂｅｓ（ｎｏｄＵＴＰ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ）
第一のプライマー：配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを最終濃度９００ｎＭで使用
第二のプライマー：配列番号１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを最終濃度９００ｎＭで使用
オリゴヌクレオチドプローブ：配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＦＡＭ蛍光色素およびクエンチャーで標識したＴａｑＭａｎプローブ）を最終濃度２５０ｎＭで使用
鋳型ｃＤＮＡ量：２００ｐｇ
検出機器：ＱＸ２００ＤｒｏｐｌｅｔＤｉｇｉｔａｌＰＣＲシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）
反応条件：反応溶液から検出機器に含まれるＤｒｏｐｌｅｔＧｅｎｅｒａｔｏｒにより液滴を生成し、９５℃１０分の後、９４℃３０秒と５５℃１分を４０回繰り返し、最後に９８℃１０分間保温するＰＣＲ反応を行い、検出機器に含まれるＤｒｏｐｌｅｔＲｅａｄｅｒにおいて液滴のＦＡＭ蛍光シグナルを検出した。

実施例５前立腺がん細胞株におけるＡＲ−Ｖ３のドロップレットデジタルＰＣＲによる検出（その２）
オリゴヌクレオチドプローブを配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）に変更した他は、実施例４と同様な方法で２２Ｒｖ１ｃＤＮＡおよびＶＣａＰｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ−Ｖ３特定塩基配列の増幅および検出を行なった。

実施例６前立腺がん細胞株におけるＡＲ−Ｖ３のドロップレットデジタルＰＣＲによる検出（その３）
オリゴヌクレオチドプローブを配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）に変更した他は、実施例４と同様な方法で２２Ｒｖ１ｃＤＮＡおよびＶＣａＰｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ−Ｖ３特定塩基配列の増幅および検出を行なった。

実施例７前立腺がん細胞株におけるＡＲ−Ｖ３のドロップレットデジタルＰＣＲによる検出（その４）
オリゴヌクレオチドプローブを配列番号４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）に変更した他は、実施例４と同様な方法で２２Ｒｖ１ｃＤＮＡおよびＶＣａＰｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ−Ｖ３特定塩基配列の増幅および検出を行なった。

実施例４から７の結果をまとめて表２に示す。これら実施例で用いたオリゴヌクレオチドプローブ（具体的には、配列番号１から４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ）はいずれも２２Ｒｖ１ｃＤＮＡおよびＶＣａＰｃＤＮＡ中に含まれるＡＲ−Ｖ３を検出できた。

Claims

試料中に含まれるアンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子スプライシングバリアントを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、
前記スプライシングバリアントがＡＲ遺伝子のスプライシングバリアント３（ＡＲ−Ｖ３）であり、
前記プローブの塩基配列が配列番号１から４のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な配列を含む、
前記プローブ。
オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列が配列番号１から４のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列からなる、請求項１に記載のプローブ。
ＡＲ遺伝子スプライシングバリアントの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとを用いて前記特定塩基配列を増幅する工程と、
増幅した特定核酸配列の一部とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて前記特定核酸配列を検出する工程とを含む、
試料中に含まれるＡＲ遺伝子スプライシングバリアントの検出方法であって、
前記スプライシングバリアントがＡＲ−Ｖ３であり、
前記第一のプライマーがｅｘｏｎ２領域の一部と相同的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、
前記第二のプライマーがｃｒｙｐｔｉｃｅｘｏｎ４領域の一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、
前記プローブが請求項１または２に記載のプローブである、前記検出方法。
第一のプライマーが配列番号５に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の検出方法。
第一のプライマーが配列番号６から８のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号１０または１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の検出方法。
試料中に含まれるＡＲ遺伝子スプライシングバリアントを検出するための試薬であって、
前記スプライシングバリアントがＡＲ−Ｖ３であり、
配列番号６から８のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０または１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１から４のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブとを少なくとも含む、前記試薬。
去勢抵抗性前立腺がんの検査方法であって、
請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドプローブを用いて試料中に含まれるＡＲ−Ｖ３を検出する工程を含む、前記検査方法。