JP2021052659A - Container for processing sheet-like cell culture with ridge - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、凸部を有するシート状細胞培養物の処理のための容器に関する。 The present invention relates to a container for processing a sheet-like cell culture having protrusions.
近年、重症心不全治療の解決策として新しい再生医療の開発が進められている。その一例として、重症心筋梗塞等において組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いて作製したシート状細胞培養物を心臓表面に適用する手法などが試みられている。シート状細胞培養物を用いる手法は、大量の細胞を広範囲に安全に移植することが可能であり、例えば、心筋梗塞（心筋梗塞に伴う慢性心不全を含む）、拡張型心筋症、虚血性心筋症、収縮機能障害（例えば、左室収縮機能障害）を伴う心疾患（例えば、心不全、特に慢性心不全）などの治療にとくに有用である。 In recent years, the development of new regenerative medicine has been promoted as a solution for the treatment of severe heart failure. As an example, a method of applying a sheet-like cell culture prepared by using a temperature-responsive culture dish to which tissue engineering is applied to the surface of the heart in severe myocardial infarction or the like has been attempted. Techniques using sheet-like cell cultures allow large amounts of cells to be safely transplanted over a wide area, such as myocardial infarction (including chronic heart failure associated with myocardial infarction), dilated cardiomyopathy, and ischemic cardiomyopathy. , Especially useful for the treatment of heart disease (eg, heart failure, especially chronic heart failure) with systolic dysfunction (eg, left ventricular systolic dysfunction).
このようなシート状細胞培養物を臨床応用するには、例えば、作製されたシート状細胞培養物を洗浄などの処理をして、対象に適用可能な状態に持ってこなければならない。こういった処理には、シート状細胞培養物と液体とを収容した容器から液体のみを除去する工程が含まれる。液体を除去する方法としては、マイクロピペットなどの器具を用いて容器から吸い出す、容器を傾けて容器の縁から液体を放出する、あるいは容器を傾けて、容器内の液体を一か所に集めたうえで集まった液体を器具を用いて吸い出す、などが挙げられる（特許文献１）。しかしながら、シート状細胞培養物と液体とを収容した容器から液体のみを除去することは困難であり、容器中に液体が残存することが多くある。また、シート状細胞培養物は絶対的な物理的強度が低いため、容器中に液体が残存することによって、皺、破れ、破損などが生じることも多くある。 In order to clinically apply such a sheet-shaped cell culture, for example, the prepared sheet-shaped cell culture must be subjected to a treatment such as washing to bring it into a state applicable to the subject. Such treatment involves removing only the liquid from the container containing the sheet cell culture and the liquid. The liquid can be removed by sucking it out of the container using an instrument such as a micropipette, tilting the container to release the liquid from the edge of the container, or tilting the container to collect the liquid in the container in one place. Examples include sucking out the liquid collected above using an instrument (Patent Document 1). However, it is difficult to remove only the liquid from the container containing the sheet-shaped cell culture and the liquid, and the liquid often remains in the container. In addition, since the sheet-shaped cell culture has a low absolute physical strength, wrinkles, tears, breakages, etc. often occur due to the remaining liquid in the container.
このような中、本発明者らは、シート状細胞培養物と液体とが収容されている容器から液体のみを除去する際に、液体を除去する操作によりシート状細胞培養物を傷つける、液体の除去する操作をした後に、容器内に液体が残存していることにより、シート状細胞培養物が容器底面をすべり、皺を生じるといった問題に直面した。したがって本発明の目的は、そのような問題を解決し、シート状細胞培養物と液体とが収容されている容器から液体のみを効率的に除去することで、シート状細胞培養物の処理のステップにおいて、皺、破れ、破損が生じるリスクを低減するための容器を提供することにある。 Under these circumstances, the present inventors damage the sheet-shaped cell culture by the operation of removing the liquid when only the liquid is removed from the container containing the sheet-shaped cell culture and the liquid. After the removal operation, the liquid remaining in the container caused the sheet-like cell culture to slip on the bottom surface of the container, causing wrinkles. Therefore, an object of the present invention is to solve such a problem and efficiently remove only the liquid from the container containing the sheet-shaped cell culture and the liquid, thereby performing a step of treating the sheet-shaped cell culture. The purpose is to provide a container for reducing the risk of wrinkling, tearing, and breakage.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中で、容器の底面から上方に突出する凸部を有し、凸部の高い位置に該シート状細胞培養物を載置することにより、該シート状細胞培養物に付着する余分な液体を低い方向へ流れさせることができる、シート状細胞培養物の処理に用いるための容器により、効率的にシート状細胞培養物に付着した余分な液体を除去できることを見出し、本発明を完成させた。 While conducting diligent research to solve the above problems, the present inventors have a convex portion protruding upward from the bottom surface of the container, and place the sheet-shaped cell culture at a high position of the convex portion. Thereby, the excess liquid adhering to the sheet-shaped cell culture can be allowed to flow in a low direction, and the container for use in the treatment of the sheet-shaped cell culture allows the sheet-shaped cell culture to be efficiently adhered to the sheet-shaped cell culture. We have found that excess liquid can be removed and completed the present invention.
すなわち本発明は、以下に関する。
［１］シート状細胞培養物の処理に用いるための容器であって、
容器の底面から上方に突出する凸部を有し、
凸部の高い位置に該シート状細胞培養物を載置することにより、該シート状細胞培養物に付着する余分な液体を低い方向へ流れさせることができる、前記容器。
［２］凸部の、少なくともシート状細胞培養物が載置される部分が、ドーム状の形状をしている、［１］に記載の容器。
［３］凸部と容器の内面との間に、環状の空間が形成されるよう構成される、［１］または［２］に記載の容器。
That is, the present invention relates to the following.
[1] A container for use in the treatment of sheet-shaped cell cultures.
It has a convex part that protrudes upward from the bottom of the container,
By placing the sheet-shaped cell culture at a high position on the convex portion, the excess liquid adhering to the sheet-shaped cell culture can flow in a low direction.
[2] The container according to [1], wherein at least the portion of the convex portion on which the sheet-shaped cell culture is placed has a dome shape.
[3] The container according to [1] or [2], which is configured to form an annular space between the convex portion and the inner surface of the container.
［４］凸部が、シート状細胞培養物が載置される部分の外側に１以上の柱を有する、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の容器。
［５］凸部および／または柱の少なくとも一部が弾性を有する、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の容器。
［６］サイズ調節が可能である抜き型を含む、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の容器。
[4] The container according to any one of [1] to [3], wherein the convex portion has one or more pillars on the outside of the portion on which the sheet-shaped cell culture is placed.
[5] The container according to any one of [1] to [4], wherein at least a part of the convex portion and / or the column has elasticity.
[6] The container according to any one of [1] to [5], which comprises a die whose size can be adjusted.
［７］シート状細胞培養物の処理に用いるための容器であって、
容器の底面から上方に突出する凸部を有し、
該凸部に、該シート状細胞培養物を載置させる載置部と、
該載置部の周囲を取り囲むように設けられた液体が保持される空間を有する、前記容器。
［８］凸部の高い位置に載置部が設けられ、シート状細胞培養物を該載置部に載置することにより、該シート状細胞培養物に付着する余分な液体を低い方向へ流れさせることができる、［７］に記載の容器。
［９］［１］〜［８］のいずれか１つに記載の容器と該容器を収容するための外容器とを含むキット。
[7] A container for use in the treatment of sheet-shaped cell cultures.
It has a convex part that protrudes upward from the bottom of the container,
A mounting portion on which the sheet-shaped cell culture is placed on the convex portion,
The container having a space for holding a liquid provided so as to surround the mounting portion.
[8] A mounting portion is provided at a high position of the convex portion, and by placing the sheet-shaped cell culture on the mounting portion, excess liquid adhering to the sheet-shaped cell culture flows in a low direction. The container according to [7], which can be used.
[9] A kit including the container according to any one of [1] to [8] and an outer container for accommodating the container.
［１０］シート状細胞培養物を処理するための方法であって、以下：
（ａ）底面から上方に突出する凸部を有する容器の、凸部の高い位置にシート状細胞培養物を載置するステップ、
（ｄ）シート状細胞培養物を凸部の高い位置に維持し、該シート状細胞培養物に付着する余分な液体を低い方向へ流れさせるステップ、
を含む、前記方法。
［１１］ステップ（ａ）の後で、かつステップ（ｄ）の前に、
（ｂ）該シート状細胞培養物が浸漬するまで洗浄液を添加し、該シート状細胞培養物を洗浄するステップ、
（ｃ）洗浄液を除去するステップ、
をさらに含む、［１０］に記載の方法。
[10] A method for treating a sheet-like cell culture, wherein:
(A) A step of placing a sheet-like cell culture at a high position of the convex portion of a container having a convex portion protruding upward from the bottom surface.
(D) A step of maintaining the sheet-shaped cell culture at a high position on the convex portion and allowing excess liquid adhering to the sheet-shaped cell culture to flow in a low direction.
The method described above.
[11] After step (a) and before step (d)
(B) A step of adding a washing solution until the sheet-shaped cell culture is immersed and washing the sheet-shaped cell culture.
(C) Step of removing cleaning liquid,
The method according to [10], further comprising.
［１２］洗浄液の添加および／または除去がシート状細胞培養物を載置する部分の外側から行われる、［１１］に記載の方法。
［１３］ステップ（ｄ）の後に、
（ｅ）該シート状細胞培養物上に高分子ゲル化可能な化合物を積層し、積層体を作製するステップ、
をさらに含む、［１０］〜［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］ステップ（ｅ）の後に、
（ｆ）該積層体のシート状細胞培養物を含む部分を切り出すステップ、
をさらに含む、［１３］に記載の方法。
［１５］［１０］〜［１４］のいずれか１つに記載の方法にしたがって処理されたシート状細胞培養物。
［１６］シート状細胞培養物の適用により改善される疾患を処置する方法であって、［１５］に記載のシート状細胞培養物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、前記方法。
[12] The method according to [11], wherein the addition and / or removal of the washing solution is performed from the outside of the portion on which the sheet-shaped cell culture is placed.
[13] After step (d)
(E) A step of laminating a compound capable of polymer gelling on the sheet-shaped cell culture to prepare a laminate.
The method according to any one of [10] to [12], further comprising.
[14] After step (e)
(F) A step of cutting out a portion of the laminate containing the sheet-like cell culture.
The method according to [13], further comprising.
[15] A sheet-like cell culture treated according to the method according to any one of [10] to [14].
[16] A method for treating a disease improved by application of a sheet-shaped cell culture, wherein an effective amount of the sheet-shaped cell culture according to [15] is applied to a subject in need thereof. Included, said method.
本発明の容器によれば、シート状細胞培養物に付着している余分な液体を、該シート状細胞培養物から容易に除去することができる。そのため、シート状細胞培養物の表面に付着した液体を除去するために、ピペットなどをシート状細胞培養物に近づけることもなく、皺、破損、破れを生じるリスクを低減することができる。また、本発明の容器を用いることにより、シート状細胞培養物を皺のない引き伸ばされた状態にすることができるため、積層体を作製する際には皺のよった積層体にならず、対象に適用する際においても皺のない状態で適用に供することができる。さらに、本発明のシート状細胞培養物に付着した液体や洗浄に用いた液体なども１か所から容易に除去することができるため、シート状細胞培養物の洗浄ステップなどの操作も容易にすることができる。 According to the container of the present invention, excess liquid adhering to the sheet-shaped cell culture can be easily removed from the sheet-shaped cell culture. Therefore, in order to remove the liquid adhering to the surface of the sheet-shaped cell culture, the risk of wrinkling, breakage, and tearing can be reduced without bringing a pipette or the like close to the sheet-shaped cell culture. Further, by using the container of the present invention, the sheet-shaped cell culture can be made into a wrinkle-free and stretched state. Therefore, when the laminate is prepared, the laminate does not have wrinkles and is a target. It can be applied without wrinkles even when it is applied to. Further, since the liquid adhering to the sheet-shaped cell culture of the present invention and the liquid used for washing can be easily removed from one place, operations such as the washing step of the sheet-shaped cell culture can be facilitated. be able to.
加えて、本発明の容器によれば、シート状細胞培養物や積層体の位置を固定することができる。そのためシート状細胞培養物や積層体がずれることなどによる皺や破れ、破損のリスクを低減させることができ、また積層体の切り出しステップなどにおいてもより容易に切り出しが可能になる。 In addition, according to the container of the present invention, the position of the sheet-shaped cell culture or the laminate can be fixed. Therefore, the risk of wrinkles, tears, and breakage due to the sheet-like cell culture and the laminate being displaced can be reduced, and the laminate can be cut out more easily in the cutting step.
本発明の一側面は、容器の底面から上方に突出する凸部を有し、凸部の高い位置に該シート状細胞培養物を載置することにより、該シート状細胞培養物に付着する余分な液体を低い方向へ流れさせることができる、シート状細胞培養物の処理に用いるための容器に関する。 One aspect of the present invention has a convex portion that protrudes upward from the bottom surface of the container, and by placing the sheet-shaped cell culture at a high position of the convex portion, an extra that adheres to the sheet-shaped cell culture. The present invention relates to a container for use in the treatment of sheet-like cell cultures, which allows a low-flowing liquid to flow.
本発明において、「シート状細胞培養物」とは、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）体、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、細胞が明確な層構造を示すことなく、細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）配置された状態で存在していてもよい。 In the present invention, the "sheet-like cell culture" refers to cells connected to each other to form a sheet. The cells may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via intervening substances. The intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance capable of at least physically (mechanically) connecting cells to each other, and examples thereof include an extracellular matrix. The mediator is preferably derived from cells, particularly from the cells that make up the cell culture. The cells are at least physically (mechanically) connected, but may be more functionally, for example, chemically or electrically connected. The sheet-like cell culture may be composed of one cell layer (single layer) or two or more cell layers (laminated (multilayer) body, for example, two layers, three layers, etc. It may be 4 layers, 5 layers, 6 layers, etc.). Further, the sheet-shaped cell culture may have a three-dimensional structure having a thickness exceeding the thickness of one cell without showing a clear layered structure of the cells. For example, in the vertical cross section of a sheet-shaped cell culture, cells may be present in a non-uniformly (for example, mosaic-like) arrangement without being uniformly aligned in the horizontal direction.
シート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本開示のシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本開示のシート状細胞培養物は、好ましくは、シート状細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。 Sheet cell cultures preferably do not contain scaffolds. Scaffolds may be used in the art to attach cells to and / or inside the surface and maintain the physical integrity of sheet cell cultures, such as polyvinylidene difluoride. Although membranes made of PVDF) and the like are known, the sheet-shaped cell cultures of the present disclosure can maintain their physical integrity even in the absence of such scaffolds. In addition, the sheet-shaped cell culture of the present disclosure preferably comprises only the cell-derived substances constituting the sheet-shaped cell culture, and does not contain any other substances.
シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたもの（ｉＰＳ細胞由来接着細胞）であってもよい。シート状細胞培養物を構成する細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。ｉＰＳ細胞由来接着細胞の非限定例としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞などが挙げられる。 The cells constituting the sheet-like cell culture are not particularly limited as long as they can form the sheet-like cell culture, and include, for example, adherent cells (adhesive cells). Adhesive cells include, for example, adherent somatic cells (eg, myocardial cells, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells, root membrane cells, gingival cells, bone membrane cells, skin. Cells, synovial cells, chondrocytes, etc.) and stem cells (eg, tissue stem cells such as myoblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as iPS (induced pluripotent stem) cells, mesenchymal stem cells, etc.) And so on. Somatic cells may be stem cells, particularly those differentiated from iPS cells (iPS cell-derived adherent cells). Non-limiting examples of cells constituting the sheet-like cell culture include, for example, myoblasts (eg, skeletal myoblasts), mesenchymal stem cells (eg, bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, skin, hair roots, etc.). Muscle tissue, endometrial membrane, placenta, umbilical cord blood, etc.), myocardial cells, fibroblasts, heart stem cells, embryonic stem cells, iPS cells, synovial cells, chondrocytes, epithelial cells (eg, oral mucosal epithelial cells) , Retinal pigment epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells, etc.), endothelial cells (eg, vascular endothelial cells, etc.), hepatocytes (eg, hepatic parenchymal cells, etc.), pancreatic cells (eg, pancreatic islet cells, etc.), renal cells, adrenal cells , Dental membrane cells, gingival cells, bone membrane cells, skin cells and the like. Non-limiting examples of iPS cell-derived adherent cells include iPS cell-derived myocardial cells, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells, root membrane cells, gingival cells, and bone membrane cells. , Skin cells, synovial cells, cartilage cells and the like.
シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。また、シート状細胞培養物を構成する細胞の種類の数は特に限定されず、１種類のみ細胞で構成されていてもよいが、２種類以上の細胞を用いたものであってもよい。シート状細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の含有比率（純度）は、シート状細胞培養物の形成終了時において、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上である。 The cells that make up the sheet cell culture can be derived from any organism that can be treated with the sheet cell culture. Such organisms include, but are not limited to, for example, humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, sheep, rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, etc. Is included. Further, the number of types of cells constituting the sheet-shaped cell culture is not particularly limited, and only one type of cells may be used, but two or more types of cells may be used. When there are two or more types of cells forming the sheet-shaped cell culture, the content ratio (purity) of the most abundant cells is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably at the end of the formation of the sheet-shaped cell culture. Is 70% or more, more preferably 75% or more.
細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本開示においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本開示の一態様において、細胞は自家細胞である。本開示の別の態様において、細胞は他家細胞である。 The cell may be a heterologous cell or an allogeneic cell. Here, "heterologous cell" means a cell derived from an organism of a species different from the recipient when the sheet-shaped cell culture is used for transplantation. For example, when the recipient is a human, cells derived from monkeys and pigs correspond to heterologous cells. In addition, "homogeneous cell" means a cell derived from an organism of the same species as the recipient. For example, when the recipient is a human, the human cell corresponds to an allogeneic cell. Allogeneic cells include autologous cells (also referred to as autologous cells or autologous cells), ie, recipient-derived cells and allogeneic non-autologous cells (also referred to as allogeneic cells). Autologous cells are preferred in the present disclosure because they do not cause rejection when transplanted. However, it is also possible to utilize heterologous cells and allogeneic non-autologous cells. When using heterologous cells or allogeneic non-autologous cells, immunosuppressive treatment may be required to suppress rejection. In the present specification, cells other than autologous cells, that is, allogeneic non-self-derived cells and allogeneic non-self-derived cells may be collectively referred to as non-autologous cells. In one aspect of the disclosure, the cell is an autologous cell or an allogeneic cell. In one aspect of the disclosure, the cell is an autologous cell. In another aspect of the disclosure, the cell is an allogeneic cell.
シート状細胞培養物は、既知の任意の方法（例えば、特表２００７−５２８７５５、国際公開第２０１７／１３８０２号特開２０１０−０８１８２９、特開２０１１−１１０３６８など参照）で製造することができる。シート状細胞培養物の製造方法は、典型的には、細胞を培養基材上に播種するステップ、播種した細胞をシート化するステップ、形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離するステップを含むが、これに限定されない。細胞を培養基材上に播種するステップの前に、細胞を凍結するステップおよび細胞を解凍するステップを行ってもよい。さらに、細胞を解凍するステップの後に細胞を洗浄するステップを行ってもよい。これら各ステップは、シート状細胞培養物の製造に適した既知の任意の手法で行うことができる。 The sheet-shaped cell culture can be produced by any known method (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-528755, International Publication No. 2017/13802, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-081829, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-10368, etc.). The method for producing a sheet-shaped cell culture is typically a step of seeding cells on a culture substrate, a step of sheeting the seeded cells, and peeling the formed sheet-shaped cell culture from the culture substrate. Includes, but is not limited to, steps. Prior to the step of seeding the cells on the culture medium, a step of freezing the cells and a step of thawing the cells may be performed. In addition, a step of washing the cells may be performed after the step of thawing the cells. Each of these steps can be performed by any known technique suitable for the production of sheet cell cultures.
本発明において、「シート状細胞培養物の処理」とは、シート状細胞培養物を形成してから対象に供されるまでの間に、シート状細胞培養物の状態に変化を与えるための操作を指す。かかる操作は、シート状細胞培養物に付着した余分な液体を除去することを要するあらゆる操作を含み、例えば、これらに限定されないが、シート状細胞培養物の洗浄、シート状細胞培養物を含む積層体の作製および該積層体の切り出しなどが含まれる。
本発明において、「シート状細胞培養物に付着する余分な液体を除去する」とは、シート状細胞培養物の構成に不要である液体を除去することを指し、これらに限定されないが、培養過程、洗浄過程などでシート状細胞培養物を浸漬している液体を除去すること、および浸漬している液体を除去した後、シート状細胞培養物に付着している液体を除去することを含む。本発明において、シート状細胞培養物に付着する余分な液体を除去することには、シート状細胞培養物の組成に含まれる水分を除去することは含まない。
本発明において、液体は、シート状細胞培養物の処理に用いるあらゆる液を含み、これらに限定されないが、例えば、培地、洗浄液、緩衝液、トロンビン液やフィブリノゲン液などの高分子ゲル化可能な化合物を含む液、およびそれらの廃液を含む。これらを総称して液体という場合がある。
In the present invention, "treatment of sheet-shaped cell culture" is an operation for changing the state of sheet-shaped cell culture between the time when the sheet-shaped cell culture is formed and the time when the sheet-shaped cell culture is provided to a subject. Point to. Such operations include, but are not limited to, any operations that require removal of excess liquid adhering to the sheet cell cultures, such as, but not limited to, washing sheet cell cultures, stacking comprising sheet cell cultures. The production of the body and the cutting out of the laminated body are included.
In the present invention, "removing excess liquid adhering to the sheet-shaped cell culture" refers to removing liquid unnecessary for the composition of the sheet-shaped cell culture, and is not limited to, but is limited to, the culture process. This includes removing the liquid in which the sheet-shaped cell culture is immersed in a washing process or the like, and removing the liquid adhering to the sheet-shaped cell culture after removing the immersed liquid. In the present invention, removing the excess liquid adhering to the sheet-shaped cell culture does not include removing the water contained in the composition of the sheet-shaped cell culture.
In the present invention, the liquid includes, but is not limited to, any liquid used for treating sheet-like cell cultures, and is a polymer gelable compound such as a medium, a washing liquid, a buffer solution, a thrombin solution or a fibrinogen solution. Contains liquids containing, and their waste liquids. These may be collectively referred to as a liquid.
本発明において、「容器」とは、内部にシート状細胞培養物、液体などを収容でき、液体が漏出しないものであれば特に限定されず、市販の容器を含む任意のものを用いることができる。容器の材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられるがこれに限定されない。また、容器は、その内部でシート状細胞培養物を処理できるような大きさの底面を有することが好ましく、例えば、シャーレ、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられるがこれに限定されない。容器の底面の面積は、典型的には、１．１３〜７８．５ｃｍ２、好ましくは、１２．６〜７８．５ｃｍ２、より好ましくは、９．１〜６０．８ｃｍ２である。 In the present invention, the "container" is not particularly limited as long as it can contain a sheet-shaped cell culture, a liquid, etc., and the liquid does not leak, and any container including a commercially available container can be used. .. As the material of the container, for example, polyethylene, polypropylene, Teflon (registered trademark), polyethylene terephthalate, polymethylmethacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, polyacrylamide, polydimethylacrylamide, metal ( For example, iron, stainless steel, aluminum, copper, brass) and the like, but are not limited thereto. Further, the container preferably has a bottom surface sized so that a sheet-shaped cell culture can be processed inside the container, and examples thereof include, but are not limited to, a petri dish, a cell culture dish, and a cell culture bottle. The area of the bottom surface of the container is typically 1.13 to 78.5 cm 2 , preferably 12.6 to 78.5 cm 2 , and more preferably 9.1 to 60.8 cm 2 .
本発明において、「凸部」とは、容器の底面から上方に突出し、容器底面に対して高低差を生じさせている部分を指す。本発明において凸部のシート状細胞培養物を載置するための部分を頂部（載置部）と称する。頂部は、シート状細胞培養物を載置するための十分な面積を有する。頂部は、シート状細胞培養物を載置できるものであれば、どのような形状をしていてもよく、平坦な形状であってもよい。一態様において、頂部は緩やかに傾斜している。ここで緩やかに傾斜とは、傾斜している頂部にシート状細胞培養物を載置した際に、該シート状細胞培養物の自重が、シート状細胞培養物と頂部との間の摩擦力などの頂部に止まる力に勝って該シート状細胞培養物が滑り落ちない程度の傾斜であることを指す。頂部が緩やかに傾斜していることにより、シート状細胞培養物に付着した液体は、傾斜に沿って緩やかに低い方向へと流れていく。したがって、付着している液体も傾斜に沿って流れやすくなり、より効率的にシート状細胞培養部に付着した液体を除去することができる。特に、頂部の緩やかな傾斜は、シート状細胞培養物と容器の表面との間に存在する液体を除去することもまた可能にする。一態様において、頂部は緩やかに丸みを帯びている。ここで緩やかに丸みを帯びるとは、載置されたシート状細胞培養物が頂部の形状により傷つかない程度に丸みを帯びていることを指す。頂部は、緩やかに丸みを帯びることにより、シート状細胞培養物を傷つけないようにして緩やかな傾斜を備えることができる。 In the present invention, the "convex portion" refers to a portion that protrudes upward from the bottom surface of the container and causes a height difference with respect to the bottom surface of the container. In the present invention, the portion on which the convex sheet-shaped cell culture is placed is referred to as a top (placement portion). The apex has sufficient area for placing the sheet cell culture. The apex may have any shape or a flat shape as long as the sheet-shaped cell culture can be placed on the top. In one aspect, the apex is gently sloping. Here, the term “gentle inclination” means that when the sheet-shaped cell culture is placed on the inclined top, the weight of the sheet-shaped cell culture is the frictional force between the sheet-shaped cell culture and the top. It means that the sheet-like cell culture has an inclination that does not slip off over the force that stops at the top of the cell. Due to the gentle slope of the apex, the liquid adhering to the sheet-like cell culture flows gently in the lower direction along the slope. Therefore, the adhering liquid also easily flows along the slope, and the liquid adhering to the sheet-shaped cell culture portion can be removed more efficiently. In particular, the gentle slope of the apex also makes it possible to remove the liquid present between the sheet cell culture and the surface of the vessel. In one aspect, the apex is gently rounded. Here, gently rounded means that the placed sheet-shaped cell culture is rounded to the extent that it is not damaged by the shape of the apex. The apex can be gently rounded to provide a gentle slope without damaging the sheet cell culture.
本発明の一態様において、頂部の形状は、少なくともその一部分がドーム状の形状をしている。ここでドーム状の形状とは、最も高い位置である頂点を有し、その頂点から容器の外側に向けて緩やかに傾斜する曲面から構成されていることをいう。すなわち、頂点から容器の外側に向けて徐々に高さが低くなっていくことを指す。このとき載置されたシート状細胞培養物は、頂点に引っかかることで位置が決定される。さらに頂点に引っかかったシート状細胞培養物は、自重で引張され、緩やかに傾斜する曲面に沿って延ばされ、皺がない状態となる。本態様において、シート状細胞培養物を少なくとも一部がドーム状の形状をした頂部に載置した時、シート状細胞培養物に付着した余分な液体のみが、頂部の傾斜した曲面に沿って低い位置に流れ落ちていく。 In one aspect of the present invention, the shape of the top is at least partly dome-shaped. Here, the dome-shaped shape means that it has an apex at the highest position and is composed of a curved surface that gently inclines from the apex toward the outside of the container. That is, it means that the height gradually decreases from the apex to the outside of the container. The position of the sheet-shaped cell culture placed at this time is determined by being caught on the apex. Furthermore, the sheet-like cell culture caught on the apex is pulled by its own weight and stretched along a gently sloping curved surface to be in a wrinkle-free state. In this embodiment, when the sheet cell culture is placed on the apex, which is at least partly dome-shaped, only the excess liquid adhering to the sheet cell culture is low along the sloping curved surface of the apex. It flows down to the position.
本発明において、凸部の材料としては、凸部の頂部にシート状細胞培養物を載置することができるものであれば特に限定はされず、例えば、容器と同じ材料を用いることができる。本発明の一態様において、凸部は、容器と一体成型されていてもよい。
本発明の一態様において、凸部は弾性を有する材料で構成される。弾性を有する材料としては、これらに限定されるものではないが、天然ゴム、合成ゴム（例えば、イソプレンゴム、ブタジエンゴム、スチレン・ブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ニトリルゴム、ブチルゴム、エチレンプロピレンゴム、クロロスルホン化ポリエチレン、フッ素ゴム、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーンゴムなど）などのゴム（特に加硫されたもの）、熱可塑性エラストマーなどが挙げられる。本態様において、凸部は押すことにより形状を歪める。したがって、例えば、凸部に載置したシート状細胞培養物を回収する際に、ヘラやピンセットを、押し込むことで凸部の形状が歪み、シート状細胞培養物と凸部との間に侵入させることができるために、ヘラやピンセットが容易にシート状細胞培養物を回収できるようになる。
In the present invention, the material of the convex portion is not particularly limited as long as the sheet-shaped cell culture can be placed on the top of the convex portion, and for example, the same material as the container can be used. In one aspect of the present invention, the convex portion may be integrally molded with the container.
In one aspect of the invention, the protrusions are made of an elastic material. The elastic material is not limited to these, but natural rubber and synthetic rubber (for example, isoprene rubber, butadiene rubber, styrene-butadiene rubber, chloroprene rubber, nitrile rubber, butyl rubber, ethylene propylene rubber, chlorosulfone). Examples include rubbers (particularly vulcanized rubbers) such as polyethylene chemicals, fluororubbers, and silicone rubbers such as polydimethylsiloxane, and thermoplastic elastomers. In this embodiment, the convex portion distorts its shape by pushing. Therefore, for example, when collecting the sheet-shaped cell culture placed on the convex portion, the shape of the convex portion is distorted by pushing the spatula or tweezers, and the sheet-shaped cell culture is allowed to enter between the convex portion. This allows spatula and tweezers to easily recover sheet-like cell cultures.
本発明の一態様において、容器は、凸部と容器の内面との間に、環状の空間を形成している。ここで、環状の空間とは、頂部を取り囲むようにひとつながりに形成されている空間であれば、どのような形状であってもよい。すなわちシート状細胞培養物に付着した液体は、どの液体も１つの環状の空間に流れ落ちることとなる。ここで、流れ落ちた液体は、環状の空間にて保持される。したがって、流れ落ちた液体により周辺環境を汚染することはない。また、同様に洗浄等の操作において容器に液体を添加した際も、添加された液体は１つの環状の空間に流れ落ちることとなる。流れ落ちた液体は、環状の空間にて保持されるため、そこから容易に液体を回収することが可能となる。 In one aspect of the invention, the container forms an annular space between the convex portion and the inner surface of the container. Here, the annular space may have any shape as long as it is a space formed in a continuous manner so as to surround the top. That is, any liquid adhering to the sheet-shaped cell culture will flow down into one annular space. Here, the liquid that has flowed down is held in the annular space. Therefore, the liquid that has flowed down does not pollute the surrounding environment. Similarly, when a liquid is added to the container in an operation such as cleaning, the added liquid will flow down into one annular space. Since the liquid that has flowed down is held in the annular space, the liquid can be easily recovered from there.
本発明の一態様において、凸部は、頂部の外側に１以上の柱を有する。一態様において、柱は、柱と容器の内面との間で液体の添加および回収の作業を可能とする幅だけ離れた位置にある。一態様において、柱は頂部から、ゲル部分に余白を残して積層体の切り出しが可能となる距離離れた位置にある。
本発明において柱とは、凸部から頂部の外側において突出している部分を指す。柱は、容器内に液体を充填する際に、もしくは液体をピペットなどで容器から抜く際に、液流を緩やかにし、シート状細胞培養物が液流により皺、破損、破れが生じるリスクをさらに低減させることを可能とする。加えて、かかる柱は、積層体を作製する際に、柱を巻き込んで高分子化合物がゲル化することにより、積層体におけるゲル層を固定し、積層体の切り出しをより容易にすることを可能とする。
In one aspect of the invention, the convex portion has one or more columns on the outside of the apex. In one aspect, the column is located between the column and the inner surface of the container by a width that allows the work of adding and retrieving the liquid. In one aspect, the column is located at a distance from the top that allows the laminate to be cut out, leaving a margin in the gel portion.
In the present invention, the pillar refers to a portion protruding from the convex portion to the outside of the apex. Pillars slow the flow of liquid when filling the container with liquid or when removing the liquid from the container with a pipette, further increasing the risk of sheet cell cultures wrinkling, breaking or tearing due to the liquid flow. It is possible to reduce it. In addition, such pillars can fix the gel layer in the laminated body by entraining the pillars and gelling the polymer compound when the laminated body is produced, which makes it easier to cut out the laminated body. And.
本発明において、柱の材料は、シート状細胞培養物の処理において悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されず、例えば、容器と同じ材料を用いることができる。本発明の一態様において、柱は、凸部と一体成型されていてもよい。
本発明の一態様において、柱は弾性を有する材料から構成される。弾性を有する材料としては、これらに限定されるものではないが、天然ゴム、合成ゴム（例えば、イソプレンゴム、ブタジエンゴム、スチレン・ブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ニトリルゴム、ブチルゴム、エチレンプロピレンゴム、クロロスルホン化ポリエチレン、フッ素ゴム、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーンゴムなど）などのゴム（特に加硫されたもの）、熱可塑性エラストマーなどが挙げられる。本態様において、柱は、押すことにより形状を歪め、曲がることができる。したがって、例えば、凸部に載置したシート状細胞培養物を回収する際に、ヘラやピンセットを押し込むことにより、柱は曲がり、ヘラやピンセットがシート状細胞培養物を回収することを妨げず、容易にシート状細胞培養物を回収できるようになる。
In the present invention, the material of the pillar is not particularly limited as long as it does not adversely affect the treatment of the sheet-shaped cell culture, and for example, the same material as the container can be used. In one aspect of the present invention, the pillar may be integrally molded with the convex portion.
In one aspect of the invention, the columns are made of elastic material. The elastic material is not limited to these, but natural rubber and synthetic rubber (for example, isoprene rubber, butadiene rubber, styrene-butadiene rubber, chloroprene rubber, nitrile rubber, butyl rubber, ethylene propylene rubber, chlorosulfone). Examples include rubbers (particularly vulcanized rubbers) such as polyethylene chemicals, fluororubbers, and silicone rubbers such as polydimethylsiloxane, and thermoplastic elastomers. In this embodiment, the pillar can be distorted in shape and bent by pushing. Therefore, for example, when collecting the sheet-shaped cell culture placed on the convex portion, by pushing the spatula or tweezers, the column is bent, and the spatula or tweezers does not prevent the sheet-shaped cell culture from being collected. The sheet-shaped cell culture can be easily collected.
本発明の別の側面は、シート状細胞培養物を載置することにより、該シート状細胞培養物に付着する余分な液体を除去することができる凸部を該容器の底面に有する、シート状細胞培養物の処理に用いるための容器および該容器を収容するための外容器とを含むキットに関する。
一態様において、外容器は密閉することが可能な構造をしていてもよい。一態様において、外容器は内部の無菌性を維持することが可能な構造をしていてもよい。一態様において、外容器は、密閉され、一般エリアにおいて内部に含むシート状細胞培養物を含む容器を無菌的に保持することにより、シート状細胞培養物を含む容器を一般エリアにて汚染されることなく手術室の高度清潔エリアへの持ち込むことを可能にする。
Another aspect of the present invention is a sheet-like structure having a convex portion on the bottom surface of the container capable of removing excess liquid adhering to the sheet-like cell culture by placing the sheet-like cell culture. The present invention relates to a kit containing a container for use in processing a cell culture and an outer container for containing the container.
In one aspect, the outer container may have a structure that can be sealed. In one aspect, the outer container may have a structure capable of maintaining the sterility of the inside. In one embodiment, the outer container is sealed and the container containing the sheet cell culture is contaminated in the general area by aseptically holding the container containing the sheet cell culture contained therein in the general area. Allows you to bring it into a highly clean area of the operating room without having to.
本発明におけるキットは、これらに限定されるものではないが、例えば、培地、洗浄液、緩衝液、細胞培養に使用する器具、輸送容器、使用方法に関する指示などをさらに含んでもよい。
細胞培養に使用する器具としては、例えば、ピペット、セルストレーナー、セルスクレーバーなどが挙げられる。
使用方法に関する指示としては、例えば、使用説明書、製造方法や使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどが挙げられる。
The kit in the present invention is not limited to these, and may further include, for example, a medium, a washing solution, a buffer solution, an instrument used for cell culture, a transport container, instructions on a method of use, and the like.
Examples of instruments used for cell culture include pipettes, cell strainers, and cell scrapers.
Examples of the instruction regarding the usage method include a usage manual, a medium on which information on the manufacturing method and the usage method is recorded, for example, a flexible disc, a CD, a DVD, a Blu-ray disc, a memory card, a USB memory, and the like.
本発明のさらに別の側面は、（ａ）底面から上方に突出する凸部を有する容器の、凸部の高い位置にシート状細胞培養物を載置するステップ、（ｄ）シート状細胞培養物を凸部の高い位置に維持し、該シート状細胞培養物に付着する余分な液体を低い方向へ流れさせるステップを含む、シート状細胞培養物を処理するための方法に関する。
本発明において、容器の凸部の高い位置にシート状細胞培養物を載置し、その状態を維持することにより、シート状細胞培養物の表面に付着する余分な液体は、凸部の高低差に従い、他の操作なしに、低い位置へと流れ落ちていく。本発明の一態様において、容器は、凸部に加えて、凸部の頂部の外側に１つ以上の柱を有する。本発明の一態様において、凸部および／または１つ以上の柱は、弾性を有する。
Yet another aspect of the present invention is (a) a step of placing the sheet-shaped cell culture at a high position of the convex portion of a container having a convex portion protruding upward from the bottom surface, (d) a sheet-shaped cell culture. The present invention relates to a method for treating a sheet-shaped cell culture, which comprises a step of maintaining a high position of a convex portion and allowing excess liquid adhering to the sheet-shaped cell culture to flow in a low direction.
In the present invention, by placing the sheet-shaped cell culture at a high position on the convex portion of the container and maintaining the state, the excess liquid adhering to the surface of the sheet-shaped cell culture has a height difference of the convex portion. According to, it flows down to a lower position without any other operation. In one aspect of the invention, the container has one or more columns on the outside of the top of the convex portion in addition to the convex portion. In one aspect of the invention, the protrusions and / or one or more columns are elastic.
本発明の一態様において、方法は、（ａ）の後で、かつステップ（ｄ）の前に、（ｂ）該シート状細胞培養物が浸漬するまで洗浄液を添加し、該シート状細胞培養物を洗浄するステップ、（ｃ）洗浄液を除去するステップ、をさらに含む。本発明において、洗浄液は、シート状細胞培養物に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されず、例えば、ハンクス平衡塩緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩおよびＨａｍ’ｓ Ｆ−１２などが挙げられる。
本発明の一態様において、洗浄液の添加および／または除去は凸部の頂部の外側から行われる。好ましくは、洗浄液の添加および／または除去は、容器が、凸部の柱のいずれか１つの外側から行われる。さらに好ましくは、洗浄液の添加は、柱のいずれか１つの外側から、シート状細胞培養物が浸漬されるまで徐々に行われ、洗浄液の除去は、柱のいずれか１つの外側から、シート状細胞培養物の周囲から液体がなくなるまで徐々に行われる。
In one aspect of the invention, the method is that after (a) and before step (d), (b) the washing solution is added until the sheet cell culture is immersed, and the sheet cell culture is added. Further includes (c) a step of removing the cleaning liquid. In the present invention, the washing solution is not particularly limited as long as it does not adversely affect the sheet-shaped cell culture, and examples thereof include Hanks equilibrium salt buffer, HEPES, DMEM, RPMI and Ham's F-12. ..
In one aspect of the invention, the addition and / or removal of the cleaning solution is carried out from the outside of the top of the convex portion. Preferably, the addition and / or removal of the cleaning solution is carried out from the outside of any one of the convex columns of the container. More preferably, the addition of the washing solution is gradually carried out from the outside of any one of the columns until the sheet-shaped cell culture is immersed, and the removal of the washing solution is performed from the outside of any one of the columns until the sheet-shaped cells are immersed. Gradually until there is no liquid around the culture.
本発明の一態様において、方法は、ステップ（ｄ）の後に、（ｅ）該シート状細胞培養物上に高分子ゲル化可能な化合物を積層し、積層体を作製するステップをさらに含む。本発明において、高分子ゲル化可能な化合物は、生体に悪影響を与えないものであれば、任意のものを使用することができる。かかる化合物により形成されるゲルとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、フィブリンゲル、ゼラチン、コラーゲンおよびアルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。一態様において、かかる化合物により形成されるゲルは生体内分解性ゲルであり、生体内において分解し、体内へ吸収され、代謝、排泄される。
一態様において、かかる化合物により形成されるゲルは２液を混合することによりゲル化が生じるものである。一態様において、ゲルは室温付近で固化状態にあるものである。一態様において、ゲルは温度による可逆性を示さない。このようなゲルとしては、これらに限定されないが、フィブリノゲン液とトロンビン液を混合させてなるフィブリンゲル、ＮＨＳ化ＣＭデキストリンおよびトレハロース水溶液と炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム水溶液を混合させてなる癒着防止剤などが挙げられる。これらは、例えばボルヒール（登録商標）組織接着用（帝人ファーマ社製）、ベリプラスト（登録商標）組織接着用（ＣＳＬベーリング社製）、アドスプレー（登録商標）（テルモ社製）として商業的に入手可能であり、本発明において使用することができる。本発明において、ゲルは好ましくは、フィブリンゲルである。
In one aspect of the invention, the method further comprises, after step (d), (e) laminating a polymer gelable compound on the sheet cell culture to prepare a laminate. In the present invention, any compound that can be polymerized and gelled can be used as long as it does not adversely affect the living body. Gels formed by such compounds include, but are not limited to, fibrin gels, gelatin, collagen, sodium alginate and the like. In one embodiment, the gel formed by such a compound is an in vivo degradable gel, which is degraded in vivo, absorbed into the body, metabolized and excreted.
In one embodiment, the gel formed by such a compound is gelled by mixing the two liquids. In one aspect, the gel is in a solidified state near room temperature. In one aspect, the gel does not show temperature reversibility. Such gels include, but are not limited to, fibrin gel obtained by mixing fibrinogen solution and thrombin solution, anti-adhesion agent obtained by mixing NHS-modified CM dextrin and trehalose aqueous solution with sodium carbonate and sodium hydrogen carbonate aqueous solution. Can be mentioned. These are commercially available, for example, for Bolheel (registered trademark) tissue bonding (Teijin Pharma Limited), Veriplast (registered trademark) tissue bonding (CSL Bering), and Adspray (registered trademark) (Terumo). It is possible and can be used in the present invention. In the present invention, the gel is preferably a fibrin gel.
本発明の一態様において、方法は、ステップ（ｅ）の後に、（ｆ）該積層体のシート状細胞培養物を含む部分を切り出すステップをさらに含む。一態様において、積層体からの切り出しは、積層体の一部をピンセットで固定し、メスまたはハサミによって行われる。一態様において、積層体からの切り出しは、定型の抜き型を用いて、積層体に押し付けることにより行われる。一態様において、抜き型は大きさを適宜調節できるものであり、シート状細胞培養物の大きさに応じて切り出しの範囲を決定できるものである。大きさが適宜調節できる抜き型とは、例えば、リング状の抜き型であってリングの直径を調節するためのアジャスターを含むものなどが挙げられる。 In one aspect of the invention, the method further comprises (f) cutting out a portion of the laminate containing the sheet cell culture after step (e). In one embodiment, cutting out from the laminate is performed by fixing a part of the laminate with tweezers and using a scalpel or scissors. In one embodiment, cutting from the laminated body is performed by pressing the laminated body against the laminated body using a standard punching die. In one embodiment, the size of the die can be adjusted as appropriate, and the range of cutting can be determined according to the size of the sheet-shaped cell culture. Examples of the punching die whose size can be appropriately adjusted include a ring-shaped punching die including an adjuster for adjusting the diameter of the ring.
本発明の別の側面は、本発明の方法にしたがって処理されたシート状細胞培養物に関する。 Another aspect of the invention relates to sheet cell cultures treated according to the methods of the invention.
本発明の別の側面は、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患を処置する方法であって、本発明の方法により処理されたシート状細胞培養物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む方法に関する（以下、「本発明の処置方法」と称することがある）。 Another aspect of the invention is a method of treating a disease that is ameliorated by the application of a sheet cell culture, which requires an effective amount of the sheet cell culture treated by the method of the invention. It relates to a method including application to the subject (hereinafter, may be referred to as "the treatment method of the present invention").
本発明の処置方法は、本発明の処理方法に従って、シート状細胞培養物を処理するステップをさらに含んでもよい。本発明の処置方法は、シート状細胞培養物を製造するステップの前に、対象からシート状細胞培養物を製造するための細胞または細胞の供給源となる組織を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象とは異種の個体である。 The treatment method of the present invention may further include the step of treating the sheet-like cell culture according to the treatment method of the present invention. The treatment method of the present invention may further include collecting cells from a subject or a tissue from which the cells are supplied, prior to the step of producing the sheet-shaped cell culture. .. In one embodiment, the subject from which the cell or tissue from which the cell is source is collected is the same individual as the subject to whom the sheet-like cell culture or composition is administered. In another embodiment, the subject from which the cell or tissue from which the cell is source is collected is a separate entity of the same species as the subject receiving the administration, such as a sheet cell culture or composition. In another embodiment, the subject from which the cell or the tissue from which the cell is source is collected is an individual different from the subject to which the sheet-like cell culture or composition is administered.
本発明において、用語「対象」は、任意の生物個体、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体を意味する。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）の処置が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。 In the present invention, the term "subject" means any individual organism, preferably an animal, more preferably a mammal, even more preferably a human. In the present invention, the subject may be healthy or suffer from some disease, but the disease improved by the application of the sheet-like cell culture (for example, a disease related to tissue abnormality). When the treatment is intended, it typically means a subject who has or is at risk of developing the disease.
また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。 Also, the term "treatment" shall include all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions aimed at curing, transient remission or prevention of disease. For example, the term "treatment" refers to delaying or stopping the progression of a disease that is ameliorated by the application of sheet cell culture (eg, a disease associated with tissue abnormalities), regression or disappearance of a lesion, or the onset of the disease. Includes medically acceptable interventions for a variety of purposes, including prevention or prevention of recurrence.
本発明において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、シート状細胞培養物のサイズや重量、枚数など）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。 In the present invention, the effective amount is, for example, an amount capable of suppressing the onset or recurrence of a disease, reducing symptoms, or delaying or stopping the progression (for example, size, weight, number of sheet-shaped cell cultures, etc.). The amount is preferably an amount that prevents the onset and recurrence of the disease or cures the disease. In addition, an amount that does not cause an adverse effect exceeding the benefit of administration is preferable. Such an amount can be appropriately determined by, for example, a test in an experimental animal such as a mouse, a rat, a dog or a pig, or a disease model animal, and such a test method is well known to those skilled in the art. In addition, the size of the tissue lesion to be treated can be an important index for determining the effective amount.
適用方法としては、典型的には組織への直接的な適用が挙げられる。適用頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合などには、複数のシートを適用することも可能である。組織への直接的な適用は、例えば本発明のシート状細胞培養物等を組織の疾患部位に貼付するように適用する方法などが用いられる。 The application method typically includes direct application to an organization. The application frequency is typically once per treatment, but it is possible to apply a plurality of sheets when the desired effect is not obtained. For direct application to tissues, for example, a method of applying the sheet-shaped cell culture of the present invention or the like so as to be attached to a diseased part of tissues is used.
処置の対象となる組織（適用組織）としては、限定されずに、例えば、心臓（心筋）、角膜、網膜、食道、皮膚、関節、軟骨、肝臓、膵臓、歯肉、腎臓、甲状腺、骨格筋、中耳などが挙げられる。また、処置の対象となる疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患（例えば、心筋傷害（心筋梗塞、心外傷等）、心筋症（虚血性心筋症、拡張型心筋症、拡張相肥大型心筋症等）など）、角膜疾患（例えば、角膜上皮幹細胞疲弊症、角膜損傷（熱・化学腐食）、角膜潰瘍、角膜混濁、角膜穿孔、角膜瘢痕、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡など）、網膜疾患（例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症など）、食道疾患（例えば、食道手術（食道ガン除去）後の食道の炎症・狭窄の予防など）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷（外傷、熱傷）など）、関節疾患（例えば、変形性関節炎など）、軟骨疾患（例えば、軟骨の損傷など）、肝疾患（例えば、慢性肝疾患など）、膵臓疾患（例えば、糖尿病など）、歯科疾患（例えば、歯周病など）、腎臓疾患（例えば、腎不全、腎性貧血、腎性骨異栄養症など）、甲状腺疾患（例えば、甲状腺機能低下症など）、筋疾患（例えば、筋損傷、筋炎など）、中耳疾患（例えば、中耳炎など）が挙げられる。 The tissue to be treated (applicable tissue) is not limited, for example, heart (myocardium), cornea, retina, esophagus, skin, articular cartilage, liver, pancreas, gingiva, kidney, thyroid gland, skeletal muscle, etc. The middle ear and the like can be mentioned. The diseases to be treated include, for example, heart diseases (for example, myocardial injuries (myocardial infarction, cardiac trauma, etc.)) and myocardial diseases (ischemic myocardial disease, dilated myocardial disease, dilated phase fertilizer). (Major myocardial disease, etc.), Corneal disease (eg, corneal epithelial stem cell exhaustion, corneal injury (heat / chemical corrosion), corneal ulcer, corneal opacity, corneal perforation, corneal scar, Stevens Johnson syndrome, ocular herbitis ), Retinal diseases (eg, retinal pigment degeneration, age-related yellow spot degeneration, etc.), esophageal diseases (eg, prevention of esophageal inflammation / stenosis after esophageal surgery (removal of esophageal cancer)), skin diseases (eg, prevention Skin damage (trauma, burns, etc.), joint disease (eg, osteoarthritis), cartilage disease (eg, cartilage damage), liver disease (eg, chronic liver disease), pancreatic disease (eg, diabetes, etc.) ), Dental disease (eg periodontal disease), kidney disease (eg renal failure, renal anemia, renal osteodystrophy, etc.), thyroid disease (eg, hypothyroidism), muscle disease (eg, hypothyroidism) , Muscle injury, myitis, etc.), middle ear diseases (eg, middle ear inflammation, etc.).
適用組織が心臓などの臓器である場合など、適用箇所が拍動や蠕動運動などにより頻繁に動く場合、本開示のシート状細胞培養物等を貼付するだけでは適用箇所から脱落してしまう場合がある。したがって本発明の処置方法の好ましい一態様において、本発明のシート状細胞培養物等を疾患部位に適用した後、貫通部位に縫合針などを通して本開示のシート状細胞培養物等を縫合固定することが含まれる。これにより疾患部位に適用された本開示のシート状細胞培養物等が、適用箇所から脱落することを防止できる。 When the application site moves frequently due to beating or peristaltic movement, such as when the application tissue is an organ such as the heart, the application site may fall off from the application site simply by attaching the sheet-shaped cell culture or the like of the present disclosure. is there. Therefore, in a preferred embodiment of the treatment method of the present invention, after applying the sheet-shaped cell culture or the like of the present invention to the diseased site, the sheet-shaped cell culture or the like of the present disclosure is sutured and fixed through a suture needle or the like through the penetrating site. Is included. As a result, it is possible to prevent the sheet-shaped cell culture or the like of the present disclosure applied to the diseased part from falling off from the applied part.
以下に本発明の好適な実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明する。
［第１実施形態］
まず、本発明の第１実施形態について説明する。
図１は、本発明の第１実施形態に係る容器の上面図および断面図である。なお、本開示における各図において、説明を容易とするため、各部材の大きさは、適宜強調されており、図示の各部材は実際の大きさを示すものではない。
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
[First Embodiment]
First, the first embodiment of the present invention will be described.
FIG. 1 is a top view and a cross-sectional view of the container according to the first embodiment of the present invention. In addition, in each figure in this disclosure, the size of each member is emphasized as appropriate for easy explanation, and each member in the figure does not show an actual size.
図１に示すように、本発明の第１実施形態に係る容器１は、容器の底面から上方に突出する凸部２を有し、凸部２の高い位置にシート状細胞培養物３を載置することにより、該シート状細胞培養物に付着する余分な液体を低い方向へ流れさせることができる。容器１は、その底面の中央に凸部を有する汎用シャーレ状の容器であり、シート状細胞培養物および液体などを収容できる収容空間を構成する。凸部２は、シート状細胞培養物を載置する頂部２１を有している。ここで頂部２１は、ドーム状の形状をしており、その表面は、緩やかな丸みを帯びており、そのもっとも位置が高くなっている部分である頂点２２から容器の外側に向けて緩やかに傾斜している。本実施形態においては、凸部２が容器の底面の中央に位置しており、頂部２１と容器の間に環状につながった空間が形成されている。したがって、シート状細胞培養物３から流れ落ちる液体は連通し、一か所から回収することができる。
As shown in FIG. 1, the
次に本実施形態の容器の使用例を示す。
（１）シート状細胞培養物に付着した余分な液体の除去について
本実施形態において、まずはじめに別容器にて作成したシート状細胞培養物３を、本実施形態に係る容器の凸部２の頂部２１に載置する。シート状細胞培養物３を載置する位置としては、図１においては凸部の中央に載置しているが、これに限られない。シート状細胞培養物を頂点２２に引っかけるために、好ましくは、頂点２２にシート状細胞培養物の一部が位置するように載置する。このときに、別容器にてシート状細胞培養物に付着していた余分な液体は、頂部２１から容器の外側へと向かう傾斜した曲面に沿って容器の低い位置へ流れ落ちていき、したがってシート状細胞培養物に付着した余分な液体を除去することができる。さらに、シート状細胞培養物３の一部が頂点２２に位置するように載置することにより、シート状細胞培養物３は、頂点２２に引っかかった状態で、自重で伸びていき、頂部２１の傾斜した曲面に沿って皺が引き伸ばされていく。
Next, an example of using the container of this embodiment is shown.
(1) Removal of excess liquid adhering to the sheet-shaped cell culture In the present embodiment, first, the sheet-shaped
（２）シート状細胞培養物の洗浄について
本実施形態に係る容器を用いて、シート状細胞培養物の洗浄を行うことができる。、使用者は、上記（１）と同様にシート状細胞培養物３を凸部の頂部２１に載置し、次に洗浄液を容器内に徐々に添加していく。液位がシート状細胞培養物３が浸漬する程度まで上がると、シート状細胞培養物３に付着している成分は洗浄液にて洗い流される。次いで容器から徐々に洗浄液を抜いていく。このとき、洗浄液を頂部の外側から添加および／または除去することで、洗浄液を添加および／または除去する際に生じる液流によるシート状細胞培養物への影響を最小限にしてもよい。ここで頂部２１の外側は、液体が連通することができる環状の空間が形成されているため、1か所から液体を回収し、容器から除去することができる。このときシート状細胞培養物３は、凸部２の頂点２２に引っかかることで止まり、シート状細胞培養物３に付着していた成分を含む洗浄液が除去される。さらにシート状細胞培養物３に付着している洗浄液も頂点２１から容器の外側へと向かう傾斜した曲面に沿って流れ落ちていくため、ピペットなどの器具をシート状細胞培養物３へと近づけることなく頂部２１の外側から洗浄液を除去することができる。これらの操作を１以上の回数行うことにより、シート状細胞培養物は、洗浄される。また洗浄液で浸漬させる際にシート状細胞培養物３にわずかに皺が生じたとしても、凸部２の頂部２１に引っかかる際に、自重により頂部２１の傾斜した曲面に沿って皺が引き伸ばされていく。
(2) Washing of sheet-shaped cell culture The sheet-shaped cell culture can be washed using the container according to the present embodiment. The user places the sheet-shaped
（３）シート状細胞培養物と高分子ゲル化可能な化合物との積層体の作製について
また、本実施形態に係る容器を用いて、シート状細胞培養物３上に高分子ゲル化可能な化合物を積層し、積層体を作製することができる。使用者は、シート状細胞培養物３を凸部の頂部２１に載置し、次に高分子ゲル化可能な化合物をシート状細胞培養物３上に添加する。このとき上述したように、シート状細胞培養物３に付着している余分な液体は、容器の低い位置へと流れ落ちているため、そのような液体が添加される化合物と反応することも、その液体により化合物の濃度が薄まることもない。加えて、シート状細胞培養物３が載置されている頂部２１は、頂点２２を最も高い位置として緩やかに傾斜しているため、粘性を有する該化合物を頂点２２から添加することにより、傾斜した曲面に沿って緩やかにシート状細胞培養物３全体にわたって広がっていく。
(3) Preparation of a laminate of a sheet-shaped cell culture and a compound capable of polymer gelling Further, a compound capable of polymer gelling on a sheet-shaped
（４）積層体の切り出しについて
さらに、本実施形態に係る容器を用いて、シート状細胞培養物３と高分子ゲル化可能な化合物とで作製した積層体を切り出すことができる。上述したようにシート状細胞培養物３と高分子ゲル化可能な化合物との積層体を作製した後、シート状細胞培養物３に付着した余分な液体が流れ落ちていること、特に、頂部２１が傾斜していることによりシート状細胞培養物と容器との間の余分な液体が流れ落ちているために、シート状細胞培養物３は、切り出し操作において液体に滑るなどして、押し出され難く積層体の切り出しが容易になる。さらにはシート状細胞培養物３を頂点２２に引っかけることにより、シート状細胞培養物３の位置はより強固に固定され、さらに容易に切り出し操作を行うことができる。加えて、積層体を作製した後、ゲル化していない化合物を洗い流すためにさらに洗浄作業を行ったとしても、（２）にて上述したように洗浄液が、積層体のシート状細胞培養物を含む部分に残らないため、切り出し作業に影響を与えることがない。
(4) Cutting out of the laminate Further, using the container according to the present embodiment, it is possible to cut out the laminate prepared by the sheet-shaped
［第２実施形態］
次に、本発明の第２実施形態について説明する。
図２は、本発明の第２実施形態に係る容器の上面図および断面図である。なお、本開示における各図において、説明を容易とするため、各部材の大きさは、適宜強調されており、図示の各部材は実際の大きさを示すものではない。
また、図中、第１実施形態に係る容器１の構成と同一の構成については、同一の符号を付し、以下、第１実施形態との相違点について詳細に説明し、同様の事項については、説明を省略する。
[Second Embodiment]
Next, the second embodiment of the present invention will be described.
FIG. 2 is a top view and a cross-sectional view of the container according to the second embodiment of the present invention. In addition, in each figure in this disclosure, the size of each member is emphasized as appropriate for easy explanation, and each member in the figure does not show an actual size.
Further, in the figure, the same configurations as those of the
図２に示すように、本発明の第２実施形態に係る容器１は、シート状細胞培養物３を載置する部分の外側に柱４をさらに含む。
As shown in FIG. 2, the
次に本実施形態の容器の使用例を示す。
（１）シート状細胞培養物の洗浄について
本実施形態に係る容器を用いて、シート状細胞培養物の洗浄を行うことができる。使用者は、第１実施形態の（１）に記載したように、シート状細胞培養物３を凸部の頂部２１に載置し、次に洗浄液を柱４の外側から徐々に添加していく。ここで、液を添加する際の流れによる勢いは、柱４によって緩められる。液位がシート状細胞培養物３が浸漬する程度まで上がると、次いで柱４の外側から徐々に洗浄液を抜いていく。これらの操作により第１実施形態の（２）にて記載したようにシート状細胞培養物３は洗浄される。
Next, an example of using the container of this embodiment is shown.
(1) Washing of sheet-shaped cell culture The sheet-shaped cell culture can be washed using the container according to the present embodiment. As described in (1) of the first embodiment, the user places the sheet-shaped
（２）シート状細胞培養物と高分子ゲル化可能な化合物との積層体の作製について
また、本実施形態に係る容器を用いて、シート状細胞培養物３と高分子ゲル化可能な化合物とで積層体を作製することができる。積層体の作製の方法については、第1実施形態（３）に記載したとおりであるが、本実施形態においては高分子ゲル化可能な化合物は、柱４を巻き込む形でゲル化する。
（３）積層体の切り出しについて
さらに、本実施形態に係る容器を用いて、シート状細胞培養物３とゲルとで作製した積層体を切り出すことができる。積層体のゲル部分が柱を巻き込む形でゲル化していることから、シート状細胞培養物３の位置がゲル部分により第１実施形態における切り出し時よりさらに固定され、切り出し操作により押し出されることはなく、より容易に切り出し操作を行うことができる。また、切り出し操作によりシート状細胞培養物３が動くことがないため、抜き型を押し込むようにして積層体を切り出すことも可能となる。例えば抜き型は大きさを自在に設定できるものであり、シート状細胞培養物の大きさに応じて切り出しを行うことができる。
(2) Preparation of a laminate of a sheet-shaped cell culture and a compound capable of polymer gelling Further, using the container according to the present embodiment, a sheet-shaped
(3) Cutting out of the laminated body Further, using the container according to the present embodiment, the laminated body prepared by the sheet-shaped
符号の説明
１ 容器
２ 凸部
２１ 頂部
２２ 頂点
３ シート状細胞培養物
４ 柱
Description of
Claims (16)
容器の底面から上方に突出する凸部を有し、
凸部の高い位置に該シート状細胞培養物を載置することにより、該シート状細胞培養物に付着する余分な液体を低い方向へ流れさせることができる、前記容器。 A container for use in the treatment of sheet-like cell cultures.
It has a convex part that protrudes upward from the bottom of the container,
By placing the sheet-shaped cell culture at a high position on the convex portion, the excess liquid adhering to the sheet-shaped cell culture can flow in a low direction.
容器の底面から上方に突出する凸部を有し、
該凸部に、該シート状細胞培養物を載置させる載置部と、
該載置部の周囲を取り囲むように設けられた液体が保持される空間を有する、前記容器。 A container for use in the treatment of sheet-like cell cultures.
It has a convex part that protrudes upward from the bottom of the container,
A mounting portion on which the sheet-shaped cell culture is placed on the convex portion,
The container having a space for holding a liquid provided so as to surround the mounting portion.
（ａ）底面から上方に突出する凸部を有する容器の、凸部の高い位置にシート状細胞培養物を載置するステップ、
（ｄ）シート状細胞培養物を凸部の高い位置に維持し、該シート状細胞培養物に付着する余分な液体を低い方向へ流れさせるステップ、
を含む、前記方法。 A method for treating sheet cell cultures, such as:
(A) A step of placing a sheet-like cell culture at a high position of the convex portion of a container having a convex portion protruding upward from the bottom surface.
(D) A step of maintaining the sheet-shaped cell culture at a high position on the convex portion and allowing excess liquid adhering to the sheet-shaped cell culture to flow in a low direction.
The method described above.
（ｂ）該シート状細胞培養物が浸漬するまで洗浄液を添加し、該シート状細胞培養物を洗浄するステップ、
（ｃ）洗浄液を除去するステップ、
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。 After step (a) and before step (d),
(B) A step of adding a washing solution until the sheet-shaped cell culture is immersed and washing the sheet-shaped cell culture.
(C) Step of removing cleaning liquid,
10. The method of claim 10.
（ｅ）該シート状細胞培養物上に高分子ゲル化可能な化合物を積層し、積層体を作製するステップ、
をさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。 After step (d)
(E) A step of laminating a compound capable of polymer gelling on the sheet-shaped cell culture to prepare a laminate.
The method according to any one of claims 10 to 12, further comprising.
（ｆ）該積層体のシート状細胞培養物を含む部分を切り出すステップ、
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。 After step (e)
(F) A step of cutting out a portion of the laminate containing the sheet-like cell culture.
13. The method of claim 13.
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