JP2020537654A - アンチセンス送達のための細胞透過性ペプチド - Google Patents

Abstract

オリゴヌクレオチド、細胞透過性ペプチドおよびペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、本明細書において提供される。それを必要とする被験体において、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を処置する方法であって、被験体に、本明細書において記載されているオリゴヌクレオチド、ペプチドおよびペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与するステップを含む、方法も、本明細書において提供される。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に共有結合的に結合しているオリゴヌクレオチドを含む、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、本明細書において提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月１７日に出願された米国仮出願第６２／５７３，３７９号の優先権を主張するものであり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

アンチセンス技術は、選択的スプライス産物を含む１つまたは複数の特異的な遺伝子産物の発現をモジュレートするための手段を提供し、いくつかの治療的、診断的および研究適用において独自に有用である。アンチセンス技術の背後にある原理は、標的核酸とハイブリダイズするアンチセンス化合物、例えばオリゴヌクレオチドが、いくつかのアンチセンス機構のいずれか１つを通して、転写、スプライシングまたは翻訳等の遺伝子発現活性をモジュレートすることである。アンチセンス化合物の配列特異性は、それらを、標的検証および遺伝子機能化のためのツール、ならびに疾患に関与する遺伝子の発現を選択的にモジュレートするための治療薬として、魅力的なものにする。

アンチセンス技術の分野においては著しい進歩が為されてきたが、当該技術分野において、改善されたアンチセンスまたはアンチジーン性能を有するオリゴヌクレオチドおよびペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが依然として必要である。

細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に共有結合的に結合しているオリゴヌクレオチドを含む、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、本明細書において提供される。それを必要とする被験体において疾患を処置する方法であって、被験体に、本明細書において記載されているペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与するステップを含む、方法も、本明細書において提供される。

したがって、一態様では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
または薬学的に許容されるその塩
［式中、Ａ’は、
であるか、またはＥ’は、
であり、
式中、Ｌは、Ｊのアミノ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_１〜６−Ｃ_１〜６−ヘテロ芳香族−（ＣＨ_２）_１〜６Ｃ（Ｏ）であり、
各Ｊは、各出現において独立して、アルギニン、グリシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リシン、グルタミン、グルタミン酸、セリン、プロリン、バリン、イソロイシン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸およびトレオニンからなる群より選択され、
ｔは、５〜２７であり、
少なくとも１つのＪは、アルギニンである］
が、本明細書において提供される。

一実施形態では、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_１〜６−トリアゾール−（ＣＨ_２）_１〜６Ｃ（Ｏ）である。

一実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式Ｉａのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
または薬学的に許容されるその塩
［式中、（Ｊ）_ｔ−Ｇは、上で定義した通りの細胞透過性ペプチドである］
である。

別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式Ｉｂのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
または薬学的に許容されるその塩
［式中、（Ｊ）_ｔ−Ｇは、上で定義した通りの細胞透過性ペプチドである］
である。

さらに別の態様では、それを必要とする被験体において、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を処置する方法であって、被験体に、本開示のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。

図１Ａは、エクソンスキッピングに対してフルオロフォア付着または機能的ＰＭＯのいずれかを有するＣＰＰ有効性を比較するためのワークフローを示す。図１Ｂは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの一種であるＰＭＯの基本構造を示す。 図１Ｃは、本明細書において提供される通りのＰＭＯおよびＣｙ５．５の構造の比較を示す。図１Ｄは、機能的エクソンスキッピングについてのｅＧＦＰアッセイの記載を示す。 図１Ｅは、Ｃｙ５．５カーゴまたはＰＭＯ ＩＶＳ２−６５４カーゴのいずれかを有する１３のＣＰＰの比較を示す。 図２Ａは、アンチセンス送達のための計算的に導出されたペプチド配列の開発のためのワークフローのスキーム、および試験セットに基づくモデルの性能測定基準を示す。図２Ｂは、５つの予測されたＰＭＯ担体（ＰＰＣ）および２つの予測された陰性配列（ＮＳ）の表を示す。図２Ｃは、血清含有培地中のＰＰＣおよびＮＳのそれぞれにより５μＭの濃度で処理されたｅＧＦＰ ＨｅＬａ細胞の平均蛍光強度を示す。 図３Ａは、ＰＰＣの取り込みに対する温度の効果を示す。図３Ｂは、ＰＰＣの取り込みに対するサイトカラシンＤの効果を示す。

タンパク質および核酸等の多くの薬学的に活性な化合物の効率的な細胞内送達は、薬物送達の分野において未解決の課題である。多くの大型の巨大分子は、原形質膜を横切ることができず、多くの場合、エンドソームに捕捉されて終わり、リソソーム内で分解される。過去数十年にわたって、分子に高密度の電荷を過給すること、分子をリポソームまたはナノ粒子等の送達ビヒクルと複合体化すること、および細胞透過性ペプチドにコンジュゲートすることを含む、大型の巨大分子の細胞質送達を促進するための複数のアプローチが開発されている。

ＨＩＶ−１からのトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）の２０アミノ酸断片により、タンパク質が原形質膜を横切ることができたという発見以来、何百もの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が細胞質への移入を改善することが報告されている。これらのペプチドは、ウイルスタンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、シグナルペプチドおよび抗菌ペプチド等の多くの天然供給源に由来していた。加えて、ＣＰＰは、合理的に設計され、ＤＮＡでコードされたペプチドライブラリーから同定されている。ＣＰＰ配列は、多種多様な物理化学的特性を呈し、高度にカチオン性〜両親媒性〜疎水性の範囲に及ぶ。ペプチドが細胞透過性ペプチドであることを確認するために、伝統的な実験は、フローサイトメトリーおよびフルオロフォア標識されたＣＰＰを使用する生細胞共焦点イメージングを含んでいた（例えば、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅおよび図２Ｃを参照）。これらの実験は細胞透過の証拠を提供するが、これらは、ＣＰＰが特定の巨大分子カーゴの送達に好適であるか否かという問いに対処できない。それにもかかわらず、ＣＰＰは、ペプチド、酵素、抗体、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子および化学療法薬の細胞送達を改善するために利用されてきた。

ＣＰＰの１つの有望な適用は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）の送達のためである。ＰＭＯは、リボース糖がメチレンモルホリン環で置き換えられ、ホスホジエステル骨格がホスホロジアミデート骨格で置き換えられている、電荷中性アンチセンス治療薬である。ＰＭＯは、プレｍＲＮＡに結合し、「エクソンスキッピング」として公知であるプロセスを通して遺伝子スプライシングを変更することができる。最近、ＰＭＯエテプリルセンは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１をスキップすることにより、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の根本的な遺伝子的原因を処置するための最初で唯一のＦＤＡ承認療法となった。エテプリルセン等のＰＭＯ療法は顕著な有望性を示すが、必要とされる投薬量は、多くの場合、限定された細胞内送達により、１週間当たり複数グラムである。ＣＰＰとＰＭＯとの間にコンジュゲートを作出することは、送達を改善する際における１つの有効なアプローチとされてきた。O’Donovanらは、１６の異なるＣＰＰ−ＰＭＯコンジュゲートのわずかなライブラリーに注目し、Moultonらは、ＤＭＤのためにＰＭＯカーゴの送達を改善したアルギニンリッチペプチドを同定した。しかしながら、ＰＭＯ送達を促進するＣＰＰの特色の体系的な調査はまだない。

細胞透過性ペプチドに共有結合的に結合しているオリゴヌクレオチドを含む、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、本明細書において提供される。それを必要とする被験体において疾患を処置する方法であって、被験体に、本明細書において記載されているペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与するステップを含む、方法も、本明細書において提供される。本明細書において記載されているオリゴヌクレオチドおよびそれによりペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、天然または修飾されていないオリゴヌクレオチドと比べて、配列選択性を損なわずにＤＮＡおよびＲＮＡに対するより強い親和性を示す。一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨによる開裂を最小化または防止する。一部の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨを活性化しない。

本明細書において記載されているペプチドは、それらの対応するペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに、より低い毒性を付与し、オリゴヌクレオチドの活性を強化し、薬物動態および組織分布を改善し、細胞送達を改善し、信頼性も高く制御可能でもあるｉｎ ｖｉｖｏ分布を付与する。

定義
本開示を記載するために使用される種々の用語の定義を、以下に列挙する。これらの定義は、具体的な事例において別段限定されない限り、個々にまたはより大きい群の一部としてのいずれかで、本明細書および特許請求の範囲の全体を通して使用される場合の用語に当てはまる。

用語「約」は、当業者には理解され、それが使用される文脈によってある程度変動する。本明細書で使用される場合、量、時間的持続期間等の測定可能な値に言及する際、用語「約」は、指定値から±５％、±１％および±０．１％を含む±２０％または±１０％の変動を包含することを意味するが、これは、そのような変動が、開示されている方法を実施するために適切であるからである。

用語「アルキル」は、ある特定の実施形態では、１〜６個または１〜８個の間の炭素原子をそれぞれ含有する、飽和、直鎖または分枝鎖炭化水素部分を指す。Ｃ_１〜６−アルキル部分の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル部分を含むがこれらに限定されず、Ｃ_１〜８−アルキル部分の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ヘプチルおよびオクチル部分を含むがこれらに限定されない。

アルキル置換基における炭素原子の数は、接頭辞「Ｃ_ｘ〜ｙ」によって示すことができ、ｘは、置換基における炭素原子の最小数であり、ｙは、最大数である。同様に、Ｃ_ｘ鎖は、ｘ個の炭素原子を含有するアルキル鎖を意味する。

用語「へテロアルキル」は、それ自体がまたは別の用語と組み合わせて、別段の記載がない限り、記載されている数の炭素原子ならびにＯ、ＮおよびＳからなる群より選択される１個または２個のヘテロ原子からなる、安定な直鎖または分枝鎖アルキル基を意味し、窒素および硫黄原子は、必要に応じて酸化されていてよく、窒素ヘテロ原子は、必要に応じて四級化されていてよい。ヘテロ原子は、ヘテロアルキル基の残りとそれが付着している断片との間を含むヘテロアルキル基の任意の位置に置かれ、かつヘテロアルキル基における最も遠位の炭素原子に付着されていてよい。例は、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＨ、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_３および−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ_３を含む。例えば、−ＣＨ_２−ＮＨ−ＯＣＨ_３または−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ_３等、最大２個のヘテロ原子が連続してよい。

用語「アリール」は、単独でまたは他の用語と組み合わせて用いられ、別段の記載がない限り、１個または複数の環（典型的には、１、２または３個の環）を含有する炭素環式芳香族系を意味し、そのような環は、ビフェニル等、ペンダント様式で一緒に付着されていてよく、または、ナフタレン等、縮合されていてよい。アリール基の例は、フェニル、アントラシルおよびナフチルを含む。種々の実施形態では、アリール基の例は、フェニル（例えば、Ｃ_６−アリール）およびビフェニル（例えば、Ｃ_１２−アリール）を含んでよい。一部の実施形態では、アリール基は、６〜１６個の炭素原子を有する。一部の実施形態では、アリール基は、６〜１２個の炭素原子を有する（例えば、Ｃ_６〜１２−アリール）。一部の実施形態では、アリール基は、６個の炭素原子を有する（例えば、Ｃ_６−アリール）。

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」は、芳香族の特徴を有する複素環を指す。ヘテロアリール置換基は、炭素原子の数によって定義されてよく、例えば、Ｃ_１〜９−ヘテロアリールは、ヘテロ原子の数を含まず、ヘテロアリール基に含有される炭素原子の数を示す。例えば、Ｃ_１〜９−ヘテロアリールは、追加で１〜４個のヘテロ原子を含むことになる。多環式ヘテロアリールは、部分的に飽和した１個または複数の環を含んでよい。ヘテロアリールの非限定的な例は、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル（例えば、２−および４−ピリミジニルを含む）、ピリダジニル、チエニル、フリル、ピロリル（例えば、２−ピロリルを含む）、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル（例えば、３−および５−ピラゾリルを含む）、イソチアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，３，４−トリアゾリル、テトラゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリルおよび１，３，４−オキサジアゾリルを含む。

多環式複素環およびヘテロアリールの非限定的な例は、インドリル（例えば、３−、４−、５−、６−および７−インドリルを含む）、インドリニル、キノリル、テトラヒドロキノリル、イソキノリル（例えば、１−および５−イソキノリルを含む）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリル、シンノリニル、キノキサリニル（例えば、２−および５−キノキサリニルを含む）、キナゾリニル、フタラジニル、１，８−ナフチリジニル、１，４−ベンゾジオキサニル、クマリン、ジヒドロクマリン、１，５−ナフチリジニル、ベンゾフリル（例えば、３−、４−、５−、６−および７−ベンゾフリルを含む）、２，３−ジヒドロベンゾフリル、１，２−ベンズイソオキサゾリル、ベンゾチエニル（例えば、３−、４−、５−、６−および７−ベンゾチエニルを含む）、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル（例えば、２−ベンゾチアゾリルおよび５−ベンゾチアゾリルを含む）、プリニル、ベンズイミダゾリル（例えば、２−ベンズイミダゾリルを含む）、ベンゾトリアゾリル、チオキサンチニル、カルバゾリル、カルボリニル、アクリジニル、ピロリジジニルおよびキノリジジニルを含む。

用語「保護基」または「化学保護基」は、化合物の一部またはすべての反応性部分をブロックし、保護基が除去されるまで、そのような部分が化学反応に関わるのを防止する化学部分、例えば、Ｔ．Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ， Ｐ．Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ３ｒｄ ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９９）において列挙され記載されている部分を指す。異なる保護基が用いられる場合、各（異なる）保護基は異なる手段によって除去可能であることが有利であり得る。全く異質な反応条件下で開裂される保護基は、そのような保護基の差次的な除去を可能にする。例えば、保護基は、酸、塩基および水素化分解によって除去され得る。トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、アセタールおよびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル等の基は、酸不安定性であり、水素化分解によって除去可能なＣｂｚ基および塩基不安定性であるＦｍｏｃ基で保護されたアミノ基の存在下、カルボキシおよびヒドロキシ反応性部分を保護するために使用されてよい。カルボン酸部分は、限定なく、メチルまたはエチル等の塩基不安定性基でブロックされてよく、ヒドロキシ反応性部分は、カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル等の酸不安定性基でブロックされたアミンの存在下、アセチル等の塩基不安定性基で、または、酸および塩基の両方に安定であるが加水分解的に除去可能なカルバメートで、ブロックされてよい。

カルボン酸およびヒドロキシル反応性部分は、ベンジル基等の加水分解的に除去可能な保護基でブロックされてもよく、一方、アミン基は、Ｆｍｏｃ等の塩基不安定性基でブロックされてよい。式（Ｉ）の化合物の合成に特に有用なアミン保護基は、トリフルオロアセトアミドである。カルボン酸反応性部分は、２，４−ジメトキシベンジル等の酸化的に除去可能な保護基でブロックされてよく、一方、共存するアミノ基は、フッ化物不安定性シリルカルバメートでブロックされてよい。

アリルブロッキング基は、酸および塩基保護基の存在下で有用であり、これは、前者が安定であり、その後金属またはパイ酸触媒によって除去され得るからである。例えば、アリルでブロックされたカルボン酸は、酸不安定性カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルまたは塩基不安定性酢酸アミン保護基の存在下、パラジウム（０）触媒反応で脱保護され得る。保護基のさらに別の形態は、化合物または中間体が付着し得る樹脂である。残基が樹脂に付着している限り、その官能基はブロックされ、反応することができない。樹脂から解放されると、官能基は反応するために利用可能になる。

用語「核酸塩基」、「塩基対合部分」、「核酸塩基対合部分」または「塩基」は、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび／またはモルホリノサブユニットの複素環式環部を指す。核酸塩基は、天然に存在してよく、または、修飾されているかもしくはこれらの天然に存在する核酸塩基の類似体であってよく、例えば、核酸塩基の１個または複数の窒素原子は、各出現において独立して、炭素によって置き換えられていてよい。例示的な類似体は、ヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基成分）、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン、１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）（Ｇ−クランプ）等を含む。

塩基対合部分のさらなる例は、それらのそれぞれのアミノ基がアシル保護基によって保護されたウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニンおよびヒポキサンチン、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、ピリミジン類似体、例えば、シュードイソシトシンおよびシュードウラシル、ならびに他の修飾された核酸塩基、例えば、８−置換プリン、キサンチンまたはヒポキサンチン（後半の２つは自然分解生成物である）を含むがこれらに限定されない。Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ， ＲＮＡ， ２００３， ９， １０３４−１０４８， Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， ２２， ２１８３−２１９６およびＲｅｖａｎｋａｒ ａｎｄ Ｒａｏ， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ７， ３１３において開示されている修飾された核酸塩基も企図されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

塩基対合部分のさらなる例は、１個または複数のベンゼン環が付加された拡大サイズの核酸塩基を含むがこれらに限定されない。その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃａｔａｌｏｇ （ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）； Ｋｒｕｅｇｅｒ ＡＴ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．， ２００７， ４０， １４１−１５０； Ｋｏｏｌ， ＥＴ， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．， ２００２， ３５， ９３６−９４３； Ｂｅｎｎｅｒ Ｓ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， ２００５， ６， ５５３−５４３； Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ， Ｆ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ２００３， ７， ７２３−７３３； Ｈｉｒａｏ， Ｉ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ２００６， １０， ６２２−６２７において記載されている核酸塩基置き換えは、本明細書において記載されているオリゴマーの合成に有用であるとして企図されている。拡大サイズの核酸塩基の例を以下に示す。

用語「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、複数の連結したヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方の組合せを含む化合物を指す。本明細書において提供される具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、モルホリノオリゴヌクレオチドである。

語句「モルホリノオリゴヌクレオチド」または「ＰＭＯ」は、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’−環外炭素に接合するホスホルアミデートまたはホスホロジアミデート連結によって一緒に連結したモルホリノサブユニットを有する修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。各モルホリノサブユニットは、標的における核酸塩基に核酸塩基特異的水素結合によって結合するために有効な核酸塩基対合部分を含む。

用語「アンチセンスオリゴマー」、「アンチセンス化合物」および「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、それぞれが塩基対合部分を有し、塩基対合部分を核酸（典型的にはＲＮＡ）における標的配列にワトソン−クリック塩基対合によってハイブリダイズさせて、標的配列内に核酸：オリゴマーヘテロ二本鎖を形成する、サブユニット間連結によって連結しているサブユニットの配列を指す。オリゴマーは、標的配列に対して厳密な（完璧な）または近接した（十分な）配列相補性を有してよく、オリゴマーの末端付近の配列における変動は、概して、内部における変動よりも好ましい。

そのようなアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳をブロックもしくは阻害するまたは天然もしくは異常なプレｍＲＮＡスプライスプロセシングを阻害する／変更するように設計することができ、それがハイブリダイズする標的配列「に向けられる」または「に対して標的化される」と言うことができる。標的配列は、典型的には、ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドン、翻訳抑制オリゴマー、または前処理された（ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）ｍＲＮＡのスプライス部位、スプライス抑制オリゴマー（ＳＳＯ）を含む領域である。スプライス部位の標的配列は、前処理されたｍＲＮＡにおける通常のスプライスアクセプタージャンクションの下流にその５’末端の１〜約２５個の塩基対を有するｍＲＮＡ配列を含んでよい。種々の実施形態では、標的配列は、スプライス部位を含む、またはエクソンコード配列内に完全に含有されるもしくはスプライスアクセプターもしくはドナー部位に及ぶ、前処理されたｍＲＮＡの任意の領域であってよい。オリゴマーは、より一般的には、標的の核酸に対して上述した様式で標的化される場合、タンパク質、ウイルスまたは細菌等の生物学的に関連する標的「に対して標的化される」と言われる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的ＲＮＡは、各分子における十分な数の対応する位置が、互いに水素結合できるヌクレオチドによって占有されており、それにより、オリゴヌクレオチドと標的との間に安定かつ特異的な結合が出現する場合、互いに相補的である。故に、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドと標的との間に安定かつ特異的な結合が出現するような、十分な程度の相補性または正確な対合を示すために使用される用語である。当該技術分野において、オリゴヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的配列のものに対して１００％相補的である必要はないことが理解される。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの標的分子への結合が標的ＲＮＡの正常機能に干渉する場合に、特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が望ましい条件下、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合には生理的条件下、およびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイが実施される条件下で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するために、十分な程度の相補性がある。

オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（多くの場合、当該技術分野においては単に「塩基」と称される）修飾または置換も含み得る。修飾または置換された塩基を含有するオリゴヌクレオチドは、核酸において最も一般的に見られる１個または複数のプリンまたはピリミジン塩基が、あまり一般的ではないまたは非天然塩基で置き換えられている、オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸塩基は、プリン塩基のＮ９原子においてまたはピリミジン塩基のＮ１原子において、ヌクレオチドまたはヌクレオシドのモルホリン環に共有結合的に連結している。

プリン塩基は、一般式：
によって記載される通りの、イミダゾール環に縮合したピリミジン環を含む。

アデニンおよびグアニンは、核酸において最も一般的に見られる２個のプリン核酸塩基である。これらは、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ２−メチルグアニン、ヒポキサンチンおよび７−メチルグアニンを含むがこれらに限定されない他の天然に存在するプリンで置換されていてよい。

ピリミジン塩基は、一般式：
によって記載される通りの６員ピリミジン環を含む。

シトシン、ウラシルおよびチミンは、核酸において最も一般的に見られるピリミジン塩基である。これらは、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、シュードウラシルおよび４−チオウラシルを含むがこれらに限定されない他の天然に存在するピリミジンで置換されていてよい。一実施形態では、本明細書において記載されているオリゴヌクレオチドは、ウラシルの代わりにチミン塩基を含有する。

他の修飾または置換された塩基は、２，６−ジアミノプリン、オロチン酸、アグマチジン、リシジン、２−チオピリミジン（例えば、２−チオウラシル、２−チオチミン）、Ｇ−クランプおよびその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば、５−ハロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、スーパーＴ）、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、スーパーＧ、スーパーＡおよびＮ４−エチルシトシン、またはその誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）、およびＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）、シュードウラシルまたはその誘導体；ならびに２，６−ジフルオロトルエンのような縮重もしくはユニバーサル塩基または塩基脱落部位のような欠損塩基（例えば、１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、ｌ−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース；または環酸素が窒素で置き換えられたピロリジン誘導体（アザリボース））を含むがこれらに限定されない。シュードウラシルは、ウリジンにあるような正規のＮ−グリコシドではなくＣ−グリコシドを有する、ウラシルの天然に存在する異性化バージョンである。

ある特定の修飾または置換された核酸塩基は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるために特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６および０〜６置換プリンを含む。種々の実施形態では、核酸塩基は、５−メチルシトシン置換を含んでよく、これは、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２°Ｃだけ増大させることが示されている。

一部の実施形態では、修飾または置換された核酸塩基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの精製を容易にするために有用である。例えば、ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３個またはそれよりも多い（例えば、３、４、５、６個またはそれよりも多い）連続するグアニン塩基を含有してよい。ある特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、一連の３個またはそれよりも多い連続するグアニン塩基は、精製を複雑化する、オリゴヌクレオチドの凝集をもたらし得る。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、連続するグアニンの１つまたは複数は、ヒポキサンチンで置換され得る。一連の３個またはそれよりも多い連続するグアニン塩基における１個または複数のグアニンのヒポキサンチンによる置換は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの凝集を低減させ、それにより、精製を容易にすることができる。

本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドは、合成され、生物起源のアンチセンス組成物を含まない。本開示の分子は、取り込み、分布もしくは吸収またはそれらの組合せを補助するために、他の分子、分子構造または化合物の混合物、例えば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所または他の製剤と、混合、カプセル化、コンジュゲートまたは別様に会合されてもよい。

用語「相補的な」および「相補性」は、塩基対合則によって関係付けられたオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列「Ｔ−Ｇ−Ａ（５’−３’）」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ（５’−３’）」に対して相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従って適合する、「部分的」であってよい。あるいは、核酸間に、「完全な」、「全くの」または「完璧な」（１００％）相補性があってよい。核酸ストランド間の相補性の程度は、核酸ストランド間のハイブリダイゼーションの効率および強さに対して顕著な効果を有する。完璧な相補性が多くの場合望ましいが、一部の実施形態は、標的ＲＮＡに関して、１つまたは複数であるが好ましくは６、５、４、３、２または１つのミスマッチを含み得る。そのようなハイブリダイゼーションは、アンチセンスオリゴマーの標的配列に対する「近接した」または「実質的な」相補性でおよび厳密な相補性で出現し得る。一部の実施形態では、オリゴマーは、標的配列に、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の相補性でハイブリダイズしてよい。オリゴマー内の任意の場所における変動が含まれる。ある特定の実施形態では、オリゴマーの末端付近の配列における変動は、概して、内部における変動よりも好ましく、存在する場合、典型的には、５’末端、３’末端または両方の末端の約６、５、４、３、２または１ヌクレオチド内である。

用語「ペプチド」は、複数の連結されたアミノ酸を含む化合物を指す。本明細書において提供されるペプチドは、細胞透過性ペプチドであるとみなされ得る。

用語「細胞透過性ペプチド」および「ＣＰＰ」は、交換可能に使用され、輸送ペプチド、担体ペプチドまたはペプチド形質導入ドメインとも称される、カチオン性細胞透過性ペプチドを指す。本明細書において提供されるペプチドは、所与の細胞培養集団の細胞の１００％以内で細胞透過を誘導する能力を有し、複数の組織内における巨大分子トランスロケーションを、全身投与時にｉｎ ｖｉｖｏで可能にする。種々の実施形態では、本開示のＣＰＰ実施形態は、さらに以下で記載する通り、アルギニンリッチペプチドを含んでよい。

用語「処置」は、疾患の好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）に使用される１つまたは複数の特定の手順の適用を指す。ある特定の実施形態では、具体的な手順は、１つまたは複数の薬学的作用物質の投与である。個体（例えば、ヒト等の哺乳動物）または細胞の「処置」は、個体または細胞の自然経過を変更するための試みにおいて使用される任意の種類の介入である。処置は、医薬組成物の投与を含むがこれに限定されず、予防的にまたは病理学的事象の開始もしくは病原体との接触に続いてのいずれかで実施されてよい。処置は、疾患または状態の症状または病理学に対するあらゆる望ましい効果を含み、例えば、処置されている疾患または状態の１つまたは複数の測定可能なマーカーにおける最小限の変化または改善を含んでよい。処置されている疾患もしくは状態の進行速度を低減させること、その疾患もしくは状態の発症を遅延させること、またはその発症の重症度を低減させることに向けられ得る、「予防的」処置も含まれる。

「有効量」または「治療有効量」は、単回用量としてまたは一連の用量の一部としてのいずれかで哺乳動物被験体に投与される、所望の治療効果を産生するために有効なアンチセンスオリゴマー等の治療用化合物の量を指す。

用語「好転」は、状態または疾患の少なくとも１つの指標の重症度の軽減を意味する。ある特定の実施形態では、好転は、状態または疾患の１つまたは複数の指標の進行における遅延または減速を含む。指標の重症度は、当業者に公知である主観的または客観的尺度によって決定され得る。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって親オリゴヌクレオチドが修飾された、開示されているオリゴヌクレオチドの誘導体を指す。好適な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９８５， ｐ． １４１８およびＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ６６， ２ （１９７７）において見られ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
細胞透過性ペプチドに化学的に連結しているオリゴヌクレオチドが、本明細書において提供される。細胞透過性ペプチドは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを強化する。特に、細胞透過性ペプチドは、線形または非環状ペプチドである。一部の実施形態では、ＣＰＰは、アルギニンリッチペプチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みをさらに強化する、１つまたは複数のへテロアルキル部分（例えば、ポリエチレングリコール）に、付加的に化学的に連結することができる。１つの例示的な実施形態では、ポリペプチド、例えばアルギニンリッチポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端残基において、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端に共有結合的にカップリングされる。

故に、一態様では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
または薬学的に許容されるその塩が、本明細書において提供され、式中、
Ａ’は、−ＮＨＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−Ｎ（Ｃ_１〜６−アルキル）ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、
から選択され、式中、
Ｒ^５は、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）_ｘ−ＯＨであり、ｘは、３〜１０であり、各アルキル基は、各出現において独立して、Ｃ_２〜６−アルキルであるか、またはＲ^５は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_１〜６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ_１〜６−アルキル）Ｒ^６、−（Ｃ_１〜６−へテロアルキル）−Ｒ^６、アリール−Ｒ^６、ヘテロアリール−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ_１〜６−アルキル）−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ^６、および
から選択され、
式中、Ｒ^６は、ＯＨ、ＳＨおよびＮＨ_２から選択されるか、またはＲ^６は、固体支持体に共有結合的に連結しているＯ、ＳもしくはＮＨであり、
各Ｒ^１は、ＯＨおよび−ＮＲ^３Ｒ^４から独立して選択され、各Ｒ^３およびＲ^４は、各出現において独立して、−Ｃ_１〜６−アルキルであり、
各Ｒ^２は、Ｈ、核酸塩基、および化学保護基で官能基化された核酸塩基から独立して選択され、核酸塩基は、各出現において独立して、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリンおよびデアザ−プリンから選択されるＣ_３〜６−複素環式環を含み、
ｚは、８〜４０であり、
Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ_１〜６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_１〜６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
から選択され、式中、
Ｑは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２Ｓ_２（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ^７は、−（ＣＨ_２）_２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であり、Ｒ^８は、−（ＣＨ_２）_６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２であり、
Ｌは、Ｊのアミノ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_１〜６−Ｃ_１〜６−ヘテロ芳香族−（ＣＨ_２）_１〜６Ｃ（Ｏ）であり、
ｔは、５〜２７であり、
各Ｊは、各出現において独立して、アルギニン、グリシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リシン、グルタミン、グルタミン酸、セリン、プロリン、バリン、イソロイシン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸およびトレオニンからなる群より選択され、
少なくとも１つのＪは、アルギニンであり、
Ｇは、Ｊのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、Ｇは、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_１〜６−アルキル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択され、
下記の条件の少なくとも１つが真である：
１）Ａ’は、
であるか、または２）Ｅ’は、
である。

一実施形態では、Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ_１〜６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_１〜６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、および
から選択される。

さらに別の実施形態では、Ａ’は、−Ｎ（Ｃ_１〜６−アルキル）ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、
から選択される。

別の実施形態では、Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、４−メトキシトリチル、および
から選択される。

また別の実施形態では、Ａ’は、−Ｎ（Ｃ_１〜６−アルキル）ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、
から選択され、
Ｅ’は、
である。

さらに別の実施形態では、Ａ’は、
である。

別の実施形態では、Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される。

さらに別の実施形態では、Ｅ’は、Ｈおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３から選択される。

また別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式Ｉａのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
である。

別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式Ｉｂのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
である。

式ＩおよびＩｂのある実施形態では、Ｅ’は、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される。

式ＩおよびＩｂの別の実施形態では、Ｅ’は、Ｈおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３から選択される。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのある実施形態では、各Ｊは、グリシン、アラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リシン、グルタミン、グルタミン酸、セリン、プロリン、バリン、アルギニンおよびトレオニンから独立して選択される。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、各Ｊは、アルギニン、リシンおよびグルタミンから独立して選択される。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、各Ｊは、グリシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、トリプトファン、グルタミン、プロリン、リシン、アルギニンおよびバリンから独立して選択される。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、各Ｊは、アルギニン、イソロイシン、プロリン、ロイシン、フェニルアラニンおよびグリシンから独立して選択される。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、各Ｊは、グリシン、アルギニン、プロリン、グルタミン酸、セリン、リシンおよびロイシンから独立して選択される。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、各Ｊは、アラニン、ロイシン、トリプトファン、リシン、トレオニン、バリン、プロリンおよびアルギニンから独立して選択される。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、各Ｒ^１は、Ｎ（ＣＨ_３）_２である。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、各Ｒ^２は、核酸塩基であり、核酸塩基は、各出現において独立して、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリンおよびデアザ−プリンから選択されるＣ_４〜６−複素環式環を含む。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、各Ｒ^２は、核酸塩基であり、核酸塩基は、各出現において独立して、ピリミジン、プリンおよびデアザ−プリンから選択されるＣ_４〜６−複素環式環を含む。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、各Ｒ^２は、各出現において独立して、アデニン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンから選択される核酸塩基である。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、各Ｒ^２は、各出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンから選択される核酸塩基である。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_１〜６−トリアゾール−（ＣＨ_２）_１〜６Ｃ（Ｏ）−である。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、Ｌは、
である。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、Ｇは、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、Ｇは、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３である。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、Ｇは、Ｈである、

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３である。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、Ｊは、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、ＲＲＩＲＰＲＰＰＲＬＰＲＰＲＰＲＰＬＰＦＰＲＰＧ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＲＰＲＥＳＧＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰ、ＡＬＷＫＴＬＬＫＫＶＬＫＡＰＫＫＫＲＫＶ、ＲＲＩＰＮＲＲＰＲＲ、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ、ＨＡＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＹＫＧＫＦＷ、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ、ＬＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＥＲＱＳＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱ、ＲＨＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ、ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ、ＫＱＩＮＮＷＦＩＮＱＲＫＲＨＷＫ、ＫＬＷＭＲＷＹＳＰＴＴＲＲＹＧ、ＲＲＷＷＲＲＷＲＲ、ＳＱＩＫＩＷＦＱＮＫＲＡＫＩＫＫ、ＧＡＹＤＬＲＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＲＥＲＱＳＲ、ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ、ＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰ、ＲＱＶＴＩＷＦＱＮＲＲＶＫＥＫＫ、ＲＬＲＷＲ、ＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲ、ＣＡＹＨＲＬＲＲＣ、ＳＲＲＡＲＲＳＰＲＨＬＧＳＧ、ＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲ、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ、ＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＭＤＶ、ＬＹＫＫＧＰＡＫＫＧＲＰＰＬＲＧＷＦＨ、ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ、ＫＧＴＹＫＫＫＬＭＲＩＰＬＫＧＴ、ＰＰＲＰＰＲＰＰＲ、ＲＡＳＫＲＤＧＳＷＶＫＫＬＨＲＩＬＥ、ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＷＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ、ＦＫＩＹＤＫＫＶＲＴＲＶＶＫＨ、ＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰ、ＧＰＦＨＦＹＱＦＬＦＰＰＶ、ＰＬＩＬＬＲＬＬＲＧＱＦ、ＹＴＡＩＡＷＶＫＡＦＩＲＫＬＲＫ、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＲＫＶ、ＬＩＲＬＷＳＨＬＩＨＩＷＦＱＮＲＲＬＫＷＫＫＫ、ＶＤＫＧＳＹＬＰＲＰＴＰＰＲＰＩＹＮＲＮ、ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ、ＧＳＰＷＧＬＱＨＨＰＰＲＴ、ＫＬＡＬＫＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ、ＩＰＡＬＫ、ＶＰＡＬＲ、ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ、ＩＡＷＶＫＡＦＩＲＫＬＲＫＧＰＬＧ、ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＶＱＲＫＲＱＫＬＰ、ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ、ＶＰＴＬＫ、またはＶＳＡＬＫである。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、Ｊは、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、ＲＲＩＲＰＲＰＰＲＬＰＲＰＲＰＲＰＬＰＦＰＲＰＧ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＲＰＲＥＳＧＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰ、ＡＬＷＫＴＬＬＫＫＶＬＫＡＰＫＫＫＲＫＶ、ＲＲＩＰＮＲＲＰＲＲ、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ、ＨＡＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＹＫＧＫＦＷ、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ、ＬＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＥＲＱＳＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱ、ＲＨＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ、ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ、ＫＱＩＮＮＷＦＩＮＱＲＫＲＨＷＫ、ＫＬＷＭＲＷＹＳＰＴＴＲＲＹＧ、ＲＲＷＷＲＲＷＲＲ、ＳＱＩＫＩＷＦＱＮＫＲＡＫＩＫＫ、ＧＡＹＤＬＲＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＲＥＲＱＳＲ、ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ、ＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰ、ＲＱＶＴＩＷＦＱＮＲＲＶＫＥＫＫ、ＲＬＲＷＲ、ＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲ、ＣＡＹＨＲＬＲＲＣ、ＳＲＲＡＲＲＳＰＲＨＬＧＳＧ、ＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲ、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ、ＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＭＤＶ、ＬＹＫＫＧＰＡＫＫＧＲＰＰＬＲＧＷＦＨ、ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ、またはＫＧＴＹＫＫＫＬＭＲＩＰＬＫＧＴである。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、Ｊは、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、ＲＲＩＲＰＲＰＰＲＬＰＲＰＲＰＲＰＬＰＦＰＲＰＧ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＲＰＲＥＳＧＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰ、またはＡＬＷＫＴＬＬＫＫＶＬＫＡＰＫＫＫＲＫＶである。

式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートは、コンジュゲートされていないオリゴヌクレオチドと比較して、取り込みにおける少なくとも２倍の改善を実証する。

ある実施形態では、オリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートは、コンジュゲートされていないオリゴヌクレオチドと比較して、取り込みにおける少なくとも５倍の改善を実証する。

別の実施形態では、オリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートは、対応するＣｙ５．５−ペプチドコンジュゲートと比較して、取り込みにおける改善を実証する。

さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ標的に対して配列相補性を有する標的化配列を含む。具体的な実施形態では、ＲＮＡ標的は、細胞ＲＮＡ標的である。別の具体的な実施形態では、標的化配列は、ＲＮＡ標的に結合するために十分な配列相補性を有する。さらに別の具体的な実施形態では、標的化配列は、ＲＮＡ標的に対して完璧な配列相補性を有する。

本開示の代表的なペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、数ある中でも、下記の構造のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
または薬学的に許容されるその塩［式中、
Ｇは、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３であり、Ｇは、ペプチドのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、
Ｒ^２は、各出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンから選択される核酸塩基であり、
ｚは、８〜４０であり、
ＣＰＰは、各出現において独立して、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、ＲＲＩＲＰＲＰＰＲＬＰＲＰＲＰＲＰＬＰＦＰＲＰＧ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＲＰＲＥＳＧＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰ、ＡＬＷＫＴＬＬＫＫＶＬＫＡＰＫＫＫＲＫＶ、ＲＲＩＰＮＲＲＰＲＲ、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ、ＨＡＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＹＫＧＫＦＷ、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ、ＬＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＥＲＱＳＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱ、ＲＨＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ、ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ、ＫＱＩＮＮＷＦＩＮＱＲＫＲＨＷＫ、ＫＬＷＭＲＷＹＳＰＴＴＲＲＹＧ、ＲＲＷＷＲＲＷＲＲ、ＳＱＩＫＩＷＦＱＮＫＲＡＫＩＫＫ、ＧＡＹＤＬＲＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＲＥＲＱＳＲ、ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ、ＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰ、ＲＱＶＴＩＷＦＱＮＲＲＶＫＥＫＫ、ＲＬＲＷＲ、ＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲ、ＣＡＹＨＲＬＲＲＣ、ＳＲＲＡＲＲＳＰＲＨＬＧＳＧ、ＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲ、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ、ＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＭＤＶ、ＬＹＫＫＧＰＡＫＫＧＲＰＰＬＲＧＷＦＨ、ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ、ＫＧＴＹＫＫＫＬＭＲＩＰＬＫＧＴ、ＰＰＲＰＰＲＰＰＲ、ＲＡＳＫＲＤＧＳＷＶＫＫＬＨＲＩＬＥ、ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＷＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ、ＦＫＩＹＤＫＫＶＲＴＲＶＶＫＨ、ＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰ、ＧＰＦＨＦＹＱＦＬＦＰＰＶ、ＰＬＩＬＬＲＬＬＲＧＱＦ、ＹＴＡＩＡＷＶＫＡＦＩＲＫＬＲＫ、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＲＫＶ、ＬＩＲＬＷＳＨＬＩＨＩＷＦＱＮＲＲＬＫＷＫＫＫ、ＶＤＫＧＳＹＬＰＲＰＴＰＰＲＰＩＹＮＲＮ、ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ、ＧＳＰＷＧＬＱＨＨＰＰＲＴ、ＫＬＡＬＫＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ、ＩＰＡＬＫ、ＶＰＡＬＲ、ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ、ＩＡＷＶＫＡＦＩＲＫＬＲＫＧＰＬＧ、ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＶＱＲＫＲＱＫＬＰ、ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ、ＶＰＴＬＫ、またはＶＳＡＬＫから選択される］
を含む。

本開示のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの一実施形態では、Ｇは、Ｈである。

本開示のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの別の実施形態では、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３である。

ある実施形態では、Ｌは、ペプチドのカルボキシ末端に共有結合的に連結しており、Ｇは、ペプチドのアミノ末端に共有結合的に連結している。

本明細書で使用される場合、「Ｇは、Ｊのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結している」は、Ｊ（−ＣＯＯＨ）のカルボキシ末端が、Ｎ（Ｈ）基を介して変数Ｇに共有結合的に結合していることを示し、Ｊのカルボキシ末端のヒドロキシル基は、Ｎ（Ｈ）で置き換えられている。例えば、ＧがＨである場合、下記の構造は、ＪおよびＧによって形成される。

一部の実施形態では、本明細書において記載されているペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、溶媒和されていない。他の実施形態では、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つまたは複数は、溶媒和形態である。当該技術分野において公知の通り、溶媒和物は、水、エタノール等の薬学的に許容される溶媒のいずれかであり得る。

式Ｉ、Ｉａ、ＩｂおよびＩＩのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートはそれらの中性形態で示されているが、一部の実施形態では、これらのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、薬学的に許容される塩形態で使用される。

オリゴヌクレオチド
モルホリノベースのサブユニットの重要な特性は、１）安定な非荷電または正に荷電された骨格連結によってオリゴマー形態で連結される能力；２）ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシル、５−メチル−シトシンおよびヒポキサンチン）を支持し、それにより、形成されたポリマーが、標的ＲＮＡを含む相補的塩基標的核酸と、比較的短いオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜１５塩基）で約４５℃を上回るＴ_Ｍ値でハイブリダイズすることができる能力；３）哺乳動物の細胞に能動的にまたは受動的に輸送されるオリゴヌクレオチドの能力；ならびに４）ＲＮアーゼおよびＲＮアーゼＨ分解にそれぞれ抵抗する、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘテロ二本鎖の能力を含む。

オリゴマーと標的配列との間に形成される二本鎖の安定性は、結合Ｔ_Ｍおよび二本鎖の細胞の酵素的開裂に対する感受性の関数である。相補的配列ＲＮＡに関するオリゴマーのＴ_Ｍは、Ｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８５， ｐｐ． １０７−１０８によって記載されたもの等の従来の方法によって、またはＭｉｙａｄａ Ｃ． Ｇ． ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ Ｒ． Ｂ．， １９８７， Ｏｌｉｇｏｍｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． Ｖｏｌ． １５４ ｐｐ． ９４−１０７において記載されている通りに、測定され得る。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、相補的配列ＲＮＡに関して、体温よりも高い、および一実施形態では約４５℃または５０℃よりも高い、結合Ｔ_Ｍを有してよい。６０〜８０℃の範囲内またはそれよりも高いＴ_Ｍも含まれる。周知の原理によれば、相補的塩基（ｂａｓｅｄ）ＲＮＡハイブリッドに関して、オリゴマーのＴ_Ｍは、二本鎖におけるＣ：Ｇ対合塩基の比を増大させることによって、もしくはヘテロ二本鎖の長さを（塩基対で）増大させることによって、または両方によって、増大できる。同時に、細胞取り込みを最適化することを目的として、オリゴマーのサイズを限定することが有利であり得る。この理由から、本開示の化合物は、２５塩基またはそれよりも短い長さで高Ｔ_Ｍ（４５〜５０℃またはそれよりも高い）を示す化合物を含む。

オリゴヌクレオチドの長さは、プレｍＲＮＡ分子内の意図した場所に選択的に結合することができる限り、変動してよい。そのような配列の長さは、本明細書において記載されている選択手順に従って決定することができる。概して、オリゴヌクレオチドは、長さ約８ヌクレオチド〜長さ最大約５０ヌクレオチドである。例えば、オリゴヌクレオチドの長さ（ｚ）は、８〜３８、８〜２５、１５〜２５、１７〜２１、または約１８であり得る。しかしながら、この範囲内のヌクレオチドの任意の長さが、本明細書において記載されている方法において使用され得ることが分かるであろう。

一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基修飾または置換を含有する。例えば、ある特定の核酸塩基は、本明細書において記載されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるように選択されてよい。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシンおよび２，６−ジアミノプリンを含むＮ−２、Ｎ−６および０〜６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２°Ｃだけ増大させることが示されており、本明細書において記載されているアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれてよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのピリミジン塩基は、５−置換ピリミジン塩基を含み、ピリミジン塩基は、シトシン、チミンおよびウラシルからなる群より選択される。一実施形態では、５−置換ピリミジン塩基は、５−メチルシトシンである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのプリン塩基は、Ｎ−２、Ｎ−６置換プリン塩基を含む。一実施形態では、Ｎ−２、Ｎ−６置換プリン塩基は、２，６−ジアミノプリンである。

モルホリノベースのオリゴマー（アンチセンスオリゴマーを含む）が、例えば、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号および係属中の米国特許出願第１２／２７１，０３６号、同第１２／２７１，０４０号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ／２００９／０６４４７１号および同第ＷＯ／２０１２／０４３７３０号ならびにＳｕｍｍｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９７， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ７， １８７−１９５において詳述されており、これらは、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

したがって、一態様では、式ＩＩのオリゴヌクレオチド：
または薬学的に許容されるその塩
［式中、
Ａは、ＯＨ、−ＮＨＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−Ｎ（Ｃ_１〜６−アルキル）ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、
からなる群より選択され、
Ｒ^５は、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）_ｘＯＨであり、ｘは、３〜１０であり、各アルキル基は、各出現において独立して、−Ｃ_２〜６−アルキルであるか、またはＲ^５は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_１〜６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−Ｃ_１〜６−アルキル−Ｒ^６、−Ｃ_１〜６−へテロアルキル−Ｒ^６、−アリール−Ｒ^６、−ヘテロアリール−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ_１〜６−アルキル−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ^６および−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ^６からなる群より選択され、
Ｒ^６は、ＯＨ、ＳＨおよびＮＨ_２からなる群より選択されるか、あるいはＲ^６は、固体支持体に共有結合的に連結しているＯ、ＳまたはＮＨであり、
各Ｒ^１は、独立して、ＯＨまたは−ＮＲ^３Ｒ^４であり、
各Ｒ^３およびＲ^４は、各出現において独立して、−Ｃ_１〜６−アルキルであり、
各Ｒ^２は、Ｈ、核酸塩基、および化学保護基で官能基化された核酸塩基からなる群より独立して選択され、核酸塩基は、各出現において独立して、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリンおよびデアザ−プリンからなる群より選択されるＣ_３〜６−複素環式環を含み、
ｚは、８〜４０であり、
Ｅは、Ｈ、−Ｃ_１〜６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_１〜６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、および
からなる群より選択され、
Ｑは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２Ｓ_２（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ^７は、−（ＣＨ_２）_２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であり、
Ｒ^８は、−（ＣＨ_２）_６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２である］
が、本明細書において提供される。

式ＩＩの一実施形態では、Ａは、
であり、
Ｅは、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、ベンゾイルおよびステアロイルからなる群より選択され、
Ｒ^５は、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）_ｘ−ＯＨであり、各アルキル基は、各出現において独立して、−Ｃ_２〜６−アルキル、トリチルおよび４−メトキシトリチルであり、
各Ｒ^２は、独立して、核酸塩基であり、核酸塩基は、各出現において独立して、ピリジン、ピリミジン、プリン、およびデアザ−プリンからなる群より選択されるＣ_４〜６−複素環式環を含む。

式ＩＩの別の実施形態では、Ｒ^５は、Ｃ（Ｏ）（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_３−ＯＨであり、
各Ｒ^２は、独立して、核酸塩基であり、核酸塩基は、各出現において独立して、ピリミジンまたはプリンを含む。

また別の実施形態では、式ＩＩのオリゴヌクレオチドは、式ＩＩａのオリゴヌクレオチド：
である。

式ＩＩおよびＩＩａのある実施形態では、Ｒ^２は、各出現において独立して、アデニン、２，６−ジアミノプリン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンであり、
各Ｒ^１は、−Ｎ（ＣＨ_３）_２である。

本明細書において記載されている通りのヌクレオチド部分の種々の実施形態が、表１において提供される。

一部の実施形態では、本明細書において記載されているオリゴヌクレオチドは、溶媒和されていない。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドの１つまたは複数は、溶媒和形態である。当該技術分野において公知の通り、溶媒和物は、水、エタノール等の薬学的に許容される溶媒のいずれかであり得る。

式ＩＩおよびＩＩａのオリゴヌクレオチドはそれらの中性形態で示されているが、一部の実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される塩形態で使用される。

ペプチド
本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドは、ＣＰＰにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチド部分を含む。特に、細胞透過性ペプチドは、線形または非環状ペプチドである。一部の実施形態では、ＣＰＰは、理論上の正の正味電荷を有することができる。一部の実施形態では、正の正味電荷は、１〜１２の整数であり得る。そのようなＣＰＰの代表を以下に示す：
［式中、ｃは、１〜１２の整数である］。

一部の実施形態では、ＣＰＰは、化合物の細胞への輸送を強化するために有効な、アルギニンリッチペプチド輸送部分であり得る。輸送部分は、一部の実施形態では、オリゴマーの末端に付着している。ペプチドは、所与の細胞培養集団の細胞の、間にあるすべての整数を含む、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％以内で細胞透過を誘導する能力を有し、複数の組織内における巨大分子トランスロケーションを、全身投与時にｉｎ ｖｉｖｏで可能にする。一実施形態では、細胞透過性ペプチドは、アルギニンリッチペプチド輸送体であってよい。

上述した通りの輸送部分は、付着した輸送部分の非存在下におけるオリゴマーの取り込みと比べて、付着したオリゴマーの細胞移入を大幅に強化することが示されている。取り込みは、コンジュゲートされていない化合物と比べて少なくとも２倍、一部の実施形態では１０倍強化され得る。一部の実施形態では、取り込みは、ＣＰＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートと比べて少なくとも２倍、一部の実施形態では１０倍強化され得る。

アルギニンリッチペプチド輸送体（すなわち、細胞透過性ペプチド）の使用は、本開示を実施する際に特に有用である。ある特定のペプチド輸送体は、アンチセンス化合物の、筋細胞を含む初代細胞への送達において高度に有効であることが示されている。さらに、本明細書において記載されているペプチド輸送体は、アンチセンスＰＭＯにコンジュゲートされた場合、いくつかの遺伝子転写物のスプライシングを変更する能力の強化を実証する。

故に、一態様では、式ＩＩＩのペプチド：
または薬学的に許容されるその塩
［式中、
ｔは、５〜２７であり、
各Ｊは、各出現において独立して、アルギニン、グリシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リシン、グルタミン、グルタミン酸、セリン、プロリン、バリン、イソロイシン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸およびトレオニンからなる群より選択され、
少なくとも１つのＪは、アルギニンであり、
Ｇは、Ｊのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、Ｇは、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_１〜６−アルキル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択され、
Ｌは、固体支持体に共有結合的に連結していてよい−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_１〜６−Ｃ_１〜６−ヘテロ芳香族−（ＣＨ_２）_１〜６Ｃ（Ｏ）である］
が、本明細書において提供される。

ある実施形態では、各Ｊは、グリシン、アラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リシン、グルタミン、グルタミン酸、セリン、プロリン、バリン、アルギニンおよびトレオニンから独立して選択される。

別の実施形態では、各Ｊは、アルギニン、リシンおよびグルタミンから独立して選択される。

別の実施形態では、各Ｊは、グリシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、トリプトファン、グルタミン、プロリン、リシン、アルギニンおよびバリンから独立して選択される。

別の実施形態では、各Ｊは、アルギニン、イソロイシン、プロリン、ロイシン、フェニルアラニンおよびグリシンから独立して選択される。

また別の実施形態では、各Ｊは、グリシン、アルギニン、プロリン、グルタミン酸、セリン、リシンおよびロイシンから独立して選択される。

さらに別の実施形態では、各Ｊは、アラニン、ロイシン、トリプトファン、リシン、トレオニン、バリン、プロリンおよびアルギニンから独立して選択される。

また別の実施形態では、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_１〜６−Ｃ_１〜６−ヘテロ芳香族−（ＣＨ_２）_１〜６Ｃ（Ｏ）である。

別の実施形態では、Ｌは、
である。

さらに別の実施形態では、Ｇは、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、ベンゾイルおよびステアロイルからなる群より選択される。

また別の実施形態では、Ｇは、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３またはＨである。

別の実施形態では、Ｇは、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３である。

別の実施形態では、Ｇは、Ｈである。

さらに別の実施形態では、Ｇは、Ｊのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結している。さらなる実施形態では、Ｌは、Ｊのアミノ末端にアミド結合によって共有結合的に連結している。

一部の実施形態では、本明細書において記載されているペプチドは、溶媒和されていない。他の実施形態では、ペプチドの１つまたは複数は、溶媒和形態である。当該技術分野において公知の通り、溶媒和物は、水、エタノール等の薬学的に許容される溶媒のいずれかであり得る。

式ＩＩＩのペプチドはそれらの中性形態で示されているが、一部の実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される塩形態で使用される。

方法
それを必要とする被験体において、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を処置する方法であって、被験体に、式Ｉ、ＩａまたはＩｂのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。

したがって、一態様では、それを必要とする被験体において、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を処置する方法であって、被験体に、本開示のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。

一実施形態では、筋疾患は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである。

別の実施形態では、ウイルス感染症は、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルスおよびデングウイルスからなる群より選択されるウイルスによって引き起こされる。

別の実施形態では、細菌感染症は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって引き起こされる。

本明細書で考慮される被験体は、典型的には、ヒトである。しかしながら、被験体は、処置が所望される任意の哺乳動物であり得る。故に、本明細書において記載されている方法は、ヒトおよび獣医学的適用の両方に適用され得る。

投与／用量
治療用組成物の製剤およびそれらのその後の投与（投薬）は、当業者の技量内である。投薬は、処置される疾患状況の重症度および応答性に依存し、処置の経過は、数日間から数か月間、または疾患状況の十分な縮小が達成されるまで継続する。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定から算出することができる。

当業者ならば、最適投薬量、投薬方法論および繰り返し率を簡単に決定することができる。最適投薬量は、個々のオリゴマーの相対的効力に応じて変動してよく、概して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であることが分かっているＥＣ_５０に基づいて推定することができる。概して、投薬量は、０．０１μｇ〜１００ｇ／体重１ｋｇであり、１日、１週間、１か月または１年に１回または複数回、またはさらには２〜２０年ごとに１回、与えられてよい。当業者ならば、体液または組織中における測定された滞留時間および薬物の濃度に基づき、投薬の繰り返し率を簡単に推定することができる。処置成功後、疾患状況の再発を防止するために、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、オリゴマーは、０．０１μｇ〜１００ｇ／体重１ｋｇの範囲内の維持用量で、１日に１回または複数回〜２０年ごとに１回、投与される。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド（式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチド）は、単独で投与される。

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、治療有効量または投薬量で投与される。「治療有効量」は、それ単独で患者に投与された場合、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を有効に処置する、式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチドの量である。所与の事例において特定の被験体に対して「治療有効量」であることが判明している量は、そのような投薬量が当業者によって「治療有効量」であると考えられているにもかかわらず、検討中の疾患または状態を同様に処置されている被験体の１００％には有効でない場合がある。治療有効量に対応するオリゴヌクレオチドの量は、疾患の種類、疾患の段階、処置されている患者の年齢、および他の事実に強く依存する。

異なる実施形態では、式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチドおよび使用される有効量に応じて、オリゴヌクレオチドは、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症に関与する遺伝子の発現をモジュレートすることができる。

式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチドの量は、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症の有効な処置をもたらすべきであるが、量は、好ましくは、患者にとって過度に毒性ではない（すなわち、量は、好ましくは、医療ガイドラインによって確立された通りの毒性限界内である）。一部の実施形態では、過度の毒性を防止するまたは筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症のより効果的な処置を提供することのいずれかまたは両方のために、投与される総投薬量に対する限定が提供される。典型的には、本明細書で考慮される量は、１日当たりであるが、半日および２日または３日サイクルも本明細書で考慮される。

異なる投薬量レジメンが、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を処置するために使用されてよい。一部の実施形態では、上述した例示的な投薬量のいずれか等の１日投薬量が、１日に１回、２回、３回、または４回、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間投与される。処置されている疾患の段階および重症度に応じて、より短い処置時間（例えば、最大５日間）が高い投薬量とともに用いられてよく、またはより長い処置時間（例えば、１０またはそれよりも多い日数、または週数、または月数、またはそれよりも長い）が低い投薬量とともに用いられてよい。一部の実施形態では、１日に１回または２回の投薬量は、１日おきに投与される。

式ＩＩおよびＩＩａのオリゴヌクレオチドまたはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物形態は、純粋な形態でまたは適切な医薬組成物で、当該技術分野において公知の許容される投与モードまたは作用物質のいずれかを介して投与され得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、経口的に、鼻に、非経口的に（静脈内、筋肉内または皮下）、局所的に、経皮的に、膣内に、膀胱内に、大槽内にまたは直腸的に、投与され得る。剤形は、例えば、固体、半固体、凍結乾燥粉末または液体剤形、例えば、錠剤、丸剤、軟質弾性または硬質ゼラチンカプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、坐剤、エアゾール剤等、例えば、正確な投薬量の単純な投与に好適な単位剤形であり得る。特定の投与経路は、経口、特に、好都合な１日投薬量レジメンを、処置される疾患の重症度に従って調整することができるものである。

助剤およびアジュバント剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、懸濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着香剤、乳化剤および分注剤（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含んでよい。微生物の活動の防止は、概して、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等、種々の抗菌および抗真菌剤によって提供される。糖、塩化ナトリウム等の等張剤も含まれてよい。注射可能薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。助剤は、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤および酸化防止剤、例えば、クエン酸、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、ブチル化ヒドロキシトルエン等も含むことができる。

固体剤形は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶コーティングおよび当該技術分野において周知である他のものを用いて調製することができる。これらは、乳白剤を含有することができ、腸管のある特定の部分において活性オリゴヌクレオチド（単数または複数）を遅延方式で放出するような組成のものであり得る。使用され得る包理組成物の例は、ポリマー性物質およびワックスである。活性オリゴヌクレオチドは、適切ならば、上で言及した賦形剤の１つまたは複数を加えたマイクロカプセル化形態であることもできる。

経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を含む。そのような剤形は、例えば、本明細書において記載されているコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩および必要に応じた薬学的アジュバントを、担体、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等；可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド；油、特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル；またはこれらの物質の混合物等に、溶解する、分散する等して、それにより、溶液または懸濁液を形成することによって、調製される。

概して、意図される投与モードに応じて、薬学的に許容される組成物は、約１重量％〜約９９重量％の本明細書において記載されているオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩および９９重量％〜１重量％の薬学的に許容される賦形剤を含有することになる。一例では、組成物は、約５重量％〜約７５重量％の間の本明細書において記載されているオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩となり、残りは、好適な薬学的賦形剤である。

そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかとなるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ． （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９９０）を参照されたい。

キット
他の実施形態では、キットが提供される。本開示に従うキットは、本開示のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは組成物を含む、パッケージを含む。一部の実施形態では、キットは、式Ｉ、ＩａもしくはＩｂに従うペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩を含む。他の実施形態では、キットは、式ＩＩもしくはＩＩａに従うオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩を含む。また他の実施形態では、キットは、式ＩＩＩに従うペプチド、または薬学的に許容されるその塩を含む。

語句「パッケージ」は、本明細書において提示されるオリゴヌクレオチドまたは組成物を含有する任意の容器を意味する。一部の実施形態では、パッケージは、箱または包装紙であり得る。薬学的製品を包装する際に使用するための包装材料は、当業者に周知である。薬学的包装材料の例は、ボトル、管、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、コンテナ、シリンジ、ボトル、ならびに、選択された製剤ならびに意図される投与モードおよび処置に好適な任意の包装材料を含むがこれらに限定されない。

キットは、パッケージ内に含有されていないがパッケージの外側に付着している物品、例えばピペットも含有することができる。

キットは、本開示のオリゴヌクレオチドまたは組成物を患者に投与するための指示をさらに含有することができる。キットは、米国食品医薬品局等の規制機関によって承認された本明細書におけるオリゴヌクレオチドの使用の指示も含むことができる。キットは、オリゴヌクレオチドについてのラベリングまたは製品添付文書も含有することができる。パッケージもしくは任意の製品添付文書または両方は、それら自体が規制機関によって承認されてよい。キットは、パッケージ内に、固相または液相（提供される緩衝液等）のオリゴヌクレオチドを含むことができる。キットは、方法を行うために溶液を調製するための緩衝液、および液体を１つのコンテナから別のコンテナへ移すためのピペットも含むことができる。

例証を目的としておよび本開示のある特定の具体的な実施形態を記載するために、実施例が以下で明記されている。しかしながら、特許請求の範囲は、本明細書において明記されている実施例によって決して限定されるものではない。開示されている実施形態への種々の変更および修正は、当業者に明らかであろうし、限定なく、本開示の化学構造、置換基、誘導体、製剤または方法に関連するものを含むそのような変更および修正は、本開示の趣旨および添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、為され得る。本明細書におけるスキーム内の構造における変数の定義は、本明細書において提示される式中の対応する位置のものに見合っている。

細胞透過性ペプチドは、タンパク質およびオリゴヌクレオチドを含む治療的に関連する大型分子の細胞内送達を容易にすることができる。天然および合理的設計の両方に由来する数百のＣＰＰ配列が文献において記載されているが、任意の所与の配列の性能は、それが目的のカーゴによく適合していることに依拠する。本実験は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のために最近ＦＤＡに承認された説得力のある種類のアンチセンス治療薬であるホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）の送達のためのＣＰＰに特異的に焦点を合わせている。フルオロフォアカーゴとは対照的にＰＭＯカーゴの送達のための公知のＣＰＰの性能における幅広い差異が、本明細書において記載されている。したがって、いずれのペプチド配列がＰＭＯ送達を最も特異的に実施するかを予測するための計算法の使用は、活性ＣＰＰ−ＰＭＯコンジュゲートを決定するための効率的な方法となるであろう。

特異的なカーゴを送達するために有効なＣＰＰを発見または予測することは、依然として未解決の課題である。ＣＰＰ配列を予測するための１つの方法は、ＣＰＰの実験データセットに対してトレーニングされた計算モデルを構築することによる。サポートベクターマシンおよびＮ対１ニューラルネットワークを用い、物理化学的特性、アミノ酸組成およびジペプチド組成に基づくＣＰＰ予測については、以前に記載されている。これらのモデルは、いくつかの論文から収集されたＣＰＰ配列に対してトレーニングされており、これは、異なる実験設計（細胞系、濃度等）を用い、細胞透過を測定するために蛍光カーゴを主に使用する。結果として、これらのモデルは、所与の送達問題のためのＣＰＰ選択に影響を与えるカーゴ特異的な基準を獲得しない。

計算モデルのライブラリーを生成するために、文献のＣＰＰ配列を使用して６４のＣＰＰ−ＰＭＯコンジュゲートを合成し、コンジュゲートを蛍光ベースのレポーターアッセイにおいて機能的エクソンスキッピングについて評価した。次いで、このライブラリーからのエクソンスキッピングデータを使用して、所与のペプチドが、ＰＭＯにコンジュゲートされた場合にエクソンスキッピングを少なくとも３倍強化するか否かを予測するためのランダム決定フォレスト分類子を当てはめた。最後に、７つの以前に報告されていないペプチド配列（「ＰＰＣ」と呼ばれる）をレポーターアッセイにおいて評価して、計算モデルを検証した。計算的に予測された配列の１つは、ＰＭＯの特異的送達を、試験された文献のＣＰＰの８０％よりも良好に実施した。これらの結果は、ＣＰＰ配列を目的のカーゴに合わせることの重要性および特定の機能を有するペプチド配列を発見するための機械学習の検出力を強調する。

（実施例１）
ペプチド調製および精製のための一般的方法
高速流動ペプチド合成
ペプチドは、自動流動ペプチド合成装置を使用して０．１ｍｍｏｌスケールで合成した。ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＨＹＲ樹脂（２００ｍｇ）を、９０℃で維持した反応器にロードした。すべての試薬を、９０℃で維持したステンレス鋼ループに通すＨＰＬＣポンプを用いて８０ｍＬ／分で流した後、反応器に導入した。各カップリングについて、ＤＭＦ中０．２Ｍアミノ酸および０．２Ｍ ＨＡＴＵを含有する１０ｍＬの溶液を、２００μＬのジイソプロピルエチルアミンと混合し、反応器に送達した。１０．４ｍＬの２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを使用して、Ｆｍｏｃ除去を遂行した。各ステップの間に、１５ｍＬのＤＭＦを使用して、反応器を洗い流した。最終カップリングはアミノ酸ではなく４−ペンチン酸とであったが、同じ条件を使用した。合成の完了後、樹脂をＤＣＭで３回洗浄し、真空下で乾燥させた。

ペプチド開裂および脱保護
各ペプチドを、６ｍＬのＲｅａｇｅｎｔ Ｋ（８２．５％トリフルオロ酢酸、５％フェノール、５％水、５％チオアニソールおよび２．５％ １，２−エタンジチオール（ＥＤＴ））での処理による同時包括的な側鎖脱保護および樹脂からの開裂に供した。開裂物を室温で１６時間放置して、Ｐｂｆの完全な除去を確実にした。開裂カクテルを濾過して樹脂を除去し、Ｎ２を混合物に吹き込むことによって、蒸発させた。次いで、約３５ｍＬの冷エーテルを添加し、粗生成物を、３分間の遠心分離を通してペレット化した。このエーテル研和および遠心分離をもう２回繰り返した。第３の洗浄の後、ペレットを５０％水および５０％アセトニトリルに再溶解し、凍結乾燥した。

ペプチド精製
溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡを含有する水
溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル
凍結乾燥したペプチドを、最小体積の移動相（９５％Ａ、５％Ｂ）に溶解した。溶液を、質量ベースの精製システムに付着させた逆相ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ１８カラム：９．４×２５０ｍｍ、５μｍまたはＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ３カラム：９．４×２５０ｍｍ、５μｍ）にロードした。線形勾配は０．５％Ｂ／分で５％Ｂから５５％Ｂまで実行した。機器からの各画分についての質量データを使用して、純粋な画分のみをプールし、凍結乾燥した。画分プールの純度をＬＣ−ＭＳによって確認した。

実施例１のプロトコールを使用して、表２のペプチドを合成した。

（実施例２）
ペプチドコンジュゲーション
５−アジドペンタン酸をＰＭＯにカップリングするための手順
ＰＭＯ ＩＶＳ−６５４（Ｒ_２＝５’−ＧＣＴ ＡＴＴ ＡＣＣ ＴＴＡ ＡＣＣ ＣＡＧ−３’；ｚ＝１８）（２００ｍｇ、３２μｍｏｌ）を、６００μＬのＤＭＳＯに溶解した。溶液に、２４４μＬのＤＭＦ中のＨＢＴＵ（３２０μＬのＤＭＦ中０．４Ｍ ＨＢＴＵ、１２８μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２２．３μＬ、１２８μｍｏｌ）で活性化させた４当量の５−アジドペンタン酸（１３．６μＬ、１２８μｍｏｌ）を含有する溶液を添加した（最終反応体積＝１．２ｍＬ）。反応を２５分間進めた後、１ｍＬの水および２ｍＬの水酸化アンモニウムでクエンチした。水酸化アンモニウムは、反応過程中に形成されたあらゆるエステルを加水分解する。１時間後、溶液を４０ｍＬに希釈し、逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ３カラム：２１．２×１００ｍｍ、５μｍ）および５８分間かけて（１％Ｂ／分）２から６０％Ｂまでの線形勾配（溶媒Ａ：水；溶媒Ｂ：アセトニトリル）を使用して精製した。機器からの各画分についての質量データを使用して、純粋な画分のみをプールし、凍結乾燥した。画分プールの純度をＬＣ−ＭＳによって確認した。凍結乾燥により、１７１ｍｇの乾燥粉末（８４％収率）を得た。

アジド／アルキンヒュスゲン環化付加によるＰＭＯ−ペプチドコンジュゲーションのための一般的手順
セプタムキャップ付きの２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、ペプチドアルキン（１．１μｍｏｌ）、ＩＳＶ２−６５４アジド（０．９５μｍｏｌ）および臭化銅（０．０５ｍｍｏｌ）を投入した。バイアルを窒素で５分間パージして、酸素の除去を確実にした後、セプタムを通して約１ｍＬのＤＭＦを添加した。反応混合物を１分間ボルテックスした。２時間後、反応混合物を１０ｍＬの５０ｍＭトリス（ｐＨ８）で希釈し、逆相ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ３ ９．４×５０ｍｍ、５μｍ）にロードした。２０分間かけて５〜４５％Ｂの線形勾配を使用して、クロマトグラフィーを実施した。溶媒Ａ：水中５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝８；溶媒Ｂ：９０％アセトニトリル １０％水中５ｍＭ酢酸アンモニウム ｐＨ＝８。機器からの各画分についての質量データを使用して、純粋な画分のみをプールし、凍結乾燥した。画分プールの純度をＬＣ−ＭＳによって確認した。

（実施例３）
計算設計
５分割交差検証(five-fold cross validation)を用いて推定された分類正確度を有するグリッド検索を通して、ランダムフォレスト分類子ハイパーパラメーターを最適化した。選択された特徴の数、ツリーの数および最大ツリー深度は、それぞれ、５、１０および５であった。２０配列のホールドアウト試験セットに対する分類子評価からの性能測定基準を、図２Ａに示す。

性能測定基準を以下で定義し、ＴＰは、真陽性を指し、ＴＮは、真陰性を指し、ＦＰは、偽陽性を指し、ＦＮは、偽陰性を指す。

各ペプチド配列について１９の特徴を算出し、そのうちの１つはペプチド分子量であった。残りの１８の特徴は６つのアミノ酸物理化学的記述子に由来し、これらは、２２の天然および５９３の非天然アミノ酸について算出された３８４の分子特性の因子分析によって産生された。各ペプチド配列について、これらの６つの記述子を、５つのＮ末端残基、５つのＣ末端残基およびペプチド配列全体にわたって平均化した。

ＣＰＰ配列を、コンジュゲートされていないＰＭＯに関してｅＧＦＰ蛍光における３倍を上回る変化を呈するか否かに基づき、陽性または陰性例のいずれかとして分類した。４４の配列をランダムフォレストモデルのためのトレーニングセットとして使用し、２０の配列をホールドアウト（hold out）して、モデルがデータに適正に当てはまり、配列のエクソンスキッピング活性を成功裏に予測することができる程度を評価するための試験セットとして役立てた。モデルの性能測定基準を、図２Ａに示す。

実験的に検証するために、ＣＰＰライブラリーからのトレーニングデータセットにおいて観察された分布に比例する見込みがあるペプチド長およびアミノ酸組成を選択することにより、ランダムペプチド配列を生成した。ランダムペプチドのうち、５つの陽性配列はｅＧＦＰ蛍光における３倍を上回る増大につながることが予測され、２つは陰性配列（ＮＳ）であることが予測された。ＰＭＯ送達のための新規ペプチド配列を開発するためにより多くの陽性配列を選択し、これらは予測されたＰＭＯ担体（ＰＰＣ）と称された。これらのＰＰＣを、固相ペプチド合成によって合成し、ＰＭＯ ＩＶＳ２−６５４にコンジュゲートし、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。結果を、図２Ａおよび図２Ｂに示す。

（実施例４）
フローサイトメトリー
ＰＭＯ−ＣＰＰコンジュゲートのライブラリーを試験するために、ＧＦＰ蛍光のフローサイトメトリー分析を行った。ＣＰＰを試験するために、ＨｅＬａ６５４細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＭＥＭ中、３７℃および５％ＣＯ_２で維持した。各ＰＭＯ−ＣＰＰコンジュゲートのストックを、リン酸緩衝血清（ＰＢＳ）中で調製した。２６０ｎｍにおける吸光度を測定することおよび１６８，７００Ｌｍｏｌ^−１ｃｍ^−１の吸光率を使用することによって、ストックの濃度を決定した。細胞を、５μＭの濃度の各それぞれのコンジュゲートとともに、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＭＥＭ中、３７℃および５％ＣＯ_２で２２時間インキュベートした。次に、処理培地を吸引し、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ ０．２５％とともに３７℃および５％ＣＯ_２で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、２％ＦＢＳおよび２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムを加えたＰＢＳに再懸濁した。

フローサイトメトリー分析をＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで行った。ゲートをデータに適用して、ヨウ化プロピジウムに対して高度に陽性であるかまたは主な細胞集団とは十分に異なる前方／側方散乱読み取りを有する細胞を除外した。各ヒストグラムは、少なくとも１０，０００のゲート化事象を含有する。結果を、図１Ｅ、図２Ｃおよび表３に示す。

（実施例５）
阻害剤実験
様々なエンドサイトーシスの機序を阻害するために、パルスチェイス実験を実施した。簡潔に述べると、ＨｅＬａ６５４細胞を、９６ウェルプレート内、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＭＥＭ中、１ウェル当たり５，０００細胞の密度で平板培養した。翌日、細胞を、示された濃度の各阻害剤で処理した。３０分後、ＰＭＯ−ペプチドコンジュゲートを、５μＭの濃度で各ウェルに添加した。３７℃および５％ＣＯ_２で３時間インキュベーション後、処理培地を新鮮培地（阻害剤もＰＭＯ−ペプチドもなし）で置き換え、細胞を、３７℃および５％ＣＯ_２でもう２２時間成長させた。４℃の実験では、平板培養の翌日、細胞を４℃で３０分間プレインキュベートし、続いて、ＰＭＯ−ペプチドコンジュゲートを、５μＭの濃度で各ウェルに添加した。４℃で３時間のインキュベーションの後、処理培地を新鮮培地で置き換え、細胞を、３７℃および５％ＣＯ_２でもう２２時間成長させた。次いで、試料調製およびフローサイトメトリーを、上述した通りに実施した。各ヒストグラムは、２０μＭサイトカラシンＤおよび２００ｎＭワートマニンによる処理を除いて、少なくとも２，０００のゲート化事象を含有する。結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。

ｅＧＦＰ蛍光は、阻害剤の多くとのプレインキュベーション後も比較的変化しなかったが、サイトカラシンＤとのプレインキュベーションは、ｅＧＦＰ蛍光の顕著な減少につながった。サイトカラシンＤは、アクチンミクロフィラメントの迅速に成長する反矢じり端に結合し、これにより、アクチンモノマーの集合および解離を防止する。これは、細胞の細胞骨格だけでなく、かき乱し再編成してマクロピノサイトーシスを容易にする膜の能力にも影響を及ぼす。ｅＧＦＰ蛍光の減少はエクソンスキッピング経路における下流への効果によるものである可能性があるが、これらの結果は、マクロピノサイトーシスが、本コンジュゲートの内部移行において重要な役割を果たすことを示唆する。

参照による組み込み
本出願全体を通して引用されるすべての参考文献（文献参照、発行済み特許、公開された特許出願および同時係属中の特許出願を含む）の内容は、これによりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者に一般的に公知の意味と一致する。

均等物
当業者ならば、日常実験以上のものを使用することなく、本明細書において記載されている開示の具体的な実施形態の多くの均等物を認識または解明することができるであろう。そのような均等物は、下記の特許請求の範囲によって包含されるように意図されている。

Claims (21)

1. 式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
   または薬学的に許容されるその塩であって、式中、
   Ａ’は、−ＮＨＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−Ｎ（Ｃ_１〜６−アルキル）ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、
   から選択され、式中、
   Ｒ^５は、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）_ｘ−ＯＨであり、ｘは、３〜１０であり、各アルキル基は、各出現において独立して、Ｃ_２〜６−アルキルであるか、またはＲ^５は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_１〜６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ_１〜６−アルキル）Ｒ^６、−（Ｃ_１〜６−へテロアルキル）−Ｒ^６、アリール−Ｒ^６、ヘテロアリール−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ_１〜６−アルキル）−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ^６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ^６、および
   から選択され、
   式中、Ｒ^６は、ＯＨ、ＳＨおよびＮＨ_２から選択されるか、またはＲ^６は、固体支持体に共有結合的に連結しているＯ、ＳもしくはＮＨであり、
   各Ｒ^１は、ＯＨおよび−ＮＲ^３Ｒ^４から独立して選択され、各Ｒ^３およびＲ^４は、各出現において独立して、−Ｃ_１〜６−アルキルであり、
   各Ｒ^２は、Ｈ、核酸塩基、および化学保護基で官能基化された核酸塩基から独立して選択され、前記核酸塩基は、各出現において独立して、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリンおよびデアザ−プリンから選択されるＣ_３〜６−複素環式環を含み、
   ｚは、８〜４０であり、
   Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ_１〜６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_１〜６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
   から選択され、式中、
   Ｑは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_２Ｓ_２（ＣＨ_２）_２Ｃ（Ｏ）−であり、
   Ｒ^７は、−（ＣＨ_２）_２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であり、Ｒ^８は、−（ＣＨ_２）_６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２であり、
   Ｌは、Ｊのアミノ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_１〜６−Ｃ_１〜６−ヘテロ芳香族−（ＣＨ_２）_１〜６Ｃ（Ｏ）であり、
   ｔは、５〜２７であり、
   各Ｊは、各出現において独立して、アルギニン、グリシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リシン、グルタミン、グルタミン酸、セリン、プロリン、バリン、イソロイシン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸およびトレオニンからなる群より選択され、
   少なくとも１つのＪは、アルギニンであり、
   Ｇは、Ｊのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、Ｇは、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_１〜６−アルキル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される｝
   下記の条件の少なくとも１つが真である：
   １）Ａ’は、
   であるか、または２）Ｅ’は、
   である、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩。
2. Ａ’が、−Ｎ（Ｃ_１〜６−アルキル）ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、
   から選択される、請求項１に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
3. Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、４−メトキシトリチル、および
   から選択される、請求項１から２のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
4. 前記式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、
   から選択されるペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであり、式中、Ｅ’は、Ｈ、Ｃ_１〜６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される、請求項１に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
5. 式（Ｉａ）のものである、請求項１または４に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
6. 式（Ｉｂ）のものである、請求項１または４に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
7. 各Ｊが、グリシン、アラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リシン、グルタミン、グルタミン酸、セリン、プロリン、バリン、アルギニンおよびトレオニンから独立して選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
8. 各Ｊが、アルギニンである、請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
9. 各Ｒ^１が、Ｎ（ＣＨ_３）_２である、請求項１から８のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
10. 各Ｒ^２が、各出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンから選択される核酸塩基である、請求項１から９のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
11. Ｌが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_１〜６−トリアゾール−（ＣＨ_２）_１〜６Ｃ（Ｏ）−である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
12. Ｌが、
    である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
13. Ｇが、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
14. Ｇが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３である、請求項１から２３のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
15. Ｊが、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、ＲＲＩＲＰＲＰＰＲＬＰＲＰＲＰＲＰＬＰＦＰＲＰＧ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＲＰＲＥＳＧＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰ、ＡＬＷＫＴＬＬＫＫＶＬＫＡＰＫＫＫＲＫＶ、ＲＲＩＰＮＲＲＰＲＲ、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ、ＨＡＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＹＫＧＫＦＷ、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ、ＬＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＥＲＱＳＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱ、ＲＨＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ、ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ、ＫＱＩＮＮＷＦＩＮＱＲＫＲＨＷＫ、ＫＬＷＭＲＷＹＳＰＴＴＲＲＹＧ、ＲＲＷＷＲＲＷＲＲ、ＳＱＩＫＩＷＦＱＮＫＲＡＫＩＫＫ、ＧＡＹＤＬＲＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＲＥＲＱＳＲ、ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ、ＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰ、ＲＱＶＴＩＷＦＱＮＲＲＶＫＥＫＫ、ＲＬＲＷＲ、ＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲ、ＣＡＹＨＲＬＲＲＣ、ＳＲＲＡＲＲＳＰＲＨＬＧＳＧ、ＰＰＲＰＰＲＰＰＲＰＰＲ、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ、ＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＭＤＶ、ＬＹＫＫＧＰＡＫＫＧＲＰＰＬＲＧＷＦＨ、ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ、ＫＧＴＹＫＫＫＬＭＲＩＰＬＫＧＴ、ＰＰＲＰＰＲＰＰＲ、ＲＡＳＫＲＤＧＳＷＶＫＫＬＨＲＩＬＥ、ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＷＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ、ＦＫＩＹＤＫＫＶＲＴＲＶＶＫＨ、ＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰ、ＧＰＦＨＦＹＱＦＬＦＰＰＶ、ＰＬＩＬＬＲＬＬＲＧＱＦ、ＹＴＡＩＡＷＶＫＡＦＩＲＫＬＲＫ、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＲＫＶ、ＬＩＲＬＷＳＨＬＩＨＩＷＦＱＮＲＲＬＫＷＫＫＫ、ＶＤＫＧＳＹＬＰＲＰＴＰＰＲＰＩＹＮＲＮ、ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ、ＧＳＰＷＧＬＱＨＨＰＰＲＴ、ＫＬＡＬＫＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ、ＩＰＡＬＫ、ＶＰＡＬＲ、ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ、ＩＡＷＶＫＡＦＩＲＫＬＲＫＧＰＬＧ、ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＶＱＲＫＲＱＫＬＰ、ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ、ＶＰＴＬＫ、またはＶＳＡＬＫである、請求項１に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
16. Ｊが、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、ＲＲＩＲＰＲＰＰＲＬＰＲＰＲＰＲＰＬＰＦＰＲＰＧ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＲＰＲＥＳＧＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰ、またはＡＬＷＫＴＬＬＫＫＶＬＫＡＰＫＫＫＲＫＶである、請求項１から１５のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
17. 請求項１から１６のいずれか一項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
18. 筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症の処置を必要とする被験体において、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を処置する方法であって、前記被験体に、請求項１から１６のいずれか一項に記載の化合物または請求項１７に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
19. 前記筋疾患が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ウイルス感染症が、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルスおよびデングウイルスからなる群より選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項１８に記載の方法。
21. 前記細菌感染症が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって引き起こされる、請求項１８に記載の方法。