JP2020536632A - 移植可能なバイオリアクター、ならびにその作製方法および使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、エンクロージャ内に密閉された細胞を備える移植可能なバイオリアクターであって、前記細胞はパラクリン因子を産生することができ、前記エンクロージャは折り畳み可能であるか、拡張可能であるか、折り畳み可能かつ拡張可能であるか、または折り畳み可能でも拡張可能でもなく、前記エンクロージャは、前記細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、前記細胞を免疫学的攻撃から保護する免疫学的バリアをさらに提供するように半透過性であり、前記エンクロージャはエキソソーム、核酸およびタンパク質を含む細胞のセレクトーム全体に対して透過性である。前記移植可能なバイオリアクターは様々な構成を有し得、その他の活性剤と共にヒドロゲル、マイクロビーズおよびナノファイバーマトリックスを含み得る細胞培養マトリックスを内部に収容することができる。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０１７年１０月５日に出願された米国仮特許出願第６２／５６８，３４８号の利益を主張し、当該出願の内容は、本明細書に完全に記載されているかのようにあらゆる目的で参照により本明細書に援用される。

幹細胞およびそれらが生成する生成物は、損傷した組織を再生し、損傷後の治癒を改善する可能性を秘めている。このような治療は、心筋梗塞（ＭＩ）などの組織損傷後の有害なリモデリングを制限し得る。有害なリモデリング、即ち、ＭＩ後の収縮末期容積（ＥＳＶ）および拡張末期容積（ＥＤＶ）の変化によって評価される左心室容積の増加は、死亡率と心不全の発症との強力な予測因子である。しかしながら、多くの臨床試験のおける有害なリモデリングに対する幹細胞療法の効果は、現在まで控えめである。１つの理由は、静脈内もしくは冠動脈内注入によるか、または直接の心筋注入によるかにかかわらず、幹細胞を患者に送達するために現在使用されている方法の多くでは、おそらく、心臓に留まる細胞の割合はごくわずかであり、心臓に留まる細胞のうち有意な期間生存する細胞はほとんどないことであるかもしれない。同時に、幹細胞療法の好ましい効果の多くは、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、核酸、エキソソーム、ならびにその他の分子および小胞の放出から生じるという前臨床研究からの証拠が増えている。細胞セクレトームのこれらおよびその他のコンポーネントは、まとめて「パラクリン因子」と呼ばれる。したがって、心臓に送達された細胞がそこに留まり、限られた期間しか生残しない場合、該細胞がパラクリン機構を介して有益な効果を発揮するための時間も同様に限られ、このことは、ほとんどの臨床試験で見られる控えめな有益な効果に対する１つの説明であるかもしれない。

梗塞をした心筋の治癒および再生を促進するために幹細胞の冠内および心筋内注射を使用した臨床試験は、これまでに控えめな結果をもたらしてきた。控えめな結果の潜在的な理由にはパラクリン因子の不十分なレベルが含まれ、これは、細胞死、免疫学的メカニズムによる除去、および送達後の単純な「ウォッシュアウト」による細胞の保持不良が原因であり、細胞に有益な効果を発揮するための短時間の機会しか残さない。

したがって、修復および治癒を必要とする臓器にパラクリン因子を送達するための改善された方法に対する満たされていないニーズが依然として存在する。

幹細胞の生存および保持を改善し、それにより幹細胞が有益なパラクリン媒介効果を発揮できる時間を増加させるために、本発明者は、移植可能なバイオリアクターを開発した。当該バイオリアクターは、細胞、例えば幹細胞の集団を収容するエンクロージャであり、いくつかの実施形態では他の非幹細胞型を備え、パラクリン因子、栄養素および廃棄物の自由交換を可能にするが、細胞の自由交換は可能にしない半透過性膜を有し、２０１１年１０月３日に出願された米国特許出願第１３／２５１，９１０号に開示された本発明者の第１世代バイオリアクターに関連し、当該出願の内容はその全体が記載されているかのように参照により本明細書に援用される。バイオリアクターの細胞の脱出とホストの免疫細胞の侵入とを防ぐことにより、当該バイオリアクターは、パラクリン因子を放出しながら、収容される細胞がｉｎ ｖｉｖｏで長期間生存できる保護された環境をもたらし、したがって有益な効果をもたらす時間を長くすることができる。移植可能なバイオリアクターは、パラクリン因子の全身または局所送達用であり得る。バイオリアクターは、任意に、別の医療デバイスに接着することができる。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、エンクロージャ内の細胞培養マトリックス内の細胞であって、パラクリン因子を産生することができる細胞を備え、前記エンクロージャは折り畳み可能であるか、拡張可能であるか、折り畳み可能かつ拡張可能であるか、または折り畳み可能でも拡張可能でもなく、前記エンクロージャは、前記細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、免疫学的バリアも提供することができるように半透過性である、移植可能なバイオリアクターを提供する。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、移植可能なバイオリアクターであって、前記バイオリアクターの前記エンクロージャは非細胞支持構造を備え、該構造はその表面上での細胞の増殖を可能にする、移植可能なバイオリアクターを提供する。そのような支持構造の例には、マイクロビーズ、ナノファイバー、およびヒドロゲルが含まれるが、これらに限定されず、折り畳み可能および拡張可能にすることもできる。

さらなる実施形態によれば、本発明は、エンクロージャ内のナノファイバーの三次元ネットワーク内に密閉された細胞であって、パラクリン因子を産生することができる細胞を備え、前記エンクロージャは折り畳み可能であるか、拡張可能であるか、折り畳み可能かつ拡張可能であるか、または折り畳み可能でも拡張可能でもなく、前記エンクロージャは、前記細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、免疫学的バリアも提供することができるように半透過性である、移植可能なバイオリアクターを提供する。

一実施形態によれば、本発明は、エンクロージャ内に密閉された細胞であって、パラクリン因子を産生することができる細胞を備え、前記エンクロージャは折り畳み可能であるか、拡張可能であるか、折り畳み可能かつ拡張可能であるか、または折り畳み可能でも拡張可能でもなく、前記エンクロージャは、少なくとも１つの透過性材料層に接触または隣接する少なくとも１つの半透過性材料層を含み、前記透過性材料層は前記エンクロージャの外側を向いている側にあり、前記エンクロージャは、前記細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、免疫学的バリアも提供することができるように半透過性である、移植可能なバイオリアクターを提供する。

別の実施形態によれば、本発明は、エンクロージャ内の細胞であって、パラクリン因子を産生することができる細胞を備え、前記エンクロージャは折り畳み可能であるか、拡張可能であるか、折り畳み可能かつ拡張可能であるか、または折り畳み可能でも拡張可能でもなく、前記エンクロージャは、少なくとも第１および第２の透過性材料層の間に、接触してまたは隣接して配置された少なくとも１つの半透過性材料層を含み、前記第１の透過性材料層は前記エンクロージャの外側を向いている側にあり、前記第２の透過性材料層は前記エンクロージャの内側を向いている側にあり、前記エンクロージャは、前記細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、免疫学的バリアも提供することができるように半透過性である、移植可能なバイオリアクターを提供する。

一実施形態によれば、本発明は、エンクロージャ内の細胞であって、パラクリン因子を産生することができる細胞を備え、前記エンクロージャは、細胞培養マトリックス内の少なくとも１つの細胞層に接触または隣接する少なくとも１つの半透過性材料層を含み、前記第１の透過性材料層は前記エンクロージャの外側を向いている側にあり、前記細胞層は前記エンクロージャの内側を向いている側にあり、該構造が前記細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、免疫学的バリアも提供することができるように、前記細胞層は巻くか、積み重ねるか、折り畳む（ｒｏｌｌｅｄ， ｓｔａｃｋｅｄ， ｏｒ ｆｏｌｄｅｄ）ことができる、移植可能なバイオリアクターを提供する。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、エンクロージャ内の細胞を備える移植可能なバイオリアクターであって、前記バイオリアクター内に１つ以上のエンクロージャまたはルーメンが存在する、移植可能なバイオリアクターを提供する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのパラクリン因子産生および細胞生存率実験のための第１世代（Ｇ１）幹細胞移植可能なバイオリアクター（ＳＣＩＢ）示す図である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプロトタイプＧ１−ＳＣＩＢからのパラクリン因子の放出を示す図である。１０^６個のヒトＭＳＣを含むＧ１−ＳＣＩＢは、７日間にわたって培養されたとき、周囲の培地に関連するＰＦを放出した。 ｉｎ ｖｉｖｏのプロトタイプＧ１−ＳＣＩＢを示す図である。Ａ）右の内頸静脈を介して移植されたプロトタイプＧ１−ＳＣＩＢの透視画像。異種間ヒトＭＳＣは、Ｂ）ブタの生体内で１週間後にプロトタイプＳＣＩＢから関連するＰＦを放出し続け、Ｃ）培養において正常なＭＳＣ形態および増殖特性を示した。 ＥＳＶ（ｐ＝０．０３６細胞ｖｓプラセボ）およびＥＤＶ（ｐ＝０．０５９細胞ｖｓプラセボ）の増加量の減少により測定したとき、Ｇ１−ＳＣＩＢ療法はＭＩ後４週間の有害なリモデリングを減少させた。 ＭＩの３日後および４週間後の遅延ガドリニウム造影ＭＲＩにより測定された傷跡のサイズ。傷跡のサイズは、細胞群およびプラセボ群の両方で変化したが、ＳＣＩＢベースの細胞療法は、密なコア傷跡の減少とともに、不均一な灰色の傷跡の増加をもたらした。 トラックエッチングされた（ポリ）エチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムの走査型電子顕微鏡写真であり、均一な円柱状の細孔の密なパターンを示している（低倍率：左；高倍率：右）。 Ｇ２ ＳＣＩＢ装置の一実施形態の概略図であり、以下の寸法を有するカテーテル上のデュアルルーメンパウチを示す：シャフト長３０ｃｍの０．０６４インチカテーテルシャフト、２ｍｍテーパーカテーテルチップ、シングル０．０１４インチＯＴＷガイドワイヤーポート、シングル細胞注入ポート、ルアー互換接続、および２つの放射線不透過マーカー（図７Ａ）。バイオリアクターのパウチの実施形態を示す写真である。写真は、以下の仕様のＧ２−ＳＣＩＢ細胞チャンバー設計を示している：壁厚約２５ｕｍ、直径約６．０ｍｍ、長さ約１２０ｍｍで、直径約２μｍのトラックエッチングされた細孔を有し、約７×１０^６〜８×１０^６細孔／ｃｍ^２のポリエチレンテレフタレート構造（図７Ｂ）。チャンバーまたはパウチは、内部マイクロビーズ（カスタマイズ可能）および／または内部ヒドロゲル（カスタマイズ可能）などの非細胞支持構造を含むことができる。 本発明のデュアルルーメンパウチまたはチャンバーの一連の写真を示す図であり、直径約２μｍのトラックエッチングされた細孔、およびそれらの高く均一な密度を詳細に示す顕微鏡写真が２つの異なる倍率で示されている。 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）がフィブロネクチンでコーティングされたポリスチレンビーズに付着できることを示す図であり、該ビーズは内部細胞接着微小表面を提供し、バイオリアクターの細胞パウチまたはチャンバー内の細胞容量および生存率を高める。細胞チャンバー内での培養７日後の緑：生細胞／赤：死細胞染色を使用して、顕微鏡写真は、ポリスチレンビーズに付着している生きているＭＳＣを示し、より高倍率で生きているＭＳＣを有する単一ビーズを示す。細胞チャンバー内における９０％超の細胞生存率が７日で達成され、生細胞はチャンバーまたはパウチ全体に分布していた。 直径０．４４μｍの細孔を有するトラックエッチングされたＰＥＴ膜パウチの透過性を示す図である。（Ａ）ＦＩＴＣ標識ウシ血清アルブミンは、ＳＣＩＢから迅速に放出される；（Ｂ）エキソソーム（赤で表示）も膜を自由に通過し、Ｈ９ｃ２ラット心筋芽細胞（緑）によって容易に取り込まれる。 ＭＳＣがヒドロゲルマトリックスなしでＳＣＩＢパウチにロードされた場合（Ｂ、オレンジ）よりも、ＭＳＣがヒドロゲルマトリックスと一緒にＳＣＩＢパウチにロードされた場合（Ｂ、青）に、Ｇ２−ＳＣＩＢパウチ中のマウスＭＳＣの生物発光イメージング（ＢＬＩ）（Ａ）は著しく高くなる。生物発光が高いほど、細胞生存率が高くなる。 Ａ）Ｇ２−ＳＣＩＢ（オレンジ）からのＶＥＧＦ放出は、Ｇ１−ＳＣＩＢ（青）からのＶＥＧＦ放出よりも１０倍以上多い。Ｂ）これと一致して、Ｇ２−ＳＣＩＢによって誘発された内皮細管形成も、Ｇ１−ＳＣＩＢによって誘発された内皮細管形成を上回る。 細胞培養マトリックスまたはナノファイバークラウドを封入する透過性膜および半透過性膜を有する本発明のバイオリアクターエンクロージャの実施形態の例を示す図である。 ナノファイバーメッシュおよび細胞層を有する交互の層を備えたロール型エンクロージャバイオリアクターの実施形態の例を示す図である。

本明細書において開示される移植可能なバイオリアクターの実施形態は、密閉ハウジングにおけるウォッシュアウトまたは免疫学的クリアランスからバイオリアクターの内容物を保護しながら、バイオリアクターから分泌されるパラクリン因子の適切な長期送達をもたらすことにより、拡散またはウォッシュアウトの問題を解決することができる。本発明は、一実施形態では低侵襲の経皮バイオリアクターを、別の実施形態では移植可能なデバイスを含み、その両方がパラクリン因子を適切に産生および放出することができる。バイオリアクターは、パラクリン因子の放出により、他の組織または臓器における治癒および再生を促進するためにも使用され得る。

本明細書で使用される場合、「バイオリアクター」とは、ハウジングまたはエンクロージャ内の細胞の集まり、またはパウチ内の細胞によって生成されるパラクリン因子の放出を可能にする半透過性膜内に挟まれた細胞の集まりを指す。バイオリアクターは、複数のハウジング、エンクロージャ、またはルーメンを含むことができる。バイオリアクターは、カテーテルを使用して、またはカテーテル使用せずに、哺乳類における原位置に（ｉｎ ｓｉｔｕ）配置され得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、カテーテルまたは類似の装置を用いて、哺乳類の血管空間内の原位置に（ｉｎ ｓｉｔｕ）配置され得る。

本明細書で使用される場合、「パラクリン因子」とは、別の細胞に影響を与えるために１つの細胞によって産生される拡散性成分である。拡散性成分は、任意のタンパク質、成長因子、核酸、核物質、ウイルス、ウイルスベクター（遺伝子治療で使用されるベクターを含む）、脂質、生体分子、サイトカイン、ケモカイン、小胞、エキソソーム、バイオリアクター内に収容された細胞によって産生される栄養素または流体を含む、細胞セクレトームの任意の成分であり得る。本発明のパウチの透過性特性は、パラクリン因子、栄養素、廃棄物、およびシグナル伝達因子のエンクロージャへの出入りを可能にするが、免疫細胞の侵入、または幹細胞もしくは他の種類の細胞の侵入もしくは流出は可能にしないように設計されているため、本発明の重要な特徴である。当業者は、「パラクリン因子」には、典型的には直径５０ｎｍ〜２００ｎｍの小胞であるエキソソームを含む多くの因子が含まれることを理解するであろう。いかなる特定の理論にもとらわれることなく、これらの因子は、組織修復を支援する目的のためにｉｎ ｖｉｖｏ導入される幹細胞または他の細胞型に起因するあらゆる保護効果の主要なメディエーターのうちの１つであることも企図される。パラクリン因子の例には、血管新生を促進する因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＡＮＧ）、細胞保護を促進する因子（例えば、ＩＧＦ−１、ＬＩＦ、ＴＭＳＢ４）、細胞増殖を促進する因子（例えば、ＦＧＦ、ＰＧＦ、ＳＣＧ）、細胞遊走を促進する因子（例えば、ＴＨＢＳ１、ＳＤＦ−１、ＰＤＧＦ）、ならびにこれらの因子の１つ以上を組み込んだ分泌型エキソソームが含まれる。

本明細書で使用される場合、「半透過性」という用語は、一部の実施形態では、エンクロージャの外膜が、特定のサイズの分子、タンパク質、ペプチド、核酸、小胞などが膜を通過することを許し、細胞などのより大きなサイズのオブジェクトは通過できないことを意味する。これらの種類の膜は市販されており、種々の分子量カットオフ値または細孔サイズを有する。他の実施形態では、「半透過性」という用語は、特定のサイズのタンパク質、ペプチド、核酸、小胞などが膜を通過し、細胞などのより大きなサイズのオブジェクトは通過できないことを可能にするために、透過性ではない膜または表面に特定の直径で作製された微細孔の存在を意味するために使用される。

本明細書で使用される場合、「幹細胞」は、胚性幹細胞、成体幹細胞、および人工多能性幹細胞を含み得るが、これらに限定されない。胚性幹細胞は、限定されることなく、全能性幹細胞、多能性幹細胞および複能性幹細胞を含み、成体幹細胞は、限定されることなく、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、脂肪由来幹細胞および内皮幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、例えば、線維芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、他のパラクリン因子分泌細胞（例えば、限定されることなく、肝細胞、膵島細胞、骨髄細胞）、または操作された細胞などの任意の非幹性型の細胞（ｎｏｎ−ｓｔｅｍ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｓ）およびそれらの任意の組み合わせも含まれ得る。いくつかの実施形態では、カーディオスフィア（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ）などの細胞クラスター、ならびに異なる幹細胞および非幹細胞の混合物も含まれ得る。いくつかの実施形態では、該細胞は、例えば、遺伝子改変細胞（例えば、細胞または細胞群に固有であっても固有でなくてもよい成長因子をコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞）、別の細胞型から形質転換された細胞（例えば、人工多能性幹細胞およびこれらの細胞に由来する細胞）、または検出可能な部分で標識された細胞（例えば、蛍光タグを有する細胞または生物発光をコードする遺伝子を有するトランスフェクトされた細胞）などの「改変」または「操作された」細胞を含み得る。

本発明の様々な実施形態は以下を含む：（ａ）細胞戦略を利用して損傷した心筋および他の組織の回復を強化する移植可能なバイオリアクター；（ｂ）経皮的に移植可能なバイオリアクター（意図した治療期間が完了した後の取り外しを可能にする、容易に回収可能な経皮バイオリアクターも含む）；（ｃ）細胞によって新たに（ｄｅ ｎｏｖｏ）生成されるパラクリン因子を放出する、一時的な移植可能なデバイス；（ｄ）細胞によって新たに（ｄｅ ｎｏｖｏ）生成されるパラクリン因子を放出する、永久的な移植可能なデバイス；（ｅ）標準的な血管鞘を介して移植されたバイオリアクター；（ｆ）標的組織においてパラクリン因子を局所的に放出する移植可能なバイオリアクター；（ｇ）細孔を有するバリアを含む移植可能なバイオリアクターであって、該細孔は細胞由来の生体分子の放出を可能にするが、免疫細胞および他の細胞の侵入、またはバイオリアクター内に収容された細胞の流出を可能にするほど十分に大きくない、移植可能なバイオリアクター；（ｈ）本明細書に記載されている材料で構成されるバリアを含み、該バリアは細胞由来の生体分子の放出を可能にするが、免疫細胞および他の細胞の侵入、またはバイオリアクター内に収容された細胞の流出を可能にするほど十分に大きくないように設計されている移植可能なバイオリアクター；（ｉ）パラクリン因子を全身的に放出する移植可能なバイオリアクター；（ｊ）カテーテル内にマルチチューブおよびマルチルーメン細胞チャンバーまたはパウチを有する移植可能なバイオリアクター；および（ｋ）細胞チャンバーまたはパウチ内に、マイクロビーズまたはナノファイバーまたはヒドロゲルマトリックスなどの非細胞支持構造を有する移植可能なバイオリアクター。

１つ以上の実施形態によれば、本発明のバイオリアクターは、パラクリン因子の全身送達または局所送達のいずれかのために設計され得る。バイオリアクターは、外科、腹腔鏡、経皮、内視鏡、関節鏡、または気管支鏡の技術を含むがこれらに限定されない任意の臨床技術による移植の実施形態を包含する。バイオリアクターは、様々な実施形態において、医療デバイスに接着することができる。

いくつかの実施形態では、全身送達用の移植可能なバイオリアクターは、幹細胞またはパラクリン因子を産生および放出する他の細胞型を収容するエンクロージャを備える。細胞エンクロージャは、一実施形態では、半透過性膜で製造された物理的エンクロージャを含み、別の実施形態では、幹細胞を封入する微孔質ポリマーマトリックスで製造された物理的エンクロージャを含む。細胞エンクロージャは、細胞に対しては非透過性であるが、流体、パラクリン因子、廃棄物および栄養素の自由な透過を可能にするのに十分なサイズの微細孔を含むので、それらは効率よくかつ妨害なしに移送され得る。いくつかの実施形態では、移植可能なバイオリアクターは、（中心静脈や大動脈などの）血管内空間に配置される；他の体腔、開口部、組織、血管、臓器、または皮膚（例えば、傷中）への移植も企図される。いくつかの実施形態では、移植可能なバイオリアクターは一時的に移植され、後で回収される。他の実施形態では、移植可能なバイオリアクターは永久的な移植物として無期限に残る。

本発明の移植可能なバイオリアクターは、標的における産生されたバイオプロダクト（ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の全身送達または局所送達のために設計され得る。どちらのタイプも、外科、腹腔鏡、経皮、内視鏡、関節鏡、または気管支鏡の技術を含むがこれらに限定されない任意の臨床技術による移植の実施形態を包含する。どちらのタイプも、様々な実施形態において、医療デバイスに接着することができる。

一実施形態では、全身送達用の移植可能なバイオリアクターは、パラクリン因子を産生および放出する幹細胞および／または他の細胞型を収容するエンクロージャを備える。細胞エンクロージャは、一実施形態では、幹細胞を封入する半多孔質膜で製造された物理的エンクロージャを含み、別の実施形態では、幹細胞を封入する微孔質ポリマーマトリックスで製造された物理的エンクロージャを含む。細胞エンクロージャは、細胞に対しては非透過性であるが、流体、パラクリン因子、廃棄物および栄養素の自由な透過を可能にするのに十分なサイズの微細孔を含むので、それらは効率よくかつ妨害なしに移送され得る。

全身送達用バイオリアクターの別の実施形態では、移植可能なバイオリアクターのエンクロージャは、そのルーメン中に幹細胞、他の細胞型、および／または培地を含むエンクロージャである。様々な実施形態において、エンクロージャは、（ａ）スタンドアロンであるか、または（ｂ）ワイヤーまたはカテーテルに取り付けられるか、または（ｃ）別の移植可能なデバイスの一部として取り付けられ得、（ｃ）の場合、エンクロージャは他のデバイスと一緒に移植され得る。これらの例のいずれにおいても、バイオリアクターは、外科的移植、経皮的移植、または任意の身体開口部もしくは傷を介した挿入、または腹腔鏡、内視鏡、関節鏡もしくは気管支鏡技術を介した配置を含むがこれらに限定されない任意の臨床技術によって移植され得る。これらの例のいずれにおいても、バイオリアクターは除去され得る。一実施形態では、エンクロージャを所望の内容物で事前に充填することができ、または、カテーテルに取り付けられている場合、移植中および移植後に、エンクロージャを充填すること、ならびに潜在的に空にすることおよび再充填することができる。経皮的に移植される場合、例えば血管内空間への配置のために、デバイスを直接または標準的な血管鞘を介して通すことができる（可能な実施形態が、図１、図７および図８に示されている）。

いくつかの実施形態によれば、本発明のバイオリアクターは、細胞用のエンクロージャとして機能する１つ以上の細胞チャンバーまたはパウチを備える。
（ａ）構造
いくつかの実施形態では、細胞チャンバー／パウチは、１つ以上のカテーテル管の本体または遠位端に取り付けられ、任意に、カテーテルを介した細胞パウチへの物質の注入、サンプリング、および／または循環を可能にするために、少なくとも１つの開放ポートにまたがる。細胞パウチの幾何学的形状に制限はない；例えば、細胞パウチは滑らかかつ円筒形であってもよく、複数の凹部と表面の起伏とで形作られてもよい。細胞パウチの最大直径は、それが配置される解剖学的構造を完全にまたがって閉塞しないようなものである。パウチの位置決めを支援するために、パウチのいずれかの端、パウチ内、または取り付けられたカテーテル上に、放射線不透過性マーカーを配置することができる。

いくつかの実施形態では、バイオリアクターのカテーテルは閉鎖され得、開放ポートを含まない。

要約すると、本発明のバイオリアクターの実施形態の複数のバリエーションが存在し得る。そのようなバリエーションは、例えば、１つ以上のカテーテル管を含むことができる；各カテーテル管は、１つ以上の細胞チャンバーまたはパウチを含むことができる；各細胞チャンバーまたはパウチは、１つ以上のカテーテル管にまたがることができる。

（ｂ）半透過性
いくつかの実施形態では、バイオリアクターエンクロージャの細胞パウチ壁は半透過性である。少なくとも２つの広範な可能な実施形態がある。第一の例示的な実施形態では、該壁は免疫保護バリアであり、したがって細胞に対しては不透過性であるが、（成長因子、タンパク質、脂質、エキソソーム、核物質、および細胞外小胞を含む）細胞セクレトームのコンポーネント、ならびに老廃物および栄養素に対しては透過性である。これらの条件を満たすことができる細孔サイズの具体的な範囲には、５０ｎｍ〜５０００ｎｍの細孔直径が含まれる。

第２の例示的な実施形態では、該壁は、ウォッシュアウトバリアとしてのみ機能する。この実施形態では、バイオリアクターエンクロージャの細胞パウチ壁は、細胞パウチ内の細胞を含む免疫保護構造に対して不透過性である（以下に詳述）が、それ以外の場合は透過性である。この場合の細孔直径は、内部免疫保護構造の最小直径よりも小さいことだけが必要である。

（ｃ）内部免疫保護構造
いくつかの実施形態によれば、細胞は、スタンドアロンまたは免疫保護構造内のいずれかで、バイオリアクターエンクロージャの細胞パウチ内に配置される。これらの免疫保護構造は文献に詳しく記載されており、ヒドロゲルミクロスフェア（例えば、キトサン、アルギン酸塩、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、およびそれらの様々な誘導体に基づく）およびエンクロージャ、セルロースベースのエンクロージャ、ナノファイバーベースのマトリックス、または微細加工された細胞エンクロージャを含む。これらの免疫保護構造の特徴には、半透過性が含まれる；すなわち、それらは細胞に対して不透過性であるが、栄養素、老廃物、および細胞セクレトームのコンポーネントに対して透過性である。細胞パウチ中の免疫保護構造内に細胞を配置することは、細胞パウチ自体も免疫保護性である必要はないことを示唆する。

（ｄ）材料組成
いくつかの実施形態によれば、バイオリアクターエンクロージャの細胞チャンバー／パウチは、広範囲の生体適合性の合成材料および非合成材料の１つまたはそれらの組み合わせから構成され得る。合成材料の例としては、特にポリ（エチレンテレフタレート）およびその誘導体を含むポリエステルおよびその誘導体のポリマーおよびコポリマー、ポリテトラフルオロエチレンおよびその誘導体を特に含むフルオロポリマー、ポリカーボネートおよびその誘導体、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）およびその誘導体、ポリ（ｎ−ブチルメタクリレート）およびその誘導体、ポリ（スチレン−ｂ−イソブチレン−ｂ−スチレン）およびその誘導体、ポリカプロラクトンおよびその誘導体、ポリイミドおよびその誘導体、ポリウレタンおよびその誘導体、ポリスルホンおよびその誘導体、ポリアクリロニトリルおよびその誘導体、ポリメチルメタクリレートおよびその誘導体、ポリ（乳酸）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、シリコンが挙げられる。非ポリマー材料には、シリコンおよびその誘導体が含まれ得る。非合成材料の例には、セルロースベースの材料およびその誘導体、コラーゲンベースの材料およびその誘導体、ならびに細胞外マトリックスベースの材料およびその誘導体が含まれる。材料はもともと多孔質である（例えば、セルロースまたは延伸ポリテトラフルオロエチレン）ことも、（トラックエッチング、レーザーマイクロドリル、マイクロマシニング、フォトリソグラフィーエッチング、化学エッチングなどの）様々な製造方法で多孔質にすることもできる。

コーティング
本発明のバイオリアクターエンクロージャの内面は、細胞の付着および機能を強化する分子でコーティングされ得る。具体例には、フィブロネクチン、ポリリジン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有するタンパク質、および任意の誘導体が含まれる。内面を表面修飾して、細胞の付着および機能を強化することもできる。このプロセスの具体例には、コロナ処理およびプラズマ処理が含まれる。バイオリアクターエンクロージャの外面は、血栓症および／または線維症を最小限に抑えるため、免疫原性を低下させるため、生体適合性を向上させるため、またはその他の物質の持続的送達性を向上させるために、コーティングまたは表面修飾され得る。コーティングまたは表面修飾の調整は、当業者によく知られている。具体例には、ヘパリン鎖またはポリエチレングリコール鎖の外部表面への付着、または外部表面のフルオロパッシベーション処理（ｆｌｕｏｒｏｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）が含まれる。さらに、薬物送達デバイスを細胞チャンバー／パウチに取り付けて、内部微小環境または細胞パウチの外部への任意の薬物または薬剤の送達を可能にすることができる。そのようなデバイスは、例えば、薬物または生物活性剤を含有する、ヒドロゲル、ポリマーマトリックス、ビーズ、およびナノ粒子を含み得る。

形状
バイオリアクターエンクロージャの物理的形状は、滑らかになるように設計され得るか、または物質移動のための表面積を最大化するために表面の起伏および凹部を組み込むように設計され得る。

バイオリアクターの内容物
治癒および／または再生の標的とされている損傷および臓器の種類に基づいて、任意の数の天然または遺伝的に改変された細胞型または幹細胞株がデバイスにおいて使用され得る。該細胞は、スタンドアロンで使用することも、または任意の数のタンパク質、成長因子、核酸、またはその他の分子もしくは小胞を含む培地に浸すこともできる。バイオリアクターの内容物の具体的かつ非網羅的な例を以下の段落で概説する。

細胞チャンバー／パウチの内部環境
細胞パウチの内部微小環境は、以下のコンポーネントの少なくとも１つ以上を含む：（ａ）１種類以上のパラクリン因子産生細胞；（ｂ）非細胞支持構造；（ｃ）１種類以上の支持細胞。細胞パウチの内部微小環境は、細胞培養培地を含むこともできる。これらのコンポーネントのすべては、パラクリン因子の産生量、放出動態、およびパラクリン因子の種類を制御するために、エンドユーザーによっていつでもカスタマイズされ得る。さらに、細胞の付着および増殖を強化する薬剤（例えば、ポリリジン、フィブロネクチン、またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有するタンパク質）、血栓症を軽減する薬剤（例えば、ヘパリン、直接トロンビン阻害剤、または抗血小板薬）、炎症を軽減する薬剤（例えば、ステロイドを用いて）、感染を軽減する薬剤（例えば、抗生物質または抗ウイルス剤を用いて）、細胞増殖を調整する薬剤（例えば、成長要因を用いて）を含むように、または任意の薬物もしくは薬剤を内部微小環境中または細胞パウチの外部に送達することができるように、内部微小環境のすべてのコンポーネントを変更することができる。さらに、任意の薬物または薬剤の内部微小環境のみへの送達、または細胞パウチの外部への送達も同様に可能にするために、内部微小環境は薬物送達デバイスを含むことができる。そのようなデバイスは、例えば、薬物または生物活性剤を含む、ヒドロゲル、ポリマーマトリックス、ビーズ、およびナノ粒子を含み得る。

いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、上述のように、カテーテル管に取り付けられたエンクロージャであり、該カテーテル管は、パウチのルーメンを患者の外部のカテーテル部分に接続するポートを備え、細胞および培地の注入、サンプリング、および循環を可能にする。他の実施形態では、カテーテルのハウジング内の複数のルーメンは、パウチ内の細胞の継続的な循環のための追加オプションを与えることができ、開放された遠位ポートは静脈ラインとしてまたは中心静脈圧のために使用され得る。あるいは、バイオリアクターをワイヤーに直接取り付けることもできる。

本明細書で使用する場合、「非細胞支持構造」という用語は、限定されることなく、ビーズ、微粒子、ナノファイバー、および細胞培養マトリックスなどの物理的なものを含むことができる。細胞培養マトリックスは、例えば、ヒドロゲル、スキャフォールド、ナノファイバー、微粒子を含むことができ、生物学的材料、合成材料、または異なる生物学的材料および／または合成材料の任意の組み合わせに基づくことができる。細胞培養マトリックスは、生分解性または非生分解性であり得る。あるいは、細胞培養マトリックスは、酵素などの特定の薬剤と接触させない限り分解しない材料で作製することができる。そのような材料の例はコラーゲンまたはヒアルロナンマトリックスであり、それぞれコラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼと接触するように配置されない限り分解しない。バイオリアクターの内部微小環境の細胞チャンバーまたはパウチは、培地、マイクロビーズ（例えば、ポリスチレンベースのマイクロビーズ、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）ベースのマイクロビーズ、またはポリ（乳酸）ベースのマイクロビーズ）、ヒドロゲル（例えば、ヒアルロナンベースのヒドロゲル、ポリ（エチレングリコール）ベースのヒドロゲル、またはコラーゲンベースのヒドロゲル）、ポリマーマトリックス、組織工学スキャフォールド、ナノファイバー（例えば、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）ベースのナノファイバー）、および生物学的細胞外マトリックスの１つまたはそれらの組み合わせを含むことができる。支持構造を使用して、一次パラクリン因子産生細胞または支持細胞、またはそれら両方の細胞接着および増殖を促進することができる。細胞接着または細胞増殖を促進するために、支持構造のコンポーネントを（例えば、フィブロネクチン、ポリリジン、インテグリン、カドヘリン、シンデカン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有するタンパク質、またはその他の薬剤で）コーティングまたは（例えば、コロナ処理またはプラズマ処理で）表面修飾することもできる。拡散バリアを課してパラクリン因子の放出動態を制御する（例えば、パウチに様々な密度のヒドロゲルを充填することによって）ために、支持構造を使用することもできる。支持構造の材料は、合成材料または非合成材料であり得、かつ生分解性または非生分解性であり得る。細胞支持環境の注入前、注入中、または注入後に、細胞を細胞パウチに注入することができる。あるいは、細胞を、最初にパウチの外側の支持環境で成長させて（例えば、ミクロスフェアまたはナノファイバーの表面で成長させて）から、パウチ内に配置することができる。

いくつかの実施形態によれば、細胞培養マトリックスまたは非細胞支持構造は、事前にロードされて後の使用のために保管されていた細胞と一緒にバイオリアクターエンクロージャ内に封入される前または後に、事前形成され得る；または代替的に、その個々のコンポーネントの反応物中に保存され、必要な場合にだけバイオリアクターエンクロージャ内への直接添加によって調製され得る；または代替的に、バイオリアクターエンクロージャの外側に形成されてから、形成された状態でバイオリアクターエンクロージャ内に注入され得る。

いくつかの実施形態では、デバイスが移植される間に、非細胞支持構造の形成、改変、またはその両方を行うこともできる。例えば、バイオリアクターが移植される間に、非細胞性細胞外マトリックスは、線維芽細胞によってバイオリアクターエンクロージャ内においてｉｎ ｓｉｔｕで形成、改変、またはそれらの両方をされ得る。非細胞支持構造は、薬剤またはバイオリアクター内もしくはバイオリアクター外の状態の変化によって改変され得る。例えば、バイオリアクターエンクロージャ内に配置されたヒアルロナンベースのマトリックスは、ホストのヒアルロニダーゼへの曝露により、時間の経過とともに分解され得る。細胞は、バイオリアクターエンクロージャ内の細胞培養マトリックス中で増殖させるか、または最初にバイオリアクターエンクロージャ外の細胞培養マトリックス中で増殖させてから、細胞培養マトリックスと共にバイオリアクターエンクロージャ内に注入することができる。

具体例として、間葉系幹細胞は、パウチ中に配置される前に、フィブロネクチンでコーティングされたポリスチレンマイクロビーズ（例えば、直径約１００μｍ）上に播種される。播種された細胞は、細胞パウチ中に配置される前にマイクロビーズ上で一定期間増殖させるか、または細胞パウチ中に配置される直前にマイクロビーズに播種されるか、または代替的に、ブランクのマイクロビーズがパウチ中に配置されてから細胞が細胞パウチ中に直接注入されるか、または前述の方法のいくつかが組み合わせられる。直径１００μｍの各マイクロビーズは、例えば、１５〜１００、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００細胞を含む、約１０〜１００細胞の容量を有し得、したがって、エンドユーザーは、注入されるマイクロビーズの数を制御することによって、細胞パウチ中の細胞数を制御することができる。

ヒトまたは非ヒト細胞、幹細胞、非幹細胞、遺伝子改変細胞、タグ付き細胞、表面修飾細胞、操作された細胞、細胞クラスター、および原核または真核細胞を含むがこれらに限定されない、任意の細胞型または細胞型の組み合わせをバイオリアクターエンクロージャ内に播種できることが企図されている。

支持細胞
パラクリン因子産生細胞および非細胞支持構造は、細胞パウチ内に配置された１つ以上の支持細胞型によって支持され得、おそらくパラクリン因子産生細胞によってもたらされるより長い期間の利益を可能にする。これらの支持細胞はパラクリン因子も産生する可能性があるが、その主な目的は、一次パラクリン因子産生細胞を支持し、おそらく一次パラクリン因子産生細胞または外部ホストからのシグナルに応答して、非細胞支持構造を生成または調整することである。パラクリン因子産生細胞に対する支持細胞の比率に制限はない。支持細胞とパラクリン因子産生細胞の比率の例は、１：１〜１：２０の範囲である。支持細胞型の例には、線維芽細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、および骨髄間質細胞が含まれる（ただし、これらに限定されない）。任意の他の適切な細胞型を支持細胞として使用することができる。細胞型は、ヒトまたは非ヒト細胞、幹細胞、非幹細胞、遺伝子改変細胞、タグ付き細胞、表面修飾細胞、操作された細胞、および原核細胞または真核細胞であり得る。

第１の例示的な実施形態として、線維芽細胞を使用して、パウチ内の細胞外マトリックスの形成を経時的に強化および調節し、パウチ内のパラクリン因子産生細胞の付着、生存能力、および増殖を強化することができる。

第２の例示的な実施形態として、パウチ内に原始的な血管毛細血管系を作製するために、内皮細胞および内皮前駆細胞が使用される。このような系は、半透過性エンクロージャを横切る栄養素、廃棄物、シグナル伝達分子およびパラクリン因子の物質移動の効率を高め、パウチ内のパラクリン因子産生細胞のより密な三次元パッキングを可能にすることができる。

第３の例示的な実施形態として、パウチ内の幹細胞の増殖を調節および刺激するシグナル伝達分子および成長因子を産生するために、骨髄間質細胞が使用される。対象ホストおよび支持細胞自身がパウチ内で増殖しているパラクリン因子産生細胞からのシグナルを感知できるので、支持細胞は、増殖している細胞および対象ホストのニーズに基づいてその活性を変化させることができ、したがって、細胞パウチ内の内部微小環境を継続的に調節することができる。

可能なバリエーション
エンドユーザーが製造時から使用時までのいつでも細胞パウチの内部環境をカスタマイズできるように、バイオリアクターは設計される。

第１の例示的な実施形態として、エンドユーザーは、異なる疾患のために放出されるパラクリン因子の種類を変更するために、パラクリン因子産生細胞を変更することができる（例えば、エンドユーザーは、肝疾患に対する因子を生成するために肝細胞を使用するか、心臓病に対する因子を生成するために間葉系幹細胞を使用する可能性がある）。

第２の例示的な実施形態として、エンドユーザーは、パラクリン因子の産生量またはパラクリン因子の放出速度を変更するために、非細胞支持構造を変更することができる（例えば、エンドユーザーは、パラクリン因子の産生量を低下させるために、小児患者に対して、成人患者に対するよりもより少ない数の細胞コーティングマイクロビーズを注入する場合がある；あるいは、異なる患者、または回復の異なる段階で異なるニーズを有する同じ患者に対応するために、エンドユーザーはヒドロゲルの架橋密度を減少または増加させて、パラクリン因子放出の速度をそれぞれ増加または減少させる場合がある）。

第３の例示的な実施形態として、エンドユーザーは、異なる種類のパラクリン因子産生細胞に対応するか、または異なる移植期間に対応するために、支持細胞の種類を変更することができる。

エンドユーザーはまた、デバイスが患者に移植されている期間中にこれらの変更のいずれかを行うことができる。例えば、バイオリアクターへの遠位ポートを含む実施形態を使用すると、エンドユーザーは、患者の状態の変化に基づいて、パラクリン因子産生細胞の種類、支持細胞もしくは構造、またはパラクリン因子産生細胞に対する支持細胞の比率を変更する場合がある。エンドユーザーは、放出されるパラクリン因子の種類、パラクリン因子の総産生量、またはパラクリン因子の放出動態を制御するために、様々な疾患タイプに対してこれを実行することを望む場合がある。

「ヒドロゲル」とは、水を吸収して弾性ゲルを形成することができる水膨潤性ポリマーマトリックスを意味する。水性環境に配置されると、乾燥したヒドロゲルは、架橋の程度によって許容される範囲で、その中に液体を取り込むことによって膨潤する。

ポリマーは、繰り返しモノマー単位から構成される分子を指すために使用され、ホモポリマー、ブロックコポリマー、ヘテロポリマー、ランダムコポリマー、グラフトコポリマーなどを含む。「ポリマー」には、線状ポリマーおよび分岐ポリマーも含まれ、分岐ポリマーには、高分岐ポリマー、樹枝状ポリマー、およびスターポリマーが含まれる。

モノマーは、ポリマー中の基本的な繰り返し単位（複数可）である。モノマーは、それ自体がモノマーであってもよく、または少なくとも２つの異なるモノマーのダイマーまたはオリゴマーであってもよく、各ダイマーまたはオリゴマーはポリマー中で繰り返される。

いくつかの実施形態では、細胞培養マトリックスは、ポリマー、マトリックス、およびゲルを含むことができ、本開示は、マトリックス、ポリマー、およびゲルの作製方法および使用方法を含む。前記ポリマーの１つは、イミドを含む。所望の組成物で作製された所望のゲル、ネットワーク、スキャフォールド、フィルムなどは、細胞、組織、臓器の統合および成長を促進する。他の実施形態では、細胞培養マトリックスは、細胞培養を支持する（例えば、マイクロビーズ、ナノファイバーなどの）任意の構造を含むことができる。

生体適合性ポリマー、生体適合性架橋ポリマーマトリックスおよび生体適合性は当該分野で認識されている。例えば、生体適合性ポリマーには、それ自体がホスト（例えば、動物または人間）に対して毒性がなく、かつ、ホストにおいて毒性のある濃度でモノマーまたはオリゴマーのサブユニットまたは他の副産物を生成する速度で分解しないポリマー（ポリマーが分解する場合）が含まれる。本発明の特定の実施形態では、生分解は、一般に、生物におけるポリマーの分解、例えば無毒であることが知られているかもしれないそのモノマーサブユニットへの分解を含む。ただし、そのような分解から生じる中間のオリゴマー生成物は、異なる毒性学的特性を有していてもよく、あるいは生分解はポリマーのモノマーサブユニット以外の分子を生成する酸化または他の生化学反応を含んでもよい。したがって、特定の実施形態では、患者への移植または注射などのｉｎ ｖｉｖｏでの使用を目的とする生分解性ポリマーの毒物学は、１つ以上の毒性分析の後に決定されてもよい。本組成物が上記のように生体適合性であることのみが必要である。したがって、本組成物は、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％またはそれより少ない生体適合性ポリマーを含有するポリマーであって（例えば、本明細書に記載のポリマーおよび他の材料および賦形剤を含む）、かつ依然として生体適合性であるポリマーを含んでいてもよい。

本明細書において架橋物とは、一般に、共有結合の形成から生じる、分子間架橋および任意に分子内架橋を含む組成物を指す。２つの架橋可能なコンポーネント間の共有結合は直接的であってもよく（その場合、１つのコンポーネント中の原子は他方のコンポーネント中の原子に直接結合される）、連結基を介して間接的であってもよい。架橋ゲルまたはポリマーマトリックスは、共有結合に加えて、水素結合および静電（イオン）結合などの分子間および／または分子内の非共有結合も含み得る。

「ゲル」とは、液体と固体の間の物質の状態を指し、一般に、液体媒体中で膨潤した架橋ポリマーネットワークとして定義される。通常、ゲルは、固体と液体の両方を含む２相コロイド分散であり、ゲル中の固体の量は、「ゾル」と呼ばれる２相コロイド分散中の固体の量よりも多い。したがって、「ゲル」は液体の一部の特性（即ち、形状は弾力性があり、かつ変形可能）と、固体の一部の特性（即ち、２次元表面上で３次元を維持するのに十分なほど、形状が離散している）とを有する。

ヒドロゲルは、水で膨潤した不溶性ポリマーネットワークを形成するように架橋された親水性ポリマーからなり得る。架橋は多くの物理的または化学的メカニズムによって開始され得る。光重合は、ポリマー鎖を共有結合で架橋する方法であり、これにより、光開始剤およびポリマー溶液（「プレゲル」溶液と呼ばれる）が、光開始剤に特異的な光源に曝される。活性化されると、光開始剤はポリマー鎖中の特定の官能基と反応し、それらを架橋してヒドロゲルを形成する。反応は急速（３〜５分）で、室温および体温で進行する。光誘起ゲル化は、スキャフォールド形成の空間的および時間的制御を可能にし、注射後およびｉｎ ｖｉｖｏでのゲル化中における形状操作を可能にする。細胞および生物活性因子は、光ゲル化の前にポリマー溶液と混合するだけで、容易にヒドロゲルのスキャフォールドに組み込まれ得る。

あるいは、反応物は、外部開始剤を必要とせずに架橋をもたらす、イミドおよびアミドのような相補的反応基を含むことができる。

所望のヒドロゲルは、細胞増殖を促進する半相互浸透性ネットワークであり得る。粘度は、使用されるモノマーおよびポリマー、ヒドロゲルに閉じ込められた水のレベル、ならびに組み込まれた増粘剤、例えばタンパク質、脂質、糖類などの生体高分子によって調整され得る。そのような増粘剤の一例は、ヒアルロン酸またはコラーゲンである。

いくつかの実施形態では、細胞培養マトリックスは、イミドにより官能化された、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸等の生物学的適合性ポリマーの少なくとも１つのモノマー単位を含むことができる。それらの出発分子は細胞外マトリックスの天然成分である。しかしながら、一般に、任意の生物学的適合性ポリマーを該ポリマーとして使用することができ、そのポリマーは少なくともイミドを有する。他の適切なポリマーは、天然に存在するもの、例えば、ＧＡＧ、ムコ多糖、コラーゲンまたはプロテオグリカン成分（例えば、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、グルコサミン、デルマタン、ケラタン、ヘパラン、ヒアルロナン、アグリカンなど）を含む。

本発明の架橋ポリマーマトリックスは、ヒドロゲルを含み得、かつヒドロゲルを形成し得る。ヒドロゲルの含水量は、細孔構造に関する情報を与える。さらに、含水量は、例えば、ヒドロゲル内の封入された細胞の生存に影響を与える因子であり得る。ヒドロゲルが吸収することができる水の量は、架橋密度および／または細孔サイズに関連しているかもしれない。例えば、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン、カルボキシメチルスターチ、硫酸ケラチン、またはエチルセルロースなどの官能化マクロマー（ｍａｃｒｏｍｅｒ）上のイミドの割合（％）は、吸収可能な水の量を決定するかもしれない。

１つ以上の実施形態によれば、生物活性剤を、本発明のバイオリアクターエンクロージャ中の細胞培養マトリックスに組み込むこともできる。「組み込まれた」、「封入された」および「閉じ込められた」は、治療薬、色素、または他の材料および細胞培養マトリックス組成物などのポリマー組成物に関して使用される場合、当該分野で認識されている。特定の実施形態では、これらの用語は、所望の用途におけるそのような薬剤の徐放を可能にする組成物に、そのような薬剤を組み込むこと、配合すること、または含有させることを含む。これらの用語は、例えば、治療薬または他の材料がポリマーマトリックスに組み込まれる任意の方法を企図する場合があり、例えば、（共有結合または他の結合相互作用によって）そのようなポリマーのモノマーに付着させ、そのようなモノマーを重合の一部にしてポリマー製剤を与えること、ポリマーマトリックス全体に分布されること、（共有結合または他の結合相互作用によって）ポリマーマトリックスの表面に付加されること、ポリマーマトリックス内に封入されることなどを含む。「共組み込み」または「共封入」という用語は、本組成物における、治療薬または他の材料、および少なくとも１つの他の治療薬または他の材料の組み込みを指す。

より具体的には、任意の治療薬または他の材料がポリマーおよび／またはエンクロージャに封入される物理的形態は、特定の実施形態によって異なっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、治療薬または他の材料は、最初にミクロスフェアに封入されてから、ミクロスフェア構造の少なくとも一部が維持されるようにポリマーと組み合わされてもよい。あるいは、治療薬または他の材料は、本発明のポリマーに十分に非混和性であってもよく、該ポリマー中に溶解するのではなく、小さな液滴として分散される。任意の封入された治療薬または他の材料の徐放が、封入形態が任意の特定用途に十分に許容可能であるかどうかを決定する限り、封入または組み込みのあらゆる形態が本発明によって企図される。

いくつかの実施形態によれば、エンクロージャ内で使用される細胞培養マトリックスを、任意の数のタンパク質、成長因子、脂質、核酸、塩、その他の分子、細胞、または細胞外小胞を含む液体培地に浸すことができる。

限定されないが、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸オリゴペプチド、コラーゲン、およびフィブロネクチンなどの生物学的モチーフを細胞培養マトリックスに組み込んで、細胞接着を強化することができる。細胞接着分子のクラスの例には、カドヘリン、インテグリンおよびシンデカン、ならびにそれらの部分および断片が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の一態様では、架橋ポリマーマトリックスまたはゲルと、１つ以上の生物活性剤とを含む細胞培養マトリックスが調整され得る。生物活性剤は、組成物の意図された目的によって大きく異なり得る。活性という用語は当該分野で認識されており、対象において局所的または全身的に作用する生物学的、生理学的、または薬理学的に活性な物質である任意の部分を指す。「薬物」と呼ばれることもある生物活性剤の例は、メルクインデックス（Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ）、医師のデスクリファレンス（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、および治療の薬理学的基礎（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）などのよく知られている文献に記載されており、それらには、限定されることなく、医薬品；ビタミン；ミネラルサプリメント；疾患または病気の治療、予防、診断、治癒または緩和に使用される物質；体の構造または機能に影響を与える物質；または、生理的環境に置かれた後に生物学的に活性またはより活性になるプロドラッグが含まれる。「薬物」の具体例はヘパリンであり、ヘパリンはその抗血栓作用のために使用され得る。例えば、対象への投与時に隣接する組織または体液中に放出され得る生物活性剤の様々な形態を使用してもよい。いくつかの実施形態では、生物活性剤は、例えば、血管新生を促進するために、本発明の架橋ポリマーマトリックスにおいて使用され得る。他の実施形態では、例えば、傷害または損傷後の血管新生または治癒の促進と併せて、疾患または症状を治療、改善、阻害、または予防するために、生物活性剤が本発明の架橋ポリマーマトリックスにおいて使用され得る。

生物活性剤のさらなる例には、酵素、受容体アンタゴニストまたはアゴニスト、ホルモン、成長因子、自家骨髄、抗生物質、抗菌剤、および抗体が含まれるが、これらに限定されない。「生物活性剤」という用語は、本発明の組成物に組み込まれ得る様々な細胞型および遺伝子を包含することも意図されている。

特定の実施形態では、本組成物は、全組成物の約１重量％〜約７５重量％またはそれ以上、あるいは約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％または７０％の生物活性剤を含む。

生物活性剤の非限定的な例には、以下が含まれる：アドレナリン遮断剤、同化作用剤（ａｎａｂｏｌｉｃ ａｇｅｎｔ）、アンドロゲンステロイド、抗コレステロールおよび抗脂質剤、抗コリン作用剤および交感神経刺激剤、抗凝固剤、抗高血圧剤、抗感染症剤、ステロイドなどの抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤、解熱剤および鎮痛剤、抗血栓剤、抗狭心症剤、生物学的製剤、心臓活性剤、血管拡張剤、冠動脈拡張剤、診断薬、造血剤、エストロゲン、成長因子、末梢血管拡張剤、プロゲステロン剤、プロスタグランジン、ビタミン、抗原性物質、およびプロドラッグ。

さらに、組換えベータグルカン；ウシ免疫グロブリン濃縮物；ウシスーパーオキシドジスムターゼ；フルオロウラシル、エピネフリン、およびウシコラーゲンを含む製剤；組換えヒルジン（ｒ−Ｈｉｒ）、ＨＩＶ−１免疫原；組換えヒト成長ホルモン、組換えＥＰＯ（ｒ−ＥＰＯ）；遺伝子活性化ＥＰＯ（ＧＡ−ＥＰＯ）；組換えヒトヘモグロビン（ｒ−Ｈｂ）；組換えヒトメカセルミン（ｒ−ｌＧＦ−ｌ）；組換えインターフェロンα；レノグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ）；オランザピン；組換え甲状腺刺激ホルモン（ｒ−ＴＳＨ）；およびトポテカンなどの組換えまたは細胞由来のタンパク質が使用され得る。

さらに、以下に列挙するペプチド、タンパク質、およびその他の大きな分子も使用され得る：インターロイキン１〜１８（変異体および類似体を含む）；軟骨再生に有用であり得るインターフェロンα、γ、ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）およびその類似体、ゴナドトロピン放出ホルモン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；腫瘍壊死因子−α；神経成長因子（ＮＧＦ）；成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化骨形成因子、線維芽細胞成長因子相同因子（ＦＧＦＨＦ）；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）；インスリン成長因子（ＩＧＦ）；侵入阻害因子−２（ＩＩＦ−２）；骨形成タンパク質１−７（ＢＭＰ１−７）；ソマトスタチン；チモシン−α−γ−グロブリン；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；および補体因子、ならびにそのような因子（例えば、成長因子）の生物学的活性類似体、断片、および誘導体。

多機能調節タンパク質であるトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、本発明のポリマーマトリックスに組み込まれ得る。ＴＧＦスーパー遺伝子ファミリーのメンバーには、ベータトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−１３１、ＴＧＦ−１３２、ＴＧＦ−１３３）；骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）；ヘパリン結合成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ｌＧＦ））、（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、成長分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）；およびアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）が含まれる。成長因子は、哺乳動物細胞などの天然または自然の供給源から単離され得るか、または組換えＤＮＡ技術もしくは様々な化学プロセスなどによって合成的に調製され得る。さらに、これらの因子の類似体、断片、または誘導体は、それらが天然分子の生物学的活性の少なくとも一部を示すことを条件として、使用され得る。例えば、類似体は、部位特異的変異誘発または他の遺伝子工学技術によって変更された遺伝子の発現によって調製され得る。

一実施形態によれば、コラーゲンを組み込んだチオール修飾ヒアルロナンヒドロゲルが、バイオリアクターエンクロージャ内の幹細胞のための細胞培養マトリックスとして使用され得る。この特定の実施形態では、幹細胞の懸濁液がチオール修飾ヒアルロナン溶液中で調製され、バイオリアクターエンクロージャに注入され、チオール反応性ポリエチレングリコールジアクリレートで架橋され、ヒドロゲルを形成する。

別の実施形態によれば、細胞は、バイオリアクターエンクロージャの外側の微粒子の表面上で増殖させることができる；次に、細胞でコーティングされた微粒子がバイオリアクターエンクロージャに注入され、バイオリアクターエンクロージャの内部容積の一部または大部分を満たすことができる。

カテーテルの設計
（ａ）構造
いくつかの実施形態によれば、本発明は、カテーテルを含むことができる。本発明のカテーテルは、１つの管、または代替的に、１つ以上の点で接合されている多数の管を含むことができる。各カテーテル管は、細胞、培地、およびその他の材料の注入、サンプリング、または循環のオプションを可能にする１つ以上のルーメンを有し得る。いくつかの実施形態では、カテーテル管の１つ以上は、１つ以上の追加ポートを備えることができ、これらのポートのいくつかは細胞パウチの内側ルーメンに開口し、他のポートは循環と直接連通して、血管内ラインとしてのその使用を可能にする。例えば、ルーメンの１つは、血管内配置および位置決めを容易にするために、「オーバーザワイヤー」またはモノレール「迅速交換」構成におけるガイドワイヤーの通過専用にすることができる。別のルーメンは、位置決めを助けるために、カテーテル管の遠位端に配置された、空気または流体で満たされた膨張可能なバルーンに接続され得る。カテーテルは１つ以上の外部ポートに取り付けられ、必要に応じて、細胞、培地、およびその他の材料の注入、サンプリング、および循環を可能にする。
（ｂ）材料
カテーテルのハウジングは、任意の適切な生体適合性材料（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリアミド、ポリイミド、フルオロポリマー、ポリオレフィン、またはポリエーテルエーテルケトン）から製造され得る。カテーテルの外側は、細胞の付着および機能の強化に役立つ分子でコーティングされ得る。これらの分子のいくつかは、ポリ−Ｌ−リジン、フィブロネクチン、またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有する他のタンパク質を含む。これは、最初にプラズマリアクター内で、または過マンガン酸カリウムなどの化学酸化剤でカテーテルの表面を酸化してから、該表面を適切な分子官能基と反応させることで達成することができる。カテーテルの外側を抗凝固剤（ヘパリンなど）でスプレーコーティングまたはディップコーティングして、移植中の血栓形成を最小限に抑えることもできる。カテーテルの外部はまた、線維症を最小限に抑えるため、または送達を促進するために、（例えば、フルオロパッシベーション（ｆｌｕｏｒｏｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ）を使用して）表面修飾されてもよい。あるいは、カテーテルの一部（例えば、細胞パウチの内側に広がるカテーテルのセグメント）を改変して細胞接着を改善することができ、一方、カテーテルの別の部分（例えば、細胞パウチの外側のカテーテルのセグメント）を改変して、線維症、血栓症を減らし、送達を促進することができる。さらに、薬物送達デバイスをカテーテルに取り付けることができる。そのようなデバイスは、例えば、薬物または生物活性剤を含むヒドロゲル、ポリマーマトリックス、ビーズ、およびナノ粒子を含み得る。

カテーテルを含むいくつかの実施形態によれば、カテーテルのハウジングは、標準的なマルチルーメン中心静脈カテーテルと同様に、多数のルーメン、近位アクセスポートおよび遠位開口部で構成されるポリ塩化ビニル管（またはその他の適切な生体適合性材料）から作られ得る。これらのポートは、細胞、培地、治療薬、ガス、または当業者によって有益であると認識されている他の薬剤の循環に使用することができる。基本的な管構成へのいくつかの任意の変更は、当業者には明らかであろう。

いくつかの実施形態では、バイオリアクターが取り付けられているカテーテルの表面は、幹細胞の付着および機能の強化に役立つ分子でコーティングされ得る。これらの分子の一部には、ポリリジン、フィブロネクチン、またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有する他のタンパク質が含まれる。これは、最初にプラズマリアクター内で、または過マンガン酸カリウムなどの化学酸化剤でカテーテルの表面を酸化し、次に該表面を適切な分子官能基と反応させることで達成することができる。カテーテルの外側を抗凝固剤（ヘパリンなど）でスプレーコーティングまたはディップコーティングして、移植中および移植後の血栓形成を最小限に抑えることもできる。

ガイディングバルーン
小さなバルーン（直径約１ｃｍ）をカテーテルの先端の近くに配置することができ、該バルーンはガスまたは流体で満たされると、血管内配置をガイドするのを助けることができる。

ガイドワイヤーの誘導
カテーテル内の個々のルーメンを使用して、「オーバーザワイヤー」またはモノレール「迅速交換」構成でガイドワイヤーを通過させ、血管内配置をガイドすることができる。該デバイスはまた、細胞、細胞馴化培地（ｃｅｌｌ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）、濃縮パラクリン因子、または有益な効果を有し得るかもしくは有すると決定された他の治療流体の注入、断続的なリサイクルまたは連続循環を可能にする。

いくつかの実施形態では、カテーテルベースのデバイスは、必要に応じて取除去され得る。エンクロージャは、最初に注入ポートを通してドローバックすることによって（ｂｙ ｄｒａｗｉｎｇ ｂａｃｋ）しぼませる。その後、デバイス全体を体から引き出すことができる。血管鞘が除去され、止血を達成するために手動圧迫または血管閉鎖デバイスが使用される。

二次デバイス搭載バイオリアクター
一実施形態では、上述したバイオリアクターエンクロージャは、様々な他の二次デバイスに取り付けられ、該デバイスと共に移植され得る。バイオリアクターエンクロージャは、二次デバイスに取り付けるために、必要に応じて小型化され得る。心血管領域では、二次デバイスには、特に、ステント、バルーン、大動脈内バルーンポンプ、経皮的および外科的に移植された心室補助デバイス、経皮的および外科的に移植された人工弁および弁クリップまたはリング、血管内移植片、血栓フィルター、ペースメーカーまたは除細動器の表面またはリード、中隔欠損閉鎖器、心耳閉鎖装置、肺動脈カテーテル、静脈カテーテル、および動脈カテーテルが含まれるが、これらに限定されない。心血管領域外では、標的組織への直接的または間接的なアクセスを提供する任意のデバイスが、バイオリアクターエンクロージャを取り付けるための可能な候補である。

いくつかの実施形態によれば、バイオリアクター内の細胞は、「ナノファイバークラウド」と呼ばれるナノファイバーの三次元ネットワーク内にロードされ得る。ナノファイバーは、典型的な直径が約１０００ｎｍのファイバーとして定義され、電界紡糸などの既知の方法で作製され得る。ナノファイバーは、例えば、ポリ−Ｌ−乳酸コポリマーを含むほとんどの生物学的適合性ポリマーから作製され得る。該ポリマーは次にマトリックスまたは表面上に電界紡糸され（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ）、ファイバーが収集される。本発明者は、幹細胞がナノファイバーから構成されるマトリックスに容易に接着し、該マトリックス上で激しく増殖することを示すデータを発表しており（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１５年６月；５２：３１８−２６頁）、当該文献は参照により本明細書に援用される。

したがって、一実施形態によれば、本発明は、エンクロージャ内のナノファイバーの三次元ネットワーク内に密閉された細胞であって、パラクリン因子を産生することができる細胞を備え、前記エンクロージャは、血管内に移植可能であるように折り畳み可能かつ拡張可能であり得、前記エンクロージャは、前記細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、免疫学的バリアも提供することができるように半透過性である、血管内移植可能なバイオリアクターを提供する。

いくつかの実施形態では、ナノファイバークラウドは、バイオリアクターエンクロージャの内側に形成され得るか、または代替的に、バイオリアクターエンクロージャの外側に形成されてから、後でバイオリアクターエンクロージャ内に注入または配置され得る。ナノファイバークラウドは、バイオリアクターエンクロージャの全体またはその一部を満たすことができる。

バイオリアクターのパウチ内のナノファイバークラウドのナノファイバー密度またはナノファイバー配向は、所望のクラウド透過性、細胞播種密度、および細胞播種パターンに応じて調整され得ることが、当業者によって理解されよう。

いくつかの実施形態によれば、本発明のナノファイバーは、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、またはポリジオキサノンを含むがこれらに限定されない生分解性ポリマー材料に基づくことができる。ナノファイバーはまた、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、またはポリスルホンを含むがこれらに限定されない非生分解性材料から構成され得る。ナノファイバーはまた、セルロース、コラーゲン、脂質、核酸、およびタンパク質を含むがこれらに限定されない生物学的材料から構成され得る。ナノファイバーはまた、１つ以上の生分解性材料、非生分解性材料、および生物学的材料の任意の組み合わせから構成され得る。

「生分解性」は、当該分野で認識されており、ｉｎ ｖｉｖｏなどでの使用中に分解することが意図される、本明細書に記載されるものなどのモノマー、ポリマー、ポリマーマトリックス、ゲル、組成物および製剤が含まれる。生分解性ポリマーおよびマトリックスと、非生分解性ポリマーは、前者が使用中に分解される可能性があるという点で通常異なる。特定の実施形態では、そのような使用は、ｉｎ ｖｉｖｏ療法などのｉｎ ｖｉｖｏでの使用を含み、他の特定の実施形態では、そのような使用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用を含む。一般に、生分解性に起因する分解は、生分解性ポリマーのその構成要素サブユニットへの分解、または、例えば生化学的プロセスによる、ポリマーのより小さな非ポリマーサブユニットへの消化を含む。特定の実施形態では、２つの異なるタイプの生分解が一般的に特定され得る。例えば、１つのタイプの生分解は、ポリマー主鎖における結合（共有結合かどうかにかかわらず）の切断を含み得る。そのような生分解では、典型的にはモノマーおよびオリゴマーが生じ、さらにより典型的には、そのような生分解は、ポリマーの１つ以上のサブユニットを接続する結合の切断によって起こる。対照的に、別のタイプの生分解は、側鎖内部の結合（共有結合かどうかにかかわらず）の切断、または側鎖、官能基などをポリマー主鎖に接続する結合の切断を含んでいてもよい。例えば、治療薬、生物活性剤、または側鎖としてポリマー主鎖に付着した他の化学的部分が、生分解により放出され得る。特定の実施形態では、ポリマーの使用中に、一方または他方または両方の一般的タイプの生分解が起こり得る。本明細書で使用される場合、「生分解」という用語は、両方の一般的タイプの生分解を包含する。

生分解性ポリマーの分解速度は、分解の原因となる結合の化学的アイデンティティ（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、そのようなポリマーの分子量、結晶化度、生体安定性および架橋度、移植物の物理的特性、形状およびサイズ、ならびに投与の方法および場所を含む、様々な因子にしばしば部分的に依存する。例えば、分子量が大きいほど、結晶化度が高くなり、かつ／または生体安定性が高くなる。「生分解性」という用語は、「生体分解可能（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）」とも呼ばれる材料およびプロセスをカバーすることを意図している。

特定の実施形態では、そのようなポリマーの生分解速度は、酵素、例えばコンドロイチナーゼの存在に依存する可能性がある。そのような状況では、生分解速度は、ポリマーマトリックスの化学的アイデンティティ（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）および物理的特性だけでなく、そのような酵素のアイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）にも依存する可能性がある。

特定の実施形態では、本発明のポリマー製剤は、所望の用途で許容される期間内に生分解する。ｉｎ ｖｉｖｏ療法などの特定の実施形態では、そのような分解は、通常、ｐＨが６〜８で約２５℃〜３７℃の温度を有する生理的溶液にさらされたときに、約５年未満、約１年未満、約６か月未満、約３か月未満、約１か月未満、約１５日未満、約５日未満、約３日未満、または約１日未満の期間で発生する。他の実施形態では、ポリマーは、所望の用途に応じて、約１時間〜数週間の期間内に分解する。いくつかの実施形態では、ポリマーまたはポリマーマトリックスは、分解時に放出される検出可能な薬剤を含み得る。

いくつかの実施形態では、細胞接着を強化するために、例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸オリゴペプチド、コラーゲン、およびフィブロネクチンなどの接着分子がナノファイバークラウドに組み込まれ得る。

本発明のバイオリアクターで使用するための細胞は、電界紡糸（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）の直後に本発明のナノファイバークラウドに播種されて、後の使用のために保存され得るか、または代替的に、使用直前にナノファイバークラウドに播種され得る。

いくつかの実施形態によれば、ヒトまたは非ヒト細胞、幹細胞、非幹細胞、遺伝子改変細胞、タグ付き細胞、表面修飾細胞、操作された細胞、原核または真核細胞を含むがこれらに限定されない任意の細胞型または細胞型の組み合わせを、バイオリアクターエンクロージャ内のナノファイバークラウドに播種することができる。

ナノファイバークラウドを、任意の数のタンパク質、成長因子、脂質、核酸、塩、任意の他の分子、細胞、または細胞外小胞を含む液体培地に浸すことができることは、当業者に理解されるであろう。ナノファイバークラウドを、ヒドロゲルなどの本明細書に記載されているものを含むがこれらに限定されない培養マトリックスに浸すこともできる。ナノファイバークラウドを、液体培地とヒドロゲルなどの培養マトリックスとの任意の組み合わせに浸すこともできる。

バイオリアクターのパラクリン因子産生に直接寄与しない１つ以上の細胞型が、バイオリアクターのパウチに組み込まれ得ることも、当業者には理解されよう。一例として、エンクロージャ内の細胞外マトリックスの形成を強化するため、またはバイオリアクターエンクロージャにおける他の細胞の生存能力を支持するために、そのような細胞がバイオリアクターエンクロージャ内で使用され得る。任意の細胞型を使用できることが企図される。例として、細胞型は、ヒトまたは非ヒト細胞、幹細胞、非幹細胞、遺伝子改変細胞、タグ付き細胞、表面修飾細胞、操作された細胞、細胞クラスター、原核細胞または真核細胞であり得る。

一実施形態によれば、本発明は、例えば、バイオリアクターのパウチ内の細胞外マトリックスの形成を支持するために線維芽細胞を含むバイオリアクターエンクロージャを提供し、該細胞外マトリックスの形成は、一次パラクリン因子産生バイオリアクター細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｆａｃｔｏｒ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）の付着、生存能力、および増殖を強化する。

バイオリアクターエンクロージャの代替組成物

上述したように、バイオリアクターエンクロージャは、細胞の動きを制限するがパラクリン因子、栄養素、および廃棄物の自由な移動を可能にするように設計された所定の分子量カットオフを有する広範囲の生物学的または合成の半透過性膜から構築され得る。

１つ以上の代替の実施形態によれば、本発明は、適切な所定の分子量カットオフを有する本質的に半透過性の膜（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｓｅｍｉ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を必要としないバイオリアクターエンクロージャの新規組成物を提供する。

機械加工された材料

本発明のバイオリアクターエンクロージャは、適切な直径および密度の細孔を形成するように材料を機械加工することによって、任意の非透過性材料から製造することができる。バイオリアクターエンクロージャは、適切な直径および密度の細孔を形成するように材料を機械加工することによって、任意の本質的に半透過性の材料（ただし、不適切な細孔直径または細孔密度を有する）から製造することもできる。

本明細書で使用される場合、「適切な細孔直径」は、細胞の通過を防止する一方で、エキソソームを含むパラクリン因子、ならびに栄養素、廃棄物、および流体の自由通過を可能にするものとして定義される。いくつかの実施形態では、当業者は、本発明のパウチ内に配置する前に、細胞を免疫保護構造（例えば、ヒドロゲルビーズまたは免疫保護マイクロパウチ）内に配置することが可能であることを理解するであろう。その実施形態では、パウチ自体は免疫保護性である必要はない。そのシナリオにおける適切な細孔直径は、免疫保護構造の通過を防止するだけでよいものである。

本明細書で使用される場合、「適切な細孔密度」は、バイオリアクターエンクロージャ内の細胞の生存能力を支持するのに十分な細孔密度として定義され、バイオリアクターのパウチ内の細胞の最大細胞集団および代謝要求に応じて変化し得る。一例として、１００ｎｍ〜５０００ｎｍの範囲の細孔直径は、これらの基準を満たすことができる。一例として、１００，０００／ｃｍ^２〜１００，０００，０００／ｃｍ^２の範囲の細孔密度は、これらの基準を満たすことができる。これらの細孔直径は、細胞がパウチの免疫保護構造内に最初に配置されなかった場合にのみ適用される。細胞が、本発明のパウチ内に配置される前に、免疫保護構造（例えば、ヒドロゲルビーズまたは免疫保護マイクロパウチ）内に配置される実施形態では、パウチの細孔直径が内部の免疫保護構造の最小直径よりも小さい限り、はるかに大きなパウチ細孔直径がこの基準を満たすことができる。

いくつかの実施形態によれば、バイオリアクターエンクロージャを横切る連続的または断続的な外向きの流体フラックスを適用して、パウチからの材料の流出を促進し、エンクロージャへの材料の侵入を低減することができる。バイオリアクターエンクロージャを横切る連続的または断続的な内向きの流体フラックスは、反対の効果のために適用され得る。そのような流体フラックスは、本開示に記載されている任意のエンクロージャに適用され得る。具体例として、バイオリアクターエンクロージャのルーメンを外部の流体ソースに接続することによって、１０ｃｃ／時間の速度での生理食塩水の連続的な外向きのフラックスが適用される。さらに、任意で、流体は、患者が必要とする任意の薬剤（薬物、抗血栓剤、抗炎症剤、栄養など）、またはバイオリアクターのパウチ内の細胞もしくは支持構造が必要とする任意の薬剤を含むことができる。流体フラックスは、蠕動ポンプ、静脈内注入ポンプ（ＩＶ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｐｕｍｐ）、および当技術分野で知られている医療デバイスで使用される他のポンプを用いて生成することができる。

いくつかの実施形態によれば、本発明のパウチを機械加工するために使用される方法は、トラックエッチング、マイクロドリル、レーザードリル、フォトリソグラフィーエッチング、または細孔を形成するための他の適切な手段を含むが、これらに限定されない。トラックエッチングは、イオンを使用して材料に衝撃を与え、損傷トラックを形成する技術である；次に、水酸化ナトリウムなどの化学エッチング液を使用して損傷トラックを拡大することにより、細孔が作製される。マイクロドリルとレーザードリルは、マイクロドリルまたはレーザーを使用して物理的に細孔を形成する技術である。フォトリソグラフィーエッチングは半導体業界で確立された技術であって、細孔の幾何学的パターンがフォトマスクを通してフォトレジストでコーティングされたエンクロージャ表面に転写される；次に、液体ウェットエッチングまたはプラズマドライエッチングプロセスを使用して、細孔を生成する。

いくつかの実施形態では、エンクロージャ材料は、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、またはポリエチレンテレフタレートを含むがこれらに限定されない非生分解性材料から構成され得る。エンクロージャ材料はまた、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、またはポリジオキサノンを含むがこれらに限定されない生分解性材料から構成され得る。エンクロージャ材料はまた、セルロース、コラーゲン、脂質、核酸、およびタンパク質を含むがこれらに限定されない生物学的材料から構成され得る。エンクロージャ材料はまた、１つ以上の生分解性材料、非生分解性材料および／または生物学的材料の任意の組み合わせから構成され得る。エンクロージャ材料は、細胞の付着および機能を強化する分子でコーティングされ得る。具体例には、フィブロネクチン、ポリリジン、インテグリン、カドヘリン、シンデカン、およびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有するタンパク質が含まれる。エンクロージャ材料はまた、細胞の付着および機能を強化するために表面修飾され得る。このプロセスの具体例には、コロナ処理およびプラズマ処理が含まれる。エンクロージャ材料はまた、血栓症または線維症を最小限に抑えるため、免疫原性を低下させるため、生体適合性を向上させるため、またはその他の物質の送達性を向上させるために、コーティングまたは表面修飾され得る。具体例には、ヘパリン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖の付着、またはフルオロパッシベーション処理が含まれる。コーティングまたは表面修飾の調整は、当業者によく知られている。エンクロージャ材料は、（例えば、薬物、生物製剤、または他の薬剤を組み込んだヒドロゲルまたはポリマーマトリックスの使用を通じて）薬物送達能力を含むか、または薬物送達デバイスに取り付けられ得る。

機械加工されていないバイオリアクターエンクロージャについて上述したように、機械加工されたバイオリアクターエンクロージャは、表面の起伏、凹部、またはそれらの両方を用いて形成してもよいし、あるいはそれらのどちらも用いずに形成してもよいことが当業者に理解される。いくつかの実施形態では、機械加工されたエンクロージャは、拡張可能、または折り畳み可能、または拡張可能かつ折り畳み可能であってもよく、あるいは拡張可能でも折り畳み可能でもなくてよい。いくつかの実施形態では、該エンクロージャの外部表面は細胞接着または血栓形成を妨げる薬剤でコーティングされてもよく、該エンクロージャの内部表面は細胞接着を強化する薬剤でコーティングされてもよく、該エンクロージャの外部表面は細胞接着または血栓形成を妨げる薬剤でコーティングされ且つ内部表面は細胞接着を強化する薬剤でコーティングされてもよく、該エンクロージャの外部表面は細胞接着または血栓形成を妨げる薬剤でコーティングされず且つ内部表面は細胞接着を強化する薬剤でコーティングされなくてもよい。

一実施形態によれば、拡張可能および折り畳み可能な半透過性バイオリアクターエンクロージャは、約３００万／ｃｍ^２〜１０００万／ｃｍ^２の細孔密度で、約１０００ｎｍ〜２５００ｎｍの直径の細孔をトラックエッチングすることによって、不透過性ポリエチレンテレフタレート膜から形成され得る。

透過性膜と半透過性材料との複合材料

一実施形態によれば、本発明は、エンクロージャ内の細胞培養マトリックス内の細胞であって、パラクリン因子を産生することができる細胞を備え、前記エンクロージャは折り畳み可能かつ拡張可能であり得、前記エンクロージャは、少なくとも１つの透過性材料層に接触または隣接する少なくとも１つの半透過性材料層を含み、前記透過性材料層は前記エンクロージャの外側を向いている側にあり、前記エンクロージャは、前記細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、免疫学的バリアも提供することができるように半透過性である、移植可能なバイオリアクターを提供する。

別の実施形態によれば、本発明は、エンクロージャ内の細胞培養マトリックス内の細胞であって、パラクリン因子を産生することができる細胞を備え、前記エンクロージャは折り畳み可能かつ拡張可能であり得、前記エンクロージャは、少なくとも第１および第２の透過性材料層の間に、接触してまたは隣接して配置された少なくとも１つの半透過性材料層を含み、前記第１の透過性材料層は前記エンクロージャの外側を向いている側にあり、前記第２の透過性材料層は前記エンクロージャの内側を向いている側にあり、前記層は、前記細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、免疫学的バリアも提供することができるように半透過性である、移植可能なバイオリアクターを提供する（図１３）。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、適切に半透過性のバイオリアクターエンクロージャを提供することができ、適切に半透過性の材料または機械加工された材料をより透過性の高い膜の層の間に挟むことによって、または代替的に、１つの半透過性材料または機械加工された材料を透過性膜に取り付けて複合エンクロージャを構成することによって、当該適切に半透過性のバイオリアクターエンクロージャを製造することができる。

別の実施形態によれば、外層の平均細孔直径がそれぞれ５０００ｎｍ超の２層の透過性膜を使用して、内層の平均細孔直径が５０００ｎｍ未満のナノファイバーメッシュを挟むことができる。（図１０）。ナノファイバーメッシュは、複合エンクロージャを構成するために、１つ以上の生分解性材料、非生分解性材料、生物学的材料、または非生物学的材料から構成され得る。

別の実施形態によれば、それぞれが５０００ｎｍ超の平均細孔直径を有する外層の２層の透過性膜を使用して、平均細孔直径が５０００ｎｍ未満の内層を有するヒドロゲルを挟んで（図１０）、複合エンクロージャを構成することができる。ヒドロゲルは、生分解性材料、非生分解性材料、生物学的材料、または非生物学的材料から構成され得る。

いくつかの他の実施形態によれば、そのような透過性膜の１つ、２つ、またはそれ以上の層を複合エンクロージャ内で使用することができる。複合エンクロージャは、表面の起伏、凹部、またはそれらの両方を用いて形成してもよいし、あるいはそれらのどちらも用いずに形成してもよい。

いくつかの実施形態では、複合エンクロージャは、拡張可能、または折り畳み可能、または拡張可能かつ折り畳み可能であってもよく、あるいは拡張可能でも折り畳み可能でもなくてよい。

いくつかの実施形態では、複合エンクロージャの外部表面は細胞接着または血栓形成を妨げる薬剤でコーティングされてもよく、複合エンクロージャの内部表面は細胞接着を強化する薬剤でコーティングされてもよく、複合エンクロージャの外部表面は細胞接着または血栓形成を妨げる薬剤でコーティングされ且つ複合エンクロージャの内部表面は細胞接着を強化する薬剤でコーティングされてもよく、複合エンクロージャの外部表面は細胞接着または血栓形成を妨げる薬剤でコーティングされず且つ複合エンクロージャの内部表面は細胞接着を強化する薬剤でコーティングされなくてもよい。

折り畳み式エンクロージャのバイオリアクター

一実施形態によれば、本発明は、エンクロージャ内に密閉された細胞であって、パラクリン因子を産生することができる細胞を備え、前記エンクロージャは、細胞培養マトリックス内の少なくとも１つの細胞層に接触または隣接する少なくとも１つの半透過性材料層を含み、前記第１の透過性材料層は前記エンクロージャの外側を向いている側にあり、前記細胞層は前記１つ以上のエンクロージャの内側を向いている側にあり、前記半透過性層が前記細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、免疫学的バリアも提供することができるように、前記細胞層はそれ自体の上に巻くか折り畳むことができる、移植可能なバイオリアクターを提供する。そのような実施形態は、バイオリアクターが、任意の体腔内、臓器内、血管内、組織内、または皮膚上、または外部もしくは内部の創傷内、または外科的創傷内に配置されることを可能にすることができる。

いくつかの実施形態では、折り畳まれたエンクロージャバイオリアクターは、所定の多孔度を有する機械加工された材料の層からなり得る。

いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、１つ以上の異なる半透過性および／または機械加工された材料層および／または透過層を含み、該バイオリアクターは、１つまたは多数の異なる透過性および半透過性シートから、該シートを上下に重ね、図１４に示すように「スイスロール」の構造と同様に断面にスパイラルパターンを形成するように、それらを巻き上げる（ｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅｍ ｕｐ）かまたはそれらを中心軸の周りに配置することで製造され得る。変形例では、シートを巻き上げる（ｒｏｌｌｉｎｇ ｕｐ）代わりに、細胞が半透過性シートの間に挟まれるように、シートを任意の望ましい構成のうちの１つに折り畳むことができる。

いくつかの実施形態では、バイオリアクターの異なる透過性および／または半透過性シートは巻くか折り畳まれて、中心軸の周りに空洞または管構造を組み込むか、中心軸の周りを空洞または管構造で囲み、培養培地、培養マトリックスまたはナノファイバークラウドと一緒にまたはそれらなしで、細胞を収容することができる。あるいは、バイオリアクターの異なる透過性および／または半透過性シートを、ステントまたはカテーテルなどの医療デバイスの表面上またはその表面の周りに直接巻き上げるか折り畳むことができる。

例えば、一実施形態では、バイオリアクターの異なる透過性および／または半透過性シートは、中央の空洞の中心にあるカテーテルを用いて巻き上げられる。いくつかの実施形態では、カテーテルは、多孔質材料で作製することができる。

いくつかの実施形態によれば、１つ以上の細胞型を、透過性および／または半透過性シートと一緒に巻き上げるか折り畳む前に、バイオリアクターの１つ以上の異なる透過性および／または半透過性シート上で直接増殖させることができる。

一実施形態では、細胞層を、生分解性ナノファイバーのフラットシート上で増殖させ、巻き上げ、バイオリアクターの一部を構成し得るスパイラル構造に組み込こむことができる。

別の実施形態では、半透過性ナノファイバーメッシュの１つのフラットシートを幹細胞とコンフルエンスまで培養し、カテーテルに対して巻き上げ、その中心でカテーテルを囲む同心円状に交互に並んだ幹細胞および半透過性ナノファイバーメッシュ層のスパイラルを形成することができる（図１１）。

いくつかの実施形態では、ロール型バイオリアクターは、表面の起伏、凹部、またはそれらの両方を用いて形成され得る。

いくつかの実施形態では、ロール型バイオリアクターは、拡張可能、折り畳み可能、または拡張可能かつ折り畳み可能であり得る。

いくつかの実施形態では、ロール型バイオリアクターは、細胞接着または血栓形成に影響を与える薬剤でコーティングされ得る。

別の実施形態によれば、透過性および／または半透過性シートが巻き上げられるか折り畳まれるときに特定の構成で細胞を含有する所望の三次元構造が形成されるような方法で、ロール型バイオリアクターは、透過性および／または半透過性シートの特定の部分で増殖される特定の細胞型を含み得る。この構成は、透過性および／または半透過性シートから三次元の組織工学スキャフォールドを作製する便利な方法をもたらすことができる。

例えば、本発明の一実施形態は、人工血管を作製するために使用され得る有用な構造を提供することができる。３つ以上のセグメントを含むのに少なくとも十分な長さを有する半透過性材料の長くフラットなストリップであって、各セグメントはらせん軸を一回囲むのに十分な長さを有するストリップは、その最初のセグメントに内皮細胞が播種され、中央のセグメントに平滑筋細胞が播種され、最後のセグメントに線維芽細胞が播種される。次に当該複合構造が巻き上げられ、これにより最内層に内皮細胞、中間層に平滑筋細胞、最外層に線維芽細胞を有する血管に類似した構造が作製される。

これらの実施形態のすべてにおいて、透過性および／または半透過性シートが折り畳まれるか巻き上げられる前または後のいずれかにおいて、細胞が透過性および／または半透過性シート上に播種され得ることが、当業者によって理解されるであろう。あるいは、細胞は、折り畳みプロセス中または巻き上げプロセス中に播種され得る。

本明細書に提示される実施例は、本発明の範囲を例示するが、本発明の範囲を限定することは意図していない。

（実施例１）
第１世代（Ｇ１）幹細胞移植可能なバイオリアクター（ＳＣＩＢ）のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験

血管カテーテルシャフトに取り付けられた円筒形幹細胞チャンバー（図１）を有する第１世代ＳＣＩＢ（Ｇ１−ＳＣＩＢ）のプロトタイプを製作し、試験を行った。Ｇ１プロトタイプは、１００キロダルトンの分子量カットオフを備えた半透過性セルロースエステル膜から構築されたもので、パラクリン因子（ＰＦ）のエキソソーム画分に対して不透過性である。ヒートシールされた遠位端と１８ゲージの針を使用して１ｃｍ間隔で開窓されたシャフトを有する２０ｃｍの改造６フレンチ血管カテーテル（Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マールボロ、マサチューセッツ州）に、１０ｃｍの膜セグメントを取り付けた。シアノアクリレート医療デバイス接着剤（Ｈｅｎｋｅｌ、ロッキーヒル、コネチカット州）、２−０絹外科縫合糸、および０．１２５インチ医療グレード熱収縮チューブ（ＩｎｓｕｌＴａｂ、ウォバーン、マサチューセッツ州）を使用して、該膜を改造カテーテルの中央部分に固定した。ＳＣＩＢを７０％エタノール中、紫外線下で１２時間滅菌し、細胞培養実験およびｉｎ ｖｉｖｏ移植前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、マナサス、バージニア州）および細胞培養培地で洗浄した。設計どおり、このデバイスは幹細胞チャンバーとともに大きな血管のルーメンに配置され、ＰＦ、シグナル伝達分子、栄養素、および老廃物の血流との自由な交換を可能にする。

Ｇ１−ＳＣＩＢのＭＳＣ生存率およびパラクリン因子（ＰＦ）放出
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＦ放出を評価するために、ＳＣＩＢに増加する数のヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ、１０^５、１０^６、および５×１０^６）をロードし、通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ_２）で７日間、別々のフラスコ中の培養培地中に浸した。培養培地は、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）、Ｌ−グルタミン（３５０μｇ／ｍＬ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、マナサス、バージニア州）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（５０ｉＵ／ｍＬ／５０μｇ／ｍＬ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、マナサス、バージニア州）を補充したＡｌｐｈａ−ＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、マナサス、バージニア州）からなっていた。ＳＣＩＢ外の培地のサンプルを１、３、および７日目に収集し、残渣をペレット化するために遠心分離してから、−８０℃で瞬間凍結した。この条件培地（ＣＭ）における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）の濃度を、マルチプレックスＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｓｙｓ、ローガン、ユタ州）を用いて評価した。培地のみをロードした（即ち、細胞なし）ＳＣＩＢをコントロールとして使用した。ＭＳＣは７日間の培養にわたって高い生存率を示し（７５．４±１１．６％、ｎ＝６）、ＥＬＩＳＡで評価したところ、関連するＰＦを産生した（図２）。低酸素チャンバーに配置されたＳＣＩＢ内のＭＳＣは、ＶＥＧＦを含む血管新生ＰＦの放出を増加させ、収容された細胞がＳＣＩＢの外部の条件に基づいてそのＰＦの放出を変更する能力が確認された。Ｇ１−ＳＣＩＢのＭＳＣ容量を決定するために、段階的な用量のＭＳＣを幹細胞チャンバーパウチ内で７日間培養し、ＰＦ産生を評価した；Ｇ１−ＳＣＩＢのＰＦ産生は、２５００万細胞の細胞用量でピークに達し、この用量がＧ１−ＳＣＩＢの最大容量として採用された。

Ｇ１−ＳＣＩＢの生体適合性および免疫保護
Ｉｎ ｖｉｖｏでのデバイスの生体適合性を確認するために、ＳＣＩＢをヨークシャーブタ（２０〜３０ｋｇ）の右内頸静脈に外科的切開により挿入し、透視下でＳＶＣと右心房との接合部まで進めた。所定の位置に配置されると、ＳＣＩＢの近位端が固定され、創傷が閉じられた。１０^６個のヒトＭＳＣをロードしたＧ１−ＳＣＩＢがブタの上大静脈に移植され（図３Ａ）、異種ＭＳＣの使用にもかかわらず、免疫反応または輸血反応の証拠はなかった。１週間後に、Ｇ１−ＳＣＩＢを外植し、培地に戻した。外植されたＧ１−ＳＣＩＢから回収されたＭＳＣは、継続的な増殖、その後の７日間にわたるＶＥＧＦなどの代表的なＰＦの継続的な放出（図３Ｂ）、および正常な形態（図３Ｃ）を示した。

プラセボコントロールのブタの心筋梗塞試験
ＳＣＩＢベースの治療が心筋梗塞（Ｍ）後の有害な心臓リモデリングを変更したかどうかを決定するために、９０分の左前下行動脈閉塞によって誘発された前部ＭＩの３日後に、２５００万個のブタＭＳＣを含むＧ１−ＳＣＩＢと、培地のみを含むＧ１−ＳＣＩＢ（プラセボ）とを、ブタの上大静脈（ＳＶＣ）に配置した（各群でｎ＝８）。バイオリアクターの移植前の左心室（ＬＶ）機能、チャンバーサイズ、および傷跡を評価するために、ＭＩの３日後のＳＣＩＢの挿入直前に、ベースライン心臓ＭＲＩを全身３．０ＴのＭＲスキャナーを使用して取得した。ラジオ周波数スポイルドグラディエント・リコールドエコー（ｒａｄｉｏｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｐｏｉｌｅｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｒｅｃａｌｌｅｄ ｅｃｈｏ、ＳＰＧＲ）パルスシーケンスを使用して、シネ画像を取得した（繰り返し時間、ＴＲ＝４．３ｍｓｅｃ、エコー時間、ＴＥ＝２．１ｍｓｅｃ；フリップα＝１２°；面内分解能１．３×１．３ｍｍ、３０フェーズ／心臓サイクル）。０．２ｍｍｏｌ／ｋｇのＭａｇｎｅｖｉｓｔ（Ｂａｙｅｒ、ウェイン、ニュージャージー州）の末梢注入後に、インバージョンリカバリー準備Ｔ１強調グラジエントエコーシーケンス（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ−ｐｒｅｐａｒｅｄ Ｔ１ ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｃｈｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を用いて、遅延ガドリニウム造影（ＬＧＥ）画像を取得した（ＴＲ＝５．３；ＴＥ＝２．６；１ Ｒ−Ｒ；フリップα＝２０°；面内分解能１．４×１．５ｍｍ）。ベースから頂点までの短軸画像は６ｍｍのスライス厚で取得され、シネ画像およびＬＧＥ画像のギャップはなかった。同一のイメージングパラメーターを使用した４週目の心臓ＭＲＩは、Ｇ１−ＳＣＩＢが配置されている間、プラセボのブタと比較して、細胞処理ブタでは有害な左心室心臓リモデリングが著しく低下し（ブラインド分析による）、収縮末期容積（ＥＳＶ、２．１±４．１ｍＬ／１１．４±２．９ｍＬ、細胞／プラセボ、ｐ＝０．０３６）と拡張末期容積（ＥＤＶ、０．３±４．３ｍＬ／１０．４±３．８ｍＬ、細胞／プラセボ、ｐ＝０．０５９）はわずかに増加することを明らかにした（図４）。左心室駆出率はプラセボのブタで減少したが（−５．８±１．７％、ｐ＝０．０３）、細胞処理ブタでは減少しなかった（−２．３±２．９％、ｐ＝０．３３）。遅延ガドリニウム造影心臓ＭＲＩで評価したところ、両方の群で全傷跡サイズに変化があった（図５）。傷跡サイズはさらに、コアの高密度の傷跡（ｃｏｒｅ ｄｅｎｓｅ ｓｃａｒ）と不均一な灰色の傷跡（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｇｒａｙ ｓｃａｒ）とに区分された。コア範囲は、ハイパーエンハンスド領域内の最大ＳＩの５０％よりも大きいＳＩを有する全ピクセルを含んでいた。微小血管閉塞の領域は、コアの一部として含まれた。灰色ゾーンの範囲は、正常な心筋におけるピークＳＩよりも大きいが、ハイパーエンハンスド領域内の最大ＳＩの５０％未満であるＳＩを有する全ピクセルを含んでいた。不均一な傷跡の塊（ｍａｓｓ）の構成要素（すなわち、「灰色の」塊および高密度の「コア」の塊）がそのように分析された場合、ＳＣＩＢベースの細胞療法を受けた動物は、プラセボを受けた動物には存在しなかった高密度のコア傷跡の大幅な減少とともに、不均一な灰色の傷跡の大幅な増加を示した。動物から除去されたＧ１−ＳＣＩＢは培地に入れられ、ＭＳＣを有するＧ１−ＳＣＩＢはＰＦを放出し続けた（７日で７８７±２５７ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ）。重要なのは、すべての動物が研究期間中生き残ったことである；致死性不整脈、デバイス血栓症、または肺塞栓症を示唆する晩期死亡または予期せぬ死亡はなかった。

安全性
ＳＣＩＢを移植したすべてのブタが全ての試験を生き延びた。同種異系のブタＭＳＣの使用にもかかわらず、免疫反応を示唆する発熱または白血球増加の証拠はなかった。ブタはＳＣＩＢの除去後４週間観察され、無症状のままであった。剖検では、腫瘍性作用の証拠は見られなかった。興味深いことに、細胞治療群では心膜炎なかったのに対し、プラセボ群のブタの５０％に心膜炎があり、細胞治療群ではＭＩ後の炎症反応の低下が示唆された。

要約
Ｇ１−ＳＣＩＢ内で増殖したＭＳＣは生存可能であり、関連するＰＦを自由に放出する；Ｇ１−ＳＣＩＢは安全で耐容性が高く、ブタの上大静脈に配置された場合、収容された細胞に対して最大４週間の免疫保護をもたらす；同種異系ＭＳＣを使用したＳＣＩＢベースの細胞療法は、ブタにおいて、ＭＩ後４週間、有害なリモデリングを有利に低減させた。

（実施例２）
強化されたパラクリン因子透過性と内部ヒドロゲルマトリックスとを備えた第２世代（Ｇ２）幹細胞移植可能なバイオリアクター（ＳＣＩＢ）のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験

第２世代のＳＣＩＢ（Ｇ２−ＳＣＩＢ）のプロトタイプは幹細胞パウチで構築され、該パウチは２５μｍの厚さのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムに基づき、パウチ内に間葉系幹細胞を封入するために高度に多孔性のヒアルロナンヒドロゲルを組み込んでいた（図７Ａ−７Ｂ）。ＰＥＴフィルム中の細孔は、非常に均一な円形細孔の高密度フィールドの作製を可能にする技術であるトラックエッチングを使用して作製された。（図６、図８）。ＰＥＴフィルムは、最初に高真空下でサイクロトロンによって加速された単一エネルギー重イオンによって照射され、フィルムを通る直線的な損傷トラックを作製する。次に、照射されたフィルムの損傷トラックは、酸中和と脱塩水による洗浄との前に、連続するアルカリ加水分解浴で処理され、照射時間、エッチングの塩基と酸の濃度、エッチング温度、およびエッチング時間の変化によって厳密に制御され得る細孔サイズおよび密度を有する均一な円筒状細孔がエッチングされる。プロトタイプＧ２−ＳＣＩＢの幹細胞パウチは、細孔直径が０．４４μｍ〜２．０μｍ、密度が２４０万細孔／ｃｍ^２〜８００万細孔／ｃｍ^２の範囲で作製されたが、上記で詳述したように、より小さなまたはより大きな細孔直径ならびにより低いまたはより高い細孔密度が実現可能である。エキソソームは一般に直径０．２μｍ未満で、細胞は一般に直径８μｍを超えるため、Ｇ２−ＳＣＩＢの細孔は、パウチが細胞に対する不透過性を維持しながら、（Ｇ１−ＳＣＩＢとは異なって）ＰＦのエキソソーム画分に対して完全に透過性であることを可能にする。

タンパク質およびエキソソームに対するＧ２−ＳＣＩＢの透過性

ＦＩＴＣ−アルブミンに対するＧ２−ＳＣＩＢパウチの透過性を２時間にわたって測定した。分子量６６ｋＤ（多くの成長因子パラクリン因子と同等またはそれよりも大きいサイズ）のアルブミンは、０．４４μｍの細孔を有するトラックエッチングされたＰＥＴ膜を妨害なく横断し周囲の浴（ｂａｔｈ）に入り、３０分以内にＳＣＩＢから２０％が放出され、２時間未満でほぼ１００％が放出された（図１０Ａ）。エキソソームも、Ｇ２−ＳＣＩＢのパウチ膜を容易に横断する。ラットＨ９ｃ２心筋芽細胞は、トラックエッチングされたＰＥＴ膜を横切って自由に移動するエキソソームを貪欲に取り込んだ（図１０Ｂ）。同時に、膜を横断するＨ９ｃ２心筋芽細胞は見られなかったが、これは、トラックエッチングされた細孔直径と比較して、細胞径が大幅に大きいことと一致している。

ヒドロゲルマトリックスによる、Ｇ２−ＳＣＩＢにおける幹細胞の生存率の増強

パウチに注入されたＨｙＳｔｅｍ ＨＰヒアルロナンヒドロゲル有りまたは無しで、ルシフェラーゼ発現マウスＭＳＣを、直径４．０ｍｍ×長さ３２ｍｍの円筒形ＳＣＩＢのトラックエッチングされたＰＥＴパウチ内で１４日間、１０^６細胞の用量で増殖させた。マーカーＣＤ４４、Ｓｃａ−１、ＣＤ３１、ＣＤ４５、およびＣＤ３４を使用したフローサイトメトリーは、ＭＳＣがそれらの細胞表面マーカーの発現プロファイルを保持したことを示す。ＭＳＣの生存率は、ルシフェラーゼ生物発光イメージング（ＢＬＩ）を使用して、培養１４日間まで評価された。内部ヒドロゲルマトリックスを組み込んだＧ２−ＳＣＩＢパウチ内のマウスＭＳＣは、内部ヒドロゲルマトリックスなしのＧ２−ＳＣＩＢパウチ内のマウスＭＳＣと比較して、有意に高い生存率を維持した（図１１Ａ）。パウチにヒドロゲルマトリックスを組み込んだ場合のマウスＭＳＣ生存率の４倍の増加は、培養１４日間まで持続した（図１１Ｂ）。

Ｇ２−ＳＣＩＢにおけるＰＦ産生および細管形成

ヒアルロナンヒドロゲルを組み込んだＧ２−ＳＣＩＢで増殖させたヒトＭＳＣおよび同様の寸法のＧ１−ＳＣＩＢで増殖させたヒトＭＳＣ、ならびに相対的なＰＦ産生量および放出量を評価した。代表的な血管新生ＰＦであるＶＥＧＦの産生は、ＥＬＩＳＡによって測定された。ＶＥＧＦのＧ２−ＳＣＩＢ産生は、７日間の培養期間を通じて、Ｇ１−ＳＣＩＢよりも均一に１０倍以上多かった（図１２Ａ）。これと一致して、培養８日後にＧ２−ＳＣＩＢから放出されたパラクリン因子によって誘発されたｉｎ ｖｉｔｒｏでの内皮細胞の細管形成も、Ｇ１−ＳＣＩＢによって誘発されたそれよりも有意に大きかった（図１２Ｂ）。Ｇ２−ＳＣＩＢの改善されたｉｎ ｖｉｔｒｏ細管形成ポテンシャルは、内部ヒドロゲルマトリックスの存在によって説明することができる。内部ヒドロゲルマトリックスのないＧ２−ＳＣＩＢをＧ１−ＳＣＩＢと比較すると、細管形成の程度に有意差はもはや存在しなかった。

Ｇ２−ＳＣＩＢの生体適合性および免疫保護

ルシフェラーゼを発現する５×１０^６のマウスＭＳＣをロードしたＧ２−ＳＣＩＢを、ブタの上大静脈に２週間移植した；同じ数の細胞をロードしたコントロールＧ２−ＳＣＩＢは培地中に維持された。異種細胞の使用にもかかわらず、該動物は移植に十分耐え、免疫反応、輸血反応、または血栓症のいかなる証拠もなかった。外植後、生物発光イメージングは、培地中に維持されたｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｇ２−ＳＣＩＢと比較して、移植されたＧ２−ＳＣＩＢで３５％高いＭＳＣ生存率を示した。これらのデータは、免疫保護および生体適合性がＧ２−ＳＣＩＢによって維持されることを実証していた；さらに、移植されたＧ２−ＳＣＩＢにおけるＭＳＣ生存率がより高いことは、ＳＣＩＢ幹細胞パウチ膜を横切る栄養素および老廃物の移動効率が、血流を循環させることによって向上することを示唆する。

マイクロビーズを用いたＧ２−ＳＣＩＢの細胞生存率

ＭＳＣをポリスチレンマイクロビーズにロードした（直径１０６μｍ〜１２５μｍが使用されたが、これよりも大きいまたは小さい直径も可能である）。マイクロビーズを滅菌してからフィブロネクチンでコーティングし、ＭＳＣを播種した。ＭＳＣをマイクロビーズ上で３日間培養した。次いで、ＭＳＣでコーティングされたマイクロビーズを、細胞チャンバー容積３．４ｍｌあたり約６００，０００〜１２０万マイクロビーズの密度で、ＳＣＩＢの細胞チャンバーに注入した。異なる細胞のロードレベルを達成するために、より高いまたはより低いマイクロビーズ密度を使用することもできる。細胞チャンバー中での７日後、ＭＳＣはマイクロビーズに付着したままであり、細胞パウチで７日間培養した後のマイクロビーズ上の細胞生存率は、生細胞／緑色蛍光・死細胞／赤色蛍光生存率アッセイによると９０％を超えた（図９）。

要約

内部ヒアルロナンヒドロゲルマトリックスを組み込んだ新規トラックエッチングＰＥＴパウチを有するＧ２−ＳＣＩＢの試験は、大きなタンパク質およびエキソソームに対する透過性、細胞に対する不透過性を実証し、ｉｎ ｖｉｖｏでの生体適合性および免疫保護を維持しながら、高レベルのＰＦ産生と内皮細胞細管形成により優れた幹細胞生存率を促進した。

本明細書に引用される、刊行物、特許出願、および特許を含むすべての参考文献は、各参考文献が個別にかつ具体的に参照により援用されることが示され、その全体が本明細書に記載された場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。

本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明の説明の文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」および同様の指示対象の使用は、単数および複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。「備える」、「有する」、「含む」、および「含有する」という用語は、特に断りのない限り、制限のない用語（すなわち、「含むがこれに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指示がない限り、範囲内に含まれる各個別の値を個別に参照する簡略法として機能することのみを意図しており、各個別の値は、本明細書に個別に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行され得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図しており、別段の請求がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の言語は、請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であると示すものと解釈されるべきではない。

本発明を実施するために本発明者に知られている最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読むことで当業者に明らかになり得る。本発明者は、当業者がそのような変形を適切に使用することを期待し、本発明者は、本明細書に具体的に記載された以外の方法で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用される法律によって許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題のすべての修正および均等物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれる。

Claims (30)

1. ａ）内面および外面を有する密閉空間を規定する１つ以上のエンクロージャであって、前記１つ以上のエンクロージャは折り畳み可能であるか、拡張可能であるか、折り畳み可能かつ拡張可能であるか、または折り畳み可能でも拡張可能でもなく、前記１つ以上のエンクロージャは、前記密閉空間における細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、免疫学的バリアも提供することができるように半透過性であり、前記１つ以上のエンクロージャは、前記エンクロージャからのパラクリン因子の流出を可能にすることができる、１つ以上のエンクロージャ；および
   ｂ）前記１つ以上のエンクロージャ内の細胞培養マトリックス内の細胞であって、パラクリン因子を産生することができる、細胞
   を備える、移植可能なバイオリアクター。
2. ａ）内面および外面を有する密閉空間を規定する１つ以上のエンクロージャであって、前記１つ以上のエンクロージャは折り畳み可能であるか、拡張可能であるか、折り畳み可能かつ拡張可能であるか、または折り畳み可能でも拡張可能でもなく、前記１つ以上のエンクロージャは、少なくとも第１および第２の透過性材料層の間に、接触してまたは隣接して配置された少なくとも１つの半透過性材料層を含み、前記第１の透過性材料層は前記エンクロージャの外側に面する表面上にあり、前記第２の透過性材料層は前記エンクロージャの内側に面する表面上にあり、前記１つ以上のエンクロージャは、前記密閉空間における細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、免疫学的バリアも提供することができるように半透過性であり、前記１つ以上のエンクロージャは、前記パウチからのパラクリン因子の流出を可能にすることができる、１つ以上のエンクロージャ；および
   ｂ）前記１つ以上のエンクロージャ内の細胞培養マトリックス内の細胞であって、パラクリン因子を産生することができる、細胞
   を備える、移植可能なバイオリアクター。
3. ａ）内面および外面を有する密閉空間を規定する１つ以上のエンクロージャであって、前記エンクロージャは折り畳み可能であるか、拡張可能であるか、折り畳み可能かつ拡張可能であるか、または折り畳み可能でも拡張可能でもなく、前記１つ以上のエンクロージャは、細胞培養マトリックス内の少なくとも１つの細胞層に接触または隣接する少なくとも１つの半透過性材料層を含み、前記第１の透過性材料層は前記１つ以上のエンクロージャの外側に面する表面上にあり、前記細胞層は前記１つ以上のエンクロージャの内側に面する表面上にあって、巻くか折り畳むことができ、前記１つ以上のエンクロージャは、前記密閉空間における細胞の封じ込めをもたらし、前記細胞の流出を防ぐとともに、免疫学的バリアも提供することができるように半透過性であり、前記１つ以上のエンクロージャは、前記エンクロージャからのパラクリン因子の流出を可能にすることができる、１つ以上のエンクロージャ；および
   ｂ）前記エンクロージャ内の細胞培養マトリックス内の細胞であって、パラクリン因子を産生することができる、細胞
   を備える、移植可能なバイオリアクター。
4. 前記エンクロージャは生物学的材料および／または合成材料からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の移植可能なバイオリアクター。
5. 前記生物学的材料は酢酸セルロースである、請求項４に記載の移植可能なバイオリアクター。
6. 前記合成材料は、ポリスルホン、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、それらのコポリマー、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレンおよびそれらの誘導体、ポリカーボネートおよびその誘導体、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）およびその誘導体、ポリ（ｎ−ブチルメタクリレート）およびその誘導体、ポリ（スチレン−ｂ−イソブチレン−ｂ−スチレン）およびその誘導体、ポリカプロラクトンおよびその誘導体、ポリイミドおよびその誘導体、ポリウレタンおよびその誘導体、ポリ（乳酸）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ならびにシリコンからなる群から選択される、請求項４に記載の移植可能なバイオリアクター。
7. 前記エンクロージャは、直径が約５０ｎｍ〜５，０００ｎｍの細孔を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の移植可能なバイオリアクター。
8. 前記エンクロージャは、１００，０００細孔／ｃｍ^２〜１００，０００，０００細孔／ｃｍ^２の細孔密度を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の移植可能なバイオリアクター。
9. 前記細胞は幹細胞である、請求項１〜８のいずれかに記載の移植可能なバイオリアクター。
10. 前記幹細胞は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞および内皮幹細胞からなる群から選択される、請求項９に記載の移植可能なバイオリアクター。
11. 前記細胞培養マトリックスは、細胞培養培地、マイクロビーズ、ヒドロゲル（例えば、ヒアルロナンベース、ＰＥＧベース、またはコラーゲンベースのヒドロゲル）、ポリマーマトリックス、組織工学スキャフォールド、ナノファイバー（例えば、ＰＬＧＡベースのナノファイバー）、および生物学的細胞外マトリックスからなる群から選択される１つ以上の組成物を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の移植可能なバイオリアクター。
12. 前記マイクロビーズはポリスチレンベースのマイクロビーズである、請求項１１に記載の移植可能なバイオリアクター。
13. 前記マイクロビーズは細胞接着を強化する薬剤でコーティングされている、請求項１２に記載の移植可能なバイオリアクター。
14. 前記マイクロビーズはフィブロネクチンでコーティングされている、請求項１３に記載の移植可能なバイオリアクター。
15. 前記細胞培養マトリックスは、ポリマーマトリックスおよび／またはマトリックスゲルを含む、請求項１１に記載の移植可能なバイオリアクター。
16. 前記ポリマーマトリックスは、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、キトサン、デキストラン、コラーゲンおよび自己組織化オリゴペプチドからなる群から選択される、請求項１５に記載の移植可能なバイオリアクター。
17. 前記マトリックスゲルは架橋ヒドロゲルである、請求項１５に記載の移植可能なバイオリアクター。
18. 前記架橋ヒドロゲルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル／アミンコンジュゲート、イソシアネート／アミンコンジュゲート、エポキシ／アミンコンジュゲート、イソチオシアネート／アミンコンジュゲート、およびアルコール／グルタメートからなる群から選択される、請求項１７に記載の移植可能なバイオリアクター。
19. 前記細胞培養マトリックスはナノファイバーの三次元ネットワークを含む、請求項１１に記載の移植可能なバイオリアクター。
20. 前記ナノファイバーの三次元ネットワークは、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリジオキサノン、非生分解性材料（ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホンを含むがこれらに限定されない）、および生物学的材料（セルロース、コラーゲン、脂質、核酸、タンパク質を含むがこれらに限定されない）、およびそれらの組合せからなる、請求項１９に記載の移植可能なバイオリアクター。
21. 前記エンクロージャの外部表面は、細胞接着または血栓形成を妨げる薬剤でコーティングされている、請求項１〜３のいずれかに記載の移植可能なバイオリアクター。
22. 前記パウチの内部表面は、細胞接着を強化する薬剤でコーティングされている、請求項１〜３のいずれかに記載の移植可能なバイオリアクター。
23. 前記バイオリアクターエンクロージャはワイヤーに取り付けられているか、カテーテルに取り付けられているか、または別の移植可能な医療デバイスの一部として取り付けられている、請求項１〜３のいずれかに記載の移植可能なバイオリアクター。
24. 前記医療デバイスは、ステント、バルーン、大動脈内バルーンポンプ、心室補助デバイス、人工弁、人工弁クリップ、人工弁リング、血栓フィルター、ペースメーカー、除細動器、ペースメーカーまたは除細動器ワイヤー、中隔欠損閉鎖器、心耳装置、肺動脈カテーテル、静脈カテーテルまたは動脈カテーテルである、請求項２３に記載の移植可能なバイオリアクター。
25. 前記細胞は幹細胞および支持細胞を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の移植可能なバイオリアクター。
26. 前記幹細胞は間葉系幹細胞であり、かつ前記支持細胞が線維芽細胞である、請求項２５に記載の移植可能なバイオリアクター。
27. 前記エンクロージャは、前記パウチによって規定される封じ込め空間が空にされること、充填されること、または再充填されことのうち少なくとも１つを可能にするためにアクセス可能に構成されたポートを規定する、請求項１〜３のいずれかに記載の移植可能なバイオリアクター。
28. 遠位端および近位端を有するカテーテルをさらに備え、前記カテーテルの前記遠位端は前記ポートを介して前記パウチに取り付けられ、
    前記カテーテルの前記近位端が使用中に患者の体の外部に延びるように適合される一方で、前記カテーテルの前記遠位端が移植可能であるように、前記カテーテルは少なくとも部分的に移植可能である、請求項２７に記載の移植可能なバイオリアクター。
29. 前記エンクロージャはポリエチレンテレフタレートを含む、請求項６に記載の移植可能なバイオリアクター。
30. 前記細胞培養マトリックスはフィブロネクチンでコーティングされたポリスチレンマイクロビーズを含み、前記幹細胞は間葉系幹細胞であり、前記バイオリアクターエンクロージャはワイヤーに取り付けられている、請求項２８に記載の移植可能なバイオリアクター。