JP2020534861A - 抗体およびワクチン送達用のナノ粒子プラットフォーム - Google Patents
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Abstract
Description
ナノケージ単量体、および
前記ナノケージ単量体に連結された抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質であって、
前記抗体またはそのフラグメントは結合対の第1の成分を含み、
複数の前記融合タンパク質が自己集合してナノケージを形成し、複数の前記抗体またはそのフラグメントが前記ナノケージの外面を装飾し、それにより、前記結合対の第1の成分が、前記結合対の第2の成分と相互作用するために露出されているものとする、融合タンパク質。
別に説明されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語の定義は、1994年にオックスフォード大学プレスによって発行された、Benjamin Lewin、Genes(ジーンズ)V(ISBN 0−19−854287−9);Blackwell Science Ltd.により1994年に発行された、Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology(分子生物学辞典)(ISBN 0−632−02182−9);およびVCH Publishers、Inc.により1995年に発行されたRobert A.Meyers(編)、Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference(分子生物学および生物工学:包括的デスクリファレンス)(ISBN 1−56081−569−8)に記載されている。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料はすべて本発明の試験の実施に使用することができるが、典型的な材料および方法は本明細書に記載されている。本発明についての説明および請求において、以下の用語が使用される。
本明細書に記載されているのは、融合タンパク質である。融合タンパク質は、ナノケージ単量体およびナノケージ単量体に結合した抗体またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントは抗原結合エピトープを含む。複数の融合タンパク質が自己集合してナノケージを形成し、複数の抗体またはそのフラグメントがナノケージの外表面を装飾し、それにより抗原結合エピトープが抗原との相互作用のために露出される。
に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列またはそのフラグメント、例えば、上記配列に対して、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する配列、例えば100%配列同一性を含むか、またはそれからなる配列を含む。
構築物設計およびクローニング
ヒトフェリチンL鎖のアミノ酸配列(Uniprot:P02792)を得、12アミノ酸のGGS4xリンカーをN末端およびC末端に付加した。N末端リンカーの上流に、StrepTag IIアフィニティタグを付加してアフィニティ精製を促進し、AflII制限部位およびXbaI制限部位を付加して下流のクローニングを促進した。さらに、NheI制限部位およびKpnI制限部位をC末端リンカーに対し下流に付加した(図2A)。同様に、テルモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)ルマジンシンターゼ(Uniprot:Q9X2E5)のアミノ酸配列を得、N末端およびC末端のGGS4xリンカーを隣接させた。AgeI制限部位およびNheI制限部位をこの構築物のN末端に付加し、AflII部位およびXbaI部位をC末端に付加した後、Strep Tag IIを付加した(図2B)。両方の構築物を、ヒト発現のためにコドン最適化し、合成し、pHLsec発現ベクターにクローニングした。エプラツズマブFabの重鎖(エプラツズマブHC)またはデニンツズマブFabの重鎖(デニンツズマブHC)を、フェリチン(図2A)構築物およびルマジンシンターゼ(図2B)構築物のN末端に上記の制限部位を使用してクローニングした。さらに、NheI制限部位およびKpnI制限部位を使用して、eGFPおよびiLOVをフェリチンのC末端にクローニングした。
Fab HCナノ粒子構築物、Fab LCおよび非コンジュゲートナノ粒子(Fabは例としてデニンツズマブまたはエプラツズマブであり、ナノ粒子はフェリチン(図2A)またはルマジンシンターゼ(図2B)である)を、一時的にHEK293F(Thermo Fisher Scientific)細胞に1:1:1の比率で同時トランスフェクトした。細胞を200 mLの培養液に0.8 x 106細胞mL−1で分割した。50μgのDNAをろ過し、トランスフェクション試薬FectoPRO(Polyplus Transfections)と1:1の比率で混合し、室温で10分間インキュベートした。次に、DNA:FectoPRO溶液を細胞に直接添加し、細胞をMultitron Proシェーカー(Infors HT)中37℃、180rpm、8%CO2で6〜7日間インキュベートした。
本発明のフェリチン(図4A)ナノ粒子およびルマジンシンターゼ(図4B)ナノ粒子を発現する抗体Fabの電子顕微鏡写真の作成について説明する。精製されたナノ粒子を、2%ギ酸ウラニルで染色した。20〜50枚の画像からなるデータセットを、200kVで動作する電界放出FEI Tecnai F20電子顕微鏡と30e−Å−2の電子線照射により手動で収集した。Orius電荷結合素子(CCD)カメラ(Gatan Inc.)を使用して画像を34,483×の較正倍率で取得し、その結果、標本でのピクセルサイズは2.61Åになり、約0.75〜2μmのデフォーカス範囲が使用された。EMAN2を使用して、合計約1,000枚の粒子画像を手動で選択した。粒子画像の2D分類は、50クラスが許可されて実行された。
エプラツズマブFab(図5A)、エプラツズマブ−フェリチン(図5B)およびエプラツズマブ−ルマジンシンターゼ(図5C)のCD22への結合親和性を、Octet RED96 BLIシステム(Pall ForteBio)を使用したバイオレイヤー干渉法(BLI)により測定した。Ni−NTAバイオセンサーを1xカイネティクスバッファー(1X PBS、pH 7.4、0.002%Tween、0.01%BSA)で水和し、25ng/μLのCD22(Uniprot:P20273)を1,000rpmで300秒間ロードした。次に、バイオセンサーを、1xカイネティクスバッファーを含むウェルに60秒間ベースラインまで移入した後、Fab/ナノ粒子の連続希釈液を含むウェルに移した。その後、180秒会合段階の後に、1xカイネティクス中における180秒解離段階が続いた。分析は、Octetソフトウェアを用いて1:1の適合モデルで実行された。
抗体−フェリチン(図6Aおよび6B)またはフェリチン単独(図6C)のナノ粒子(0.5mg/ml〜1mg/mL)を、1時間Alexa Fluor−647(4mg/mL)(Thermo Fisher Scientific)により10:1v/vの比率で標識した。次に、ナノ粒子を2Lの1x PBSで8時間透析し、透析緩衝液を3回交換した。5μg/mLの透析標識ナノ粒子を使用して、5分間、10分間または30分間、ヒトBjab細胞(1x106細胞/mL)を処理した。所望のインターナリゼーション時間の後、細胞を3回洗浄し、Lab−Tek IIチャンバー(Nalge Nunc International)に分注した。63x油浸対物レンズとEM−CCDカメラ(Hamamatsu Photonics)を装備したWaveFX−XI回転ディスク共焦点顕微鏡(Quorum Technologies)を使用して画像を捉えた。細胞の中心面の画像を取得し、Volocityソフトウェア(Improvision)を使用して画像を処理および解析した。
クローニング、発現、精製およびEMは上記と同様である。さらに、NheI制限部位およびKpnI制限部位を使用して、eGFPおよびiLOVをフェリチンのC末端にクローニングした。フェリチン−GFP/iLOV粒子の生成に関しては、HEK293F細胞にフェリチン−GFP/iLOV構築物のみをトランスフェクトしたことを除き、プロトコルは上記と同様である。染色は、例2で上述した要領で行われた。フェリチン−GFP/iLOVナノ粒子の蛍光を、365nmの波長でトランスイルミネータにより測定した(図7)。
融合タンパク質を以下の要領で構築および精製した。まず初めに、5.5x CSP NPNAリピートと、それに続く8、10、または12残基のフレキシブルGGSリンカーを、pcDNA3.4 TOPO発現ベクターにおける1210−HC−Fab配列のN末端にクローニングした。CSP−NPNA5.5−8x−1210 Fab(図10A)、CSP−NPNA5.5−10x−1210 Fab(図10B)およびCSP−NPNA5.5−12x−1210 Fab(図10C)を、FectoPRO(Polyplus)トランスフェクション試薬を使用し、pcDNA3.4 TOPO発現ベクターでの1210−LC遺伝子(図10D)による同時トランスフェクションによりHEK293F細胞において一時的に発現させることにより製造した。精製は、KappaSelectアフィニティクロマトグラフィー(GE Healthcare)により行われた。Fabを、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した(Superdex 200 Increase 10/300 GL、GE Healthcare、図11および図12参照)。
CSPへの結合の測定を、次の要領で実施した。CSP−NPNA5.5−リンカー−1210 FabがCSPを認識できるかどうか、またはCSP結合部位がNPNA5.5によって閉塞されているかどうかを判断するために、バイオレイヤー干渉法(Octet RED96、ForteBio)実験を実施した(図13)。組換えCSPをカイネティクスバッファー(PBS、pH 7.4、0.01%(w/v)BSA、0.002%Tween−20)で10μg/mLに希釈し、Ni−NTA(NTA)バイオセンサー(ForteBio)に固定した。カイネティクスバッファーにリガンドをロードして安定したベースラインを確立した後、バイオセンサーを、1210 Fab、CSP−NPNA5.5−8x−1210 Fab、CSP−NPNA5.5−10x−1210 Fab、およびCSP−NPNA5.5−12x−1210 Fabを含むウェルに浸漬した。その後、解離速度をモニターするために、カイネティクスバッファーにチップを浸漬した。
抗体−融合タンパク質相互作用の絶対質量の測定を、以下の要領で実施した。ITCから回収された1210 Fab/CSP−NPNA5.5−リンカー−1210 Fab共複合体を、次の較正済検出システム:(i)MiniDawn Treos MALS検出器(Wyatt);(ii)準弾性光散乱(QELS)検出器(Wyatt);および(iii)Optilab T−reX屈折率(RI)検出器(Wyatt)を備えたAKTA Pureクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare)にインラインで結合されたSuperdex 200 Increase 10/300 GL(GE Healthcare)にロードした。データ処理を、ASTRAソフトウェア(Wyatt)を使用して実行し、図18Aに示す。
BG505 Env SOSIP三量体を、AgeI制限部位およびXbaI制限部位を使用してフェリチンのN末端にクローニングした。eOD−GT6のアミノ酸配列を得、ルマジンシンターゼのC末端に付加し、GGS4xリンカーとNheI制限部位により分離させた。Strep Tag IIを構築物のC末端に付加して、アフィニティ精製を促進した。構築物全体を哺乳類発現用にコドン最適化し、合成し、制限酵素AgeIおよびXhoIを使用してpHLsec発現ベクターにクローニングした(図19)。Fab HCナノ粒子、Fab LCおよび抗原ナノ粒子(Fabはデニンツズマブであり、抗原はBG505 SOSIPまたはeODGT6であり、ナノ粒子はフェリチンまたはルマジンシンターゼのいずれかである)を、上記前例で説明した要領で、一時的にHEK293F(Thermo Fisher Scientific)に同時トランスフェクトし、上記と同じプロトコルを使用して精製したが、ただしBG505含有ナノ粒子も、500mM塩化ナトリウム洗浄と1 Mα−メチルマンノシド溶出を使用してスノードロップ(Galanthus Nivalis)レクチン(GNL)アガロース親和性によって精製した。ネガティブ染色電子顕微鏡法は、前の例での説明と同様であった。バイオレイヤー干渉法は、前の例での説明と同様であり、CD19mVenusおよびVRC01 Fabを、Ni−NTAバイオセンサーおよび抗ヒトFabバイオセンサーにコーティングされたリガンドとして使用して、デニンツズマブナノ粒子およびBG505/eODGT6−ナノ粒子への結合をそれぞれ検出した。カルシウムフラックスアッセイ(図23)については、Bjab細胞(1x106細胞)を、HBSS中で1μMのFluo−4染料(Life Technologies)と30分間インキュベートした。細胞を5mLの1X PBSで2回洗浄し、氷上で500μlのRPMIに再懸濁した。取得前に、細胞を37℃浴中で5分間温め、BD LSR Fortess Cell AnalyzerのFITCチャネルで30秒間高値で取得し、ベースラインを確立した。次に、示された量のナノ粒子を細胞に加えて素早く混合し、その後データを5〜10分間、またはシグナルがベースラインに戻るまで取得した。FlowJoでデータを分析して平均強度を確立し、それを経時的にプロットした。
単鎖Fcナノ粒子を、次の配列を使用して設計した。配列中、太字はFcドメインを示し、通常のフォントはリンカーを示し、下線はフェリチンを示す:
概要
親和性成熟により、病原体の侵入から保護するために、抗原結合特性が改善された体細胞変異抗体バリアントを発現するB細胞が選択される。本発明者らは、マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)のスポロゾイト周囲タンパク質(PfCSP)に対する防御抗体を発現するヒトB細胞のクローン選択と親和性成熟の根底にある分子メカニズムを究明した。PfCSPの反復性により、2つのPfCSPリピート結合モノクローナル抗体間の直接的な同型相互作用が促進され、それによって抗原親和性とB細胞活性化が改善されることを分子詳細で示す。これらのデータは、ヒトにおいて寄生虫曝露を繰り返した後、同型抗体の相互作用を伝達する体細胞変異の強力な選択についての機構的な説明を提供する。本発明者らの発見は、PfCSPおよびおそらくは他の反復抗原に対する抗体応答を改善するための抗原介在親和性成熟の異なる方式を示している。
ジェノタイピング
この研究は、テュービンゲン(Tubingen)大学の医学部および大学クリニックの倫理委員会によって承認され、医薬品の臨床試験の実施の基準およびヘルシンキ宣言の原則を厳守した。試料を入手した臨床試験は、https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02115516およびEudraCTデータベースの番号2013−003900−38の下で登録され、FDA IND 15862の下、Paul−Ehrlich−Institute(ポール・エールリッヒ研究所)の承認を受けて実施された(8、9)。ゲノムDNAを全血から抽出した。IGHV3遺伝子ファミリーセグメントを、バーコードプライマーを使用して増幅させた。アンプリコンをプールし、TruSeq PCRフリーライブラリー調製キット(Illumina)を使用して配列決定用に調製した。300〜300 bpのペアエンドプロトコルを使用して、MiSeqシーケンサーで配列決定を実行した。配列決定リードを、PandaSeq(24)を使用して組み立て、バーコード識別によりドナーに割り当てた。
抗体コード化プラスミドでの部位特異的変異導入を、Q5部位特異的変異導入キット(Qiagen)を使用して実施した。
IgG産生については、IGH可変領域およびIGK可変領域を、以前に説明したように、それぞれヒトIGK定常領域およびIGG1定常領域の上流の発現ベクターにクローニングした(25)。組換えモノクローナル抗体をHEK293F細胞(ThermoFisher Scientific)で発現させ、プロテインGセファロース(GE healthcare)精製抗体の抗体濃度を前述のようにELISAで測定した(9、10)。FabをIgGのパパイン消化により生成し、プロテインAクロマトグラフィー、続いて陽イオン交換クロマトグラフィー(MonoS、GE Healthcare)およびサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200 Increase 10/300 GL、GE Healthcare)で精製した。ITC研究では、IGH可変領域およびIGK可変領域を、それぞれヒトIGK定常領域およびCH1定常領域のすぐ上流にあるpcDNA3.4 TOPO発現ベクターにクローニングした。Fabを、HEK293F細胞(ThermoFisher Scientific)で一時的に発現させ、KappaSelectアフィニティクロマトグラフィー(GE Healthcare)およびサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200 Increase 10/300 GL、GE Healthcare)で精製した。
ELISAを、以前に記載されているように大腸菌(E.coli)で発現されたN末端が切断された形でNANP5(Alpha Diagnostic International)、NANP3(PSL GmbH、Heidelberg)またはPfCSPに対して実施した(10、26)。BLI、SEC−MALS、および単一粒子ネガティブ染色EMについては、HEK293F細胞での一時的発現のために、完全長PfCSP(NF54株)をpcDNA3.4−TOPOにクローニングした。PfCSPを、HisTrap Ni/NTA(GE Healthcare)およびサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200 Increase 10/300 GL、GE Healthcare)で精製した。
表面プラズモン共鳴測定を、シリーズSセンサーチップCM5(GE Healthcare)にドッキングされたBIACORE T200機器(GE Healthcare)で実行した。pH 7.4の150mM NaClを含む10ミリモルのHEPESを、記載されているように(9)ランニングバッファーとして使用した。アミンカップリングベースのヒト抗体捕捉キットを使用して、抗ヒトIgG抗体をチップに固定した。等しい濃度のサンプル抗体とアイソタイプ対照が、それぞれサンプルフローセルとリファレンスフローセルで捕捉された。フローセルを安定させるために、ランニングバッファーを10μL/分の速度で20分間注入した。ランニングバッファー中の0.015μM、0.09μM、0.55μM、3.3μM、および20μMのNANP3を30μL/分の速度で注入した。フローセルを3 M MgCl2で再生させた。データを、BIACORE T200ソフトウェアV2.0を使用した定常状態速度論解析により適合させた。
精製1210 FabおよびキメラH.2140/K.1210 Fabを、12mg/mLに濃縮し、結晶化試験前に1:5モル比でNANP5(10mg/mL)およびNANP3(10mg/mL)によりそれぞれ10mg/mLに希釈した。精製1450 FabとNANP5を3:1のモル比で混合し、サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200 Increase 10/300 GL、GE Healthcare)により過剰の1450 Fabを除いて精製した。次いで、精製1450−NANP5を、結晶化試験の前に6mg/mLに濃縮した。1210−NANP5共結晶は20%(w/v)PEG 3350および0.2 Mクエン酸ナトリウム中で成長し、15%(w/v)エチレングリコールで凍結保護された。NANP3と複合体を形成したキメラH.2140/K.1210 Fabの共結晶は、20%(w/v)PEG 4000、0.6 M塩化ナトリウム、および0.1 M MES pH 6.5中で成長し、15%(w/v)グリセロールで凍結保護された。1450−NANP5共結晶は、22.5%(w/v)PEG 3350および0.2 Mクエン酸水素二アンモニウム中で成長し、15%(w/v)エチレングリコールで凍結保護された。データを、Canadian Light Source(CLS)の08ID−1ビームラインまたはAdvanced Photon Source(APS)の23−IDビームラインで収集し、XDSを使用して処理およびスケーリングした(27)。Phaserを使用した分子置換によって、構造を決定した(28)。phenix.refine(29)を使用して構造の精密化を行い、Coot(30)を使用して精密化の反復を行った。ソフトウェアはSBGridを介してアクセスされた(31)。
熱量測定滴定実験を、Auto−iTC200機器(Malvern)を使用して25℃で行った。タンパク質を、20mM Tris pH 8.0および150mM塩化ナトリウムに対して4℃で一晩透析した。NANP5ペプチドおよびNANP3ペプチドを透析緩衝液で2〜3μMに希釈し、熱量測定セルに加え、2.5μlの15回の連続注入で1210、1210_GL、1210 H.D100Ymut_K.N92Ymut(1210_YY)Fab、および1210_H.K56_Nrev_K.N93_Srev(1210_NS)Fab(100μM)により滴定した。実験を少なくとも3回実施し、平均値と平均値の標準誤差を記録した(図30)。Origin 7.0を使用して、1:1結合モデルに従って実験データを分析した。Prismでの片側マン・ホイットニー検定を使用して、統計解析を実行した。
BLI(Octet RED96、ForteBio)実験を実施して、完全長PfCSPに対する1210および1210_YY IgGの結合力を測定した。完全長PfCSPをカイネティクスバッファー(PBS、pH 7.4、0.01%(w/v)BSA、および0.002%Tween20)で10μg/mLに希釈し、Ni/NTA(NTA)バイオセンサー(ForteBio)に固定した。カイネティクスバッファーにリガンドをロードして安定したベースラインを確立した後、IgGの2倍希釈系列を含むウェルにバイオセンサーを浸漬した。その後、解離速度をモニターするために、カイネティクスバッファーにチップを浸漬した。ForteBioのデータ分析ソフトウェア9.0を使用して速度論データを分析し、曲線を1:1結合モデルに適合させた。
NANP5ペプチドと3倍モル過剰の1210 Fabとで複合体を形成させ、次の較正済検出システム:(i)MiniDawn Treos MALS検出器(Wyatt);(ii)準弾性光散乱(QELS)検出器(Wyatt);および(iii)Optilab T−reX屈折率(RI)検出器(Wyatt)を備えたAKTA Pureクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare)にインラインで結合されたSuperdex 200 Increase 10/300 GL(GE Healthcare)にロードした。330マイクログラムの完全長PfCSPを、上記検出システムを備えたAgilent Technologies 1260 Infinity II HPLCとインラインで結合されたSuperdex 200 Increase 10/300 GL(GE Healthcare)にロードした。完全長PfCSP(5μM)と20倍モル過剰の1210 Fab(100μM)とで複合体を形成させ、100μLまたは400μLを、上記の検出システムを備えたAgilent Technologies 1260 Infinity II HPLCとインラインで結合されたSuperose 6 Increase 10/300 GL(GE Healthcare)にロードした。ASTRAソフトウェア(Wyatt)を使用して、データ処理を実行した。
400メッシュのCuグリッドをコロイドン(colloidon)でコーティングし、炭素の薄い連続層をグリッド上に蒸着させた。カーボングリッドを、標準プロトコルに従ってグロー放電させた。完全長PfCSPと複合体を形成した1210 Fabの3μLの液滴を、グロー放電カーボングリッドに塗布した。20秒後、グリッドをブロットし、3μLの1%(w/v)ギ酸ウラニル溶液を、中間でブロットして、5秒間と最終18秒間の2ロットについて3回加えた。200 kVで稼働するFEI Tecnai 20でデータを収集した。デフォーカス値が1〜3μmである120枚の画像が収集された。最初に、Relion 2.0(32)で合計1080枚の粒子画像を手動で選択し、10のクラスを許可して粒子画像の2D分類を実行した。それに続いて、947枚の粒子画像を含む最高の6つの2Dクラスを使用して、120枚の顕微鏡写真から13,146枚の粒子画像を自動選択し、50クラスを許可して2D分類を実行した。
内因性BCR発現を欠いている、トリプルRag2、λ5、およびSLP−65 TKO−EST欠損マウスのプレB細胞を、レトロウイルス形質導入によりIg重鎖および軽鎖の遺伝子で再構成した(33)。ウイルス粒子の生成のために、完全なIGHMおよびIGK可変領域をコード化する構築物を、pMIZCCおよびpMIZYNベクターバックボーンにクローニングした(34)。1ウェルあたり1.8 x 105のPhoenix−Ecoウイルスパッケージング細胞を、完全イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM、5%FCS、2mMグルタミン、0.5mLβ−メルカプトエタノール、およびペニシリン/ストレプトマイシン含有)中の6ウェル培養プレートに播種した。24時間後、3μlのGeneJuice試薬を使用して100μlの純IMDM中、0.5μgの重鎖および0.5μgの軽鎖プラスミドを細胞にトランスフェクトし、37℃および8%CO2で48時間インキュベートした。上清を採取し、0.45μmフィルターを使用してウイルス粒子を精製した。1μl/mLのポリブレンをウイルス粒子懸濁液に加えた。並行して、2 x 105TKO−EST細胞を1.5 mLチューブに移し入れ、遠心分離した(366xg、4℃、5分)。上清を捨て、細胞ペレットを800μlのウイルス粒子懸濁液に再懸濁した。TKO−EST細胞に対し、366xgおよび37℃でスピン形質導入を行った。3時間後、培地を、IL−7を補充した新鮮な完全なIMDMと交換し、細胞を6ウェルプレートに播種した。
Ca2+fluxを(33)に記載されているように測定した。ウイルス形質導入後、1×106TKO−EST細胞にカルシウム感受性染料Indo−1 AM(Molecular Probes)を37℃で45分間ロードした。Indo−1染色溶液を、25μlのIndo−1ストック溶液(25μlのDMSOで50μgのIndo−1を希釈して調製)と25μlのプルロン酸F−127および113μlのFCSを混合することにより調製し、インキュベートした。(5分、暗所、RT)。Indoロード細胞を5mLの1%FCS IMDMで洗浄し、500μlの1%FCS IMDMに再懸濁し、FACSチューブに移した。各試料を、測定前にホットプレート上37℃で10分間個別に予熱した。Ca 2+フラックスのベースラインをLSRサイトメータで30秒間記録した後、4−ヒドロキシタモキシフェン(4−OHT、最終濃度:2μM)を含む抗原溶液5μlを添加し、抗原に応答したCa 2+フラックスを6分間記録した。異なる細胞株における表面Ig発現は、抗IgMおよび抗IgKの蛍光標識抗体の結合によりFACSで測定したとき同低度であった。4−OHTおよびα−Igκ抗体(1μg/mL)で刺激すると、すべての細胞株の同等の機能が確認された。
Pf横断アッセイを、記載されているように(9、10)96ウェルプレート形式で実行した。簡単に述べると、雌のアノフェレス・コルッツィ(Anopheles coluzzii)の蚊の唾液腺から得られた75,000 Pfのスポロゾイトを、異なる濃度のモノクローナル抗体と30分間プレインキュベートした後、0.5mg/mLデキストラン/ローダミン(Molecular Probes)の存在下でHC−04ヒト肝細胞とインキュベートした。未処理のスポロゾイトとデキストラン/ローダミンのみをそれぞれ陽性対照として使用し、実験のバックグラウンドシグナルを決定した。1%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定した後、デキストラン陽性(すなわち、横断した細胞)のパーセンテージをLSR IIフローサイトメータを使用して測定した。バックグラウンドシグナルを、すべての測定値から差し引いた。横断阻害を、未処理のスポロゾイトで観察された横断速度に基づいて測定した。各抗体についてのデータを、少なくとも3つの独立した実験からプールし、3パラメトリックHill関数を使用して滴定曲線を適合させた。
すべての動物実験は、ドイツのベルリンにあるLAGeSo(H0027/12)によって承認された。免疫付与と感染を、以前に説明されているように実行した(9、10)。簡単に述べると、8週齢のC57BL/6雌マウス(1群あたり5匹)に対し、100μlのPBS中の100μgまたは30μgのモノクローナルヒト抗PfCSP抗体またはアイソタイプ対照(mGO53(35))による腹腔内での受動免疫を行った。受動免疫の24時間後、マウスに対し、5,000のPfCSPトランスジェニックネズミマラリア原虫(プラスモジウム・ベルゲイ(Plasmodium berghei))(Pb‐PfCSP)(10)スポロゾイトを尾根に皮下注射して感染させた。感染後3日目から12日目まで、ギムザ染色された血液塗抹標本を毎日分析した。寄生虫陽性であると公表するために、少なくとも100個の顕微鏡視野をカウントした。
ヒトマラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum、Pf)のスポロゾイトは、免疫優性中央NANPリピート領域を伴う表面タンパク質のスポロゾイト周囲タンパク質(PfCSP)を発現する(1〜3)。動物モデルがPf感染から防御される場合、該リピートに対する抗体が介在することがあり得る(4〜6)。しかしながら、抗NANP抗体介在による防御は、ワクチン接種では容易に達成されない。したがって、防御的PfCSP NANP抗体の誘導は、前赤血球ワクチン開発の主要な目標である(7)。本発明者らは、最近、クロロキンによる予防下における生きたPfスポロゾイトへの繰り返し曝露後のPfナイーブボランティアにおける抗NANP PfCSPメモリーB細胞応答が、8−アミノ酸(aa)長の免疫グロブリン(Ig)κ相補性決定領域(CDR)3(KCDR3:8)を有する強力なPf抑制性のIGHV3−33およびIGKV1−5コード化生殖細胞系抗体のクローン選択および拡大によって主に成熟することを示した(8、9)。
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図38は、マラリアワクチン抗原(CSP−NANP5.5−リンカー抗体)が完全長PfCSP抗原を認識できるIgG力価を引き出すことを示す。予想どおり、応答はブースト可能で、3回の投与で増加する。これら2つの例において、マラリアワクチンは2つの異なるナノ粒子に表示され、一方は他方よりも強い免疫応答をもたらす。図39は、図38における免疫付与から誘発された抗PfCSP血清の活性/機能を示す。これは、スポロゾイト横断阻害アッセイで測定される。所定の血清希釈度で、ナノ粒子上でのマラリアワクチンの提示方法に応じて、阻害活性は50%〜80%の間で変化する。これらの結果は、1)本明細書に記載のマラリアワクチンが抗マラリア免疫応答を誘導すること、および2)得られた免疫血清がスポロゾイトに対する阻害能力を有することを示す。
配列表2 <223>抗体
配列表3 <223>エピトープ
配列表4 <223>Flagタグ
配列表5 <223>抗体
配列表6 <223>ナノ粒子
配列表7〜25 <223>抗体
Claims (57)
- ナノケージ単量体、および
前記ナノケージ単量体に連結された抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質であって、
前記抗体またはそのフラグメントは結合対の第1の成分を含み、
複数の前記融合タンパク質が自己集合してナノケージを形成し、複数の前記抗体またはそのフラグメントが前記ナノケージの外面を装飾し、それにより、前記結合対の第1の成分が、前記結合対の第2の成分と相互作用するために露出されているものとする、融合タンパク質。 - 前記結合対の第1の成分が抗体またはそのフラグメントのFc部分であり、前記結合対の第2の成分がFc受容体である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記結合対の第1の成分が抗原結合エピトープであり、前記結合対の第2の成分が抗原である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記ナノケージが約3個〜約100個のナノケージ単量体、例えば24個または60個の単量体を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記ナノケージ単量体が、フェリチン、エンカプスリン、SOR、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、カルボキシソーム、ボールトタンパク質、GroEL、熱ショックタンパク質、E2P、MS2コートタンパク質、それらのフラグメント、およびそれらのバリアントから選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記ナノケージ単量体と前記抗体またはそのフラグメントとの間にリンカーをさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーが柔軟性であるかまたは剛性であり、約1個〜約30個のアミノ酸残基を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーが約8個〜約16個のアミノ酸残基を含む、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーがGGSリピートを含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーが4つのGGSリピートを含む、請求項9に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原をさらに含む、請求項3〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原がリピートドメインを含む、請求項3〜11のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原がマラリア抗原である、請求項3〜12のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原がマラリアCSPタンパク質のフラグメントである、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原が前記マラリアCSPタンパク質のNANPリピートドメインのフラグメントである、請求項14に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原が5.5 NANPリピートを含む、請求項15に記載の融合タンパク質。
- 前記抗原がNPNANPNANPNANPNANPNANPである、請求項16に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体またはそのフラグメントがリピートドメインに特異的である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体またはそのフラグメントがマラリア抗原に特異的である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体またはそのフラグメントがマラリアCSPタンパク質に特異的である、請求項19に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体またはそのフラグメントが、前記マラリアCSPタンパク質のNANPリピートドメインに特異的である、請求項20に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体またはそのフラグメントが、次の配列:
に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列またはそのフラグメントを含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗体またはそのフラグメントが次の配列:
を含む、請求項22に記載の融合タンパク質。 - 前記抗体またはそのフラグメントが配列:
からなる、請求項23に記載の融合タンパク質。 - 前記抗体またはそのフラグメントが腫瘍抗原に特異的である、請求項1〜28のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体またはそのフラグメントが自己抗原に特異的である、請求項1〜28のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体またはそのフラグメントが、CD19、CD22、CD79、BCMA、またはCD20に特異的である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体またはそのフラグメントが標的臓器に特異的である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体またはそのフラグメントがFabフラグメントの重鎖および/または軽鎖を含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体またはそのフラグメントがFcフラグメントを含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記抗体またはそのフラグメントがscFvを含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- Fab軽鎖および/または重鎖をさらに含む、請求項31に記載の融合タンパク質。
- 別個に生成されたFab軽鎖および/またはFab重鎖と会合している、請求項31に記載の融合タンパク質。
- 検出可能な部分をさらに含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記検出可能な部分が、GFP、EGFP、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および/またはiLOVなどのLOVタンパク質などのフラビンに基づく蛍光タンパク質である、請求項34に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜35のいずれか一項に記載の少なくとも1つの融合タンパク質を含むナノケージ。
- 各ナノケージ単量体が、請求項1〜32のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、請求項36に記載のナノケージ。
- 前記ナノケージ単量体の約20%〜約80%が請求項1〜26のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、請求項36に記載のナノケージ。
- 前記ナノケージが多価である、請求項36〜38のいずれか一項に記載のナノケージ。
- 医薬品、診断薬、および/または造影剤などのカーゴ分子を担持する、請求項36〜39のいずれか一項に記載のナノケージ。
- 前記カーゴ分子がタンパク質であり、前記カーゴ分子が前記ナノケージに内包されるように前記融合タンパク質に融合されている、請求項40に記載のナノケージ。
- 前記カーゴ分子が、GFP、EGFP、アメトリンなどの蛍光タンパク質、および/またはiLOVなどのLOVタンパク質などのフラビンに基づく蛍光タンパク質である、請求項41に記載のナノケージ。
- 前記カーゴ分子が前記融合タンパク質に融合されておらず、前記ナノケージに内包されている、請求項42に記載のナノケージ。
- 前記カーゴ分子が内部に含まれることによりT細胞エピトープを提供するが、場合によってはB細胞エピトープを提供しないこともある、請求項36〜43のいずれか一項に記載のナノケージ。
- 前記カーゴ分子が前記融合タンパク質に融合されており、内部に含まれることによりT細胞エピトープを提供するが、場合によってはB細胞エピトープを提供しないこともある、請求項36〜43のいずれか一項に記載のナノケージ。
- 前記カーゴ分子が小分子、放射性同位体、または磁性粒子である、請求項43に記載のナノケージ。
- 前記表面に抗原をさらに含む、請求項36〜46のいずれか一項に記載のナノケージ。
- 前記抗原が、ナノケージ単量体との融合タンパク質として発現される、請求項47に記載のナノケージ。
- 請求項36〜48のいずれか一項に記載のナノケージを含むワクチン。
- 請求項1〜35のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコード化する核酸分子。
- 請求項50に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項51に記載のベクターを含み、請求項1〜35のいずれか一項に記載の融合タンパク質を生産する宿主細胞。
- 請求項36〜48のいずれか一項に記載のナノケージまたは請求項59に記載のワクチンを投与することを含む、対象に免疫を付与する方法。
- 請求項36〜48のいずれか一項に記載のナノケージまたは請求項49に記載のワクチンを投与することを含む、疾患または状態を処置および/または予防する方法。
- 前記疾患または状態が、がん、HIV、マラリア、または自己免疫疾患である、請求項54に記載の方法。
- 診断的イメージング方法であって、請求項36〜48のいずれか一項に記載のナノケージを対象、組織、または試料に投与すること、および前記対象、組織、または試料をイメージングすることを含み、前記ナノケージが、蛍光タンパク質または磁気イメージング部分などの診断標識を含むものとする、方法。
- FACSまたはELISAなどにおける研究ツールとしての、請求項1〜35のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項36〜48のいずれか一項に記載のナノケージの使用。
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McEnaney | Development of Synthetic Molecules for Direct Targeting for Activation and Suppression of Immunological Responses and Related Studies |
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