CN116724048A - 由非hla-a*02展示以用于不同类型癌症的免疫治疗的酰胺化肽及其脱酰胺化对应物 - Google Patents

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延斯·霍克曼
海科·舒斯特
丽娜·乌尔科夫
克里斯托夫·施拉德
延斯·弗里采
D·瓦勒夫斯基
迈克尔·罗默
奥利弗·施尔
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Abstract

本发明涉及一种肽或其医药学上可接受的盐，该肽包含选自由以下各项组成的群组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113；及(ii)其变异体序列，该变异体序列维持结合至MHC分子的能力和/或诱导T细胞与该变异体肽的交叉反应。

Description

由非HLA-A*02展示以用于不同类型癌症的免疫治疗的酰胺化 肽及其脱酰胺化对应物
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参考以顺应式ASCII本文档案(.txt)提交的序列表
依照EFS-Web法律框架及37CFR§§1.821-825(参见MPEP§2442.03(a))、规则30EPC、及§11PatV，与本申请案同时提交呈ASCII-顺应式本文档案(标题为“Sequence_listing_2912919-105001_ST25”，2021年7月19日创建，且大小为43,501位元组)的顺应于WIPO标准ST.25的电子序列表，且序列表的全部内容以引用方式并入本文。为避免疑问，若说明书及电子序列表中提及的序列之间存在差异，则说明书中的序列应被视为正确的序列。
本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白质、核酸及细胞。详言之，本发明涉及癌症的免疫治疗。此外，本发明涉及单独的肿瘤相关联的T细胞肽抗原决定基或其与其他肿瘤相关联的肽组合，该肽可例如充当疫苗组合物的活性医药成分，该活性医药成分刺激抗肿瘤免疫反应，或离体刺激T细胞及将其转移至患者中。结合至主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex；MHC)的分子的肽或此等肽亦可为抗体、可溶性T细胞受体、及其他结合分子的标靶。
本发明涉及来源于人类肿瘤细胞的HLA I类分子的若干新颖的肽序列及其变异体，可用于疫苗组合物以用于引出抗肿瘤免疫反应，或用作用于开发医药活性/免疫活性化合物及细胞的标靶。
发明背景
根据世界卫生组织(World Health Organization；WHO)，在2012年全世界范围内的四种主要的非传染性致死疾病涉及癌症。同一年，结肠直肠癌、乳癌及呼吸道癌被列入高收入国家的前10个死因中。
考虑到与治疗癌症相关联的严重副作用及费用，需要鉴别出可用于治疗癌症的因素。
亦需要鉴别表示癌症的生物标志、产生较好的癌症诊断、预后评估、及治疗成功预测的因素。
癌症免疫治疗
癌症的免疫治疗表示在最小化副作用的同时对癌细胞的特异性靶向的选择。癌症免疫治疗利用肿瘤相关抗原的存在。
肿瘤相关抗原(tumor associated antigen；TAA)的当前分类包含以下主要群组：
a)癌症-睾丸抗原：曾鉴别的可由T细胞识别的第一种TAA属于此类别，其最初是称为癌症-睾丸(cancer-testis；CT)抗原。因为睾丸的细胞不表达I类及II类HLA分子，所以该些抗原不可由正常组织中的T细胞识别且因此可被视为免疫上肿瘤特异性的。CT抗原的熟知实例为MAGE家族成员及NY-ESO-1。
b)分化抗原：该些TAA在肿瘤与出现肿瘤的正常组织的间共用。大多数已知的分化抗原在黑素瘤及正常黑色素细胞中发现。实例包括但不限于黑素瘤的酪氨酸酶及Melan-A/MART-1或前列腺癌的PSA。
c)过度表达的TAA：编码经广泛表达的TAA的基因已在组织学上不同类型的肿瘤中以及在许多正常组织中检测到，其通常具有较低的表达水平。可能的是，藉由正常组织加工及可能提呈的许多抗原决定基处于针对T细胞识别的阈值水平以下，而其在肿瘤细胞中的过度表达可藉由破坏先前建立耐受性来触发抗癌反应。此类别的TAA的突出实例为Her-2/neu、存活素(survivin)、端粒酶、或WT1。
d)肿瘤特异性抗原：该些独特的TAA由正常基因的突变产生(诸如β-连环蛋白、CDK4、等等)。该些分子改变中的一些与赘瘤性转变和/或进展相关联。肿瘤特异性抗原通常能够诱导强的免疫反应而不承担正常组织自体免疫反应的风险。另一方面，该些TAA在大多数情况下仅与鉴别出该些TAA的切确肿瘤有关且不在许多个别肿瘤之间共用。若在具有肿瘤特异性(相关联)同功型的蛋白质的情况下，肽是起源于肿瘤特异性(相关联)外显子，则亦可出现肽的肿瘤特异性(或关联)。
e)致癌病毒蛋白质：该些TAA是病毒蛋白质，其可在致癌过程中起着关键作用，且因为其是外来的(不具有人类起源)，所以其可唤起T细胞反应。此类蛋白质的实例为人类乳突状瘤类型16病毒蛋白质、E6及E7，皆表达于宫颈癌瘤中。
人类内生性反转录病毒(human endogenous retrovirus；HERV)构成人类基因组的显著部分(约8％)。该些病毒元件在数百万年前整合至基因组中且自那时起世代垂直传递。极大多数的HERV经由突变或截断已丧失功能活性，而诸如HERV-K演化支的成员的一些内生性反转录病毒仍编码功能基因且已被证实形成类反转录病毒粒子。HERV原病毒的转录受表观遗传学控制且在正常生理条件下保持沉默。然而，已在某些疾病及尤其针对不同类型的癌症描述了导致病毒蛋白质的活性转译的再活化及过度表达。HERV衍生蛋白质的此种肿瘤特异性表达可经控制用于不同类型的癌症免疫治疗。
f)由异常转译后修饰产生的TAA：此类TAA可由肿瘤中既不为特异性又不被过度表达但藉由主要在肿瘤中为活性的转译后加工而变成肿瘤相关联的蛋白质来产生。该类别的实例由改变的糖基化模式产生，其在肿瘤中导致针对MUC1或如同降解期间的蛋白质剪接的事件的新颖抗原决定基，其可或可不为肿瘤特异性的。
基于T细胞的免疫治疗靶向来源于肿瘤相关联或肿瘤特异性蛋白质的肽抗原决定基，该肽抗原决定基藉由MHC分子提呈。由肿瘤特异性T淋巴细胞，亦即，其抗原决定基识别的抗原可为来源于所有蛋白质类别的分子，诸如酶、受体、转录因子等等，其表达在相应肿瘤的细胞中且相较于相同起源的未改变细胞，通常在相应肿瘤的细胞中上调。
存在两种类型的MHC分子，MHC I类及MHC II类。MHC I类分子由α重链及β-2-微球蛋白组成，MHC II类分子由α及β链组成。其三维构造导致用于与肽非共价相互作用的结合凹槽。
MHC I类分子可在大多数有核细胞上发现。该分子提呈由主要内原性蛋白质、缺陷性核糖体产物(defective ribosomal product；DRIP)及较大肽的蛋白质水解分解裂解产生的肽。然而，来源于胞内体分室或外源性来源的肽亦频繁地在MHC I类分子上发现。I类提呈的此种非经典方式在文献中称为交叉提呈(Brossart及Bevan,1997；Rock等人,1990)。MHC II类分子可主要在专门的抗原提呈细胞(antigen presenting cell；APC)上发现，且主要提呈外源性或跨膜蛋白质的肽，该肽例如在胞吞作用期间藉由APC吸收且随后经加工。
肽及MHC I类的复合物由带有适当T细胞受体(T cell receptor；TCR)的CD8阳性T细胞识别，而肽及MHC II类分子的复合物由带有适当TCR的CD4阳性辅助T细胞识别。熟知的是，TCR、肽及MHC借此以1:1:1的化学计量的量存在。
CD4阳性辅助T细胞在藉由CD8阳性细胞毒性T细胞诱导反应及持续有效的反应方面起重要作用。来源于肿瘤相关抗原(tumor associated antigen；TAA)的CD4阳性T细胞抗原决定基的鉴别对于开发用于触发抗肿瘤免疫反应的医药产品而言具有很大的重要性。在肿瘤位点处，T辅助细胞支援细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell；CTL)友好的细胞介素环境，且吸引效应细胞，例如CTL、自然杀手(natural killer；NK)细胞、巨噬细胞、及颗粒性白血球。
在不存在炎症的情况下，MHC II类分子的表达主要受限于免疫系统的细胞，尤其是专门的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell；APC)，例如，单核细胞、单核细胞来源的细胞、巨噬细胞、树突细胞。在癌症患者中，已发现肿瘤的细胞表达MHC II类分子(Dengjel等人,2006)。
本发明的伸长(较长)的肽可充当MHC II类活性抗原决定基。
藉由MHC II类抗原决定基活化的T辅助细胞在设置CTL于抗肿瘤免疫性中的效应物功能方面中起重要作用。触发TH1类型的T辅助细胞反应的T辅助细胞抗原决定基支援CD8阳性杀手T细胞的效应物功能，包括针对在其细胞表面上展示肿瘤相关联肽-MHC复合物的肿瘤细胞的细胞毒性功能。以此方式，单独的或与其他肿瘤相关联肽组合的肿瘤相关联T辅助细胞肽抗原决定基可充当刺激抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物的活性医药成分。
因为HLA II类分子的组成型表达通常限于免疫细胞，所以自原发肿瘤直接分离II类肽的可能性在先前考虑为不可能的。然而，Dengjel等人成功地自肿瘤直接鉴别出大量MHC II类抗原决定基(WO 2007/028574、EP 1 760 088 B1、其内容以全文引用方式并入本文)。
对于触发(引出)细胞免疫反应的MHC I类肽，其亦必须结合至MHC分子。此过程取决于MHC分子的等位基因及肽的氨基酸序列的特定同质多晶形性。MHC I类结合肽通常为8-12个氨基酸残基长度且通常在其序列中含有与MHC分子的相应结合凹槽相互作用的两个保存的残基(“锚定物”)。以此方式，每一MHC等位基因具有决定哪些肽可特异性结合至结合凹槽的“结合模体”。
在MHC I类依赖性免疫反应中，肽不仅必须能够结合至藉由肿瘤细胞表达的某些MHC I类分子，而且其随后亦必须由带有特异性TCR的T细胞识别。
对于将由T淋巴细胞识别为肿瘤特异性或相关联抗原且将用于治疗的蛋白质，必须满足特定先决条件。抗原应主要藉由肿瘤细胞而非藉由正常健康组织表达，或藉由正常健康组织以相当小的量表达。可能有利的是，相较于正常健康组织，肽藉由肿瘤细胞过度提呈。此外合意的是，相应抗原不仅存在于一类肿瘤中，且以高浓度存在。肿瘤特异性及肿瘤相关联抗原常常来源于直接涉及正常细胞转变至肿瘤细胞的蛋白质，该转变归因于细胞的功能，例如在细胞周期中控制或抑制细胞凋亡。另外，直接由转变引起的蛋白质的下游标靶可上调且因此可间接地为肿瘤相关联的。此类间接肿瘤相关联抗原亦可为疫苗接种方法的标靶(Singh-Jasuja等人,2004，其内容以全文引用方式并入本文)。必要的是，抗原决定基存在于抗原的氨基酸序列中，以便确保来源于肿瘤相关抗原的此种肽(“免疫性肽”)导致体外或体内T细胞反应。
TAA可为开发基于T细胞的免疫治疗的起始点。用于鉴别及表征TAA的方法通常基于使用可自患者或健康受试者分离的T细胞，或其基于产生肿瘤与正常组织的间的差异转录分布或差异肽表达模式。然而，鉴别在肿瘤组织或人类肿瘤细胞系中过度表达的或在此类组织或细胞系中选择性表达的基因不会提供关于在免疫治疗中使用自该些基因转录的抗原的精确信息。这是因为该些抗原的抗原决定基的仅个别亚群适于此类应用，因为必须存在具有相应TCR的T细胞且此特定抗原决定基的免疫耐受性必须不存在或为最小程度。
在藉由根据本发明的特异性TCR(例如可溶行TCR)及抗体或其他结合分子(支架)靶向肽-MHC的情况下，基础肽的免疫原性是次要的。在该些情况下，提呈是决定因素。
产生肿瘤相关联肽的脱糖基化及后续脱酰胺化
TAA可能不仅由对肿瘤为特异性的或过度表达的蛋白质产生。其亦可由在肿瘤中既不为特异性又不过度表达的蛋白质的异常转译后修饰(post-translationalmodification；PTM)产生：然而此类TAA可藉由主要在肿瘤中为活性的转译后加工而变成肿瘤相关联的。
虽然转译后修饰改变并延长免疫肽组的免疫图谱，其具有多样功能及后果。一些PTM阻碍经修饰的肽结合至HLA复合物(Andersen等人,1999)，其可贡献于肿瘤细胞的免疫回避策略。其他修饰导致较高的HLA亲和力或增加的免疫原性，其已与自体免疫疾病相关联(Arentz-Hansen等人,2000；McGinty等人,2015；Sidney等人,2018；Raposo等人,2018)，但可开发用于恶性肿瘤中的免疫治疗(Zarling等人,2006；Purcell等人,2007；Petersen等人,2009；Cobbold等人,2013；Marcilla等人,2014；Lin等人,2019；Brentville等人,2020)。
先前的PTM分析将脱酰胺化鉴别为HLA I提呈的免疫肽的相当普遍的修饰(Han等人,2011；Mei等人,2020)。此种化学反应导致自天冬酰胺酸(N)至天冬氨酸(D)的氨基酸转化(Knorre,Kudryashova及Godovikova 2009；Mei等人,2020)。
N脱酰胺化富集在来源于膜相关联蛋白质的肽中且与序列模体N[X^P][ST]相关联，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸且继之以丝氨酸(S)或苏氨酸(T)(Han等人,2011；Cao等人2017；Mei等人,2020)。此模体是N-糖基转移酶的经确立识别模体(Yan及Lennarz2005；Petersen,Purcell及Rossjohn 2009)，其在内质网(endoplasmic reticulum；ER)中将N脱酰胺化连接至初期糖基化。机械地，蛋白质或多肽在其于ER中转译期间变得糖基化。在其输出至细胞质之后，其藉由肽-N-聚糖酶(PNG酶)变成脱糖基化的。在此水解降解过程期间，N残基亦脱酰胺化成D，从而导致氨基酸序列的末端变化。在蛋白质或多肽于蛋白酶体中进一步降解之后，肽被再次运送至ER中。此时，其结合至HLA复合物，易位至细胞膜且在细胞表面上提呈脱酰胺化肽(参见第1图)(Misaghi等人,2004；Petersen,Purcell及Rossjohn2009；Mei等人,2020)。此机制潜在地允许T细胞在感染期间识别并清除具有经扰动糖基化而且由改变的肿瘤细胞新陈代谢产生的细胞。
先前的PTM分析将脱酰胺化鉴别为HLA I提呈的免疫肽的相当普遍的修饰(Han等人,2011；Mei等人,2020)。此种化学反应导致自天冬酰胺酸(N)至天冬氨酸(D)的氨基酸转化(参见第2图)(Knorre,Kudryashova,及Godovikova 2009；Mei等人,2020)。
虽然癌症中的异常糖基化最初与免疫抑制作用相关联(Liu及Rabinovich 2005；Rodriguez等人,2018；De Bousser等人,2020)，累积的证据表明其亦可开发用于基于T细胞的治疗。因此，糖蛋白自身(Posey等人,2016；Maher等人,2016；RodrIguez,Schetters及vanKooyk 2018；De Bousser等人,2020)或糖基化依赖性脱酰胺化肽充当新抗原且可被靶向。在研究以下各项的文献中对脱酰胺化肽的免疫性作用存在一些充分描述的实例：病原体的人类免疫缺陷性病毒1型套膜糖蛋白(glycoprotein；GP)(Behrens等人,2017；Ferris等人,1999)、C型肝炎GP E1(Selby等人,1999)及淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒GP 1(Hudrisier等人,1999)肽，以及黑素瘤中的酪氨酸酶肽(Mosse等人,1998；Schaed等人,2002；Altrich-VanLith等人,2006；Ostankovitch等人,2009)。
因此，上文描述的脱酰胺化肽及抗原提呈的非典型路径充当用于基于T细胞的肿瘤免疫治疗的令人感兴趣的标靶。
发明内容
在第一方面中，本发明涉及一种肽或其医药学上可接受的盐，该肽包含选自由以下各项组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113；及其变异体序列，该变异体序列结合至MHC分子和/或诱导T细胞与该变异体肽交叉反应。
下表(表1A及表2)展示根据本发明的肽、其相应SEQ ID NO、及该些肽的预期来源(基本)基因。
表1A：根据本发明的肽。应注意，每一行中的两个相邻肽为包含可能的N-糖基化模体的野生型序列(右侧栏)，及缺少该N-糖基化模体的突变版本(左侧栏)，其中N(Asn)残基已由其脱酰胺化变异体D(Asp)置换。
表1B：根据本发明的肽。
SEQ ID NO 序列
227 ELAGIGILTV
228 YLLPAIVHI
表2A：根据本发明的非脱酰胺化肽及该肽所来源的一个示范性来源转录物ID(获自综资料库https://www.ensembl.org/的ENST ID)，然而，肽可另外起源于本文未列出的其他另外的或替换的转录物。重要的是理解，虽然针对野生型变异体指示出来源，但其同样地适用于如表1A的概要中所示的脱酰胺化对应物。
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表2B：根据本发明的肽及该肽所来源的一个示范性来源转录物ID(获自综资料库https://www.ensembl.org/的ENST ID)，然而，肽可另外起源于本文未列出的其他另外的或替换的转录物。
SEQ ID NO 序列 转录物ID
227 ELAGIGILTV ENST00000381471p26
228 YLLPAIVHI ENST00000225792p148
本发明此外大体上涉及用于治疗增生性疾病的根据本发明的肽。上下文中的增生性疾病例如为急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌。
尤其较佳的为单独或呈组合的肽，其选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113组成的群组。
因此，本发明的另一方面涉及根据本发明的肽用于治疗(较佳组合治疗)增生性疾病的用途。
本发明此外涉及根据本发明的肽，其具有结合至MHC分子I类或—以伸长形式、诸如长度变异体—MHC II类的能力。
本发明进一步涉及伸长肽，其在给药(例如作为疫苗给药)之后可经细胞内加工，从而产生较短的肽，其由或主要由根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成，该较短肽随后藉由细胞表面上的HLA提呈。
本发明进一步涉及根据本发明的肽，其中该肽(各自)由或主要由根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成。
本发明进一步涉及根据本发明的肽，其中该肽包括非肽键。
本发明进一步涉及根据本发明的肽，其中该肽为融合蛋白质的部分，其尤其融合至HLA-DR抗原相关联不变链(Ii)的N末端氨基酸或融合至抗体(或融合至抗体的序列中)，该抗体诸如例如对树突细胞为特异性的抗体。
本发明进一步涉及编码根据本发明的肽的核酸。本发明进一步涉及根据本发明的核酸，其为DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合。
本发明进一步涉及表达载体，其能够表达和/或表达根据本发明的核酸。
本发明进一步涉及根据本发明的肽、根据本发明的核酸或根据本发明的表达载体，其用于治疗疾病及用于药物中、尤其用于治疗癌症。
本发明进一步涉及抗体及制造该些抗体的方法，该抗体对根据本发明的肽或根据本发明的该肽与MHC的复合物为特异性的。
本揭示内容亦可涉及产生特异性结合至与包含、由或主要由根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成的肽复合的MHC I类分子的抗体的方法，该方法包括：利用与由或主要由根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成的肽复合的可溶形式的MHC I类分子使含有表达该MHCI类分子的细胞的经基因工程改造的非人类哺乳动物免疫；自该非人类哺乳动物的抗体产生细胞分离mRNA分子；产生展示藉由该mRNA分子编码的蛋白质分子的噬菌体展示库；及自该噬菌体展示库分离至少一个噬菌体，其中该至少一个噬菌体展示特异性结合至与包含、由或主要由根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成的肽复合的该MHC I类分子的该抗体。在另一方面中，抗体可为单株抗体。
在一方面中，抗体可以<100nM、更佳地<50nM、更佳地<10nM、更佳地<1nM、更佳地<0.1nM、更佳地<0.01nM的结合亲和力(Kd)结合至与包含、由或主要由根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成的抗原复合的该MHC I类分子。
在另一方面中，产生抗体的方法可进一步包括将抗体人源化。在此方面中，产生抗体的方法可进一步包括将抗体与一种毒素接合。在另一方面中，产生抗体的方法可进一步包括将抗体与免疫刺激域接合。
在一方面中，产生抗体的方法可进一步包括修饰呈双特异性抗体形式的抗体。在另一方面中，产生抗体的方法可进一步包括修饰呈嵌合抗体形式的抗体。在另一方面中，产生抗体的方法可进一步包括修饰呈Fv形式的抗体。在此方面中，产生抗体的方法可进一步包括修饰呈Fab形式的抗体。在另一方面中，产生抗体的方法可进一步包括修饰呈Fab'形式的抗体。在另一方面中，产生抗体的方法可进一步包括用放射性核苷酸标记抗体，该放射性核苷酸可选自由以下各项组成的群组：111In、99Tc、14C、131I、3H、32P、及35S。在另一方面中，非人类哺乳动物可为小鼠。
本发明进一步涉及工程改造至自体或同种异体T细胞中的TCR，尤其是可溶TCR及经选殖TCR，及制造该些TCR的方法，以及带有该TCR或与该TCR交叉反应的NK细胞或其他细胞。可溶TCR可具有<100nM、更佳地<50nM、更佳地<10nM、更佳地<1nM、更佳地<0.1nM、更佳地<0.01nM的结合亲和力(Kd)。而基于经选殖细胞的TCR可具有<50μM、更佳地<25μM、更佳地<10μM、更佳地<1μM、更佳地<0.1μM的结合亲和力(Kd)。
抗体及TCR为当前的根据本发明的肽的免疫治疗用途的另外实施例。
本发明进一步涉及包含根据本发明的核酸或如前文所述的表达载体的寄主细胞。本发明进一步涉及根据本发明的寄主细胞，其为抗原提呈细胞及较佳地为树突细胞。
本发明进一步涉及根据本发明的该方法，其中抗原藉由使足够量的抗原与抗原提呈细胞接触来载入至适合的抗原提呈细胞或人工抗原提呈细胞的表面上表达的I类或II类MHC分子上。
本发明进一步涉及根据本发明的方法，其中抗原提呈细胞包含能够表达含有SEQID NO:1至SEQ ID NO:113的该肽的表达载体。
本发明进一步涉及藉由根据本发明的方法产生的活化T细胞，其中该T细胞选择性地识别表达包含根据本发明的氨基酸序列的多肽的细胞。
本发明进一步涉及杀伤患者中的靶细胞的方法，该患者的靶细胞异常地表达包含根据本发明的任何氨基酸序列的多肽，该方法包含将有效量的如根据本发明产生的T细胞给药至患者。
本发明进一步涉及如所描述的任何肽、根据本发明的核酸、根据本发明的表达载体、根据本发明的细胞、根据本发明的活化T淋巴细胞、TCR或抗体或其他肽和/或肽-MHC结合分子作为药剂或在制造药剂中的用途。较佳地，该药剂对癌症为活性的。
较佳地，该药剂为基于可溶TCR或抗体的细胞治疗剂、疫苗或蛋白质。
本发明进一步涉及根据本发明的用途，其中该癌症为急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌，且较佳地为急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌细胞。
本发明进一步涉及基于根据本发明的肽的生物标志，本文称为“标靶”，其可用于诊断癌症，较佳为急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌。标志可为肽自身的过度提呈，或相应基因的过度表达。标志亦可用于预测治疗、较佳地免疫治疗、及最佳靶向藉由生物标志鉴别的同一标靶的免疫治疗的成功机率。例如，抗体或可溶TCR可用于染色肿瘤的切片以检测具有MHC的复合物中所关注肽的存在。
视情况，抗体携带诸如免疫刺激域或毒素的另一效应物功能。
本发明亦涉及该些新颖标靶在癌症治疗情形中的用途。
发明详述
免疫反应的刺激取决于藉由寄主免疫系统识别为外来的抗原的存在。发现肿瘤相关抗原的存在产生使用寄主的免疫系统来干涉肿瘤生长的可能性。现针对癌症免疫治疗来探究控制免疫系统的体液臂及细胞臂两者的各种机制。
细胞免疫反应的特异性元件能够特异性地识别及破坏肿瘤细胞。自肿瘤浸润细胞群体或自周边血液分离T细胞暗示此类细胞在针对癌症的天然免疫防御中起重要作用。CD8阳性T细胞尤其在此反应中起重要作用，该CD8阳性T细胞识别MHC I类分子，其带有来源于位于细胞溶质中的蛋白质或缺陷性核糖体产物(defect ribosomal products；DRIPS)的通常具有8至12个氨基酸残基的肽。人类的MHC分子亦称为人类白血球抗原(humanleukocyte-antigen；HLA)。
如本文所使用且除非另外说明，否则所有术语如下文所给出的来定义。
术语“T细胞反应”意指藉由肽在体外或体内诱导的效应物功能的特异性增殖及活化。对于MHC I类限制的细胞毒性T细胞，效应物功能可为肽脉冲靶细胞、肽前驱物脉冲靶细胞或天然肽提呈靶细胞的溶解，藉由肽诱导的细胞介素(较佳为干扰素-γ、TNF-α、或IL-2)的分泌，藉由肽诱导的效应分子(较佳为颗粒酶或穿孔蛋白)的分泌，或去颗粒。
术语“肽”在本文用以指定一系列氨基酸残基，其典型地藉由相邻氨基酸的α胺基与羧基之间的肽键将一个氨基酸连接至另一个氨基酸。
此外，术语“肽”将包括一系列氨基酸残基的盐，该氨基酸残基典型地藉由相邻氨基酸的α胺基与羧基之间的肽键将一个氨基酸连接至另一个氨基酸。较佳地，盐为肽的医药学上可接受的盐，诸如，例如氯化物或乙酸盐(三氟乙酸盐)。必须注意，根据本发明的肽的盐实质上不同于在其体内状态下的肽，因为肽在体内并非呈盐的形式或与相对离子相关联。
术语“肽”亦将包括“寡肽”。术语“寡肽”在本文用以指定一系列氨基酸残基，其典型地藉由相邻氨基酸的α胺基与羧基之间的肽键将一个氨基酸连接至另一个氨基酸。寡肽的长度对本发明不是关键的，只要寡肽中维持正确的一或多个抗原决定基即可。
术语“多肽”指定一系列氨基酸残基，其典型地藉由相邻氨基酸的α胺基与羧基之间的肽键将一个氨基酸连接至另一个氨基酸。多肽的长度对本发明不是关键的，只要维持正确的抗原决定基即可。与术语肽或寡肽相对比，术语多肽意味指代含有超过约30个氨基酸残基的分子。
若编码此类分子的肽、寡肽、蛋白质或多核苷酸能够诱导免疫反应，则其为“免疫性的”(且因此为本发明内的“免疫原”)。在本发明的情况下，免疫原性更具体地定义为诱导T细胞反应的能力。因此，“免疫原”将为能够诱导免疫反应的分子，且在本发明的情况下为能够诱导T细胞反应的分子。在另一方面中，免疫原可为用于产生针对其的特异性抗体或TCR的肽、肽与MHC的复合物、寡肽、和/或蛋白质。
I类T细胞“抗原决定基”需要短的肽，其结合至I类MHC分子，从而形成三元复合物(MHC I类α链、β-2-微球蛋白、及肽)，该三元复合物可由带有以适当的亲和力结合至MHC-肽复合物的匹配T细胞受体的T细胞识别。结合至MHC I类分子的肽的长度典型地为8-12个氨基酸，且长度最典型地为9个氨基酸。
在人类体内，存在编码MHC I类分子(人类的MHC分子亦称为人类白细胞抗原(human leukocyte antigen；HLA))的三个不同的基因座：HLA-A、HLA-B、及HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02及HLA-B*07为可自该些基因座表达的不同MHC I类等位基因的实例。
本发明的肽，较佳地在包括至如本文描述的本发明的疫苗中时结合至选自由以下各项组成的群组的至少一者：HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01及HLA-B*44:02，外加视情况其他HLA异型。归因于结合模式的相似性，诸如相关锚定位置的相似性，一些肽结合至超过一种等位基因，此种重叠很可能为但不限于亦结合至HLA-B*15的HLA-A*01结合肽、亦结合至HLA-A*11的HLA-A*03结合肽、亦结合至HLA-B*35及HLA-B*51的HLA-B*07结合肽。
疫苗亦可包括泛结合MHC II类肽。因此，本发明的疫苗可用于治疗患者中的对相应HLA等位基因为阳性的癌症，而归因于该些肽的泛结合特性，不需要针对MHC II类异型的选择。
若本发明的肽与结合至另一等位基因的肽组合，则相较于单独针对任一种MHC I类等位基因，可治疗较高百分比的任何患者群体。
在一较佳实施例中，术语“核苷酸序列”是指去氧核糖核苷酸的异聚物。
编码特定肽、寡肽、或多肽的核苷酸序列可为天然存在的或其可经合成构筑。通常，编码本发明的肽、多肽、及蛋白质的DNA区段自cDNA片段及短的寡核苷酸连接子装配，或自一系列寡核苷酸装配，以提供能够在包含来源于微生物或病毒操纵子的调节元件的重组转录单元中表达的合成基因。
如本文所使用，术语“编码(coding)(或编码(encoding)肽的核苷酸)”是指包括对生物系统相容的人工(人造)起始密码子及终止密码子的编码肽的核苷酸序列，该序列将藉由例如适用于产生TCR的树突细胞或另一细胞系统表达。
如本文所使用，对核酸序列的提及包括单链核酸及双链核酸两者。因此，例如对DNA而言，除非上下文另外指示，否则特定序列是指此类序列的单链DNA、此类序列与其补体的双链体(双链DNA)及此类序列的补体。
术语“编码区”是指基因的部分，其天然地或正常地编码彼基因在其天然基因体学环境中的表达产物，亦即，在体内编码该基因的初始表达产物的区域。
编码区可来源于非突变(“正常”)基因、突变基因或经改变基因，或甚至可来源于使用DNA合成领域的技艺人士所熟知的方法在实验室中整体合成的DNA序列或基因。
术语“表达产物”意指多肽或蛋白质，其为基因及由遗传码简并产生并因此编码相同氨基酸的任何核酸序列编码等效物的天然转译产物。
当提及编码序列时，术语“片段”意指DNA的一部分，其包含小于完全的编码区，其表达产物保持与完全编码区的表达产物本质上相同的生物功能或活性。
术语“DNA区段”是指呈单独片段形式或作为较大DNA构建体的组分的DNA聚合物，其已来源于以实质上纯的形式，亦即，在不污染内生性物质的情况下经至少一次分离的DNA，且其数量或浓度赋能藉由标准生化方法，例如，藉由使用选殖载体来鉴别、操纵、及回收该区段及其组分。以不由典型地存在于真核基因中的内部非转译序列或内含子中断的开放阅读框架形式提供此类区段。非转译DNA的序列可存在于开放阅读框架下游，其中该序列不干扰编码区的操纵或表达。
术语“医药学上可接受的盐”是指所揭示肽的衍生物，其中肽藉由制成试剂的酸式或碱式盐来修饰。例如，酸式盐自游离碱(典型地其中药物的中性形式具有中性-NH2基团)制备，涉及与适合酸的反应。用于制备酸式盐的适合酸包括：有机酸，例如，乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、及类似物；以及无机酸，例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、及类似物。相反地，可存在于肽上的酸部分的碱式盐的制备使用诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺或类似物的医药学上可接受的碱来制备。在一较佳实施例中，医药组合物包含作为乙酸的盐(乙酸盐)、三氟乙酸盐或盐酸的盐(氯化物)的肽。
呈医药学上可接受的盐形式的本揭示内容的肽不是天然发现的。本揭示内容的肽结合MHC分子。送至内质网(endoplasmic reticulum；ER)用于与MHC分子缔合的MHC肽是最终肽的较长前驱物，该最终肽在结合至MHC分子时(肽-MHC复合物)运送至细胞表面。藉由MHC分子提呈的肽从不自由浮动且甚至在与MHC分子缔合之后，将其自ER中的较长前驱物修正至适当大小。如天然所见，本揭示内容的肽(处于或不处于较长前驱物肽内)在任何时候皆不呈医药学上可接受的盐形式。盐形式的存在意指侧基和/或N末端和/或C末端结合至盐离子是显著不同的结构/化学变化。本揭示内容的肽的医药学上可接受的盐形式需要能够以化学计量定义的摩尔浓度给予肽质子或接受肽的质子的酸和/或碱，此种盐仅在不为细胞质的受控环境中形成。
术语“启动子”意指涉及结合RNA聚合酶以起始转录的DNA区。
术语“分离”意指将物质自其原始环境(例如，天然环境，若其为天然存在的话)移除。例如，存在于活动物体内的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但与天然系统中的共存物质的一些或所有分离的相同多核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可为载体的部分和/或此类多核苷酸或多肽可为组合物的部分，且仍是分离的，原因在于此类载体或组合物并非其自然环境的部分。
根据本发明揭示的多核苷酸及重组或免疫多肽亦可呈“纯化”形式。术语“纯化”不需要绝对纯度，实情为，其意欲作为相对定义，且可包括高度纯化的制剂或仅部分纯化的制剂，因为彼等术语是相关技术中的技艺人士所理解的。例如，自cDNA库分离的个别纯系已习知地纯化至电泳同质性。清楚地涵盖将起始材料或天然材料纯化至至少一个数量级、较佳地两个或三个数量级、及更佳地四个或五个数量级。此外，清楚地涵盖具有以重量计较佳99.999％或至少99.99％或99.9％；且甚至合需地99％或更大的纯度的所主张多肽。
根据本发明揭示的核酸及多肽表达产物，以及含有此类核酸和/或此类多肽的表达载体可呈“富集形式”。如本文所使用，术语“富集”意指物质的浓度为(例如)其天然浓度的至少约2、5、10、100、或1000倍，有利地为以重量计0.01％、较佳地以重量计至少约0.1％。亦涵盖以重量计约0.5％、1％、5％、10％、及20％的富集制剂。构成本发明的序列、构建体、载体、纯系、及其他物质可有利地呈富集形式或分离形式。术语“活性片段”意指通常为肽、多肽或核酸序列的片段，其在单独或视情况与适合佐剂一起或于载体中给药至动物时产生免疫反应(亦即，具有免疫活性)，该动物诸如哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、骆马、绵羊、山羊、犬、或马，以及包括人类，此类免疫反应呈现在诸如人类的受体动物内刺激T细胞反应的形式。替代地，“活性片段”亦可用于诱导体外T细胞反应。
如本文所使用，术语“部分”、“区段”及“片段”在相关于多肽使用时，是指诸如氨基酸残基的残基的连续序列，该序列形成较大序列的子集。例如，若多肽经受用任何共同的内肽酶(诸如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶)处理，则由此种处理产生的寡肽将表示起始多肽的部分、区段或片段。在相关于多核苷酸使用时，该些术语是指藉由用任何核酸内切酶处理该多核苷酸所产生的产物。
根据本发明，在提及序列时，术语“一致性百分比”或“一致百分比”意指在待比较的序列(“比较序列”)与所描述或主张的序列(“参考序列”)的比对之后，将序列与所主张或描述的序列比较。
随后根据下式决定一致性百分比：
一致性百分比＝100[1-(C/R)]
其中C为在参考序列与比较序列之间的比对长度上，在参考序列与比较序列之间的差异数，其中
(i)参考序列中的每一碱基或氨基酸，其不具有比较序列中的相应比对碱基或氨基酸，及
(ii)参考序列中的每一间隙，及
(iii)参考序列中的每一比对碱基或氨基酸构成差异，该比对碱基或氨基酸不同于比较序列中的比对碱基或氨基酸，及
(iiii)比对必须在比对序列的位置1处开始；
且R为在与比较序列的比对长度上，参考序列中的碱基或氨基酸的数目，其中参考序列中产生的任何间隙亦作为碱基或氨基酸计数。
若在比较序列及参考序列之间存在比对，该比对的如上文计算的一致性百分比约等于或大于规定的最低一致性百分比，则比较序列与参考序列具有规定的最低一致性百分比，即使可存在上文计算的一致性百分比小于规定的一致性百分比的比对。
如上文所提及，本发明因此提供一种肽，其包含选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113或其变异体组成的群组的序列，该变异体将诱导T细胞与该肽交叉反应。本发明的肽具有结合至MHC分子I类或将该肽的伸长版本结合至II类的能力。
在本发明中，术语“同源”是指两个氨基酸序列的序列(亦即，肽或多肽序列)之间的一致性程度(参见上文的一致性百分比)。上述“同源性”藉由在最佳条件下，在待比较的序列上比较两个比对序列来决定。此序列同源性可藉由使用例如ClustalW演算法产生比对来计算。通常可用的序列分析软件，更具体而言，Vector NTI、GENETYX或其他工具藉由公共资料库提供。
熟习此项技术者将能够评定藉由特定肽的变异体诱导的T细胞是否将能够与肽自身交叉反应(参见，例如，Appay等人,2006；Colombetti等人,2006；Fong等人,2001；Zaremba等人,1997，其内容以全文引用方式并入本文)。
就给定氨基酸序列的“变异体”而言，发明人意指氨基酸残基中例如一或两者的侧链经改变(例如藉由用另一天然存在的氨基酸残基的侧链或一些其他侧链将其置换)以使得肽仍能够以实质上与由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113中的给定氨基酸序列组成的肽相同的方式结合至HLA分子。例如，肽可经修饰以便其即使不改良亦至少维持与适合MHC分子的结合凹槽相互作用及结合至该结合凹槽的能力，及以彼方式，其即使不改良亦至少维持结合至活化T细胞的TCR的能力，该适合MHC分子诸如选自由以下各项组成的群组中的一者：HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01及HLA-B*44:02，外加视情况其他HLA异型。
该些T细胞可随后与细胞交叉反应且杀伤表达多肽的细胞，该多肽含有如本发明的方面中所定义的同族肽的天然氨基酸序列。如可来源于科学文献及资料库的(Rammensee等人,1999；Godkin等人,1997，其以全文引用方式并入本文)，HLA结合肽的某些位置典型地为形成装配至HLA分子的结合模体的核心序列的锚定物残基，该核心序列藉由构成结合凹槽的多肽链的极性、电子物理学、疏水性及空间性质来定义。因此，熟习此项技术者将能够藉由维持已知的锚定物残基来修饰SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113中列明的氨基酸序列，且将能够决定此类变异体是否维持结合MHC I类或II类分子的能力。本发明的变异体保持结合至活化T细胞的TCR的能力，该活化T细胞随后可与表达多肽的细胞交叉反应且杀伤细胞，该多肽含有如本发明的方面中所定义的同族肽的天然氨基酸序列。
若未另外说明，则如本文揭示的原始(未修饰)肽可藉由在肽链内的不同、可能的选择性位点处取代一或多个残基来修饰。较佳地，彼等取代位于氨基酸链的端部处。此类取代可具有保守特性，例如，其中一个氨基酸藉由类似结构及特性的氨基酸置换，诸如其中疏水性氨基酸藉由另一疏水性氨基酸置换。甚至更保守的将是置换具有相同或相似大小或化学特性的氨基酸，诸如其中亮氨酸藉由异亮氨酸置换。在天然存在的同源蛋白质的家族中的序列变异研究中，某些氨基酸取代比其他取代常常更耐受，且该些取代常常展示在原始氨基酸与其置换物之间的大小、电荷、极性、及疏水性的相似性，且此等用于定义“保守取代”的基础。
保守取代在本文中解释为以下五个群组之一者内的互换：群组1-小的脂族非极性或稍有极性的残基(Ala、Ser、Thr、Pro、Gly)；群组2-极性的带负电残基及其酰胺(Asp、Asn、Glu、Gln)；群组3-极性的带正电残基(His、Arg、Lys)；群组4-大的脂族非极性残基(Met、Leu、Ile、Val、Cys)；及群组5-大的芳族残基(Phe、Tyr、Trp)。
在一方面中，保守取代可包括藉由Dayhoff在“The Atlas of Protein Sequenceand Structure.Vol.5”,Natl.Biomedical Research中描述的彼等保守取代，其内容以全文引用方式并入本文。例如，在一方面中，属于以下群组之一者的氨基酸可彼此互换，因此构成保守互换：群组1：丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、天冬酰胺酸(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；群组2：半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)；群组3：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫胺酸(M)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)；群组4：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)；群组5：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)；及群组6：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)。在一方面中，保守氨基酸取代可选自以下：T→A、G→A、A→I、T→V、A→M、T→I、A→V、T→G、和/或T→S。
在一方面中，保守氨基酸取代可包括氨基酸藉由相同类别的另一氨基酸取代，例如(1)非极性：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp；(2)不带电、极性：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；及(4)碱性：Lys、Arg、His。其他保守氨基酸取代亦可如下制得：(1)芳族：Phe、Tyr、His；(2)质子供体：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp；及(3)质子受体：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln(参见，例如，美国专利第10,106,805号，其内容以全文引用方式并入本文)。
在另一方面中，保守取代可根据表3来制得。用于预测对蛋白质修饰的耐受性的方法可在文献中找到(Guo等人,2004，其内容以全文引用方式并入本文)。
表3：保守氨基酸取代的列表。
原始残基 保守取代(其他在本领域中已知)
Ala Ser,Gly,Cys
Arg Lys,Gln,His
Asn Gln,His,Glu,Asp
Asp Glu,Asn,Gln
Cys Ser,Met,Thr
Gln Asn,Lys,Glu,Asp,Arg
Glu Asp,Asn,Gln
Gly Pro,Ala,Ser
His Asn,Gln,Lys
Ile Leu,Val,Met,Ala
Leu Ile,Val,Met,Ala
Lys Arg,Gln,His
Met Leu,Ile,Val,Ala,Phe
Phe Met,Leu,Tyr,Trp,His
Ser Thr,Cys,Ala
Thr Ser,Val,Ala
Trp Tyr,Phe
Tyr Trp,Phe,His
Val Ile,Leu,Met,Ala,Thr
在另一方面中，保守取代可为表4中标题“保守取代”之下展示的彼等取代。若此类取代导致生物活性的变化，则表4中命名为“示范性取代”的更实质的变化可被引入并在需要时筛选产物。
表4：示范性氨基酸取代。
原始残基 示范性取代(其他在本领域中已知)
Ala Val,Leu,Ile
Arg Lys,Gln,Asn
Asn Gln,His,Asp,Lys,Arg
Asp Glu,Asn
Cys Ser,Ala
Gln Asn,Glu
Glu Asp,Gln
Gly Ala
His Asn,Gln,Lys,Arg
Ile Leu,Val,Met,Ala,Phe,Norleucin
Leu Norleucin,Ile,Val,Met,Ala,Phe
Lys Arg,Gln,Asn
Met Leu,Phe,Ile
Phe Leu,Val,Ile,Ala,Tyr
Pro Ala
Ser Thr
Thr Ser,Ala
Trp Tyr,Phe
Tyr Trp,Phe,Thr,Ser
Val Ile,Leu,Met,Phe,Ala,Norleucin
当然，此类取代可涉及不同于普遍的L-氨基酸的结构。因此，D-氨基酸可取代常见于本发明的抗原肽中的L-氨基酸，且仍藉由本文的揭示内容涵盖。另外，非标准氨基酸(亦即，不同于普遍天然存在的蛋白原氨基酸)亦可用于取代目的以产生根据本发明的免疫原及免疫多肽。
若发现一个以上的位置处的取代导致具有如下文所定义的实质上等效或更大的抗原活性的肽，则彼等取代的组合将受测试以决定组合取代是否导致对肽的抗原性的相加或协同效应。
主要由如本文指示的氨基酸序列组成的肽可使一或两个非锚定物氨基酸(参见下文关于锚定物模体的内容)互换，而在与非修饰肽比较时其结合至MHC分子I类或II类的能力无实质变化或不受负面影响。在另一实施例中，在主要由如本文指示的氨基酸序列组成的肽中，一或两个氨基酸可与其保守互换配偶体(参见下文)互换，而在与非修饰肽比较时其结合至MHC分子I类或II类的能力无实质变化或不受负面影响。
实质上不贡献于与T细胞受体相互作用的氨基酸残基可藉由用其他氨基酸置换来修饰，该其他氨基酸的并入实质上不影响T细胞反应性且不消除与相关MHC的结合。因此，在不管给定附带条件的情况下，本发明的肽可为任何肽(发明人借以该术语来包括寡肽或多肽)，其包括氨基酸序列或如所给出的其一部分或变异体。
较长(伸长)肽亦可为适合的。可能的是，虽然MHC I类抗原决定基的长度通常为8个氨基酸与12个氨基酸之间，但其藉由自包括实际抗原决定基的较长肽或蛋白质的肽加工来产生。较佳的是，侧接实际抗原决定基的残基为在加工期间实质上不影响暴露实际抗原决定基所必需的蛋白质水解分解的残基。
本发明的肽可藉由多达四个氨基酸来伸长，亦即，可将1、2、3或4个氨基酸以4:0与0:4之间的任何组合添加至任一端部。根据本发明的伸长的组合可见于表5中。
表5：本发明的肽伸长的组合
C末端 N末端
4 0
3 0或1
2 0或1或2
1 0或1或2或3
0 0或1或2或3或4
N末端 C末端
4 0
3 0或1
2 0或1或2
1 0或1或2或3
0 0或1或2或3或4
用于伸长/延伸的氨基酸可为蛋白质或任何其他氨基酸的原始序列的肽。伸长可用于增强肽的稳定性或可溶性。
因此，本发明的抗原决定基可与天然存在的肿瘤相关抗原决定基或肿瘤特异性抗原决定基一致，或可包括与参考肽相差不超过四个残基的抗原决定基，只要其具有实质上相同的抗原活性即可。
在一替代实施例中，肽在任一侧或两侧上藉由超过4个氨基酸伸长，较佳地达到多达30个氨基酸的总长度。此举可导致MHC II类结合肽。对MHC II类的结合可藉由本领域中所知的方法来测试。
因此，本发明提供MHC I类抗原决定基的肽及变异体，其中肽或变异体具有8个与100个之间，较佳地8个与30个之间，及最佳8个与12个之间，亦即8个、9个、10个、11个、12个氨基酸的总长度，在伸长II类结合肽的情况下，长度亦可为13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个氨基酸。
当然，根据本发明的肽或变异体将具有结合至MHC分子I类或II类的能力。肽或变异体对MHC复合物的结合可藉由本领域中所知的方法来测试。
较佳地，当针对经取代的肽测试对根据本发明的肽为特异性的T细胞时，经取代的肽相对于背景达成最大溶解增加的一半时的肽浓度不超过约1mM、较佳地不超过约1μM、更佳地不超过约1nM、及仍更佳地不超过约100pM、及最佳地不超过约10pM。亦较佳的是，经取代的肽由来自超过一个个体、至少两个个体、及更佳地三个个体的T细胞识别。
在本发明的一尤其较佳实施例中，肽由或主要由根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成。
“主要由......组成”将意指除根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113中任何者或其变异体的序列之外，根据本发明的肽含有另外的N末端和/或C末端定位的氨基酸伸展链，其未必形成起MHC分子的抗原决定基作用的肽的部分。
然而，该些伸展链对提供根据本发明的肽至细胞中的有效引入而言是重要的。在本发明的一个实施例中，肽为融合蛋白质的部分，该融合蛋白质包含例如来源于NCBI(GenBank登录号X00497)的HLA-DR抗原相关联不变链(p33，下文为“Ii”)的80个N末端氨基酸。在其他融合物中，本发明的肽可融合至如本文描述的抗体或其功能部分，尤其是融合至抗体的序列中，以便藉由该抗体特异地靶向，或例如融合至对如本文描述的树突细胞为特异性的抗体中。
另外，肽或变异体可经进一步修饰以改良稳定性和/或对MHC分子的结合以便引出更强的免疫反应。用于肽序列的此种最佳化的方法在本领域中为熟知的且包括例如引入逆向肽键或非肽键。
在逆向肽键中，氨基酸残基不藉由肽(-CO-NH-)键联来联接而是将肽键逆转。此类逆反拟肽物可使用本领域中所知的方法制得，例如诸如藉由Meziere及同事(Meziere等人,1997，其以引用方式并入本文)描述的彼等方法。此方法涉及制成伪肽，其含有涉及主链且不涉及侧链的定向的变化。他们证实对于MHC结合及T辅助细胞反应而言，该些伪肽是有用的。含有NH-CO键而非CO-NH肽键的逆反肽对蛋白质水解的抗性大得多(Meziere等人,1997)。
非肽键例如为-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、及-CH2SO-。US 4,897,445提供用于在多肽链中固相合成非肽键(-CH2-NH)的方法，其涉及藉由标准程序合成的多肽及藉由使胺基醛及氨基酸在NaCNBH3存在下反应而合成的非肽键。
包含上文描述的键的肽可用存在于其胺基和/或羧基末端处的另外的化学基团来合成，以增强肽的稳定性、生物利用率、和/或亲和力。例如，可将诸如苄氧羰基的疏水基、丹磺酰基、或第三丁氧基羰基添加至肽的胺基末端。同样地，可将乙酰基或9-茀基甲氧基-羰基置于肽的胺基末端处。另外，可将疏水基、第三丁氧基羰基、或酰胺基添加至肽的羧基末端。
另外，本发明的肽可经合成以改变其立体构型。例如，可使用肽的一或多个氨基酸残基的D-异构物而非常见的L-异构物。另外，本发明的肽的至少一个氨基酸残基可藉由熟知的非天然存在氨基酸残基之一取代。诸如该些取代的改变可用以增加本发明的肽的稳定性、生物利用率和/或结合作用。
类似地，本发明的肽或变异体可藉由在肽的合成之前或之后使特定氨基酸反应来化学修饰。此类修饰的实例在本领域中为熟知的(Lundblad,2004，其以引用方式并入本文)。氨基酸的化学修饰包括但不限于藉由以下各项的修饰：酰基化、脒基化、赖氨酸的吡哆醇化、还原性烷基化、胺基由2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)的三硝基苄基化、藉由将过氧甲酸氧化半胱氨酸至磺基丙氨酸达成的羧基的酰胺修饰及硫氢基修饰、形成汞剂衍生物、与其他硫醇化合物形成混合的二硫化物、与顺丁烯二酰亚胺的反应、用碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化及在碱性pH下用氰酸盐的胺基甲酰化，但不限于此等(Coligan等人,1995，其内容以全文引用方式并入本文)。
简言之，蛋白质中的例如精胺酰基残基的修饰常常是基于诸如苯基乙二醛、2,3-丁二酮、及1,2-环己二酮的邻近二羰基化合物的反应以形成加合物。另一实例是甲基乙二醛与精胺酰基残基的反应。半胱氨酸可经修饰而无其他诸如赖氨酸及组氨酸的亲核位点的伴随修饰。因此，大量试剂可用于半胱氨酸的修饰。诸如Sigma-Aldrich(www.sigma-aldrich.com)的公司的网站提供关于特定试剂的信息。
蛋白质中二硫键的选择性还原亦是普遍的。二硫键可在生物医药剂的热处理期间形成及氧化。Woodward的试剂K可用以修饰特定的谷氨酸残基。N-(3-(二甲基胺基)丙基)-N’-乙基碳化二亚胺可用于形成赖氨酸残基与谷氨酸残基的间的分子内交联。例如，焦碳酸二乙酯为用于修饰蛋白质中的组胺酰基残基的试剂。组氨酸亦可使用4-羟基-2-壬烯醛来修饰。赖氨酸残基及其他α-胺基的反应例如适用于将肽结合至表面或蛋白质/肽的交联。赖氨酸为聚(乙烯)二醇的连接位点及蛋白质的糖基化的主要修饰位点。蛋白质中的甲硫胺酸残基可用例如碘乙酰胺、溴乙基胺、及氯胺T来修饰。
四硝基甲烷及N-乙酰基咪唑可用于修饰酪氨酰基残基。经由形成二酪氨酸的交联可用过氧化氢/铜离子来完成。
对修饰色氨酸的近期研究已使用了N-溴琥珀酰亚胺、2-羟基-5-硝苄基溴化物或3-溴-3-甲基-2-(2-硝苯基巯基)-3H-吲哚(BPNS-粪臭素)。
用PEG成功地修饰治疗性蛋白质及肽常常与循环半衰期的延长相关联，而将蛋白质与戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯及甲醛交联用于制备水凝胶。用于免疫治疗的过敏原的化学修饰常常藉由用氰酸钾的氨基甲酰化来达成。
本发明的另一实施例涉及非天然存在的肽，其中该肽由或主要由根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成，且已作为医药学上可接受的盐合成地产生(例如合成)。合成地产生肽的方法在本领域中为熟知的。根据本发明的肽的盐实质上不同与在其体内状态下的肽，因为体内产生的肽没有盐。肽的非天然盐形式介导肽的可溶性，尤其在包含肽的医药组合物(例如，如本文揭示的肽疫苗)的情形中如此。需要肽的足够及至少实质的可溶性以便有效地将肽提供至待治疗的受试者。较佳地，盐为肽的医药学上可接受的盐。根据本发明的该些盐包括碱金属盐及碱土金属盐，诸如霍夫迈斯特离子序列的盐，该霍夫迈斯特离子序列包含阴离子PO4 3-、SO4 2-、CH3COO-、Cl-、Br-、NO3 -、ClO4-、I-、SCN-及阳离子NH4 +、Rb+、K+、Na+、Cs+、Li+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+及Ba2+。特定而言，盐选自(NH4)3PO4、(NH4)2HPO4、(NH4)H2PO4、(NH4)2SO4、NH4CH3COO、NH4Cl、NH4Br、NH4NO3、NH4CIO4、NH4I、NH4SCN、Rb3PO4、Rb2HPO4、RbH2PO4、Rb2SO4、Rb4CH3COO、Rb4Cl、Rb4Br、Rb4NO3、Rb4CIO4、Rb4I、Rb4SCN、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、K2SO4、KCH3COO、KCl、KBr、KNO3、KClO4、KI、KSCN、Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、Na2SO4、NaCH3COO、NaCl、NaBr、NaNO3、NaCIO4、NaI、NaSCN、ZnCI2 Cs3PO4、Cs2HPO4、CsH2PO4、Cs2SO4、CsCH3COO、CsCl、CsBr、CsNO3、CsCIO4、CsI、CsSCN、Li3PO4、Li2HPO4、LiH2PO4、Li2SO4、LiCH3COO、LiCl、LiBr、LiNO3、LiClO4、LiI、LiSCN、Cu2SO4、Mg3(PO4)2、Mg2HPO4、Mg(H2PO4)2、Mg2SO4、Mg(CH3COO)2、MgCl2、MgBr2、Mg(NO3)2、Mg(ClO4)2、MgI2、Mg(SCN)2、MnCl2、Ca3(PO4),、Ca2HPO4、Ca(H2PO4)2、CaSO4、Ca(CH3COO)2、CaCl2、CaBr2、Ca(NO3)2、Ca(ClO4)2、CaI2、Ca(SCN)2、Ba3(PO4)2、Ba2HPO4、Ba(H2PO4)2、BaSO4、Ba(CH3COO)2、BaCl2、BaBr2、Ba(NO3)2、Ba(ClO4)2、BaI2、及Ba(SCN)2。特定而言，较佳的为NH乙酸盐、MgCl2、KH2PO4、Na2SO4、KCl、NaCl、及CaCl2，诸如，例如，氯化物或乙酸盐(三氟乙酸盐)(例如Berge等人,1977，其内容以全文引用方式并入本文)。
通常，肽及变异体(至少在氨基酸残基之间含有肽键的彼等变异体)可藉由固相肽合成的Fmoc-聚酰胺模式来合成，如藉由Lukas等人(Lukas等人,1981，其内容以全文引用方式并入本文)及其中引用的参考文献所揭示。临时的N-胺基保护藉由9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)基团来提供。此高度碱不稳定的保护基的重复分解使用于N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶来进行。侧链功能性可作为以下形式来保护：其丁基醚(在丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸情况下)、丁酯(在谷氨酸及天冬氨酸情况下)、丁氧基羰基衍生物(在赖氨酸及组氨酸情况下)、三苯甲基衍生物(在半胱氨酸情况下)及4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基衍生物(在精氨酸情况下)。在麸酰胺酸或天冬酰胺酸为C末端残基的情况下，使用4,4'-二甲氧基二苯甲基来保护侧链酰胺基功能性。固相支撑物基于自三种单体二甲基丙烯酰胺(主链单体)、双丙烯酰基乙二胺(交联剂)及丙烯酰基肌胺酸甲酯(功能化剂)构成的聚二甲基-丙烯酰胺聚合物。所使用的肽至树脂可分解连接剂为酸不稳定的4-羟甲基-苯氧基乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物作为其预形成的对称酐衍生物来添加，例外的是天冬酰胺酸及谷酰胺酸，其使用逆向N,N-二环己基-碳化二亚胺/1羟基苯并三唑介导的偶合程序来添加。所有偶合及去保护反应使用茚三酮、三硝基苯磺酸或异搏定(isotin)测试程序来监视。在完成合成之后，将肽自树脂支撑物分解并藉由用含有50％净化剂混合物的95％三氟乙酸进行处理来伴随地移除侧链保护基。常用的净化剂包括乙二硫醇、苯酚、大茴香醚及水，确切的选择取决于所合成的肽的构成氨基酸。此外，用于合成肽的固相及液相方法的组合是可能的(参见例如Bruckdorfer等人,2004及其中引用的参考文献，其内容以全文引用方式并入本文)。
三氟乙酸藉由在真空中蒸发来移除，后续用二乙醚研磨以得到粗肽。存在的任何净化剂藉由简单的萃取程序来移除，接着水相的冷冻干燥得到不含净化剂的粗肽。用于肽合成的试剂通常可购自例如Calbiochem-Novabiochem(诺丁汉,英国)。
纯化可藉由任何一种技术或技术的组合来执行，诸如再结晶、粒径排阻层析、离子交换层析、疏水性相互作用层析及(通常)使用例如乙腈/水梯度分离的逆相高效液相层析。
肽的分析可使用以下各项来进行：薄层层析、电泳、尤其是毛细管电泳、固相萃取(solid phase extraction；CSPE)、逆相高效液相层析、酸水解之后的氨基酸分析及快速原子轰击(fast atom bombardment；FAB)质谱分析，以及MALDI及ESI-Q-TOF质谱分析。
为选择过度提呈的肽，计算提呈分布，其展示中值样品提呈以及复制物变异。该分布将所关注肿瘤实体的样品与正常组织样品的基线并置。可随后藉由计算线性混合效应模型的p-值(Pinheiro等人,2015)，藉由伪发现率(Benjamini及Hochberg,1995，其内容以全文引用方式并入本文)对多个测试进行调整来将该些分布中的每一个合并成过度提呈记分。
对于藉由质谱分析法鉴别及相对定量HLA配位体而言，将来自震动-冻结组织样品的HLA分子纯化且分离HLA相关联肽。将经分离的肽分离，且藉由线上奈米电喷洒-离子化(nano-electrospray-ionization；nanoESI)液相层析-质谱分析法(liquidchromatography-mass spectrometry；LC-MS)实验来鉴别序列。藉由将自急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌样品记录的天然肿瘤相关联肽(natural tumor-associated peptide；TUMAP)的断裂模式与一致序列的相应合成参考肽的断裂模式比较来验证所得的肽序列。因为肽直接鉴别为原发肿瘤的HLA分子的配位体，所以该些结果提供针对自急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌获得的原发癌组织上的经鉴别肽的天然加工及提呈的直接证据(参考实例1，第3A图至第3D图)。
相较于若干不同的非癌性组织及器官，探索管线v2.1允许基于直接相对定量癌症组织上的HLA限制肽水平来鉴别及选择为用于免疫治疗的潜在标靶的相关过度提呈的肽。参见例如美国专利申请公开案第2013/0096016号，其内容以全文引用方式并入本文。此举藉由开发无标记差分定量，使用藉由专属资料分析管线处理的所获取LC-MS资料，将用于序列鉴别、光谱丛集化、离子计算、滞留时间校准、电荷状态反折积及正规化的演算法组合来达成。
将来自公共资源(Olexiouk等人,2016；Subramanian等人,2011，其内容以全文引用方式并入本文)的另外的序列信息整合至探索管线中以赋能鉴别来自非典型起源的TUMAP。建立针对每一肽及样品的包括误差估计的提呈水平。已鉴别出相对非癌性组织及器官专门提呈于肿瘤组织上的肽及在肿瘤中过度提呈的肽。
将来自急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌组织样品的HLA-肽复合物纯化且藉由LC-MS分离并分析HLA相关联肽(参见实例1)。本申请案中含有的所有TUMAP皆利用此方法在急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌样品上鉴别，从而确认其在急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、及其组合上的提呈。
使用无标记LC-MS资料的离子计数来定量在多个急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌以及正常组织上鉴别的TUMAP。方法假定肽的LC-MS信号区域与其在样品中的丰度相关。基于集中趋势来正规化各种LC-MS实验中的肽的所有定量信号，根据样品取平均值且将其合并成柱状图，此称作提呈分布。提呈分布合并了如同蛋白质资料库搜索、光谱丛集化、电荷状态反折积(去电荷)及滞留时间校准及正规化的不同分析方法。
除肽的过度提呈之外，测试隐伏基因的mRNA表达。mRNA资料经由正常组织及癌症组织的RNASeq分析来获得(参见实例2、第4A图至第4D图)。正常组织资料的另外来源为来自约3000个正常组织样品的公共可用RNA表达资料的资料库(Lonsdale,2013，其内容以全文引用方式并入本文)。本发明中较佳地包括来源于其编码mRNA高度表达于癌症组织中但在极重要正常组织中表达极低或不存在的蛋白质的肽。
本发明提供肽，其适用于治疗过度或专门提呈本发明的肽的癌症/肿瘤，较佳地急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌。该些肽藉由质谱分析法展示为藉由原发性人类急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌样品上的HLA分子天然提呈。
肽所来源于的许多来源基因/蛋白质(亦称为“全长蛋白质”或“基本蛋白质”经证实相较于正常组织而言在癌症中高度地过度表达—关于本发明的“正常组织”将意指健康血液、脑、心脏、肝、肺、脂肪组织、肾上腺、胆管、膀胱、骨、骨髓、食管、眼睛、胆囊、头及颈、大肠、小肠、肾、淋巴结、中枢神经、周边神经、胰腺、副甲状腺、腹膜、垂体、胸膜、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、甲状腺、气管、及输尿管细胞或其他正常组织细胞，诸如乳房、卵巢、胎盘、前列腺、睾丸、胸腺、子宫，其皆证明来源基因的高度肿瘤关联(参见，实例2)。此外，肽自身强烈地过度提呈在肿瘤组织上但非正常组织上—关于本发明的“肿瘤组织”将意指来自罹患以下各项的患者的样品：急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌(参见实例1)。
HLA结合肽可藉由免疫系统、具体而言T淋巴细胞识别。T细胞可破坏提呈所鉴别HLA-肽复合物的细胞，例如提呈衍生肽的急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌细胞。
相较于正常组织，本发明的肽过度提呈在癌症组织中且因此可用于产生根据本发明的抗体和/或TCR，诸如可溶TCR(参见表10)。此外，肽在与相应MHC复合时可亦用于产生根据本发明的抗体和/或TCR，尤其可溶TCR。相应方法是熟练技艺人士所熟知的且亦可见于相应文献中(参见下文)。因此，本发明的肽适用于在患者中产生免疫反应，借以可破坏肿瘤细胞。患者中的免疫反应可藉由向患者直接给药所描述肽或适合前驱物物质(例如编码该些肽的伸长肽、蛋白质、或核酸)来诱导，理想地与增强免疫原性的药剂(亦即，佐剂)组合给药来诱导。起源于此类治疗性疫苗接种的免疫反应可预期对肿瘤细胞为高度特异性的，因为本发明的标靶肽不会以可比较量提呈在正常组织上，从而防止针对患者内的正常细胞的非所要自体免疫反应的风险。
本说明书进一步涉及包含α链及β链的TCR(“α/βTCR”)。亦提供根据本发明的肽，其能够在藉由MHC分子提呈时结合至TCR及抗体。
本说明书亦涉及根据本发明的TCR的片段，其能够在藉由HLA分子提呈时结合至根据本发明的肽抗原。该术语尤其涉及可溶TCR片段，例如缺失跨膜部分和/或恒定区的TCR、单链TCR、及其例如与免疫球蛋白的融合物。
本说明书亦涉及表达本说明书的TCR及肽的核酸、载体及寄主细胞；及其使用方法。
术语“T细胞受体”(缩写为TCR)是指包含α多肽链(α链)及β多肽链(β链)的异源二聚分子，其中异源二聚受体能够结合至藉由HLA分子提呈的肽抗原。术语亦包括所谓的γ/δTCR。
在一个实施例中，本说明书提供产生如本文描述的TCR的方法，该方法包含在适于促进TCR的表达的条件下培养能够表达TCR的寄主细胞。
在另一方面中，本说明书涉及根据本说明书的方法，其中藉由将足够量的抗原与抗原提呈细胞接触来将抗原载入至适合的抗原提呈细胞或人工抗原提呈细胞的表面上表达的I类或II类MHC分子，或藉由将抗原/I类或II类MHC复合物单体四聚来将抗原载入至I类或II类MHC四聚物上。
通常认为α/βTCR的α及β链及γ/δTCR的γ及δ链各自具有两个“域”，亦即可变域及恒定域。可变域由可变区(V)及联接区(J)的序连(concatenation)组成。可变域亦可包括前导区(L)。β及δ链亦可包括多样性区(D)。α及β恒定域亦可包括C末端跨膜(transmembrane；TM)域，其将α及β链锚定至细胞膜。
关于γ/δTCR，如本文所使用的术语“TCRγ可变域”是指不具有前导区(L)的TCRγV(TRGV)区及TCRγJ(TRGJ)区的序连，且术语TCRγ恒定域是指细胞外TRGC区，或C末端截断TRGC序列。同样地，术语“TCRδ可变域”是指不具有前导区(L)的TCRδV(TRDV)区及TCRδD/J(TRDD/TRDJ)区的序连，且术语“TCRδ恒定域”是指细胞外TRDC区，或C末端截断TRDC序列。
本说明书的α/β异源二聚TCR可具有在其恒定域之间引入的二硫键。此类型的较佳TCR包括具有TRAC恒定域序列及TRBC1或TRBC2恒定域序列的彼等TCR，只不过TRAC的Thr 48及TRBC1或TRBC2的Ser 57藉由半胱氨酸残基置换，该半胱氨酸在TCR的TRAC恒定域序列与TRBC1或TRBC2恒定域序列之间形成二硫键。
在具有或不具有上述所引入的链内键的情况下，本说明书的α/β异源二聚TCR可具有TRAC恒定域序列及TRBC1或TRBC2恒定域序列，且TCR的TRAC恒定域序列及TRBC1或TRBC2恒定域序列可藉由在TRAC的外显子2的Cys4与TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的初始二硫键连接。
本说明书的TCR可包含选自由放射性核种、萤光团及生物素组成的群组的可检测标记。本说明书的TCR可接合至治疗活化剂，诸如放射性核种、化学治疗剂、或毒素。
可检测标记
可检测标记可例如萤光染料、酶、底物、生物发光物质、放射性物质、及化学发光标记。示范性酶标记包括但不限于山葵过氧化酶、乙酰胆碱酶、碱性磷酸酶、b-半乳糖苷酶及萤光素酶。示范性萤光团(萤光物质)包括但不限于玫瑰红、萤光素、萤光异硫氰酸盐、伞形酮、二氯三嗪基胺、藻红素及丹磺酰氯。示范性化学发光标记包括但不限于发光胺。示范性生物发光物质包括但不限于萤光素及水母发光蛋白。示范性放射性物质包括但不限于铋-213(213Bs)、碳-14(14C)、碳-11(11C)、氯-18(18Cl)、铬-51(51Cr)、钴-57(57Co)、钴-60(60Co)、铜-64(64Cu)、铜-67(67Cu)、镝-165(165Dy)、铒-169(169Er)、氟-18(18F)、镓-67(67Ga)、镓-68(68Ga)、锗-68(68Ge)、鈥-166(166Ho)、铟-111(111In)、碘-123(123I)、碘-124(124I)、碘-125(125I)、碘-131(131I)、铱-192(192Ir)、铁-59(59Fe)、氪-81(81Kr)、铅-212(212Pb)、镏-177(177Lu)、钼-99(99Mo)、氮-13(13N)、氧-15(15O)、钯-103(103Pd)、磷-32(32P)、钾-42(42K)、铼-186(186Re)、铼-188(188Re)、铷-81(81Rb)、铷-82(82Rb)、钐-153(153Sm)、硒-75(75Se)、钠-24(24Na)、锶-82(82Sr)、锶-89(89Sr)、硫35(35S)、鎝-99m(99Tc)、铊-201(201Tl)、氚(3H)、氙-133(133Xe)、镱-169(169Yb)、镱-177(177Yb)、及钇-90(90Y)。
放射性核种
放射性核种发射α或β粒子(例如放射性免疫接合物)。此类放射性同位素包括但不限于：β发射体，诸如磷-32(32P)、钪-47(47Sc)、铜-67(67Cu)、镓-67(67Ga)、钇-88(88Y)、钇-90(90Y)、碘-125(125I)、碘-131(131I)、钐-153(153Sm)、镏-177(177Lu)、铼-186(186Re)、铼-188(188Re)；及α发射体，诸如砹-211(211At)、铅-212(212Pb)、铋-212(212Bi)、铋-213(213Bi)或锕-225(225Ac)。
毒素
毒素包括但不限于甲氨蝶呤、氨基蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪；烷基化剂，诸如甲基二(氯乙基)胺、噻替哌氮芥苯丁酸、美法仑、双氯乙基亚硝脲(BSNU)、丝裂霉素C、洛莫司汀(CCNU)、1-甲基亚硝基脲、环磷酰胺、甲基二(氯乙基)胺、白消安、二溴甘露醇、链佐霉素、丝裂霉素C、顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂及卡铂(paraplatin)；蒽环类包括道诺霉素(以前称为柔红霉素)、阿霉素(阿德力霉素)、地托比星、洋红霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌及比生群；抗生素包括放线菌素(放线菌霉素D)、博莱霉素、卡奇霉素、光辉霉素、及蒽霉素(AMC)；及抗分裂剂，诸如长春花属生物碱类、长春新碱及长春花碱。其他细胞毒性剂包括紫杉醇蓖麻毒蛋白、假单胞菌属外毒素、吉西他滨、细胞迟缓素B、短杆菌素D、溴化乙锭、吐根素、依托泊苷、替尼泊苷、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮、1-脱氢睪固酮、葡萄糖皮质素、普鲁卡因、四卡因、利多卡因、心得安、嘌霉素、丙卡巴肼、羟基脲、天门冬素酶、皮质类固醇、米托坦(O,P'-(DDD))、干扰素、及该些细胞毒性剂的混合物。
治疗剂包括但不限于卡铂、顺铂、紫杉醇、吉西他滨、卡奇霉素、阿霉素、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、放线菌霉素D、环磷酰胺、长春新碱、博莱霉素、VEGF拮抗剂、EGFR拮抗剂、铂类、紫杉酚、伊立替康、5-氟尿嘧啶、健择他滨、亚叶酸、类固醇、环磷酰胺、美法仑、长春花属生物碱类、氮芥、酪氨酸激酶抑制剂、放射治疗、性激素拮抗剂、选择性雄性素受体调节剂、选择性雌性素受体调节剂、PDGF拮抗剂、TNF拮抗剂、IL-1拮抗剂、介白素(例如IL-12或IL-2)、IL-12R拮抗剂、毒素接合的单株抗体、肿瘤抗原特异性单株抗体、帕妥珠单抗、抗CD20抗体、Rituxan、RTM、奥克雷珠单抗、奥法木单抗、DXL625、/>或其任何组合。来自植物及细菌的诸如蓖麻毒蛋白、白喉毒素及假单胞菌属毒素的毒性酶可用以产生细胞类型特异性杀伤试剂(Youle等人,1980，Gilliland等人,1980，Krolick等人,1980)。其他细胞毒性剂包括细胞毒性核糖核酸酶(参见美国专利第6,653,104号，每一参考文献的内容以全文引用方式并入本文)。
在一实施例中，本说明书的在α链中具有至少一个突变和/或在β链中具有至少一个突变的TCR相较于未突变TCR具有经修饰的糖基化。
在一实施例中，在TCRα链和/或TCRβ链中包含至少一个突变的TCR具有对肽-HLA分子复合物的结合亲和力和/或结合半衰期，其为包含未突变TCRα链和/或未突变TCRβ链的TCR的结合亲和力和/或结合半衰期的至少两倍。肿瘤特异性TCR及其开发物的亲和力增强依赖于存在最佳TCR亲和力窗。此窗口的存在基于以下观察结果：当相较于对例如HLA-A*02-限制的肿瘤相关联自身抗原为特异性的TCR时，对例如HLA-A*02-限制的病原体为特异性的TCR具有通常低约10倍的Kd值。虽然肿瘤抗原具有为免疫性的潜力，但现在已知的是，因为肿瘤由个体自身的细胞产生，所以仅突变蛋白质或利用经改变的转译加工的蛋白质将由免疫系统视为外来的。经上调或过度表达的抗原(所谓自身抗原)将不必诱导针对肿瘤的功能免疫反应：表达对该些抗原为高度反应性的TCR的T细胞将在称为中心耐受性(centraltolerance)的过程中在胸腺内阴性地选择，意指仅保留对自身抗原具有低亲和力TCR的T细胞。因此，本说明书的TCR或变异体对肽的亲和力可藉由本领域中熟知的方法来增强。
本说明书进一步涉及鉴别及分离根据本说明书的TCR的方法，该方法包含用来自健康供体的对相应HLA等位基因为阴性的PBMC孵育HLA-肽单体，用四聚物-藻红素(phycoerythrin；PE)孵育PBMC，及藉由萤光活化细胞分选(fluorescence activated cellsorting；FACS)Calibur分析分离高结合力T细胞。
本说明书进一步涉及鉴别及分离根据本说明书的TCR的方法，该方法包含获得具有全部人类TCRαβ基因座(1.1及0.7Mb)的基因转殖小鼠，其T细胞表达补偿小鼠TCR缺陷的多样性人类TCR免疫图谱，用肽使小鼠免疫，用四聚物-藻红素(PE)孵育自基因转殖小鼠获得的PBMC，及藉由萤光活化细胞分选(FACS)Calibur分析分离高结合力T细胞。
在一个方面中，为获得表达本说明书的TCR的T细胞，将编码本说明书的TCR-α和/或TCR-β链的核酸选殖至诸如γ反转录病毒或慢病毒的表达载体中。产生重组病毒且随后测试其功能性，诸如抗原特异性及功能结合力。随后将最终产物的等分试样用于转导标靶T细胞群体(通常自患者PBMC纯化)，使其在输注至患者中之前扩增。
在另一方面中，为获得表达本说明书的TCR的T细胞，藉由本领域中所知的例如体外转录系统的技术合成TCR RNA。随后藉由电穿孔将体外合成的TCR RNA引入自健康供体获得的初代CD8阳性T细胞中，以重新表达肿瘤特异性TCR-α和/或TCR-β链。
为增加表达，可将编码本说明书的TCR的核酸可操作地连接至强的启动子，诸如反转录病毒末端长重复序列(long terminal repeat；LTR)、巨细胞病毒(cytomegalovirus；CMV)、鼠类干细胞病毒(murine stem cell virus；MSCV)U3、磷酸甘油酯激酶(phosphoglycerate kinase；PGK)、β-肌动蛋白、泛蛋白、及猴病毒40(SV40)/CD4复合启动子、伸长因子(elongation factor；EF)-1a及脾灶形成病毒(spleen focus-formingvirus；SFFV)启动子。在一较佳实施例中，启动子对所表达的核酸而言为异源的。
除强的启动子之外，本说明书的TCR表达卡匣可含有可增强转殖基因表达的另外元件，包括促进慢病毒构建体的核易位的中央多聚嘌呤区(central polypurine tract；cPPT)(Follenzi等人,2000)，及藉由增加RNA稳定性来增加转殖基因表达的水平的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(woodchuck hepatitis virus post-transcriptionalregulatory element；wPRE)(Zufferey等人,1999，其内容以全文引用方式并入本文)。
本发明的TCR的α及β链可藉由位于单独载体中的核酸编码，或可藉由位于同一载体中的多核苷酸编码。
达成高水平TCR表面表达需要所引入TCR的TCR-α及TCR-β链以高水平转录。为达成此举，可将本说明书的TCR-α及TCR-β链选殖至单一载体的双顺反构建体中，该单一载体已被证实能够克服此障碍。在TCR-α链与TCR-β链之间使用病毒内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site；IRES)产生两个链的协同表达，因为TCR-α链及TCR-β链自单一转录物产生，该单一转录物在转译期间分成两个蛋白质，从而保证产生等摩尔比率的TCR-α链及TCR-β链(Schmitt等人,2009，其内容以全文引用方式并入本文)。
编码本说明书的TCR的核酸可经密码子最佳化以增加自寄主细胞的表达。遗传码的冗余性允许一些氨基酸藉由超过一种密码子编码，但某些密码子由于匹配tRNA的相对可用性以及其他因素而相比其他密码子为次“最佳的”(Gustafsson等人,2004)。修饰TCR-α及TCR-β基因序列以使得每一氨基酸藉由用于哺乳动物基因表达的最佳密码子编码，以及消除mRNA不稳定性模体或隐藏剪接位点已被证实显著地增强TCR-α及TCR-β基因表达(Scholten等人,2006，该些参考文献的内容以全文引用方式并入本文)。
此外，所引入TCR链与内生性TCR链之间的错误配对可导致特异性的获取，其为自体免疫性带来显著风险。例如，混合TCR二聚物的形成可减少可用于形成适当配对TCR复合物的CD3分子的数目，且因此可显著地减小表达所引入TCR的细胞的功能结合力(Kuball等人,2007，其内容以全文引用方式并入本文)。
为减少错误配对，本说明书的所引入TCR链的C末端域可经修饰以便促进链间亲和力，同时减小所引入链与内生性TCR配对的能力。该些策略可包括用鼠类对应物(鼠源化C末端域)置换人类TCR-α及TCR-βC末端域；藉由将第二半胱氨酸残基引入所引入TCR的TCR-α链及TCR-β链两者中在C末端域中产生第二链间二硫键(半胱氨酸修饰)；调换TCR-α及TCR-β链C末端域中的相互作用残基(“杵-进-臼(knob-in-hole)”；及将TCR-α链及TCR-β链的可变域直接融合至CD3ζ(CD3ζ融合物)(Schmitt等人,2009)。
在一实施例中，寄主细胞经工程改造以表达本说明书的TCR。在较佳实施例中，寄主细胞为人类T细胞或T细胞前驱细胞。在一些实施例中，T细胞或T细胞前驱细胞自癌症患者获得。在其他实施例中，T细胞或T细胞前驱细胞自健康供体获得。关于待治疗的患者，本说明书的寄主细胞可为同种异体或自体的。在一个实施例中，寄主为经转变以表达α/βTCR的γ/δT细胞。
“医药组合物”为适于在医学环境中给药至人类的组合物。较佳地，医药组合物为无菌的且根据GMP准则来产生。
医药组合物包含呈游离形式或呈医药学上可接受的盐形式的肽(参见上文)。如本文所使用，“医药学上可接受的盐”是指所揭示肽的衍生物，其中肽藉由制成试剂的酸式或碱式盐来修饰。例如，酸式盐自游离碱(典型地其中药物的中性形式具有中性-NH2基团)制备，涉及与适合酸的反应。用于制备酸式盐的适合酸包括：有机酸，例如，乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、及类似物；以及无机酸，例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、及类似物。相反地，可存在于肽上的酸部分的碱式盐的制备使用诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺或类似物的医药学上可接受的碱来制备。
在一尤其较佳实施例中，医药组合物包含作为乙酸的盐(乙酸盐)、三氟乙酸盐或盐酸的盐(氯化物)的肽。
较佳地，本发明的药剂为诸如疫苗的免疫治疗剂。该药剂可直接给药至患者中，给药至受影响器官中，或全身性静脉内(i.v.)、皮肤下(s.c.)、真皮内(i.d.)、腹膜内(i.p.)、肌肉内(i.m.)给药或离体施加至来源于患者或人类细胞系的细胞，随后将其给药至患者，或体外用于选择来源于患者的免疫细胞的亚群，随后再给药至患者。若核酸体外给药至细胞，则其可适用于待转染的细胞以便共同表达免疫刺激细胞介素，诸如介白素-2。肽可实质上为纯的或与免疫刺激佐剂(参见下文)组合或使用与免疫刺激细胞介素的组合，或用例如脂质体的适合递送系统给药。肽亦可接合至适合载体，诸如匙孔贝血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin；KLH)或甘露聚糖(参见WO 95/18145及Longenecker等人,1993，两者皆以全文引用方式并入本文)。肽亦可经标记，可为融合蛋白质，或可为杂合分子。预期其序列在本发明中给出的肽刺激CD4或CD8T细胞。然而，CD8 T细胞的刺激在藉由CD4 T辅助细胞提供的帮助存在下为更有效的。因此，对于刺激CD8T细胞的MHC I类抗原决定基而言，杂合分子的融合配偶体或切片适合提供刺激CD4阳性T细胞的抗原决定基。CD4及CD8刺激抗原决定基在本领域中为熟知的且包括本发明中所鉴别的彼等抗原决定基。
在一个方面中，疫苗包含具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113列明的氨基酸序列的至少一个肽，及至少一个另外的肽，较佳地两个至50个、更佳地两个至25个、甚至更佳地两个至20个及最佳地两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个或十八个肽。肽可来源于一或多个特异性TAA且可结合至MHC I类分子。
本发明的另一方面提供编码本发明的肽或肽变异体的核酸(例如多核苷酸)。多核苷酸可例如为DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合，其为单链和/或双链的，或为多核苷酸(诸如，例如，具有硫代磷酸酯主链的多核苷酸)的初始或稳定化形式，且其可含有或可不含有内含子，只要其编码肽即可。当然，仅含有藉由天然存在肽键联接的天然存在氨基酸残基的肽可藉由多核苷酸编码。本发明的又一方面提供能够表达根据本发明的多肽的表达载体。
已开发各种方法来将多核苷酸、尤其DNA连接至载体，例如经由互补黏性末端来连接。例如，可将互补均聚物区添加至待插入载体DNA中的DNA区段。载体及DNA区段随后藉由互补均聚物尾部之间的氢键合来联接以形成重组DNA分子。
含有一或多个限制位点的合成连接子提供将DNA区段联接至载体的替代方法。含有各种限制内切酶的合成连接子可商购自大量来源，包括InternationalBiotechnologies Inc.New Haven,CN,USA。
修饰编码本发明的多肽的DNA的合需方法使用如藉由Saiki等人揭示的聚合酶链反应(Saiki等人,1988，其内容以全文引用方式并入本文)。此方法可用于例如藉由在适合限制位点中的工程改造来将DNA引入适合载体中，或可用于以如本领域中所知的其他有用方式来修饰DNA。若使用病毒载体，则痘病毒或腺病毒载体是较佳的。
DNA(或在反转录病毒载体的情况下，RNA)可随后在适合寄主中表达以产生包含本发明的肽或变异体的多肽。因此，编码本发明的肽或变异体的DNA可根据已知技术来使用，鉴于本文含有的教示内容来适当地修饰，以构筑表达载体，随后将表达载体用于转变适当的寄主细胞以用于表达及产生本发明的多肽。此类技术包括例如US 4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075、及4,810,648中披露的技术，其每一者的内容以全文引用方式并入本文。
编码构成本发明的化合物的多肽的DNA(或在反转录病毒载体的情况下，RNA)可联接至多种其他DNA序列以用于引入至适当寄主中。伴生DNA将取决于寄主的特性、将DNA引入寄主中的方式、及是否需要游离基因体维持或整合。
通常，以用于表达的适当定向及正确阅读框架将DNA插入诸如质粒的表达载体中。必要时，DNA可连接至由所要寄主识别的适当的转录及转译调节控制核苷酸序列，尽管此类控制序列普遍可用于表达载体中。随后经由标准技术将载体引入寄主中。通常，并非所有寄主将藉由载体转变。因此，将必需针对所转变寄主细胞进行选择。一种选择技术涉及利用任何必需的控制元件将DNA序列并入表达载体中，该控制元件编码经转变细胞中的可选择特质，诸如抗生素抵抗性。
替代地，用于此类可选择特质的基因可在另一载体上，该载体与所要寄主细胞共同转变。
随后鉴于本文揭示的教室内容将已藉由本发明的重组DNA转变的寄主细胞在熟习此项技术者所知的适当条件下培养足够时间，以允许多肽的表达，可随后将多肽回收。
许多表达系统是已知的，包括细菌(例如大肠杆菌(E.coli)及枯草杆菌(Bacillussubtilis))、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、丝状真菌(例如麴菌属(Aspergillus spec.))、植物细胞、动物细胞及昆虫细胞。较佳地，系统可为可购自ATCCCell Biology Collection的诸如CHO细胞的哺乳动物细胞。
用于组成型表达的典型哺乳动物细胞载体质粒包含具有适合polyA尾部及抗性标志(诸如新霉素)的CMV或SV40启动子。一个实例为可购自Pharmacia,Piscataway,美国新泽西州的pSVL。可诱导哺乳动物表达载体的实例为pMSG，亦可购自Pharmacia。有用的酵母质体载体为pRS403-406及pRS413-416且通常可购自Stratagene Cloning Systems,LaJolla,加州92037,美国。质粒pRS403、pRS404、pRS405及pRS406为酵母整合质粒(YIps)且整合了酵母可选择标志HIS3、TRP1、LEU2及URA3。质粒pRS413-416为酵母中节质粒(YeastCentromere plasmid；Ycp)。基于CMV启动子的载体(例如来自Sigma-Aldrich)提供FLAG、3xFLAG、c-myc或MAT的各种组合中的短暂或稳定表达、胞质表达或分泌、及N末端或C末端标记。该些融合蛋白质允许检测、纯化及分析重组蛋白质。双重标记的融合物提供检测灵活性。
强的人类巨细胞病毒(CMV)启动子调节区驱使在COS细胞中高达1mg/L的构成蛋白质表达水平。对于较小强度细胞系，蛋白质水平典型地为约0.1mg/L。SV40复制起点的存在将导致在允许SV40复制的COS细胞中的高水平DNA复制。CMV载体例如可含有用于在细菌细胞中复制的pMB1(pBR322的衍生物)起点、用于细菌中的安比西林抗性选择的b-内酰胺酶、hGH polyA、及f1起点。含有前原胰蛋白酶(pre-pro-trypsin；PPT)前导序列的载体可导引FLAG融合蛋白质分泌至培养基中以用于使用ANTI-FLAG抗体、树脂、及培养板纯化。其他载体及表达系统在本领域中熟知为与各种寄主细胞一起使用。
在另一实施例中，本发明的两种或更多种肽或肽变异体以连续次序编码及因此表达(类似于“串珠”构建体)。为进行此举，肽或肽变异体可藉由连接子氨基酸的伸展链(例如实例LLLLLL(SEQ ID NO:229))来连接或融合在一起，或可在肽或肽变异体之间不使用任何另外的肽的情况下连接。该些构建体亦可用于癌症治疗且可诱导涉及MHC I及MHC II两者的免疫反应。
本发明亦涉及用本发明的多核苷酸载体构建体转变的寄主细胞。寄主细胞可为原核或真核的。在一些情况下细菌细胞可较佳为原核寄主细胞且典型地为大肠杆菌的菌株，例如，可购自Bethesda Research Laboratories Inc.,Bethesda,马里兰州,美国的大肠杆菌菌株DH5，及可购自Rockville,马里兰州,美国的典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection；ATCC)的RR1(编号ATCC 31343)。较佳真核寄主细胞包括酵母、昆虫及哺乳动物哺乳动物细胞，较佳地脊椎动物细胞，诸如来自小鼠、大鼠、猴或人类纤维母细胞及结肠细胞系。酵母寄主细胞包括YPH499、YPH500及YPH501，其通常可购自StratageneCloning Systems,La Jolla,加州92037,美国。较佳哺乳动物寄主细胞包括可以购自ATCC的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞(编号CCL61)、可以购自ATCC的NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3(编号CRL 1658)、可以购自ATCC的猴肾来源的COS-1细胞(编号CRL1650)及为人类胚肾细胞的293细胞。较佳昆虫细胞为Sf9细胞，其可用杆状病毒表达载体转染。关于选择用于表达的适合寄主细胞的概述可见于文献中(Balbás及Lorence,2004)。
用本发明的DNA构建体转变适当细胞寄主藉由熟知方法完成，该方法典型地取决于所使用的载体类型。关于原核寄主细胞的转变，参见例如Cohen等人或Green及Sambrook(Cohen等人,1972；Green及Sambrook,2012)。酵母细胞的转变描述于Sherman等人(Sherman等人,1986)中。Beggs的方法(Beggs,1978)亦是有用的。关于脊椎动物细胞，适用于转染此类细胞的试剂，例如磷酸钙及DEAE-聚葡糖或脂质体制剂可购自Stratagene CloningSystems，或Life Technologies Inc.,Gaithersburg,马里兰州20877,美国。电穿孔亦适用于转变和/或转染细胞且在本领域中熟知用于转变酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞及脊椎动物细胞。该些参考文献中的每一者的内容以全文引用方式并入本文。
可藉由诸如PCR的熟知技术来鉴别成功转变的细胞，亦即，含有本发明的DNA构建体的细胞。替代地，可使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。
将了解本发明的某些寄主细胞(例如细菌、酵母及昆虫细胞)适用于制备本发明的肽。然而，其他寄主细胞可适用于某些治疗性方法。例如，诸如树突细胞的抗原提呈细胞可适用于表达本发明的肽以使得其可载入至适当MHC分子。因此，本发明提供包含根据本发明的核酸或表达载体的寄主细胞。
在一较佳实施例中，寄主细胞为抗原提呈细胞，尤其树突细胞或抗原提呈细胞。载有含有前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase；PAP)的重组融合蛋白质的APC由美国食品药物管理局(Food and Drug Administration；FDA)于2010年4月29日批准用于治疗无征状或症状最少的新陈代谢HRPC(Sipuleucel-T)(Rini等人,2006；Small等人,2006，其内容以全文引用方式并入本文)。
本发明的另一方面提供产生肽或其变异体的方法，该方法包含培养寄主细胞且将肽自寄主细胞或其培养基分离。
在另一实施例中，本发明的肽、核酸或表达载体用于药物。例如，肽或其变异体可制备用于i.v.、s.c.、i.d.、i.p.、i.m.注射。肽注射的较佳方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.、及i.v。DNA注射的较佳方法包括i.d.、i.m.、s.c.、i.p.及i.v。可给与例如剂量在50μg与1.5mg之间、较佳地为125μg至500μg的肽或DNA且该剂量将取决于相应的肽或DNA。此范围的剂量成功地用于先前试验(Walter等人,2012)。
用于活性疫苗接种的多核苷酸可实质上为纯或含在适合载体或递送系统中。核酸可为DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合。用于设计及引入此类核酸的方法在本领域中为熟知的。概述藉由Teufel等人(Teufel等人,2005，其内容以全文引用方式并入本文)提供。多核苷酸疫苗易于制备，但并未完全理解该些载体在诱导免疫反应中的作用模式。适合载体及递送系统包括病毒DNA和/或RNA，诸如基于腺病毒、痘疮病毒、反转录病毒、疱疹病毒、腺病毒相关病毒或含有超过一种病毒的元件的杂合体的系统。非病毒递送系统包括阳离子脂质及阳离子聚合物且在DNA递送技术中为熟知的。亦可使用诸如经由“基因枪”的物理递送。藉由核酸编码的一或多种肽可为融合蛋白质，例如具有如上文所述刺激相应相反CDR的T细胞的抗原决定基。
本发明的药剂亦可包括一或多种佐剂。佐剂为非特异性地增强或加强免疫反应，例如藉由CD8阳性T细胞及辅助T(TH)细胞介导的对抗原的免疫反应的物质，且因此该佐剂是考虑为适用于本发明的药剂。
适合佐剂包括但不限于1018ISS、铝盐、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或来源于鞭毛蛋白的TLR5配位体、FLT3配位体、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特/>瑞喹莫德、ImuFact IMP321、介白素如IL-2、IL-13、IL-21、干扰素-α或-β、或其聚乙二醇化衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、LipoVac、MALP2、MF59、单磷酰基脂质A、蒙塔尼IMS 1312、蒙塔尼ISA 206、蒙塔尼ISA 50V、蒙塔尼ISA-51、油包水及水包油乳液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、/>载体系统、基于聚(乳酸共聚乙醇酸)[PLG]及聚葡糖微粒、牛乳铁蛋白素SRL172、类病毒体及其他类病毒粒子、YF-17D、VEGF阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Aquila的QS21刺激子(其来源于皂素)、分枝杆菌感提取物及合成细菌细胞壁模拟物、及其他专属佐剂，诸如Ribi's Detox、Quil、或Superfos。诸如弗氏佐剂的GM-CSF的佐剂为较佳的。先前已描述专用于树突细胞及其制剂的若干免疫佐剂(例如MF59)(Allison及Krummel,1995，其内容以全文引用方式并入本文)。
亦可使用细胞介素。若干细胞介素已被直接联系于影响树突细胞迁移至淋巴组织(例如，TNF)，促进树突细胞熟化成用于T淋巴细胞的有效抗原提呈细胞(美国专利第5,849,589号，其以全文引用方式并入本文)(例如，GM-CSF、IL-1及IL-4)及充当免疫佐剂(例如，IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich等人,1996，其内容以全文引用方式并入本文)。在一方面中，可体外使用细胞介素及免疫佐剂，诸如用于T细胞的扩增或活化，或供离体使用。
亦已报道CpG免疫刺激寡核苷酸增强佐剂在疫苗环境中的效应。在不受理论约束的情况下，CpG寡核苷酸藉由经由类铎受体(Toll-like receptor；TLR)、主要为TLR9来活化先天性(非适应性)免疫系统。CpG触发的TLR9活化增强了在预防法性疫苗及治疗性疫苗两者中对多种抗原的抗原特异性体液及细胞反应，该抗原包括肽或蛋白抗原、活或已杀伤病毒、树突细胞疫苗、自体细胞疫苗及多糖接合物。更重要地，其增强了树突细胞熟化及分化，从而导致TH1细胞的增强活化及强的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocyte；CTL)传代，甚至在不存在CD4 T细胞辅助的情况下如此。藉由TLR9刺激诱导的TH1偏置甚至在正常地促进TH2偏置的诸如明矾或不完全弗氏佐剂(incomplete Freund's adjuvant；IFA)的疫苗佐剂的存在下得以维持。在利用其他佐剂或在诸如微粒、奈米粒子、脂质乳液或类似制剂的制剂中配制或共同给药时，CpG寡核苷酸展示甚至更大的佐剂活性，此尤其在抗原相对弱时是诱导强反应所必需的。其亦促进免疫反应且赋能抗原剂量减少达大约两个数量级，同时在一些实验中相对不具有CpG的全剂量疫苗具有可比较抗体反应(Krieg,2006)。以全文引用方式并入本文的US 6,406,705 B1描述将CpG寡核苷酸、非核酸佐剂及抗原联合使用以诱导抗原特异性免疫反应。CpG TLR9拮抗剂为Mologen(柏林，德国)的dSLIM(双主干-环圈免疫调节剂)，其是本发明的医药组合物的较佳组分。亦可使用其他TLR结合分子，诸如RNA结合TLR 7、TLR 8和/或TLR 9。
有用佐剂的其他实例包括但不限于化学修饰的CpG(例如，CpR,Idera)，诸如聚(I:C)及其衍生物的dsRNA类似物(例如，聚(ICLC)、聚(IC-R)、聚(I:C12U))，非CpG细菌DNA或RNA以及免疫活性小分子及抗体，诸如环磷酰胺、舒尼替尼、免疫查核点抑制剂，包括伊匹单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、及米普利单抗、/>Celebrex、NCX-4016、西地那非、他达那非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑洛胺、替西罗莫司、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF阱、ZD2171、AZD2171、抗CTLA4、靶向免疫系统的关键结构的其他抗体(例如抗CD40、抗TGF-β、抗TNF-α受体)及SC58175，其可在治疗上起作用或充当佐剂。适用于本发明的情形中的佐剂及添加剂的量及浓度可容易地藉由熟练技艺人士在没有不当实验的情况下决定。
较佳佐剂为抗CD40、咪喹莫特、瑞喹莫德、GM-CSF、环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐珠单抗、干扰素-α、CpG寡核苷酸及衍生物、聚(I:C)及衍生物、RNA、西地那非、及具有PLG或类病毒体的微粒制剂。
在根据本发明的医药组合物的较佳实施例中，佐剂选自由以下各项组成的群组：诸如颗粒性白血球巨噬细胞菌落刺激因子(Granulocyte Macrophage ColonyStimulating Factor；GM-CSF，沙格司亭)的菌落刺激因子、环磷酰胺、咪喹莫特、瑞喹莫德、干扰素-α、或其混合物。
在根据本发明的医药组合物的较佳实施例中，佐剂为环磷酰胺、咪喹莫特或瑞喹莫德。甚至更佳佐剂为蒙塔尼IMS 1312、蒙塔尼ISA 206、蒙塔尼ISA 50V、蒙塔尼ISA-51、聚ICLC及抗CD40 mAb、或其组合。
此组合物是用于不经肠给药，诸如皮下、真皮内、肌肉内或经口给药。组合物可经由皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内、胸膜内、囊泡内、鞘内、局部、经口给药或组合途径来给药。为此，将肽及视情况其他分子溶解或悬浮在医药学上可接受的、较佳水性载体中。另外，组合物可含有诸如缓冲液的赋形剂、黏合剂、爆破剂、稀释剂、风味剂、润滑剂等等。医药学上可接受的载剂包括但不限于赋形剂、润滑剂、乳化剂、稳定剂、溶剂、稀释剂、缓冲液、媒剂、或其组合。识别具有MHC分子的复合物中的本揭示内容的肽的肽或T细胞亦可连同诸如表6中所示的细胞介素的免疫刺激性物质一起给药。
表6：免疫刺激细胞介素
细胞介素，例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IFN-α、及IFN-β亦可用于活化和/或扩增T细胞，诸如识别在具有MHC分子的复合物中的本揭示内容的肽的T细胞。
可用于此类组合物的赋形剂的广泛清单可例如获自A.Kibbe,Handbook ofPharmaceutical Excipients(Kibbe,2000)。适合医药载剂的其他实例描述于Remington'sPharmaceutical Sciences(Gennaro,1997；Banker及Rhodes,2002，其内容以全文引用方式并入本文)。组合物可用于防止、预防和/或治疗腺瘤疾病或癌性疾病。示范性制剂可例如见于EP2112253中。
重要的是实现：藉由根据本发明的疫苗触发的免疫反应在不同细胞阶段及不同发育阶段攻击癌症。此外，攻击不同的癌症相关联传讯路径。此为超越仅针对一个或少数标靶的疫苗的优点，疫苗会引起肿瘤轻易地适应攻击(肿瘤逃逸)。此外，并非所有个别肿瘤表达相同模式的抗原。因此，若干肿瘤相关联肽的组合确保每一单个肿瘤带有至少一些标靶。以如下方式设计组合物：预期每一肿瘤表达若干抗原且覆盖肿瘤生长与维持所必需的若干独立路径。因此，疫苗可容易地以“现货供应”用于较大的患者群体。此意指预选择待用疫苗治疗的患者可限于HLA类型，不需要用于抗原表达的任何另外的生物标志，但仍确保若干标靶同时地藉由所诱导的免疫反应攻击，从对于效力而言很重要(Banchereau等人,2001；Walter等人,2012，其内容以全文引用方式并入本文)。
如本文所使用，术语“支架”是指特异性结合至(例如抗原)决定因子的分子。在一个实施例中，支架能够将连接有(例如(第二个)抗原结合部分)的实体导引至标靶位点，例如导引至特定类型的肿瘤细胞或带有抗原决定因子的肿瘤基质(例如肽与MHC的复合物，根据本申请案)。在另一实施例中，支架能够活化经由其标靶抗原(例如T细胞受体复合抗原)的传讯。支架包括但不限于抗体及其片段、抗体的抗原结合域(包含抗体重链可变区及抗体轻链可变区)、包含至少一个锚蛋白重复模体及单域抗原结合(single domain antigenbinding；SDAB)分子的结合蛋白、适体、(可溶)TCR及诸如同种异体或自体T细胞的(经修饰)细胞。为评定分子是否为结合至标靶的支架，可执行结合检定。
“特异性”结合意指支架比其他天然存在的肽-MHC复合物更好地结合所关注的肽-MHC复合物，达到如下程度：装备有能够杀伤带有特定标靶的细胞的活性分子的支架不杀伤不能具有特定标靶的另一细胞，但提呈其他肽MHC复合物。若交叉反应性肽-MHC的肽不是天然存在的，亦即，不来源于人类HLA肽组学，则结合至其他肽-MHC复合物为不相关的。评定靶细胞杀伤的测试在本领域中是熟知的。该测试应使用具有未改变肽-MHC提呈的靶细胞(初级细胞或细胞系)，或载入有肽以使得达到天然存在的肽-MHC水平的细胞来执行。
每一支架可包含标记，其提供：经结合支架可藉由决定藉由该标记提供的讯号的存在或不存在来检测。例如，支架可用萤光染料或任何其他可适用的细胞标志分子来标记。此类标志分子在本领域中是熟知的。例如，藉由例如萤光染料提供的萤光标记可藉由萤光或激光扫描显微术或流式细胞术提供经结合适体的视觉化。
每一支架可例如与诸如IL-21、抗CD3、及抗CD28的第二活性分子接合。
就关于多肽支架的其他信息而言，参见例如WO 2014/071978A1的背景部分及其中引用的参考文献，其内容以全文引用方式并入本文。
本发明的肽可用于产生及开发针对MHC-肽复合物的特异性抗体。该些抗体可用于治疗，将毒素或放射性物质靶向至患病组织。该些抗体的另一用途可为将放射性核种靶向至患病组织以用于诸如PET的成像目的。此用途可有助于检测小的转移或决定患病组织的大小及精确定位。
因此，本发明的另一方面提供用于产生特异性结合至与HLA限制抗原(较佳地根据本发明的肽)复合的MHCI类或II分子的重组抗体的方法，该方法包含：利用与该HLA限制抗原复合的可溶形式的MHCI类或II分子使包含表达该人类MHCI类或II分子的细胞的经基因工程改造的非人类哺乳动物免疫；自该非人类哺乳动物的抗体产生细胞分离mRNA分子；产生展示藉由该mRNA分子编码的蛋白质分子的噬菌体展示库；及自该噬菌体展示库分离至少一个噬菌体，该至少一个噬菌体展示特异性结合至与该HLA限制抗原复合的该MHCI类或II分子的该抗体。
因此本发明的另一方面提供特异性结合至与HLA限制抗原复合的MHCI类或II分子的抗体，其中该抗体较佳地为多克隆抗体、单株抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、其抗体片段、或其组合。
双特异性抗体
在一方面中，双特异性抗体包括能够选择性地结合两个或更多个抗原决定基的抗体。双特异性抗体可以各种方式制造(Holliger&Winter,1993，其内容以全文引用方式并入本文)，例如，以化学方式制备或自杂合融合瘤制备，或可如上文所述为任何双特异性抗体片段。可使用scfv二聚物或双抗体而不使用完整抗体。双抗体及scFv可不用Fc区，仅使用可变域(通常包括来自来源抗体的轻链及重链的可变域组分)来构筑，其潜在地减少抗遗传型反应的效应。其他形式的双特异性抗体包括Traunecker及同事描述的单链“Janusins”(Traunecker等人,1991，其内容以全文引用方式并入本文)。
双特异性抗体通常包括两个不同的结合域，其中每一结合域特异性结合两个不同抗原上或同一抗原上的不同抗原决定基。若双特异性抗体能够选择性地结合两个不同的抗原决定基(第一抗原决定基及第二抗原决定基)，则第一结合域对第一抗原决定基的亲和力将通常低于第一结合域对第二抗原决定基的亲和力的至少一个至两个或三个或四个数量级，且反之亦然。藉由双特异性抗体识别的抗原决定基可在同一或不同标靶上(例如，同一或不同蛋白质上)。双特异性抗体可藉由将识别同一抗原的不同抗原决定基的结合域组合来制得。
一些示例性双特异性抗体具有两个重链(每一者具有三个重链CDR，继之以(N末端至C末端)CH1域、铰链、CH2域、及CH3域)，及两个免疫球蛋白轻链，其经由与每一重链缔合而赋予抗原结合特异性。然而，可设想另外的架构，包括双特异性抗体，其中轻链与每一重链缔合但不(或最少地)贡献于抗原结合特异性，或轻链可结合藉由重链抗原结合区结合的抗原决定基中的一或多个，或轻链可与每一重链缔合且赋能重链之一或两者结合至一或两个抗原决定基。
在特定实施例中，双特异性抗体可包括抗体臂，其与结合至白血球上的触发分子的臂组合，以便将细胞防御机制聚焦且定位至所靶向的疾病细胞，该触发分子诸如T细胞受体分子(例如，CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD 16)。双特异性抗体亦可用于将细胞毒性剂定位至所靶向的疾病细胞。
双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2双特异性抗体)。参见，例如，WO 1996/016673；美国专利第5,837,234号；WO 1998/002463；美国专利第5,821,337号，其内容以全文引用方式并入本文。
双特异性抗体可具有延长的半衰期。在特定实施例中，双特异性抗体的半衰期延迟可藉由以下方式达成：藉由偶合至诸如聚乙二醇或其他拟晶亲水聚合物的惰性聚合物来增加抗体的流体力学体积；融合或接合至大的无序肽；或将抗体融合或偶合至配位体。该些变化形式及大量其他变化形式描述于其他地方(美国专利第7,083,784号、美国专利第7,670,600号、美国专利申请公开案第2010/0234575号，及Zwolak等人,2017，其内容以全文引用方式并入本文)。具有延长半衰期的双特异性抗体描述于例如美国专利第8,921,528号及美国专利申请公开案第2014/0308285号中，其内容以全文引用方式并入本文。
制成双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。全长双特异性抗体的产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个链具有不同的特异性(Millstein等人,1983,WO 1993/008829,Traunecker等人,1991；其内容以引用方式全文并入本文)。
多克隆抗体
制成多克隆抗体的方法在本领域中是已知的。多克隆抗体为来源于用抗原免疫的动物的血清的抗体分子的异源群体。选择性地结合根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113或其变异体或片段的肽的多克隆抗体可藉由本领域中熟知的方法制成(参见，例如，Howard&Kaser(2007)，其以全文引用方式并入本文)。
嵌合抗体
嵌合抗体为其不同部分来源于不同动物物种的分子，诸如，彼等具有来源于鼠类抗体的可变区及人类免疫球蛋白恒定区的彼等者，其主要用于减少在应用时的免疫原性且增加生产产率，例如其中鼠类单株抗体具有自融合瘤的较高产率但在人类中具有较高免疫原性，以使得人类鼠类嵌合单株抗体得以使用。嵌合抗体及其产生方法在本领域中是已知的(Cabilly等人,1984；Morrison等人,1984；Boulianne等人,1984；欧洲专利申请案173494(1986)；WO 86/01533(1986)；欧洲专利申请案184187(1986)；Sahagan等人,1986；Liu等人,1987；Sun等人,1987；Better等人,1988；Harlow&Lane,1998；美国专利第5,624,659号，其内容以全文引用方式并入本文)。
抗体片段
除完整免疫球蛋白(或其重组对应物)之外，可合成包含抗原决定基结合位点(例如，Fab、F(ab')2、或其他片段)的免疫球蛋白。“片段”或最小免疫球蛋白可利用重组免疫球蛋白技术来设计。例如，用于本发明的“Fv”免疫球蛋白可藉由合成融合可变轻链区及可变重链区来产生。亦关注抗体的组合，例如，双抗体，其包含两个相异Fv特异性。免疫球蛋白的抗原结合片段包括但不限于SMIP(小分子免疫医药剂)、骆驼抗体、奈米抗体、及IgNAR。
用于产生此类抗体及单链MHC I类复合物的相应方法，以及用于产生该些抗体的工具揭示于WO 03/068201、WO 2004/084798、WO 01/72768、WO 03/070752中，及出版物中(Cohen等人,2003a；Cohen等人,2003b；Denkberg等人,2003，其出于本发明的目的以全文引用方式并入本文)。
较佳地，抗体以<100nM、更佳地<50nM、更佳地<10nM、更佳地<1nM、更佳地<0.1nM、更佳地<0.01nM的结合亲和力结合至复合物，其亦在本发明的情形中视为“特异性”的。
本发明涉及包含选自由以下各项组成的群组的氨基酸序列的肽
·SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113，
·及其变异体序列，其维持结合至MHC分子的能力和/或诱导T细胞与该变异体肽的交叉反应，或其医药学上可接受的盐。
所揭示的肽结合至以下至少一者：HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01及HLA-B*44:02，外加视情况其他HLA异型。同样地，肽变异体结合至主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex；MHC)的分子的能力涉及HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01及HLA-B*44:02，外加视情况其他HLA异型。
在一个实施例中，上文所主张肽的变异体序列意指在其所谓的“锚定位置”中具有取代的序列。
应注意，MHC限制肽中的该些锚定位置包含介导肽结合至MHC中的肽结合凹槽的氨基酸残基。
其仅在结合多肽与肽-MHC复合物之间的结合反应中起小的作用，意指该些位置中的取代不显著地影响以此方式修饰的肽的免疫原性TCR/抗体结合。
下表(表7)展示肽的锚定位置及该些位置中结合HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01及HLA-B*44:02的较佳/所接受的氨基酸残基。
表7：锚定位置及该些位置中用于上述HLA等位基因的较佳氨基酸。
归因于结合模式的相似性，诸如相关锚定位置的相似性，一些肽结合至超过一种等位基因，此种重叠很可能为但不限于亦结合至HLA-B*15的HLA-A*01结合肽、亦结合至HLA-A*11的HLA-A*03结合肽、亦结合至HLA-B*35及HLA-B*51的HLA-B*07结合肽。
此外，本发明涉及其与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113至少88％同源的变异体，前提是，其结合至MHC分子和/或诱导T细胞与该变异体肽交叉反应。
在一个实施例中，上文所主张肽的变异体序列意指藉由至少一个保守氨基酸取代修饰的序列。术语“保守氨基酸取代”的定义及范畴揭示在表3及4以及与其相关的描述中。
在一个实施例中，该肽具有结合至MHC l类分子的能力，且在结合至该MHC时，能够藉由CD4和/或CD8 T细胞识别。
在一个实施例中，MHC I类分子为选自由以下各项组成的群组的至少一者：HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01及HLA-B*44:02，外加视情况其他HLA异型。
本发明进一步涉及包含序列的肽，该序列选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113或其变异体组成的群组，其与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113至少88％同源(较佳为一致的)，其中该肽或变异体具有在8个与30个之间的氨基酸，及较佳在8个与12个之间的氨基酸，或若所选肽具有9个氨基酸的长度，则在9个与30个之间的氨基酸，及较佳在9个与12个之间的氨基酸，或若所选肽具有10个氨基酸的长度，则在10个与30个之间，及较佳在10个与12个之间的氨基酸。
在一个实施例中，该肽或其变异体包含在相应序列的C末端和/或N末端处的1至4个另外的氨基酸。参见表5获得其他详情。
在一个实施例中，该肽或其变异体具有多至30个氨基酸的长度。在一个实施例中，该肽或其变异体具有多至16个氨基酸的长度。在一个实施例中，该肽或其变异体具有多至12个氨基酸的长度。
在一个实施例中，该肽或其变异体具有8至30个氨基酸的总长度。在一个实施例中，该肽或其变异体具有8至16个氨基酸的总长度。在一个实施例中，该肽或其变异体具有8至12个氨基酸的总长度。
在一个实施例中，该肽或其变异体具有9至30个氨基酸的总长度。在一个实施例中，该肽或其变异体具有9至16个氨基酸的总长度。在一个实施例中，该肽或其变异体具有9至12个氨基酸的总长度。
在一个实施例中，该肽或其变异体具有10至30个氨基酸的总长度。在一个实施例中，该肽或其变异体具有10至16个氨基酸的总长度。在一个实施例中，该肽或其变异体具有10至12个氨基酸的总长度。
在一个实施例中，该肽或其变异体具有根据相应SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113的长度。在一个实施例中，肽由或主要由根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成。
本发明进一步涉及根据本发明的肽，其中该肽包括非肽键。
本发明进一步涉及根据本发明的肽，其中该肽为融合蛋白质的部分，其尤其包含HLA-DR抗原相关联不变链(Ii)的N末端氨基酸，或其中肽融合至抗体(或融合至抗体中)，该抗体诸如例如对树突细胞为特异性的抗体。
本发明进一步涉及抗体或其功能片段，其特异性地识别或结合至根据本发明的肽或其变异体，或在结合至MHC分子时结合至根据本发明的肽或其变异体。
在一个实施例中，MHC分子为选自由以下各项组成的群组的至少一者：HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01及HLA-B*44:02异型MHC分子，外加视情况其他HLA异型。
在其他实施例中，此抗体为可溶或膜结合的。在其他实施例中，此抗体为单株抗体或其片段。在其他实施例中，此抗体携带诸如免疫刺激域或毒素的另一效应物功能。
本发明进一步涉及T细胞受体或其功能片段，其与MHC配位体反应或结合至MHC配位体，其中该配位体为根据本发明的肽或其变异体，或在结合至MHC分子时为根据本发明的肽或其变异体。
在一个实施例中，MHC分子为选自由以下各项组成的群组的至少一者：HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01及HLA-B*44:02，外加视情况其他HLA异型。
在其他实施例中，该T细胞受体提供为可溶分子。在其他实施例中，该T细胞受体携带诸如免疫刺激域或毒素的另一效应物功能。
本发明进一步涉及核酸，其编码根据本发明的肽或其变异体、根据本发明的抗体或其片段、或根据本发明的T细胞受体或其片段。
本发明进一步涉及根据本发明的核酸，其为DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合。
在一个实施例中，该核酸连接至异源启动子序列。在一个实施例中，该核酸提供为表达和/或包含该核酸的表达载体。
本发明进一步涉及重组寄主细胞，其包含根据本发明的肽或其变异体、根据本发明的抗体或其片段、根据本发明的T细胞受体或其片段、或根据本发明的核酸或表达载体。
本发明进一步涉及用于产生活化T淋巴细胞的体外方法，该方法包含将T细胞与适合抗原提呈细胞或模拟抗原提呈细胞的人工构建体的表面上表达的载入抗原的人类I类或II类MHC分子体外接触达足以以抗原特异性方式活化该T细胞的一段时间，其中该抗原为根据相应描述的肽或其变异体。
在一个实施例中，抗原提呈细胞包含表达载体，其能够表达含有SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:113或该变异体氨基酸序列的该肽。
本发明进一步涉及产生根据本发明的肽的体外方法，该方法包含培养根据本发明的寄主细胞，及自该寄主细胞或其培养基分离肽。
本发明进一步涉及藉由根据本发明的方法产生的活化T淋巴细胞，其中该T淋巴细胞选择性地识别提呈根据本发明的肽或其变异体的细胞。该提呈可为异常提呈或异常表达。
本发明进一步涉及包含至少一个活性成分的医药组合物，该活性成分选自由以下各项组成的群组
·根据本发明的肽或其变异体，
·根据本发明的抗体或其片段，
·根据本发明的T细胞受体或其片段，
·根据本发明的核酸或表达载体，
·根据本发明的寄主细胞，
·或根据本发明的活化T淋巴细胞，及医药学上可接受的载剂。
在一个实施例中，此医药组合物是用于个别患者的个性化医药组合物。在一个实施例中，医药组合物为疫苗。方法亦可适于产生用于下游应用的T细胞纯系，该下游应用诸如TCR分离、或可溶抗体、及其他治疗选择。
「个性化医药剂」将意指针对一个个别患者特定定制的治疗，其将仅用于此个别患者的治疗，包括主动个性化的癌症疫苗及使用自体患者组织的授受性细胞治疗。
本发明进一步涉及用于产生根据本发明的肽或其变异体、根据本发明的抗体或其片段、或根据本发明的T细胞受体或其片段及自该寄主细胞和/或其培养基分离肽或其变异体、抗体或其片段或T细胞受体或其片段的方法。
本发明进一步涉及根据本发明的肽或其变异体、根据本发明的抗体或其片段、根据本发明的T细胞受体或其片段、根据本发明的核酸或表达载体、根据本发明的寄主细胞、或根据本发明的活化T淋巴细胞，其用于药物或用于药物的制造。
本发明进一步涉及杀伤患者中的靶细胞的方法，该靶细胞异常地表达包含根据本发明的任何氨基酸序列的多肽。该方法包含向患者给药有效量的如根据本发明的活化T淋巴细胞。
同样地，本发明涉及根据本发明的活化T淋巴细胞，其用于杀伤患者的靶细胞，该靶细胞提呈包含根据本发明的任何氨基酸序列的多肽，或用于制造用于杀伤此类靶细胞的药剂。
本发明进一步涉及治疗患者的方法，该患者
·被诊断为患癌症，
·罹患癌症，或
·有患上癌症的风险，
该方法包含向患者给药有效量的根据本发明的肽或其变异体、根据本发明的抗体或其片段、根据本发明的T细胞受体或其片段、根据本发明的核酸或表达载体、根据本发明的寄主细胞、或根据本发明的活化T淋巴细胞。
同样地，本发明进一步涉及根据本发明的肽或其变异体、根据本发明的抗体或其片段、根据本发明的T细胞受体或其片段、根据本发明的核酸或表达载体、根据本发明的寄主细胞、或根据本发明的活化T淋巴细胞，其用于治疗患者，该患者
·被诊断为患癌症，
·罹患癌症，或
·有患上癌症的风险，或用于制造用于治疗此患者的药剂。
本发明进一步涉及根据本发明的用途，其中药剂为疫苗。
本发明进一步涉及用于根据本发明的用途的方法或肽、抗体、T细胞受体、核酸、寄主细胞或活化T淋巴细胞，其中该癌症选自由以下各项组成的群组：急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌。
本发明进一步涉及试剂盒，其包含：
(a)容器，该容器包含医药组合物，该医药组合物含有根据本发明的呈溶液或呈冻干形式的医药组合物；
(b)视情况，第二容器，该第二容器含有用于冻干制剂的稀释剂或重构溶液；
(c)视情况，至少一或多种选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113组成的群组的肽。
在其他实施例中，试剂盒包含缓冲液、稀释剂、过滤器、针、或注射器中之一或多者。
本发明进一步涉及基于根据本发明的肽的在本文中成为“标靶”的特定标志蛋白质及生物标志，其可用于诊断和/或预后以下至少一者：急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌。
术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”在本文中以广义使用且包括多克隆抗体及单株抗体两者。除完整或“完全”免疫球蛋白分子之外，术语“抗体”中亦包括彼等免疫球蛋白分子的片段(例如CDR、Fv、Fab及Fc片段)或聚合物及免疫球蛋白分子的人源化版本，只要其展现根据本发明的任何所要性质即可(例如，特异性结合急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌标志多肽)。
本发明的单株抗体可使用融合瘤方法制备。在融合瘤方法中，典型地用免疫剂使小鼠或其他适当的寄主动物免疫以引出淋巴细胞，其产生或能够产生将特异性结合至免疫剂的抗体。替代地，淋巴细胞可体外免疫。
单株抗体亦可藉由重组DNA方法制成，该方法诸如US 4,816,567中描述的方法。本发明的编码单株抗体的DNA可使用已知程序(例如，藉由使用寡核苷酸探针，其能够特异性结合至编码鼠类抗体的重链及轻链的基因)容易地分离及测序。
体外方法亦适于制备单价抗体。消化抗体以产生其片段、尤其是Fab片段可使用本领域中所知的常规技术来完成。例如，消化可使用木瓜蛋白酶来执行。木瓜蛋白酶消化的实例描述于WO 94/29348及US 4,342,566中，其内容以全文引用方式并入本文。抗体的木瓜蛋白酶消化典型地产生两个一致的抗原结合分段，称为Fab片段，每一者具有单一抗原结合位点及残余Fc片段。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段及pFc'片段。
抗体片段无论是否连接至其他序列亦可包括特定区或特异性氨基酸残基的插入、缺失、取代、或其他经选择的修饰，前提是片段的活性相较于非修饰抗体或抗体片段并未显著地改变或受损。该些修饰可提供一些额外的性质，以便移除/添加能够二硫键合的氨基酸，增加其生物寿命，改变其分泌特性等等。在任何情况下，抗体片段必须拥有生物活性性质，诸如结合活性、调节在结合域处的结合等等。抗体的功能区或活性区可藉由蛋白质的特定区的突变诱发来鉴别，继之以表达并测试所表达的多肽。此类方法对本领域中的熟练行医者显而易见，且可包括编码抗体片段的核酸的位点特异性突变诱发。
本发明的抗体可进一步包含人源化抗体或人类抗体。非人类(例如，鼠类)抗体的人源化形式为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(complementary determining region；CDR)的残基由来自非人类物种(供体抗体)的CDR的具有所要特异性、亲和力及能力的残基置换，该非人类物种诸如小鼠、大鼠或兔。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架(framework；FR)残基藉由相应非人类残基置换。人源化抗体亦可包含既不在受体抗体又不在引入的CDR或框架序列中发现的残基。大体而言，人源化抗体将包含至少一个及典型地两个可变域的实质上全部，其中CDR区的全部或实质上全部相应于非人类免疫球蛋白的彼等CDR区，且FR区的全部或实质上全部为人类免疫球蛋白共通序列的彼等FR区。人源化抗体最佳地亦将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，其典型地为人类免疫球蛋白的彼者。
用于人源化非人类抗体的方法在本领域中为熟知的。通常，人源化抗体具有一或多个自非人类来源引入其中的氨基酸残基。该些非人类氨基酸残基常常称为“引入”残基，其典型地获自“引入”可变域。人源化可基本上藉由将啮齿动物CDR或CDR序列取代人类抗体的相应序列来执行。因此，此类“人源化”抗体为嵌合抗体(US 4,816,567，其内容以全文引用方式并入本文)，其中实质上小于完整的人类可变域已藉由来自非人类物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体典型地为人类抗体，其中一些CDR残基及可能地一些FR残基藉由来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。
可使用基因转殖动物(例如，小鼠)，其在免疫之后能够在不存在内生性免疫球蛋白产生的情况下产生人类抗体的完全免疫图谱。例如，已描述：嵌合及生殖系突变小鼠中的抗体重链联接区的同型组合缺失导致内生性抗体产生的完全抑制。将人类生殖系免疫球蛋白基因阵列转移至此生殖系突变小鼠中将导致在抗原攻毒后产生人类抗体。人类抗体亦可在噬菌体展示库中产生。
在一方面中，本揭示内容的抗体亦可经由噬菌体展示、或核糖体展示、或酵母展示、或细菌展示、或杆状病毒展示、或哺乳动物细胞展示、或mRNA展示来获得。该些方法全部为本领域中的熟知技术，其具体操作可参见相应教科书或操作手册(Mondon等人,2008；其内容以全文引用方式并入本文)。使用例如噬菌体展示，单独的抗体基因可被插入噬菌体的DNA中，以便抗体分子上可结合抗原的可变区可偶合至噬菌体的壳蛋白。在噬菌体感染大肠杆菌之后，可在大肠杆菌中复制单链DNA，且噬菌体可重装配并分泌至培养基中，而大肠杆菌可不被溶解。噬菌体可利用标靶抗原共同孵育；且在将结合噬菌体分离之后，可随后进行扩增及纯化以便可筛选大量纯系。噬菌体展示技术可鉴于文献中(Liu等人,2004，及US20100021477；其内容以全文引用方式并入本文)。
在另一方面中，本揭示内容可包括用于使用噬菌体展示方法产生单株抗体的方法。具体而言，mRNA可自藉由用于使动物免疫的方法免疫的动物制备，该动物例如兔、大鼠、小鼠、天竺鼠、仓鼠、山羊、马、鸡、绵羊、及骆驼(例如，骆马)，在使动物免疫之后，可使用mRNA作为模板来制备cDNA以便可制备仅编码抗体可变区的单链抗体(scFv)基因。基因可选殖至噬菌粒载体。将噬菌粒载体转导于其中的大肠杆菌用噬菌体感染，以便在噬菌体壳上表达scFV抗体。针对抗原蛋白质或针对肽-MHC复合物筛选以此方式表达的scFv可制备对抗原蛋白质或肽-MHC复合物为特异性的单株scFV抗体。在本文中，mRNA的制备、cDNA的制备、次选殖至噬菌粒或转导至大肠杆菌、噬菌体感染、及筛选对抗原蛋白质或肽-MHC复合物为特异性的单株scFV抗体各自可藉由已知方法执行。例如，将scFV基因次选殖至含有由编码前导序列(讯号序列)的基因片段及噬菌体壳蛋白III组成的两个元件及M13的复制起点的噬菌粒载体及使用M13噬菌体作为噬菌体可在M13噬菌体上表达scFV抗体。另外，藉由筛选获得的噬菌体可感染至特定细菌且经培养，以便亦可自培养物大数量地收集对抗原蛋白质为特异性的单株抗体。根据用于产生本揭示内容的单株抗体的方法，不仅可制备scFV抗体而且可制备不具有恒定区的抗体片段，诸如Fab抗体片段。
在另一方面中，本披露内容可包括噬菌体展示库，其中抗体的重链及轻链可变区可经合成以使得其包括几乎所有的可能特异性。
在另一方面中，本揭示内容可包括含有除M13之外的噬菌体的噬菌体展示库的传代。诸如λ噬菌体的其他噬菌体亦可用于本揭示内容的方法中。已产生λ噬菌体展示库，其展示藉由在其表面上的异源DNA编码的肽(Sternberg等人,1995；其内容以全文引用方式并入本文)。此外，本揭示内容的方法可延伸以包括不同于噬菌体的病毒，诸如真核病毒。可产生真核病毒，其编码适于递送至哺乳动物的基因且编码并展示能够靶向特定细胞类型或组织的抗体，基因将递送至该特定细胞类型或组织。例如，已产生反转录病毒载体，其展示功能抗体片段(Russell等人,1993；其内容以全文引用方式并入本文)。
在另一方面中，本揭示内容提供用于产生特异性结合至与HLA限制抗原(较佳地由或主要由根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113的氨基酸序列组成的肽)复合的MHCI类或II分子的重组抗体的方法，该方法可包括：利用与该HLA限制抗原复合的可溶形式的MHCI类或II类分子使包含表达该MHCI类或II类分子的细胞的经基因工程改造的非人类哺乳动物免疫；自该非人类哺乳动物的抗体产生细胞分离mRNA分子；产生展示藉由该mRNA分子编码的蛋白质分子的噬菌体展示库；及自该噬菌体展示库分离至少一个噬菌体，该至少一个噬菌体展示特异性结合至与该HLA限制抗原复合的该MHCI类或II类的该抗体。
本发明的抗体较佳地于医药学上可接受的载剂中给药至受试者。典型地，适当量的医药学上可接受的盐用于制剂中以赋予该制剂等张性。医药学上可接受的载剂的实例包括盐水、Ringer氏溶液及葡萄糖溶液。溶液的pH较佳地为约5至约8，及更佳地约7至约7.5。其他载体包括持续释放制剂，诸如含有抗体的实体疏水性聚合物的半渗透基质，该基质呈成形物件形式，例如，膜、脂质体或微粒。熟习此项技术者将明白某些载体可更佳地取决于例如所给药抗体的给药途径及浓度。
可藉由注射(例如，静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内)或藉由诸如输注的其他方法将抗体给药至受试者、患者、或细胞，该其他方法确保抗体以有效形式递送至血流。抗体亦可藉由肿瘤内或肿瘤周围途径给药，以发挥局部以及全身性治疗效果。局部或静脉内注射是较佳的。
用于给药抗体的有效剂量及时程可凭经验决定，且做出此类决定在次项技术中的技艺水准内。熟习此项技术者将理解必须给药的抗体的剂量将取决于例如将接受抗体的受试者、给药途径、所使用抗体的特定类型及所给药的其他药物而变化。单独使用的抗体的典型日剂量可取决于如上文所述的因素在每日1μg/kg体重至多至100mg/kg体重或更大的范围。在给药抗体之后，较佳地用于治疗急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌之后，治疗抗体的效力可以熟练行医者所熟知的各种方式来评定。例如，接受治疗的受试者中癌症的大小、数量、和/或分布可使用标准肿瘤成像技术来监视。相较于将在不存在抗体给药时发生的疾病过程，阻止肿瘤生长、导致肿瘤收缩、和/或防止新肿瘤发育的经治疗给药的抗体是用于治疗癌症的有效抗体。
本发明的另一方面提供用于产生识别特异性肽-MHC复合物的可溶T细胞受体的方法。此类可溶T细胞受体可自特异性T细胞纯系产生，且其亲和力可藉由靶向互补决定区的突变诱发来增加。为达T细胞受体选择的目的，可使用噬菌体展示(US 2010/0113300，Liddy等人,2012，其内容以全文引用方式并入本文)。为达在噬菌体展示期间及在作为药物的实际使用情况下T细胞受体的稳定，可例如藉由非初始二硫键、其他共价键(单链T细胞受体)、或藉由二聚域来连接α链及β链(Boulter等人,2003；Card等人,2004；Willcox等人,1999，其内容以全文引用方式并入本文)。T细胞受体可连接至毒素、药物、细胞介素(参见例如US2013/0115191，其内容以全文引用方式并入本文)、及招募效应细胞的诸如抗CD3域等等的域，以便对靶细胞执行特定功能。此外，其在用于授受性转移的T细胞中表达。其他信息可见于WO 2004/033685A1及WO 2004/074322A1。可溶TCR的组合描述于WO 2012/056407A1中。用于产生的其他方法揭示于WO 2013/057586A1中，其内容以全文引用方式并入本文。
另外，本发明的肽和/或TCR或抗体或其他结合分子可用于基于生检样品来验证病理学家对癌症的诊断。
抗体或TCR亦可用于体内诊断检定。通常，用放射性核苷酸(诸如111In、99Tc、14C、131I、3H、32P、及35S)标记抗体以便肿瘤可使用免疫闪烁摄影来定位。在一个实施例中，抗体或其片段结合至选自由上文所述蛋白质组成的群组的蛋白质的两个或更多个标靶的细胞外域，且结合亲和力(Kd)为<100nM、更佳地<50nM、更佳地<10nM、更佳地<1nM、更佳地<0.1nM、更佳地<0.01nM。
用于诊断用途的抗体可用适于藉由各种成像方法检测的探针来标记。用于检测探针的方法包括但不限于萤光、光、共焦及电子显微术；磁共振成像及光谱学；萤光镜检查、电脑断层摄影术及正电子发射断层摄影术。适合的探针包括但不限于萤光素、玫瑰红、曙红及其他萤光团、放射性同位素、金、釓及其他镧系元素、顺磁铁、氟-18及其他发射正电子的放射性核种。另外，探针可双功能或多功能的且可藉由所列方法中的超过一种方法检测。该些抗体可用该探针直接或间接标记。探针与抗体的连接包括探针的共价连接，探针于抗体中的并入，及用于结合探针的螯合化合物的共价连接，以及本领域中充分确认的其他连接。对于免疫组织化学，疾病组织样品可为新鲜的或冻结的或可嵌入石蜡中且用诸如福马林的防腐剂固定。固定或嵌入的切片含有与经标记的初级抗体及二级抗体接触的样品，其中抗体用于原位检测蛋白质的表达。
本发明的另一方面包括用于产生活化T淋巴细胞的体外方法，该方法包含将T细胞与适合抗原提呈细胞的表面上表达的载入肽的人类MHC分子体外接触达足以以抗原特异性方式活化该T细胞的一段时间，其中该抗原为根据本发明的肽。较佳地，足够量的抗原与抗原提呈细胞一起使用。
较佳地，哺乳动物细胞缺乏或具有减少水平或功能的TAP肽运输蛋白。缺乏TAP肽运输蛋白的适合细胞包括T2、RMA-S及果蝇细胞。TAP为与抗原加工相关联的运输蛋白。
载有缺陷性细胞系T2的人类肽可以购自12301Parklawn Drive,Rockville,马里兰州20852的美国典型培养物保藏中心(目录号CRL199)2；果蝇细胞系Schneider系2可以购自ATCC(目录号CRL19863)；小鼠RMA-S细胞系描述于Ljunggren等人(Ljunggren及Karre,1985，其内容以全文引用方式并入本文)中。
较佳地，在转染之前，寄主细胞实质上不表达MHC I类分子。亦较佳的是，刺激物细胞表达对提供用于T细胞的共刺激讯号为重要的分子，诸如B7.1、B7.2、ICAM-1及LFA3。众多MHC I类分子及共刺激物分子的核酸序列可公告地自GenBank及EMBL资料库获得。
在MHC I类抗原决定基用作抗原的情况下，T细胞为CD8阳性T细胞。
若抗原提呈细胞经转染以表达此抗原决定基，则较佳地细胞包含能够表达含有SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:113或其变异体氨基酸序列的肽的表达载体。
大量其他方法可用于体外产生T细胞。例如，自体肿瘤浸润的淋巴细胞可用于CTL的传代。Plebanski等人(Plebanski等人,1995)在T细胞的制备中利用自体周边血液淋巴细胞(peripheral bloodlymphocyte；PLB)。此外，藉由用肽或多肽脉冲树突细胞或经由用重组病毒感染来产生自体T细胞系可能的。此外，B细胞可用于产生自体T细胞。另外，用肽或多肽脉冲或用重组病毒感染的巨噬细胞可用于制备自体T细胞。S.Walter等人(Walter等人,2003，其内容以全文引用方式并入本文)描述藉由使用人工抗原提呈细胞(artificialantigen presenting cell；aAPC)来体外致敏细胞，其亦为针对所选肽产生T细胞的适合方式。在本发明中，aAPC藉由经由生物素:链霉亲和素生物化学将预形成的MHC-肽复合物偶合至聚苯乙烯粒子(微珠)的表面来产生。此系统允许准确控制aAPC上的MHC密度，其允许自血液样品以高效率选择性地引出高或低更结合力抗原特异性T细胞反应。除MHC-肽复合物外，aAPC应载有具有共刺激活性的其他蛋白质，如偶合至其表面的抗CD28抗体。此外，此类基于aAPC的系统常常需要添加适当的可溶性因子，例如细胞介素，如介白素-12。
同种异体细胞亦可用于制备T细胞且方法在以全文引用方式并入本文的WO 97/26328中详细描述。例如，除果蝇细胞及T2细胞之外，其他细胞可用以提呈抗原，该细胞诸如CHO细胞、杆状病毒感染的昆虫细胞、细菌、酵母、及痘疮感染的靶细胞。另外，可使用植物病毒，参见例如Porta等人(Porta等人,1994，其内容以全文引用方式并入本文)，其描述将豇豆嵌纹病毒开发作为用于提呈外来肽的高产率系统。
针对本发明的肽的活化T细胞适用于治疗。因此，本发明的另一方面提供可藉由本发明的前述方法获得的活化T细胞。
藉由上文方法产生的活化T细胞将选择性地识别异常地表达多肽的细胞，该多肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113的氨基酸序列。
较佳地，T细胞藉由经由其TCR与HLA-肽复合物的相互作用(例如，结合)来识别细胞。T细胞适用于杀伤患者中的靶细胞的方法，该患者的靶细胞异常地表达包含本发明的氨基酸序列的多肽，其中给药该患者有效量的活化T细胞。给药至患者的T细胞可来源于患者且如上文描述来活化(亦即，其为自体T细胞)。替代地，T细胞不是来自患者而是来自另一个体。当然，若个体为健康个体，则是较佳的。就“健康个体”而言，发明人意指个体通常为健康良好的，较佳地具有健全的免疫系统且更佳地未罹患任何可容易测试及检测的疾病。
在体内，用于根据本发明的CD8阳性T细胞的靶细胞可为肿瘤的细胞(其有时表达MHC II类)和/或肿瘤围绕的基质细胞(其有时亦表达MHC II类)(Dengjel等人,2006)。
本发明的T细胞可用作治疗组合物的活性成分。因此，本发明亦提供杀伤患者中的靶细胞的方法，该患者的靶细胞异常地表达包含本发明的氨基酸序列的多肽，该方法包含向该患者给药有效量的如上文定义的T细胞。
就“异常地表达”而言，发明人亦意指多肽相较于正常组织中的表达水平过度表达，或基因在肿瘤所来源的组织中为缄默的但在肿瘤中得以表达。就“过度表达”而言，发明人意指多肽以在正常组织中存在的水平的至少1.2倍；较佳地至少2倍、及更佳地在正常组织中存在的水平的至少5倍或10倍的水平存在。
T细胞可藉由本领域中所知的方法，例如上文描述的彼等方法获得。
用于T细胞的此所谓授受性转移的方案在本领域中为熟知的。可找到若干概述(Gattinoni等人,2006；Morgan等人,2006，其内容以全文引用方式并入本文)。
本发明的另一方面包括与MHC复合的肽用以产生T细胞受体的用途，该T细胞受体的核酸经选殖且引入寄主细胞、较佳地T细胞中。此工程改造的T细胞可随后转移至患者用于癌症的治疗。
本发明的任何分子，亦即，肽、核酸、抗体、表达载体、细胞、活化T细胞、T细胞受体或编码其的核酸适用于治疗特征为逃避免疫反应的细胞的病症。因此，本发明的任何分子可用作药剂或用于制造药剂。分子可自身使用或与本发明的其他分子或(a)已知分子组合。
本发明的试剂盒较佳地包含本发明的于适合容器中的冻干制剂及用于其重构和/或使用的指令。适合的容器包括例如瓶、小瓶(例如双腔室小瓶)、注射器(诸如双腔室注射器)及试管。容器可由诸如玻璃或塑胶的各种材料形成。较佳地，试剂盒和/或容器含有关于或相关联于容器的指示用于重构和/或使用的指导的说明书。例如，标签可指示冻干制剂将重构至如上文描述的肽浓度。标签可进一步指示制剂适用于或意欲用于皮下给药。
保持有制剂的容器可为多次使用小瓶，允许重构制剂的重复给药(例如，2-6次给药)。试剂盒可进一步包含第二容器，其包含适合的稀释剂(例如，碳酸氢钠溶液)。
在稀释剂及冻干制剂的混合之后，重构制剂中的最终肽浓度较佳地为至少0.15mg/mL/肽(＝75μg)及较佳地不超过3mg/mL/肽(＝1500μg)。试剂盒可进一步包括自商业及使用者立场而言为合需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器及带有使用说明书的包装插页。
本发明的试剂盒可具有单一容器，其含有根据本发明的医药组合物的制剂，具有或不具有其他组分(例如，其他化合物或该些其他化合物的医药组合物)，或可具有用于每一组分的相异容器。
较佳地，本发明的试剂盒包括本发明的制剂，其经包装用于与第二化合物(诸如佐剂(例如GM-CSF)、化学治疗剂、天然产物、激素或拮抗剂、抗血管新生剂或抑制剂、细胞凋亡诱导剂或螯合剂)或其医药组合物的共同给药组合。试剂盒的组分可预复合或每一组分可在给药至患者之前处于分离的相异容器中。试剂盒的组分可以一或多种液体溶液、较佳地水溶液、更佳地无菌水溶液来提供。试剂盒的组分亦可提供为实体，其可藉由添加适合溶剂转化成液体，该溶剂较佳地提供于另一相异容器中。
治疗性试剂盒的容器可为小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器、或封装实体或液体的任何其他手段。通常，在存在超过一种组分时，试剂盒将含有第二小瓶或其他容器，其允许单独配料。试剂盒亦可含有用于医药学上可接受的液体的另一容器。较佳地，治疗性试剂盒将含有装置(例如，一或多个针、注射器、滴管、移液管等等)，其赋能本发明的药剂的给药，该药剂为当前试剂盒的组分。
当前制剂为适于藉由任何可接受的途径给药肽的制剂，该途径诸如经口(肠内)、经鼻、经眼、皮下、真皮内、肌肉内、静脉内或经皮。较佳地，给药是s.c.给药，且最佳地藉由输注泵的i.d.给药。
因为本发明的肽自急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌分离，所以本发明的药剂较佳地用于治疗急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌。
在一个示范性实施例中，包括在疫苗中的肽藉由以下鉴别：(a)鉴别藉由来自个别患者的肿瘤样品提呈的肿瘤相关联肽(tumor-associated peptide；TUMAP)；及(b)选择在(a)中重新鉴别的至少一个肽且确认其免疫原性。
一旦选择用于基于个性化肽的疫苗的肽，即生产该疫苗。疫苗较佳地为由溶于20-40％之间的DMSO、较佳地约30-35％之间的DMSO(诸如约33％ DMSO)中的个别肽组成的液体制剂。
包括于产物中的每一肽溶于DMSO中。单一肽溶液的浓度必须取决于待包括于产品中的肽的数目来选择。将单一肽-DMSO溶液以相等份数混合以达成含有待包括于产品中的所有肽的溶液，浓度为约2.5mg/mL/肽。随后将混合溶液用注射用水1:3稀释以达成于33％DMSO中的0.826mg/mL/肽的浓度。将稀释溶液经由0.22μM无菌过滤器过滤。获得最终本体溶液。
将最终本体溶液填充于小瓶中且在-20℃下储存直至使用。一个小瓶含有700μL溶液，含有0.578mg的每一种肽。其中，500μL(大致每肽400μg)将应用于真皮内注射。
除适用于治疗癌症之外，本发明的肽亦适于作为诊断剂。因为肽自急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌细胞产生，且因为已测定该些肽不存在于或以较低水平存在于正常组织中，所以该些肽可用于诊断癌症的存在。
所主张肽于血液样品中的组织生检上的存在可辅助病理学家诊断癌症。借助于抗体、质谱分析法或本领域中所知的其他方法检测到某些肽可暗示病理学家该组织样品是恶性的或发炎的或大体上为患病的，或可用作急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌的生物标志。成群的肽的存在可赋能对患病组织的分类或子分类。
在患病组织试样上检测到肽可赋能关于涉及免疫系统的治疗的益处，尤其在已知T淋巴细胞或预期T淋巴细胞涉及作用机制的情况下如此。MHC表达的损失是已充分描述的机制，受感染或恶性细胞藉由该机制逃避免疫监视。因此，肽的存在证实此机制未藉由所分析细胞利用。
本发明的肽可用以分析针对彼等肽的诸如T细胞反应的淋巴细胞反应或针对肽或复合至MHC分子的肽的抗体反应。该些淋巴细胞反应可用作用于决定进一步治疗步骤的预后标志。该些反应亦可用作免疫治疗方法中的替代反应标志，目标藉由不同手段诱导淋巴细胞反应，例如疫苗接种蛋白质、核酸、自体材料、淋巴细胞的授受性转移。在基因治疗环境中，针对肽的淋巴细胞反应可在评估副作用中予以考虑。监视淋巴细胞反应亦可为用于移植治疗的跟踪检查的有价值工具，例如用于检测移植物对寄主及寄主对移植物疾病。
现将在以下描述本发明的较佳实施例的实例中且参考随附图式来描述本发明，然而，本发明不限于此。出于本发明的目的，本文引用的所有参考文献以全文引用方式并入本文。
另外，应注意，实验资料及图式可在本文中仅揭示用于如所主张的所选择的肽集合。虽然对于本文揭示及主张的所有肽而言，已产生完全的资料集且可根据请求获得，但申请人决定在本文中不并入所有该些完全的资料集，因为此将超出本申请案正文的可管控范畴。
图式简单说明
第1图展示脱酰胺化肽的抗原加工路径及其藉由HLA I类的提呈。在转译期间，具有糖基化模体N[X^P][ST]的蛋白质在其于ER中的N残基处变成糖基化的(1)。在其输出之后，细胞溶质酰胺酶PNG酶移除N-连接寡糖，从而导致脱酰胺化成天冬氨酸盐(D)(2)。在蛋白酶体中的进一步降解(3)且将肽再次运送至ER中(4)之后，其结合至HLA I复合物(5)。肽-HLA I复合物随后遵循经典的抗原提呈路径，易位至细胞膜且在细胞表面上提呈脱酰胺化肽(6)。
第2图展示自天冬酰胺酸(N)至天冬氨酸(D)的脱酰胺化反应(第2图)。
第3A图至第3D图展示各种肽在不同癌症组织相较于正常组织的过度提呈。上方部分：将来自技术性重复量测的中值MS讯号强度针对正常样品(灰色点，图式左方部分)及检测到肽的肿瘤样品(黑色点，图式右方部分)绘制为点。方框显示中值，正规化讯号强度的第25百分位数及第75百分位数，而框须(whisker)延伸至仍在下四分位数的1.5四分位距(interquartile range；IQR)内的最低资料点，及仍在上四分位数的1.5IQR内的最高资料点。下方部分：将每种器官中的相对肽检测频率展示为直方图(spine plot)。图面下方的数字指示自针对每一器官(对HLA-A*01阳性正常样品，N>200；对HLA-A*03阳性正常样品，N>210；对HLA-A*24正常样品，N>180；对HLA-B*07正常样品，N>200；对HLA-B*08阳性正常样品，N>90及对HLA-B*44正常样品，N>210)或肿瘤适应症(对HLA-A*01阳性癌症样品，N>190；对HLA-A*03阳性癌症样品，N>180；对HLA-A*24阳性癌症样品，N>330；对HLA-B*07阳性癌症样品，N>190；对HLA-B*08阳性癌症样品，N>100及对HLA-B*44阳性癌症样品，N>210)分析的样品总数中检测出肽的样品数目。若在样品上已检测到肽但由于技术原因无法定量，则样品包括此检测频率表示中，但在图式的上方部分中不展示点。组织(从左至右)：正常样品：脂肪(脂肪组织)；肾上腺gl(肾上腺)；胆管；膀胱；血细胞；血管(bloodvess)(血管(bloodvessel))；骨髓；脑；乳房；esoph(食管)；眼睛；胆bl(胆囊)；头及颈；心脏；intest.la(大肠)；intest.sm(小肠)；肾；肝；肺；淋巴结；神经中枢(中枢神经)；神经periph(周边神经)；卵巢；胰腺；parathyr(副甲状腺)；perit(腹膜)；pituit(垂体)；胎盘；胸膜；前列腺；skel.mus(骨骼肌)；皮肤；脊髓；脾；胃；睾丸；胸腺；甲状腺；气管；输尿管；子宫。肿瘤样品：AML(急性骨髓性白血病)；BRCA(乳癌)；CCC(胆管细胞癌)；CLL(慢性淋巴球性白血病)；CRC(结肠直肠癌)；GBC(胆囊癌)；GBM(神经胶质母细胞瘤)；GC(胃癌)；GEJC(胃食管结合部癌)；HCC(肝细胞癌)；HNSCC(头及颈鳞状细胞癌)；MEL(黑素瘤)；NHL(非霍奇金氏淋巴瘤)；NSCLCadeno(非小细胞肺癌)；NSCLCother(无法明确指派至NSCLCadeno或NSCLCsquam的NSCLC样品)；NSCLCsquam(鳞状细胞非小细胞肺癌)；OC(卵巢癌)；OSCAR(食管癌)；PACA(胰腺癌)；PRCA(前列腺癌)；RCC(肾细胞癌)；SCLC(小细胞肺癌)；UBC(膀胱癌)；UEC(子宫内膜癌)。第3A图)肽：ISDITEKNSGLY(SEQ ID NO:6)、第3B图)肽：MTDVDRDGTTAY(SEQ ID NO:19)、第3C图)肽：IYLDRTLLTTI(SEQ ID NO:56)、第3D图)肽：TYLPTDASLSF(SEQ ID NO:76)。
第4A图至第4D图展示本发明的来源基因的示范性表达分布，该来源基因过度表达于不同癌症样品中。肿瘤(黑色点)及正常(灰色点)样品根据器官起源来分组。方框及框须图表示中值FPKM值，亦即第25百分位数及第75百分位数(方框)加框须，该框须延伸至仍在下四分位数之1.5四分位距(interquartile range；IQR)内的最低资料点，及仍在上四分位数之1.5IQR内的最高资料点。FPKM：每千碱基每百万映射度数的片段数。组织(从左至右)：正常样品：脂肪(脂肪组织)；肾上腺gl(肾上腺)；胆管；膀胱；血细胞；血管(bloodvess)(血管(blood vessel))；骨髓；脑；乳房；esoph(食管)；眼睛；胆bl(胆囊)；头及颈；心脏；intest.la(大肠)；intest.sm(小肠)；肾；肝；肺；淋巴结；神经periph(周边神经)；卵巢；胰腺；parathyr(副甲状腺)；perit(腹膜)；pituit(垂体)；胎盘；胸膜；前列腺；skel.mus(骨骼肌)；皮肤；脊髓；脾；胃；睾丸；胸腺；甲状腺；气管；输尿管；子宫。肿瘤样品：AML(急性骨髓性白血病)；BRCA(乳癌)；CCC(胆管细胞癌)；CLL(慢性淋巴球性白血病)；CRC(结肠直肠癌)；GBC(胆囊癌)；GBM(神经胶质母细胞瘤)；GC(胃癌)；GEJC(胃食管结合部癌)；HCC(肝细胞癌)；HNSCC(头及颈鳞状细胞癌)；MEL(黑素瘤)；NHL(非霍奇金氏淋巴瘤)；NSCLCadeno(非小细胞肺癌)；NSCLCother(无法明确指派至NSCLCadeno或NSCLCsquam的NSCLC样品)；NSCLCsquam(扁平细胞非小细胞肺癌)；OC(卵巢癌)；OSCAR(食管癌)；PACA(胰腺癌)；PRCA(前列腺癌)；RCC(肾细胞癌)；SCLC(小细胞肺癌)；UBC(膀胱癌)；UEC(子宫内膜癌)。第4A图)Ensembl ID：ENST00000336375p218，肽：VHNFTLPSW(SEQ ID NO:114)；第4B图)Ensembl ID：ENST00000264144p359，肽：FFQNSTFSF(SEQ ID NO:115)；第4C图)Ensembl ID：ENST00000254508p924，肽：IVRNLSCRK(SEQ ID NO:116)；第4D图)Ensembl ID：ENST00000314191p3305，肽：YIDNVTLI(SEQ ID NO:117)。
第5图展示对一个示范性肽VYTDISHHF(SEQ ID NO:55)的IdentControl实验的结果。肽藉由在资料依赖获取(data-dependent acquisition；DDA)模式中比较稳定同位素标记(stable isotope labeled；SIL)的标准的断裂物的IdentControl确认。身份(Identity)使用室内测定光谱相关性阈值来确认。
第6图展示用于肽ISDITEKNSGLY(SEQ ID NO:6)的CoElution实验的一个示范性结果。肽藉由使用稳定同位素标记(stable isotope labeled；SIL)的内标及标靶MS(sPRM或IS-PRM)的CoElution确认。使用SIL-肽及天然肽的非重叠MS2分离窗。执行使用非HLA肽组学样品(例如，胰蛋白酶消化或5％FA)作为基质的对照实验来确认SIL内标的同位素纯度。肽身份在专家手动核查中基于客观、预定义的标准来确认。
第7A图至第7E图展示健康HLA-A*01+、A*24+或B*44+供体的肽特异性体外CD8+T细胞反应的示范性结果。使用涂覆有抗CD28 mAb的人工APC及HLA-A*01、A*24、或B*44与SEQID NO:56(A，左方图面)、SEQ ID NO:28(B，左方图面)、SEQ ID NO:30(C，左方图面)、SEQ IDNO:32(D，左方图面)或SEQ ID NO:14(E，左方图面)的复合物来致敏CD8+T细胞。在三个刺激循环的后，藉由用A*24/SEQ IDNO:56(A)、A*01/SEQ ID NO:28(B)、A*24/SEQ ID NO:30(C)、B*44/SEQ ID NO:32(D)或A*01/SEQID NO:14(E)进行2D多聚物染色来执行肽反应性细胞的检测。右方图面(A、B、C、D及E)展示用与所关注复合物相同异型的不相关HLA/肽复合物刺激的细胞的对照染色。活的单细胞针对CD8+淋巴细胞闸控。布林闸(Boolean gates)帮助排除用对不同肽为特异性的多聚物所检测的假阳性事件。指示CD8+淋巴细胞中的特异性多聚物+细胞的频率。
实例
实例1
细胞表面上提呈的肿瘤相关联肽的鉴别及定量
组织样品
患者的组织自以下获得：
BioIVT(Detroit,密歇根州，美国&Royston,赫兹，英国)；Bio-Options Inc.(Brea,加州,美国)；BioServe(Beltsville,马里兰州,美国)；Capital BioScience Inc.(Rockville,马里兰州,美国)；Conversant Bio(Huntsville,阿拉巴马州,美国)；CurelineInc.(Brisbane加州,美国)；DxBiosamples(San Diego,加州,美国)；Geneticist Inc.(Glendale,加州,美国)；Indivumed GmbH(汉堡，德国)；京都府立医科大学(KPUM)(京都,日本)；大阪市立大学(OCU)(大阪,日本)；ProteoGenex Inc.(Culver City,加州,美国)；Tissue Solutions Ltd(格拉斯哥,英国)；Bonn(波恩,德国)；Asklepios ClinicSt.Georg(汉堡，德国)；瓦尔德西布伦大学医院(巴塞罗那,西班牙)；癌症免疫治疗中心(CCIT)；海莱乌医院(海莱乌,丹麦)；莱顿大学医疗中心(LUMC)(莱顿,荷兰)；IstitutoNazionale Tumori“Pascale”，分子生物学及病毒肿瘤学单位(那不勒斯,意大利)；斯坦福癌症中心(Palo Alto,加州,美国)；日内瓦大学医院(日内瓦,瑞士)；海德堡大学医院(海德堡,德国)；慕尼黑大学医院(慕尼黑,德国)；蒂宾根大学医院(蒂宾根,德国)。
已在外科手术或尸体解剖之前给与所有患者书面知情同意书。组织在切除之后立即震动-冻结且在-70℃或以下储存直至TUMAP的分离。
自组织样品分离HLA肽
来自震动-冻结组织样品的HLA肽池根据稍微修改的方案(Falk等人,1991；Seeger等人,1999)，使用HLA-A*02特异性抗体BB7.2、HLA-A、HLA-B、HLA-C特异性抗体W6/32、HLA-DR特异性抗体L243及HLA-DP特异性抗体B7/21、CNBr活化的琼脂糖凝胶、酸处理、及超滤，藉由自实体组织的免疫沉淀来获得。
表8展示肽及其结合至的HLA异型，该HLA异型来自由HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01及HLA-B*44:02组成的群组。然而，归因于结合模式的相似性，诸如相关锚定位置的相似性，一些肽结合至超过一种等位基因，此种重叠很可能为但不限于亦结合至HLA-B*15的HLA-A*01结合肽、亦结合至HLA-A*11的HLA-A*03结合肽、亦结合至HLA-B*35及HLA-B*51的HLA-B*07结合肽。
表8：根据本发明的脱酰胺化肽及其结合至的HLA等位基因
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质谱学分析
所获得的HLA肽池根据其疏水性，藉由逆相层析法(nanoAcquity UPLC系统，Waters)来分离，且在配备ESI源的LTQ velos及融合杂合体质谱仪(ThermoElectron)中分析溶析肽。将肽池直接装载至装填有1.7μm C18逆相材料(Waters)的分析熔融矽石微毛细管柱(75μm i.d.x 250mm)上，施加400nL每分钟的流动速率。随后，使用两步180分钟二元梯度，自10％至33％ B，以300nL每分钟的流动速率来分离肽。梯度由溶剂A(于水中的0.1％甲酸)及溶剂B(于乙腈中的0.1％甲酸)构成。涂覆金的玻璃毛细管(PicoTip,New Objective)用于引入nanoESI源中。LTQ-Orbitrap质谱仪使用TOP5策略在资料依赖性模式中操作。简言之，扫描循环在orbitrap(R＝30000)中以高质量准确度的全扫描起始，继之以亦在orbitrap(R＝7500)中对5个最大丰度前驱物离子的MS/MS扫描，同时动力学排除先前选择的离子。串联质谱藉由处于固定伪发现率(q≤0.05)及另外的人工控制的SEQUEST来解释。在其中所鉴别肽序列不确定的情况下，其另外藉由所产生的天然肽断裂模式与合成的序列一致性参考肽的断裂模式的比较来验证。
无标记相对LC-MS定量藉由离子计数，亦即藉由LC-MS特征的提取及分析来执行(Mueller等人,2007)。该方法假定：肽的LC-MS讯号面积与其在样品中的丰度相关。所提取特征进一步藉由电荷状态反折积及滞留时间校准来处理(Mueller等人,2008；Sturm等人,2008)。最终，所有LC-MS特征与序列鉴别结果交互参照以组合不同样品及组织的定量资料来获得肽提呈分布。将定量资料以根据说明技术及生物学重复测试内的差异的集中趋势的二阶方式正规化。因此，每一鉴别的肽可与定量资料相关联，从而允许样品与组织之间的相对定量。另外，对肽候选者获得的所有定量资料手动检查来确保资料一致性并检验自动分析的准确度。对于每一肽，计算提呈分布，其展示平均样品提呈以及重复测试差异。该分布将AML(急性骨髓性白血病)；BRCA(乳癌)；CCC(胆管细胞癌)；CLL(慢性淋巴球性白血病)；CRC(结肠直肠癌)；GBC(胆囊癌)；GBM(神经胶质母细胞瘤)；GC(胃癌)；GEJC(胃食管结合部癌)；HCC(肝细胞癌)；HNSCC(头及颈鳞状细胞癌)；MEL(黑素瘤)；NHL(非霍奇金氏淋巴瘤)；NSCLCadeno(非小细胞肺癌)；NSCLCother(无法明确指派至NSCLCadeno或NSCLCsquam的NSCLC样品)；NSCLCsquam(鳞状细胞非小细胞肺癌)；OC(卵巢癌)；OSCAR(食管癌)；PACA(胰腺癌)；PRCA(前列腺癌)；RCC(肾细胞癌)；SCLC(小细胞肺癌)；UBC(膀胱癌)；UEC(子宫内膜癌)样品与正常组织样品的基线并置。示范性过度表达的肽的提呈分布展示于第3A图-第3D图中。图中仅将肽的彼等鉴别结果展示为点，其在对所指示HLA等位基因为阳性且用对相应异型为特异性的抗体来加工的组织样品上得到。
对所有肽(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113)而言，各种适应症的肽提呈展示于表9中。此表列出所有适应症，对该适应症鉴别相应肽至少一次，其独立于样品的HLA类型或用于加工该样品的抗体。
表9：在各种癌症实体上的根据本发明的肽的提呈，及因此如所提及的肽用于诊断和/或治疗如所指示的癌症的特定相关性。癌症类型：AML(急性骨髓性白血病)；BRCA(乳癌)；CCC(胆管细胞癌)；CLL(慢性淋巴球性白血病)；CRC(结肠直肠癌)；GBC(胆囊癌)；GBM(神经胶质母细胞瘤)；GC(胃癌)；GEJC(胃食管结合部癌)；HCC(肝细胞癌)；HNSCC(头及颈鳞状细胞癌)；MEL(黑素瘤)；NHL(非霍奇金氏淋巴瘤)；NSCLCadeno(非小细胞肺癌)；NSCLCother(无法明确指派至NSCLCadeno或NSCLCsquam的NSCLC样品)；NSCLCsquam(鳞状细胞非小细胞肺癌)；OC(卵巢癌)；OSCAR(食管癌)；PACA(胰腺癌)；PRCA(前列腺癌)；RCC(肾细胞癌)；SCLC(小细胞肺癌)；UBC(膀胱癌)；UEC(子宫内膜癌)。
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实例2
编码本发明的肽的基因的表达分布
肽于肿瘤细胞上相较于正常细胞的过度提呈或特异性提呈足以使其适用于免疫治疗，且一些肽是肿瘤特异性的，而不管其来源蛋白质亦存在于正常组织中。又，mRNA表达分布增加了在选择用于免疫治疗的肽标靶中的另外的安全性水平。尤其对于具有高安全性风险的治疗选择，诸如亲和力成熟的TCR，理想的标靶肽将来源于对肿瘤为唯一且不见于正常组织上的蛋白质。
RNA来源及制备
在已自每一患者获得书面知情同意书之后，如上文所指示来提供外科手术移除的组织试样(参见实例1)。在外科手术之后立即将肿瘤组织试样快速冻结且稍后在液氮下用研钵及研杵均质化。总体RNA使用TRI试剂(Ambion,达姆施塔特，德国)自该些样品制备，继之以用RNeasy(QIAGEN,希尔登,德国)清除；两种方法皆根据制造商的方案来执行。
来自健康人类组织的用于RNASeq实验的总体RNA自以下获得：Asterand(Detroit,密歇根州，美国)A&Royston,赫兹，英国)；Bio-Options Inc.(Brea,加州，美国)；Geneticist Inc.(Glendale,加州，美国)；ProteoGenex Inc.(Culver City,加州，美国)；Tissue Solutions Ltd(格拉斯哥，英国)。
来自肿瘤组织的用于RNASeq实验的总体RNA自以下获得：Asterand(Detroit,密歇根州，美国&Royston,赫兹，英国)；BioCat GmbH(海德堡，德国)；BioServe(Beltsville,马里兰州，美国)；Geneticist Inc.(Glendale,加州，美国)；Istituto Nazionale Tumori“Pascale”(那不勒斯，意大利)；ProteoGenex Inc.(Culver City,加州，美国)；海德堡大学医院(海德堡，德国)。
所有RNA样品的品质及数量在Agilent 2100生物分析仪(Agilent,瓦尔德布隆，德国)上使用RNA 6000Pico LabChip试剂盒(Agilent)来评定。
RNAseq实验
肿瘤及正常组织RNA样品的基因表达分析藉由CeGaT(图宾根，德国)的下一代测序(RNAseq)来执行。简言之，测序库使用Illumina HiSeq v4试剂试剂盒，根据提供商的方案(Illumina Inc.,San Diego,加州，美国)来制备，该方案包括RNA断裂、cDNA转化及添加测序转接蛋白。将来源于多个样品的库等摩尔混合且在Illumina HiSeq 2500定序器上，根据制造商的说明来测序，从而产生50个bp单端读数。将经处理的读数使用STAR软件映射至人类基因组(GRCh38)。基于ensembl序列资料库(Ensembl77)的注解，表达资料在转录物水平作为RPKM(每千碱基每百万映射读数的读数，藉由软件Cufflinks产生)提供及在外显子水平(总读数，藉由软件Bedtools产生)提供。将外显子读数针对外显子长度及比对大小来正规化以获得RPKM值。
第4A图至第4D图中展示本发明的来源基因的示范性表达分布，该来源基因高度过度表达或专门表达于AML(急性骨髓性白血病)；BRCA(乳癌)；CCC(胆管细胞癌)；CLL(慢性淋巴球性白血病)；CRC(结肠直肠癌)；GBC(胆囊癌)；GBM(神经胶质母细胞瘤)；GC(胃癌)；GEJC(胃食管结合部癌)；HCC(肝细胞癌)；HNSCC(头及颈鳞状细胞癌)；MEL(黑素瘤)；NHL(非霍奇金氏淋巴瘤)；NSCLCadeno(非小细胞肺癌)；NSCLCother(无法明确指派至NSCLCadeno或NSCLCsquam的NSCLC样品)；NSCLCsquam(扁平细胞非小细胞肺癌)；OC(卵巢癌)；OSCAR(食管癌)；PACA(胰腺癌)；PRCA(前列腺癌)；RCC(肾细胞癌)；SCLC(小细胞肺癌)；UBC(膀胱癌)；UEC(子宫内膜癌)中。其他示范性基因的表达记分展示于表9中。
表10：表达记分。该表列出来自在肿瘤中相较于一组正常组织高度过度表达(++)或在肿瘤中相较于一组正常组织过度表达(+)的基因的肽。此记分的基线自对以下相关正常组织的量测来计算：脂肪组织；肾上腺；胆管；膀胱；血细胞；血管；骨髓；脑；乳房；食管；眼睛；胆囊；头及颈；心脏；大肠；小肠；肾；肝；肺；淋巴结；周边神经；卵巢；胰腺；副甲状腺；腹膜；垂体；胎盘；胸膜；前列腺；骨骼肌；皮肤；脊髓；脾；胃；睾丸；胸腺；甲状腺；气管；输尿管；子宫。在同一组织类型的若干样品的表达资料是可用的情况下，将所有相应样品的算术平均值用于计算。
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实例3
藉由IdentControl及CoElution验证肽
为验证根据本发明的肽，所有肽使用标准及充分确立的使用Fmoc策略的固相肽合成来合成。必要时，使用稳定同位素标记(stable isotope labeled；SIL-)的氨基酸来引入区别的质量偏移且允许使用该些标记肽作为内标(例如，若肽选用于CoElution实验中的身份确认)。每一个别肽的身份及纯度藉由质谱学及分析RP-HPLC来决定。肽以>50％的纯度获得为白色至灰白色冻干物(三氟乙酸盐)。所有TUMAP较佳地作为三氟乙酸盐或乙酸盐来给药，其他盐形式亦是可能的。
肽的初始验证藉由IdentControl，经由光谱比较来达成。为此，藉由使用如用于获得天然光谱的匹配断裂模式及碰撞能量获得高解析度参考MS2光谱将合成肽用于验证肽鉴别结果。自动化光谱比较使用光谱相关性的敏感度量与截止记分来执行，该截止记分经测定在<1％ FDR下，基于包含>10,000个手动验证光谱的基准资料集产生90％灵敏度。模糊的鉴别结果进一步在CoElution实验中经受验证。
表11：IdentControl结果。光谱相关性指示来自内生性检测肽的MS/MS光谱相较于合成肽的相似性，值越高，光谱约类似。肽在满足0.75的阈值时得以验证，或光谱根据手册核查考虑为一致的。
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为进一步验证，使肽经受使用SIL内标肽的CoElution实验。为此，将SIL肽掺入来自样品的HLA肽组学提取物中，且使其经受液相层析靶向的质谱学(liquidchromatography-targeted mass spectrometry；LC-MS)以基于光谱相似性以及在滞留时间维度中的CoElution来确认肽身份。必要时，调节所掺入的SIL-肽量至肽比电离因子(在校准曲线中测定)。使用预定义的经靶向MS2扫描事件来执行LC-MS，其利用对SIL-肽及天然肽物种而言不重叠的分离窗以避免共同断裂。为确认同位素纯度及不存在SIL-肽及天然肽的共同断裂，在含有胰蛋白酶基质的非HLA肽中执行对照实验，必须确认该基质不存在任何未标记的讯号。藉由CoElution的肽检测及验证藉由基于多个预定义客观标准进行专家手动核查来测定，该标准包括SIL肽相较于未标记肽MS2迹线的点积(dot product；dotP)、在多次连续扫描中存在最强烈跃迁及对准的峰顶点。藉由CoElution验证的肽的列表可见于表12中。
表12：阳性CoElution实验的肽
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实例4
MHC I类提呈肽的体外免疫原性
为获得关于本发明的TUMAP的免疫原性的信息，发明人使用基于用载有肽/MHC复合物及抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞(artificial antigen presenting cell；aAPC)重复刺激CD8+T细胞的体外T细胞致敏检定来执行研究。因此，发明人可展示本发明的MHC I类限制的TUMAP的免疫原性，从而证明该些肽为T细胞抗原决定基，针对其的CD8+前驱T细胞存在于人类中(表13A至13D)。
CD8+T细胞的体外致敏
为藉由载有肽-MHC复合物(peptide-MHC complex；pMHC)及抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞执行体外刺激，发明人首先在知情同意之后，使用自德国曼海姆大学诊所获得的健康供体的CD8微珠(Miltenyi Biotec,Bergisch-拉德巴赫，德国)，经由阳性选择来自新鲜的HLA-A*01、HLA-A*24、HLA-B*08或HLA-B*44白血球分离术产品分离CD8+T细胞。
将PBMC及分离的CD8+淋巴细胞在T细胞培养基(T cell medium；TCM)中孵育直至使用，该T细胞培养基由补充有以下各项的RPMI-Glutamax(Invitrogen,卡尔斯鲁厄，德国)组成：10％热钝化人类AB血清(PAN-Biotech,艾登巴赫，德国)、100U/ml盘尼西林/100μg/ml链霉素(Cambrex,科隆,德国)、1mM丙酮酸钠(CC Pro,奥伯多拉,德国)、20μg/ml健他霉素(Cambrex)。亦在此步骤将2.5ng/mL IL-7(PromoCell,海德堡，德国)及10U/ml IL-2(Novartis Pharma,纽伦堡，德国)添加至TCM。
在良好限定的体外系统中，每个刺激条件使用四种不同的pMHC分子及每个读出条件使用8种不同的pMHC分子来执行pMHC/抗CD28涂覆珠粒的产生、T细胞刺激及读出。
如制造商(Perbio,波恩,德国)所推荐，使用磺酸基N-羟基琥珀酰亚胺基生物素将纯化的共刺激小鼠IgG2a抗人类CD28 Ab 9.3(Jung等人,1987)以化学方式生物素化。所使用的珠粒为直径5.6μM的链霉亲和素涂覆的聚苯乙烯粒子(Bangs实验室，伊利诺伊州，美国)。
用于阳性及阴性对照刺激的pMHC分别为A*02:01/MLA-001(来自经修饰Melan-A/MART-1的肽ELAGIGILTV(SEQ ID NO:227))及A*02:01/DDX5-001(来自DDX5的YLLPAIVHI，SEQ ID NO:228)。
在4x 12.5ng不同的生物素-pMHC存在下，将800.000个珠粒/200μl涂于96孔板中，洗涤且随后以200μl的体积添加600ng生物素抗CD28。藉由在37℃下，将1x106个CD8+T细胞与2x105个经洗涤经涂覆珠粒在补充有5ng/mL IL-12(PromoCell)的200μl TCM中共同孵育来在96孔板中起始刺激。随后将培养基的一半藉由补充有80U/ml IL-2的新鲜TCM更换且在37℃下继续孵育4天。执行此刺激循环总共三次。对于每个条件使用8种不同pMHC分子的pMHC多聚物读出而言，如先前所描述(Andersen等人,2012)使用二维组合编码方法，其中次要修饰涵盖偶合至5种不同的萤光染料。最终，藉由将细胞用活/死的近IR染料(Invitrogen,卡尔斯鲁厄,德国)、CD8-FITC抗体纯系SK1(BD,海德堡,德国)及萤光pMHC多聚物染色来执行多聚物分析。为分析，使用配备适当激光器及过滤器的BD LSRII SORP血细胞计数器。肽特异性细胞系以总CD8+细胞的百分比来计算。使用FlowJo软件(Tree Star,俄勒冈州，美国)进行多聚物分析的评估。特异性多聚物+CD8+淋巴细胞的体外致敏藉由比较阴性对照刺激来检测。若发现一个健康供体的至少一个可评估体外刺激孔在体外刺激之后含有特异性CD8+T细胞系(亦即，此孔含有CD8+T细胞之中的至少1％的特异性多聚物+，且特异性多聚物+细胞的百分比为阴性对照刺激的中值的至少10倍)，则对于给定抗原检测出免疫原性。
癌症肽的体外免疫原性
对于所测试的HLA I类肽而言，体外免疫原性可藉由肽特异性T细胞系的传代来证明。在对本发明的5种肽的TUMAP特异性多聚物染色之后的示范性流式细胞术结果连同相应阴性对照展示于第7图中。来自本发明的12种肽的结果概述于表13A至13D中。
表13A：本发明的HLA-A*01肽的体外免疫原性
藉由申请人对本发明的HLA-A*01限制肽进行的体外免疫原性实验的示范性结果。指示了体外免疫原性实验的结果。阳性孔及供体(可评估者之中)的百分比如所指示的<20％＝+；20％-49％＝++；50％-69％＝+++；>＝70％＝++++来概述。
SEQ ID NO 序列 阳性孔[％]
14 WSDWSNPAY "+++"
28 PSDLSVFTSY "++"
40 LSDLTCNNY "+"
表13B：本发明的HLA-A*24肽的体外免疫原性
藉由申请人对本发明的HLA-A*24限制肽进行的体外免疫原性实验的示范性结果。指示体外免疫原性实验的结果。阳性孔及供体(可评估者之中)的百分比如所指示的<20％＝+；20％-49％＝++；50％-69％＝+++；>＝70％＝++++来概述。
SEQ ID NO 序列 阳性孔[％]
30 IYNFRLWDF +
35 VFHDHTYHL +
41 NYLLYVSDF +
56 IYLDRTLLTTI +
表13C：本发明的HLA-B*08肽的体外免疫原性
藉由申请人对本发明的HLA-B*08限制肽进行的体外免疫原性实验的示范性结果。指示体外免疫原性实验的结果。阳性孔及供体(可评估者之中)的百分比如所指示的<20％＝+；20％-49％＝++；50％-69％＝+++；>＝70％＝++++来概述。
SEQ ID NO 序列 阳性孔[％]
17 DILDRTGHQL +
表13D：本发明的HLA-B*44肽的体外免疫原性
藉由申请人对本发明的HLA-B*44限制肽进行的体外免疫原性实验的示范性结果。指示体外免疫原性实验的结果。阳性孔及供体(可评估者之中)的百分比如所指示的<20％＝+；20％-49％＝++；50％-69％＝+++；>＝70％＝++++來概述。
SEQ ID NO 序列 阳性孔[％]
8 AQDTTYLWW +
27 DEAVRDITW +
32 RDATASLW +
42 AERDLDVTI +
实例5
MHC结合检定
进一步测试用于根据本发明的基于T细胞的治疗的候选肽的MHC结合能力(亲和力)。藉由UV-配位体交换来产生个别肽-MHC复合物，其中UV敏感性肽在UV照射之后分解且由如分析的所关注肽交换。仅可有效地结合且稳定化肽接纳性MHC分子的肽候选物防止MHC复合物的解离。为测定交换反应的产率，执行基于稳定化的MHC复合物的轻链(β2m)的检测的ELISA。如Rodenko等人(Rodenko等人,2006)大体上描述的来执行检定。
在室温下，用PBS中的2μg/ml链霉亲和素涂覆96孔MAXISorp板(NUNC)隔夜，洗涤4次且在37℃下在含有2％BSA的阻断缓冲液中阻断1h。将再折叠HLA-A*02:01/MLA-001单体用作标准，其覆盖15-500ng/mL的范围。在阻断缓冲液中将UV交换反应的肽-MHC单体稀释100倍。在37℃下降样品孵育1h，洗涤4次，在37℃下用2μg/ml HRP接合的抗β2m孵育1h，再次洗涤且用TMB溶液检测，该TMB溶液用NH2SO4终止。在450nm处量测吸收。展示高交换产率(较佳地高于50％、最佳地高于75％)的候选肽通常对于抗体或其片段和/或T细胞受体或其片段的传代及产生而言是较佳的，因为其展示对MHC分子的足够结合力且防止MHC复合物的解离。
对于来自本发明的112种肽的MHC-肽结合结果概述于表14A至G中。
表14A：MHC I类结合记分。HLA I类限制肽与HLA-A*01:01的结合藉由肽交换产率来划定范围：≧10％＝+；≧20％＝++；≧50％＝+++；≧75％＝++++
表14B：MHC I类结合记分。HLA I类限制肽与HLA-A*02:01的结合藉由肽交换产率来划定范围：≧10％＝+；≧20％＝++；≧50％＝+++；≧75％＝++++
SEQ ID NO 序列 肽交换
53 SLIDITHGF ++++
表14C：MHC I类结合记分。HLA I类限制肽与HLA-A*03:01的结合藉由肽交换产率来划定范围：≧10％＝+；≧20％＝++；≧50％＝+++；≧75％＝++++
SEQ ID NO 序列 肽交换
3 IVRDLSCRK +++
22 NLYDWSASY ++
29 RLWDFTMNAK +++
47 RLPAADFTRY ++
61 KAYDQTHLY ++++
63 HLYYDVTEK +++
表14D：MHC I类结合记分。HLA I类限制肽与HLA-A*24:02的结合藉由肽交换产率来划定范围：≧10％＝+；≧20％＝++；≧50％＝+++；≧75％＝++++
/>
表14E：MHC I类结合记分。HLA I类限制肽与HLA-B*07:02的结合藉由肽交换产率来划定范围：≧10％＝+；≧20％＝++；≧50％＝+++；≧75％＝++++
SEQ ID NO 序列 肽交换
21 APFKDVTEY +++
39 LPFFTDKTLSF ++++
48 FPYYLKIDY +++
62 HPDLTSMTF ++++
70 HPFGYDLTL ++++
71 VPRNQDESV ++++
105 NPADISVAL ++++
106 SPKIFDSSW +++
107 GEPTSDITLL +++
表14F：MHC I类结合记分。HLA I类限制肽与HLA-B*08:01的结合藉由肽交换产率来划定范围：≧10％＝+；≧20％＝++；≧50％＝+++；≧75％＝++++
SEQ ID NO 序列 肽交换
17 DILDRTGHQL +++
72 DVSDKITFM +++
表14G：MHC I类结合记分。HLA I类限制肽与HLA-B*44:05的结合藉由肽交换产率来划定范围：≧10％＝+；≧20％＝++；≧50％＝+++；≧75％＝++++
/>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
Val His Asp Phe Thr Leu Pro Ser Trp
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Phe Phe Gln Asp Ser Thr Phe Ser Phe
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
Ile Val Arg Asp Leu Ser Cys Arg Lys
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Tyr Ile Asp Asp Val Thr Leu Ile
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
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Gly Tyr Ile Asp Asp Val Thr Leu Ile
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
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Ile Ser Asp Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr
1 5 10
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<211> 9
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<213> 人工序列
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<400> 7
Val Thr Arg Asp Asp Thr Ala Ser Tyr
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
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Ala Gln Asp Thr Thr Tyr Leu Trp Trp
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Ile Phe Asp Glu Thr Gly Arg Phe
1 5
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<211> 9
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<213> 人工序列
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Gln Val Asp Gly Ser Leu Leu Val Ile
1 5
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
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Asn His Ile Thr Asp Thr Ser Leu Asn Leu Phe
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
Ile Thr Asp Thr Ser Leu Asn Leu Phe
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Ser His Tyr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
Trp Ser Asp Trp Ser Asn Pro Ala Tyr
1 5
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
Thr Glu Gly Asp Phe Thr Lys Glu Ala Ser Thr Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Val Thr Gln Asp Asp Thr Gly Phe Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Asp Ile Leu Asp Arg Thr Gly His Gln Leu
1 5 10
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<220>
<223> 合成
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Gly Thr Asp Lys Gln Asp Ser Thr Leu Arg Tyr
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Met Thr Asp Val Asp Arg Asp Gly Thr Thr Ala Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Thr Ser Asp Thr Ser Gln Tyr Asp Thr Tyr
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
Ala Pro Phe Lys Asp Val Thr Glu Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Asn Leu Tyr Asp Trp Ser Ala Ser Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
Ser Tyr Asp Glu Thr Lys Ile Lys Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
Phe Tyr Asp Asn Ser Val Ile Ile Phe
1 5
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
Phe Thr Asp Leu Ile Thr Asp Glu Ser Ile Asn Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
Ile Tyr Pro Asp Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
Asp Glu Ala Val Arg Asp Ile Thr Trp
1 5
<210> 28
<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
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Pro Ser Asp Leu Ser Val Phe Thr Ser Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Arg Leu Trp Asp Phe Thr Met Asn Ala Lys
1 5 10
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<223> 合成
<400> 30
Ile Tyr Asn Phe Arg Leu Trp Asp Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
Val Gln Pro Asp Ser Ser Tyr Thr Tyr
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Arg Asp Ala Thr Ala Ser Leu Trp
1 5
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
Ile Ser Asp Gly Met Asp Ser Ser Ala His Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
Leu Ser Asp Leu Ser Leu Ala Asp Ile
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
Val Phe His Asp His Thr Tyr His Leu
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
Tyr Trp Asp Glu Thr Leu Lys Glu Phe
1 5
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
Arg Ser Leu Asp Cys Thr Val Lys Thr Tyr
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
Lys Leu Thr Asp Asn Ser Asn Gln Phe
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
Leu Pro Phe Phe Thr Asp Lys Thr Leu Ser Phe
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
Leu Ser Asp Leu Thr Cys Asn Asn Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
Asn Tyr Leu Leu Tyr Val Ser Asp Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
Ala Glu Arg Asp Leu Asp Val Thr Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
Phe Phe Thr Asp Lys Thr Leu Ser Phe
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
Lys Glu Asn Gln Asp His Ser Tyr Ser Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
Tyr Phe Val Asp Val Thr Thr Arg Ile
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
Lys Glu Val Asp Asp Thr Leu Leu Val Asn Glu Leu
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
Arg Leu Pro Ala Ala Asp Phe Thr Arg Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
Phe Pro Tyr Tyr Leu Lys Ile Asp Tyr
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
Pro Ser Asp Gly Ser Met His Asn Tyr
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
Arg Ser Ile Asp Val Thr Gly Gln Gly Phe
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
Arg Val Asp Asp Ile Thr Asp Gln Phe
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
Leu Thr Glu Val Glu Lys Asp Ala Thr Ala Leu Tyr
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
Ser Leu Ile Asp Ile Thr His Gly Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
Gln Tyr Gln Asp Thr Thr Val Ser Phe
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
Val Tyr Thr Asp Ile Ser His His Phe
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
Ile Tyr Leu Asp Arg Thr Leu Leu Thr Thr Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
Phe Tyr Asp Leu Ser Ile Gln Ser Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
Gly Thr Asp Gln Thr Gly Lys Gly Leu Glu Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 59
Ile Leu Phe Ser Asp Ser Thr Arg Leu Ser Phe
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
His Val Lys Asp Ala Thr Met Gly Tyr
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
Lys Ala Tyr Asp Gln Thr His Leu Tyr
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
His Pro Asp Leu Thr Ser Met Thr Phe
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
His Leu Tyr Tyr Asp Val Thr Glu Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
Phe His Tyr Asp Asp Thr Ala Gly Tyr Phe
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 65
Ile Tyr Gln Phe Ala Arg Leu Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 66
Tyr His Asp Gln Thr Ile Ser Phe
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 67
Gln Ala Ile Asp Leu Ser Leu Asn Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 68
Val Phe Asp Glu Thr Lys Asn Leu Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 69
Lys Ser Tyr His Asp Gln Thr Ile Ser Phe
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 70
His Pro Phe Gly Tyr Asp Leu Thr Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 71
Val Pro Arg Asn Gln Asp Glu Ser Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 72
Asp Val Ser Asp Lys Ile Thr Phe Met
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 73
Asp Glu Ser Lys Tyr Thr Trp Ser Trp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 74
Leu Glu Asn Met Tyr Asp Leu Thr Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 75
Gln Glu Val Asp Ile Ser Leu His Tyr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 76
Thr Tyr Leu Pro Thr Asp Ala Ser Leu Ser Phe
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 77
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 78
Asp Glu Thr Ile Trp Tyr Val Arg Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 79
Phe Thr Asp Thr Ser Ser Tyr Glu Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 80
Leu Thr Asn Asp Gln Thr Leu Arg Leu
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 81
Val Thr Glu Thr Met Gly Ile Asp Gly Ser Ala Tyr
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
Val Thr Asp Val Thr Glu Glu His Tyr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
Thr Phe Val Asp Ala Ser Arg Thr Leu Tyr
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 84
Glu Val Glu Gly Val Ile Asp Gly Thr Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
Glu Val Gln Asp His Ser Thr Ser Ser Tyr
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
Ile Leu Pro Asp Ile Thr Thr Thr Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
Ile Thr Asp Asp Thr Val Gln Thr Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
Trp Leu Asp Arg Ser Thr Ile Leu Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 89
His Val Ser Asp Val Thr Val Asn Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 90
His Val Asp Asn Ser Asn Leu Asn Tyr
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 91
Gly Val Asp Asp Thr Ser Leu Leu Tyr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 92
Gly Gln Tyr Asp Asp Ser Leu Gln Ala Tyr
1 5 10
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 93
His Ala Asp Leu Thr Thr Leu Thr Phe
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 94
Tyr Ser Ile Asp Val Thr Asn Val Met
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 95
Val Tyr Ile Asp Asp Ser Val Glu Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 96
Ile Phe Val Pro Thr Asp Arg Ser Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 97
Arg Tyr Val Asn Asp Tyr Thr Asn Ser Phe
1 5 10
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
Ala Phe Asp Lys Thr Ile Val Lys Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 99
Val Tyr Val Asp Thr Thr Glu Leu Ala Leu
1 5 10
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 100
Glu Tyr Gln Asp Phe Ser Thr Leu Phe
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 101
Val Tyr Leu Asp Ala Ser Lys Val Pro Gly Phe
1 5 10
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
Ile Tyr Pro Asp Gly Thr Leu Leu Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
Arg Gln Asp Glu Ser Tyr Leu Asn Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
His Leu Phe Tyr Asp Val Thr Val Phe
1 5
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 105
Asn Pro Ala Asp Ile Ser Val Ala Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
Ser Pro Lys Ile Phe Asp Ser Ser Trp
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 107
Gly Glu Pro Thr Ser Asp Ile Thr Leu Leu
1 5 10
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 108
Asp Glu Thr His Thr Leu Gln Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 109
Asp Glu Thr Ala Ala Tyr Lys Ile Met
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 110
Ala Glu Ser Leu Ala Val His Asp Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 111
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asp Leu
1 5
<210> 112
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 112
Ala Glu Phe Phe Asp Tyr Thr Val Arg Thr Leu
1 5 10
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 113
Thr Asp Phe Thr Lys Ile Ala Ser Phe
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 114
Val His Asn Phe Thr Leu Pro Ser Trp
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 115
Phe Phe Gln Asn Ser Thr Phe Ser Phe
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 116
Ile Val Arg Asn Leu Ser Cys Arg Lys
1 5
<210> 117
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 117
Tyr Ile Asp Asn Val Thr Leu Ile
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 118
Gly Tyr Ile Asp Asn Val Thr Leu Ile
1 5
<210> 119
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 119
Ile Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr
1 5 10
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 120
Val Thr Arg Asn Asp Thr Ala Ser Tyr
1 5
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 121
Ala Gln Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp
1 5
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 122
Ile Phe Asn Glu Thr Gly Arg Phe
1 5
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 123
Gln Val Asn Gly Ser Leu Leu Val Ile
1 5
<210> 124
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 124
Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu Phe
1 5 10
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 125
Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu Phe
1 5
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 126
Thr Ala Asn Tyr Asn Thr Ser His Tyr
1 5
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 127
Trp Ser Asn Trp Ser Asn Pro Ala Tyr
1 5
<210> 128
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 128
Thr Glu Gly Asn Phe Thr Lys Glu Ala Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 129
Val Thr Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr
1 5
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 130
Asp Ile Leu Asn Arg Thr Gly His Gln Leu
1 5 10
<210> 131
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 131
Gly Thr Asp Lys Gln Asn Ser Thr Leu Arg Tyr
1 5 10
<210> 132
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 132
Met Thr Asp Val Asp Arg Asn Gly Thr Thr Ala Tyr
1 5 10
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 133
Thr Ser Asn Thr Ser Gln Tyr Asp Thr Tyr
1 5 10
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 134
Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 135
Asn Leu Tyr Asn Trp Ser Ala Ser Tyr
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 136
Ser Tyr Asn Glu Thr Lys Ile Lys Phe
1 5
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 137
Phe Tyr Asn Asn Ser Val Ile Ile Phe
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 138
Phe Thr Asp Leu Ile Thr Asn Glu Ser Ile Asn Tyr
1 5 10
<210> 139
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 139
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1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 140
Asp Glu Ala Val Arg Asn Ile Thr Trp
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 141
Pro Ser Asn Leu Ser Val Phe Thr Ser Tyr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 142
Arg Leu Trp Asn Phe Thr Met Asn Ala Lys
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 144
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 146
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<213> 人工序列
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<223> 合成
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<213> 人工序列
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<223> 合成
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Lys Leu Thr Asn Asn Ser Asn Gln Phe
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 152
Leu Pro Phe Phe Thr Asn Lys Thr Leu Ser Phe
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 153
Leu Ser Asn Leu Thr Cys Asn Asn Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 154
Asn Tyr Leu Leu Tyr Val Ser Asn Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 155
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 156
Phe Phe Thr Asn Lys Thr Leu Ser Phe
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 157
Lys Glu Asn Gln Asn His Ser Tyr Ser Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 158
Tyr Phe Val Asn Val Thr Thr Arg Ile
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 159
Lys Glu Val Asn Asp Thr Leu Leu Val Asn Glu Leu
1 5 10
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 160
Arg Leu Pro Ala Ala Asn Phe Thr Arg Tyr
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 161
Phe Pro Tyr Tyr Leu Lys Ile Asn Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 162
Pro Ser Asn Gly Ser Met His Asn Tyr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 163
Arg Ser Ile Asn Val Thr Gly Gln Gly Phe
1 5 10
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 164
Arg Val Asp Asn Ile Thr Asp Gln Phe
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 165
Leu Thr Glu Val Glu Lys Asn Ala Thr Ala Leu Tyr
1 5 10
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 166
Ser Leu Ile Asn Ile Thr His Gly Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 167
Gln Tyr Gln Asn Thr Thr Val Ser Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 168
Val Tyr Thr Asn Ile Ser His His Phe
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 169
Ile Tyr Leu Asn Arg Thr Leu Leu Thr Thr Ile
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<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 170
Phe Tyr Asn Leu Ser Ile Gln Ser Phe
1 5
<210> 171
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 171
Gly Thr Asn Gln Thr Gly Lys Gly Leu Glu Tyr
1 5 10
<210> 172
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 172
Ile Leu Phe Ser Asn Ser Thr Arg Leu Ser Phe
1 5 10
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 173
His Val Lys Asn Ala Thr Met Gly Tyr
1 5
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 174
Lys Ala Tyr Asn Gln Thr His Leu Tyr
1 5
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 175
His Pro Asn Leu Thr Ser Met Thr Phe
1 5
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 176
His Leu Tyr Tyr Asn Val Thr Glu Lys
1 5
<210> 177
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 177
Phe His Tyr Asn Asp Thr Ala Gly Tyr Phe
1 5 10
<210> 178
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 178
Ile Tyr Gln Phe Ala Arg Leu Asn Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 179
Tyr His Asn Gln Thr Ile Ser Phe
1 5
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 180
Gln Ala Ile Asn Leu Ser Leu Asn Phe
1 5
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 181
Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu
1 5
<210> 182
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 182
Lys Ser Tyr His Asn Gln Thr Ile Ser Phe
1 5 10
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 183
His Pro Phe Gly Tyr Asn Leu Thr Leu
1 5
<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 184
Val Pro Arg Asn Gln Asn Glu Ser Val
1 5
<210> 185
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 185
Asn Val Ser Asp Lys Ile Thr Phe Met
1 5
<210> 186
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 186
Asn Glu Ser Lys Tyr Thr Trp Ser Trp
1 5
<210> 187
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 187
Leu Glu Asn Met Tyr Asn Leu Thr Phe
1 5
<210> 188
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 188
Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr
1 5
<210> 189
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 189
Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe
1 5 10
<210> 190
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 190
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 191
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 191
Asn Glu Thr Ile Trp Tyr Val Arg Phe
1 5
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 192
Phe Thr Asn Thr Ser Ser Tyr Glu Tyr
1 5
<210> 193
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 193
Leu Thr Asn Asn Gln Thr Leu Arg Leu
1 5
<210> 194
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 194
Val Thr Glu Thr Met Gly Ile Asn Gly Ser Ala Tyr
1 5 10
<210> 195
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 195
Val Thr Asn Val Thr Glu Glu His Tyr
1 5
<210> 196
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 196
Thr Phe Val Asn Ala Ser Arg Thr Leu Tyr
1 5 10
<210> 197
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 197
Glu Val Glu Gly Val Ile Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 198
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 198
Glu Val Gln Asn His Ser Thr Ser Ser Tyr
1 5 10
<210> 199
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 199
Ile Leu Pro Asn Ile Thr Thr Thr Tyr
1 5
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 200
Ile Thr Asn Asp Thr Val Gln Thr Tyr
1 5
<210> 201
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 201
Trp Leu Asn Arg Ser Thr Ile Leu Tyr
1 5
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 202
His Val Ser Asn Val Thr Val Asn Tyr
1 5
<210> 203
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 203
His Val Asn Asn Ser Asn Leu Asn Tyr
1 5
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 204
Gly Val Asn Asp Thr Ser Leu Leu Tyr
1 5
<210> 205
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 205
Gly Gln Tyr Asn Asp Ser Leu Gln Ala Tyr
1 5 10
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 206
His Ala Asn Leu Thr Thr Leu Thr Phe
1 5
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 207
Tyr Ser Ile Asn Val Thr Asn Val Met
1 5
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 208
Val Tyr Ile Asn Asp Ser Val Glu Leu
1 5
<210> 209
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 209
Ile Phe Val Pro Thr Asn Arg Ser Leu
1 5
<210> 210
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 210
Arg Tyr Val Asn Asn Tyr Thr Asn Ser Phe
1 5 10
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 211
Ala Phe Asn Lys Thr Ile Val Lys Leu
1 5
<210> 212
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 212
Val Tyr Val Asn Thr Thr Glu Leu Ala Leu
1 5 10
<210> 213
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 213
Glu Tyr Gln Asn Phe Ser Thr Leu Phe
1 5
<210> 214
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 214
Val Tyr Leu Asn Ala Ser Lys Val Pro Gly Phe
1 5 10
<210> 215
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 215
Ile Tyr Pro Asn Gly Thr Leu Leu Ile
1 5
<210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 216
Arg Gln Asn Glu Ser Tyr Leu Asn Phe
1 5
<210> 217
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 217
His Leu Phe Tyr Asn Val Thr Val Phe
1 5
<210> 218
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 218
Asn Pro Ala Asn Ile Ser Val Ala Leu
1 5
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 219
Ser Pro Lys Ile Phe Asn Ser Ser Trp
1 5
<210> 220
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 220
Gly Glu Pro Thr Ser Asn Ile Thr Leu Leu
1 5 10
<210> 221
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 221
Asn Glu Thr His Thr Leu Gln Phe
1 5
<210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 222
Asn Glu Thr Ala Ala Tyr Lys Ile Met
1 5
<210> 223
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 223
Ala Glu Ser Leu Ala Val His Asn Ile
1 5
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 224
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu
1 5
<210> 225
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 225
Ala Glu Phe Phe Asn Tyr Thr Val Arg Thr Leu
1 5 10
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 226
Thr Asn Phe Thr Lys Ile Ala Ser Phe
1 5
<210> 227
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 227
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5 10
<210> 228
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 228
Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile
1 5
<210> 229
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 229
Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5

Claims (21)

1.一种肽或其医药学上可接受的盐，所述肽包含选自由以下各项组成的群组的氨基酸序列：
·SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113，
·及其变异体序列，其维持结合至MHC分子的能力和/或诱导T细胞与该变异体肽的交叉反应。
2.权利要求1所述的肽，其中
·该肽具有结合至MHC I类别分子的能力，和/或
·其中该肽在结合至该MHC时能够被CD4和/或CD8 T细胞识别。
3.权利要求1至2中任一项所述的肽或其变异体，其中该肽或其变异体具有8至30个氨基酸的总长度。
4.权利要求1至3中任一项所述的肽或其变异体，其中该肽包括非肽键。
5.权利要求1至4中任一项所述的肽或其变异体，其中该肽是融合蛋白质的部分。
6.一种抗体或其功能片段，其特异性地识别或结合至权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体，或结合至在结合至MHC分子时的权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体。
7.一种T细胞受体或其功能片段，其与MHC配位体反应或结合至MHC配位体，其中该配位体为权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体，或为在结合至MHC分子时的权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体。
8.一种核酸，其编码权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体、权利要求6所述的抗体或其片段、或权利要求7所述的T细胞受体或其片段。
9.一种重组寄主细胞，其包含权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体、权利要求6所述的抗体或其片段、权利要求7所述的T细胞受体或其片段或权利要求8所述的核酸或表达载体。
10.一种用于产生活化T淋巴细胞的体外方法，该方法包含将T细胞与适合的抗原提呈细胞或模拟抗原提呈细胞的人工构建体的表面上表达的载入抗原的人类MHC I类或II类分子体外接触达足以以抗原特异性方式活化该T细胞的一段时间，其中该抗原为权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体。
11.一种藉由权利要求11所述的方法产生的活化T淋巴细胞，所述活化T淋巴细胞选择性地识别提呈权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体的细胞。
12.一种医药组合物，其包含选自由以下各项组成的群组的至少一种活性成分：
·权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体，
·权利要求6所述的抗体或其片段，
·权利要求7所述的T细胞受体或其片段，
·权利要求8所述的核酸或表达载体，
·权利要求9所述的寄主细胞，
·或权利要求10所述的活化T淋巴细胞，
及医药学上可接受的载剂。
13.一种用于产生权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体、权利要求6所述的抗体或其片段或权利要求7所述的T细胞受体或其片段的方法，该方法包含培养权利要求9所述的寄主细胞，且自该寄主细胞和/或其培养基分离该肽或其变异体、该抗体或其片段或该T细胞受体或其片段。
14.用于药物或用于制造药物的权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体、权利要求6所述的抗体或其片段、权利要求7所述的T细胞受体或其片段、权利要求8所述的核酸或表达载体、权利要求9所述的寄主细胞或权利要求11所述的活化T淋巴细胞。
15.一种杀伤患者中的靶细胞的方法，该靶细胞提呈包含权利要求1至5中任一项所给出的氨基酸序列的多肽，该方法包含向该患者给药有效量的权利要求11所述的活化T淋巴细胞。
16.权利要求11所述的活化T淋巴细胞，所述活化T淋巴细胞
a)用于该杀伤患者中的靶细胞，该靶细胞提呈包含权利要求1至5中任一项所给出的氨基酸序列的多肽，或
b)用于制造用于杀伤此类靶细胞的药剂。
17.一种治疗患者的方法，该患者
·被诊断为患癌症，
·罹患癌症，或
·有患上癌症的风险，
该方法包含向该患者给药有效量的权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体、权利要求6所述的抗体或其片段、权利要求7所述的T细胞受体或其片段、权利要求8所述的核酸或表达载体、权利要求9所述的寄主细胞或权利要求11所述的活化T淋巴细胞。
18.用于治疗患者或用于制造用于治疗此患者的药剂的权利要求1至5中任一项所述的肽或其变异体、权利要求6所述的抗体或其片段、权利要求7所述的T细胞受体或其片段、权利要求8所述的核酸或表达载体、权利要求9所述的寄主细胞、或权利要求11所述的活化T淋巴细胞，该患者
·被诊断为患癌症，
·罹患癌症，或
·有患上癌症的风险。
19.权利要求17所述的方法或权利要求18所述的肽、抗体、T细胞受体、核酸、寄主细胞或活化T淋巴细胞的用途，其中该癌症选自由以下各项组成的群组：急性骨髓性白血病、乳癌、胆管细胞癌、慢性淋巴球性白血病、结肠直肠癌、胆囊癌、神经胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管结合部癌、肝细胞癌、头及颈鳞状细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌及子宫内膜癌。
20.一种试剂盒，其包含：
(a)容器，该容器包含医药组合物，该医药组合物含有呈溶液或呈冻干形式的权利要求12所述的医药组合物；
(b)可选地，第二容器，该第二容器含有用于冻干制剂的稀释剂或重构溶液；
(c)可选地，选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:113组成的群组的至少一或多种肽。
21.权利要求20所述的试剂盒，其进一步包含缓冲液、稀释剂、过滤器、针、或注射器中的一种或多种。
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