JP2020530281A5

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Filing date: 2018-07-05
Publication date: 2021-08-12
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Description

[本発明1001]
（ｉ）異種レセプター遺伝子と；
（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターであって、
該レポーターの発現は、該レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、
該レポーターは、該異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、
誘導性レポーターと
を含む、核酸。
[本発明1002]
本発明1001の核酸を含むベクター。
[本発明1003]
異種レセプター遺伝子を含むベクター。
[本発明1004]
誘導性レポーターをさらに含み、該レポーターの発現が、前記レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、該レポーターが、前記異種レセプター遺伝子に固有のインデックス領域を含むバーコードを含む、本発明1003のベクター。
[本発明1005]
誘導性レポーターを含むベクターであって、該レポーターがバーコードを含む、ベクター。
[本発明1006]
前記レセプター遺伝子がＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）をコードする、本発明1002〜1004のいずれかのベクター。
[本発明1007]
前記レセプター遺伝子が、補助ポリペプチドをコードする1つ以上のさらなるポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1002〜1006のいずれかのベクター。
[本発明1008]
前記補助ポリペプチドが、選択可能またはスクリーニング可能なタンパク質を含む、本発明1007のベクター。
[本発明1009]
前記補助ポリペプチドがタンパク質タグを含む、本発明1007または1008のベクター。
[本発明1010]
前記補助ポリペプチドが転写因子を含む、本発明1007〜1008のいずれかのベクター。
[本発明1011]
前記レセプター遺伝子が、レセプター遺伝子および補助ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、本発明1010のベクター。
[本発明1012]
前記融合タンパク質が、レセプター遺伝子と補助ポリペプチドとの間にプロテアーゼ部位を含む、本発明1011のベクター。
[本発明1013]
前記補助ポリペプチドが、1つ以上の輸送タグを含む、本発明1002〜1012のいずれかのベクター。
[本発明1014]
前記補助ポリペプチドが2つの輸送タグを含む、本発明1013のベクター。
[本発明1015]
前記輸送タグが、Ｌｕｃｙおよび／またはＲｈｏタグを含む、本発明1013または1014のベクター。
[本発明1016]
前記レポーターが、ＧＰＣＲの活性化時のシグナル伝達によって誘導される、本発明1002〜1015のいずれかのベクター。
[本発明1017]
前記レセプター応答性エレメントが、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、活性化Ｔ細胞応答要素の核因子（ＮＦＡＴ−ＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ）、がおよび血清応答因子応答エレメント（ＳＲＦ−ＲＥ）のうちの1つ以上を含む、本発明1002〜1016のいずれかのベクター。
[本発明1018]
前記レセプター応答性エレメントがＣＲＥを含む、本発明1017のベクター。
[本発明1019]
前記ＣＲＥが、配列番号1の少なくとも5つの繰り返しを含む、本発明1018のベクター。
[本発明1020]
前記レセプター応答性エレメントが、前記補助ポリペプチド転写因子によって結合されるＤＮＡエレメントを含む、本発明1010〜1019のいずれかのベクター。
[本発明1021]
前記補助ポリペプチド転写因子が逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）を含み、前記レセプター応答性エレメントがテトラサイクリン応答性エレメント（ＴＲＥ）を含む、本発明1020のベクター。
[本発明1022]
ＧＰＣＲが嗅覚レセプター（ＯＲ）である、本発明1006〜1021のいずれかのベクター。
[本発明1023]
前記レセプターがアドレナリンレセプターを含む、本発明1002〜1022のいずれかのベクター。
[本発明1024]
前記アドレナリンレセプターがβ−2アドレナリンレセプターを含む、本発明1023のベクター。
[本発明1025]
前記レセプター遺伝子が核ホルモンレセプター遺伝子を含む、本発明1002〜1022のいずれかのベクター。
[本発明1026]
レセプター遺伝子がレセプターチロシンキナーゼ遺伝子を含む、本発明1002〜1022のいずれかのベクター。
[本発明1027]
前記レセプターが膜貫通レセプターである、本発明1002〜1026のいずれかのベクター。
[本発明1028]
前記レセプターが細胞内レセプターである、本発明1002〜1026のいずれかのベクター。
[本発明1029]
ウイルスベクターを含む、本発明1002〜1028のいずれかのベクター。
[本発明1030]
レンチウイルスベクターを含む、本発明1029のベクター。
[本発明1031]
前記レセプター遺伝子が構成的プロモーターを含む、本発明1002〜1029のいずれかのベクター。
[本発明1032]
前記レセプター遺伝子が条件的プロモーターを含む、本発明1002〜1029のいずれかのベクター。
本発明1032．1
前記異種レセプター遺伝子が、条件的プロモーターに作動可能に連結される、本発明1002〜1032のいずれかのベクター。
本発明1032．2
前記条件的プロモーターがテトラサイクリン応答エレメントである、本発明1032．1のベクター。
[本発明1033]
バーコードが少なくとも10個の核酸である、本発明1002〜1032のいずれかのベクター。
[本発明1034]
前記レポーターが、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むか、またはさらに含み、
前記遺伝子が、3’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、
本発明1002〜1032のいずれかのベクター。
[本発明1035]
前記バーコードが、蛍光タンパク質の遺伝子の3’ＵＴＲに位置する、本発明1034のベクター。
[本発明1036]
前記ＯＲＦが、選択可能またはスクリーニング可能なタンパク質をコードする、本発明1034または1035のベクター。
[本発明1037]
前記ＯＲＦがルシフェラーゼタンパク質をコードする、本発明1036のベクター。
[本発明1038]
レセプター遺伝子が、5’末端および／または3’末端でインスレーター配列に隣接している、本発明1002〜1037のいずれかのベクター。
[本発明1039]
レポーターが、5’および／または3’末端でインスレーター配列に隣接している、本発明1002〜1037のいずれかのベクター。
[本発明1040]
インスレーターがｃＨＳ4インスレーターを含む、本発明1038または1039のベクター。
[本発明1041]
第2、第3、または第4のバーコードを含む、本発明1002〜1040のいずれかのベクター。
[本発明1042]
前記第2、第3、または第4のバーコードのうちの少なくとも1つが、アッセイ条件またはマイクロプレート上の位置の1つまたは複数に固有のインデックス領域を含む、本発明1041のベクター。
[本発明1043]
本発明1002〜1040のいずれかのベクターを含むウイルス粒子。
[本発明1044]
本発明1003〜1039のいずれかのベクターまたは本発明1043のウイルス粒子を含む、細胞。
本発明1044．1
本発明1002〜1042のいずれかのベクターの複数のコピーを含む細胞。
本発明1044．2
前記ベクターの少なくとも3つのコピーを含む、本発明1044．1の細胞。
[本発明1045]
細胞の集団であって、
各細胞は、
（ｉ）異種レセプター遺伝子と；
（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターであって、
該レポーターの発現は、該レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、
該レポーターは、該異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、
誘導性レポーターと
を含み、
前記細胞は、異なる異種レセプターを発現し、各単一の細胞は、1つの特定の異種レセプターの1つ以上のコピーおよび1つの特定のレポーターの1つ以上のコピーを有する、
細胞の集団。
[本発明1046]
（ｉ）異種レセプター遺伝子と；
（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターであって、
該レポーターの発現は、該レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、
該レポーターは、該異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、
誘導性レポーターと
を含む、細胞。
[本発明1047]
前記レセプター遺伝子がＧＰＣＲをコードする、本発明1044．2〜1046のいずれかの細胞。
[本発明1048]
前記レポーターが、ＧＰＣＲの活性化時のシグナル伝達によって誘導される、本発明1047の細胞。
[本発明1049]
前記レセプター遺伝子が、補助ポリペプチドをコードする1つ以上のさらなるポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1044．2〜1048のいずれかの細胞。
[本発明1050]
前記補助ポリペプチドが、選択可能またはスクリーニング可能なタンパク質を含む、本発明1049の細胞。
[本発明1051]
前記補助ポリペプチドがタンパク質タグを含む、本発明1049または1050の細胞。
[本発明1052]
前記補助ポリペプチドが転写因子を含む、本発明1049〜1051のいずれかの細胞。
[本発明1053]
前記レセプター遺伝子が、該レセプター遺伝子および前記補助ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、本発明1049〜1052のいずれかの細胞。
[本発明1054]
前記融合タンパク質が、レセプター遺伝子と補助ポリペプチドとの間にプロテアーゼ部位を含む、本発明1053の細胞。
[本発明1055]
前記誘導性レポーターが、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、活性化Ｔ細胞応答エレメントの核因子（ＮＦＡＴ−ＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ）、および血清応答因子応答エレメント（ＳＲＦ−ＲＥ）のうちの1つ以上を含む、本発明1047〜1054のいずれかの細胞。
[本発明1056]
前記ＧＰＣＲが嗅覚レセプター（ＯＲ）である、本発明1047〜1055のいずれかの細胞。
[本発明1057]
1つ以上のアクセサリータンパク質をコードする1つ以上の遺伝子をさらに含む、本発明1044〜1056のいずれかの細胞。
[本発明1058]
前記1つ以上のアクセサリータンパク質が、Ｇαサブユニット、Ｒｉｃ−8Ｂ、ＲＴＰ1Ｌ、ＲＴＰ2、ＲＴＰ3、ＲＴＰ4、ＣＨＭＲ3、およびＲＴＰ1Ｓのうちの1つ以上を含む、本発明1057の細胞。
本発明1058．1
前記細胞が、1つ以上のアクセサリー因子遺伝子をコードする1つ以上の外因性ヌクレオチドの安定な組み込みを含み、アクセサリー因子遺伝子が、ＲＴＰ1Ｓ、ＲＴＰ2、Ｇαサブユニット、およびＲｉｃ−8ｂを含む、本発明1044．2〜1058のいずれかの細胞。
[本発明1059]
前記1つ以上のアクセサリータンパク質がアレスチンタンパク質を含む、本発明1057の細胞。
[本発明1060]
前記アレスチンタンパク質がプロテアーゼに融合されている、本発明1059の細胞。
[本発明1061]
前記レセプター遺伝子が核ホルモンレセプター遺伝子を含む、本発明1044．2〜1060のいずれかの細胞。
[本発明1062]
前記レセプター遺伝子がレセプターチロシンキナーゼ遺伝子を含む、本発明1044．2〜1061のいずれかの細胞。
[本発明1063]
レセプターが膜貫通レセプターである、本発明1044．2〜1062のいずれかの細胞。
[本発明1064]
前記1つ以上のアクセサリータンパク質が、シャペロンタンパク質、Ｇタンパク質、およびグアニンヌクレオチド交換因子の1つ以上を含む、本発明1057〜1063のいずれかの細胞。
[本発明1065]
前記異種レセプター遺伝子から発現されるレセプタータンパク質をさらに含む、本発明1044．2〜1064のいずれかの細胞。
g [本発明1066]
前記レセプタータンパク質が細胞内に局在する、本発明1065の細胞。
[本発明1067]
前記異種レセプター遺伝子と少なくとも80％同一であるタンパク質をコードする内因性遺伝子を欠いている、本発明1044．2〜1066のいずれかの細胞。
[本発明1068]
前記レセプター遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれている、本発明1044．2〜1067のいずれかの細胞。
[本発明1069]
前記誘導性レポーターが細胞のゲノムに組み込まれている、本発明1044．2〜1068のいずれかの細胞。
[本発明1070]
前記レセプター遺伝子および誘導性レポーターが遺伝的に連結されている、本発明1068または1069の細胞。
[本発明1071]
前記レセプター遺伝子および誘導性レポーターが遺伝的に連結されていない、本発明1068または1069の細胞。
[本発明1072]
組み込まれた前記レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターが、標的指向させた組み込みによって組み込まれている、本発明1068〜1071のいずれかの細胞。
[本発明1073]
前記組み込みが、Ｈ11セーフハーバー遺伝子座内である、本発明1072の細胞。
[本発明1074]
組み込まれた前記レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターが、ゲノムにランダムに組み込まれている、本発明1068〜1071のいずれかの細胞。
[本発明1075]
前記ランダムな組み込みが、前記レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターの転位を含む、本発明1074の細胞。
[本発明1076]
少なくとも2コピーのレセプター遺伝子および／または誘導性レポーターを含む、本発明1044．2〜1075のいずれかの細胞。
[本発明1077]
前記レセプター遺伝子が構成的プロモーターを含む、本発明1044．2〜1076のいずれかの細胞。
[本発明1078]
前記レセプターの発現が構成的である、本発明1065〜1077のいずれかの細胞。
[本発明1079]
前記レセプター遺伝子が条件的プロモーターを含む、本発明1044．2〜1076のいずれかの細胞。
[本発明1080]
前記レセプターの発現が条件的である、本発明1065〜1076または1079のいずれかの細胞。
[本発明1081]
前記バーコードおよび／またはインデックス領域が少なくとも10個の核酸である、本発明1044．2〜1080のいずれかの細胞。
[本発明1082]
前記レポーターが蛍光タンパク質の遺伝子を含むか、またはさらに含み、該遺伝子が3’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、本発明1044．2〜1081のいずれかの細胞。
[本発明1083]
前記バーコードが、前記蛍光タンパク質の遺伝子の3’ＵＴＲに位置する、本発明1082の細胞。
[本発明1084]
前記遺伝子がルシフェラーゼタンパク質をコードする、本発明1082または1083に細胞の細胞。
[本発明1085]
前記レセプター遺伝子が、5’末端および3’末端でインスレーター配列に隣接している、本発明1068〜1084のいずれかの細胞。
[本発明1086]
前記レポーターが、5’および3’末端でインスレーター配列に隣接している、本発明1068〜1085のいずれかの細胞。
[本発明1087]
前記異種レセプターの発現レベルが、生理学的に関連する発現レベルである、本発明1044．2〜1086のいずれかの細胞。
[本発明1088]
凍結されている、本発明1044．2〜1087のいずれかの細胞。
[本発明1089]
哺乳動物細胞である、本発明1044．2〜1088のいずれかの細胞。
[本発明1090]
ヒト胎児由来腎臓293Ｔ（ＨＥＫ293Ｔ）細胞である、本発明1090の細胞。
[本発明1091]
本発明1044〜1090のいずれかの細胞を含むアッセイシステム。
[本発明1092]
リガンドおよびレセプターの結合をスクリーニングするための方法であって、
本発明1044〜1090のいずれかの細胞をリガンドと接触させる工程と、
1つ以上のレポーターを検出する工程と、
1つ以上のレポーターの同一性を決定する工程と
を含み、
前記レポーターの同一性は、結合したレセプターの同一性を示す、
方法。
[本発明1093]
前記レポーターの同一性を決定する工程が、細胞から核酸を単離することを含む、本発明1092の方法。
[本発明1094]
前記核酸がＲＮＡを含む、本発明1093の方法。
[本発明1095]
前記単離されたＲＮＡに対して逆転写酵素反応を行ってｃＤＮＡを作製する工程をさらに含む、本発明1094の方法。
[本発明1096]
前記ＲＴが前記溶解物中で行われる、本発明1095の方法。
[本発明1097]
前記単離された核酸を増幅する工程をさらに含む、本発明1093〜1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
単離された前記核酸を配列決定する工程をさらに含む、本発明1093〜1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
前記1つ以上のレポーターを検出する工程が、前記細胞からの蛍光レベルを検出することを含む、本発明1092〜1098のいずれかの方法。
[本発明1100]
少なくとも2つの異なる異種レセプターが前記細胞において発現される、本発明1092〜1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
細胞の集団が1つの組成物中で共混合される、本発明1092〜1100のいずれかの方法。
[本発明1102]
細胞の集団が基材に接着している、本発明1092〜1101のいずれかの方法。
[本発明1103]
細胞の集団が、基材の1つのウェル内または1つの細胞培養皿内に含まれる、本発明1092〜1102のいずれかの方法。
[本発明1104]
前記細胞をプレーティングする工程をさらに含む、本発明1092〜1103のいずれかの方法。
[本発明1105]
前記細胞が96ウェル細胞培養プレート上にプレーティングされる、本発明1104の方法。
[本発明1106]
前記細胞が凍結されており、前記方法が、凍結された細胞を解凍する工程をさらに含む、本発明1092〜1105のいずれかの方法。
[本発明1107]
以下の工程を含む、リガンドおよびレセプターの結合をスクリーニングするための方法:
細胞の集団をリガンドと接触させる工程であって、
細胞の集団の各細胞は、
（ｉ）異種レセプター遺伝子と；
（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターであって、
該レポーターの発現は、該レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、
該レポーターは、該異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、
誘導性レポーターと
を含み、
前記細胞の集団は、前記異種レセプター遺伝子に由来する少なくとも300個の異なるレセプターを発現し、各単一の細胞は、1つの特定の異種レセプターの1つ以上のコピーおよび1つの特定のレポーターの1つ以上のコピーを有する、
工程と、
1つ以上のレポーターを検出する工程と、
1つ以上のレポーターの同一性を決定する工程であって、レポーターの同一性は、結合したレセプターの同一性を示す、工程。
[本発明1108]
少なくとも2つの異なるベクターを含むベクターライブラリーであって、該ベクターが、異なる異種レセプター遺伝子および異なる誘導性レポーターを含む、ベクターライブラリー。
[本発明1109]
本発明1045〜1090のいずれかの細胞の集団を含む細胞ライブラリー。
[本発明1110]
前記ウイルス粒子が、異なる異種レセプター遺伝子および異なる誘導性レポーターを含む、本発明1043の少なくとも2つのウイルス粒子を含むウイルスライブラリー。
[本発明1111]
レセプタータンパク質を含む細胞のライブラリーを作製するための方法であって、
（ｉ）本発明1001の核酸もしくは本発明1002〜1039のいずれかのベクターを細胞中で発現させる工程；または
（ｉｉ）細胞を本発明1043のウイルスに感染させる工程
を含み、
前記細胞は、異なる異種レセプターを発現し、各単一の細胞は、1つの特定の異種レセプターの1つ以上のコピーおよび1つの特定のレポーターの1つ以上のコピーを発現する、方法。
[本発明1112]
本発明1108〜1110のいずれかのライブラリーを含むキット。
[本発明1113]
（ｉ）誘導性プロモーターに作動可能に連結された異種レセプター遺伝子と；
（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含むレポーターであって、
該レポーターの発現は、異種レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、
該レポーターは、該異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、
レポーターと
を含む、核酸。
[本発明1114]
本発明1113の核酸の少なくとも2コピー〜少なくとも6コピーを含む、細胞。
本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な記載から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示してはいるが、それらは例示としてのみ提示されていることを理解すべきである。なぜなら、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変は、この詳細な説明から、当業者には明らかだからである。

Claims

哺乳動物細胞の集団であって、
各哺乳動物細胞は、
（ｉ）異種レセプター遺伝子と；
（ｉｉ）レセプター応答性エレメントを含む誘導性レポーターであって、
該誘導性レポーターが、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、活性化Ｔ細胞応答エレメントの核因子（ＮＦＡＴ−ＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ）、および血清応答因子応答エレメント（ＳＲＦ−ＲＥ）のうちの１つ以上を含み、
該レポーターの発現は、該レセプター遺伝子によってコードされるレセプターの活性の活性化に依存し、
該レポーターは、該異種レセプター遺伝子に固有であるインデックス領域を含むバーコードを含む、
誘導性レポーターと
を含み、
前記細胞は、異なる異種レセプターを発現し、各単一の細胞は、１つの特定の異種レセプターの１つ以上のコピーおよび１つの特定のレポーターの１つ以上のコピーを有する、
細胞の集団。
前記レセプター遺伝子がＧＰＣＲをコードする、請求項１に記載の細胞。
１つ以上のアクセサリータンパク質をコードする１つ以上の遺伝子をさらに含み、任意で、該１つ以上のアクセサリータンパク質が、Ｇαサブユニット、Ｒｉｃ−８Ｂ、ＲＴＰ１Ｌ、ＲＴＰ２、ＲＴＰ３、ＲＴＰ４、ＣＨＭＲ３、およびＲＴＰ１Ｓのうちの１つ以上を含む、請求項１または２に記載の細胞。
前記異種レセプター遺伝子と少なくとも８０％同一であるタンパク質をコードする内因性遺伝子を欠いている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
前記レセプター遺伝子および／または前記誘導性レポーターが細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
組み込まれた前記レセプター遺伝子および／または誘導性レポーターが、標的指向させた組み込みによって組み込まれている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
前記組み込みが、Ｈ１１セーフハーバー遺伝子座内である、請求項６に記載の細胞。
少なくとも２コピーのレセプター遺伝子および／または誘導性レポーターを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞。
前記レセプター遺伝子が条件的プロモーターを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
前記レセプターの発現が条件的である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞。
前記バーコードおよび／またはインデックス領域が少なくとも１０個の核酸である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
前記レポーターが蛍光タンパク質の遺伝子を含むか、またはさらに含み、該遺伝子が３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
前記遺伝子がルシフェラーゼタンパク質をコードする、請求項１２に記載の細胞。
前記レセプター遺伝子が、５’末端および３’末端でインスレーター配列に隣接している、および／または前記レポーターが、５’および３’末端でインスレーター配列に隣接している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
リガンドおよびレセプターの結合をスクリーニングするための方法であって、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞をリガンドと接触させる工程と、
１つ以上のレポーターを検出する工程と、
１つ以上のレポーターの同一性を決定する工程と
を含み、
前記レポーターの同一性は、結合したレセプターの同一性を示す、
方法。