JP2020525042A - 成人t細胞白血病/リンパ腫(atl)のモニタリング法 - Google Patents
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Abstract
Description
、多臓器不全、および/または頻繁な日和見感染などがある。ATLは、血液合併症、循環異常リンパ球の有無、並びに高カルシウム血レベルおよび乳酸脱水素酵素(LDH)レベルを含む生物学的パラメーターに基づいて、急性型、リンパ腫型、くすぶり型および慢性型の4種類の病型に分類されている。この病型分類に患者の治療計画および予後は大きく影響される。高悪性度の病型を患う患者の予後は非常に悪く、生存期間中央値は急性白血病性型の場合で4〜6か月間、リンパ腫型の場合で9〜10か月である。低悪性度(indolent)型の予後はより有望であり、慢性型およびくすぶり型の全生存期間中央値はそれぞれ33か月間および51か月間である。
がある。HTLV−1感染無症候性キャリアおよび非悪性HTLV−1関連疾患は、宿主ゲノム内のプロウイルス組み込み部位によってそれぞれ一意に同定される、存在量が異なる多数のクローンを特徴としているが、ATLの発症は、多クローン性の感染細胞集団を根底とした、単一の優勢クローンの出現が関連している。現在までに検査されたATL症例の大部分で、推定悪性クローンは、単一のプロウイルス組込を保有している。
undance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood 117:3113-3122, 2011)では、各ク
ローンのマッピングと存在量の定量化を同時に可能にする、ライゲーションを介したPCRおよび超並列シーケンスに基づくアプローチが開発された。
前記PCR産物は、前記細胞の宿主ゲノムDNA内の前記レトロウイルスの組み込み部位を含む標的配列と、隣接宿主ゲノムDNA配列とを含有し、前記組み込み部位は少なくとも前記レトロウイルスの3’−LTR配列末端または5’−LTR配列末端を含み、
前記PCR産物は、第一末端と、第二末端と、以下の順番の配列とを含み:
前記第一末端に特異的な配列、少なくとも6個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、宿主ゲノムDNA配列、少なくとも前記レトロウイルスの3’−LTR配列末端または5’−LTR配列末端、前記第二末端に特異的な配列;
前記PCR産物は、以下の工程によって作製される:
a)前記対象に由来する細胞からゲノムDNAを単離する工程;
b)工程a)で得られた前記ゲノムDNAを切断する工程;
c)前記レトロウイルスの5’−LTRに結合するプライマー、前記レトロウイルスの3’−LTRに結合するプライマー、dNTP、およびDNAポリメラーゼの存在下で、工程b)で得られた前記切断されたDNAを用いて伸長反応を行う工程であって、前記dNTPが標識dNTPを含み、且つ/または、前記プライマーが標識されていることにより、3’シングルヌクレオチドオーバーハングを有する標識DNA鎖を含む二本鎖DNA産物が生成され、前記標識は結合性リガンドである、前記工程;
d)3’シングルヌクレオチドオーバーハングを有するリンカーを工程c)で得られた生成物の末端にライゲーションする工程であって、前記リンカーの前記3’シングルヌクレオチドオーバーハングが前記標識DNA鎖の前記3’シングルヌクレオチドオーバーハングと相補的であることによって、少なくとも6個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、および前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも1つが導入される、前記工程、
e)前記結合性リガンドに結合する受容体を用いて工程d)で得られた生成物を単離する工程;
f)鋳型としての工程e)で得られた生成物の存在下で、工程e)で得られた生成物の前記第一末端に特異的な第一プライマーおよび前記第二末端に特異的な第二プライマーを用いて、PCR反応を少なくとも1回実行する工程であって、前記第一プライマーおよび前記第二プライマーが、その5’末端に互いに異なる少なくとも1個の付加配列をそれぞれ含むことによって、前記第一末端に特異的な前記付加配列と前記第二末端に特異的な前記付加配列とを含む前記直鎖PCR産物が生成される、前記工程。
ハングが、工程c)で合成されたDNA鎖の3’シングルヌクレオチドオーバーハングにハイブリダイズされることで、標識DNA鎖を含む二本鎖DNA生成物が生成され、前記二本鎖DNA生成物が、少なくとも前記レトロウイルスの3’−LTR配列末端または5’−LTR配列末端、並びに挿入部位および切断部位の隣接宿主ゲノムDNA配列、少なくとも6個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、並びに前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも1つ、を含む。
工程f)は以下の工程を含む:
f1)鋳型としての工程e)で得られた生成物、X3配列に結合するプライマー、5’−LTRに結合するプライマー、3’−LTRに結合するプライマーの存在下で、第一PCR反応を実行する工程であって、前記5’−LTRに結合するプライマーおよび前記3’−LTRに結合するプライマーがそれぞれ、追加のX1配列をその5’末端に含むことにより、前記X1配列をも含むPCR産物が生成される、前記工程;
f2)鋳型としての工程f1)で得られた生成物、その5’末端に追加のX4配列を有するX3配列に結合するプライマー、その5’末端に追加のX2配列を有するX1配列に結合するプライマーの存在下で、第二PCR反応を実行することにより、前記X2配列および前記X4配列をも含むPCR産物が生成される工程。
請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法によって直鎖PCR産物が作製され、前記PCR産物が多重シーケンスにかけられることで全ての挿入部位および全ての切断部位が決定され、前記切断部位はそれぞれの挿入部位と相関しており、
その後、特定のTリンパ球クローンを表す各挿入部位について異なる切断部位の数を計数し、同一の挿入部位および同一のランダムタグを有するリードを排除することによりあらゆるPCRデュプリケート(PCR duplicate)を考慮から排除し、それから特定のTリ
ンパ球クローンの各々の存在量を決定することが行われる、
前記方法を提供する。
特定のTリンパ球クローンの各々の存在量に基づいて成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)の再発の可能性を判定すること;および/または
特定のTリンパ球クローンの各々の存在量に基づいて成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)の治療の成功を判定すること。
特定のTリンパ球クローンの存在量が多いことは、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)の再発の可能性が高いこと、および/または、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)の治療が成功していないこと、を示し;
特定のTリンパ球クローンの存在量が少ないことは、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)の再発の可能性が低いこと、および/または、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)の治療が成功していること、を示す。
基づいて、治療を受けているATL患者および治療を受けていないATL患者の両方を、モニタリングできることを意味している。
、リンカーが付加される。このために、3’シングルヌクレオチドオーバーハングを有する部分二本鎖DNAを与えるオリゴヌクレオチドが用いられ、ここで、前記リンカーのこのシングルヌクレオチドは、伸長工程時にポリメラーゼによって新規合成された標識(ビオチン化)DNA鎖に付加されたシングルヌクレオチドに相補的である。伸長工程時にポリメラーゼによって新規合成された標識(ビオチン化)DNA鎖に付加されたシングルヌクレオチドはAであるため、リンカーの3’シングルヌクレオチドオーバーハングはT(チミジンデゾキシリボヌクレオチド)となる。この伸長工程と後のライゲーション工程により、所定の構造を有する目的のDNAコンストラクトが得られる。宿主ゲノムDNAを含む末端が特定の配列を伴って得られ、一方、反対側の末端は3’−LTR末端または5’−LTR末端を含む。このDNAコンストラクトは、さらに、宿主ゲノムDNA配列とプロウイルス配列との間の元の接合部(挿入部位)も含んでいる。この特定の挿入部位が、特定のT細胞クローンの指標となる。このDNAコンストラクトはまた、ゲノムDNAの切断部位(切断工程時に生成された)と、それに付加されたリンカーも含む。この切断部位は、特定のクローンの存在量を推定するための評価の際に用いられ、上記のように、特定のクローンは特定またはユニークな挿入部位によって示される。
ンデックスは多重シーケンスのために用いられる。
って示され、各種形状は異なる時点に対応している(丸(dot):診断、四角:血液の再
発(relapse blood)、三角:リンパ腫の再発(relapse lymphoma)、菱形:完全寛解(complete remission)CR1、CR2およびCR3)。灰色の領域は完全臨床寛解の期間
を示している(表1)。クローン性再構成が生じたT細胞受容体−γ(TCR−γ)遺伝子の検出が行われた試料は、黒色の輪郭でマークされた形を有する(TCR+)。クローン頻度分布は円グラフで表されており、各スライスは独立した組み込み部位およびその対応するクローンの存在量を表している。単一の優勢クローン(100プロウイルスコピーあたりの存在量、円グラフの下に表示)が黒色で示されている。ATL60は、単一悪性クローンにおいて、4種類の等頻度のプロウイルスのエビデンスを示している(単一TCR−γ再構成、ATL60、表2)。残りの潜在的なクローンは灰色で示されている。PVL:PBMC内のプロウイルス量(100細胞あたりのtaxコピー)。悪性クローンの絶対存在量(PBMC内の優勢HTLV−1挿入部位の割合)は、PVLおよび白血病性クローンの相対的存在量から定量化できる。完全寛解時の悪性組み込み部位の絶対存在量、ATL14−CR1<0.007%(スキームd、0.016%のPVL、43%の相対的存在量)。
R−宿主接合部が検出された一方での、HTSクローナリティー法で確認された5’LTR−宿主リードの非存在と一致している。長いリードは、ATLにおける2型欠損HTLV−1プロウイルスの同定について、5’/3’デュアルHTS法を検証している。HTLV−1プロウイルスゲノムおよび転写物が上段に示される。PF:フォワードプライマー、PR:リバースプライマー、cov:カバレッジ。
本明細書で使用される場合、「リガンド−受容体ペア」または「結合ペア」という表現は、互いを認識し互いに結合することが可能な化学部分である、リガンドおよび受容体を指す。リガンドおよび受容体は、互いを認識し互いに結合して複合体を形成できるものであれば、いかなる部分であってもよい。さらに、リガンドおよび受容体は、第三の媒介物質の結合を介して相互作用してもよい。通常、リガンド−受容体ペアを構成するリガンドおよび受容体は、特異的な非共有結合性相互作用により互いに結合する結合分子である。リガンドおよび受容体は、天然のものでも人工のものでもよく、他の化学種と集合体を形成してもよい。
本発明が提供する改善されたHTSに基づく方法を利用することで、患者の縦断的PBMC試料から単離されたゲノムDNAにおける、HTLV−1組み込み部位の、マッピングおよび存在量の定量化が同時に行われた。これまでに開発されたTag−NGSプロトコルに記載されるランダムタグに加えて、本発明の最適化された方法は、ライブラリー調製およびデータ解析にいくつかの重要な改変を含み、これまでに確立されたプロトコルの制限のいくつかが克服されている。簡潔には、5’LTRおよび3’LTRの両方をアッセイすることにより、前記技術のダイナミックレンジが増加したことで、クローン存在量のより良好な測定が可能となり、プロウイルスにおける5’−欠失の発生に関する重要な情報が得られるようになった。Biotin−11−dUTPを用いた伸長工程により、末端修復と、ストレプトアビジンを用いたLTR陽性断片の濃縮促進とが同時に行われ、その後、限定的なPCRが行われて、PCRデュプリケートが回避される。従って、個別の末端修復工程を省略できる。アダプターおよびインデックスを追加するための特注のシーケンスプライマーの代わりに、市販のイルミナ社製プライマーを用いたことで、ライブラリーの多重化が単純化され、プロトコルを臨床環境に適用可能となる程度までコストおよび実行時間の両方が低減された。イルミナ社製MiSeq装置により、ライブラリーが
アセンブルされ、150bpのペアエンドシーケンスリードが得られた(平均生リード数:373,400、範囲:28,930〜977,000)。5’LTR−宿主接合部または3’LTR−宿主接合部のいずれかを支持するリードが保持された。
より確認された。5’LTR欠失2型欠損プロウイルスのATL細胞への組み込みは、およそ1/3の症例で観察され、予後と関連している。
本発明者らは、白血病性の病型と診断された、5例のATLの後向き試料の縦断的解析を行った。これらのATLは全て、導入療法後に臨床的寛解を達成したが、様々な期間の血液学的応答の後に再発したものである。系統的試料を改良型HTS法で検査してプロウイルス組み込み部位をマッピングし、診断時に同定された優勢な白血病性クローンの分子的な追跡を可能とした。
of adult T-cell leukemia-lymphoma: a proposal from an international consensus meeting. J Clin Oncol 27:453-9, 2009)によって、すなわち、CBCの正常化、血液中
に存在する異常リンパ球が5%未満であること、および、4週間を超えて測定可能な腫瘍が存在しないこと、によって、定義された。腫瘍血液学の公認診断研究所において欧州標準プロトコルにより測定された、患者のCBC、リンパ球絶対数(ALC)、血液スメア、臨床データ、および生物学的パラメーターが、ネカー病院の電子医療記録から後向きに得られた(表2)。
F:女性、M:男性、病型は下山分類に従い定義されたもの、CHOP:シクロホスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、LSG15:VCAP−AMP−VEPC、IFNα:インターフェロンα、AS2O3:三酸化ヒ素、CR:完全寛解(単位は月)、*ATL11診断は、この患者から最初期に入手可能な試料に相当(化学療法後に非応答者臨床状態、AZT−IFNα−AS2O3治療前)。
HTLV−1患者由来の試料は、ヘルシンキ宣言に従いインフォームドコンセントが得られた後、治験審査委員会に承認されたプロトコルの後に、フランス、パリ大学のネカー病院で、「イル・ド・フランスII倫理委員会(Comite d’ethique Ile de France II)
」に従って、採取された。試料は、治療を行ったが再発した、5人のATL患者(4例の急性型および1例の予後不良慢性型)由来のPBMCから構成される試料であった。PBMCはHistopaque−1077(シグマ社)を用いて血液から分離された。本研究で用いられたDNAは、キアゲン社製AllPrep−DNAキットを用いて単離された。
合計5μgのDNAを、超音波処理により、Bioruptor(登録商標)装置(ダイアジェノード社(Diagenode)、ベルギー)を用いて切断した。切断の設定は、05秒
間のON-90秒間のOFFを合計8サイクル、であった。最適な切断のために、4サイ
クルの後にチューブをスピンダウンした。また、この手順を、DNA量を5μg未満(200ngまで)にして行った。
実施例2で得られたDNAに、以下のDNA伸長工程を行った:HTLV−1 5’−LTRプライマーおよびHTLV−1 3’−LTRプライマー(5’−GGGCCCTGACCTTTTCAGAC−3’:配列番号1;5’−CCACCCCTTTCCCTTTCATT−3’:配列番号2)を用いる、ビオチン化dUTP(0.25mM)(サーモサイエンティフィック社)、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、各1mM、dTTP、0.75mM)および2.5ユニットのHot Start Taq Polymerase(プロメガ社)の存在下での、DNA伸長工程。以下の伸長プログラムを実行した:ステップ1:95℃、2.5分間、ステップ2:95℃、0.5分間、ステップ3:58℃、0.5分間、ステップ4:72℃、1.0分間、ステップ5:72℃、5分間、ステップ6:12℃、反応終了。ステップ3〜4を30サイクル繰り返した。Taqポリメラーゼによって、プロウイルスのLTR領域(プライマーが結合する)から開始されて、宿主ゲノム配列の方向に、ビオチン化DNA鎖が合成され、この新たな鎖の3’末端に追加の1個のアデノシンヌクレオチドが付加される。
Agencourt Ampure XPビーズ(ベックマン・コールター社)を用いて、実施例3で得られたDNAを精製した。再懸濁されたAgencourt Ampure XPビーズに、1:1の割合で、前記伸長産物を加えた。
実施例4で得られたDNAをライゲーション工程にかけ、ライゲーション工程では、配列番号3(5’−GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNCGCTCTTCCGATCT−3’)のオリゴヌクレオチドおよび配列番号4(5’−/5Phos/GATCGGAAGAGCGAAAAAAAAAAAAA−3’)のオリゴヌクレオチドから構成されるリンカーを、前記DNAに加えてライゲーションし、それにより、イルミナ社製Nextera Reverseプライマーにも存在する配列と8ntのランダムタグとを導入した。T4 DNAリガーゼ酵素(ニュー・イングランド・バイオラボ社)を用いて反応を実行した。反応は、室温で3時間実行することもできるし、16℃で一晩実行することもできる。
ライゲーション工程の最終産物は、DNA伸長工程の際に組み込まれたビオチンを含有する。ストレプトアビジンビーズ(Dynabeads M−280、インビトロジェン/ライフテクノロジーズ社)を用いることにより、実施例5で得られた生成物を選択および精製した。
実施例6で得られた生成物に、以下のPCR工程を行った:HTLV−1特異的プライマー(HTLV−5’末端−PCRプライマー:5’−TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNGGGATATTTGGGGCTCATGG−3’:配列番号5;およびHTLV−3’末端−PCRプライマー:5’−TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNGACAGCCCATCCTATAGCACTC−3’:配列番号6)、およびリンカー特異的プライマー(5’−GTCTCGTGGGCTCGGAGAT−3’、配列番号7)を用いる、dNTPおよびQ5 Hot Start High−Fidelity Taq Polymerase(ニュー・イングランド・バイオラボ社)の存在下での、以下のPCR1プログラム(15サイクル)を用いる、PCR工程:ステップ1:98℃、30秒間、ステップ2:98℃、8秒間、ステップ3:66℃、20秒間、ステップ4:72℃、30秒間、ステップ5:72℃、60秒間、ステップ6:12℃、反応終了。ステップ2〜4を15サイクル繰り返す。この工程により、イルミナ社製Nextera
Forwardプライマーにも存在する配列が導入される。
Agencourt Ampure XPビーズ(ベックマン・コールター社)を用いて、実施例7で得られたDNAを精製した。再懸濁されたAgencourt Ampu
re XPビーズに、1:1の割合で、前記PRC1産物を加えた。
実施例8で得られた生成物に、以下の第二PCR工程を行った:Nexteraプライマー配列とマッチするプライマー(イルミナ社製)を用いる、dNTPおよびQ5 Hot Start High−Fidelity Taq Polymerase(ニュー・イングランド・バイオラボ社)の存在下での、以下のPCR1プログラム(12サイクル)を用いる、PCR工程:ステップ1:98℃、30秒間、ステップ2:98℃、8秒間、ステップ3:62℃、20秒間、ステップ4:72℃、30秒間、ステップ5:72℃、60秒間、ステップ6:12℃、反応終了。ステップ2〜4を12サイクル繰り返す。この工程により、P5配列およびインデックス配列、並びにP7配列およびインデックス配列が導入される。
Agencourt Ampure XPビーズ(ベックマン・コールター社)を用いて、実施例8で得られたDNAを精製した。再懸濁されたAgencourt Ampure XPビーズに、1:0.8の割合で、前記PRC2産物を加えた。
種々のPCR2産物(それぞれユニークなインデックスセットを有する)をプールすることによりライブラリーを構築した。
キアゲン社製AllPrep DNA/RNA/miRNAキットを用いてDNAを単離し、HTLV−1 3’領域を標的とするプライマーおよび正規化用のそれぞれアクチンのRPS9を標的とするプライマー(インテグレーテッド・DNA・テクノロジーズ社製のプライマー)を用いるリアルタイムPCRによってプロウイルスDNAを定量化した。1×PCR緩衝液(Platinum Quantitative PCR SuperMix−UDG)中、1μgのトータルDNA、プライマーおよびプローブ(それぞれ200nMの濃度)を含有する50μL体積(HTLV−1)の中で、または、50ngのDNAおよび1×Universal PCR Master Mix, No Am
pErase UNGa(サーモサイエンティフィック社)を含有する10μLの中で、ランを実行した(BLV)。温度サイクル条件は、95℃、10分間、その後、95℃、15秒間および60℃、1分間を50サイクル、であった。Tarl2細胞株(HTLV−1、単一プロウイルスコピー)由来DNAの連続希釈により検量線を作成した。プロウイルス量(単位は%PBMC)=(試料平均量)×2/(試料RPS9量またはアクチン量)*100。
HTLV−1プロウイルス、並びにその5’側および3’側に隣接するゲノム配列を、LongAmp(登録商標)Taq DNA Polymerase(ニュー・イングランド・バイオラボ社)を用いて、PCR増幅した。ATL14(推定完全長プロウイルス、5’LTR−宿主接合部および3’LTR−宿主接合部、HTSクローナリティーによって検出):フォワードプライマー(5’−TGGGGCGACATCTGAAGAAA−3’:配列番号8)、およびリバースプライマー(5’−TGCAGGGTTGGAGTTTCAGA−3’:配列番号9)は、750bp(野生型染色体)、およびプロウイルスを含む約9000bpのバンドを生成した。ATL11−R−LN(リンパ節、再発):フォワードプライマー(5’−CCTTAATCACGCTCTGGTGC−3’:配列番号10)およびリバースプライマー(5’−GCGGACTTGGGCCTTATCAT−3’:配列番号11)は、460bpのバンド(野生型染色体)、および推定5’LTR欠失2型欠損プロウイルスを含む約4000bpのバンドを生成した。ゲル精製PCR産物から調製されたライブラリー(Ligation Sequencing Kit 2D−R9.4)を、SpotON Flow Cell Mk−I−R9.4(オックスフォード・ナノポアテクノロジーズ社)でシーケンスした。Poretoolsを用いてFASTQ配列を抽出し、適切な部位にプロウイルスが組み込まれたカスタムゲノムに、BWA−MEMを介して、マッピングした。
TCR−γ遺伝子再構成を、確立されたEuroClonality(Biomed−2)プロトコル(Van Dongen JJM et al.: Design and standardization of PCR primers
and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 17:2257-2317, 2003)を用いて評価した。
CD4(RPA−T4クローン)、CD25(2A3)、HLA−DR(L243)、CD3dim(UCHT1)およびCD7absent(124−1D1)を発現する異常リンパ球集団の存在を、EuroFlowの標準プロトコルに従って、フローサイトメトリー(FCM)により検査した。
クローナリティーは、細胞または物質が、1つの供給源に由来している状態であること、または、他の供給源に由来している状態であること、を暗示する。従って、ポリクローナル(多くのクローンに由来);オリゴクローナル(少数のクローンに由来);およびモノクローナル(1つのクローンに由来)、というような用語がある。これらの用語は抗体または免疫細胞に関連して最も多く使用される。HTLV−1プロウイルスが細胞ゲノム内の同一部位に挿入された細胞は全て、「姉妹細胞(Sister cell)」とされる。「クロ
ーン」は姉妹細胞の集団である。超音波処理によるランダムなDNA断片化は、ユニークな挿入部位の存在量の定量化を可能にする、重要な特徴となる。ユニークな挿入部位のそれぞれについて、長さの異なるアンプリコンの数がカウントされる。「アンプリコン」は、PCRの際に生成される分子である。
白血病型(4人は急性型、1人は予後不良の慢性型)と診断され、全員が導入療法後に臨床的寛解を達成した、5人のATL患者の後向きPBMC試料の、縦断的なクローナリティー解析を実施した。これは、最適化されたHTSに基づく方法を適用して、HTLV−1組み込み部位のマッピングおよび対応するクローンの存在量の定量化を行うことで、優勢な推定腫瘍クローンの分子的追跡を可能にすることにより、実現された。患者の特徴および試料の特徴を表1にまとめる。5人の患者全員が最終的には再発したが、血液学的寛解の持続期間、臨床経過、および生存成績は患者間で様々であった。2人の患者が5.8年と2.4年という長期に及ぶ臨床的寛解(それぞれ、ATL11およびATL60;図1a、図1b)を達成したが、一方で、3人の患者が急速な再発を示し、寛解は、ATL7は4.3か月、ATL14は5.3か月、ATL100は3.7か月という、著しくより短いものであった(表1、図1c〜e)。
回収されず、このことは、再発時に出現した新たな悪性クローンが5’LTR欠失プロウイルスであったことを強く示唆している。本発明者らは、長期Oxford Nanoporeシーケンス技術を適用して、再発時に発生したリンパ腫におけるプロウイルスおよびそのゲノムバウンダリ(genomic boundary)を特徴づけることにより、これが実際に事実であることを確認した。これにより、5’/3’デュアルHTSアプローチが5’LTR欠失2型欠損プロウイルスを正確に検出できることが示された(図2)。
TCR−γ再構成データが記録され、さらに、血液細胞の免疫表現型プロファイルがFCMにより測定された(図1および表2)。これらのアッセイはネカー病院における通例の造血器腫瘍評価に組み込まれている。ある特定の時点において、クローン性再構成を示したTCR−γおよび/またはFCMは、標準的な血液学的応答基準よりも良好な再発の指標であったが、これらのアッセイは両方とも制限があった。TCR−γに関しては、HTSクローナリティーが、導入療法に対する不応性の優れた予測者であった(図1、ATL100 CR1、ATL14 CR1およびCR2)。HTSアプローチの別の利点は、TCR−γアッセイとは対照的に、それが、短期間の分子的寛解後の再発の定量的測定を可能としたこと(図1、ATL60)と、より高い感度を示したこと(図1d、CR1、0.007%の絶対存在量、それに対して、TCR−γアッセイは約1%という感度)である。FCMの場合、5人中4人のATLにおいて、発現がCD4+、CD25+、CD7−、およびCD3dimの異常リンパ球集団が明らかとなったが、健常人において観察される分布とのCD3発現レベルの重複を考慮すると、CD3dimステータスを用いた残存病変の正確な検出のためのFCMデータの忠実な解釈には、依然として問題があった。さらに、全てのATL症例がCD3dim表現型を示すわけでもなく(表2、ATL100:CD3high)、このことは、分子応答のマーカーとしてのFCMの限界を示している。結論として、HTSクローナリティーを含む本発明の方法は、現在、試験された他のどのアッセイよりも優れている。
Claims (15)
- レトロウイルスに感染した宿主対象または前記レトロウイルスに関連した疾患を患う対象の細胞に由来するゲノムDNAから直鎖PCR産物を作製するための方法であって、
前記PCR産物は、前記細胞の宿主ゲノムDNA内の前記レトロウイルスの組み込み部位を含む標的配列と、隣接宿主ゲノムDNA配列とを含有し、前記組み込み部位は少なくとも前記レトロウイルスの3’−LTR配列末端または5’−LTR配列末端を含み、
前記PCR産物は、第一末端と、第二末端と、以下の順番の配列とを含み:
前記第一末端に特異的な配列、少なくとも6個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、宿主ゲノムDNA配列、少なくとも前記レトロウイルスの3’−LTR配列末端または5’−LTR配列末端、前記第二末端に特異的な配列;
前記PCR産物は、以下の工程によって作製される:
a)前記対象に由来する細胞からゲノムDNAを単離する工程;
b)工程a)で得られた前記ゲノムDNAを切断する工程;
c)前記レトロウイルスの5’−LTRに結合するプライマー、前記レトロウイルスの3’−LTRに結合するプライマー、dNTP、およびDNAポリメラーゼの存在下で、工程b)で得られた前記切断されたDNAを用いて伸長反応を行う工程であって、前記dNTPが標識dNTPを含み、且つ/または、前記プライマーが標識されていることにより、3’シングルヌクレオチドオーバーハングを有する標識DNA鎖を含む二本鎖DNA産物が生成され、前記標識は結合性リガンドである、前記工程;
d)3’シングルヌクレオチドオーバーハングを有するリンカーを工程c)で得られた生成物の末端にライゲーションする工程であって、前記リンカーの前記3’シングルヌクレオチドオーバーハングが前記標識DNA鎖の前記3’シングルヌクレオチドオーバーハングと相補的であることによって、少なくとも6個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、および前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも1つが導入される、前記工程、
e)前記結合性リガンドに結合する受容体を用いて工程d)で得られた生成物を単離する工程;
f)鋳型としての工程e)で得られた生成物の存在下で、工程e)で得られた生成物の前記第一末端に特異的な第一プライマーおよび前記第二末端に特異的な第二プライマーを用いて、PCR反応を少なくとも1回実行する工程であって、前記第一プライマーおよび前記第二プライマーが、その5’末端に互いに異なる少なくとも1個の付加配列をそれぞれ含むことによって、前記第一末端に特異的な前記付加配列と前記第二末端に特異的な前記付加配列とを含む前記直鎖PCR産物が生成される、前記工程。 - 伸長工程c)で用いられたDNAポリメラーゼが、合成されたDNA鎖の3’末端に単一の余剰ヌクレオチドを付加する、請求項1に記載の方法。
- 工程c)において、少なくとも前記レトロウイルスの3’−LTR配列末端または5’−LTR配列末端、並びに挿入部位および切断部位の隣接宿主ゲノムDNA配列、を含む二本鎖DNA産物が得られる、請求項1または2に記載の方法。
- 工程d)において、前記リンカーが、それぞれ3’−LTRまたは5’−LTRを有する末端とは反対側の、工程c)で得られた生成物の末端に付加される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程d)において、標識DNA鎖を含む二本鎖DNAが得られ、前記二本鎖DNA生成物は、少なくとも前記レトロウイルスの3’−LTR配列末端または5’−LTR配列末端、挿入部位および切断部位の隣接宿主ゲノムDNA配列、少なくとも6個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、並びに前記第一末端に特異的な
配列のうちの少なくとも1つ、を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 工程d)において、シングルヌクレオチドオーバーハングを有するリンカーが、3’シングルヌクレオチドオーバーハングを有する、工程c)で得られた生成物の末端にライゲーションされ、リンカーのシングルヌクレオチドオーバーハングが、工程c)で合成されたDNA鎖の3’シングルヌクレオチドオーバーハングにハイブリダイズされることで、標識DNA鎖を含む二本鎖DNA生成物が生成され、前記二本鎖DNA生成物が、少なくとも前記レトロウイルスの3’−LTR配列末端または5’−LTR配列末端、並びに挿入部位および切断部位の隣接宿主ゲノムDNA配列、少なくとも6個のランダムな連続ヌクレオチドを含む配列、それに続くリンカー配列、並びに前記第一末端に特異的な配列のうちの少なくとも1つと、を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)において合成DNA鎖の3’末端に付加されたシングルヌクレオチドオーバーハングがデオキシアデノシンであり、工程d)で付加されたリンカーのシングルヌクレオチドオーバーハングがデゾキシチミジンである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCR産物が以下の順番で、X4配列、X3配列、6〜30個のヌクレオチドを含むタグ配列、宿主ゲノムDNA配列、少なくとも前記レトロウイルスの3’−LTR配列末端または5’−LTR配列末端、X1配列、X2配列を含み;
工程f)が以下の工程:
f1)鋳型としての工程e)で得られた生成物、X3配列に結合するプライマー、5’−LTRに結合するプライマー、3’−LTRに結合するプライマーの存在下で、第一PCR反応を実行する工程であって、前記5’−LTRに結合するプライマーおよび前記3’−LTRに結合するプライマーがそれぞれ、追加のX1配列をその5’末端に含むことにより、前記X1配列をも含むPCR産物が生成される、前記工程;
f2)鋳型としての工程f1)で得られた生成物、その5’末端に追加のX4配列を有するX3配列に結合するプライマー、その5’末端に追加のX2配列を有するX1配列に結合するプライマーの存在下で、第二PCR反応を実行することにより、前記X2配列および前記X4配列をも含むPCR産物が生成される工程、
を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記結合性リガンドおよび前記受容体が、ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン;ジゴキシゲニン(digoxygenin)/抗ジゴキシゲニン(digoxygenin)抗体;ハプテン/抗ハプテン抗体;抗原/抗体からなる結合性ペアの群から選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レトロウイルスがHTLV−1であり、前記HTLV−1関連疾患が成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)であり、前記ゲノムDNAが末梢血単核球(PBMC)由来である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)を患う対象における優勢な白血病性Tリンパ球クローンを測定し縦断的にモニタリングするための方法であって、
請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法によって直鎖PCR産物が作製され、前記PCR産物が多重シーケンスにかけられることで全ての挿入部位および全ての切断部位が決定され、前記切断部位はそれぞれの挿入部位と相関しており、
その後、特定のTリンパ球クローンを表す各挿入部位について異なる切断部位の数を計数し、同一の挿入部位および同一のランダムタグを有するリードを排除することによりあらゆるPCRデュプリケート(PCR duplicate)を考慮から排除し、それから特定のTリ
ンパ球クローンの各々の存在量を決定することが行われる、前記方法。 - 特定のTリンパ球クローンの各々の存在量に基づいて成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)の再発の可能性を判定することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 特定のTリンパ球クローンの各々の存在量に基づいて、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)の治療の成功を判定することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 特定のTリンパ球クローンの存在量が多いことが、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)の再発の可能性が高いこと、および/または、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)の治療が成功していないこと、を示し;
特定のTリンパ球クローンの存在量が少ないことが、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)の再発の可能性が低いこと、および/または、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)の治療が成功していること、を示す、
請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。 - 前記特定のTリンパ球クローンが、診断時に優勢な白血病性クローンと同定されたものと同じである、請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法。
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