JP2020525038A - 敗血症診断用キット及びそれを用いた診断方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ラマン活性金コア−銀シェル二量体の合成は、ターゲットオリゴヌクレオチドが結合された金ナノ粒子と、それに追加して銀前駆体の量により調節される銀シェルを形成するDNA−directed bridging methodにより行った。
測定の正確度を向上させるために、サイズが調節された2種の完全な球形の金ナノ粒子をコアとして選択した。合成には、成均館大学校のイ・ギラ教授研究チームにより提示された方法を用いた(非特許文献3)。具体的には、作製する球形粒子より大きいサイズの8面体を初期粒子として合成し、それをエッチングして真円度(circularity)0.94以上を有する完全な球形の金ナノ粒子を準備した。合成に用いられるCTAB(cetyl trimethylammonium bromide)により、粒子が凝集したり、粒子表面でのチオール基によるDNAの導入に不利であるため、ツイーン20などの界面活性剤などで処理して負のゼータ電位を有するように表面を改質した。
敗血症診断のためのターゲットオリゴヌクレオチドは、敗血症を引き起こすことが知られている代表的な菌株である大腸菌、肺炎桿菌(Klepsiella pneumoniae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、エンテロコッカス・フェカリス菌(Enterococcus faecalis)及び緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のゲノムから選択した。
配列番号8;5’−GGGATATCTGACCAGTCGGG−3’
配列番号9;5’−GAATTAAAAAACAGGAAATC−3’
配列番号10;5’−AGGTCAACAATGCTGCGGAT−3’
配列番号11;5’−CTGCAGAAACACTGTACGTC−3’
配列番号12;5’−GTACTTCGCAAATCTCAACG−3’
配列番号13;5’−CAAATGAACATCAAAGCGAA−3’
配列番号14;5’−TTAACTGCCCTACACTGGTG−3’
配列番号15;5’−GACAATGTCGGTAAAGTTAA−3’
配列番号16;5’−GTTAACTGCCCTACACTGGTG−3’
配列番号17;5’−CAAGGTCTTTTGGGGTTATCG−3’
配列番号18;5’−GGTACCAGAGGTCTCGTAAA−3’
配列番号19;5’−CAGAGGTCTCGTAAAACTGA−3’
配列番号20;5’−TCACAAACAGATAATGGCGT−3’
配列番号21;5’−AAATAGAAGTGGTTCTGAAG−3’
配列番号22;5’−CTATGATTGTGGTAGCCATC−3’
配列番号23;5’−ATTATTGTAGGTGTATTAGC−3’
配列番号24;5’−CGAACTAAAGCTTCGTTTACC−3’
配列番号25;5’−CCACGTCCATATTTATCAGT−3’
配列番号26;5’−CAATGTTCTACCATAGCGAT−3’
配列番号27;5’−CATACGATCTTTACTTATCC−3’
配列番号28;5’−GCTTCTTTCCTCCCGAGTGC−3’
配列番号29;5’−TTGCACTCAATTGGAAAGAG−3’
配列番号30;5’−GAAGAACAAGGACGTTAGTA−3’
配列番号31;5’−ACTGAACGTCCCCTGACGGT−3’
配列番号32;5’−TGGTTAAACTTTTTGCCTTA−3’
配列番号33;5’−CGAGCGAAGATCATTGGCAC−3’
配列番号34;5’−TTTTGAACATCATCGGTGAC−3’
配列番号35;5’−CATATAGTCTAAGAAGGCTT−3’
配列番号36;5’−AATGTAATAATTGGTTCATA−3’
配列番号37;5’−CCCTGGGTAAATAGGTGCTG−3’
配列番号38;5’−GGAATTTCGTTCCCGTTACT−3’
配列番号39;5’−ATACCAGTTCGCAAAAAGCA−3’
配列番号40;5’−ACGATCCGAAAACCTTCTTC−3’
配列番号41;5’−GTCCATTGCCGAAGATTCCC−3’
配列番号42;5’−CTTTCGAGCCTCAGCGTCAG−3’
配列番号43;5’−CAGGGTATCTAATCCTGTTT−3’
配列番号44;5’−GTGTATTAGGtGAAGGTGTT−3’
配列番号45;5’−TGATGGCCGTGTATTAGGTG−3’
配列番号46;5’−GAAATCGTCGTAATAAACCG−3’
配列番号47;5’−CAAGAAATCGTCGTAATAAA−3’
配列番号48;5’−GGAATTGAAGGTATTTTAAA−3’
配列番号49;5’−ATTAACGCTAGGAGAGCCGG−3’
配列番号50;5’−CGACTATTTACAAGTTCGCCC−3’
配列番号51;5’−ATTTACAAGTTCGCCCAGAG−3’
配列番号52;5’−CAGCGGTACGTCCTTGACCA−3’
配列番号53;5’−GCCAGACATGTACGTCGGCC−3’
配列番号54;5’−GTTTCCAGTGCGTGGTACTG−3’
配列番号55;5’−GACGAAGACGTACAGCGGCC−3’
配列番号56;5’−GCGCTCAGTCAGGAAAGCAT−3’
配列番号57;5’−CGACAAGAAGGCGCTCAGTC−3’
配列番号58;5’−GACCTGGCAGTGCATTCTTC−3’
配列番号59;5’−GTCATTCGCAGTGGTCCCTG−3’
Claims (17)
- 敗血症第1原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第1ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第1コア金ナノ粒子と、
敗血症第1原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第2ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第2コア金ナノ粒子と、
安定化剤、還元剤及び銀又は金イオンを含む溶液とを含む敗血症診断用キットであって、
前記第1ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第2ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端に第1ラマン活性分子が結合されたものである敗血症診断用キット。 - 前記敗血症第1原因菌とは異なる敗血症第2原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第3ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第3コア金ナノ粒子と、敗血症第2原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第4ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第4コア金ナノ粒子を少なくとも1対さらに含むことにより、複数の敗血症原因菌を同時に診断することができ、前記第3ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第4ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端に第2ラマン活性分子が結合されたものである、請求項1に記載の敗血症診断用キット。
- 前記第3コア金ナノ粒子及び前記第4コア金ナノ粒子は、それぞれ第1コア金ナノ粒子と第2コア金ナノ粒子のいずれか一方及び他方とサイズが同一であるか、又は全て独立したものである、請求項2に記載の敗血症診断用キット。
- 前記第1コア金ナノ粒子及び前記第3コア金ナノ粒子は、それぞれ独立して10〜50nmの平均直径を有し、前記第2コア金ナノ粒子及び前記第4コア金ナノ粒子は、それぞれ第1コア金ナノ粒子及び第3コア金ナノ粒子の1〜2倍の平均直径を有する、請求項1又は2に記載の敗血症診断用キット。
- 前記第1ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第2ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、及び第3ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第4ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、それらに含まれる塩基数が同一であるか、±5個以内の差であり、第1ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第2ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに第3ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第4ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計は、それぞれ独立して15〜100である、請求項1又は2に記載の敗血症診断用キット。
- 前記第1コア金ナノ粒子及び前記第3コア金ナノ粒子のサイズが20nmであれば、それぞれ第1ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第2ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに第3ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第4ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計が30であることを基準に、第1コア金ナノ粒子のサイズと第1ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第2ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに第3コア金ナノ粒子のサイズと第3ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第4ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計は、互いに比例する、請求項1又は2に記載の敗血症診断用キット。
- 前記第1コア金ナノ粒子〜前記第4コア金ナノ粒子は、標準偏差±0.05以下の真円度(circularity)0.9〜1.0を有する球形である、請求項1又は2に記載の敗血症診断用キット。
- 前記敗血症第1原因菌及び前記敗血症第2原因菌は、それぞれ独立して大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klepsiella pneumoniae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、エンテロコッカス・フェカリス菌(Enterococcus faecalis)及び緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の敗血症診断用キット。
- 第1コア金ナノ粒子、第2コア金ナノ粒子、第3コア金ナノ粒子及び第4コア金ナノ粒子は、それぞれ独立して20〜100nmの直径を有する完全球形粒子である、請求項1又は2に記載の敗血症診断用キット。
- 前記第1ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第2ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれか一方は5’末端を介して、他方は3’末端を介して、それぞれ第1コア金ナノ粒子及び第2コア金ナノ粒子に結合され、第3ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第4ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれか一方は5’末端を介して、他方は3’末端を介して、それぞれ第3コア金ナノ粒子及び第4コア金ナノ粒子に結合されたものである、請求項1又は2に記載の敗血症診断用キット。
- 前記第1ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び前記第2ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、どちらも敗血症第1原因菌特異的ゲノムの一部と相補的な5〜20個のヌクレオチド配列を含み、第3ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第4ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、どちらも敗血症第2原因菌特異的ゲノムの一部と相補的な5〜20個のヌクレオチド配列を含み、これら配列は、互いに重ならず、第1ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第2ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、並びに第3ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第4ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、それぞれ0〜3個のヌクレオチド間隔で隣接して位置する、請求項1又は2に記載の敗血症診断用キット。
- 前記第1ラマン活性分子又は前記第2ラマン活性分子は、互いに異なる波長でラマン信号を示す有機蛍光分子である、請求項1又は2に記載の敗血症診断用キット。
- 前記第1ラマン活性分子及び前記第2ラマン活性分子は、低い蛍光信号を示す、請求項1又は2に記載の敗血症診断用キット。
- 敗血症発症の疑いのある個体から採取した検体から分離したゲノムを含む試料を準備する第1ステップと、
前記第1ステップで準備した試料を、敗血症原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第1ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第1コア金ナノ粒子、及び敗血症原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第2ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第2コア金ナノ粒子と反応させる第2ステップ(ここで、前記第1ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第2ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端にラマン活性分子が結合されたものである)と、
前記第2ステップの生成物を、安定化剤、還元剤及び銀又は金イオンを含む溶液と反応させ、第1コア金ナノ粒子及び第2コア金ナノ粒子上に同時に銀又は金からなる第1シェル及び第2シェルをそれぞれ形成する第3ステップと、
前記第3ステップで得られた生成物のラマン活性分子のラマン信号を測定する第4ステップとを含む、敗血症診断のための情報提供方法。 - 前記敗血症原因菌は、大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klepsiella pneumoniae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、エンテロコッカス・フェカリス菌(Enterococcus faecalis)及び緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)からなる群から選択される、請求項14に記載の情報提供方法。
- 第4ステップで測定したラマン活性分子のラマン信号が、同じサイズの金コア−銀又は金シェルナノ粒子に標識された同じラマン活性分子から測定したラマン信号に比べて、大幅に増加した場合、第1ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第2ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと相補的な配列をゲノムに含む敗血症原因菌に感染したと判断する、請求項14に記載の情報提供方法。
- 前記第3ステップは、第1シェルと第2シェル間の最も短い距離が0.5〜10nmになるまで行う、請求項14に記載の情報提供方法。
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