ミスフォールディング特異的抗体の生成は、天然型構造において、存在しないか、またはより少ない程度に存在する、ミスフォールドTDP−43ペプチドに対する標的の同定を通して達成され得る。ミスフォールディング特異的エピトープは、主な配列において、天然型構造における対応するセグメントと異なる必要はなく、しかしながら、ミスフォールド集合体の文脈において立体配座的に区別されるべきである。すなわち、エピトープは、天然型構造において存在しない(または好ましくない)ミスフォールド集合体中の骨格および/または側鎖立体配座の観点で区別される立体配座を提示するだろう。
天然型タンパク質領域に対して産生された抗体は、ミスフォールドタンパク質について選択的でない傾向があり、したがって、天然型機能性タンパク質に同様に結合する。
本明細書に記載のように、TDP−43のミスフォールド形態について選択的であり得る抗体を発生させるために、本発明者らは、天然型折り畳みの文脈で阻害が生じやすく、ミスフォールドタンパク質の表面上に同様に露出され得る、TDP−43配列の領域を同定することを求めた。
実施例に記載のように、標準化された力場による分子動力学を使用したコンピュータシミュレーションを用いた。折り畳み構造の実験的に有効性が確認された構造モデルは、異常な細胞環境における外部チャレンジの際に障害が生じやすい隣接する主な配列の1つ以上の領域を生じるように、分子動力学を使用して部分的に展開されるその「天然型」立体配座から全体的に偏倚している。
これらの弱い安定領域は、発生期のミスフォールドタンパク質、またはミスフォールド病原性種中に露出される可能性があり、この文脈において、天然型集合体中に存在するよりも交互立体配座中に存在すると仮説を立てた。したがって、それらはミスフォールドタンパク質特異的エピトープ予測を構成し得る。
理論に縛られることは望まないが、ミスフォールドタンパク質中のこれらの配列領域は、天然型折り畳み(例えば、表面上にある)の立体配座とは区別される立体配座において露出される可能性があり、同様に、対応する数量が天然型TDP−43において示すよりも、より大きく露出された表面領域を有する領域、または異なる二面角分布によって見られる交互側鎖立体配座、および/または構造的整列によって測定される異なる全体的な立体配座中に露出され得る。
実施例に記載されるように、本発明者らは、天然型構造の文脈において阻害が生じやすく、そのため、部分的に形成された天然型構造中に露出される可能性が高いと予測される領域における最小エピトープを同定した。本発明者らは、より大きく露出された表面領域などの交互立体配座の基準を満たし、かつ/または平均二乗偏差(RMSD)によって天然型集合体に対して容易に整列しないが、より好ましくは、偏倚した、部分的に障害が生じた集合体に対して整列する、同定されたエピトープを含む環状化合物を設計した。
これらのエピトープに対して産生された抗体を、細胞培養中のミスフォールドTDP−43を認識する免疫蛍光法によって、かつALS患者対対照由来の脊髄ホモジネート中の病原性TDP43に結合する免疫ドットブロッティングによって示す。
I.定義
本明細書で使用される場合、「TDP−43」という用語は、代替的に、「TDP43」とも称されるか、または本明細書で使用される場合、「TDP」は、野生型TDP−43、天然型TDP−43を含むTDP−43のすべての形態、ならびにすべての種、特にヒトTDP−43(すなわち、hTDP−43)由来の突然変異型およびそれらの類似体を含むミスフォールド形態を意味する。ヒトTDP−43は、典型的には414アミノ酸残基のタンパク質であり、アミノ酸配列(例えば、Uniprot受託番号Q13148)およびヌクレオチド配列(例えば受託番号HGNC:11571)は、以前に特徴付けられている。TDP−43は、RRM1およびRRM2ドメインを含む。TDP−43のRRM1は、アミノ酸106〜177からなるタンパク質の第1のRNA認識モチーフを指す。TDP−43のRRM1ドメインの構造は決定されており、PDBエントリ4IUFとしてタンパク質データバンク上に列挙されている。PDB 4IUF構造をコンピュータ上で平衡させて、本明細書で不定的に「RRM1の天然型構造」、「TDP−43の平衡天然型集合体」、「TDP−43のRRM1の平衡天然型集合体」、または「TDP−43天然型構造的集合体」と称される、TDP−43の天然型構造におけるエピトープの天然型立体配座のすべての測定値に対して使用された、平衡集合体を得ることができる。
本明細書で使用される場合、「野生型」とは、非突然変異または天然に生じるタンパク質の主なアミノ酸配列を指す。
本明細書で使用される場合、「天然型」とは、特異的タンパク質またはその一部の正常な三次元構造を指す(例えば、天然型TDP−43 RRM1ドメインの結晶構造の原子レベルの座標が、タンパク質構造データバンク受託番号4IUFで入手可能である)。天然型TDP−43は、任意選択的に、「天然に折り畳まれた」TDP−43、「正常に折り畳まれた」TPD−43、および/または「健常な」TDP−43と称される。同様に、TDP−43の天然型RRM1ドメインは、任意選択的に、TDP−43の「天然に折り畳まれた」RRM1ドメインまたはTPD−43の「正常に折り畳まれた」RRM1ドメインと称される。したがって、「天然型TDP−43」、または「天然に折り畳まれたTDP−43」という用語は、本明細書では、X線結晶構造解析下での、または核磁気共鳴測定から再構成されるような、天然型構造を示す、非共有結合した個々のTDP−43ペプチドを含む分子構造を含む、発生期の翻訳後に天然に折り畳まれたTDP−43、および/または非疾患状態(例えば、正常な細胞)で折り畳まれた二量体TDP−43を指す。RRM1の天然型構造は、アルファらせんおよびベータシートの両方からなるアルファ/ベータ構造を有する。
本明細書で使用される場合、「ミスフォールド」とは、ポリペプチドまたはその一部の二次構造および三次構造を指し、ポリペプチドが、適切な機能状態でのそのポリペプチドについて正常でない立体配座を採用したことを示す。ミスフォールディングは、アミノ酸欠失、置換、または付加などのタンパク質中の突然変異によって引き起こされ得るが、野生型配列タンパク質も、疾患においてミスフォールドされ、微小環境条件および/またはニトロ化、酸化、カルボニル化、もしくは他の修飾などのアミノ酸修飾の結果として、例えば疾患特異的エピトープを露出する可能性がある。他の翻訳後修飾には、異常なユビキチン化、リン酸化、アセチル化、SUMO化、およびC末端断片のユビキチン化への開裂が含まれる。したがって、本明細書でポリペプチドを指す場合、「ミスフォールドTDP−43ポリペプチド」または「ミスフォールドTDP−43」は、立体配座が、天然型構造の一部を含有して、部分的に順序付けられ、天然型TDP−43よりも交互立体配座を有するアミノ酸のポリマーセグメントを含有して、部分的に障害が生じ、SASAの増加を示すことが多く、天然型平衡集合体中で探索されたものよりも多様な立体配座集合体を試料採取する、TDP−43の複数の立体配座を示すTDP−43ポリペプチドを指す。
ミスフォールドTDP−43は、タンパク質機能の喪失、毒性、および病原性凝集体の繁殖をもたらす凝集体の形成が生じやすい。
「突然変異TDP−43」という用語は、例えば[6]に記載の生物情報学ツールに記載される突然変異を含む、例えばFTDまたは家族性ALSに特徴的な置換など、例えばアミノ酸置換をもたらす遺伝子突然変異の結果として生じるTDP−43の形態、とくにTDP−43の内生的形態を指す。
「TTEQ(配列番号1)」という用語は、配列番号1に示すような、アミノ酸配列:トレオニン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミンを意味する。同様に、TTE、TEQ、KTTE(配列番号10)、KTTEQD(配列番号7)、TTEQD(配列番号9)、TTEQDL(配列番号11)、TEQD(配列番号8)は、1文字アミノ酸コードによって同定されたアミノ酸配列を指す。文脈に応じて、アミノ酸配列の参照は、環状化合物のアミノ酸配列など、TDP−43または単離ペプチドにおける配列を指す可能性がある。配列TTEQ(配列番号1)は、アミノ酸の主な配列における残基115〜118からなる。
本明細書で使用される場合、「TTEQ(配列番号1)または関連するエピトープおよび/または前述の任意の一部」という用語は、アミノ酸T115および/またはT116および/またはE117を最小限含み、例えば、TTE、KTT、またはTEQを含む。TTEQ(配列番号1)または関連するエピトープおよび/または前述の任意の一部の参照は、例えば、TDP−43ペプチド配列を含む環状化合物によって産生された抗体によって結合されるTDP−43上の領域を指す可能性がある。例えば、抗体は、T115、T116、もしくはE117、T115および/またはT116および/またはE117の特定の一部、または前述の任意の組み合わせに選択的または特異的に結合し得る。代替的に、抗体を作製するための環状化合物中に含まれるTDP−43ペプチド配列を指す可能性がある。
本明細書で使用される場合、「天然型における115T、116T、117E、および/または118Qによって占められるよりも交互立体配座」という用語は、例えば、PDB 4IUF、および図、および/または表に示すように、TDP−43天然型構造的集合体における115T、116T、117E、および/または118Qについての当該特性と比較して、溶媒露出度(例えば実施例に記載の環状ペプチドにおいて測定されるTTEQ(配列番号1)を含むペプチドの文脈において、RMSD構造的整列、および1つ以上の骨格の二面角もしくは側鎖二面角から選択される1つ以上の異なる立体配座特性を有することを意味する。同様に、本明細書で使用される場合、天然型構造におけるT、E、および/またはQのうちの1つ以上によって占められるよりも「交互立体配座」という用語は、PDB 4IUF、および図1〜9、および/または表において示すように、天然型TDP−43における、T、E、および/またはQのうちの1つ以上、例えば、T、E、および/またはQについて当該特性と比較して、溶媒露出度(例えば、TTEQ(配列番号1)またはTTEを含む対応する直鎖状ペプチドの文脈において、1つ以上の骨格の二面角もしくは側鎖二面角から選択される1つ以上の異なる立体配座特性を有することを意味する。例えば、図2によると、残基115Tについて、二面C−CA−CB−OG1およびC−CA−N−HNは、環状ペプチドシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)および偏倚集合体の両方を天然型における対応する二面角と区別する。特に、例えば、二面C−CA−CB−OG1は、天然型集合体中に存在しない環状集合体および偏倚集合体について180度でピークを示す。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」とは、B細胞もしくはT細胞受容体、またはその抗体もしくは結合断片によって認識されるタンパク質の領域を意味する。エピトープは、任意選択的に、直鎖状アミノ酸配列または抗体によって認識されるタンパク質の領域によって表される。エピトープは、1つ以上の抗原決定基を含み得る。例えば、ミスフォールドエピトープに対応する単離ペプチドに対して生成された抗体は、当該エピトープ配列の一部または全部を認識する。
本明細書で使用される場合、「ミスフォールドエピトープ」または「立体配座エピトープ」という用語は、対応する天然型構造中に存在しない三次元構造の少なくともある態様が同族抗体によって認識される、特定の三次元構造を有するアミノ酸の配列またはその抗原決定基を指す。「ミスフォールドエピトープまたは立体配座エピトープ」は、ミスフォールドタンパク質(例えば、ALSおよびFTD中に存在するような)中に露出されるか、またはアクセス可能である。ミスフォールドエピトープに選択的に結合する抗体は、その立体配座特異的エピトープのアミノ線のうちの1つ以上の空間配列を認識する。例えば、TTEQ(配列番号1)立体配座エピトープは、天然型TDP−43または例えばTTEQ(配列番号1)を含む直鎖状ペプチドを使用して産生された抗体上のエピトープと比較して、抗体の選択性、例えば、少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、50倍、100倍、250倍、500倍、または1000倍以上の選択性によって認識される、TTEQ(配列番号1)のエピトープを指す。
本明細書で使用される場合、「類似体」という用語は、実質的に同じ方法で本明細書に記載されるペプチド、タンパク質、または核酸分子と実質的に同じ機構を行う、本発明のアミノ酸およびヌクレオチド配列の一部、伸長、置換、変異、修飾、またはそれらの化学的同等物および誘導体を含む。環状ペプチドなどの環状化合物の類似体はまた、TDP−43ペプチドに対する付加および欠失を含む。核酸の類似体は、本発明の単離ペプチドをコードする縮退ヌクレオチド置換を含む。加えて、類似ペプチドおよび類似ヌクレオチド配列は、それらの誘導体を含む。
「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸ならびに修飾Lアミノ酸のうちのすべてを含む。アミノ酸の原子は、例えば、異なる同位体を含み得る。例えば、アミノ酸は、水素と置換された重水素、窒素−14と置換された窒素−15、および炭素−12と置換された炭素−13、ならびに他の同様の変化を含み得る。
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、1つのアミノ酸残基が、タンパク質の所望の特性を無効にすることなく、別のアミノ酸残基と置き換えられる置換である。好適な保存的アミノ酸置換は、互いに対して同様の疎水性、極性、およびR基サイズを有するアミノ酸を置換することによって行われ得る。保存的アミノ酸置換の例には、以下が含まれる。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、2つのポリペプチド配列または2つの核酸配列間の配列同一性の割合を指す。2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較の目的のために整列される(例えば、第2のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために第1のアミノ酸または核酸配列の配列で間隙を導入することができる)。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列の位置が第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、分子は、その位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数である(すなわち、同一性%=同一の重複位置の数/位置の合計数×100%)一実施形態では、2つの配列は、同じ長さである。数値計算用アルゴリズムを使用して、2つの配列間の同一性パーセントの決定も達成することができる。2つの配列の比較のために利用される数値計算用アルゴリズムの好ましい非制限的例は、Karlin and Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264−2268,modified as in Karlin and Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873−5877のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215:403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれる。例えば、スコア=100、語長=12に対するNBLASTヌクレオチドプログラムパラメータセットによりBLASTヌクレオチド調査を行って、本願の核酸分子と同種のヌクレオチド配列を得ることができる。例えば、スコア−50、語長=3に対するXBLASTプログラムパラメータセットによりBLASTタンパク質調査を行って、本明細書に記載のタンパク質分子と同種のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のために間隙のある整列を得るために、Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:3389−3402に記載されるように、間隙のあるBLASTを利用することができる。代替的に、プサイ−BLASTを使用して、分子間の距離関係を検出する反復調査(同文献)を行うことができる。BLAST、間隙のあるBLAST、およびプサイ−Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの(例えば、XBLASTおよびNBLASTの)デフォルトパラメータを使用することができる(例えば、NCBIウェブサイトを参照されたい)。配列の比較のために利用される数値計算用アルゴリズムの別の好ましい非制限的例は、Myers and Miller,1988,CABIOS 4:11−17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列整列ソフトウエアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重量残基表、12の間隙長さペナルティ、および4の間隙ペナルティを使用することができる。間隙を可能にするか、または可能にすることなく、上記に記載のものと同様の技術を使用して、2つの配列間の同一性パーセントを決定することができる。同一性パーセントの計算では、典型的には、完全な一致のみが計数される。
抗体について、IMGTまたはその他(例えばKabat番号付け慣習)によって抗体配列が最大限に整列された場合に、配列相同性の割合を判定することができる。整列後、対象の抗体領域(例えば、重鎖または軽鎖の全成熟可変領域)が参照抗体の同じ領域と比較されている場合、対象と参照抗体領域との間の配列同一性の割合は、対象および参照抗体領域の両方において同じアミノ酸によって占められる位置の数を、間隙を計数しない、2つの領域の整列位置の合計数によって除算し、100で乗算して割合に変換したものである。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖、ヒト化および他のキメラ抗体ならびにそれらの結合断片を含むことが意図される。抗体は、組み換え源に由来し得、かつ/または遺伝子導入動物中に生産され得る。生化学的技術の使用を通して生産され得るか、またはライブラリーから単離され得る、ヒト抗体も含まれる。ヒト化抗体またはキメラ抗体は、1つもしくは複数のアイソタイプまたはクラスからの配列を含み得る。
「単離抗体」という語句は、抗体を生産した供給源、例えば、動物、ハイブリドーマ、または他の細胞株(抗体を生産する組み換え細胞など)から除去されたインビボまたはインビトロで生産された抗体を指す。単離抗体は、任意選択的に、「精製され」ており、これは、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または99%の純度を意味する。
本明細書で使用される場合、無傷もしくは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部もしくは一部分に対する、抗原に結合するか、または無傷抗体と競合する、「結合断片」という用語。例示的な結合断片は、限定されないが、Fab、Fab´、F(ab´)2、scFv、dsFv、ds−scFv、二量体、ナノボディ、低分子化抗体、二特異性抗体、およびそれらの多量体を含む。断片は、無傷もしくは完全な抗体または抗体鎖の化学的もしくは酵素処理を介して得ることができる。組み換え手段によっても、断片を得ることができる。例えば、F(ab´)2断片は、ペプシンにより抗体を処理することによって生成することができる。結果として生じたF(ab´)2断片を処理して、ジスルフィド架橋を減少させ、Fab´断片を生産することができる。パパイン消化は、Fab断片の形成をもたらし得る。Fab、Fab´、およびF(ab´)2、scFv、dsFv、ds−scFv、二量体、低分子化抗体、二特異性抗体、二重特異的抗体断片、ならびに他の断片も、組み換え発現技術によって構成され得る。
当該技術分野で認識されている「IMGT番号付け」または「免疫遺伝学データベース番号付け」という用語は、抗体の重鎖および軽鎖可変領域、またはその抗原結合部分における他のアミノ酸残基よりも可変(すなわち、超可変)であるアミノ酸残基を番号付けするシステムを指す。
本明細書で参照されるCDR配列は、IMGTまたはNCBI生殖細胞系V遺伝子データベースに対するBLASTとの整列を調査するIGBlast同定に基づいている。配列がIMGT番号付けに対応することも確認された。可変領域についての全配列が提供されているので、Kabatなどの他の慣習に基づいて、CDRを同様に同定することが可能である。
抗体がTTEQ(配列番号1)などの特定された残基内のエピトープに結合すると述べられる場合、抗体が特定された残基またはそれらの一部、例えば、立体配座選択的方法における少なくとも1残基または少なくとも2残基を含有するポリペプチドに選択的または特異的に結合することを意味する。このような抗体は、TTEQ(配列番号1)のすべての残基に接触する必要はなく、当該エピトープ内のすべての単一のアミノ酸置換または欠失が、結合親和性に必ずしも有意に、または等しく影響を与える必要はない。
本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」という用語は、本明細書に記載のペプチドまたは化合物に負荷または導入することができ、直接または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生産することができる、ペプチド配列、蛍光タンパク質などの部分を指す。例えば、標識は、3H、13N、14C、18F、32P、35S、123I、125I、131Iなどの放射線不透過性陽電子放出放射性核種(例えば、PET撮像において使用するための)もしくは放射性同位体;フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリンなどの蛍光(蛍光色素分子)もしくは化学発光(発色団)化合物;アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素;撮像剤;または金属イオンであり得る。検出可能な標識はまた、例えば二次抗体を使用して、間接的に検出可能であり得る。
本明細書で使用される場合、「ミスフォールドTDP−43中に選択的に提示されるか、またはアクセス可能なエピトープ」という用語は、単量体、二量体、または凝集形態であるかどうかにかかわらずALSまたはFTD(例えば、疾患関連のミスフォールドTDP−43)中に存在するミスフォールドTDP−43上で選択的に提示されるか、またはアクセス可能であるが、TDP−43の天然型の正しく折り畳まれたホモ二量体の分子表面上ではない、エピトープを指す。
本明細書で使用される場合、「TTEQからなるエピトープ」という語句は、残基のうちの任意の1つ以上が例えばアラニンに対して突然変異した突然変異TTEQ(配列番号1)ペプチドと比較して、TTEQ(配列番号1)ペプチドに優先的に結合する抗体によって特異的かつ優先的に結合される、エピトープ、任意選択的に、立体配座エピトープを示す。同様に、本明細書で使用される場合、「立体配座エピトープがTTEQからなる」という語句は、別の立体配座(例えば天然型)上の特定の立体配座(例えば、ミスフォールドタンパク質、環状化合物、またはいくつかの他の制限された立体配座)において、任意選択的に、残基のうちの少なくとも1つ以上が、例えばアラニンに対して突然変異した場合(例えば、TTEQ(配列番号1)を含むペプチドの環状立体配座、対、残基のうちの1つ以上が突然変異したペプチドの環状立体配座)に、TTEQ(配列番号1)に優先的に結合する抗体によって特異的に結合されるエピトープを示す。
「TTEQまたはその一部からなるエピトープ」という語句は、残基のうちの少なくとも1つ以上、任意選択的に、115T、116T、117E、および/または118Qが、アラニンに対して突然変異したか、または不存在である場合のペプチドと比較して、TTEQ(配列番号1)ペプチドに特異的または優先的に結合する抗体によって特異的に結合されるエピトープを示す。同様に、本明細書で使用される場合、「立体配座エピトープがTTEQまたはその一部からなる」という語句は、別の立体配座(例えば、天然型立体配座)上で特定の立体配座(例えばミスフォールドタンパク質、環状、またはいくつかの他の制限された立体配座)にある場合に、任意選択的に、残基のうちの少なくとも1つ以上、任意選択的に115T、116T、117E、および/または118Qがアラニンに対して突然変異したか、または不存在である場合(例えば、TTEQ(配列番号1)を含むペプチドの環状立体配座、対、残基のうちの1つ以上が突然変異したか、または不存在であるペプチドの環状立体配座)に、TTEQ(配列番号1)またはその一部に優先的に結合する抗体によって特異的に結合されるエピトープを示す。
本明細書で使用される場合、「より大きい親和性」という用語は、抗体Xが標的Zよりも強く(Kon)、かつ/またはより小さい解離定数(Koff)で標的Yに結合する抗体結合の程度を指し、この文脈において、抗体Xは、Zに対するよりも標的Yに対してより大きい親和性を有する。同様に、本明細書で「より小さい親和性」という用語は、抗体Xが標的Zよりも弱く、かつ/またはより大きい解離定数で標的Yに結合する抗体結合の程度を指し、この文脈において、抗体Xは、Zに対するよりも標的Yに対してより小さい親和性を有する。抗体とその標的抗原との間の結合親和性は、KDがkon/koffに等しい、1/KDに等しいKAとして表され得る。konおよびkoff値は、(例えば、Biacoreシステムを使用して測定可能な)表面プラズモン共鳴を使用して測定することができる。
また、本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、抗体の生産を引き出し、T細胞、および免疫原の抗原性部分に対して方向付けされた他の反応性免疫細胞を活性化する物質を指す。
本明細書で使用される場合、「免疫原」は、免疫応答を引き起こし、かつ/または抗体の生産をもたらす物質を意味する。例えばKLHに接合された単離化合物を含む、本明細書に記載の免疫原性化合、接合、および融合に加えて、同定されたエピトープ、例えばTTEQおよび/またはTTEなどの関連するエピトープに対して交差反応性抗体を引き出すペプチド模倣体を用いることができる。有用な免疫原として機能するために、TDP−43ペプチドは、望ましくは、最小限T115および/またはT116および/またはE117を含む、最小約3、4、5、6、または7つのTDP−43残基を組み込み、任意選択的に、KLHなどの免疫原性増強剤を組み込む。環状ペプチド中の残基の数が増加するにつれて、構成は、直鎖状ペプチドに対して立体配座的により類似する。天然型構造と比較して、ミスフォールド状態の類似性の最適な程度は、約7〜9つの残基で生じる(表6Cおよび表8Aを参照されたい)。
環状化合物に関して「対応する直鎖状化合物」という用語は、環状化合物と同じ配列または化学的部分を含むか、またはこれらからなるが、直鎖状(非環化)形態にある、化合物、任意選択的にペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「核酸配列」という用語は、天然に生じる塩基、糖、および糖間(骨格)連結からなるヌクレオシドまたはヌクレオチド単量体の配列を指す。この用語はまた、天然に生じない単量体またはそれらの一部分を含む、修飾または置換された配列を含む。本願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列(DNA)またはリボ核酸配列(RNA)である場合があり、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む、天然に生じる塩基を含み得る。配列はまた、修飾塩基を含有し得る。このような修飾塩基の例には、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシル、ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが含まれる。核酸は、二本鎖または一本鎖のいずれかである可能性があり、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、「核酸」という用語は、相補的核酸配列ならびにコドン最適化または同義コドン同等物を含む。本明細書で使用される場合、「単離核酸配列」という用語は、組み換えDNA技術、または化学的前駆体によって生産された場合の細胞物質もしくは培地、または化学的に合成された場合の他の化学物質を実質的に含まない核酸を指す。単離核酸はまた、核酸が由来する核酸(すなわち、核酸の5´および3´末端に位置する配列)を天然に側面に配置する配列を実質的に含まない。
作動的に連結される」とは、核酸の発現を可能にする方法で核酸が調節配列に連結されることを意味することを意図している。好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫の遺伝子を含む、様々な供給源に由来し得る。適切な調節配列の選択は、選択される宿主細胞に応じ、当業者によって容易に達成することができる。このような調節配列の例には、翻訳開始シグナルを含む、転写プロモーターおよびエンハンサー、またはRNAポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列が含まれる。さらに、選択される宿主細胞および用いられるベクターに応じて、複製起点、追加のDNA制限部位、エンハンサー、転写の誘導性をもたらす配列などの他の配列が、発現ベクターに組み込まれ得る。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、当該核酸分子を、例えば、原核細胞および/もしくは真核細胞に導入することを可能にし、かつ/またはゲノムに導入することを可能にする、核酸分子のための任意の中間ビヒクルを含み、プラズミド、ファージミド、バクテリオファージまたはレトロウイルス系ベクターなどのウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを含む。本明細書で使用される場合、「プラズミド」という用語は、遺伝子的に、染色体DNAから独立して複製することができる、染色体外遺伝子物質の構成、通常、環状DNA二本鎖を指す。
「少なくとも中程度に厳しいハイブリダイゼーション条件」とは、溶液中の2つの相補的核酸分子間の選択的なハイブリダイゼーションを促進する条件を選択することを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子のすべてまたは一部分に生じ得る。ハイブリダイズ部分は、典型的には、長さが少なくとも15(例えば、20、25、30、40、または50)ヌクレオチドである。当業者であれば、核酸二本鎖、またはハイブリッドの安定性は、緩衝液を含有するナトリウム中で、ナトリウムイオン濃度および温度の関数(Tm=81.5°C−16.6(ログ10[Na+])+0.41(%(G+C)−600/I)、または同様の方程式)である、Tmによって判定されることを理解するであろう。したがって、ハイブリッドの安定性を判定する洗浄条件におけるパラメータは、ナトリウムイオン濃度および温度である。既知の核酸分子と類似しているが同一でない分子を同定するために、1%の不一致は、Tmにおける約1℃の減少をもたらすことが想定され得、例えば、核酸分子が>95%同一性を有することが求められる場合、最終洗浄温度は、約5℃減少されるであろう。これらの検討に基づいて、当業者であれば、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することができるであろう。好ましい実施形態では、厳しいハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、以下の条件を用いて、厳しいハイブリダイゼーション:上記の方程式に基づくTm−5℃の5×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)/5×デンハルト溶液/1.0%のSDSでのハイブリダイゼーション、その後の60℃での0.2×SSC/0.1%のSDSの洗浄を達成することができる。中程度に厳しいハイブリダイゼーション条件は、42℃での3×SSCにおける洗浄ステップを含む。しかしながら、代替的緩衝液、塩、および温度を使用して、同等の厳密性を達成することができることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関する追加の手引きを以下に見出すことできる。Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons,N.Y.,2002,and in:Sambrook et al.,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001。
本明細書で使用される場合、抗体を参照して「特異的に結合する」とは、抗体がその標的抗原を認識し、構造的に異なる抗原および/または修飾または突然変異した配列を含む抗原に対するよりも大きい親和性によりその標的に結合することを意味する。例えば、多価抗体は、少なくとも1e−6、少なくとも1e−7、少なくとも1e−8、少なくとも1e−9、または少なくとも1e−10のKDでその標的に結合する。少なくとも1e−8よりも大きい親和性が好ましい。可変ドメインを含むFab断片などの抗原結合断片は、非断片化抗体との多価相互作用よりも10倍または100倍小さい親和性でその標的を発見し得る。
本明細書で使用される場合、TDP−43(例えば天然型、またはミスフォールドタンパク質)の形態と優先的に結合する抗体に関して「選択的」という用語は、結合タンパク質が、少なくとも3倍、または少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも100倍、少なくとも250倍、少なくとも500倍、または少なくとも1000倍以上大きい親和性により形態に結合することを意味する。したがって、特定の立体配座(例えば、ミスフォールドタンパク質、環状ペプチド)に対してより選択的な抗体は、別の形態と比較して、少なくとも3倍などより大きい親和性によりTDP−43と優先的に結合する
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、TTEQ(配列番号1)エピトープペプチドを含むペプチドに共有結合され、任意選択的に、TTEQ(配列番号1)ペプチドのN末端およびC末端に連結されて、環状化合物を生産し得る、化学的部分を意味する。リンカーは、システイン残基などのスペーサーおよび/または1つ以上の官能性部分を含み得る。リンカーは、官能性部分を介して、担体タンパク質、またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などの免疫原向上成分に連結され得る。リンカーは、例えば、1〜9個のアミノ酸であり得る。
本明細書で使用される場合、「スペーサー」という用語は、ペプチドのN末端およびC末端に直接または間接的に共有結合されて、ペプチド自体よりも長い長さの環状化合物を生産することができる、任意の非免疫原性または低免疫原性化学的部分を意味し、例えば、スペーサーは、TTEQ(配列番号1)からなるペプチドのN末端およびC末端に連結されて、TTEQ(配列番号1)配列自体よりも長い骨格長さの環状化合物を生産することができる。すなわち、環化された場合、スペーサー(例えば、3つのアミノ酸残基のうちの)を含むペプチドは、スペーサーを含まないペプチドよりもより大きい閉鎖円を成す。スペーサーは、限定されないが、例えば、GTTEQG(配列番号4)TTEQG(配列番号5)、GTTEQ(配列番号6)などであるペプチドと組み合わせた場合の、G、A、またはPEGの繰り返しなどの非免疫原性部分を含み得る。スペーサーは、スペーサー内に散在され得るか、またはスペーサーの一方の末端または両方の末端に共有結合され得る、1つ以上のシステイン(C)残基などの1つ以上の官能化部分を含むか、またはこれらに結合され得る。CまたはD残基などの官能性部分がスペーサーの1つ以上の末端に共有結合した場合、スペーサーは、間接的に、ペプチドに共有結合する。スペーサーはまた、ビオチン分子がアミノ酸残基に導入された場合のように、スペーサー残基中に官能性部分を含み得る。
本明細書で使用される場合、「官能性部分」という用語は、本明細書で使用される場合、原子または単一原子の別の群と反応して、2つの群と原子との間の化学的相互作用を形成する原子または単一原子の群(いわゆる「相補的官能基」)を指す、「官能基」を含む化学成分を指す。システインの場合、官能基は、反応されてジスルフィド結合を形成することができる−SHであり得る。したがって、リンカーは、例えば、CCCであり得る。原子の別の群との反応は、例えば、Kd〜1e−14を有し得る、ビオチン−ストレプトアビジン結合の場合のように、共有結合または強い非共有結合であり得る。本明細書で使用される場合、強い非共有結合とは、少なくとも1e−9、少なくとも1e−10、少なくとも1e−11、少なくとも1e−12、少なくとも1e−13、または少なくとも1e−14のKdとの相互作用を意味する。
タンパク質および/または他の薬剤は、環状化合物に対して官能化(例えば、結合)されて、免疫原性を助けるか、またはインビトロ研究においてプローブとして作用するかのいずれかであり得る。この目的のために、反応すること(例えば、共有結合するか、または非共有結合であるが、強く結合する)ができる任意の官能性部分を使用し得る。特定の一実施形態では、官能性部分は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などの免疫原性向上成分、またはインビトロ免疫ブロットまたは免疫組織化学的アッセイのために使用されるウシ血清アルブミン(BSA)などの担体タンパク質であり得る、対象となるタンパク質上の不対のシステインとのジスルフィド結合を形成するように反応されるシステイン残基である。
本明細書で使用される場合、「〜と反応する」という用語は、遺伝子的に、化学的相互作用の形成をもたらす電子流または静電荷の転写があることを意味する。
本明細書で使用される場合、「動物」または「対象」という用語は、任意選択的に、ヒトを含むか、または除外する、哺乳動物を含む動物界のすべてのメンバーを含む。
本開示の範囲の理解において、「〜からなる」という用語およびその派生物は、本明細書で使用される場合、述べられた特徴、要素、成分、群、整数、および/またはステップの存在を特定する、閉鎖形式の用語であり、また、他の述べられていない特徴、要素、成分、群、整数、および/またはステップの存在を除外することを意図している。
本明細書での終点による数的範囲の列挙には、その範囲内に包含されるすべての数および分数を含む(例えば、1〜5は、1、1.5、2、2.75、3、3.90、4、および5を含む)。すべての数およびそれらの分数は、「約」という用語によって修正されることが推定されることも理解されるべきである。さらに、「1つ(a)」、「1つ(an)」、および「その(the)」とは、別段内容が明確に指定しない限り、複数の指示対象を含むことが理解されるべきである。「約」という用語は、参照される数のプラスまたはマイナス0.1〜50%、5〜50%、または10〜40%、好ましくは10〜20%、より好ましくは10%または15%を意味する。
さらに、特定のセクションに記載されている定義および実施形態は、当業者によって理解されるように好適であると記載されている本明細書の他の実施形態に適用可能であることが意図されている。例えば、以下の節では、本発明の異なる態様がより詳細に定義されている。このように定義された各態様は、明確に反対と示されない限り、いずれかの他の態様(複数可)と組み合わされ得る。具体的には、好ましいか、または利益があると示されるいずれかの特徴は、好ましいか、または利益があると示されるいずれかの他の特徴(複数可)と組み合わされ得る。
II.エピトープおよび結合タンパク質
本発明者らは、TDP−43タンパク質上のアミノ酸115〜118でのTTEQ(配列番号1)、およびTDP−43タンパク質上のアミノ酸115〜117でのTTEを含む、TDP−43中のエピトープを同定した、本発明者らは、さらに、これらのエピトープまたはそれらの一部が立体配座エピトープであること、およびTTE、TEQ、またはTTEQ(配列番号1)、またはそれらの一部が、TDP−43のミスフォールドタンパク質種における抗体結合に選択的にアクセス可能であり得ることを同定した。
天然型で同定されたエピトープと偏倚TDP−43集合体との間で同定された1つ以上の立体配座の差に基づいて、本発明者らは、ミスフォールドTDP−43に選択的または特異的に結合する抗体を生産するための立体配座的に制限された化合物および免疫原を設計した。
当該免疫原を使用して産生される抗体は、ミスフォールドTDP−43を検出するのに有用であり得る。
実施例に記載のように、環状ペプチドシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)、シクロ(CGTTEQG)(配列番号3)、シクロ(CGTTEG)(配列番号28)、およびシクロ(CGTTEGG)(配列番号29)などの環状化合物は、天然型種に関するミスフォールドTDP−43中のエピトープの立体配座を捕捉し得る。例えば、環状9量体シクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)中のアミノ酸についての溶媒アクセス可能な表面領域、RMSD構造的整列、および二面角分布は、天然型集合体中の対応する数量とは有意に異なることが見出された。これは、環状化合物が、天然型集合体中に提示される配列とは立体配座的に区別される立体配座エピトープを提供し得ることを示唆している。
III.TTEQ(配列番号1)およびTTE「エピトープ」化合物
したがって、本開示は、アミノ酸TTEQ(配列番号1)またはTDP−43上のアミノ酸残基115〜117に対応するTTE、およびアミノ酸116〜118に対応するTEQからなるTDP−43中の立体配座エピトープを同定する。実施例で実証されているように、TTEQ(配列番号1)およびTTEは、TDP−43中に障害が生じやすい領域として同定された。残基TTEおよびTTEQ(配列番号1)は、コンピュータ予測において現れた。
ミスフォールドTDP−43中に露出され得る領域を同定するために、天然型RRM1および偏倚したRRM1によって示される立体配座における差が存在する。例えば、表5は、E117は、天然型タンパク質中におけるよりも偏倚タンパク質中により多く露出され、環状ペプチドシクロ(CGGTTEQGG)においてまたより多く露出されることを示す。天然型タンパク質中では、この残基は、偏倚立体配置において阻害される、Lys 137を含む塩橋に関与する。
ある態様は、TTEQ(配列番号1)、TTEなどの関連するエピトープおよび/または前述の任意の一部を含むか、またはこれらからなるTDP−43ペプチドを含む化合物を含み、ペプチドがTTEQ(配列番号1)である場合、ペプチドは、天然型TDP−43中のTTEおよび/またはTTEQ(配列番号1)から少なくとも1つの特徴において区別される立体配座にある。実施形態では、TDP−43ペプチドは、TTE、TTEQ(配列番号1)、KTTE(配列番号10)、KTTEQ(配列番号12)、TEQ、TEQD(配列番号8)、またはTTEQD(配列番号9)から選択される。TDP−43ペプチドTTEQD(配列番号9)、TEQD(配列番号8)、KTTEQ(配列番号12)、TTE、およびTEQを使用して、本明細書で集合的にTTEQ(配列番号1)および関連するエピトープと称されるエピトープに含まれる抗体を産生することができる。実施形態では、関連するエピトープは、TTE、TEQD(配列番号8)、KTTE(配列番号10)、およびエピトープTTEに対するTDP−43のN末端またはC末端のいずれかに1、2、または3つのアミノ酸を含むエピトープを含むか、またはこれらからなる。
いくつかの実施形態では、TTE、TEQ、またはTTEQ(配列番号1)を含む、ペプチド、立体配座ペプチドは、TTEQ(配列番号1)、例えば、TTEQD(配列番号9)またはKTTEQD(配列番号7)のTDP−43のN末端および/またはC末端に1つまたは2つの追加の残基を含み得る。例えば、TDP−43におけるTTEQ(配列番号1)に対する3つのアミノ酸のN末端は、PWKであり、TTEQ(配列番号1)に対する3つのアミノ酸のC末端は、DLKである。実施形態では、TDP−43ペプチドは、6つのTDP−43残基の最大値である。実施形態では、TDP−43ペプチドは、5つのTDP−43残基の最大値である。また別の実施形態では、TDP−43ペプチド(例えば、環状化合物などの化合物中の)は、4つのTDP−43残基、任意選択的に、TTEQ(配列番号1)である。
実施形態では、化合物は、リンカーをさらに含む。リンカーは、スペーサーおよび/または1つ以上の官能性部分を含む。リンカーは、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、または9つのアミノ酸、および/またはポリエチレングリコール(PEG)部分などの同等に機能する分子、および/またはそれらの組み合わせを含み得る。実施形態では、スペーサーアミノ酸は、GおよびAなどの非免疫原性または低免疫原性アミノ酸残基から選択され、例えば、スペーサーは、GGG、GAG、G(PEG)G、PEG−PEG(PEG2とも称される)−GGなどであり得る。1つ以上の官能性部分、例えば官能基を含むアミノ酸は、薬剤または検出可能なタグまたはBSAなどの担体またはKLHなどの免疫原性向上成分に化合物を結合させるために含まれ得る。
実施形態では、リンカーは、GC−PEG、PEG−GC、GCG、またはPEG2−CGを含む。
実施形態では、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、または9つのアミノ酸を含む。
TTEまたはTTEQ(配列番号1)を含むペプチドが、TTEQ(配列番号1)に対するN末端および/またはC末端であるTDP−43中に見られる1、2、または3つの追加の残基を含む実施形態では、環化化合物中のリンカーは、TDP−43残基のN末端および/またはC末端に共有結合される(例えば、ペプチドがKTTEQ(配列番号12)である場合、リンカーは、KおよびQ残基に共有結合される)。同様に、TDP−43ペプチドがTTEQ(配列番号1)である場合、リンカーは、残基TおよびQに共有結合され、TDP−43ペプチドがTTEQD(配列番号9)である場合、リンカーは、残基TおよびDに共有結合される。
化合物のタンパク質性部分(またはリンカーがタンパク質性でもある化合物)は、同質の溶液中に固相合成または合成などのタンパク質の化学においてよく知られている技術を使用して、化学的合成によって調製することができる。
実施形態では、化合物は、環状化合物であり、例えば、TTEまたはTTEQ(配列番号1)を含むTDP−43ペプチドが環状化合物に含まれる。本明細書での「環状ペプチド」の参照は、完全にタンパク質性の化合物(例えば、リンカーが2、3、4、5、6、7、8、または9つのアミノ酸である)を指す可能性がある。実施例で判定された環状ペプチドについて記載される特性は、非アミノ酸リンカー分子を含む他の化合物(例えば、環状化合物)に組み込まれ得ることが理解される。
したがって、ある態様は、ペプチドTTEQ(配列番号1)(または、TTEなどのその一部)と、リンカーとを含む環状化合物であって、リンカーが、TTEまたはTTEQ(配列番号1)を含むペプチドに直接または間接的に共有結合され、任意選択的に、T115、T116、E117、および/またはQ118残基のうちの少なくとも1つが、天然型TDP−43中に現れ得るように、TTEQ(配列番号1)を含む天然型集合体中のT、T、E、およびQ残基よりも交互立体配座にあり、任意選択的に、少なくともT、T、E、および/またはQが、例えば、TDP−43二量体中に現れ得るように、TTEQ(配列番号1)を含む天然型集合体中に占められる立体配座よりも、より多く溶媒露出された立体配座または代替的立体配座のいずれかである、環状化合物を提供する。
実施形態では、環状化合物は、TTEまたはTTEQ(配列番号1)および最大6つのTDP−43残基(例えば、TTEまたはTTEQ(配列番号1)に対して1または2(またはTTEの場合、3つの)アミノ酸のN末端および/またはC末端)を含むTDP−43ペプチドと、リンカーとを含み、リンカーは、TDP−43ペプチドのペプチドN末端残基およびC末端残基に直接または間接的に共有結合され、任意選択的に、少なくともT115、T116、E、またはQは、TTEQ(配列番号1)を含む天然型集合体中のT115、T116、E、またはQよりも交互立体配座にあり、かつ/または天然型でのTTEQ(配列番号1)中のT115、T116、E、またはQの立体配座であり、任意選択的に、少なくともT115、T116、E、またはQは、TTEQ(配列番号1)を含む天然型集合体中に占められる立体配座よりも多い表面露出を有する。
環状化合物は、環化の前に、TDP−43ペプチド、任意選択的に、TTEQ(配列番号1)または関連するエピトープを含むペプチドのN末端またはC末端に共有結合されるリンカーを含む直鎖状分子として合成することができる。代替的に、リンカーの一部は、環化の前に、N末端に共有結合され、一部は、C末端に共有結合される。いずれかの場合でも、直鎖状化合物は、例えば、ヘッドトゥーテール環化(例えばアミド結合環化)において環化される。
実施形態では、環状化合物は、TTEQ(配列番号1)を含むか、またはこれからなるペプチドと、リンカーとを含み、リンカーは、ペプチドのN末端およびC末端(例えば、ペプチドがTTEQ(配列番号1)からなる場合のTおよびQ残基に結合される。実施形態では、T、E、および/またはQ残基のうちの少なくとも1つは、TTEQ(配列番号1)を含む天然型集合体中のT、E、および/またはQ残基のうちの少なくとも1つによって占められるよりも環状化合物において交互立体配座にある。
実施形態では、T、E、および/またはQ残基のうちの少なくとも1つは、残基によって、任意選択的に、天然型集合体中のT、E、および/またはQによって占められるよりも環状化合物において交互立体配座にある。
実施形態では、T、E、および/またはQ残基のうちの少なくとも1つは、天然型における残基によって占められるよりも環状化合物において交互立体配座にある。
実施形態では、交互立体配座は、より多く溶媒露出された立体配座である。
実施形態では、少なくともT115は、任意選択的に単独またはT116と組み合わせて、TTEQ(配列番号1)を含む天然型集合体中に占められる立体配座よりも交互立体配座にある。
例えば、交互立体配座は、天然型集合体中の二面角とは異なる、残基T115中の1つ以上の異なる二面角を含み得る。
例えば、交互立体配座は、天然型集合体中の二面角とは異なる、1つ以上の異なる骨格二面角(ラマチャンドラン角度)を含み得る。
実施形態では、環状化合物は、環状化合物と天然型集合体との間の最小平均側鎖/骨格二面角の差を含む。
実施形態では、環状化合物は、T、E、およびQから選択される残基を含み、1つ以上の側鎖または骨格二面角は、天然型集合体の文脈で対応する二面角よりも、環状化合物において、少なくとも30度、少なくとも40度、少なくとも50度、少なくとも60度、少なくとも70度、少なくとも80度、少なくとも90度、少なくとも100度、少なくとも110度、少なくとも120度、少なくとも130度、少なくとも140度、少なくとも150度、少なくとも160度、または少なくとも170度異なる。
図2および3に示すように、T115およびT116のいくつかの骨格および側鎖二面角分布は、天然型集合体と比較して、環状ペプチド集合体において実質的に異なる。例えば、表2Aは、シミュレーションされた天然型集合体および環状ペプチドについて、T115の二面角C−CA−CB−OG1における差が、環状と天然型との間で約−160度である可能性が最も高いことを示している。実施形態では、環状化合物は、天然型集合体の文脈で対応する二面角よりも、少なくとも30度、少なくとも40度、少なくとも50度、少なくとも60度、少なくとも70度、少なくとも80度、少なくとも90度、少なくとも100度、少なくとも110度、少なくとも120度、少なくとも130度、少なくとも140度、少なくとも150度、または少なくとも160度である、C−CA−CB−OG1二面角を含むT残基を含む。同様に、T116二面N−CA−CB−OG1について環状集合体と天然型集合体との間の二面角における差は、約150度である可能性が最も高い。したがって、実施形態では、環状化合物は、直鎖状化合物の文脈で対応する二面角よりも、少なくとも30度異なる、少なくとも40度異なる、少なくとも50度異なる、少なくとも60度異なる、少なくとも70度異なる、少なくとも80度異なる、少なくとも90度異なる、少なくとも100度異なるなど、最大少なくとも150度異なる、二面角N−CA−CB−OG1を含むTを含む。T115二面C−CA−N−HNについて環状ペプチドと天然型集合体との間の最も可能性の高い二面角における対応する差は、50度である。したがって、実施形態では、環状化合物は、天然型集合体の文脈で対応する二面角よりも、少なくとも30度異なる、少なくとも40度異なる、または少なくとも50度異なる、C−CA−N−HNに対する二面角を含むTを含む。T116二面CB−CA−N−HNについて環状ペプチドと天然型集合体との間の最も可能性の高い二面角における対応する差は、−70度である。したがって、実施形態では、環状化合物は、天然型集合体または天然型のいずれかの文脈で対応する二面角よりも、少なくとも30度異なる、少なくとも40度異なる、少なくとも50度異なる、少なくとも60度異なる、または少なくとも70度異なる、CB−CA−N−HNに対する二面角を含むTを含む。上記の角度差は、例えば、正または負、(+)または(−)であり得る。
表4Aに与えられるラマチャンドラン角度のピーク値によると、最も可能性の高いラマチャンドランφおよびψ値は、表4Bにも提示されるように、残基T115、T116、E117、およびQ118について環状集合体と天然型集合体との間で異なる。環状および天然型ピークφ値間のそれぞれの差Δφは、50、−65、−40、および−35度であり、環状および天然型ピークのψ値間のそれぞれの差Δψは、−45、30、40、および50度である。全体的なφ、ψ値は、環状ペプチドと天然型ペプチドとの間で有意に異なる。表3Aは、環状集合体および天然型集合体におけるφ、ψ値の分布の重複を与えている。T115、T116、E117、およびQ118についてのφおよびψ分布の平均重複は、それぞれ、28%、63%、55%、および23%である。これらの数は、合わせて、環状集合体および天然型集合体についての二面角の異なる分布を示している。
実施形態では、環状化合物は、天然型化合物の文脈で対応するラマチャンドラン角度よりも、少なくとも30度、少なくとも40度異なる、少なくとも50度、または少なくとも60度異なる、ラマチャンドラン骨格角度を含むQを含む。
角度差は、正または負、(+)または(−)であり得る。
交互立体配座は、交互骨格配向を含み得る。例えば、天然型形態と比較して、環状エピトープが抗体に対して露出する骨格配向が異なる。
実施形態では、T、T、E、Q、TT、TE、EQ、TTE、TEQ、および/またはTTEQ(配列番号1)は、例えば、天然型集合体などの非ミスフォールドタンパク質立体配座におけるこれらの残基によって占められるものと比較して、交互立体配座にある。
いくつかの実施形態では、TTEQ(配列番号1)、TTE、またはKTTE(配列番号10)を含むペプチドを含む環状化合物は、例えば、TTEQ(配列番号1)の、前述の1つのTDP−43の上流および/または下流に1つ、または2つ以上の残基を含み得る。このような場合、スペーサーは、TDP−43配列の対応する残基の末端のN末端およびC末端に共有結合される。
実施形態では、環状化合物は、配列番号2、3、22、23、28、29、30、31、32、33、34、35、および42、またはそれらの任意のサブセットのうちのいずれか1つから選択される配列を有する。実施形態では、環状化合物は、配列番号28、29、30、31、32、33、34、および35のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。別の実施形態では、環状化合物は、配列番号2、3、22、23、および42から選択される配列を含む。また他の実施形態では、環状化合物は、配列番号29、32、および34のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。また他の実施形態では、環状化合物は、配列番号2、3、22、および23のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。
環化ペプチドを作製するための方法は、当該技術分野において知られており、SS環化またはアミド環化(ヘッドトゥーテール、または骨格環化)を含む。方法は、実施例のセクションにさらに記載されている。例えば、そのN末端およびC末端に「C」残基、例えば、CGTTEQGC(配列番号13)を含むペプチドは、SS環化によって反応されて、環状ペプチドを生産することができる。実施例に記載のように、同定された立体配座エピトープに対するそれらの関連性について、環状化合物を評価した。例えば、TTEQ(配列番号1)またはTTE TDP−43ペプチドを含む環状化合物を使用して、ミスフォールドTDP−43について選択的な抗体を産生し得る。
本明細書に記載のように、エピトープTTEQ(配列番号1)および/またはその一部は、TDP−43のミスフォールドで繁殖する菌株における潜在的な標的であり得、立体配座エピトープを認識する抗体は、例えば、このような繁殖する菌株を検出するのに有用であり得る。
別の態様は、TTE、TTEQ(配列番号1)、または関連するエピトープを含む化合物、任意選択的に、本明細書に記載の環状化合物を含む、免疫原を含む。実施形態では、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などの免疫原性向上成分を含み、かつ/またはアジュバント(例えば、ミョウバン、モノホスホリルリピドA、またはQS21)と同時注入するために製剤化される。他の同様の成分が当該技術分野で知られており、追加のアジュバントが以下に記載される。以下にさらに記載されるように、アジュバントは、典型的には、化合物を含む組成物中に製剤化される。免疫原性向上成分は、アミド結合、ジスルフィド結合などを通して直接か、または化学的リンカーを通して間接的にかのいずれかで化合物に結合され得る。別の実施形態では、免疫原は、多重抗原性ペプチド(MAP)である。例えば、MAPは、環化される直鎖状化合物を調製し、任意選択的に、ヘッドトゥーテール環化を使用してペプチドを環化し、リンカー中のアミノ酸を通して、任意選択的にリンカー中のCまたはD残基を通して、環化ペプチドをMAP樹脂に接合することによって、合成され得る。MAPは、環状構造に対して構成されており(例えば、Misumi et alJ.Virol.December 2001 vol.75 no.23 11614−11620を参照されたい)、本明細書に記載のものと同様の方法を使用し得る。
免疫原性向上成分を含む免疫原は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Lateef et al 2007に記載の方法を使用して、システインなどの官能性部分を含む制限されたエピトープペプチドおよびリンカーを含有する環状化合物を、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などの免疫原性向上成分またはウシ血清アルブミン(BSA)などの担体に接合することによって生産され得る。実施形態では、実施例3に記載の方法を使用する。
さらなる態様は、本明細書に記載の化合物もしくは免疫原のタンパク質性部分をコードする単離核酸である。
IV.抗体、細胞、および核酸
したがって、抗体を産生するために、上記に記載のエピトープTTEQ(配列番号1)または関連するエピトープを含む、化合物、特に環状化合物を使用することができる。TTEQ(配列番号1)または関連するエピトープ、例えば、KTTE(配列番号10)、TTE、TEQ、TTEQD(配列番号9)、KTTEQD(配列番号7)、KTTEQDL(配列番号14)、および/または本明細書に記載の他の関連するエピトープ配列を含む環状化合物を使用して、ミスフォールドTDP−43に選択的に結合する抗体を産生することができる。
したがって、例えば、表11に列挙されるエピトープまたは環状化合物配列を含むものを含む、本明細書に記載の化合物、特に環状化合物を使用して、それらが含み、かつ/または本明細書に記載の1つ以上の異なる特徴を含む、ミスフォールドTDP−43中のこれらの残基の特異的立体配座を認識する、TDP−43中のエピトープに特異的または選択的に結合する抗体を産生することができる。
したがって、ある態様は、TDP−43上でエピトープに特異的または選択的に結合する抗体を含み、エピトープは、TTEQ(配列番号1)、それらの関連するエピトープ、またはその一部、または前述のいずれかの立体配座エピトープを含むか、またはこれらからなる。実施形態では、エピトープがTTEQ(配列番号1)からなる場合、それは、立体配座エピトープである。
実施形態では、抗体は、単離されている。
実施形態では、抗体は、特異的に結合せず、かつ/または天然型TDP−43について選択的でなく、例えば、TTEQ(配列番号1)またはTTEなどの関連するエピトープの立体配座は、天然型TDP−43中に存在する通りである。選択的結合は、本明細書に記載のように、ELISAまたは表面プラズモン共鳴測定を使用して測定することができる。
したがって、さらなる態様は、TDP−43上に存在するエピトープに特異的または選択的に結合する抗体であり、エピトープは、主に抗体の結合に関わる少なくとも1つのアミノ酸残基を含むか、またはこれからなり、少なくとも1つのアミノ酸は、配列TTEQ(配列番号1)、TEQ、またはKTTE(配列番号10)内に埋め込まれたT115、T116、E、またはQであり、任意選択的に、エピトープは、TTEQ(配列番号1)からなる場合、立体配座エピトープである(例えば、対応する天然型集合体に関して交互の任意選択的に溶媒露出される立体配座においてペプチドに選択的に結合し、例えば、エピトープの少なくとも1つのアミノ酸は、より多く溶媒露出される)。実施形態では、エピトープは、主に抗体への結合に関わる少なくとも2つの連続するアミノ酸残基を含むか、またはこれらからなり、少なくとも2つの連続するアミノ酸は、TTEQ(配列番号1)、TTE、またはTEQ内に埋め込まれたTE、またはEQである。
別の実施形態では、エピトープは、立体配座エピトープであり、TTEQ(配列番号1)、TTE、またはTEQからなる。実施形態では、抗体は、TTEQ(配列番号1)、TTE、またはTEQ、または環状化合物中の他の関連するエピトープ、任意選択的に環状ペプチド、任意選択的にシクロ(CGTTEQG)(配列番号3)、または対応する直鎖状ペプチドおよび/または天然型集合体に関して、配列番号2、3、22、23、28、29、30、31、32、33、34、35、および42、またはそれらの任意のサブセットのうちのいずれか1つの配列を有する環状ペプチドに選択的に結合する。
実施形態では、抗体は、本明細書に記載の少なくとも1つの交互立体配座特徴を含む、本明細書に記載のエピトープペプチド(例えば、天然型構造的集合体と比較して、環状化合物中のエピトープの)を含む環状化合物に特異的に結合する。例えば、特定のエピトープ立体配座に結合する抗体は、立体配座特異的抗体とも称され得る。立体配座特異的抗体は、特定のミスフォールドTDP−43種を示差的に認識することができ、天然型種と比較して、1つの種または種の群についてより高い親和性を有し得る。
例えば、実施形態では、抗体は、T、E、およびQから選択される残基を含む環状化合物に特異的に結合し、少なくとも1つの二面角は、天然型構造の文脈で対応する二面角よりも、環状化合物において、少なくとも30度、少なくとも40度、少なくとも50度、少なくとも60度、少なくとも70度、少なくとも80度、少なくとも90度、少なくとも100度、少なくとも110度、少なくとも120度、少なくとも130度、少なくとも140度、または少なくとも150度異なる。
実施形態では、抗体は、任意選択的に、TTEQ(配列番号1)を含む天然型集合体に関してシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)の文脈で、任意選択的に、TTEQ(配列番号1)を含む天然型集合体に関して直鎖状シクロ(CGTTEQG)(配列番号3)の文脈で、TTEQ(配列番号1)またはその一部を含む環状化合物に選択的に結合する。例えば、実施形態では、抗体は、環状立体配座におけるTTEQ(配列番号1)またはTTEに選択的に結合し、任意選択的に、本明細書に記載の方法を使用して、例えば、ELISA、免疫組織化学、または表面プラズモン共鳴によって測定されるように、天然型集合体におけるTTEQ(配列番号1)またはTTEと比較して、環状立体配座におけるTTEQ(配列番号1)またはTTEについて、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍または少なくとも1000倍より選択的なより大きい選択性(例えば、結合親和性)を有する。
実施形態では、抗体を生産するために選択的に結合され、かつ/または使用される環状化合物は、表11の化合物である。別の実施形態では、当該環状化合物は、配列番号2、3、22、23、28、29、30、31、32、33、34、35、および42、またはそれらの任意のサブセットから選択される環状化合物である。実施形態では、環状化合物は、配列番号28、29、30、31、32、33、34、および35のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。別の実施形態では、環状化合物は、配列番号2、3、22、23、および42から選択される配列を含む。また他の実施形態では、環状化合物は、配列番号29、32、および34のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。また他の実施形態では、環状化合物は、配列番号2、3、22、および23のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。
実施形態では、選択的に結合された環状化合物は、表11の化合物である。実施形態では、選択性は、天然型TDP−43から選択されるTDP−43の種にわたる環状化合物および/またはミスフォールドTDP−43ポリペプチドについて、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、または少なくとも1000倍より選択的である。
また別の態様では、本開示は、配列番号2、3、22、23、28、29、30、31、32、33、34、35、および42のうちのいずれか1つから選択される配列を有する環状ペプチドへの選択的な結合を競合する抗体を提供する。
モノクローナル抗体を生産するために、抗体生産細胞(リンパ球)は、本明細書に記載の免疫原により免疫付与され、標準的な体細胞の融合手順の骨髄腫細胞により融合され、よってこれらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を生じる、対照から採取され得る。このような技術は、当該技術分野でよく知られている(例えば、KohlerおよびMilsteinによって元々開発されたハイブリドーマ技術(Nature 256:495−497(1975))、ならびにヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al.,Immunol.Today 4:72(1983))、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Cole et al.,Methods Enzymol,121:140−67(1986))、および組み合せ抗体ライブラリーのスクリーニング(Huse et al.,Science 246:1275(1989))などの他の技術)。ハイブリドーマ細胞は、所望のエピトープに特異的に反応的な抗体の生産について免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。
特定の抗原または分子に対して反応的な特異的抗体または抗体断片はまた、細胞表面成分を含む細菌中に発現される、免疫グロブリン遺伝子またはそれらの一部分をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることによって生成され得る。例えば、完全なFab断片、VH領域、およびFV領域は、ファージ発現ライブラリーを使用して細菌中に発現され得る(例えば、Ward et al.,Nature 41:544−546(1989)、Huse et al.,Science 246:1275−1281(1989)、およびMcCafferty et al.,Nature 348:552−554(1990)を参照されたい)。
非ヒト種由来の抗体のヒト化は、文献によく記載されている。例えば、EP−B1 0 239400 and Carter&Merchant 1997(それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Curr Opin Biotechnol 8,449−454,1997)を参照されたい。ヒト化抗体はまた、商業的に容易に入手可能である(例えば、Scotgen Limited,2 Holly Road,Twickenham,Middlesex,Great Britain.)。
げっ歯類抗体のヒト化形態は、CDR移植によって容易に生成される(Riechmann et al.Nature,332:323−327,1988)。この手法では、げっ歯類モノクローナル抗体の抗原結合部位を含む6つのCDRループは、対応するヒトフレームワーク領域に連結される。CDR移植は、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原認識に影響を与え得るため、親和性が低減した抗体を生じることが多い(Foote&Winter.J Mol Biol,224:487−499,1992)。抗体の親和性を維持するために、部位方向付けされた変異原性または他の組み換え技術によって特定のフレームワーク残基を置き換えることが必要であることが多く、抗原結合部位のコンピュータモデリングによって補助され得る(Co et al.J Immunol,152:2968−2976,1994)。
抗体のヒト化形態は、任意選択的に、表面再建によって得られる(Pedersen et al.J Mol Biol,235:959−973,1994)。この手法では、げっ歯類抗体の表面残基のみがヒト化される。
特定の抗原に特異的なヒト抗体は、ファージ表示戦略によって同定され得る(Jespers et al.Bio/Technology,12:899−903,1994)。1つの手法では、特定の抗原に対して方向付けられたげっ歯類抗体の重鎖は、繊維状ファージ上のFab断片として表示するために、ヒト軽鎖のレパートリーからクローン化され、これと対になる。ファージは、抗原に結合することによって選択される。選択されるヒト軽鎖は、その後、ファージ上で表示するためにヒト重鎖のレパートリーと対になり、ファージは、抗原に結合することによって再び選択される。結果は、特定の抗原に特異的なヒト抗体Fab断片である。別の手法では、ファージのライブラリーは、メンバーがそれらの外部表面上に異なるヒト抗体断片(FabまたはFv)を表示する場合に生産される(Dower et al.,WO91/17271およびMcCafferty et al.,WO92/01047)。所望の特異性を有する抗体を表示するファージは、特異的抗原に対する親和性の強化によって選択される。いずれかの手法から同定されるヒトFabまたはFv断片は、哺乳動物細胞中のヒト抗体として発現するために再クローン化され得る。
ヒト抗体は、任意選択的に、遺伝子導入動物から得られる(米国特許第第6,150,584号、同第6,114,598号、および同第5,770,429号)。この手法では、キメラまたは生殖系列突然変異マウスにおける重鎖接合領域(JH)遺伝子を削除する。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイは、その後、このような突然変異マウスに転写される。結果として生じた遺伝子導入マウスは、次に、抗原チャレンジに対するヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができる。
ヒト化またはヒト抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、またはIgEを含む任意のクラスの免疫グロブリン、ならびにIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む任意のアイソタイプから選択される。ヒト化抗体またはヒト抗体は、1つもしくは複数のアイソタイプまたはクラスからの配列を含み得る。さらに、これらの抗体は、典型的には、Fab、Fab´F(ab´)2、Fd、Fv、および単一ドメイン抗体断片などの抗原結合断片として、または重鎖および軽鎖がスペーサーによって連結される単鎖抗体として生産される。また、ヒト抗体またはヒト化抗体は、単量体またはポリマー形態で存在し得る。ヒト化抗体は、任意選択的に、1つの非ヒト鎖および1つのヒト化鎖(すなわち、1つのヒト化重鎖または軽鎖)を含む。
さらに、本明細書に記載のエピトープについて特異的な抗体は、抗体ファージ表示ライブラリーをスクリーニングすることによって容易に単離される。例えば、抗体ファージライブラリは、任意選択的に、疾患特異的エピトープに対して特異的な抗体断片を同定するために、本発明の疾患特異的エピトープを使用することによってスクリーニングされる。同定された抗体断片は、任意選択的に、本発明の異なる実施形態と共に有用である組み換え抗体の変種を生産するために使用される。抗体ファージ表示ライブラリーは、当該技術分野でよく知られている、抗体ファージライブラリをスクリーニングするためのXoma(Berkeley,California)方法を通して、商業的に入手可能である。
以下に示すように、トランスフェクト細胞またはALS脊髄ホモジネート中のミスフォールド疾患関連TDP−43を検出するための陽性であるいくつかの抗体を配列決定した。
したがって、別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、任意選択的に融合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含み、当該CDRの前記アミノ酸配列は、以下の配列を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、任意選択的に融合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含み、当該CDRの前記アミノ酸配列は、以下の配列を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、任意選択的に融合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含み、当該CDRの前記アミノ酸配列は、以下の配列を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、任意選択的に融合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含み、当該CDRの前記アミノ酸配列は、以下の配列を含む。
また別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、任意選択的に融合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含み、当該CDRの前記アミノ酸配列は、以下の配列を含む。
また別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、任意選択的に融合される、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含み、当該CDRの前記アミノ酸配列は、以下の配列を含む。
図13AおよびBに示すように、CDRSは、構造的類似性を共有する。具体的には、いくつかのクローンの軽鎖配列が類似している。
実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。実施形態では、抗体は、表10に列挙されるCDR配列を含むヒト化抗体などのキメラ抗体である。
別の実施形態では、任意選択的に、単鎖抗体の文脈で、表10のCDRならびに軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体も提供する。
また別の態様では、抗体は、i)配列番号46に記載のアミノ酸配列、ii)配列番号46と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、CDR配列が、配列番号67、68、および69に記載される通りである、アミノ酸配列、またはiii)i)の保存的置換アミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では抗体は、i)配列番号48に記載のアミノ酸配列、ii)配列番号48と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、CDR配列が、配列番号70、71、および72に記載される通りである、アミノ酸配列、またはiii)i)の保存的置換アミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号45に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。別の実施形態では、抗体は、配列番号47に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号46に記載のアミノ酸配列を含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号48に記載のアミノ酸配列を含む。
また別の態様では、抗体は、i)配列番号50に記載のアミノ酸配列、ii)配列番号50と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、CDR配列が、配列番号73、74、および75に記載される通りである、アミノ酸配列、またはiii)i)の保存的置換アミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では抗体は、i)配列番号52に記載のアミノ酸配列、ii)配列番号52と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、CDR配列が、配列番号76、77、および78に記載される通りである、アミノ酸配列、またはiii)i)の保存的置換アミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号49に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。別の実施形態では、抗体は、配列番号51に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号50に記載のアミノ酸配列を含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号52に記載のアミノ酸配列を含む。
また別の態様では、抗体は、i)配列番号54に記載のアミノ酸配列、ii)配列番号54と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、CDR配列が、配列番号73、79、および80に記載される通りである、アミノ酸配列、またはiii)i)の保存的置換アミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、i)配列番号56に記載のアミノ酸配列、ii)配列番号56と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、CDR配列が、配列番号76、77、および81に記載される通りである、アミノ酸配列、またはiii)i)の保存的置換アミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号53に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。別の実施形態では、抗体は、配列番号55に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号54に記載のアミノ酸配列を含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号56に記載のアミノ酸配列を含む。
また別の態様では、抗体は、i)配列番号58に記載のアミノ酸配列、ii)配列番号58と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、CDR配列が、配列番号67、68、および82に記載される通りである、アミノ酸配列、またはiii)i)の保存的置換アミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、i)配列番号60に記載のアミノ酸配列、ii)配列番号60と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、CDR配列が、配列番号83、84、および85に記載される通りである、アミノ酸配列、またはiii)i)の保存的置換アミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号57に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。別の実施形態では、抗体は、配列番号59に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号58に記載のアミノ酸配列を含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号60に記載のアミノ酸配列を含む。
また別の態様では、抗体は、i)配列番号62に記載のアミノ酸配列、ii)配列番号62と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、CDR配列が、配列番号86、87、および88に記載される通りである、アミノ酸配列、またはiii)i)の保存的置換アミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、i)配列番号64に記載のアミノ酸配列、ii)配列番号64と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、CDR配列が、配列番号76、77、および92に記載される通りである、アミノ酸配列、またはiii)i)の保存的置換アミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号61に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。別の実施形態では、抗体は、配列番号63に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号62に記載のアミノ酸配列を含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号64に記載のアミノ酸配列を含む。
また別の態様では、抗体は、i)配列番号66に記載のアミノ酸配列、ii)配列番号66と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、CDR配列が、配列番号89、90、および91に記載される通りである、アミノ酸配列、またはiii)i)の保存的置換アミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、i)配列番号64に記載のアミノ酸配列、ii)配列番号64と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、CDR配列が、配列番号76、77、および92に記載される通りである、アミノ酸配列、またはiii)i)の保存的置換アミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号65に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされる。別の実施形態では、抗体は、配列番号63に記載のヌクレオチド配列またはそのコドン縮退もしくは最適化バージョンによってコードされた軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号66に記載のアミノ酸配列を含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号64に記載のアミノ酸配列を含む。
別の態様は、表10に列挙されるCDR配列を有する抗体と同じエピトープに特異的に結合する抗体である。
別の態様は、本明細書に記載の環状化合物、および/または表10に列挙されるCDR配列を含む抗体などの本明細書に記載の抗体を含むヒトミスフォールドTDP43との結合について競合する抗体を含む。
抗体間の競合は、例えば、共通抗原との参照抗体の特異的結合を阻害する能力について試験下の抗体を評価するアッセイを使用して判定することができる。試験抗体は、過剰の試験抗体(例えば、少なくとも2倍、5倍、10倍、または20倍)が、参照抗体の結合を、競合的結合アッセイで測定されるように、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%阻害する場合に、参照抗体と競合する。
さらなる態様は、検出可能な標識に接合された抗体である。実施形態では、検出可能な標識は、陽電子放出放射性核種である。陽電子放出放射性核種は、例えば、PET撮像において使用することができる。実施形態では、抗体は、血液脳関門にわたる、かつ/または細胞への輸送を許容する輸送部分に接合される。例えば、抗体は、鉄輸送タンパク質メラノトランスフェリン(p97)に共有結合され得るか、またはトランスフェリン受容体、インスリン受容体、リポタンパク質受容体、Basigin、Glut1、またはCD98hcなどのBBB受容体に対して特異的な抗体断片に融合され得る。別の例は、他のBBB表面受容体に対して方向付けされたBBB浸透性単一ドメイン抗体FC5または単一ドメイン抗体に融合される。実施形態では、抗体は、細胞内凝集TDP43の診断的検出のための細胞内へのエントリを容易にする輸送部分に接合される。例えば、抗体は、トランス活性化転写活性化因子(TAT)およびTAT誘導体、ペネトラチン、またはトランスポータンなどの細胞貫通ペプチドに化学的に連結され得るか、または組み換え融合される。
さらなる態様は、本明細書に記載の抗体および/またはそれらの結合断片およびミスフォールドTDP−43を含む抗体複合体に関する。さらなる態様は、本明細書に記載の抗体またはその一部をコードする単離核酸である。
重鎖または軽鎖をコードする核酸、例えば、本明細書に記載のCDR−H1、CDR−H2、および/またはCDR−H3領域を含む重鎖をコードするか、または本明細書に記載のCDR−L1、CDR−L2、および/またはCDR−L3領域を含む軽鎖をコードする核酸も提供する。
本開示は、本明細書に開示の抗体および/またはその結合断片をコードする核酸配列の変異も提供する。例えば、変異は、少なくとも中程度に厳しいハイブリダイゼーション条件またはコドン縮退または最適化された配列の下で、本明細書に開示の抗体および/またはその結合断片をコードする核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、変異核酸配列は、配列番号45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、および65のうちのいずれか1つをコードする核酸配列に対して、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%、よりいっそう好ましくは少なくとも90%、さらに最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する。
別の態様は、本明細書に開示の核酸を含む発現カセットまたはベクターである。実施形態では、ベクターは、単離ベクターである。
ベクターは、抗体および/もしくはその結合断片を生産するか、または本明細書に記載のペプチド配列を発現するのに好適なベクターを含む、任意のベクターであり得る。
核酸分子は、既知の方法で、タンパク質の発現を確保する適切な発現ベクターに組み込まれ得る。可能な発現ベクターは、限定されないが、コスミド、プラズミド、または修飾ウイルス(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)を含む。ベクターは、使用される宿主細胞と互換性があるべきである。発現ベクターは、「宿主細胞の形質変換に好適」であり、発現ベクターが、本明細書に記載のエピトープまたは抗体に対応するペプチドをコードする核酸分子を含有することを意味する。
実施形態では、ベクターは、例えば、遺伝子治療による単鎖抗体を発現するのに好適である。ベクターは、例えば、神経特異的プロモーターなどを使用して、神経組織における特異的発現のために適合され得る。実施形態では、ベクターは、IRESを含み、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の発現を可能にする。このようなベクターを使用して、インビボで抗体を送達することができる。
好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫遺伝子を含む、様々な供給源に由来し得る。
このような調節配列の実施例には、翻訳開始シグナルを含む、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはRNAポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列が含まれる。さらに、選択される宿主細胞および用いられるベクターに応じて、複製起点、追加のDNA制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性をもたらす配列などの他の配列が、発現ベクターに組み込まれ得る。
実施形態では、調節配列は、神経組織および/または細胞における発現を方向付けるか、または増加させる。
実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
組み換え発現ベクターはまた、本明細書に記載の抗体またはエピトープペプチドを発現するためのベクターで形質転換されるか、影響を受けるか、またはトランスフェクトされる宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を含有し得る。
組み換え発現ベクターはまた、組み換えペプチドの発現または安定性の増加、組み換えペプチドの溶解度の増加、および例えば、本明細書に記載のタグおよび標識を含む、親和性精製におけるリガンドとして作用することによる、標的組み換えペプチドの精製の補助を提供する、融合部分(すなわち、「融合タンパク質」)をコードする発現カセットを含有し得る。さらに、タンパク質分解性開裂部位は、標的組み換えタンパク質に追加されて、融合タンパク質の精製後の融合部分からの組み換えタンパク質の分離を可能にすることができる。典型的な融合発現ベクターは、それぞれ、グルタチオンS転移酵素(GST)、マルトースE結合タンパク質、またはタンパク質Aを組み換えタンパク質に融合させる、pGEX(Amrad Corp.,Melbourne,Australia)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)、およびpRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)を含む。
遺伝子を、例えば神経細胞および神経組織に、インビトロおよびインビボの両方で転写するためのシステムは、ウイルス、最も注目すべきは、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、およびレンチウイルスを含むレトロウイルスに基づくベクターを含む。遺伝子送達のための代替的手法は、裸のプラズミドDNAならびにリポソーム−DNA複合体の使用を含む。別の手法は、DNAがポリカチオン縮合されたAAVプラズミド、および脳内遺伝子送達により脳に捕捉および導入される脂質の使用である(Leone et al.US Application No.2002076394)。
したがって、別の態様では、本明細書に記載の化合物、免疫原、核酸、ベクター、および抗体は、例えば、本明細書に記載の抗体、化合物、免疫原、および核酸の送達のために、リポソーム、ナノ粒子、およびウイルスタンパク質粒子などのベシクル中に製剤化され得る。具体的には、ポリマーソームを含む合成ポリマーベシクルを使用して、抗体を投与することができる。
別の態様では、本明細書に記載の抗体またはその一部を発現する細胞も提供する。実施形態では、細胞は、本明細書に記載の抗体を発現するか、または本明細書に開示のベクターを含む、単離および/または組み換え細胞である。実施形態では、細胞は、ハイブリドーマなどの融合細胞である。
組み換え細胞は、ポリペプチドを生産するのに好適な、例えば、抗体および/またはその結合断片を生産するのに好適な任意の細胞を使用して生成され得る。例えば、核酸(例えばベクター)を細胞に導入するために、細胞は、用いられるベクターに応じて、トランスフェクト、形質転換、または感染され得る。
好適な宿主細胞は、幅広い様々な原核および真核宿主細胞を含む。例えば、本明細書に記載のタンパク質は、E.coliなどの細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルスを使用して)、酵母細胞、または哺乳動物の細胞中に発現され得る。
実施形態では、細胞は、酵母、植物、蠕虫、昆虫、鳥類、魚類、爬虫類、および哺乳動物細胞から選択される真核細胞である。
別の実施形態では、哺乳動物細胞は、骨髄腫細胞、脾臓細胞、またはハイブリドーマ細胞である。
実施形態では、細胞は、神経細胞である。
抗体またはペプチドを発現するのに好適な酵母および真菌宿主細胞は、限定されないが、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、genera Pichia、またはKluyveromyces、および様々な種のgenus Aspergillusを含む。酵母S.cerivisiaeを発現するためのベクターの例には、pYepSec1、pMFa、pJRY88、およびpYES2が含まれる(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)。酵母および真菌の形質転換のためのプロトコルは、当業者によく知られている。
好適であり得る哺乳動物細胞は、他の中でも特に、COS(例えば、ATCC番号CRL 1650または1651)、BHK(例えば、ATCC番号CRL 6281)、CHO(ATCC番号CCL 61)、HeLa(例えば、ATCC番号CCL 2)、293(ATCC番号1573)、およびNS−1細胞を含む。哺乳動物細胞における発現を方向付けるための好適な発現ベクターは、遺伝子的に、プロモーター(例えば、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス40などのウイルス物質に由来する)、ならびに他の転写および翻訳制御配列を含む。哺乳動物発現ベクターの例には、pCDM8およびpMT2PCが含まれる。
実施形態では、細胞は、例えば、TDP43天然型構造上でTDP−43病理学的オリゴマーに選択的に結合するか、直鎖状化合物に関して環状化合物中に提示されたエピトープ配列に選択的に結合するか、またはプラーク結合を欠いているか、もしくはごく少量のプラーク結合を有することを含む、ハイブリドーマ細胞であって、本明細書に記載のエピトープまたはエピトープ配列について特異的および/または選択的な抗体を生成する、ハイブリドーマ細胞などの融合細胞である。
さらなる態様は、本明細書に記載のエピトープに対して特異的な抗体を生産するハイブリドーマ細胞株である。
V.組成物
さらなる態様は、本明細書に記載の化合物、免疫原、核酸、ベクター、または抗体を含む組成物である。
実施形態では、組成物は、希釈剤を含む。
核酸に対して好適な希釈剤は、水、生理食塩水、およびエタノールを含むがこれらに限定されない。
抗体またはそれらの断片および/または細胞を含む、ポリペプチドに好適な希釈剤には、限定されないが、生理食塩水、pH緩衝液、ならびにグリセロール溶液、またはポリペプチドおよび/もしくは細胞を凍結させるのに好適な他の溶液が含まれる。
本明細書に記載の化合物または免疫原を含む実施形態では、組成物は、アジュバントを含む。
実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、モノホスホリルリピドA、およびQS21から選択される。
例えば、内的アジュバント(リポ多糖類など)を含む、使用され得るアジュバントは、通常、ワクチンとして使用される死菌または弱毒化した細菌の成分である。外的アジュバントは、典型的には、抗原に非共有結合され、宿主免疫応答を向上させるように製剤化された免疫調製物質である。水酸化アルミニウム、硫酸バンド、およびリン酸アルミニウム(集合的にミョウバンと称される)は、日常的に、アジュバントとして使用される。広範囲の外的アジュバントが、免疫原に対する強力な免疫応答を引き起こす可能性がある。これらは、Stimulons(QS21、Aquila、Worcester、Mass.)などのサポニン、または膜タンパク質抗原(免疫刺激複合体)に複合体化された、ISCOMおよび(免疫賦活性複合体)およびISCOMATRIXなどのそこから生成された粒子、鉱油を含むプルロニックポリマー、死滅マイコバクテリアおよび鉱油、完全フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド(MDP)およびリポ多糖類(LPS)などの細菌生成物、ならびに脂質A、およびリポソームを含む。
実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムである。別の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。水中油型乳剤は、スクアレン、落花生油、MF59(WO90/14387)、SAF(Syntex Laboratories,Palo Alto,Calif.)、およびRibi(商標)(Ribi Immunochem,Hamilton,Mont.)を含む。水中油型乳剤は、ムラミルペプチド(例えば、N−アセチルムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、−アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(nor−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミル−L−アラニン−2−(1´−2´ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(MTP−PE)、N−アセチルグルコサミニル−N−アセチルムラミル−L−AI−D−イソグル−L−アラ−ジパルミトキシプロピルアミド(DTP−DPP)セルアミド(TM))、または他の細菌細胞壁成分などの免疫賦活性剤と共に使用され得る。
アジュバントは、単一組成物として免疫原と共に投与され得る。代替的に、アジュバントは、免疫原の投与の前、同時、および/または後に投与され得る。
実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体またはその一部を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体またはその一部、および希釈剤を含む。実施形態では、組成物は、滅菌組成物である。
実施形態では、組成物は、ミスフォールドTDP−43の検出など、本明細書に記載の方法のためのものである。
VI.キット
さらなる態様は、滅菌バイアルなどのバイアルまたは他のハウジングに含まれる、本明細書に記載のi)抗体および/またはその結合断片、ii)核酸、iii)ペプチドもしくは免疫原、iv)組成物、またはv)組み換え細胞、ならびに任意選択的に、基準剤および/またはそれらの使用のための命令を含む、キットに関する。
実施形態では、キットは、ELISAである。
実施形態では、キットは、滅菌バイアルなどの容器に含有される、本明細書に記載の抗体または結合断片を含む。
VII.方法
本明細書に記載の化合物、免疫原、および抗体を作製するための方法を含む。
具体的には、TTEQ(配列番号1)の立体配座エピトープまたは関連するエピトープについて選択的な抗体を作製する方法を提供する。実施形態では、方法は、本明細書に記載の免疫原を対象に投与することと、免疫原のTDP−43ペプチドおよび/またはミスフォールドTDP−43に選択的に結合する抗体を単離することと、を含む。
さらなる態様は、ミスフォールドTDP−43、例えば、TTE、TTEQ(配列番号1)、または関連する立体配座エピトープを含むミスフォールドTDP−43を含むかどうかを検出する方法を提供し、かつ/または残基T115、T116、E、またはQのうちの少なくとも1つは、非ミスフォールドタンパク質立体配座中のT、E、および/またはQによって占められるよりも交互立体配座にある。
実施形態では、本方法は、
a.抗体:ミスフォールドTDP−43ポリペプチド複合体を生産するための許容可能な条件下で、本明細書に記載の抗体と試料を接触させることと、
b.任意の複合体の存在を検出することと、を含み、
検出可能な複合体の存在は、試料がミスフォールドTDP−43ポリペプチドを含有し得ることを示している。
別の実施形態では、本方法は、
(a)抗体−抗原複合体を生産するための許容可能な条件下で、本明細書に記載の抗体と当該対象の試験試料を接触させることと、
(b)試験試料中の抗体−抗原複合体の量を測定することと、
(c)試験試料中の抗体−抗原複合体の量を対照と比較することと、を含み、対照と比較して、試験試料中の抗体−抗原複合体の検出は、試料がTTEQ(配列番号1)またはTTE(例えば、ミスフォールドTDP−43)などの関連するエピトープを含む、TDP−43を含むことを示している。
実施形態では、試料は、生体試料である。実施形態では、試料は、脳組織、脊髄組織、またはそれらの抽出物、および/またはCSFを含む。実施形態では、試料は、ヒト対象から得られる。
実施形態では、試料は、ALSを有する対象に由来する。別の実施形態では、試料は、FTDを有する対象に由来する。
フローサイトメトリー、ドットまたはスロットブロット、ウェスタンブロット、ELISA、および免疫沈降、その後のSDS−PAGE免疫細胞化学などの免疫測定を含む、いくつかの方法を使用して、ミスフォールドTDP−43ポリペプチドが本明細書に記載の抗体を使用した試料中に存在するかどうかを判定することができる。実施形態では、使用される方法は、実施例7、8、または10に記載のステップのうちの1つ以上を含む。
表面プラズモン共鳴を使用して、立体配座の特異的結合を評価することができる。
本明細書に記載の標識された抗体を、ミスフォールドTDP−43の位置を検出するために対象に投与することもできる。
さらなる態様は、本明細書に記載の化合物を含む、化合物、免疫原、および/または組成物を対象に投与することと、任意選択的に、投与された化合物もしくは免疫原に特異的に結合する細胞および/または抗体を単離することと、を含む、対象における免疫応答を誘導する方法を含む。上記の開示は、本願を遺伝子的に記載している。以下の特定の例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。これらの例は、例示の目的のためだけに記載されており、本願の範囲を限定することを意図していない。同等物の形態の変化および置換は、状況が適切であると示唆し得るか、または適切である可能性があるため、考慮される。特定の用語が本明細書で用いられているが、このような用語は、記載の観点で意図されており、限定の目的のためではない。
以下の非制限的例は、本開示の例示である。
実施例1
TDP−43エピトープの予測
ほとんどのALS/FTD突然変異はC末端にあるが、突然変異の効果が、TDP−43の病理学的凝集体をもたらす可能性があり、これらの多量体凝集体は、構造化ドメインの障害を誘導する可能性がある。したがって、RRM1ドメインは、ミスフォールドTDP−43中に存在する立体配座特異的エピトープの存在について評価された。
TDP−43中の推定上のミスフォールドエピトープは、2016年11月9日に出願された、WO/2017/079836、SYSTEMS AND METHODS FOR PREDICTING MISFOLDED PROTEIN EPITOPES BY COLLECTIVE COORDINATE BIASINGに記載される「集合的座標の偏倚」と称される方法の助けを得て予測された。本明細書に記載のように、本方法は、タンパク質(またはペプチド凝集体)にグローバル座標の偏倚を課して、タンパク質(またはペプチド凝集体)をミスフォールドさせ、次に、部分的に非構造化されたタンパク質(またはペプチド凝集体)の最も可能性の高い展開領域を予測する、分子動力学に基づくシミュレーションを使用する。偏倚シミュレーションを行い、各残基指標に対応する(検討中のタンパク質の初期構造のものと比較して)溶媒アクセス可能な表面領域(SASA)。SASAは、H2Oにアクセス可能な表面領域を表す。SASAにおける正の変化(検討中のタンパク質の初期構造のものと比較して)は、関連する残基指標の領域における展開を示すものと考えられ得る。候補エピトープを同定するために、SASAに加えて、2つの他の方法を使用した。これらは、カットオフ長さ内の非水素原子によって定義される天然型接触の喪失と、構造的集合体における平均についての偏差の範囲を測定する平均二乗変動(RMSF)とであり、ここで、いくつかのアミノ酸についてのRMSFの増加は、こうしたアミノ酸の動力学の増加を示す。
TDP−43(PDBエントリ4IUF)の天然に折り畳まれたRRM1ドメインに本方法を適用した。
WO/2017/079836に記載の方法および以下に記載のCHARMM力場パラメータを使用して、各初期構造についてシミュレーションを行った。K.Vanommeslaeghe,E.Hatcher,C.Acharya,S.Kundu,S.Zhong,J.Shim,E.Darian,O.Guvench,P.Lopes,I.Vorobyov,and A.D. Mackerell.Charmm general force field:A force field for drug−like molecules compatible with the charmm all−atom additive biological force fields.Journal of Computational Chemistry,31(4):671−690,2010;and P.Bjelkmar,P.Larsson,M.A.Cuendet,B.Hess,and E.Lindahl.Implementation of the CHARMM force field in GROMACS:analysis of protein stability effects from correlation maps,virtual interaction sites,and water models.J.Chem.Theo.Comp.,6:459−466,2010,both of which are hereby incorporated herein by reference,with TIP3P water as solvent。
I.立体配座の特異的エピトープ
本開示は、ミスフォールドTDP−43について選択的であり得る抗体に関する。
ミスフォールディング特異的抗体の生成の必須条件は、天然型構造の文脈で存在しない(例えば、結合にアクセス可能でない)TDP−43ペプチドに対する標的の同定である。これらのミスフォールディング特異的エピトープは、主な配列において天然型TDP−43中の対応するセグメントと異なっていないが、ミスフォールドタンパク質の文脈で立体配座的に区別されるであろう。すなわち、これらは、天然に折り畳まれたタンパク質中に存在しないミスフォールドタンパク質中の区別される立体配座を提示するであろう。
天然型集合体領域に対していずれかに方向付けされる抗体は、ミスフォールドタンパク質について選択的でない傾向があり、したがって、健常なタンパク質に同様に結合する。正常なタンパク質の濃度は、ミスフォールドタンパク質の濃度よりも実質的に高い可能性があるので、このような抗体は、「標的の混乱」を生じる可能性があり、主に健常なタンパク質に結合し、機能性TDP−43、ミスフォールドタンパク質種を選択的に標的としてこれらを除去するのではなく、機能性TDP−43の除去を促進するであろう。これは、重要なRNA結合および細胞の生存に必須のストレス応答機能を阻害する可能性がある。
TDP−43のミスフォールドタンパク質形態について選択的な抗体を開発するために、外部摂動力の適用時に阻害される可能性が高い天然型タンパク質中の領域を、集合的座標アルゴリズムを使用して同定した。理論に縛られることを望まないが、天然型の文脈での阻害がミスフォールドタンパク質の表面上に同様に露出され得ると仮説を立てた。しかしながら、ミスフォールドタンパク質上で、これらの配列領域は、天然型TDP−43とは区別される立体配座中に露出され得る。例えば、表面上にあって、それらは、次に、構造的整列によって判定されるように、対応する数量がいずれかの天然型集合体中において示すよりも、より大きく露出された表面領域、異なる二面角分布、および/または全体的な異なる立体配座幾何学を有する領域に露出され得る。
TTEQ(配列番号1)およびTTEを含む環状化合物を本明細書に記載する。環状化合物は、上記の基準のうちの1つ以上を満たすように設計されている。
II.エピトープ予測
エピトープTTEQ(配列番号1)およびTTEは、予測されたエピトープとして現れる。
TTEQ(配列番号1)エピトープは、天然型接触の喪失を検討する場合に、PDB構造4IUFについての予測として現れる。(図1のパネルB)。TTEは、SASAの増加を検証する場合に、構造4IUFについてのエピトープとして現れる。TTEは、RMSFの増加を検証する場合に、構造4IUFについてのエピトープとして現れる。
本明細書に考察される図1〜9の描画について、データは、Charmm36力場を使用した陽溶媒(TIP3P)中の平衡シミュレーションから得られる。各集合体についての立体配座位のシミュレーション時間および数は、以下の通りである。環状ペプチド集合体:合計で5000フレームを含む、シミュレーション時間100ns;偏倚集合体:各展開軌道についてのシミュレーション時間90ns;合計で40000フレームを含む、軌道の実験を10回繰り返した(同等に、90*10=900ns)。単純化のために、8000フレームを40000フレームから均等に試料採取した。天然型4IUF集合体:7000フレームを含む、140ns。
III.二面角分布
ミスフォールドタンパク質選択的エピトープの同定のためのさらなるコンピュータ支援は、側鎖二面角分布、およびミスフォールドタンパク質中に露出されたエピトープについてのプロキシである、環状ペプチド中の骨格二面角についてのラマチャンドランφおよびψ分布の両方によって提供される。いくつかの角度は、天然型TDP−43中の対応する分布とは実質的に異なる分布を有する。
4つの残基T115、T116、E117、およびQ118について、側鎖および骨格二面分布を試験した。分布のパーセント重複、例えば、分布「環状」での「天然型」は、角度を5°の要素に分割し、次に、環状分布の90%がカットオフを上回り、10%が下回るままになるまで、無限遠から確率振幅におけるカットオフを減少させることによって得られる。これは、許容可能な角度における1つ以上の領域を定義する。次に、この領域内の天然型分布のパーセントを見出した。このレシピは、非相互的であり、遺伝子的に、分布の対間に異なる数を生じる。重複の平均、例えば、環状での天然型および天然型での環状の両方の平均が、遺伝子的に検討される。
図2に示すように、残基T115について、二面C−CA−CB−OG1、C−CA−N−HN、O−C−CA−Nは、天然型集合体中の対応する二面角からTTEQ(配列番号1)の環状ペプチドを明確に区別する。残基T116について、二面角O−C−CA−Nは、天然型集合体中の対応する分布から環状二面角分布を区別する。表1Bに示すように、環状集合体と偏倚集合体との間の二面重複は、残基T115およびT116について環状集合体と偏倚集合体との間の重複を越えて有意に増加される。
図3によると、T115およびT116の骨格ラマチャンドラン角度φおよびψは、天然型集合体から環状ペプチドを区別する。E117およびQ118について、環状ペプチド分布は区別されるが、互いに顕著に区別されない天然型および偏倚分布を有する重複を有する。
図2に示す二面分布から、天然型集合体が環状ペプチド二面角のほぼすべて(90%)の範囲内の二面を占める確率を見出すことができる。同様に、環状集合体が天然型ペプチド二面角のほぼすべて(90%)の範囲内の二面を占める確率を見出すことができる。図2におけるこれらの選択的二面角の平均は、残基TTEQ(配列番号1)についてのものである。T115:O−C−CA−N 28%、T115:C−CA−CB−OG1、53%。すべての重複確率が、表1Aに与えられる。残基T115およびT116について、環状集合体と偏倚集合体との間の重複は、遺伝子的に、環状集合体と天然型集合体との間の重複よりも大きい。
以下にさらに記載されるように、個々の二面角における比較的小さい差の蓄積が、ペプチドのグローバル立体配座における大きく有意な差をもたらす可能性があり、したがって、構造的整列における有意な偏差をもたらし得る。
図2に基づいて、表1Aは、互いに対する、直鎖状、環状ペプチドシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)および天然型(4IUF)形態における残基T115、T116、E117、およびQ118の骨格および側鎖角度についての二面角分布のパーセント重複を示す。縦列1は、検討される特異的二面角である。縦列2〜7は、別の集合体中の1つの集合体の検討される二面角の重複割合を表す。例えば、縦列2は、天然型集合体中の所与の二面角と環状ペプチドシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)中の同じ角度との間の重複割合を示す。
表1Bは、表1Aの数に由来している。表1Bの数は、環状形態と天然型形態との間の二面角分布の平均重複が、特に残基T115およびT116についての環状形態と偏倚形態との間の二面角分布の平均重複未満であることを示す。これは、残基T115およびT116が、天然型形態に対して最大立体配座選択性をもたらす残基であり得ることを示唆している。
図2に示すデータに基づいて、表2Aは、分布が環状ペプチドシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)と天然型集合体との間の差を示す、これらの二面角についての二面角分布のピーク値を列挙する。縦列1は、考慮される特定の二面であり、縦列2は、環状ペプチドシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)の文脈でのその角度に対する二面分布のピーク値であり、縦列3は、天然型構造的集合体の文脈でのペプチドTTEQ(配列番号1)に対する二面分布のピーク値であり、縦列4は、偏倚構造的集合体の文脈でのペプチドTTEQ(配列番号1)に対する二面分布のピーク値であり、縦列5は、環状および天然型集合体に対する二面分布のピーク値の差である。表2Bに示すように、差は、環状形態と天然型形態との間で遺伝子的により大きく、次に、環状形態と偏倚形態との間である。さらに、所与の残基について様々な二面角にわたって平均して、差(環状対天然型)マイナス(環状対偏倚)の大きさは、T115について最大であり、T115〜Q118まで単調に減少する。
IV.ラマチャンドラン角度
エピトープが抗体に対して露出する骨格配向は、ペプチドが、環状、偏倚、または天然型形態にあるかどうかに応じて異なる。この食い違いは、上記の3つの集合体中の各残基T115、T116、E117、およびQ118について、骨格に沿ってラマチャンドラン角度ファイおよびプサイ(またはφおよびψ)を描画することによって定量化することができる。図3は、残基T115、T116、E117、およびQ118について、平衡シミュレーションで試料採取されたファイおよびプサイ角度を描画する。図3のパネルAおよびBから、環状ペプチド中のT115およびT116についての骨格二面角の分布が、いずれかの天然型集合体について試料採取された二面角の分布とは異なり、偏倚集合体により類似していることが見られ得る。これは、表3Aにさらに定量化されている。
上記に定義されるように、ラマチャンドラン角度分布の重複は、表3Aに与えられる。表3Aは、図3に提示された残基T115、T116、E117、およびQ118のラマチャンドラン角度の重複確率を示す。特に、天然型集合体と一致する立体配座を採用する環状ペプチドシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)集合体の画分および環状集合体に一致する立体配座を採用する天然型集合体の画分の平均は、それぞれ、T115、T116、E117、およびQ118について28%、63%、55%、23%である。これは、プサイおよびファイ重複数の両方を平均化することによって得られる。これは、例えば、環状ペプチド集合体中のT115およびQ118の周りの配向は、天然型集合体中のこうした残基の立体配座とは立体配座的に区別されることを示している。
表3Bは、ラマチャンドラン角度の両方にわたって平均化された、例えば、天然型での環状、および環状での天然型について縦列2で平均化された、重複確率を示し、同様に縦列3は、所与の残基について正味の重複割合を達成するために、表3Aの偏倚での環状および環状での偏倚をファイ、プサイにわたって平均化している。表3Bは、T115およびT116のマチャンドラン角度が、天然型形態に対する、偏倚ミスフォールド形態に向かう、最大立体配座選択性をもたらすことを示す。
表4Aは、残基T115、T116、E117、およびQ118について図3で描画されたラマチャンドランφ、ψ角度のピーク(最も可能性の高い)値を与えている。2番目、3番目、および4番目の縦列は、それぞれ、環状ペプチドシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)、天然型集合体、および非天然型偏倚集合体の文脈で各残基についてのラマチャンドランファイ/プサイ角度のピーク値を示している。最も可能性の高いラマチャンドランファイおよびプサイ値は、残基T115、T116、E117、およびQ118について環状集合体と天然型集合体との間で異なる。表4Bに示すように、差は、環状形態と天然型形態との間でわずかにより大きく、よって、環状形態と偏倚形態との間にある。ファイおよびプサイ角度にわたって平均化された場合、T115は、上記の差の間で最大の区別を示し、そのため、環状は、特に残基T115について、天然型よりも偏倚形態とより強い重複を有する。
V.エピトープ溶解度および溶媒露出
図4のパネルAは、TDP−43 RRM1中の各アミノ酸の内的溶解度を描画している。エピトープ配列TTEQ(配列番号1)は、タンパク質配列におけるより可溶性の領域のうちの1つであることを見ることができ、これは、タンパク質構造への外部チャレンジを実行する偏倚力に対して、その特定の領域がその溶媒露出度に反しないことを示している。
図4のパネルBおよび表5は、環状ペプチドの平衡集合体、偏倚した部分的に展開されたタンパク質集合体、および天然型集合体の各残基の中間溶媒アクセス可能表面領域(SASA)を与えている。これは、偏倚集合体中の残基TTEQ(配列番号1)のSASAが天然型にわたって増加され、同様に、環状ペプチドのSASAが偏倚集合体中のものにわたって増加されたことを示し、これは、より多くの表面が露出され、よって、抗体結合にアクセス可能であることを示している。露出の増加は、残基T115およびE117について最も顕著であり、これは、天然型集合体にわたるSASAの最大増加を示す。T115について、この差は、101Å2であり、E117について、この差は、67Å2である。
図4Cは、図4Bの各残基の中間SASAを与えているが、これより、配列シクロ(CGTTEQG)(配列番号3)の環状ペプチドについてのものである。結果は、環状ペプチドシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)についてのものを概括している。
表5は、環状シクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)集合体、偏倚集合体、および天然型集合体の文脈で残基T115、T116、E117、およびQ118のSASAを示す。
VI.直鎖状立体配座または線維状立体配座のいずれかの集合体とは異なる環状ペプチド立体配座クラスターの集合体
配列TTEQ(配列番号:1)が環状ペプチドの文脈で天然型集合体におけるものとは異なる立体配座を示す明確な証拠は、立体配座間の標準的な構造的整列測定基準を使用し、次に、クラスタリング分析を実行することによって見ることができる。立体配座の平衡集合体は、天然型RRM1(PDB 4IUF)、偏倚RRM1、および環状ペプチドシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号:2)について得られる。残基TTEQ(配列番号1)についてのこれらの集合体からの立体配座のスナップを収集し、次に、環状ペプチド集合体の最大クラスター、天然型集合体の最大クラスター、および偏倚集合体中のTTEQ(配列番号1)の最大クラスターの重心に構造的に整列させ、次に、平均二乗偏差(RMSD)の3つの値を記録および描画する。クラスタリングは、本明細書では、最大クラスターアルゴリズム(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/maxcluster)によって行われる。環状、偏倚、および天然型集合体についての3つの対応するRMSD値は、図7の三次元散布図として描画される。図7のパネルAはまた、直鎖状ペプチドCGGTTEQGG(配列番号2)の平衡集合体についての結果を含む。図7Cは、いくつかの集合体間の重複割合を描画する。2つの重複数が特に重要である。1つは、非天然型偏倚集合体を含む環状集合体または天然型集合体の集合体との重複である。非天然型偏倚集合体は、天然型集合体と重複する立体配座を含まない偏倚集合体の一部である。すなわち、天然型集合体の一部と重複するいかなる偏倚立体配座も除去されるため、これは、天然型立体配座とは異なるこうした偏倚立体配座である。この数が高くなるほど、局所的に展開された状態を選択的に標的とするエピトープ足場が良好である。環状ペプチド集合体と非天然型偏倚集合体との間の重複は、直鎖状ペプチド集合体と非天然型偏倚集合体との間の重複よりも大きい。これは、非天然型ミスフォールド状態に対するプロキシとして環状足場を使用する利用を正当化する。環状ペプチドは、天然型集合体との重複よりも非天然型偏倚集合体と実質的により大きい重複を有する。
重要な他の数は、天然型構造的集合体との環状または直鎖状のいずれかの構造的集合体間の重複である。この数は低いべきである。この数が低いほど、エピトープ足場に産生される抗体が天然型構造を標的とすることが少なくなる。数的重複割合を、表6Aに与える。3つの集合体が互いに異なってクラスタリングすることは、以下の図7および表6Aから明らかである。具体的には、環状ペプチド構造的集合体は、天然型集合体とは区別され、これは、環状ペプチドエピトープに特異的な抗体が直鎖状または天然型集合体中に提示された立体配座位に対して低い親和性を有し得ることを示唆している。環状ペプチドに産生された抗体は、立体配座的に選択的であり得、TDP−43の天然型立体配座にわたってミスフォールドタンパク質形態に優先的に結合し得るであろう。集合体間の区別は、いくつかの側鎖と骨格二面角分布との間の重複にもかかわらず生じており、上記に記載の多数の多くは小さな示差的特徴が、全体的に異なる立体配座分布をもたらす。
図7のパネルD、E、Fは、対応する数量を図7A、B、Cとして描画しているが、これより、環状ペプチドシクロ(CGTTEQG)(配列番号3)についてのものである。結果は、上記と類似している。環状ペプチドは、天然型集合体との重複よりも非天然型偏倚集合体と実質的により大きい重複を有し、環状ペプチドは、直鎖状ペプチドよりも非天然型偏倚状態についてより良好なエピトープ足場である。
表6Aは、図7に提示されるように、環状、偏倚、および天然型(4IUF)ペプチド立体配座のRMSDクラスタリング散布図における重複割合を与えている。縦列1は、環状形態から天然型形態までの重複割合が非常に小さく、CGGTTEQGG(配列番号2)についてわずか5%であり、CGTTEQG(配列番号3)について4%であることを示す。一方、環状集合体から偏倚集合体までのパーセント重複は、CGGTTEQGG(配列番号2)についてほぼ3倍大きく、約14%であり、CGTTEQG(配列番号3)については約10倍大きく、42%である。環状集合体は、非天然型様立体配座を約95%の確率で試料採取している。
非天然型偏倚集合体中の環状ペプチドの重複は、ミスフォールド非天然型状態を正確に表す平均集合体中に足場の画分を与える。同様に、天然型偏倚集合体中の環状ペプチドの重複は、天然型状態を正確に表す平衡集合体中に足場の画分を与える。環状ペプチド集合体中の非天然型偏倚集合体の重複は、環状集合体に対する非天然型ミスフォールド状態の類似性を与え、同様に、環状ペプチド集合体中の天然型偏倚集合体の重複は、環状集合体に対する天然型ミスフォールド状態の類似性を与える。この後者の数量は、特定の関心があるものではないが、偏倚集合体と環状集合体との間の相互的重複は、両方とも、環状足場を使用する妥当性を定量化する評価基準である。表6Bでは、非天然型ミスフォールド立体配座対天然型立体配座を標的とする際の環状ペプチドについての良好性比率を提供するために、これらの2つの評価基準の平均をとり、これを非天然型ミスフォールド状態対天然型を標的とするための所与の環状足場を使用する際の良好性の評価基準として天然型での環状集合体の重複で除算する。縦列1は、配列を与え、縦列2は、非天然型偏倚集合体中の環状ペプチドの重複および環状ペプチド集合体中の非天然型偏倚集合体の重複の平均を与え、縦列3は、天然型集合体中の環状ペプチドの重複を与え、縦列4は、縦列2と縦列3との差を与え、縦列5は、縦列2を縦列3で除算した比率を与え、これは、環状ペプチド構成についての良好性比率として定義される。
表6Cは、良好比率の減照準で分類された、いくつかの異なる環状半径の関数として、いくつかの候補環状足場について、表6Bに定義される良好性比率(非天然型ミスフォールド立体配座対天然型立体配座を標的とする環状ペプチドの能力)を列挙する。分析された2つの環状足場の構成CGTTEQG(配列番号3)およびCGGTTEQGG(配列番号2)は、最大良好性比率を有し、よって、これらの評価基準を使用する非天然型ミスフォールド構造についての最良のプロキシであると予測されるであろう。
表6Dは、環状立体配座集合体と直鎖状立体配座集合体との間の重複割合を列挙する。集合体は、小〜中程度の重複割合によって見られるものと異なっており、これは、環状ペプチド集合体が直鎖状ペプチド集合体から立体配座的に区別され、また、発生期の展開されたペプチド鎖から立体配座的に区別される可能性が高いことを示している。
集合体間の重複を、以下の通りに計算した。第1に、この三次元RMSDスペースの体積を長さ0.1オングストロームの立方体要素に分割することによって、環状集合体と重複する偏倚集合体の画分(パーセント)を得る。次に、カットオフ密度以上の環状分布密度を有する立方体が環状分布の90%を含むような、環状分布における点の「カットオフ密度」を見つける。これは、環状分布を含む特徴的な体積を与える体積(不連続であり得る)を定義し、はずれ値に起因するいかなるアーチファクトを除去する。次に、この領域内にある偏倚分布からの点の画分を見つける。この方法では、天然型での環状、偏倚での環状などについての重複割合を見つけることが可能である。
図7のパネルCおよびFは、集合体が収束しているのに十分に大きいことを例示している。
図7のパネルGは、以下の通りにコンピュータ演算された、環状−CGGTTEQGG(配列番号2)集合体と天然型集合体との間、および環状−CGGTTEQGG(配列番号2)集合体と非天然型偏倚集合体との間の両方の相関係数を示す。2つの集合体間の相関係数は、カットオフ値よりも大きい密度を有する分布の一部を見つけることによって定義されており、そのため、合計分布の所与の割合、例えば、合計分布の60%を与える環状分布および直鎖状分布についての密度カットオフが包含される。次に、これらの部分分布について、相関係数を
として定義し、ここで、f(τ)およびg(τ)は、各ボクセルτにおける密度であり、結果は、すべてのボクセルにわたって統合(合計)される。このように定義された、天然型分布と環状分布との間の相関係数は、それぞれの分布の100%が含まれる場合、約4.5%まで収束し、非天然型偏倚分布と環状分布との間の相関係数は、それぞれの分布の100%が含まれる場合、約10.5%まで収束するか、または約2倍の重複である。
図7のパネルHは、図7Gと同様に、環状(CGTTEQG)(配列番号3)集合体と天然型集合体との間の相関係数、および環状(CGTTEQG)(配列番号3)集合体と非天然型偏倚集合体との間の相関係数の両方を示す。天然型分布と環状分布との間の相関係数は、それぞれの分布の100%が含まれる場合、約7%まで収束し、非天然型偏倚分布と環状分布との間の相関係数は、それぞれの分布の100%が含まれる場合、約25%まで収束するか、または約3.6倍の重複である。
図7のパネルIは、90%の環状(CGGTTEQGG)(配列番号2)集合体を有する天然型集合体、および90%の天然型集合体を有する環状集合体の重複を平均化することによって定義される、構造的重複に対する単一残基欠失の効果を試験している。単一アミノ酸が天然型立体配座に対して立体配座選択性をもたらす場合、構造的整列からそれを除去することにより、分布間の有意に高い重複がもたらされるであろう。この試験では、T115が、環状ペプチドに対して最も高い立体配座選択性をもたらすものとして突出している。
図7のパネルJは、図71と同様に、環状ペプチドシクロ(CGTTEQG)(配列番号3)についての単一残基欠失の効果を描画している。ここでも、残基T115は、環状ペプチドに対して立体配座選択性をもたらすものとして突出している。
構造の環状ペプチド集合体から最大クラスターの重心を構成する、CGGTTEQGG(配列番号2)の環状ペプチド集合体からTTEQ(配列番号1)の最も代表的な立体配座の原子構造の概略を、図5のパネルAに黒で示す。同様に、RMSDを使用してそれらを整列することによって黒で示す環状ペプチドに最適に重ね合わせてそれらの異なる配向を明確にした、最大クラスターの重心を構成する、天然型構造的集合体の最も代表的な立体配座を、図5に薄い灰色で示す。具体的には、T115は、2つの重心立体配座間の顕著に異なる配向を有する。図5のパネルBは、RMSDに関して整列することによって再び最適に重ね合わせた、環状配列CGTTEQG(配列番号3)についての環状ペプチドおよび天然型集合体に対する対応する重心立体配座を示す。両方の環状構成は、T115が交互立体配座にあり、より小さい範囲で、Q118が交互立体配座に現れることを示す。
表7は、環状CGGTTEQGG(配列番号2)ペプチド集合体の重心構造、天然型集合体集合体の重心構造、および非天然型偏倚集合体の重心構造において残基T115、T116、E117、およびQ118によって占められるラマチャンドラン骨格および側鎖二面角の値を列挙し、環状および天然型重心立体配座を図5に描画する。重心構造は、環状立体配座と天然型立体配座との間の実質的に異なるいくつかの二面角を表す。表7の縦列1は、対象となる残基および二面角を与え、縦列2は、環状集合体の重心構造における二面角の値を与え、縦列3は、天然型集合体の重心における二面の値を与え、縦列4は、非天然型偏倚集合体の重心における二面の値を与え、縦列5は、環状および天然型二面における差の大きさであり、縦列6は、環状および非天然型偏倚二面における差の大きさであり、縦列7は、各アミノ酸中の二面にわたって平均化された縦列5の値を与え、縦列8は、各アミノ酸における二面にわたって平均化された縦列6の値を与えている。環状二面角のうちの多くが、二面分布のピーク値について上記に記載のように、直鎖状または天然型重心における対応する二面角とは有意に異なることは明らかである。しかしながら、重心構造の二面角は、二面分布のピーク値と同じである必要はないことに留意されたい。本明細書の差の例について、残基115Tにおける二面OG1−CB−CG2−2HG2は、環状と天然型との間で100度の差を示すが、環状と非天然型偏倚との間でわずか15度である。115Tについて環状と天然型との間の平均差は、87.6度であり、115Tについて環状と非天然型偏倚との間の平均差は、51.9度である。ここでも、これらの差は、それぞれの集合体の各々における1つの立体配座(重心立体配座)についてのみのものであることに留意されたい。
再び、図6は、これより、残基TTEQ(配列番号1)についての表面領域表現を使用して、CGGTTEQGG(配列番号2)およびCGTTEQG(配列番号3)についての天然型重心、偏倚重心、および環状ペプチド重心におけるTTEQ(配列番号1)を示す。抗体に対して提示される表面領域プロファイルは、重心立体配座間で異なる。立体配座は、別々に示されているが、すべて整列されている。天然型、偏倚、および環状集合体の重心立体配座位を比較すると、E117および同様にT115の露出された表面領域は、図4Bおよび4Cに描画されるSASAと単調に一致して単調に増加する。したがって、TDP−43の環状集合体においてこの領域に産生された抗体は、天然型TDP−43中のTTEQ(配列番号1)に(例えば、等しく、または同様の選択性を有して)結合する可能性は低いであろう。
図6Eは、E117の側鎖の表面領域を埋めるが、部分的に展開されるタンパク質の偏倚に対して阻害される、TDP−43のRRM1の天然型集合体中に存在する相互作用の例を示す。天然型集合体において、E117は、各残基の側鎖を制限し、天然型集合体中のE117の表面領域の露出を減少させる、リジン137(K137)との塩橋を形成する。しかしながら、偏倚集合体においては(図6E、右パネル)、塩橋は壊れており、E117の側鎖を露出させている。図4BおよびCに描画されるように、タンパク質内の他の相互作用も、T115の露出も増加するのに十分弱体化されている。
実施例2
環状化合物CGTTEGおよびCGTTEGG中のTTEについてのRMSDによるクラスタリング
環状化合物CGTTEG(配列番号28)およびCGTTEGG(配列番号29)におけるTTEについて、同様の実験のセットを行った。
TTE環状化合物について実施例1のようにRMSDを分析した。平均二乗偏差(RMSD)によるクラスタリングプロットを、図8に示す。軸は、環状ペプチド集合体シクロ(CGTTEG)(配列番号28)(パネルA)またはシクロ(CGTTEGG)(配列番号29)(パネルB)の重心構造におけるTTEに対するTTEのRMSDに対応し、天然型構造的集合体(PDB ID 4IUFから始まる平衡)の重心構造におけるTTEに対するTTEのRMSDに対応し、非天然型偏倚集合体(天然型集合体が除去された重複する点を有する偏倚集合体)の重心構造におけるTTEに対するTTEのRMSDに対応する。各点は、環状ペプチド平衡集合体(説明文に述べられている円)、非天然型偏倚平衡集合体(説明文に述べられている+図柄)、またはPDB ID 4IUFから始まる天然型構造平衡集合体(説明文において述べられている逆三角形)のいずれかから取られた所与の立体配座に対応する。
図9は、収束を示すために、試料採取された立体配置の数の関数として異なる集合体間の重複割合を示す。環状集合体は、配列シクロ(CGTTEG)(配列番号28)(パネルA)またはシクロ(CGTTEGG)(配列番号29)(パネルB)に対応する。図7と同様に、集合体の各対についてのパーセント重複は、実施例2の文章に記載されるように、比較構造集合体の90%を有する特定の集合体のパーセント重複を示す。数的重複割合を、以下の表8Aに与える。天然型集合体との環状集合体の重複は、シミュレーションの数的正確性内でゼロであり、天然型構造に対する低い類似性は、ここでも、環状ペプチド足場についての所望の特徴である。
表8Aは、足場シクロ(CGTTEG)(配列番号28)およびシクロ(CGTTEGG)(配列番号29)について図9のパネルに提示されるようなシクロペプチドの環状形態における天然型での環状、非天然型偏倚での環状、および環状での非天然型間のRMSDクラスタリングの重複割合を示す。最後の縦列は、縦列2および3の平均を縦列4の縦列4(一番右の縦列に提供される)で除算したすることによって定義される比率を与えている。2つの足場シクロ(CGTTEG)(配列番号28)およびシクロ(CGTTEGG)(配列番号29)は、無限遠に等しい重複の比率を有する(環状集合体が天然型集合体との重複を有しない)、非天然型偏倚集合体と天然型集合体との間の最大区別を示す。
追加のコンピュータシミュレーションを行って、環状−天然型、環状−偏倚、および環状−(展開された単量体)集合体対間のイェンセン−シャノン距離[Lindorff−Larsen K,Ferkinghoff−Borg J(2009)Similarity Measures for Protein Ensembles.PLOS ONE 4(1):e4203]を測定することによって、様々な集合体間の類似性を測定した。重量の不確実性と共にこれらの測定基準に重量を適用することによって、天然型TDP−43ならびに予め折り畳まれたTDP−43単量体(すなわち、一時的に展開されたTDP−43単量体)からミスフォールド/偏倚TDP−43を差別化する実行可能な候補を選択するための複数の基準決定分析[Hwang CL,Yoon K.Multiple attribute decision making:methods and applications a state−of−the−art survey.vol.186.Springer Science&Business Media;(2012)]の使用が可能になる。RRM1中の長さ77残基の配列を使用して、アミノ酸103から始まり、アミノ酸179で終わる、RRM1ドメインの展開された単量体をモデル化した。分析を行い、分析を使用して、偏倚TDP−43 RRM1ドメインの文脈でのTTEおよびTTEQ(配列番号1)エピトープと、グリシンスペーサーの可変数からなる異なる足場の文脈での当該ペプチドを含む様々な環状ペプチドとの類似性を評価した。2つの分離されたガウス分布間の標準的な偏差の数の観点で、同じシミュレーションデータについて集合体の重複を測定した。集合体の重複データのすべてを表8Bに示す。
表8BのJSDデータによって測定される偏倚TDP−43 RRM1ドメインの文脈でTTEおよびTTEQ(配列番号1)エピトープと有意に重複したが、天然に折り畳まれたTDP−43または一時的に展開されたTDP−43のいずれかとの重複が小さい、環状ペプチドは、最大9つのアミノ酸(配列番号35)を有する足場(リンカー)を含み、これは表8Cに与えられている。
実施例3
立体配座的に制限されたエピトープを含む環状化合物構成
TTEQ(配列番号1)またはシクロ(CGTTEQG)(配列番号3)もしくはシクロ(CGTTEG)(配列番号28)などのTTEを含むペプチドは、ヘッドトゥーテールで環化することができる。
好ましくは2、3、または4つのアミノ酸および/またはPEGユニットを含む、TTEQ(配列番号1)またはTTEおよびリンカーを含む天然型集合体は、Fmocに基づく固相ペプチド合成などの既知の方法を単独でまたは他の方法と組み合わせて使用して合成することができる。PEG分子は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Hamley 2014[7]およびRoberts et al.2012[8]に記載される連結化学を使用して、N末端でアミノ基に結合され得る。天然型集合体化合物は、1)ペプチド結合を形成する(例えば、骨格を環化する)ペプチド+リンカーのアミノ末端およびカルボキシ末端、2)ペプチド+リンカー中に側鎖を有するアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または3)ペプチド+リンカー中の2つの側鎖に共有結合することによって、環化され得る。
環状化合物における結合は、すべての規則的なペプチド結合(ホモデチック環状ペプチド)であり得るか、またはエステル、エーテル、アミド、またはジスルフィド連結(ヘテロデチック環状ペプチド)などの他の種類の結合を含み得る。
ペプチドは、N末端またはC末端での、または例えば、システインおよびホモシステインを含む、ペプチドに対して内的な、チオールまたはメルカプタン含有残基の酸化によって環化され得る。例えば、ペプチドを側面に配置する2つのシステイン残基を酸化させて、ジスルフィド結合を形成することができる。用いられ得る酸化剤には、当業者に知られ得るような、当業者に知られているような方法と共に使用される、例えば、酸素(空気)、ジメチルスルホキシド、酸化グルタチオン、シスチン、酸化銅(II)、フェリシアン化カリウム、タリウム(III)トリフルオロ酢酸、または他の酸化剤が含まれる。
環状ペプチド合成に関連する方法および組成物は、米国特許公開第2009/0215172号に記載されている。米国特許公開第2010/0240865号、米国特許公開第2010/0137559号、および米国特許第7,569,541号は、環化についての様々な方法を記載している。他の例は、国際特許公開第WO01/92466号、およびAndreu et al.,1994.Methods in Molecular Biology 35:91−169に記載されている。
より具体的には、TTEQ(配列番号1)エピトープ、TEQエピトープ、またはTTEエピトープを含む環状ペプチドは、スペーサーを含むリンカーを、スペーサーを側面に配置し、かつ/またはスペーサー内に挿入されるシステイン残基に追加することによって、構成され得る。ペプチドは、ペプチドのN末端およびC末端に追加される非天然型システイン残基間のジスルフィド連結を作出することによって、環状立体配座に構成され得る。ペプチドはまた、N末端とC末端アミノ酸との間のペプチド結合(例えば、ヘッドトゥーテール環化)を形成することによって、環状化合物に合成され得る。
ペプチド合成は、標準的な製造手順に従って、CPC Scientific Inc.(Sunnyvale CA,USA)によって行われる。環状ペプチドの構造は、ミスフォールドTDP−43ポリペプチド中のTTEQ(配列番号1)のアミノ酸骨格および側鎖の立体配座および配向を模倣するように設計された。
シクロ(CGTTEQG)(配列番号3)
シクロ(CGTTEQG)(配列番号3)およびシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)は、以下の方法(CPC Scientific Inc,Sunnyvale CA)を使用して合成され得る。2−クロルトリチル塩化物樹脂上での標準的な従来のFmocに基づく固相ペプチド合成、続いて、30%のHFIP/DCMを含む樹脂による開裂によって、保護された天然型集合体を合成した。EDCを使用することによって、保護された天然型集合体を対応する保護された環状ペプチドに環化した。低濃度でのDMF中のHCl/HOBt/DIEA。保護された環状ペプチドをTFAによって脱保護して粗製環状ペプチドを与え、粗製ペプチドをRP HPLCによって精製して凍結乾燥後に純粋な環状ペプチドを与えた。
シクロ(CGTTEQG)(配列番号3)およびシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)は、それぞれ、直鎖状ペプチドCGTTEQG(配列番号3)またはCGGTTEQGG(配列番号2)のアミド縮合によって調製することができる。
シクロ(C−PEG2−TTEQG)(配列番号24)およびシクロ(C−PEG2−TTEQGG)(配列番号25)は、それぞれ、直鎖状化合物C−PEG2−TTEQG(配列番号24)またはC−PEG2−TTEQGG(配列番号25)のアミド縮合によって調製することができる。
シクロ(CGTTEQ−PEG2)(配列番号26)およびシクロ(CGGTTEQ−PEG2)(配列番号27)は、それぞれ、直鎖状化合物CGTTEQ−PEG2(配列番号26)またはCGGTTEQ−PEG2(配列番号27)のアミド縮合によって調製することができる。
直鎖状(CGTTEQG)(配列番号3)または直鎖状(CGGTTEQGG)(配列番号2)を調製することができる(CPC Scientific Inc,Sunnyvale CA)。Fmoc−Gly−Wang樹脂上の標準的な従来のFmocに基づく固相ペプチド合成によって、保護された天然型集合体を合成し、次に、保護されたペプチドをTFAによって開裂させて粗製ペプチドを与え、粗製ペプチドをRP HPLCによって精製して凍結乾燥語に純粋なペプチドを与え、これを使用してBSAに接合させた。
同様に、それぞれ、直鎖状ペプチドCGTTEG(配列番号28)またはCGTTEGG(配列番号29)のアミド縮合によって、シクロ(CGTTEG)(配列番号28)およびシクロ(CGTTEGG)(配列番号29)を調製することができる。
それぞれ、直鎖状化合物C−PEG2−TTEG(配列番号36)またはC−PEG2−TTEGG(配列番号37)のアミド縮合によって、シクロ(C−PEG2−TTEG)(配列番号36)およびシクロ(C−PEG2−TTEGG)(配列番号37)を調製することができる。
それぞれ、直鎖状化合物CGTTE−PEG2(配列番号38)またはCGGTTE−PEG2(配列番号39)のアミド縮合によって、シクロ(CGTTE−PEG2)(配列番号38)およびシクロ(CGGTTE−PEG2)(配列番号39)を調製することができる。
環状および直鎖状(CGTTEG)(配列番号28)または直鎖状(CGGTTEGG)(配列番号30)ペプチドを調製することができる(CPC Scientific Inc,Sunnyvale CA)。Fmoc−Gly−Wang樹脂上の標準的な従来のFmocに基づく固相ペプチド合成によって、保護されたものを合成し、次に、保護されたペプチドをTFAによって開裂させて粗製ペプチドを与え、粗製ペプチドをRP HPLCによって精製して凍結乾燥語に純粋なペプチドを与え、これを使用してBSAに接合させた。
免疫原の構成
環状化合物シクロ(CGTTEQG)(配列番号3)、シクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)、シクロ(CGTTEG)(配列番号28)、およびシクロ(CGTTEGG)(配列番号29)を、上記に記載のように合成し、次に、KLH(免疫付与するために)またはBSA(スクリーニングのために)(CPC Scientific Inc,Sunnyvale CA)に接合させた。BSAまたはKLHを、PBS緩衝液中でSMCCによって再活性化させ、次に、PBS緩衝液中の純粋なペプチドの溶液を接合混合物に加え、接合混合物を室温で2時間攪拌する。次に、接合混合物を、透析後に凍結乾燥して、接合生成物を与える。
ペプチドはまた、トリフルオロ酢酸対イオンプロトコルを使用して、KLH(免疫付与のために)およびBSA(スクリーニングのために)に接合され得る。ペプチドは、少なくとも95%の純度を確認するために、MSおよびHPLCによって脱塩および検査される。
実施例4
抗体の生成および選択
立体配座的に制限された化合物、任意選択的に、TTEQ(配列番号1)またはシクロ(CGTTEQG)(配列番号3)、シクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)、シクロ(CGTTEG)(配列番号28)、もしくはシクロ(CGTTEGG)(配列番号29)などのTTEを含む環状ペプチドなどの環状化合物は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に連結される。連結されたペプチドまたはペプチドは、Canadian Council on Animal Careによって認証されたプロトコルに従って、マウスのモノクローナル抗体の生産のために、Antibodies LTD(Victoria BC,Canada)に送られる。
免疫付与
簡単に言うと、雌のBALB/cマウス(Charles River Laboratories,Quebec)に免疫付与する。抗原を含有するか、アジュバントは含有しない、一連の皮下水溶液注入を、19日間にわたって与える。環状ペプチド−KLHの滅菌食塩水中に、マウスごとに0.5mg/mLの溶液の注入当たり100μgで、マウスに免疫付与する。すべてのマウスを19日目に安楽死させ、ハイブリドーマ細胞株の生成のために、リンパ球を採取する。
融合/ハイブリドーマ生成
リンパ球を単離し、ポリエチレングリコール(PEG 1500)の存在下で、マウスSP2/0骨髄腫細胞と融合させる。融合された細胞を、HAT選択を使用して培養する。この方法は、半固体メチルセルロース系HAT選択培地を使用して、ハイブリドーマ選択およびクローニングを1つのステップに組み合わせる。単一細胞由来のハイブリドーマは成長して、半固体培地上でモノクロ−ナルコロニーを形成する。融合イベント後およそ10日間、結果として生じたハイブリドーマクローンを、96ウェルの組織培養プレートに移し、中間ログ成長に到達する(およそ5日間)まで培地を含有するHT中に成長させる。
ハイブリドーマ分析(スクリーニング)
ハイブリドーマからの組織培養上清は、スクリーニング抗原(環状または直鎖状ペプチド−BSA)上で間接的ELISAによって試験することができ、二次的な、TMB基質で成長させたヤギ抗IgG/IgM(H&L)−HRPを使用して、IgGおよびIgM抗体の両方についてプローブすることができる。
このアッセイにおいて、クローン>0.2ODは、次の試験ラウンドに取られる。陽性培養をスクリーニング抗原上で再試験して、分泌および無関係な抗原(ヒトトランスフェリン)について確認する。対象となるクローンは、IgGまたはIgMアイソタイプであるかどうかを判定するために、ELISAを捕捉する抗体によってアイソタイプされ、他の環状ペプチド−BSA接合ならびに天然型−BSA接合に対する間接的ELISAによって試験して、交差反応性を評価することができる。
陽性IgG−分泌クローンは、大規模生産を対象とする。
直接結合アッセイ
直鎖状および環状ペプチド(BSAに接合された)でのクローンの結合は、Biacore(商標)3000 instrument(GE Healthcare)を使用して、表面プラズモン共鳴によって試験することができる。
フロー細胞上で固定化された高密度(少なくとも1000応答ユニット(RU))の抗原を使用して、結合分析を実行する。結合を評価するために、選択されるクローンの希釈物を表面にわたって順次注入する。
親和性動力学および特異性分析について、TTEQ(配列番号1)またはTTEおよびBSAを含む立体配座ペプチド、例えば、アミン接合を介してBSAに接合された、配列番号2、3、28、または29の配列を有する環状ペプチドを、隣接するフロー細胞上に低密度(50〜100RU)で固定化する。次に、選択されるクローンの連続2倍希釈物(4.7nM〜75nM)を、3分間60μl/分で表面にわたって順次注入し、その後、相分離させる。二重参照減算後、センサグラムを、Langmuir1:1結合モデルに適合させる。最大3つの別々の分析を、同じセンサチップおよび同じ条件を使用して、3日間連続して行う。
また、分子親和性スクリーニングシステム(MASS−1)(Sierra Sensors GmbH,Hamburg,Germany)を使用して、結合分析を行うことができる。MASS−1は、実時間での結合相互作用を観察するために、高強度レーザ光および高速光学スキャニングを用いる表面プラズモン共鳴(SPR)撮像分析バイオセンサである。ペプチド−BSA接合は、標準的なアミン結合化学を使用して、高アミン容量(HAC)センサチップの別々のフロー細胞に対して共有的に固定化され、非反応部位をブロックする。同様に、隣接するフロー細胞を、参照制御表面としてBSAにより固定化する。
同族環状ペプチドに対する抗体結合の存在について、組織培養上清をスクリーニングする。各試料を希釈し、固定化されたペプチドおよびBSA参照表面にわたって2分間複製物中に注入し、その後、5分の相分離のためにのみ、実験緩衝液を注入する。すべての分析サイクル後、センサチップ表面を再生する。BSA参照表面および空の実験緩衝液注入から結合を減算し、データの20秒窓における注入の終了の20秒前に測定された反応レポート点を結合することによって、センサグラムを二重参照する。
アイソタイピング
抗体捕捉実験を使用して、ハイブリドーマ抗体をアイソタイプする。捕捉プレートを、4Cで一晩、pH9.6の緩衝液をコーティングした100uL/ウェルの炭酸塩での1:10,000のヤギ抗マウスIgG/IgM(H&L)抗体でコーティングする。100μg/mLで、主な抗体(ハイブリドーマ上清)を加える。二次抗体を、1:5,000に加える。37Cで1時間振とうしたPBS−Tween中に100uL/ウェルで、ヤギ抗マウスIgGy−HRPまたは1:10,000ヤギ抗マウスIgMμ−HRPを加える。すべての洗浄ステップを、PBS−Tweenで30分間行う。暗所で成長させ、等しい体積1MのHClで止めた、基質TMBを、50uL/ウェルで加える。
実施例5
実施例4の方法を使用して、モノクローナル抗体を作製した。特に、システイン残基を介して、KLHに接合させたシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)またはKLHに接合させたシクロ(CGTTEQG)(配列番号3)を、マウスに注入し、モノクローナル抗体を生成した。
抗体含有ハイブリドーマ組織培養上清を、免疫グロブリンタイプについてタイプ分けし、陰性対照ペプチドおよびBSAに対してスクリーニングした。以下に記載のように、免疫付与環状ペプチドへの結合、対応する直鎖状ペプチドおよび関連する環状ペプチドシクロ(CGGTTEGGG)(配列番号32)、シクロ(CGTTEGG)(配列番号29)への結合について、陰性対照ペプチドまたはBSAに結合しなかったIgG生産クローンをELISAによって試験した。
ELISA条件
炭酸塩コーティング緩衝液(pH9.6)中に100uL/ウェルで、4Cで一晩、ペプチドシクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)またはシクロ(CGTTEQG)(配列番号3)またはそれらの直鎖状バージョンを含む0.1μg/ウェルで、ELISAプレートをコーティングした。他のアッセイでは、シクロ(CGGTTEGGG)(配列番号32)またはシクロ(CGTTEGG)(配列番号29)も使用して、ELISAプレートをコーティングした。
PBS中の3%の脱脂肪乳で、室温で1時間、プレートをブロックした。正味100uL/ウェルの主な抗体のハイブリドーマ組織培養上清を、37Cで1時間振とうしてインキュベートした。1:10,000希釈での二次抗体のヤギ抗マウスIgGy−HRPを、PBS−Tween中に100uL/ウェルで加え、37Cで1時間振とうしてインキュベートした。PBS−Tweenで30分間、すべてのステップを行った。TMB基質を、50uL/ウェルで加え、暗所で成長させ、等しい体積1MのHClで止めた。成長時間は、1〜2分であり、プレートは、450nmで読み取った。
ELISAの結果を、表9AおよびBに提示し、これらは、免疫付与ペプチド、対、対応する直鎖状ペプチドに対して精製されたモノクロ−ナル抗体の結合親和性を示す。これらに示すように、直鎖状ペプチドと比較して、免疫付与環状ペプチドに対する優先的な結合を示す、IgG抗体を生産した。
加えて、TTEエピトープを含む、関連する環状ペプチドシクロ(CGGTTEGGG)(配列番号32)およびシクロ(CGTTEGG)(配列番号29)に結合するための抗体を試験した。17個の抗体のうちの15個が、免疫原に対応する直鎖状ペプチドと比較して、関連する環状ペプチドについて、より大きい親和性を有し、試験された17個の抗体のうちの14個が、免疫原に対応する直鎖状ペプチドと比較して、関連する環状ペプチドについて約2倍以上大きい選択性を有した。
実施例6
ミスフォールドTDP−43の特徴付け
表面プラズモン共鳴および免疫組織化学を使用して、天然型TDP−43ポリペプチドならびにミスフォールドTDP−43ポリペプチドに結合する能力について、抗体を試験する。
生体試料の表面プラズモン共鳴(Biacore)
均質化ヒトおよびマウスの神経学的組織試料を計量し、その後、組織の最終濃度が20%(w/v)になるように、ある体積の新鮮な氷水TBS(5mMのEGTA、5mMのEDTA(両方とも、Sigma製の)およびRoche Diagnostics,Laval QC,Canada製のEDTAを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充された)中に沈水させた。機械的プローブホモジナイザーを使用して、この緩衝液中で組織を均質化する(3×30秒のパルス、その間に30秒の停止、すべて氷上で行われる)。次に、TBS均質化試料を、超遠心分離法(90分間で70,000xg)に供する。上清を収集し、アリコートし、−80℃で保存した。BCAタンパク質アッセイ(Pierce Biotechnology Inc,Rockford IL,USA)を使用して、TBSホモジネートのタンパク質濃度を判定する。
表面プラズモン共鳴分析ALS患者および/またはFTD患者および年齢が一致した対照由来のCSF試料および神経学的組織試料を分析する。試験抗体およびIgG1アイソタイプ対照を、センサチップの2つの別々のフロー細胞上で、高密度(約10,000)で直接固定化する。Biacore 3000を使用して、TBS中に均質化された希釈された神経学的組織試料を、300秒間表面にわたって順次注入し、その後、150秒の緩衝液中の解離および表面再生を行う。結合応答を、IgG1参照表面結合の減算によって二重参照し、アッセイ緩衝液で正規化し、および異なる群の試料を比較する。
実施例7
ヒト胚腎臓細胞(HEK293FT)を、HA−タグを有し、核局在化シグナル(TDP−43ΔNLS)を欠く、TDP−43の修飾形態で、一時的にトランスフェクトした。この形態のタンパク質は、細胞質中に蓄積し、ミスフォールド凝集体を形成する。空のベクターを、陰性対照として使用した。
細胞を、4℃で一晩、HAタグに対して(ミスフォールド細胞質TDP−43を検出するために)1μg/mlのポリクローナルウサギ抗体で、または10μg/mlの試験抗体で染色した。次に、室温で1時間、蛍光標識化抗ウサギ(赤色Alexa Fluor 647)または抗マウス(緑色Alexa Fluor 488)二次抗体で染色することによって、結合された抗体を検出した。核DNAを、Hoeschst 33342染料(青色)で染色した。0.3μmのステップを含むZ積層様式で共焦点Leica SP8顕微鏡上にマイクログラフを得た。含まれる画像は、細胞厚さ全体のZ平面投影を表す。単一蛍光チャネルおよび併合シグナルのZ積層型画像(20〜30個のステップ)を捕捉した。
結果を図10に提示する。パネルAは、Hoechst 33342染料染色細胞を示し、細胞核を明らかにする。図10Bは、HAタグ付き組み換えTDP−43ΔNLSについて染色された細胞を示す。組み換えタンパク質のみを検出する。予想されるように、NLSを欠く、外因的に発現されたTDP−43が、細胞質中に見出され、ミスフォールド凝集体中に存在している。図10Cは、シクロ(CGGTTEQGG)を使用して生産されたモノクロ−ナル抗体の結果を示す。主に細胞質染色が存在しており、これは、試験抗体が野生型核TDP−43に結合しないことを示唆している。図10Dは、HAタグ付き組み換えTDP−43ΔNLS細胞質凝集体の検出とTDP−43の試験抗体染色との間に実質的な重複(共局在化)がある併合画像を示す。
実施例8
対照および突発性ALS患者から、ヒト脊髄ホモジネートを調製し、選択される抗体によるドットプロットによって分析した。
ALSを有しないヒト由来の組織を対照として使用し、2つの異なる突発性ALS組織試料を評価した。1つは、C90rf72突然変異を保有する患者から得られた組織試料であり、もう1つは、未知の突然変異状態を有する患者から得られた組織試料であった。
複製物中で10マイクログラムのホモジネートによりPVDF膜にドット付けし、試験抗体および対照抗体(mIgG1)を、2マイクログラム/マイクロリットル貯蔵液の500倍の希釈で使用した。ウサギポリクローナルTDP−43抗体(ProteinTech,Rosemont IL)を、陽性対照として使用した。
図11Aに示すように、IgG1陰性対照は、すべての試料について、図11Bに示すように、低い背景染色を生産し、陽性対照抗体は、すべての試験された試料について頑健な陽性シグナルを生産した。
試験抗体を使用して、sALS試料の選択的染色を観察した。抗体1は、クローンIG10であり、抗体2は、クローン2H10であり、抗体3は、クローン11F3であり、抗体4は、クローン3H5であり、抗体5は、4G5であり、抗体6は、クローン9C5である。抗体6C5はまた、sALS試料の選択的染色を示した。
実施例9
結合凝集TDP−43について陽性の抗体のうちのいくつかを配列決定した。
ハイブリドーマによって発現された免疫グロブリン遺伝子の転写を、標準的なRT−PCRプロトコルを使用してハイブリドーマ細胞から生成され、標準的な染料ターミネーター毛管配列決定方法(Immunoprecise,Victoria BC Canada)を使用して配列決定された、cDNAからの特許プライマーのセットで増幅させた。
相補性判定領域(CDR)CDR1、CDR2およびCDR3を、ハイライトし、太字にし、下線を引き、IgBLASTに従って同定した(国立バイオテクノロジー情報センターツールを使用して入手可能(Ye et al.,Nucelic Acids Research 2013,Vol.41,Web Server Issue doi:10:1093|nar|gkt382)。このツールを使用して、IMGTまたはNCBI生殖系列V遺伝子データベース(このようなデータベースにおける配列は、FR/CDR境界について予め注釈がついている)に対するBLASTについてクエリを調査する。一番上のデータベース配列のヒットを使用して、予め注釈が付いているFR/CDR境界情報をクエリ配列にマッピングする。BLAST調査パラメータは、Expectカットオフ、20;ワードサイズ 9;不一致ペナルティ、−1;塵埃フィルタリング、オフである。
標識されたVH1およびVH2である抗体2H10について、2つの重鎖を同定した。
1つまたは両方の重鎖がそれらの環状ペプチド免疫原について選択的な抗体を生産するかどうかは、各重鎖(または、可変領域)を軽鎖(または、可変領域)で発現させ、標的結合を評価することによって確認することができる。
抗体2H10−VH1の重鎖整列は、2H10−V2と比較して、6C5および9C5について重鎖と最も緊密に関連している。
実施例10
抗体9C5を使用したTDP−43の免疫蛍光染色
背景を減少させる以下の修正を含む、実施例7に記載の構成およびプロトコルを使用して、ミスフォールドTDP−43を組み換え発現させた。主な抗体および二次抗体を、使用前に10000RPMで10分間回転させ、主な追加の前に、室温で1時間10%のNGSでセクションをブロックした。DAPI染色を使用して、細胞核を同定する。
図12Cに示すように、9C5抗体は、ミスフォールドTDP−43のTDP−43細胞質内包物を検出した。図12Aは、DAPI染色細胞を示し、検出されたTDP43が細胞質であることを確認している。組み換え発現されたTDP−43が、主に9C5染色と共局在化したタグ付きHAであるため(図12D)、HA(図12B)についても染色を行った。
表11 エピトープおよび環状化合物の配列
1.TTEQ(配列番号1)
2.CGGTTEQGG、シクロ(CGGTTEQGG)(配列番号2)
3.CGTTEQG、シクロ(CGTTEQG)(配列番号3)
4.GTTEQG(配列番号4)
5.TTEQG(配列番号5)
6.GTTEQ(配列番号6)
7.KTTEQD(配列番号7)
8.TEQD(配列番号8)
9.TTEQD(配列番号9)
10.KTTE(配列番号10)
11.TTEQDL(配列番号11)
12.KTTEQ(配列番号12)
13.CGTTEQGC、環状(CGTTEQGC)(配列番号13)
14.KTTEQDL(配列番号14)
15.TEQDLK(配列番号15)
16.TEQDLKE(配列番号16)
17.TEQDLKEY(配列番号17)
18.TEQDLKEYF(配列番号18)
19.EQDL(配列番号19)
20.WKTTEQ(配列番号20)
21.TTEQDLKEYFSTFGEV(配列番号21)
22.CGGTTEQGGG、シクロ(CGGTTEQGGG)(配列番号22)
23.CGTTEQGG、シクロ(CGTTEQGG)(配列番号23)
24.C−PEG2−TTEQG、シクロ(C−PEG2−TTEQG)、CTTEQG(配列番号24)
25.C−PEG2−TTEQGG、シクロ(C−PEG2−TTEQGG)、CTTEQGG(配列番号25)
26.CGTTEQ−PEG2、シクロ(CGTTEQ−PEG2)、CGTTEQ(配列番号26)
27.CGGTTEQ−PEG2、シクロール(CGTTEQ−PEG2)、CGTTEQ(配列番号27)
28.CGTTEG、シクロ(CGTTEG)(配列番号28)
29.CGTTEGG、シクロ(CGTTEGG)、(配列番号29)
30.CGGTTEGG、シクロ(CGGTTEGG)、(配列番号30)
31.CGGGTTEGG、シクロ(CGGGTTEGG)、(配列番号31)
32.CGGTTEGGG、シクロ(CGGTTEGGG)、(配列番号32)
33.CGGGTTEGGG、シクロ(CGGGTTEGGG)、(配列番号33)
34.CGGGGTTEGGG、シクロ(CGGGGTTEGGG)、(配列番号34)
35.CGGGGTTEGGGG、シクロ(CGGGGTTEGGGG)、(配列番号35)
36.C−PEG2−TTEG、シクロ(C−PEG2−TTEG)、CTTEG(配列番号36)
37.C−PEG2−TTEGG、シクロ(C−PEG2−TTEGG)、CTTEGG(配列番号37)
38.CGTTE−PEG2、シクロ(CGTTE−PEG2)、CGTTE(配列番号38)
39.CGGTTE−PEG2、シクロール(CGGTTE−PEG2)、CGGTTE(配列番号39)
40.GGCGG(配列番号40)
41.GCGG(配列番号41)
42.CGGGTTEQGG、シクロ(CGGGTTEQGG)、(配列番号42)
43.CGGGGTTEQGGG、シクロ(CGGGGTTEQGGG)、(配列番号43)
44.CGGGGTTEQGGGG、シクロ(CGGGGTTEQGGGG)、(配列番号44)
本願は、好ましい例であると現在考えられているものを参照して記載されているが、本願は、開示される例に限定されないことが理解されるべきである。対照的に、本願は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる様々な修正および同等の配列を包含することを意図している。
すべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、それらの全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。特に、例えば、表またはどこかに提供される受託番号および/またはバイオマーカー配列(例えば、タンパク質および/または核酸)を含む、本明細書に提供される各受託番号と関連付けられる配列は、それらの全体が参照により組み込まれる。
特許請求の範囲の範囲は、好ましい実施形態および実施例によって限定されるべきではなく、全体として記載と一致する最も広い範囲の解釈が与えられるべきである。
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