JP2020521744A

JP2020521744A - 純粋な駆虫組成物および関連する方法

Info

Publication number: JP2020521744A
Application number: JP2019564903A
Authority: JP
Inventors: ラフィ・バン・アロイアン; ゲイリー・アール・オストロフ
Original assignee: University of Massachusetts UMass
Current assignee: University of Massachusetts UMass
Priority date: 2017-05-23
Filing date: 2018-05-22
Publication date: 2020-07-27
Also published as: CA3062638A1; AU2018271878A1; CN111148524A; US11826389B2; EP3630150A1; US20240148800A1; CN117752694A; EP3630150A4; WO2018217807A1; US11844815B2; US20220354905A1; US20200188452A1

Abstract

対象において寄生虫または蠕虫感染を処置し、またはその発症の重篤度を低減するための組成物および方法を開示する。該方法は、単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成される単離された天然の生物活性殺線虫結晶を含む組成物を、処置有効量で対象に投与することを含む。該単離された天然の生物活性殺線虫結晶は、細菌芽胞、または結晶形態の殺線虫結晶タンパク質以外の宿主細菌タンパク質を実質的に含まない。単離された天然の生物活性殺線虫結晶を製造する方法も開示する。該結晶タンパク質は、全長Ｃｒｙタンパク質、トランケートされたＣｒｙタンパク質、Ｃｒｙタンパク質バリアント、またはＣｒｙタンパク質サブバリアントでありうる。結晶タンパク質の例には、Ｃｒｙ５Ｂ、Ｃｒｙ２１、Ｃｒｙ１４Ａ、Ｃｒｙ６ＡおよびＣｒｙ１３Ａが含まれる。

Description

［連邦委託研究の明示］
本発明は、米国保健福祉省（ＨＨＳ）国立衛生研究所（ＮＩＨ）により与えられたグラント番号NIAID 5R01AI056189-13、および米国農務省（ＵＳＤＡ）国立食品農業研究所（ＮＩＦＡ）により与えられたグラント番号NIFA 2016-67015-24861の下、政府の助成を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

［関連出願］
本願は、その内容が引用により本書の一部とされる２０１７年５月２３日出願の米国仮特許出願第６２／５１００８１号の優先権を主張する。

ヒトの消化管に寄生する土壌伝播蠕虫（ＳＴＨ）に、全世界で最も貧困な人々の２３億人、および最も貧困な子供４億人以上が感染している。土壌細菌Bacillus thuringiensis（Ｂｔ）により産生される結晶（Ｃｒｙ）タンパク質は、安全かつ効果的なＳＴＨ処置を提供する薬剤の候補である。しかしながら、Ｃｒｙタンパク質による駆虫の生物学的活性は確立されているものの、ＳＴＨ処置のためにヒトおよび動物の消化（ＧＩ）管に、無傷の生物活性Ｃｒｙタンパク質を効果的に届けることに関して、依然大きな課題が存在する。大勢の貧困患者を処置するのに、処置は非常に低い価格（１用量当たり１ドル未満）で大量に利用可能でなければならない開発途上国において、Ｃｒｙタンパク質を実用的ＳＴＨ処置剤として適用することは、Ｃｒｙタンパク質の発現および精製に係る費用およびスケールアップの問題のために制限されている。

Ｃｒｙタンパク質を提供する、安価で簡単でスケールアップ可能な方法は、該タンパク質をB. thuringiensisにおいて発現させることである。該細菌は、Ｃｒｙタンパク質を非常に高いレベルで発現するのに非常に適しており、環境への適用用にはすでに大規模で安価に培養されている。しかしながら、ＢｔにおけるＣｒｙタンパク質の高レベルでの産生には、芽胞形成が必要である。したがって、現在環境に適用されているＣｒｙタンパク質組成物は、細菌由来の結晶タンパク質と芽胞との両方を含む「芽胞−結晶溶解物」（ＳＣＬ）の形態のものである。このようなＳＣＬ組成物をヒトに適用するには、ヒトにおいて食中毒を引き起こす多くのエンテロトキシン遺伝子を含む可能性のある細菌芽胞の存在の故に、問題がある。さらに、芽胞は扱いが難しく有効性に劣るので、Ｂｔ芽胞を含む製剤はどれも単位重量当たり、必然的にかなりの量の不活性成分（芽胞）を活性成分（結晶）と共に含むことになるから、ヒトおよび動物のいずれに対しても投与がより困難である。芽胞と結晶タンパク質とを分離することは、両者がほぼ同じ大きさであるゆえに難しい。

したがって、タンパク質治療薬、例えば駆虫タンパク質を消化管に送達するための新たなアプローチが当分野において必要とされている。

本開示は、芽胞形成を欠くかまたは芽胞形成能を持たない細菌を使用して、医薬としての使用に適した純度の高い殺線虫結晶製剤を製造できるという発見に基づく。本発明の純粋な殺線虫結晶の製剤は、芽胞結晶溶解物（ＳＣＬ）から精製された結晶タンパク質よりも優れた抗蠕虫作用を提供する。さらに、そのような製剤は、ヒトへの投与に適さない不純物の芽胞および宿主細菌タンパク質を実質的に含まない。いくつかの例示態様において、本発明の製剤は、可溶性の細胞成分、脂質、および細胞壁デブリを実質的に含まない。

一側面において、本開示は、単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成される、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を含む医薬組成物を提供する。殺線虫結晶タンパク質は芽胞不形成形態の宿主細菌によって産生され、医薬組成物は、細菌芽胞、または結晶形態の殺線虫結晶タンパク質以外の宿主細菌タンパク質を実質的に含まない。

いくつかの態様において、本発明の医薬組成物は、ヒト対象への経口投与のために適当な賦形剤を含む。いくつかの態様において、宿主細菌はBacillus種である。いくつかの態様において、宿主細菌はBacillus thuringiensis（Ｂｔ）である。いくつかの態様において、宿主細菌はEscherichia coliまたはPseudomonas fluorescens種である。

いくつかの態様において、芽胞不形成宿主細菌は、天然の生物活性殺線虫結晶が該細菌のサイトゾル中に捕らえられるように、芽胞形成の欠失もたらす遺伝子変異を持つよう遺伝子組換えされている。いくつかの態様において、芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異は、以下のものからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子の欠失または不活性化である：kinA、kinB、spo0A、spo0B、spo0E、spo0F、spo0J、spo0M spoIIB、spoIID、spoIIE、spoIIF、spoIIG、spoIIL、spoIIM、spoIIIA、spoIIIB、spoIIIE、spoIVA、spoIVC、spoIVD、spoVG、spoVK、spoVL、spoVM、spoVN、spoVP、spoVQ、spoVID、σH、σF、σE、σG、およびσK。一態様において、芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異は、spo0A遺伝子の欠失または不活性化である。

いくつかの態様において、宿主細菌は、単一種の殺線虫結晶タンパク質を芽胞不形成特異的プロモーターの制御下に発現するように遺伝子組換えされている。いくつかの態様において、芽胞不形成特異的プロモーターは、Ｃｒｙ３Ａ、ＧｅｒＡ、ＧＮＡＴ、またはＴａｄＡプロモーターである。いくつかの態様において、単一種の殺線虫結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５Ｂ、Ｃｒｙ５Ｃ、Ｃｒｙ５Ｄ、Ｃｒｙ６Ａ、Ｃｒｙ１３Ａ、Ｃｒｙ１４Ａ、Ｃｒｙ２１Ａ、Ｃｒｙ２１Ｂ、Ｃｒｙ５５Ｂ、ならびにそれらのバリアントおよびトランケーションからなる群から選択される。いくつかの態様において、殺線虫結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５Ｂまたはそのバリアントもしくはフラグメントである。いくつかの態様において、殺線虫結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５ＢバリアントＳｅｒ４０７Ｃｙｓである。

本開示の医薬組成物のいくつかの態様において、医薬組成物は、単離された天然の生物活性殺線虫結晶の形態の第２の結晶タンパク質であって、該第２の結晶タンパク質のみから形成されるものをさらに含む。

いくつかの態様において、医薬組成物は、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を少なくとも９５％の含量で含む。

いくつかの態様において、単離された天然の生物活性殺線虫結晶は、経口的に利用可能な投与形態である。いくつかの態様において、医薬組成物は、乾燥粉末形態であり、医薬用カプセルに封入される。

他の一側面において、本開示は、
（ａ）単一種の殺線虫結晶タンパク質を発現するように組換えられた芽胞不形成形態の宿主細菌を増殖させること；ここで、該芽胞不形成宿主細菌は、単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成される天然の生物活性殺線虫結晶を産生し、該宿主細菌は増殖培地中で増殖され、場合により、該芽胞不形成宿主細菌は該天然の生物活性殺線虫結晶を該増殖培地中に放出する；
および
（ｂ）該天然の生物活性殺線虫結晶を単離および濃縮して、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を形成すること
を含む、医薬組成物の製造方法を提供する。

本方法のいくつかの態様において、宿主細菌はBacillus種である。いくつかの態様において、宿主細菌はBacillus thuringiensis（Ｂｔ）である。いくつかの態様において、宿主細菌はE. coliまたはP. fluorescens種である。

本方法のいくつかの態様において、芽胞不形成宿主細菌は、天然の生物活性殺線虫結晶が該細菌のサイトゾル中に捕らえられるように、芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異を持つよう遺伝子組換えされている。いくつかの態様において、芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異は、以下のものからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子の欠失または不活性化である：kinA、kinB、spo0A、spo0B、spo0E、spo0F、spo0J、spo0M spoIIB、spoIID、spoIIE、spoIIF、spoIIG、spoIIL、spoIIM、spoIIIA、spoIIIB、spoIIIE、spoIVA、spoIVC、spoIVD、spoVG、spoVK、spoVL、spoVM、spoVN、spoVP、spoVQ、spoVID、σH、σF、σE、σG、およびσK。いくつかの態様において、芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異は、spo0A遺伝子の欠失または不活性化である。

上記方法のいくつかの態様において、宿主細菌は、単一種の殺線虫結晶タンパク質を芽胞不形成特異的プロモーターの制御下に発現するように遺伝子組換えされている。いくつかの態様において、芽胞不形成特異的プロモーターは、Ｃｒｙ３Ａ、ＧｅｒＡ、ＧＮＡＴ、またはＴａｄＡプロモーターである。いくつかの態様において、単一種の殺線虫結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５Ｂ、Ｃｒｙ５Ｃ、Ｃｒｙ５Ｄ、Ｃｒｙ６Ａ、Ｃｒｙ１３Ａ、Ｃｒｙ１４Ａ、Ｃｒｙ２１Ａ、Ｃｒｙ２１Ｂ、Ｃｒｙ５５Ｂ、ならびにそれらのバリアントおよびトランケーションからなる群から選択される。いくつかの態様において、殺線虫結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５Ｂまたはそのバリアントもしくはフラグメントである。いくつかの態様において、殺線虫結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５ＢバリアントＳｅｒ４０７Ｃｙｓである。

いくつかの態様において、前記方法は、芽胞不形成宿主細菌を、該宿主細菌を不活化するために抗菌化合物に暴露するステップをさらに含む。いくつかの態様において、抗菌化合物は沃素である。いくつかの態様において、抗菌化合物は抗生物質医薬である。いくつかの態様において、抗菌化合物はβ−ラクタム抗生物質である。いくつかの態様において、抗菌化合物は、テルペン、ヘキサンおよびホルムアルデヒドからなる群から選択される有機溶媒である。いくつかの態様において、抗菌化合物はテルペンである。いくつかの態様において、テルペンは、チモール、オイゲノール、ゲラニオール、カルバクロールおよびシトラールまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様において、テルペンはカルバクロールである。いくつかの態様において、抗菌化合物はヘキサンである。

いくつかの態様において、前記方法は、殺線虫結晶タンパク質から不活化剤を抽出するために、不活化された宿主細菌に食用油を加えるステップを含む。いくつかの態様において、食用油は、トウモロコシ油、大豆油、ヤシ油、綿実油、オリーブ油、パーム油、ピーナツ油、ナタネ油、ベニバナ油およびヒマワリ油からなる群から選択される。いくつかの態様において、食用油はトウモロコシ油である。いくつかの態様において、食用油はトウモロコシ油である。いくつかの態様において、前記方法は、殺線虫結晶タンパク質から細胞成分を抽出するために、不活化された宿主細菌に有機溶媒を加えるステップを含む。いくつかの態様において、有機溶媒はヘキサンである。いくつかの態様において、ヘキサンは、不活化宿主細菌に５０％ v/vまで加えられる。いくつかの態様において、前記方法は、有機溶媒と不活化宿主細菌の混合物を遠心分離して殺線虫結晶タンパク質をペレット化するステップを含む。

いくつかの態様において、前記方法は、不活化された宿主細菌をホモジナイズして、天然の生物活性殺線虫結晶を含む細菌溶解物を形成するステップをさらに含む。いくつかの態様において、該方法は、該細菌溶解物を濃縮するステップをさらに含む。いくつかの態様において、細菌溶解物を濃縮するステップは、遠心分離、限外濾過および透析からなる群から選択される。

いくつかの態様において、前記方法は、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を、経口的に利用可能な投与形態に製剤化するステップをさらに含む。いくつかの態様において、該製剤化ステップは、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を凍結乾燥または噴霧乾燥することを含む。いくつかの態様において、該製剤化ステップは、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を医薬用カプセルに充填することを含む。

さらなる一側面において、本開示は、
（ａ）単一種の殺線虫結晶タンパク質を発現するように組換えられた芽胞不形成形態の宿主細菌を増殖させること；ここで、該芽胞不形成宿主細菌は、単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成される天然の生物活性殺線虫結晶を産生する；
（ｂ）該増殖した芽胞不形成宿主細菌を、抗菌化合物への暴露により不活化すること；
（ｃ）該不活化した芽胞不形成宿主細菌をホモジナイズして、細菌溶解物を形成すること；および
（ｄ）該細菌溶解物中の天然の生物活性殺線虫結晶を濃縮して、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を形成すること
を含む、医薬組成物の製造方法を提供する。

いくつかの態様において、この方法は、増殖した芽胞不形成宿主細菌を不活化の前に濃縮するステップをさらに含む。いくつかの態様において、宿主細菌はBacillus種である。。いくつかの態様において、宿主細菌はBacillus thuringiensis（Ｂｔ）である。いくつかの態様において、宿主細菌はE. coliまたはP. fluorescens種である。

この方法のいくつかの態様において、芽胞不形成宿主細菌は、天然の生物活性殺線虫結晶が該細菌のサイトゾル中に捕らえられるように、芽胞形成の欠失もたらす遺伝子変異を持つよう遺伝子操作されている。いくつかの態様において、芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異は、以下のものからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子の欠失または不活性化である：kinA、kinB、spo0A、spo0B、spo0E、spo0F、spo0J、spo0M spoIIB、spoIID、spoIIE、spoIIF、spoIIG、spoIIL、spoIIM、spoIIIA、spoIIIB、spoIIIE、spoIVA、spoIVC、spoIVD、spoVG、spoVK、spoVL、spoVM、spoVN、spoVP、spoVQ、spoVID、σH、σF、σE、σG、およびσK。いくつかの態様において、芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異は、spo0A遺伝子の欠失または不活性化である。

前記方法のいくつかの態様において、抗菌化合物は沃素である。該方法の他のいくつかの態様において、抗菌化合物は抗生物質医薬である。該方法のいくつかの態様において、抗菌化合物はβ−ラクタム抗生物質である。いくつかの態様において、抗菌化合物は、テルペン、ヘキサンおよびホルムアルデヒドからなる群から選択される有機溶媒である。いくつかの態様において、抗菌化合物はテルペンである。いくつかの態様において、テルペンは、チモール、オイゲノール、ゲラニオール、カルバクロールおよびシトラールまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様において、テルペンはカルバクロールである。いくつかの態様において、抗菌化合物はヘキサンである。

いくつかの態様において、前記方法は、不活化された宿主細菌から抗菌化合物を抽出するステップをさらに含む。いくつかの態様において、前記方法は、殺線虫結晶タンパク質から不活化剤を抽出するために、不活化された宿主細菌に食用油を加えるステップを含む。いくつかの態様において、食用油は、トウモロコシ油、大豆油、ヤシ油、綿実油、オリーブ油、パーム油、ピーナツ油、ナタネ油、ベニバナ油およびヒマワリ油からなる群から選択される。いくつかの態様において、食用油はトウモロコシ油である。いくつかの態様において、前記方法は、殺線虫結晶タンパク質から細胞成分を抽出するために、不活化された宿主細菌に有機溶媒を加えるステップを含む。いくつかの態様において、有機溶媒はヘキサンである。いくつかの態様において、ヘキサンは、不活化宿主細菌に５０％ v/vまで加えられる。いくつかの態様において、前記方法は、有機溶媒と不活化宿主細菌の混合物を遠心分離して殺線虫結晶タンパク質をペレット化するステップを含む。

いくつかの態様において、前記方法は、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を、経口的に利用可能な投与形態に製剤化するステップをさらに含む。いくつかの態様において、該方法は、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を凍結乾燥または噴霧乾燥することを含む製剤化ステップを含む。いくつかの態様において、該製剤化ステップは、単離され精製され純粋な天然の生物活性殺線虫結晶を医薬用カプセルに充填することを含む。

さらなる一側面において、本開示は、単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成される単離された天然の生物活性殺線虫結晶を含み、細菌芽胞を含まない医薬組成物を、処置有効量で対象に投与することを含む、対象において寄生虫感染を処置する方法を提供する。

該処置方法のいくつかの態様において、殺線虫結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５Ｂ、Ｃｒｙ５Ｃ、Ｃｒｙ５Ｄ、Ｃｒｙ６Ａ、Ｃｒｙ１３Ａ、Ｃｒｙ１４Ａ、Ｃｒｙ２１Ａ、Ｃｒｙ２１Ｂ、Ｃｒｙ５５Ｂ、ならびにそれらのバリアントおよびトランケーションからなる群から選択される。いくつかの態様において、殺線虫結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５Ｂである。いくつかの態様において、殺線虫結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５ＢバリアントＳｅｒ４０７Ｃｙｓである。

前記処置方法のいくつかの態様において、前記組成物は、第２の結晶タンパク質のみから形成される単離された天然の生物活性殺線虫結晶の形態の第２の結晶タンパク質をさらに含む。いくつかの態様において、前記医薬組成物は、少なくとも約９５％の、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を含む。いくつかの態様において、前記組成物は、乾燥粉末形態であり、医薬用カプセルに充填される。

図１Ａ〜１Ｂは、野生型結晶タンパク質における保存されたアミノ酸ブロックを示す図である。図１Ａは、いくつかのＣｒｙタンパク質間において保存されたブロックの位置を示す。de Maagd, R.A., et al. “How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world.” Trends in Genetics 17(4): 193-99, 195 (Figure 2a) (April 2001)。図１Ｂは、いくつかのＣｒｙタンパク質間において保存されたブロックの位置を示す。Schnepf, E., et al. “Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins.” Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3): 775-806, 781 (Figure 3) (Sept. 1998)。図２に、Ｃｒｙ５Ｂａ１のアミノ酸配列［配列番号１］を示す。図３に、Ｃｒｙ１３Ａａ１のアミノ酸配列［配列番号２］を示す。図４に、Ｃｒｙ１４Ａａ１のアミノ酸配列［配列番号３］を示す。図５Ａ〜５Ｃに、他の結晶タンパク質のアミノ酸配列を示す。図５Ａに、Ｃｒｙ２１Ａａ１のアミノ酸配列［配列番号４］を示す。図５Ｂに、Ｃｒｙ２１Ａａ２のアミノ酸配列（Ｃｒｙ２１Ａａ１との同一性が９８％）［配列番号５］を示す。図５Ｃに、Ｃｒｙ６Ａのアミノ酸配列［配列番号６］を示す。図６は、不活化ＢａＣＣ（ＩＢａＣＣ）から殺線虫結晶タンパク質を精製するステップを示すフローチャートである。図７は、Ｃｒｙ５ＢＰＣＣの精製プロセスのいくつかのステップからのサンプルを適用したタンパク質ゲルの画像である。図８は、Ｃｒｙ５ＢＰＣＣの、１０００倍の倍率の位相差顕微鏡写真である。図９Ａは、インビトロでＣｒｙ５ＢＰＣＣに暴露した後の鞭虫の運動性の経時変化を示すグラフである。図９Ｂは、Ｃｒｙ５ＢＰＣＣおよび水対照で処置したハムスターにおけるインビボ鞭虫量を示すヒストグラムである。図１０Ａは、インビトロでＣｒｙ５ＢＰＣＣに暴露した後の鉤虫の運動性の経時変化を示すグラフである。図１０Ｂは、Ｃｒｙ５ＢＰＣＣおよび水対照で処置したハムスターにおける鉤虫量を示すヒストグラムである。図１０Ｃは、Ｃｒｙ５ＢＰＣＣおよび水対照での処置の前後のハムスターにおける鉤虫量を示すヒストグラムである。図１１Ａは、Ｃｒｙ５Ｂ芽胞−結晶溶解物（ＳＣＬ）または水対照のいずれかで処置したハムスターにおける鉤虫量のプロットを示す。図１１Ｂは、ＳＣＬまたは水対照のいずれかで処置したハムスターにおけるグラム当たりの卵数のプロットを示す。図１２は、Ancyclostoma ceylanicum鉤虫卵に対するさまざまな濃度のＣｒｙ５ＢＰＣＣの毒性を示すヒストグラムである；一部のＣｒｙ５ＢＰＣＣは、リゾチームの添加により処理した。図１３Ａは、ＢａＣＣからＰＣＣを精製するプロトコルを示すダイアグラムである。図１３Ｂは、１０％ヘキサンによる処理の前後のＢａＣＣの顕微鏡画像（上図）、および１０％ヘキサンによる処理の前後のＢａＣＣの細胞増殖率（ＯＤ６００を用いて測定）を示す棒グラフ（下図）である。図１３Ｃは、出発ＢａＣＣ材料および最終的な精製されたＰＣＣ産物を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。図１４は、ＢａＣＣを、該細菌を死滅させるために１０％ヘキサンで処理し、他の微生物汚染物を除去するために５０％ヘキサンで処理して得たＰＣＣ（ＰＣＣ−Ｈｅｘ／Ｈｅｘ）の生物活性を示す折れ線グラフである。図１５は、ＢａＣＣを、該細菌を死滅させるためにカルバクロールで処理し（ＩＢａＣＣ）、他の微生物汚染物を除去するために５０％ヘキサンで処理して得たＰＣＣ（ＰＣＣ−Ｃａｒｖ＆Ｈｅｘ）、およびＢａＣＣを、該細菌を死滅させるために１０％ヘキサンで、他の微生物汚染物を除去するために５０％ヘキサンで処理して得たＰＣＣ（ＰＣＣ−Ｈｅｘ＆Ｈｅｘ）の生物活性を示す棒グラフである。図１６は、ＢａＣＣを、該細菌を死滅させるためにカルバクロールで、他の微生物汚染物を除去するために５０％ヘキサンで処理して得たＰＣＣの生物活性を示す折れ線グラフである。

純粋な殺線虫結晶タンパク質の組成物、そのような純粋な殺線虫結晶タンパク質を製造する方法、純粋な殺線虫結晶タンパク質の製剤を対象に投与することによりＳＴＨ感染を治療または予防する方法を開示する。

微生物
いくつかの態様において、本開示の細菌は、芽胞不形成細菌である。本書において、用語「芽胞不形成細菌」は、芽胞形成能力のない野生型細菌（例えばある種のグラム陰性細菌）、および芽胞形成を欠くように組換えられた芽胞形成細菌の遺伝的バリアント（例えばある種のグラム陽性細菌）を包含する。本書において、「芽胞形成の欠失をもたらす変異」または「芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異」とは、芽胞形成経路の構成員の欠失をもたらす任意の遺伝子変異、および／または生存能力のある芽胞の形成を阻止する任意の遺伝子変異をさす。例えば、芽胞不形成細菌およびその作製は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３４３６に記載されており、それを参照により本書の一部とする。

いくつかの態様においては、芽胞形成欠失細菌が好ましい。芽胞形成欠失細菌の例は、spo0A-Bacillus thuringiensisである。芽胞形成欠失をもたらすが、生存能力または異種遺伝子発現には実質的に影響しない、任意の変異または変異の組み合わせを用いることができる。そのような変異は、以下の遺伝子における変異を包含するが、それに限定されない：kinA、kinB、spo0A、spo0B、spo0E、spo0F、spo0J、spo0M spoIIB、spoIID、spoIIE、spoIIF、spoIIG、spoIIL、spoIIM、spoIIIA、spoIIIB、spoIIIE、spoIVA、spoIVC、spoIVD、spoVG、spoVK、spoVL、spoVM、spoVN、spoVP、spoVQ、spoVID、σH、σF、σE、σG、およびσK。（Silvaggi, J., et al. Unmasking novel sporulation genes in Bacillus subtillus. J Bacteriol. 186, 8089-8095, 2004; Sandman, K., et al. Genetic Analysis of Bacillus subtilis spo Mutations Generated by Tn917-Mediated Insertional Mutagenesis. Genetics. 117, 603-617, 1987; Malvar and Baum, Tn5401 Disruption of the spoOF Gene, Identified by Direct Chromosomal Sequencing, Results in CrylIlIA Overproduction in Bacillus thuringiensis. J Bacteriol. 176, 4750-4753, 1994）

いくつかの態様において、組換えによる芽胞形成欠失は、宿主細菌における他の結晶タンパク質および他の毒性関連芽胞形成産物の産生の欠失をももたらしうる。例えば、spo0A-Ｂｔは、Ｃｒｙ５Ｂまたは他のエンドトキシン、例えばＣｒｙ１、Ｃｒｙ４またはＣｒｙ８を産生しない。いくつかの態様において、タンパク質結晶の形成にさらなるＣｒｙタンパク質が用いられないことを確実にするために、他のＣｒｙタンパク質および／またはアクセサリータンパク質の遺伝子が欠失または不活性化されうる。

芽胞形成欠失細菌のそのような態様において、芽胞形成欠失細菌は、細菌の芽胞形成期に先立って、例えば増殖（vegetative growth）または静止期において活発におよび／または高度に発現されるプロモーターの制御下のＣｒｙ５Ｂのような単一の結晶タンパク質遺伝子を発現するように組換えられうる。そのような組換え細菌は、単一の結晶タンパク質のみを発現させることができ、得られる殺線虫結晶は均一に単一種の結晶タンパク質のみからなる。いくつかの態様において、プロモーターは異種（すなわち、芽胞不形成特異的プロモーター）である。一態様において、プロモーターはＣｒｙ３Ａ、ＧｅｒＡ、ＧＮＡＴまたはＴａｄＡプロモーターである。

いくつかの態様においては、増殖サイクルの終了時に自己溶解する芽胞不形成細菌の株を使用しうる。精製プロセスにおけるホモジナイズステップを回避または縮小しうるように、そのような自己溶解細菌を使用しうる。

細菌は、次の理由で、ＳＴＨの防除に特に適用しうる：１）組換え細菌は、哺乳動物対象の消化管に投与される前に、大量のＣｒｙタンパク質を安価に発現することができ、消化管内で細菌により分泌されうるＣｒｙタンパク質とは独立してそのように発現されるＣｒｙタンパク質は、ＳＴＨに対し顕著に作用することが示されている。２）精製Ｃｒｙタンパク質を用いて鉤虫、鞭虫およびH. bakeriに対処するための、いずれも感染齧歯動物において行われた研究により、哺乳動物消化管中のＳＴＨはＣｒｙタンパク質を摂取して、Ｃｒｙタンパク質によって死滅／無毒化されうることが示されている。３）処置用タンパク質を、該タンパク質が精製されないで発現する組換え細菌は、タンパク質精製工程が不要であるから、製造がより安価である。４）ＳＴＨ処置タンパク質（例えばＣｒｙ５Ｂ）をもたらす組換え細菌は、精製タンパク質（例えばＣｒｙ５Ｂ）よりも、同じ生物活性タンパク質用量（例えば総Ｃｒｙ５Ｂ）において、感染処置の効率が高い。

本開示の組成物および方法の微生物は、死滅および不活化された形態のBacillus種、例えばBacillus subtilis（例えばB. subtilis natto、およびB. subtilis PY79）、B. cereus（例えばB. cereus var. Toyoi (Toyocerin)、B. cereus var. toyoii）、B. toyonensis、B. clausii、B. pumilus、およびB. thuringiensisを包含する。B. subtilisは、ヒトにおいて安全に摂取される食品添加物として広く特徴付けられている。いくつかの例示態様において、死滅および不活化形態のB. thuringiensisを使用する。

他の有用な細菌は、以下の細菌の芽胞不形成バリアントを包含するが、それに限定されない：Lactococcus sp.、Bifidobacterium sp.、Streptococcus sp.、Clostridium sp.、Sporolactobacillus sp、Sporosarcina sp.、Brevibacillus sp、Leuconostoc sp.、Pedicoccus sp.、Enterococcus sp.、およびEscherichia sp。Lactobacillus sp.は、L. lactis、L. casei、L. paracasei、L. acidophilus、L. bulgaricus、L. delbrueckii subsp. bulgaricus、L. helveticus、L. plantarum、L. salivarius、L. reuteri、L. gasseri、およびL. animalisを包含するが、それに限定されない。Bifidobacterium sp.は、B. animalis、B. bifidum、B. breve、B. infantis、およびB. longumを包含するが、それに限定されない。Streptococcus sp.は、S. thermophilusを包含するが、それに限定されない。Clostridium sp.は、Clostridium butyricumを包含するが、それに限定されない。Sporolactobacillus sp.は、Sporolactobacillus vineaeを包含するが、それに限定されない。Sporosarcina sp.は、Sporosarcina pasteuriiを包含するが、それに限定されない。Brevibacillus sp.は、Brevibacillus laterosporusを包含するが、それに限定されない。

本開示に関して有用なさらに別の細菌は、グラム陰性細菌の形態を包含する。いくつかの例示態様において、グラム陰性細菌は、E. coli種（例えば、NISSLE 1917）、およびPseudomonas種（例えばPseudomonas fluorescens）を包含する。本開示の方法によって死滅または不活化することができるＣｒｙ発現グラム陰性細菌の例は、GeらのＣｒｙ発現E. coli株（“Hyperexpression of a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin-encoding gene in Escherichia coli: properties of the product”, Gene, 93: 49-54 (1990)）、およびPengらのP. fluorescens株（“A Delta-endotoxin encoded in Pseudomonas fluorescens displays a high degree of insecticidal activity”, App. Microbiol Biotech., (2003), 63:300-306）を包含する。

殺線虫タンパク質
本書において、「殺線虫タンパク質」とは、文脈から異義であることが明らかでない限り、線虫または蠕虫に対し毒性活性を示す任意のタンパク質をいう。殺線虫タンパク質の例には、蠕虫（例えば回虫）に感染した脊椎動物の消化管への経口投与（経口摂取物、飲料、食物、ピル、カプセル、粉末等）による送達のための、細菌の駆虫Ｃｒｙタンパク質（例えばCrickmore et al., 1998 Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3): 807-813; Schnepf et al., 1998 Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3): 775-806; B. thuringiensis Ｃｒｙタンパク質Ｃｒｙ５Ｂ（例えば配列番号１）およびそのサブバリアント、Ｃｒｙ１３Ａ（例えば配列番号２）およびそのサブバリアント、Ｃｒｙ１４Ａ（例えば配列番号３）およびそのサブバリアント、Ｃｒｙ２１Ａ（例えば配列番号４〜５）およびそのサブバリアント、ならびにＣｒｙ６Ａおよびそのサブバリアント（例えば配列番号６）を包含するが、それに限定されない）のような結晶タンパク質が含まれる。Ｃｒｙタンパク質は、細菌のサイトゾル中に発現され、結晶を形成し、該駆虫タンパク質へのアクセスは、細菌の溶解または開放によって可能となる。殺線虫結晶タンパク質（例えばＣｒｙタンパク質）から形成される殺線虫結晶は蠕虫において毒性を誘導するが、これは、可溶化または脱結晶化によって個々の殺線虫結晶タンパク質を放出し、それによって結晶タンパク質が蠕虫に直接作用できるようになることによる。

本発明の殺線虫結晶は、それを形成する個々の結晶タンパク質よりも安定であり、タンパク質分解に抵抗性である。本発明の細菌により発現される結晶タンパク質は、約１００ｋＤａ〜約１７０ｋＤａ、約１１０ｋＤａ〜約１６０ｋＤａ、約１２０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約１２５ｋＤａ〜約１４５ｋＤａ、または約１３０ｋＤａ〜約１４０ｋＤａの結晶を形成する。結晶タンパク質は集合して、より大きい殺線虫結晶を形成する。

各殺線虫結晶は、その最長軸において約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、約１０００ｎｍ、約１１００ｎｍ、約１２００ｎｍ、約１３００ｎｍ、約１４００ｎｍ、約１５００ｎｍ、約１６００ｎｍ、約１７００ｎｍ、約１８００ｎｍ、約１９００ｎｍ、または約２０００ｎｍのサイズを有しうる。

いくつかの態様において、本発明の殺線虫結晶は、各殺線虫結晶の最長軸の長さが、約１００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約６００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約７００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約８００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約９００ｎｍ〜約２０００ｎｍ、約１０００ｎｍ〜約２０００ｎｍでありうる。

いくつかの態様において、本発明の殺線虫結晶は、各殺線虫結晶の最長軸の長さが、約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約６００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約７００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約８００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約９００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約１０００ｎｍ〜約１０００ｎｍでありうる。

いくつかの態様において、第１の種類の殺線虫結晶タンパク質（例えばＣｒｙ５Ｂ）から形成される純粋な殺線虫結晶を、第２の種類の殺線虫結晶タンパク質（例えばＣｒｙ５Ｃ、Ｃｒｙ５Ｄ、Ｃｒｙ６Ａ、Ｃｒｙ１３Ａ、Ｃｒｙ１４Ａ、Ｃｒｙ２１Ａ、Ｃｒｙ２１Ｂ、またはＣｒｙ５５Ｂ）から形成される殺線虫結晶と、１つの医薬製剤中に組み合わせうる。そのような態様においては、１つの製剤で複数形態の純粋殺線虫結晶を同時に消化管にもたらすことが可能である。例えば、Ｃｒｙ５Ｂ耐性回虫とＣｒｙ２１Ａ耐性回虫の間に交差耐性がない故に、消化管へのＣｒｙ５ＢとＣｒｙ２１Ａの同時投与は、該組み合わせ療法に対する寄生虫耐性の発現を阻止しうる。

長期間の実施において、組換え細菌を環境的に含むために、異種Ｃｒｙタンパク質コード配列を導入するために使用されるプラスミドから抗生物質選択能（例えば遺伝子選択マーカー）を排除すること、また、脊椎動物宿主体外では複製不能な細菌株を使用することが望まれうる。例えば、ＬＡＢ（Lactic Acid Bacteria）は、チミジンまたはチミンが存在しない環境では増殖せず、チミジンおよびチミンが存在する脊椎動物の腸においてのみ増殖することができるように、チミジンまたはチミン合成において独立栄養性であるように組換えられている。例えば、Steidler L, et al. “Biological containment of genetically modified Lactococcus lactis for intestinal delivery of human interleukin 10.” Nat Biotechnol 21: 785-789 (2003)を参照されたい。

Ｃｒｙ形質転換細菌、例えばBacillusまたはＬＡＢを培養し、そのような細菌による、細胞内の、膜係留された、または分泌されたＣｒｙタンパク質の発現を、各Ｃｒｙタンパク質に対して作られた抗体および標準的なウエスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡ技術を用いて確認しうる。

すべてのコンストラクトの生物活性を評価するために、Ｃｒｙタンパク質（全長、トランケートされたもの、またはバリアント）を発現する組換え細菌を、C. elegansに与えうる。次いで、C. elegansに対するＣｒｙタンパク質毒性を、固体媒体上、および液体ウェル内での、ＬＣ５０、繁殖（brood）サイズ、成長阻害のアッセイによって定量しうる。C. elegansはＣｒｙタンパク質に、固体媒体上／液体ウェル内に分泌されたタンパク質を介して、または細菌を潰す、解放する、および消化する該虫の能力によって、アクセスすることができる。組換え細菌が生物活性Ｃｒｙタンパク質を産生していることの確認を得ることができる。さらに、生物活性（例えばμｇ／ｍＬのＬＣ_５０）を定量して、最高の活性を示すコンストラクトを決定することができる。

トランケーション、バリアント、およびサブバリアント
結晶タンパク質は、その有効性向上のためにトランケートされうる。ＳＴＨ防除のためのＢｔ毒素（例えば結晶タンパク質）の有用性は、ＳＴＨが摂取可能なタンパク質サイズによって制限されうる。いくつかの寄生回虫は、約４０ｋＤａよりも大きいタンパク質を摂取し難い。したがって、任意の特定のＢｔ毒の有効性は、ＳＴＨが取り込むタンパク質のサイズ排除によって制限され得、したがって、ＳＴＨ腸に容易に吸収されるように、毒性活性を維持しながら、十分小さいものであるべきである。トランケートされた毒素は、細菌における発現がより容易でありうる。トランケートされた毒素を製造することにより、標的ＳＴＨが、全長プロトキシン（不活性）のトランケートされた活性毒素形態への正しいプロセシングのための適正なプロテアーゼを有しなければならないという要件も緩和される。したがって、トランケートされた毒素は、ＳＴＨ標的において適正なプロテアーゼプロセシング酵素が存在するか否かに関わらず、直ちに中毒のために利用可能である。また、トランケートされた毒素は、それを発現する細胞内において可溶性であり、不溶性封入体（該細胞に対し毒性でありうるか、または毒素の誤った折り畳みをもたらしうる）を形成する可能性がより低いので、トランケートされた毒素は微生物中で、より高いレベルで発現しうる。したがって、トランケートされたＢｔ毒素フラグメント（例えば結晶タンパク質フラグメント）を製造することが望ましい。「トランケートされた」とは、Ｂｔ毒素タンパク質（結晶タンパク質）に関して言うとき、全長ではないが、対応する全長Ｂｔ毒素タンパク質の毒素活性を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％またはそれ以上維持するＢｔ毒素タンパク質のことをいう。

Ｃｒｙタンパク質の「バリアント」または「サブバリアント」は、対応する野生型ポリペプチドまたはそのトランケートされたバージョンに対して、１つまたはそれ以上の置換、例えば２０以下の置換もしくは１０以下の置換、または１０％またはそれ以下の残基における置換を有するポリペプチドを包含する。該バリアント、サブバリアントまたはトランケートされたポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドまたはトランケートされたバージョンの活性、例えば毒性活性の、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を有する。保存的置換は、下記群内での置換を包含する：グリシン、アラニン、スレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、システイン；リジン、アルギニン；アスパラギン酸、グルタミン酸；セリン、スレオニン；アスパラギン、グルタミン；フェニルアラニン、チロシン。バリアントＣｒｙタンパク質の一例は、４０７位のセリンがシステインで置換された（Ｓｅｒ４０７Ｃｙｓ）Ｃｒｙ５Ｂ（配列番号７）である。

結晶タンパク質は、全長のもの、トランケートされたもの、バリアント、またはサブバリアントでありうる。トランケートされた結晶タンパク質は、毒素活性を維持するＮおよびＣ末端の任意のトランケーションを含みうる。トランケートされた形態は、全長ではないが、対応する全長Ｂｔ毒素タンパク質の毒性活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％またはそれ以上を維持する。例えば、トランケートされた部分は、全長タンパク質の保存されたブロック５の末端とＣ末端との間でトランケートされていてよい。図１Ａおよび１Ｂに、さまざまなＣｒｙタンパク質において、付番された保存されたアミノ酸ブロック（１〜５）を比較する図を示す。

一態様において、トランケートされた結晶タンパク質は、結晶タンパク質の毒素ドメイン、および場合により５、１０または２０個までのさらなるアミノ酸を含みうる。トランケートされた結晶タンパク質は、ブロック５の保存されたアミノ酸配列の後でトランケートされていてよく、場合により５、１０または２０個までのさらなるアミノ酸を含みうる。ブロック５の保存されたアミノ酸配列は、モチーフＤＲＩＥＦ（配列番号２３）、ＤＲＬＥＦ（配列番号２４）または何らかの他の関連配列と、それに続くアミノ酸残基、例えば該モチーフの上流の３アミノ酸および下流の２アミノ酸を含みうる。表１に、さまざまなＣｒｙタンパク質のブロック５配列を示す。例えば、Schnepf, E., et al., Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins, Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3): 775-806, (例えば、第781頁、Figure 3) (Sept. 1998); およびCrickmore et al., Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins, Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3): 807-813 (Sept. 1998)を参照されたい。トランケートされた結晶タンパク質は、Ｎ末端でトランケートされていてもよい。例えば、トランケートされた結晶タンパク質は、Ｎ末端の最初の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸を含まないものでありうる。

Ｃｒｙタンパク質バリアントは、全長Ｃｒｙタンパク質およびトランケートされたＣｒｙタンパク質、そのＣｒｙタンパク質バリアントまたはサブバリアントを包含する、知られているＣｒｙタンパク質配列、例えばCrickmore et al., 1998 Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3): 807-813, またはSchnepf et al., 1998 Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3): 775-806に開示された任意のＣｒｙタンパク質配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を示しうる。また、いくつかの態様においては、そのようなＣｒｙタンパク質およびトランケーションならびにそのバリアントをコードするポリヌクレオチドが企図される

表１中、コンセンサス配列は、該グループのアラインされたタンパク質の少なくとも７５％が同一または保存的アミノ酸配列を有する位置を示している。該配列中の大文字は、その位置において少なくとも７５％の残基が同一であることを示す。小文字は、その位置において少なくとも７５％の残基が保存的であることを示す。保存的アミノ酸は、次の群に属するものである：ａ（Ａ、Ｇ、Ｓ、ＴまたはＰ）；ｄ（Ｄ、Ｅ、ＮまたはＱ）；ｆ（Ｆ、ＷまたはＹ）、Ｉ（Ｉ、Ｌ、ＭまたはＶ）、およびｋ（ＫまたはＲ）。

トランケートされた結晶タンパク質は、Ｃｒｙ５Ｂ、例えばB. thuringiensis Ｃｒｙ５Ｂ（図２）のトランケートされた形態でありうる。トランケートされたＣｒｙ５Ｂは、およそアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０から、少なくともおよそアミノ酸６９３まで伸長しうる。Ｃｒｙ５Ｂのトランケートされた形態は、さらに、保存されたブロック５の後のＣ末端側からの５、１０、２０、３０、４０または５０個までのアミノ酸を含んでもよく、例えばおよそアミノ酸６９８、７０３、７１３、７３３または７４３までを含んでもよい。

トランケートされた結晶タンパク質は、Ｃｒｙ１３Ａ、例えばB. thuringiensis Ｃｒｙ１３Ａ（図３）のトランケートされた形態でありうる。トランケートされたＣｒｙ１３Ａは、およそアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０から、少なくともおよそアミノ酸６８８まで伸長しうる。Ｃｒｙ１３Ａのトランケートされた形態は、さらに、保存されたブロック５の後のＣ末端側からの５、１０、２０、３０、４０または５０アミノ酸を含んでもよく、例えばおよそアミノ酸６９３、６９８、７０８、７１８、７２８または７３８までを含んでもよい。

トランケートされた結晶タンパク質は、B. thuringiensis Ｃｒｙ１４Ａ（図４）のトランケートされた形態でありうる。トランケートされたＣｒｙ１４Ａは、およそアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０から、少なくともおよそアミノ酸６７５まで伸長しうる。Ｃｒｙ１４Ａのトランケートされた形態は、さらに、保存されたブロック５の後のＣ末端側からの５、１０、２０、３０、４０または５０アミノ酸を含んでもよく、例えばおよそアミノ酸６８０、６８５、６９５、７０５、７１５または７２５までを含んでもよい。

トランケートされた結晶タンパク質は、Ｃｒｙ２１Ａ、例えばB. thuringiensis Ｃｒｙ２１Ａａ１（図５Ａ）またはＣｒｙ２１Ａａ２（図５Ｂ）のトランケートされた形態でありうる。トランケートされたＣｒｙ２１Ａは、およそアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０から、少なくともおよそアミノ酸６８５まで伸長しうる。Ｃｒｙ２１Ａのトランケートされた形態は、さらに、保存されたブロック５の後のＣ末端側からの５、１０、２０、３０、４０または５０アミノ酸を含んでもよく、例えばおよそアミノ酸６９０、６９５、７０５、７１５、７２５または７３５までを含んでもよい。

Ｃｒｙタンパク質のアミノ酸配列バリアント、トランケートされたバージョン、またはその両方コードする核酸分子を、当分野で知られたさまざまな方法によって作製する。そのような方法は、天然原料からの単離（天然に存在するアミノ酸配列バリアントの場合）、または例えば、先に作製されたバリアントもしくは非バリアントバージョンのタンパク質におけるオリゴヌクレオチド仲介（または部位特異的）変異導入、ＰＣＲ変異導入およびカセット変異導入による作製を包含するが、それに限定されない。さらに、本技術は、特定の生物において好ましいコドンを含むように、特定の生物においてあまり用いられないコドンを排除するように、または転写またはＲＮＡプロセシング等を阻害しうる配列を排除するように、ヌクレオチドが改変されている合成核酸分子を含む。

Ｃｒｙタンパク質のトランケーションは、保存されたブロック１〜５を少なくとも含みうる。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、既知のＣｒｙ毒素のアラインメントは、該タンパク質の多くに共通で活性毒素ドメイン中に位置すると考えられる、５つの保存された配列ブロック（ブロック１〜５）をあらわす。de Maagd, R.A., et al. “How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world.” Trends in Genetics 17(4): 193-99 (April 2001)を参照されたい。配列のカルボキシ末端側の比較により、活性毒素コア外に３つのさらなるブロックが存在すると考えられている。Schnepf, E., et al. “Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins.” Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3): 775-806 (Sept. 1998)を参照されたい。したがって、Ｃｒｙタンパク質トランケーションは、保存されたブロック５のアミノ酸配列（例えばＤＲＩＥＦ（配列番号２３）またはＤＲＬＥＦ（配列番号２４））の後においてトランケートされうる。あるいは、Ｃｒｙタンパク質トランケーションは、保存されたブロック５のアミノ酸配列（例えばＤＲＩＥＦ（配列番号２３）またはＤＲＬＥＦ（配列番号２４））にＣ末端ドメインのおよそ２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸を付け加えたものの後においてトランケートされうる。

Ｃｒｙ５Ｂａ１の完全なアミノ酸配列を図２に示す。Ｃｒｙ５Ｂにおいて、保存されたアミノ酸配列ＤＲＩＥＦ（配列番号２３）は、アミノ酸番号６９３で終わる。したがって、Ｃｒｙ５Ｂのトランケートされた形態は、少なくともアミノ酸５０からおよそ６９３までを含みうる。Ｃｒｙ５Ｂのトランケートされた形態は、およそアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０から、少なくともおよそアミノ酸６９３まで伸長しうる。その代わりに、またはそれに加えて、Ｃｒｙ５Ｂのトランケートされた形態は、Ｃ末端ドメインのおよそ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のさらなるアミノ酸を含みうる。

Ｃｒｙ１３Ａａ１の完全なアミノ酸配列を図３に示す。Ｃｒｙ１３Ａにおいて、保存されたアミノ酸配列ＤＲＬＥＦ（配列番号２４）はアミノ酸番号６８８で終わる。したがって、Ｃｒｙ１３Ａのトランケートされた形態は、少なくともアミノ酸５０からおよそ６８８までを含みうる。Ｃｒｙ５Ｂのトランケートされた形態は、およそアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０から、少なくともおよそアミノ酸６８８まで伸長しうる。その代わりに、またはそれに加えて、Ｃｒｙ１３Ａのトランケートされた形態は、Ｃ末端ドメインのおよそ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のさらなるアミノ酸を含みうる。

Ｃｒｙ１４Ａａ１の完全なアミノ酸配列を図４に示す。Ｃｒｙ１４Ａにおいて、保存されたアミノ酸配列ＤＲＩＥＦ（配列番号２３）はアミノ酸番号６７５で終わる。したがって、Ｃｒｙ１４Ａのトランケートされた形態は、少なくともアミノ酸５０からおよそ６７５までを含みうる。Ｃｒｙ５Ｂのトランケートされた形態は、およそアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０から、少なくともおよそアミノ酸６７５まで伸長しうる。その代わりに、またはそれに加えて、Ｃｒｙ１４Ａのトランケートされた形態は、Ｃ末端ドメインのおよそ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のさらなるアミノ酸を含みうる。

Ｃｒｙ２１Ａａ１およびＣｒｙ２１Ａａ２の完全なアミノ酸配列を図５Ａおよび図５Ｂにそれぞれ示す。Ｃｒｙ２１Ａａ２のアミノ酸配列は、Ｃｒｙ２１Ａａ１のアミノ酸配列との同一性が約９８％である。Ｃｒｙ２１Ａにおいて、保存されたアミノ酸配列ＤＲＩＥＦ（配列番号２３）はアミノ酸番号６８５で終わる。したがって、Ｃｒｙ２１Ａのトランケートされた形態は、少なくともアミノ酸５０からおよそ６８５までを含みうる。Ｃｒｙ５Ｂのトランケートされた形態は、およそアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０から、少なくともおよそアミノ酸６８５まで伸長しうる。その代わりに、またはそれに加えて、Ｃｒｙ２１Ａのトランケートされた形態は、Ｃ末端ドメインのおよそ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のさらなるアミノ酸を含みうる。

駆虫実験
異種Ｃｒｙタンパク質発現および生物活性を所望の細菌において確認したら、該組換え細菌を、治療型および予防型の駆虫実験に使用しうる。

抗体作製：組換えＣｒｙタンパク質（例えば、Ｃｒｙ５Ｂ、Ｃｒｙ２１Ａ、Ｃｒｙ１４Ａ、Ｃｒｙ１３ＡおよびＣｒｙ６Ａ、全長およびトランケートされたタンパク質）に対する抗体を、標準的な方法（例えば、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009)）にしたがって作製し精製しうる。

生物活性試験：すべてのコンストラクトの生物活性を試験するために、異種Ｃｒｙタンパク質を発現する組換えバチルスまたは他の細菌を、自由生活線虫C. elegansに与える。C. elegansは、固体媒体上／液体ウェル内に分泌されるタンパク質を介して、細菌が壊れて開くときに自然に放出されるタンパク質によって、または細菌を破壊および消化して細菌細胞を開放する該虫の能力によって、Ｃｒｙタンパク質にアクセスすることができる。

齧歯動物寄生虫試験：３つの腸寄生線虫を試験する：マウスにおけるH. bakeri（小腸寄生線虫）、マウスにおけるTrichuris muris（鞭虫）、ハムスターにおけるA. ceylanicum（鉤虫）を試験する。本試験では、１）消化管において異種Ｃｒｙ発現細菌が棲みつくか、また、どのくらいの期間棲みつくか；および２）該細菌が、腸寄生線虫の寄生獲得およびその経過に対してどのように影響するか、を調べる。

寄生虫試験：発現および生物活性に基づいて最良の異種Ｃｒｙタンパク質発現組換え細菌株を、ナイーブ（未感染）マウスに経口摂取させる。

経過改善効果試験：マウスをH. bakeriに感染させる。２週間後、感染マウスを、異種Ｃｒｙタンパク質発現細菌または対照細菌でそれぞれ処置する。腸内の虫の量および糞便中の卵の数を用いて、既に線虫感染しているマウスにおいて組換え細菌が駆除効果をもたらすかを決定する。

寄生虫の例
本開示の方法は、Bacillus由来の結晶タンパク質およびその誘導体を使用する、寄生虫、例えば線虫および扁形動物の防除に関する。本発明の範囲に含まれる寄生虫は、以下に属するものを包含するが、それに限定されない：Class Adenophorea、例えばOrder Mononchida、Family Plectidae、およびOrder Stichosomida、Family MermithidaeおよびTetradonematidae；Class Secernentea、例えばOrder Rhabditida、Family Carabonematidae、Cephalobidae、Chambersiellidae、Heterorhabditidae、Oxyuridae、Panagrolaimidae、Rhabditidae、Steinernematidae、Syrphonematidae、Syrphonematidae、またはThelastomatidae；Order Spirurida、Family Filariidae、Onchocercidae、Physalopteridae、Syngamidae、Spiruridae、Subuluridae、またはThelaziidae；Order Diplogasterida、Family Diplogasteridae；およびOrder Tylenchida、Family Allantonematidae、Aphelenchidae、Aphelenchoididae、Entaphelenchidae、Fergusobiidae、Phaenopsitylenchidae、Sphaerulariidae、Anguinidae、Dolichodoridae、Belonolaimidae、Pratylenchidae、Hoplolamidae、Heteroderidae、Criconematidae、Tylenchulidae、またはTylenehidae。一態様において、寄生虫は、Class Secernentea、Order Ascaridida、Family Ascarididae；Class Adenophorea、Order Trichurida、Family Trichuridae；Class Secernentea、Order Strongylida、Family Ancylostomatidae（ancylostomidae）またはTrichostrongylidae；またはClass Secernentea、Order Spirurida、Family Dracunculidae、Filariidae、またはOnchocercidaeに属するものである。

寄生虫は蠕虫でありうる。本発明の範囲に含まれる蠕虫は、以下に属するものを包含するが、それに限定されない：Phylum Annelida、Class Polychaetae、Class Myzostomida、Class Clitellata、Subclass Hirudinea、Order Gnathobdellidae、Order Rhynchobdellidae；Phylum Platyhelminthes（Flatworms）、Class Turbellaria、Class Monogenea、Order Monopisthocotylea、Order Polyopisthocotylea、Class Trematoda、Subclass Aspidogasrea、Subclass Digenea；Super Order Anepitheliocystida、Order Strigeatida、Family Schistosomatidae、Subfamily Schistosomatinae、Genus Schistosoma、Order Echinostomatida、Family Fasciolidae、Family Paramphistomatidae、Family Echinostomatidae；Super Order Epitheliocystida、Order Plagiorchiida、Family Dicrocoeliidae、Family Troglotrematidae、Order Opisthorchiida、Family Heterophyidae、Family Opisthorchiidae、Class Cestoda、Subclass Cestodaria、Subclass Eucestoda、Order Pseudophyllidea、Family Diphyllobothriidae、Order Cyclophyllidea、Family Taeniidae、Family Hymenolepididae、Family Dilepididae、Family Mesocestoididae、Order Tetraphyllidea、Order Proteocephalata、またはOrder Spatheobothridea。例えば、本発明の範囲におけるＣｒｙタンパク質は、回虫、鞭虫、鉤虫、住血吸虫または吸虫を、阻害し、抑制し、またはそれに対処するために使用しうる。

寄生虫は、消化管寄生性の回虫／線虫であってもよい。消化管寄生性の回虫／線虫は、以下の種を包含するが、それに限定されない：Haemonochus、Cooperia、Ostertagia、Trichostrongylus、Teladorsagia、Nematodirus、Ancylostoma、Cyathostominea/Cyathostomin/Cyathostome、Strongylus、Parascaris、Ascaris、Trichuris、Oesophagostomum/Oesophagustomum、Trichiuris、Bunostomum、Oxyuris、Chabertia、Habronema、Draschia、Triodontophorus、Toxocara、Toxascaris、およびUncinaria。Haemonochus種は、Haemonchus contortusおよびHaemonchus placeiを包含するが、それに限定されない。Cooperia種は、Cooperia oncophora、Cooperia pectinata、およびCooperia curticeiを包含するが、それに限定されない。Ostertagia種は、Ostertagia ostertagi、Ostertagia (Teladorsagia) circumcincta、およびOstertagia trifurcateを包含するが、それに限定されない。Trichostrongylus種は、Trichostrongylus axei、Trichostrongylus colubriformis、およびT. circumcinctaを包含するが、それに限定されない。Teladorsagia種は、Teladorsagia (Ostertagia) circumcinctaを包含するが、それに限定されない。Nematodirus種は、Nematodirus spathigerを包含するが、それに限定されない。Ancylostoma種は、Ancylostoma caninum、Ancylostoma braziliense、およびAncylostoma tubaeformeを包含するが、それに限定されない。Cyathostominea/Cyathostomin/Cyathostome線虫もまた包含される。Strongylus種（小および大）は、Strongylus vulgaris、Strongylus equinus、およびStrongylus edentatusを包含するが、それに限定されない。Parascaris種は、Parascaris equorumを包含するが、それに限定されない。Strongyloides種は、Strongyloides westeriを包含するが、それに限定されない。Ascaris種は、Ascaris suumを包含するが、それに限定されない。Trichuris種は、Trichuris globulosa、Trichuris suis、Trichuris campanula、およびTrichuris vulpisを包含するが、それに限定されない。Oesophagostomum/Oesophagustomum種は、Oesophagustomum dentatum、Oesophagustomum quadrispinulatum、Oesophagostomum columbianum、およびOesophagostomum venulosumを包含するが、それに限定されない。Trichiuris種は、Trichiuris ovisを包含するが、それに限定されない。Bunostomum種は、Bunostomum trigonocephalumを包含するが、それに限定されない。Oxyuris種は、Oxyuris equi（蟯虫）を包含するが、それに限定されない。Chabertia種は、Chabertia ovinaを包含するが、それに限定されない。Habronema種は、Habronema microstoma、およびHabronema muscaeを包含するが、それに限定されない。Draschia種は、Draschia megastomaを包含するが、それに限定されない。Triodontophorus種は、Triodontophorus minor、およびTriodontophorus serratesを包含するが、それに限定されない。Toxocara種は、Toxocara canis、およびToxocara catiを包含するが、それに限定されない。Toxascaris種は、Toxascaris leonineを包含するが、それに限定されない。Uncinaria種は、Uncinaria stenocephalaを包含するが、それに限定されない。ヒトの消化管に寄生する回虫類は、鉤虫であるAncylostoma duodenaleおよびNecator americanus、鞭虫であるTrichuris trichiura、回虫であるAscaris lumbricoides、線虫であるStrongyloides stercoralis、および蟯虫であるEnterobius vermiculariを包含するが、それに限定されない。

さらなる処置剤
いくつかの態様において、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つのさらなる処置剤との組み合わせとして投与される。さらなる処置剤は、例えば、小分子またはポリペプチド（抗体およびその断片を包含する）でありうる。さらなる態様において、さらなる処置剤は、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニストである。いくつかの態様において、さらなる処置剤は、本発明の医薬組成物と同時に投与される。いくつかの態様において、さらなる処置剤は、本発明の医薬組成物と（順序は問わず）前後して投与される。いくつかの態様において、前記ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニストは、レバミソールファミリーのニコチン性アセチルコリン受容体アゴニストから選択される。いくつかの態様において、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニストはレバミソールである。いくつかの態様において、レバミソールが、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇの量で投与される。いくつかの態様において、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニストはピランテルまたはトリベンジミジン（tribendimidine）である。いくつかの態様において、ピランテルが、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１５．０ｍｇ／ｋｇの量で投与される。いくつかの態様において、トリベンジミジンが、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの量で投与される。

投与、投与形態、医薬組成物
本発明は、対象の消化管への純粋な結晶タンパク質の投与を企図する。したがって、本発明の医薬組成物は、経口投与用に製剤化されうる。経口投与は好ましくは、水性懸濁液、エマルジョン、粉末または固体として行われる。本発明の組成物は、食物中に組み込まれるか、または使用者によって消費前に食物に添加されうる。消化管への投与は、（例えばゲルまたは半固形製剤である）肛門坐剤の形態であってもよい。そのような調製物はいずれも、標準的な方法を用いて調製される。

本発明の処置方法は典型的には、病原体または寄生虫の抑制が望ましい任意の動物に対して実施される。いくつかの態様において、動物はヒトである。しかしながら、動物は、寄生虫／病原体抑制により経済的および健康上の利益がもたらされる任意の家畜または動物学的個体でありうる。本発明の方法は、鳥類、爬虫類、哺乳動物、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよび他の家畜、または動物学的関心が持たれるさまざまな動物を包含する任意の動物に有益でありうる。他の目的は、栄養の吸収、食餌の利用およびバイオアベイラビリティの技術に精通する者には容易に理解される。

本発明はさらに、寄生虫感染を処置、軽減および／または防除するための処置システムを企図する。該システムは典型的には、本発明の処置用組成物を含む、または包装材料との組み合わせとして含む、パッケージの形態である。包装材料は、パッケージの構成成分の使用に関するラベルまたは指示書を含む。指示書は、本発明の方法または組成物のために本書に記載されるような、包装された構成成分の意図される使用を指示する。例えば、システムは、本発明の処置用組成物の１またはそれ以上の単位用量を含みうるが、それに限定されない。あるいは、システムは、バルクの量の処置用組成物を含むこともできる。ラベルは、処置用組成物を適切に単位用量またはバルク形態で使用するための指示書を含み、組成物の貯蔵、適用疾患、投与量、投与経路および投与方法等に関する情報をも含みうる。

さらに、本発明のシステムは、意図される特定の用途に応じて、下記成分の１つまたはそれ以上を、一体的または別の包装中に含んでもよい：ビフィズス菌に適する（bifidogenic）オリゴ糖、香料、担体等の成分。一態様は、従来の液体製品と組み合わせて使用するための純粋な殺線虫結晶タンパク質の単位用量パッケージを、処置方法における使用のために該純粋な殺線虫結晶タンパク質を該製品と組み合わせるための指示書と共に含む。

本発明の方法において異なる投与レジメンを用いうる。いくつかの態様において、毎日の投与を、１日に１回、２回、３回または４回の回数で、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日間にわたり行う。いくつかの態様において、１日１回または２回の投与を隔日に行う。

腸および糞便中における寄生虫増殖を抑制するのに有効な活性成分を含有する組成物の投与は、通常、体重約１００ｋｇのヒトに対しては、投与量当たり１０ｍｇ〜１０ｇの組成物の１〜１０単位の投与量を、１日〜１箇月間投与することからなる。単位投与量の投与は通常、１２時間〜４時間毎に行う。好ましくは、１日当たり２〜４の投与量の組成物（それぞれ投与量当たり約０．１ｇ〜５０ｇを含む）を１〜７日間投与することが、所望の結果の達成のために十分である。

さまざまな特定の態様において、本発明の組成物の有効用量は、成人患者に対しては組成物約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは組成物約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。有効用量の対象への投与は、任意の適当な頻度で、例えば少なくとも週１回、好ましくは１日１回行いうる。小児投与量は成人投与量の１５％〜９０％の範囲でありうる。

他のいくつかの態様において、本発明の組成物を、生理学的状態の重篤度に応じて、継続して一定の投与量で、例えば約２ｇ〜約４ｇ／日ないし約６ｇ〜約１０ｇ／日で投与しうる。感染が効果的に軽減されたら、多くの症例において、維持を目的として、対象への投与量を約２ｇ〜約４ｇ／日に低減しうる。望ましい用量を、１日のうちに適当な間隔で、複数に（例えば２、３、４、５、６またはそれ以上に）分割した用量として投与しうる。

本発明の医薬組成物は、当分野で知られた任意の許容される投与様式または手段で投与することができる。しかしながら、経口投与は、該投与経路が、純粋な殺線虫結晶タンパク質を消化管に送達する故に、好ましい。投与形態は、例えば固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体の投与形態であり得、その例は、錠剤、丸薬、軟または硬ゼラチンカプセル、散剤、溶液剤、懸濁液剤、坐剤、エーロゾル等であり得、正確な投与量で簡便に投与するのに適した単位用量の形態でありうる。投与形態の一例示態様は、本発明の純粋な殺線虫結晶タンパク質を乾燥形態で医薬担体との組み合わせとして含むカプセルである。そのような投与形態用のカプセルは、任意の適当な種類のもの、例えば従来のさまざまなゼラチンカプセルでありうる。

純粋な殺線虫結晶タンパク質と組み合わせて使用される生理学的に適合性の担体媒体は、任意の単純な種類のもの、例えば薬学的に許容しうる担体、例えばフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）媒体、または細菌種の製剤化（例えば経口投与形態への製剤化）に使用することのできる、組成物用の他の可溶性線維、糖、栄養物もしくは基剤でありうる。他の担体媒体としては、マンニトール、イヌリン（多糖）、ポリデキストロース、アラビノガラクタン、ポリオールであるラクツロース、ラクチトール等が挙げられる。当業者には明らかなように、本発明の実施において、本書の記載に基づいてさまざまな材料を担体媒体として使用することができる。

さまざまな態様において、担体媒体が存在する場合、任意の適当な量、例えば細菌種と担体媒体の総重量に対して担体媒体５重量％〜９５重量％の量で、細菌種と組み合わせることができる。他のいくつかの態様において、担体媒体の量は、５％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、２８％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または７５％のいずれかを下限とし、２０％、２２％、２５％、２８％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のいずれかであって下限よりも大きい値を上限とする範囲でありうる。特定の態様における担体媒体の量は、プロバイオティクスおよび医薬製剤の分野に精通する者には分かるように、その特定の投与形態、純粋な殺線虫結晶タンパク質の相対量、担体媒体と細菌種を含む組成物の総重量、および担体媒体の物理的および化学的性質、ならびに他の因子を考慮して決定しうる。

いくつかの態様において、純粋な殺線虫結晶タンパク質は、該Ｃｒｙタンパク質を胃の酸性環境から保護する組成物に製剤化される。したがって、本発明は、純粋な殺線虫結晶タンパク質および薬学的に許容しうる耐酸性（「腸溶性」）担体を含む組成物を包含する。耐酸性とは、担体またはコーティングが酸性環境において溶解しないことを意味する。酸性環境は、ｐＨが７未満であることによって特徴付けられる。耐酸性担体は、ｐＨ約４．０未満の酸に対して耐性である。好ましくは、耐酸性担体はｐＨ２〜３において溶解しない。最も好ましくは、耐酸性担体は、２未満のｐＨで溶解しない。純粋な殺線虫結晶タンパク質の胃酸からの保護のために、純粋な殺線虫結晶タンパク質を耐酸性担体でコーティングするか、または耐酸性担体に封入する。

いくつかの態様において、前記コーティングはｐＨ感受性である。例えば、コーティングはｐＨが４．０よりも高まると溶解しうる。例えば、コーティングは、小腸におけるような中性環境において溶解し、胃におけるような酸性環境においては溶解しない。あるいは、腸溶性コーティングは、小腸に存在する消化酵素との接触のような特定の代謝イベントに暴露されたとき、溶解する。例えば、コーティングは、膵臓の酵素、例えばトリプシン、キモトリプシンまたは膵リパーゼによって消化される。製剤は小腸において水和される。コーティングの消化または溶解によって、純粋な殺線虫結晶タンパク質、例えば純粋なＣｒｙ５Ｂが腸内へ放出されうる。

他のいくつかの態様において、純粋な殺線虫結晶タンパク質は、ゲルまたはペースト中、例えば無水炭水化物ペースト中に安定化される。他の製剤においては、純粋な殺線虫結晶タンパク質は凍結乾燥され、および／またはゲルもしくはペースト中に懸濁される。腸溶性コーティング材料は当分野で知られており、その例として、リンゴ酸−プロパン１，２−ジオールが挙げられる。セルロース誘導体、例えばセルロースアセテートフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）も、腸溶性耐酸性コーティングにおいて有用である。他の適当な腸溶性コーティングとしては、セルロースアセテートフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、およびメタクリル酸およびメタクリル酸メチルのアニオン性ポリマーが挙げられる。さらに別の適当な腸溶性コーティングは、水性エマルジョン形態のエチルアクリレート・メチルアクリル酸コポリマー、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＡＳ）である。（例えば米国特許第５５９１４３３号を参照されたい。）腸溶性コーティングは、胃における溶解に耐え、中性またはアルカリ性の腸液中で溶解するように設計される。いくつかの態様において、純粋な殺線虫結晶タンパク質は好ましくは、乾燥粉末に調製される。適当な乾燥方法は、自然乾燥、強制空気乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥等を包含する。それらのうち、噴霧乾燥、ドラム乾燥、または強制空気乾燥が好ましい。乾燥の際に、保護剤、例えばスキムミルク、グルタミン酸ナトリウム、および糖を使用しうる。糖、グルコースおよびトレハロースを使用しうる。凍結乾燥の一例において、純粋な結晶タンパク質を−８０℃で凍結し、次いでFreeZone １Ｌベンチトップ凍結乾燥システム（Labconcoカタログ番号7740020）中に入れうる。このコンデンサーを−６０℃に設定し、減圧を２２ｍＴｏｒに設定する。サンプルを一晩凍結乾燥する。噴霧乾燥の一例においては、固体が１０％ w/vのＰＣＣサンプルを、Yamato Pulvis GB22（または任意の他の噴霧乾燥システム）を用いて、１００μアトマイザーノズルから５ｍＬ／分で、噴霧空気を１Ｋｇｆ／ｍ^２に、乾燥空気を０．２１ｍ^３／分に、入口／出口温度を９８℃／５９℃にそれぞれ設定して、噴霧乾燥する。

助剤および佐剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、乳化剤および分散剤が挙げられる。要すれば、汚染微生物の作用の抑制を、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の使用により達成することができる。等張化剤、例えば糖、塩化ナトリウム等も含めうる。

固体投与形態は、コーティングおよびシェル、例えば当分野で周知の腸溶性コーティング等を伴って調製することができる。それは抑止剤を含むことができ、活性化合物を腸管内のある部分において遅延様式で放出する組成物でありうる。使用しうる包埋組成物の例は、ポリマー材料およびワックスである。場合により、１つまたはそれ以上の前記賦形剤を用いて活性化合物をマイクロカプセル化形態とすることもできる。

経口投与用の液体投与形態は、薬学的に許容しうるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤およびエリキシル剤を包含する。そのような投与形態は、例えば、活性成分（例えば純粋な殺線虫結晶タンパク質）および場合により医薬佐剤を、担体、例えば水、食塩液、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等；可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１,３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド；油、特に綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタン脂肪酸エステル；またはそれら物質の混合物等に溶解、分散等させ、それにより溶液または懸濁液を形成することによって調製される。

そのような投与形態を調製するための実際の方法は、当業者に知られているか、または明らかである。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.（Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990）を参照することができる。

方法
本発明の方法は、対象において寄生蠕虫感染を処置するためのものであり、単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成される単離された天然の生物活性殺線虫結晶を含む組成物を処置有効量で対象に投与することを含む。本発明の医薬組成物は、細菌芽胞、または結晶の形態の殺線虫結晶タンパク質以外の宿主細菌タンパク質を実質的に含まない。

本発明の方法はまた、寄生蠕虫感染の重篤度を低下するためのものであり、単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成される単離された天然の生物活性殺線虫結晶を含む組成物を処置有効量で対象に投与することを含み、該医薬組成物は、細菌芽胞、または結晶の形態の殺線虫結晶タンパク質以外の宿主細菌タンパク質を実質的に含まない。

定義
本書において、文脈から異義であることが明らかでない限り、用語「処置」、および同様の用語、例えば「処置される」、「処置する」等は、有益な、または所望の結果（これは、臨床的に望ましい結果を包含し、好ましくは臨床的に望ましい結果である）を得るためのアプローチをさす。処置は、任意に、疾患の症状もしくは状態の改善、または疾患もしくは状態の進行の遅延を伴いうる。

本書において、文脈から異義であることが明らかでない限り、「対象」とは、脊椎動物、例えば哺乳動物を意味する。哺乳動物は、ネコ、齧歯類、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジまたは霊長類でありうる。いくつかの態様において、対象はヒトである。

本書において、文脈から異義であることが明らかでない限り、「発症の可能性を低減する」、「予防」、および同様の用語、例えば「予防される」、「予防する」等は、統計学的有意性、例えば指示される方法ステップを省略した場合に得られる結果との比較において示される統計学的有意性を以て、疾患または状態の発症もしくは再発の可能性を抑制または低下するためのアプローチを包含する。同様に、疾患もしくは状態の症状の発症もしくは再発の可能性を抑制または低下すること、または場合により、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは状態の症状の発症もしくは再発を遅延させることも包含される。本書において、「予防」および同様の用語は、疾患または状態の発症または再発に先立って、疾患または状態の強さ、作用、症状および／または負荷を低減することをも包含する。このような実施形態および関連する実施形態の方法は、土壌伝播蠕虫（ＳＴＨ）感染の発症を、実質的に阻止し、その重篤度を低下させ、またはその可能性を低下させる薬剤を、有効量または処置有効量で用いて実施されうる。本書において、組成物、薬剤または物質の「有効量」または「処置有効量」とは、所望の生物学的効果、例えば有益な結果、例えば臨床的結果を得るのに十分な量である。

本書において、文脈から異義であることが明らかでない限り、「食用油」は、ヒトまたは動物が摂取するのに適当な油を包含する。食用油の例としては、植物から抽出される油、例えばトウモロコシ油、ダイズ油、ヤシ油、綿実油、オリーブ油、パーム油、ピーナツ油、ナタネ油もしくはキャノーラ油、ベニバナ油、ヒマワリ油が挙げられるが、それに限定されない。食用油は、ナッツ油、例えばアーモンド油、ビーチナッツ油、ブラジルナッツ油、カシュー油、ヘーゼルナッツ油、マカダミアナッツ油、モンゴンゴナッツ油、ペカン油、松果油、ピスタチオ油、クルミ油、およびパンプキンシード油を包含するが、それに限定されない。食用油は、柑橘類、果物、メロン類およびウリ種子類、または任意の可食植物由来の油を包含する。

いくつかの好ましい態様において、ＳＴＨ感染の重篤度または発症可能性を処置または低減するための本発明の組成物は、医薬組成物として調製される。これは好ましくは経口送達用に調製されうる。医薬組成物は、それに含まれる薬剤が、該組成物のヒトへの投与後に生物学的に利用可能となるように調製される。

本発明のいくつかの態様の実施にあたり、特に異なる指示がない限り、当分野の技術の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学およびＤＮＡ組換えの技術における従来の方法を用いうるものと理解され、その多くについて、説明の目的で下記に記載する。そのような技術は文献において詳細に説明されている。例えば、以下の文献を参照されたい：Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)、および他の同様の文献。

ＤＮＡ組換え、オリゴヌクレオチド合成ならびに組織培養および形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェクチン）のために、標準的な方法を用いうる。酵素反応および精製方法を、製造者の仕様書にしたがって、または当分野で一般に行われるように、または本書に記載されるように行いうる。これらの、および関連する技術および手順は通常、当分野で知られ、また、さまざまな総論的およびより専門的な文献（本書中に引用され述べられる）に記載される、従来の方法にしたがって実施しうる。特別な定義がなされない限り、本書において分子生物学、分析化学、有機合成化学ならびに医薬品化学および薬化学に関連して用いられる技術用語、ならびに本書における分子生物学、分析化学、有機合成化学ならびに医薬品化学および薬化学の実験手順および技術は、当分野において知られ、一般に用いられるものである。組換え技術、分子生物学的、微生物学的、化学的合成、化学分析、医薬調製、製剤化、ならびに送達および患者処置のために、標準的な方法を用いうる。

本書において、用語「純粋」および「純度」と数字との組み合わせ（例えば、９５％純粋）は、本開示の化合物および物質が他の化合物および物質に対して重量／重量の量で存在することを意味する。例えば、９５％純粋な殺線虫結晶である組成物とは、該組成物の９５％（重量／重量）が殺線虫結晶タンパク質であり、該組成物の５％（w/w）が１つまたはそれ以上の他の物質からなることを意味する。

本書において、用語「結晶含量」とパーセンテージの組み合わせ（例えば、結晶含量９５％）は、本開示の殺線虫結晶が組成物中に、該組成物の総重量に対して、記載されるパーセンテージで存在することを意味する。いくつかの態様において、本発明の組成物は、結晶含量が少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）である。

本書において、組成物または化合物に関する用語「〜を実質的に含まない」（例えば、芽胞を実質的に含まない化合物）は、該組成物または化合物が、他の物質を５％ w/wまたは５％ w/w未満の量含むこと（例えば、化合物が芽胞を５％ w/w、２％ w/w、１％ w/w、０．５％ w/w、０．１％ w/w、０．０１％ w/w、０．００１％ w/wもしくは０．０００１％ w/wまたはそれ未満の量含むこと）を意味する。

本明細書および請求の範囲において、内容からそうでないことが明らかでない限り、単数形での記載は、そのものが複数である場合を包含する。本書を通して、文脈からそうでない必要があるのでなければ、用語「含む」、または「含んでいる」のようなその変化形は、記載される要素もしくは整数または要素群もしくは整数群を含むが、他の要素もしくは整数または要素群もしくは整数群を排除しないことを意図すると理解される。そうでないことを明記しない限り、本書におけるそれぞれの態様は、必要に応じ変更を加えて、他のいずれの態様にも適用される。

本書において、用語「約」を用いた数量の記載は、それに係る値の±５％の範囲をさす（分子、ヌクレオチドまたはアミノ酸等の数で、値をさらに除すことができない場合には、最も近い整数に切り上げられる）。例えば、「約２０％」は、上限値および下限値を含む１５〜２０％を包含し得、「約８０％」は、上限値および下限値を含む７５〜８５％を包含しうる。さらに、本書において用語「約」が数量に関して用いられるとき、±５％の値に加えて、記載の数値そのものも意図され記載されるものと理解される。例えば、「約２３％」なる記載は、正２３％を明らかに意図し、記載し、含む。

以下の実施例は、例示説明のためのものであって、限定のためのものではない。

ＩＢａＣＣの作製
芽胞形成欠失細胞においてＣｒｙ５Ｂを製造するため、B. thuringiensis（Ｂｔ）株４Ｄ８；この株は、結晶タンパク質発現を欠き（Identification of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki strain HD1-Like bacteria from environmental and human samples after aerial spraying of Victoria, British Columbia, Canada, with Foray 48B. Appl Environ Microbiol. 2001 Mar;67(3):1035-43）、この株において、芽胞形成のマスターspo0Aレギュレーター（spo0A-）が相同組換えにより欠失された。本組成はさらに、Ｃｒｙ５Ｂ−ＢａＣＣ（サイトゾルに結晶を含むBacillus（Bacillus with Cytosolic Crystal））と称される

Ｃｒｙ５Ｂ−ＢａＣＣを不活化するために、該形質転換B. thuringiensis ４Ｄ８株を、１０μｇ／ｍＬエリスロマイシンおよび２００μｇ／ｍＬカナマイシンを補充した３倍濃縮ルリア−ベルターニ培地（ＬＢ）において、バッフル付き２Ｌフラスコ内で２００ｍＬの体積で、３０℃において振盪しながら４８時間好気的に培養した。形質転換B. thuringiensis細胞を、４℃において１時間、４５００ｒｐｍでの遠心分離に付し、予め冷却した滅菌再蒸留水で、元の細胞培養体積の４分の１の体積で再懸濁し、次いで１ｍｇ／ｍＬカルバクロール（食品用抗菌剤）により、４℃で振盪しながら１５分間処理した。カルバクロール処理した細胞を遠心分離し、予め冷却した滅菌再蒸留水で３回洗った。最終ペレットを４０倍濃縮し、使用するまで−８０℃で保存した。この生物学的に活性なＣｒｙ５Ｂ結晶を含む死ＢａＣＣを、ＩＢａＣＣ（サイトゾルに結晶を含む不活化Bacillus（Inactivated Bacillus with Cytosolic Crystal））と称する。４Ｄ８株はまた、自己溶解することができ、成長サイクルの最後に自然に溶解して結晶を放出することができる。それでもなお、残っている可能性のある細胞を死滅させ、残っている可能性のある無傷ＩＢａＣＣを破り開くために、カルバクロールによる死滅およびホモジナイズを行うことができる。

ホモジナイズによるＩＢａＣＣからのＣｒｙ５Ｂの精製
図６に、ＩＢａＣＣからＣｒｙ５Ｂ結晶タンパク質を精製するために用いる方法のフローチャートを示す。大量のＣｒｙ５Ｂタンパク質をＩＢａＣＣから精製するために、１０Ｌの培養物の採取を行った（図６、ステップ６１０）。１０ＬのＢａＣＣを、２５０〜３５０ＯＤ／ｍＬとなるまで増殖させた。次いで、そのＢａＣＣを遠心分離（８０００×ｇ、３０分間）により０．５Ｌ〜１Ｌに濃縮し、その後、１ｍＬ／Ｌカルバクロールを加えて室温で１５分間撹拌することにより不活化して（ステップ６１２）、ＩＢａＣＣを得た。不活化ステップの前のＢａＣＣの濃縮を、他の方法、例えば限外濾過または透析によって行ってもよい。

ＩＢａＣＣを１５０００ｐｓｉで、５〜７回のパス回数でホモジナイズし（ステップ６１４）、得られた溶解物を遠心分離して細菌溶解物を濃縮した（ステップ６１６）。他の方法、例えば限外濾過または透析によってＩＢａＣＣを濃縮してもよい。得られたペレットを０．５Ｌ〜１Ｌの１ＭＮａＣｌ溶液中に再懸濁した（ステップ６１８）。次いで、該濃縮溶解物を２５０ｍＬ／Ｌの油と、室温で２時間混合して、カルバコールを抽出した（ステップ６２０）。この油抽出の後、９Ｌの水を加え（ステップ６２２）、混合物を再度、遠心分離により濃縮した（ステップ６２４）。濃縮されたペレットを、０．５Ｌ〜１ＬのＮａＣｌ溶液中に再懸濁した（ステップ６２６）。次いで、その混合物を１０Ｌの水で３回洗い、遠心分離（８０００×ｇ、３０分間）により濃縮した（ステップ６２８）。得られる組成物は、純粋なＣｒｙ５Ｂ結晶（ＰＣＣ）である。いくつかの態様において、該組成物を噴霧乾燥または凍結乾燥しうる（ステップ６３０）。

図７に、該精製方法のさまざまな段階におけるサンプルを適用したタンパク質ゲルを示す。ゲルのレーン１は、２００ｎｍＯＤまで増殖させた後の、ホモジナイズしたＩＢａＣＣ５μＬである。レーン２は、ホモジナイズしたＩＢａＣＣを濃縮した上清の１５μＬサンプルである。レーン３は、油抽出したＩＢａＣＣ溶解物を洗った水相の１５μＬサンプルである。レーン４は、１ＭＮａＣｌ洗浄液（ステップ６２６）の１５μＬサンプルである。レーン５は、ペレット化したＩＢａＣＣをリン酸緩衝食塩液で洗った洗浄液の１５μＬサンプルである。レーン６は、ステップ６２８の後のＰＣＣの１５μＬサンプルである（３１２吸光度６００単位のＯＤまで増殖させた、別のバッチのＢａＣＣから得たもの）。

図８に、ＰＣＣ粒子の、１０００倍の倍率の位相差顕微鏡写真を示す。

自己溶解ＩＢａＣＣからのＣｒｙ５Ｂの精製
いくつかのＢａＣＣ株、例えば４Ｄ８株は、成長サイクルの最後に自己溶解する。この自己溶解により、抗菌化合物による不活化後にホモジナイズを行うステップが必要無くなるか、またはその必要性が低減されうる。したがって、図６の精製フローチャートにおいて、自己溶解する細菌株を使用する場合は、ホモジナイズステップ６１４を省略するか、またはパス回数を少なくしうる。そのような態様において、自己溶解ＢａＣＣの１０Ｌ培養物の採取を行いうる（図６、ステップ６１０）。１０ＬのＢａＣＣを、２５０〜３５０ＯＤ／ｍＬとなるまで増殖させうる。次いで、ＢａＣＣを遠心分離により０．５Ｌ〜１Ｌに濃縮し、その後、１ｍＬ／Ｌカルバクロールを加えて室温で１５分間撹拌することにより不活化して（ステップ６１２）、ＩＢａＣＣを得ることができる。不活化の前および／または後にＩＢａＣＣは自己溶解しているので、ホモジナイズの必要は無かった。不活化ステップ前のＢａＣＣの濃縮は、他の方法、例えば限外濾過または透析によって行ってもよい。

次いで、自己溶解ＩＢａＣＣの溶解物を、遠心分離、限外濾過または透析によって濃縮しうる（ステップ６１６）。次いで、得られたペレットを０．５Ｌ〜１Ｌの１ＭＮａＣｌ溶液中に再懸濁しうる（ステップ６１８）。次いで、該濃縮溶解物を２５０ｍＬ／Ｌの油と、室温で２時間混合して、カルバコールを抽出しうる（ステップ６２０）。この油抽出の後、９Ｌの水を加え（ステップ６２２）、混合物を再度、遠心分離、限外濾過または透析により濃縮しうる（ステップ６２４）。次いで、濃縮された混合物を、０．５Ｌ〜１ＬのＮａＣｌ溶液中に再懸濁しうる（ステップ６２６）。次いで、その混合物を１０Ｌの水で３回洗い、遠心分離、限外濾過または透析によって濃縮しうる（ステップ６２８）。得られた組成物は、純粋なＣｒｙ５Ｂ結晶（ＰＣＣ）でありうる。いくつかの態様において、該組成物を噴霧乾燥または凍結乾燥しうる（ステップ６３０）。

ＰＣＣはインビトロで鞭虫を中毒させる
インビトロで、実施例２に記載のように製造したＰＣＣで処理した後の鞭虫の運動性を調べた。鞭虫を各ウェルに、抗生物質を含むＲＰＭＩ培地中、３匹ずつ入れた。ＰＣＣ（Ｃｒｙ５Ｂ）の用量は２０、１００および５００μｇ／ｍＬで、各用量につき４つのウェルを使用した。図９Ａに、示されている時点で測定した鞭虫運動性に対するＰＣＣ（Ｃｒｙ５Ｂ）の用量応答効果のグラフを示す。データは、ウェル毎に平均運動性指数として表され、ここで、３＝運動性が高い、２＝運動性が緩徐、１＝触れても不動、である。

ＰＣＣはインビボで鞭虫量を低減する
ＰＣＣが鞭虫量を低減する能力をハムスターにおいて調べた。マウスを鞭虫Trichuris murisに感染させた。マウスを２群に分け（各群４匹）、水、および実施例２に記載のように製造したＣｒｙ５Ｂ約５００ｍｇ／ｋｇのＰＣＣ油洗浄物で処置した。両群に、水およびＰＣＣ油洗浄物を、０．５ｍｌの体積で単回投与として、強制経口投与した。感染後３４日目に、処置前の糞便中の卵数を測定し、マウスを、等しい糞便中の卵数で２群に分けた。感染後３５日目に、強制経口投与による処置をマウスに行った。感染後４１日目（処置から６日後）に、処置後の評価を、すべてのマウスを切開して総鞭虫数（盲腸）を測定して行った。鞭虫量の４５％の低下が見られた（水の場合、平均５．５の鞭虫数；ＰＣＣの場合、平均３の鞭虫数）（ｐ＝０．０２）。

図９Ｂに、水で処置したハムスター（対照）と、実施例２に記載のように製造したＰＣＣ５００ｍｇ／ｋｇで処置したハムスターとで鞭虫量を比較する本試験のヒストグラムを示す。

ＰＣＣはインビトロで鉤虫を中毒させる
インビトロで鉤虫（Necator americanus）の運動性を、実施例２に記載のように製造したＰＣＣによる処理後に調べた。各ウェルに３匹の鉤虫を入れ、各用量につき４つのウェルを用い、用量は２５０μｇ／ｍＬとした。図１０Ａは、Ｃｒｙ５ＢＰＣＣへのインビトロ暴露後の鉤虫運動性の経時変化を示すグラフである。ＰＣＣは、鉤虫中毒に対し用量依存的効果を示した。データは、ウェル毎に平均運動性指数として表され、ここで、３＝運動性が高い、２＝運動性が緩徐である、１＝触れられなければ動かない、０＝触れられても動かない、である。

ＰＣＣはインビボで鉤虫量を減少させる
ＰＣＣを１０ｍｇ／ｋｇの用量で用いて、鉤虫Nector americanusに感染させたハムスターを処置した。６匹のハムスターをN. americanusに感染させ、該寄生虫の駆除を防ぐために本実験の期間にわたって免疫抑制レジメン（デキサメタゾンを飲料水に含め、かつ、週２回注射した）に付した。鉤虫を与えた後（約６０日後）に、３匹のハムスターを経口ＰＣＣ１０ｍｇ／ｋｇの単回用量で処置し、３匹のハムスターを対照としての水で処置した。処置前に糞便中の卵数測定値を得て虫が棲み付いたことを確認し、処置前の糞便中卵数が等しくなるようにハムスターを２群に分けた。処置後５日目に動物を殺し、腸内鉤虫量を調べた。

図１０Ｂは、Ｃｒｙ５ＢＰＣＣおよび水対照で処置したハムスターにおける鉤虫量を示すヒストグラムである。図１０Ｃは、Ｃｒｙ５ＢＰＣＣおよび水対照による処置の前と後の、ハムスター糞便中の鉤虫卵数を示すヒストグラムである。１０ｍｇ／ｋｇのＰＣＣの単回投与により、鉤虫量が９２％減少し（Ｐ＝０．０１６）、糞便中卵数が９８％減少した（ＦＥＣ；Ｐ＝０．０−１９）。

一方、Ｃｒｙ５の芽胞含有溶解物（ＳＣＬ）は、ハムスターにおいて同等の鉤虫量減少を達成するために、４倍の量で投与する必要がある。ハムスターを鉤虫Nector americanusに感染させ、Ｃｒｙ５Ｂ４０ｍｇ／ｋｇの単回用量で処置した。図１１Ａは、ハムスターにおける経口Ｃｒｙ５ＢＳＣＬまたは水対照による処置後の鉤虫量のプロットを示す。図１１Ｂは、ハムスターにおける経口Ｃｒｙ５ＢＳＣＬまたは水対照による処置後の卵数／ｇのプロットを示す。４０ｍｇ／ｋｇＣｒｙ５ＢＳＣＬの単回用量は、鉤虫量の８８％の減少、および糞便中卵数の９５％の減少をもたらした。

ＰＣＣは鉤虫卵に対して有効な毒素である
図１２は、Ancyclostoma ceylanicum鉤虫の卵から幼虫への成長に対する、さまざまな濃度のＣｒｙ５ＢＰＣＣ（３つの調製物）の毒性を、Ｃｒｙ５ＢＩＢａＣＣと比較して示すヒストグラムである。一部のＣｒｙ５ＢＰＣＣはリゾチームの添加により処理したが、これはＣｒｙ５ＢＰＣＣの毒性に影響を及ぼさないようであった。A. ceylanicumの卵（卵約６５個／ウェル、複数ウェル／用量）を大腸菌食物源と共に緩衝液に入れ、２５℃で７日間成長させた。７日目に、孵化して第３幼虫感染段階まで成長した卵の数を調べる。ＰＣＣは低濃度でも、ＩＢａＣＣよりも高い活性で、該鉤虫の成長を阻止することができる（ＩＣ_５０が約１５ｎｇ／ｍＬ）。

ＢａＣＣからの純粋なＰＣＣの改良された精製方法
Ｃｒｙ５Ｂを発現するB. thuringiensisを、実施例１に記載のように、すなわち、（ＢａＣＣ）１０Ｌの規模で培養した（ステップ６３１）（図１３Ａ）。遠心分離（４５００ｒｐｍ、４℃で６０分間）により細胞を１０倍濃縮した後（ステップ６３２）、洗ったＢａＣＣを水５００ｍＬ（最終体積）中に懸濁し、ヘキサンを最終濃度１０％ v/vで加え、密閉容器内で室温で１時間混合して、ＩＢａＣＣを調製した（ステップ６３３）。図１３Ｂに、ＢａＣＣからのＩＢａＣＣの調製を示す顕微鏡画像を示す。左の顕微鏡画像はＢａＣＣを示し、右の顕微鏡画像では、ロッド状の構造が破壊されており、ＢａＣＣに対するヘキサンの効果が示される。図１３Ｂの棒グラフは、ＢａＣＣ（１００％細胞増殖）、および１０％ヘキサンで処理されたＢａＣＣ（０％細胞増殖、完全な不活化）の細胞増殖パーセンテージの値を示す。図１３Ｃに、ＢａＣＣ出発材料、および図１３Ａのフローチャートに示す方法に付した後の最終的な精製ＰＣＣ産物の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像を示す。ヘキサンの代わりに他の細胞不活化手段、例えば界面活性剤、抗菌剤、殺生物剤等を使用することができる。

実施例２に記載のように、ＩＢａＣＣから純粋なＣｒｙ５Ｂ結晶（ＰＣＣ）を調製した。すなわち、ＩＢａＣＣを１５０００ｐｓｉで、パス回数５〜７でホモジナイズすることにより細胞溶解して、ＩＢａＣＣ細胞壁ゴーストからＰＣＣを放出させた（ステップ６３４）。

ＰＣＣを、可溶性細胞成分、脂質および細胞壁デブリから相分配により精製するために、ヘキサンを５０％ v/vとなるように加え、密閉容器内で室温で１時間激しく混合した。そのエマルジョンを密閉ボトルに移し、４５００ｒｐｍで、４℃で１時間遠心分離した（ステップ６３５）。ヘキサンの上層を取り、廃棄溶媒とした。細胞壁デブリを含む中間層を取り、廃棄した。水溶性細胞成分を含む水層を取り、廃棄し、ＰＣＣのペレットを残した。ＰＣＣペレットを水で洗った後、凍結保存した。得られたＰＣＣはタンパク質含量が９８％ w/wであった。他のＰＣＣ回収方法、例えばＰＣＣを水相中に集め、ヘキサンおよびインターフェースを上清相に集める連続遠心分離も可能である。最終ＰＣＣは、凍結保存するか、または凍結乾燥もしくは噴霧乾燥して室温、４℃もしくは凍結温度で保存することができる。

改善された方法で精製されたＰＣＣは線虫に対して有効な毒素である
もう１つの実施例において、実施例９の方法を、実施例９のヘキサン相分配法と組み合わせた。図１４は、細菌の不活化のために１０％ヘキサンを、他の細菌汚染物を除去するために５０％ヘキサンを用いてＢａＣＣから調製したＰＣＣ（ＰＣＣ−Ｈｅｘ／Ｈｅｘ）の生物活性を示すグラフである。グラフには、未凍結乾燥ＰＣＣを菱形で、凍結乾燥ＰＣＣを四角形で示す。表示の値は、幼虫段階Ｌ４で出発した単一のC. elegansの、３日後の繁殖サイズの平均値である（条件毎にｎ＝３）。ＰＣＣの効力は、１０μｇ／ｍＬで繁殖サイズの出現を完全に抑制するので、優れている。これに対し、文献に記載されるデータによると、この用量での抑制率は平均７０％である（Hu, Y, et al., Proc Natl Acad Sci USA 107: 5955-60 (2010)）。これらデータから、ＰＣＣＨｅｘ／Ｈｅｘ法は凍結乾燥との適合性が十分であることが示される。

改善された方法で精製されたＰＣＣは鉤虫に対して有効な毒素である
図１５に、細菌の不活化（ＩＢａＣＣ）のためにカルバクロールを、他の細菌汚染物を除去するために５０％ヘキサン相分配を用いてＢａＣＣから調製したＰＣＣ（ＰＣＣ−Ｃａｒｖ＆Ｈｅｘ）の生物活性を示す。表示の値は、７日目の、成熟した感染性幼虫段階に達した鉤虫A. ceylanicum卵のパーセントである。バーが低いほど、鉤虫成長の阻害が大きいことを示す。対照は、培地中のヘキサンのみであり、終濃度をＰＣＣサンプルにおけるのと同じとしたものである。データは、ヘキサン単独では寄生虫に対し効果がないことを示している。

図１６は、細菌を殺すためにカルバクロールを、他の細菌汚染物を除去するために５０％ヘキサンを用いてＢａＣＣから調製したＰＣＣの生物活性を示す。表示の値は、２４時間置きに評価したインビトロの鉤虫A. ceylanicum成虫の運動性であり、ここで、３＝活動的で運動性が高い；２＝運動性が緩徐である；１＝触れられなければ動かない（高度の中毒）；０＝触れられても動かない（死亡が推定される）、である。データは、ＰＣＣ用量が高いほど運動性が低下するという明確な用量応答を示しており、ヘキサンで処理されたＰＣＣが、生物活性が高いことを示している。

本明細書において引用する文献および特許出願はいずれも、個々の文献または特許出願が引用により本書の一部とされることが個別に明記されるかのように、引用により本書の一部とされる。上記の発明は、明確に理解されることを目的として例示によっていくぶん詳細に説明したが、本発明の教示に照らして、特許請求の範囲またはその意図から外れることなく発明に変化および変更を加えうることは、当業者に明らかであろう。

本書において、説明の目的で、本発明の特定のステップ、要素、態様および適用を示し、説明したが、当然のことながら本発明はそれに限定されるものではないことが理解される。なぜなら、特に上記教示に照らして、本発明の範囲またはその意図から外れることなく当業者によって変更が加えられうるからである。したがって、本発明は、特許請求の範囲によって限定されることを除き、限定されるものではない。

上記のさまざまな態様は、組み合わせられてさらなる態様を表すことができる。本明細書において引用され、および／または出願データシートにおいて挙げられる、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許文献はいずれも、引用によってその全体が本書の一部とされる。態様の側面は、必要に応じてさまざまな特許、出願および文献の概念を用いるように、改変されて、さらなる態様を表すことができる。

そのような変更および他の変更を、上記の詳細な説明に照らして態様に対してなすことができる。全般に、特許請求の範囲において、用いられる用語は、請求項を、明細書および特許請求の範囲に開示される特定の態様に限定するものと解釈すべきではなく、すべての可能な態様を、請求項に認められるすべての範囲の等価物と共に包含するものと解釈すべきである。

Claims

単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成された、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を含む医薬組成物において、該結晶タンパク質は芽胞不形成形態の宿主細菌によって産生され、該医薬組成物は、細胞芽胞、または結晶の形態の殺線虫結晶タンパク質以外の宿主細菌タンパク質を実質的に含まない、医薬組成物。
ヒト対象への経口投与のために適当な賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
宿主細菌がBacillus種である、請求項１に記載の医薬組成物。
宿主細菌がBacillus thuringiensis（Ｂｔ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
宿主細菌がE. coliまたはP. fluorescens種である、請求項１に記載の方法。
芽胞不形成宿主細菌が、前記天然の生物活性殺線虫結晶が該細菌のサイトゾル中に捕らえられるように、芽胞形成の欠失もたらす遺伝子変異を持つよう遺伝子組換えされている、請求項１に記載の医薬組成物。
芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異が、下記のものからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子の欠失または不活性化である、請求項６に記載の方法：kinA、kinB、spo0A、spo0B、spo0E、spo0F、spo0J、spo0M spoIIB、spoIID、spoIIE、spoIIF、spoIIG、spoIIL、spoIIM、spoIIIA、spoIIIB、spoIIIE、spoIVA、spoIVC、spoIVD、spoVG、spoVK、spoVL、spoVM、spoVN、spoVP、spoVQ、spoVID、σH、σF、σE、σG、およびσK。
芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異が、spo0A遺伝子の欠失または不活性化である、請求項６に記載の方法。
宿主細菌が、前記単一種の殺線虫結晶タンパク質を芽胞不形成特異的プロモーターの制御下に発現するように遺伝子組換えされている、請求項１に記載の医薬組成物。
芽胞不形成特異的プロモーターが、Ｃｒｙ３Ａ、ＧｅｒＡ、ＧＮＡＴ、またはＴａｄＡプロモーターである、請求項９に記載の医薬組成物。
単一種の殺線虫結晶タンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂ、Ｃｒｙ５Ｃ、Ｃｒｙ５Ｄ、Ｃｒｙ６Ａ、Ｃｒｙ１３Ａ、Ｃｒｙ１４Ａ、Ｃｒｙ２１Ａ、Ｃｒｙ２１Ｂ、Ｃｒｙ５５Ｂ、ならびにそれらのバリアントおよびトランケーションからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
殺線虫結晶タンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂまたはそのバリアントもしくはフラグメントである、請求項１１に記載の医薬組成物。
殺線虫結晶タンパク質が、Ｃｒｙ５ＢバリアントＳｅｒ４０７Ｃｙｓである、請求項１２に記載の医薬組成物。
単離された天然の生物活性殺線虫結晶の形態の第２の結晶タンパク質をさらに含み、該結晶は該第２の結晶タンパク質のみから形成される、請求項１に記載の医薬組成物。
医薬組成物が、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を少なくとも９５％の含量で含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の医薬組成物。
単離された天然の生物活性殺線虫結晶が、経口投与で利用可能な投与形態にある、請求項１〜１５のいずれかに記載の医薬組成物。
医薬組成物が、乾燥粉末形態であり、医薬用カプセルに封入されている、請求項１〜１６のいずれかに記載の医薬組成物。
（ａ）単一種の殺線虫結晶タンパク質を発現するように遺伝子組換えされた芽胞不形成形態の宿主細菌を増殖させること；ここで、該芽胞不形成宿主細菌は、単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成される天然の生物活性殺線虫結晶を産生し、該宿主細菌は増殖培地中で増殖され、場合により、該芽胞不形成宿主細菌は該天然の生物活性殺線虫結晶を該増殖培地中に放出する；
および
（ｂ）該天然の生物活性殺線虫結晶を単離および濃縮して、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を形成すること
を含む、医薬組成物の製造方法。
宿主細菌がBacillus種である、請求項１８に記載の方法。
宿主細菌がBacillus thuringiensis（Ｂｔ）である、請求項１８に記載の方法。
宿主細菌がE. coliまたはP. fluorescens種である、請求項１８に記載の方法。
芽胞不形成宿主細菌が、前記天然の生物活性殺線虫結晶が該細菌のサイトゾル中に捕らえられるように、芽胞形成の欠失もたらす遺伝子変異を持つよう遺伝子組換えされている、請求項１８に記載の方法。
芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異が、下記のものからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子の欠失または不活性化である、請求項２２に記載の方法：kinA、kinB、spo0A、spo0B、spo0E、spo0F、spo0J、spo0M spoIIB、spoIID、spoIIE、spoIIF、spoIIG、spoIIL、spoIIM、spoIIIA、spoIIIB、spoIIIE、spoIVA、spoIVC、spoIVD、spoVG、spoVK、spoVL、spoVM、spoVN、spoVP、spoVQ、spoVID、σH、σF、σE、σG、およびσK。
芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異が、spo0A遺伝子の欠失または不活性化である、請求項２２に記載の方法。
宿主細菌が、単一種の殺線虫結晶タンパク質を芽胞不形成特異的プロモーターの制御下に発現するように遺伝子組換えされている、請求項１８に記載の方法。
芽胞不形成特異的プロモーターが、Ｃｒｙ３Ａ、ＧｅｒＡ、ＧＮＡＴ、またはＴａｄＡプロモーターである、請求項２５に記載の方法。
単一種の殺線虫結晶タンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂ、Ｃｒｙ５Ｃ、Ｃｒｙ５Ｄ、Ｃｒｙ６Ａ、Ｃｒｙ１３Ａ、Ｃｒｙ１４Ａ、Ｃｒｙ２１Ａ、Ｃｒｙ２１Ｂ、Ｃｒｙ５５Ｂ、ならびにそれらのバリアントおよびトランケーションからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
殺線虫結晶タンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂまたはそのバリアントもしくはフラグメントである、請求項２７に記載の方法。
殺線虫結晶タンパク質が、Ｃｒｙ５ＢバリアントＳｅｒ４０７Ｃｙｓである、請求項２８に記載の方法。
前記芽胞不形成宿主細菌を、該宿主細菌を不活化するために抗菌化合物に暴露するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
抗菌化合物が沃素である、請求項３０に記載の方法。
抗菌化合物が抗生物質医薬である、請求項３０に記載の方法。
抗菌化合物がβ−ラクタム抗生物質である、請求項３０に記載の方法。
抗菌化合物が、テルペン、ヘキサンおよびホルムアルデヒドからなる群から選択される有機溶媒である、請求項３０に記載の方法。
抗菌化合物がテルペンである、請求項３４に記載の方法。
テルペンが、チモール、オイゲノール、ゲラニオール、カルバクロールおよびシトラールまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
テルペンがカルバクロールである、請求項３６に記載の方法。
抗菌化合物がヘキサンである、請求項３４に記載の方法。
前記殺線虫結晶タンパク質から前記抗菌化合物、可溶性細胞成分、脂質および細胞壁デブリを抽出するために、前記不活化された宿主細菌に食用油を加えるステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
食用油がトウモロコシ油である、請求項３９に記載の方法。
前記殺線虫結晶タンパク質から前記抗菌化合物を抽出するために、前記不活化された宿主細菌に有機溶媒を加えるステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
有機溶媒がヘキサンである、請求項４１に記載の方法。
ヘキサンが、不活化宿主細菌に５０％ v/vまで加えられる、請求項４２に記載の方法。
有機溶媒と不活化宿主細菌の混合物を遠心分離して前記殺線虫結晶タンパク質をペレット化するステップをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
前記不活化された宿主細菌をホモジナイズして、天然の生物活性殺線虫結晶を含む細菌溶解物を形成するステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
前記細菌溶解物を濃縮するステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
細菌溶解物を濃縮するステップが、遠心分離、限外濾過および透析からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
前記単離された天然の生物活性殺線虫結晶を、経口的に利用可能な投与形態に製剤化するステップをさらに含む、請求項１〜４７のいずれかに記載の方法。
製剤化ステップが、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を凍結乾燥または噴霧乾燥することを含む、請求項４８に記載の方法。
製剤化ステップが、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を医薬用カプセルに充填することを含む、請求項４８に記載の方法。
（ａ）単一種の殺線虫結晶タンパク質を発現するように組換えられた芽胞不形成形態の宿主細菌を増殖させること；ここで、該芽胞不形成宿主細菌は、単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成される天然の生物活性殺線虫結晶を産生する；
（ｂ）該増殖した芽胞不形成宿主細菌を、抗菌化合物への暴露により不活化すること；
（ｃ）該不活化した芽胞不形成宿主細菌をホモジナイズして、細菌溶解物を形成すること；および
（ｄ）該細菌溶解物中の天然の生物活性殺線虫結晶を濃縮して、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を形成すること
を含む、医薬組成物の製造方法。
前記増殖した芽胞不形成宿主細菌を不活化の前に濃縮するステップをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
宿主細菌がBacillus種である、請求項５１に記載の方法。
宿主細菌がBacillus thuringiensis（Ｂｔ）である、請求項５１に記載の方法。
宿主細菌がE. coliまたはP. fluorescens種である、請求項５１に記載の方法。
芽胞不形成宿主細菌が、前記天然の生物活性殺線虫結晶が該細菌のサイトゾル中に捕らえられるように、芽胞形成の欠失もたらす遺伝子変異を持つよう遺伝子組換えされている、請求項５１に記載の方法。
芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異が、下記のものからなる群から選択される１つまたはそれ以上の遺伝子の欠失または不活性化である、請求項５６に記載の方法：kinA、kinB、spo0A、spo0B、spo0E、spo0F、spo0J、spo0M spoIIB、spoIID、spoIIE、spoIIF、spoIIG、spoIIL、spoIIM、spoIIIA、spoIIIB、spoIIIE、spoIVA、spoIVC、spoIVD、spoVG、spoVK、spoVL、spoVM、spoVN、spoVP、spoVQ、spoVID、σH、σF、σE、σG、およびσK。
芽胞形成の欠失をもたらす遺伝子変異が、spo0A遺伝子の欠失または不活性化である、請求項５６に記載の方法。
宿主細菌が、前記単一種の殺線虫結晶タンパク質を芽胞不形成特異的プロモーターの制御下に発現するように遺伝子組換えされている、請求項５６に記載の方法。
芽胞不形成特異的プロモーターが、Ｃｒｙ３Ａ、ＧｅｒＡ、ＧＮＡＴ、またはＴａｄＡプロモーターである、請求項５９に記載の方法。
単一種の細胞質結晶タンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂ、Ｃｒｙ６Ａ、Ｃｒｙ５Ｃ、Ｃｒｙ５Ｄ、Ｃｒｙ１３Ａ、Ｃｒｙ１４Ａ、Ｃｒｙ２１Ａ、Ｃｒｙ２１Ｂ、Ｃｒｙ５５Ｂ、ならびにそれらのバリアントおよびトランケーションからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
殺線虫結晶タンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂまたはそのバリアントもしくはフラグメントである、請求項６１に記載の方法。
殺線虫結晶タンパク質が、Ｃｒｙ５ＢバリアントＳｅｒ４０７Ｃｙｓである、請求項６２に記載の方法。
抗菌化合物が沃素である、請求項５１に記載の方法。
抗菌化合物が抗生物質医薬である、請求項５１に記載の方法。
抗菌化合物がβ−ラクタム抗生物質である、請求項５１に記載の方法。
抗菌化合物が、テルペン、ヘキサンおよびホルムアルデヒドからなる群から選択される有機溶媒である、請求項５１に記載の方法。
抗菌化合物がテルペンである、請求項６７に記載の方法。
テルペンが、チモール、オイゲノール、ゲラニオール、カルバクロールおよびシトラールまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
テルペンがカルバクロールである、請求項６９に記載の方法。
抗菌化合物がヘキサンである、請求項７０に記載の方法。
前記不活化された宿主細菌から前記抗菌化合物および細胞壁デブリを抽出するステップをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
前記殺線虫結晶タンパク質から前記不活化剤を抽出するために、前記不活化された宿主細菌に食用油を加えるステップをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
食用油がトウモロコシ油である、請求項７３に記載の方法。
前記殺線虫結晶タンパク質から前記抗菌化合物、可溶性細胞成分、脂質および細胞壁デブリを抽出するために、前記不活化された宿主細菌に有機溶媒を加えるステップをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
有機溶媒がヘキサンである、請求項７５に記載の方法。
ヘキサンが、不活化宿主細菌に５０％ v/vまで加えられる、請求項７６に記載の方法。
有機溶媒と不活化宿主細菌の混合物を遠心分離して前記殺線虫結晶タンパク質をペレット化するステップをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
前記単離された天然の生物活性殺線虫結晶を、経口的に利用可能な投与形態に製剤化するステップをさらに含む、請求項５１〜７８のいずれかに記載の方法。
製剤化ステップが、前記単離された天然の生物活性殺線虫結晶を凍結乾燥または噴霧乾燥することを含む、請求項７９に記載の方法。
製剤化ステップが、前記単離され精製された天然の生物活性殺線虫結晶を医薬用カプセルに充填するステップことを含む、請求項７９に記載の方法。
対象において寄生虫または蠕虫感染を処置するための方法であって、
単一種の殺線虫結晶タンパク質から形成される、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を含む医薬組成物を処置有効量で対象に投与することを含み、ここで、該医薬組成物は、細菌芽胞、または結晶の形態の殺線虫結晶タンパク質以外の宿主細菌タンパク質を実質的に含まない、方法。
殺線虫結晶タンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂ、Ｃｒｙ５Ｃ、Ｃｒｙ５Ｄ、Ｃｒｙ６Ａ、Ｃｒｙ１３Ａ、Ｃｒｙ１４Ａ、Ｃｒｙ２１Ａ、Ｃｒｙ２１Ｂ、Ｃｒｙ５５Ｂ、ならびにそれらのバリアントおよびトランケーションからなる群から選択される、請求項８２に記載の方法。
殺線虫結晶タンパク質がＣｒｙ５Ｂである、請求項８２に記載の方法。
殺線虫結晶タンパク質が、Ｃｒｙ５ＢバリアントＳｅｒ４０７Ｃｙｓである、請求項８２に記載の方法。
医薬組成物が、単離された天然の生物活性殺線虫結晶の形態の第２の結晶タンパク質をさらに含み、該結晶は該第２の結晶タンパク質のみから形成される、請求項８２に記載の方法。
医薬組成物が、単離された天然の生物活性殺線虫結晶を少なくとも約９５％の含量で含む、請求項８２に記載の方法。
医薬組成物が、乾燥粉末形態であり、医薬用カプセルに封入されている、請求項８２に記載の方法。