JP2020516249A - ヒト化抗ｔｐｂｇ抗体およびその製造方法、その複合体および使用 - Google Patents

ヒト化抗ｔｐｂｇ抗体およびその製造方法、その複合体および使用 Download PDF

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Abstract

本発明はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体およびその製造方法、その複合体と使用を公開する。（ａ） ヒト抗体のフレームワーク領域の残基を含むフレームワーク領域、および（ｂ） 配列番号４または８で示される軽鎖可変領域の一つまたは複数のＣＤＲ、あるいは配列番号２または６で示される重鎖可変領域の一つまたは複数のＣＤＲを含む。

Description

技術分野
本発明は、抗体の分野に関し、具体的に、ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体およびその製造方法、その複合体および使用に関する。
本願は出願日が２０１７年０４月０５日の中国特許出願ＣＮ２０１７１０２１８５２４．１の優先権を要求する。本願は上記中国特許出願の全文を引用する。
背景技術
胚性幹細胞の栄養膜と癌細胞を比較すると、細胞表面の分子である、栄養膜特異的糖タンパク質（ＴＰＢＧ、５Ｔ４とも呼ばれる）が発見され、胚栄養膜で発現される特異性タンパク質である。ヒトＴＰＢＧタンパク質の分子量は約７２ｋＤａで、４２０個のアミノ酸を含み、そのＮ末端のオリゴ糖構造は多様性を有し、タンパク質の加水分解を防止することができ、かつ細胞膜のシグナル伝達の過程においてほかの分子と相互作用する。ＴＰＢＧタンパク質は計７つの重複するロイシンドメイン（ＬＲＲ）を含み、タンパク質同士の相互作用に関与する。
栄養膜は胎盤と胎児の間の１層の特殊な胚性幹細胞で、ＴＰＢＧは胚発生期の様々な栄養膜細胞で幅広く発現される。正常成人の組織において、いくつかの上皮細胞でしか発現されない。しかし、ＴＰＢＧは多くの癌細胞で発現され、たとえば子宮癌、結腸癌、胃癌、卵巣癌、口腔癌、前立腺癌、肺癌や腎臓癌の組織でＴＰＢＧの発現が検出され、結腸癌、胃癌や卵巣癌では、ＴＰＢＧの発現量が癌の低治癒率に関連することを示す証拠がある。また、非小細胞肺癌、腎臓癌や膵臓癌の組織では、ＴＰＢＧの発現は９５％以上と高い。
多くの研究では、当該ＴＰＢＧの過剰発現は細胞の遷移を促進し、同時に免疫監視から逃げることができる。マウス線維芽細胞において過剰発現のＴＰＢＧは細胞を紡錘体の形態に誘導し、細胞の粘着を低下させる。マウス正常上皮細胞において、同様にＴＰＢＧは上皮細胞のカドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）を抑制し、細胞の遷移を促進することが見出された。一方、ＴＰＢＧの細胞内における部分は細胞骨格の形成を抑制する機能を有する。同時に、ＴＰＢＧは上皮間葉転換（ＥＭＴ）に関連し、ＴＰＢＧは胚性幹細胞の発育の早期マーカーとして、細胞外マトリックスプロテアーゼの活性を向上させ、アクチンの細胞骨格の配列を干渉し、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現を下方調節する。ほかの研究では、ＴＰＢＧはＣＸＣＲ４と細胞膜の表面に共局在化し、そのリガンドであるＣＸＣＬ１２ケモカインの結合を誘導し、炎症や腫瘍の拡散を促進することが見出された。ＴＰＢＧ陰性細胞では、ＣＸＣＬ１２は別の受容体ＣＸＣＲ７に結合し、走化性応答を抑制し、細胞の成長と生存に有利である。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル経路は発育および細胞の再生に非常に重要な作用を果たし、ＴＰＢＧはＬＲＰ６とＷｎｔ受容体の取り込みを抑制し、Ｗｎｔシグナル経路を抑制することによって、細胞の粘着および細胞骨格の形成を抑制し、腫瘍の転移と拡散を促進する。また、ＴＰＢＧは乳癌および胃癌の細胞において非典型的なＷｎｔ経路に関与し、同様に癌細胞の遷移と浸潤を促進することを示す証拠もある。
モノクローナル抗体は、標的性、特異性、特定性、高親和力などの優勢があるため、新規な診断・治療薬になっている。しかしながら、早期の臨床試験では、人体において非ヒト由来モノクローナル抗体を使用すると、よくヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）やヒト抗ラット抗体（ＨＡＲＡ）の応答によって、重度な免疫反応が生じ、抗体がすぐに除去されることが明らかになった。その後、キメラ抗体、ヒト化抗体および全ヒト由来抗体を含む、免疫原性が低い抗体が開発された。ヒト化の程度によって、治療性モノクローナル抗体の薬物は、ネズミ由来抗体（ヒト由来アミノ酸配列がない）、キメラ抗体（６０％〜７０％ヒト化アミノ酸配列）、ＣＤＲ移植抗体（９０％〜９５％ヒト化アミノ酸配列）および全ヒト由来抗体（１００％ヒト由来アミノ酸配列）の４種類に分かれる。ヒト化の程度の増加につれ、非ネズミ由来モノクローナル抗体は、人体の治療過程におけるヒト抗ネズミ抗体の応答（ＨＡＭＡおよびＨＡＲＡの応答）を軽減し、次第に異種性抗体の免疫原性の問題を解消し、抗原に対する高親和力を維持しながら、抗体の薬物動態学を改善し、臨床でこれらの抗体薬物が大量に標的治療に使用されている。
抗体薬物複合薬物は、抗体と効率的な小分子薬物がリンカーを介して複合してなる抗体薬物複合体で、高毒性の小分子薬物が癌細胞における標的タンパク質を認識するようにすることによって、特異的に癌細胞を殺滅することができる。ここ約百年間では、抗体による免疫療法と化学薬物による化学療法は、ずっと臨床における癌治療の二大治療策になっている。抗体は、腫瘍細胞によって過剰発現される抗原を標的とし、多くの治療性モノクローナル抗体はすでに臨床で大きな成功を収めた。臨床の実践において、治療性抗体は、優れた標的性があるが、殺傷作用に限界がある。小分子化学薬物は、癌細胞に対して効率的な殺傷作用があるが、癌細胞以外の細胞にも同様のダメージを与える。そのため、臨床において、抗体薬物および小分子薬物はそれぞれ限界があり、薬物の研究・開発に新しい需要が現れてきた。新世代の抗体薬物複合体は、抗体の標的細胞に対する特異的な結合能力を利用し、高細胞毒性の化学薬物を伝達し、癌細胞を標的とする効率的な殺傷を実現する。新たな化学的連結技術の出現につれ、抗体薬物複合薬物は８０年代末から臨床の研究が開始し、現在はすでに２つのＡＤＣ薬物がＦＤＡによって市販を許可された。
ＡＤＣ薬物の開発は、薬物標的の選択、組換え抗体の製造、リンカー技術の開発や高細胞毒性化合物の選別・最適化などのいくつかの方面に関わる。ＴＰＢＧは癌細胞によって特異的に発現されるタンパク質として、ＡＤＣ薬物の標的の候補である。
発明の概要
本発明の解決しようとする技術課題は、ＴＰＢＧ抗体が欠けているという現在の不足を克服し、親和力が高く、特異性が強いヒト化抗ＴＰＢＧ抗体および製造方法と使用を提供することで、前記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体は、ＴＰＢＧタンパク質と高度の親和力を有し、そしてヒト化の程度の増加につれ、人体の治療過程におけるヒト抗ネズミ抗体の応答（ＨＡＭＡの応答）を軽減し、次第に異種性抗体の免疫原性の問題を解消し、抗原に対する高親和力を維持しながら、抗体の薬物動態学を改善することができる。また、本発明は、前記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体およびそれに複合した抗腫瘍機能を有する小分子化合物を含む、薬物活性成分の複合体を提供するが、前記の複合体は、細胞に入り、ＴＰＢＧ陽性細胞に細胞毒性の殺傷作用を働くことができ、腫瘍などを治療する薬物の製造に使用することが可能である。
本発明者らはヒト由来ＴＰＢＧタンパク質またはヒト由来ＴＰＢＧタンパク質を過剰発現する組換え細胞株を免疫原とし、従来のハイブリドーマ製造技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６： ４９５）を使用し、一連の調整および改善によって、ＴＰＢＧ抗体のリード抗体を得た。さらに、リード抗体の初期生産、精製および同定によって、ヒト由来ＴＰＢＧタンパク質などのタンパク質と高い親和力を有するＴＰＢＧ抗体を得た。分子生物学的方法による配列決定によって、得られたマウス由来ＴＰＢＧ抗体の重鎖可変領域およびＴＰＢＧ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を知った。詳しく分析されたマウス抗体を利用し、その抗原と結合するＣＤＲ領域をヒトの抗体フレームワークと連結し、親和力を再構築し、ＣＤＲ移植抗体を形成し、その特異性および親和力の大半を維持しながら、免疫原性および毒性の副作用をほとんど除去した。当該ヒト化ＴＰＢＧ抗体を小分子化合物、たとえばＭＭＡＦと複合して複合体を得たが、前記複合体は細胞に入ることができ、ＴＰＢＧ陽性細胞に対して優れた細胞毒性の殺傷作用を有する。
本発明は、ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体であって、を含む抗体を提供する。
（ａ） ヒト抗体のフレームワーク領域の残基を含むフレームワーク領域と、
（ｂ） 配列表の配列番号４または８で示される軽鎖可変領域の一つまたは複数のＣＤＲ、あるいは配列番号２または６で示される重鎖可変領域の一つまたは複数のＣＤＲと、
前記のヒト抗体のフレームワーク領域は、重鎖のフレームワーク領域および軽鎖のフレームワーク領域を含み、ヒト抗体の軽鎖のフレームワーク領域の残基は、Ｏ２、Ｏ１２、ＤＰＫ１（Ｏ１８）、ＤＰＫ２、ＤＰＫ３、ＤＰＫ４、ＤＰＫ５、ＤＰＫ６、ＤＰＫ７、ＤＰＫ８、ＤＰＫ９、ＤＰＫ１０、 ＤＰＫ１２（Ａ２）、ＤＰＫ１３、ＤＰＫ１５、ＤＰＫ１６、ＤＰＫＩ８、ＤＰＫ１９、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２３、ＤＰＫ２４（Ｂ３）、ＤＰＫ２５、ＤＰＫ２６およびＤＰＫ２８系列、特にこれらの系列のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ならびにＪｋ断片Ｊｋ１、Ｊｋ２、Ｊｋ３、Ｊｋ４およびＪＫ５、特にこれらの系列のＦＲ４でコードされる配列を含んでもよい。ヒト抗体の重鎖のフレームワーク領域の残基は、ＤＰ４、ＤＰ７、ＤＰ８、ＤＰ９、ＤＰ１０、ＤＰ３１、ＤＰ３３、ＤＰ３５（ＶＨ３−１１）、ＤＰ４５、ＤＰ４６、ＤＰ４７、ＤＰ４８、ＤＰ４９（ＶＨ３−３０）、ＤＰ５０、ＤＰ５１（ＶＨ３−４８）、ＤＰ５３、ＤＰ５４、ＤＰ６５、ＤＰ６６、ＤＰ６７、ＤＰ６８およびＤＰ６９系列、特にこれらの系列のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ならびにＪＨ断片ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ４ｂ、ＪＨ５およびＪＨ６、特にこれらの系列のＦＲ４でコードされる配列、または重鎖のフレームワーク領域の共通配列を含んでもよい。これらのフレームワーク領域の配列は、系列の抗体の遺伝子配列を含む公共ＤＮＡデータベースまたは公開された参照文献から得ることができる。たとえば、ヒトの重鎖および軽鎖の可変領域の遺伝子の系列のＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト系列の配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃｃｏ８．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ ）から得られ、およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａら，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版から見つける。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体では、ＣＤＲはマウスのＣＤＲで、配列番号４または８で示される軽鎖可変領域の一つまたは複数のＣＤＲ、あるいは配列番号２または６で示される重鎖可変領域の一つまたは複数のＣＤＲから選ばれる。好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２のうちの３１番目〜３５番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１のうちの９１番目〜１０５番目で示され、
前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２のうちの５０番目〜６６番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１のうちの１４８番目〜１９８番目で示され、
前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号２のうちの９９番目〜１０９番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１のうちの２９５番目〜３２７番目で示され、
および、前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号４のうちの２４番目〜３８番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３のうちの７０番目〜１１４番目で示され、
前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４のうちの５４番目〜６０番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３のうちの１６０番目〜１８０番目で示され、
前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号４のうちの９３番目〜１０１番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３のうちの２７７番目〜３０３番目で示され、
あるいは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６のうちの３１番目〜３５番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５のうちの９１番目〜１０５番目で示され、
前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６のうちの５０番目〜６６番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５のうちの１４８番目〜１９８番目で示され、
前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号６のうちの９９番目〜１０９番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５のうちの２９５番目〜３２７番目で示され、
および／または、前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号８のうちの２４番目〜３４番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７のうちの７０番目〜１０２番目で示され、
前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８のうちの５０番目〜５６番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７のうちの１４８番目〜１６８番目で示され、
前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８のうちの８９番目〜９７番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７のうちの２６５番目〜２９１番目で示される。
ヒトの抗体の可変領域のフレームワークは選択されたもので、ここで、前記抗体の軽鎖可変領域における軽鎖ＦＲ配列は、ヒト軽鎖の、１）Ａ２、Ｂ３またはＯ１８のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域と、２）ＪＫ２またはＪＫ５のＦＲ４領域とを含むヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域の組み合わせ由来のもので、前記抗体の重鎖可変領域における重鎖ＦＲ配列は、ヒト重鎖配列の、１）ＶＨ３−４８、ＶＨ３−３０またはＶＨ３−１１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域と、２）ＪＨ６のＦＲ４領域を含むヒト抗体の重鎖フレームワーク領域の組み合わせ由来のものである。一般的に、ヒトレシピエントのフレームワーク領域の選択は、ドナーの抗体のフレームワーク領域と類似するか、あるいは可変領域サブファミリーの共通配列と最も類似するように行われる。移植後、ドナーおよび／またはレシピエントの配列において配列の突然変異をさせることによって、抗原の結合、機能性、コドンの使用、発現レベルなど、ヒト以外の残基のフレームワーク領域への導入を含む、最適化を行うことができる。
好ましくは、前記のヒト化抗ＴＰＢＧ 抗体は、少なくとも１つの重鎖可変領域および／または少なくとも１つの軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号２、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０で示され、前記の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号４、配列番号８、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号４２、配列番号４４または配列番号４６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ配列表における配列番号１、配列番号５、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号３９で示され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列表における配列番号３、配列番号７、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５で示されるか、
あるいは、前記の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号２、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記の軽鎖可変領域の配列は配列表における配列番号４、配列番号８、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号４２、配列番号４４または配列番号４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、好ましくは、前記の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号１、配列番号５、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号３９で示されるヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列と８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、前記の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号３、配列番号７、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５で示されるヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列と８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列である。
好ましくは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２１で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２１で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号３１で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示される配列であるか、
あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示される配列である。
上記のように、上記アミノ酸配列の番号は表１−１に示される通りである。
ここで、表１−１における数字は、配列表における配列番号で、たとえばｈ１２Ｂ１２−１の重鎖タンパク質の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１８で、ｈ１２Ｂ１２−１の軽鎖タンパク質の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２６である。
前記のヒト化抗ＴＰＢＧ−１３抗体、好ましくは抗体の全長タンパク質、抗原抗体の結合ドメインのタンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）および単一領域抗体（Ｓｉｇｎｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）のうちの一つまたは複数、ならびに上記抗体で製造されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術などを含む、多くのアプローチおよび技術によって研究・製造することができるが、ハイブリドーマ技術によって野生型または遺伝子組み換えマウスからモノクローナル抗体を調製するのは主流である。また、本発明はスーパーヒト化抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）なども含む。
前記の抗体全長タンパク質は本分野の通常の抗体全長タンパク質で、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含む。
好ましくは、前記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体は、ヒト由来抗体の重鎖定常領域および／またはヒト由来抗体の軽鎖定常領域も含む。前記の重鎖可変領域および軽鎖可変領域はヒト由来の重鎖定常領域およびヒト由来の軽鎖定常領域と、全ヒト化抗体の全長タンパク質を構成する。ここで、前記のヒト化抗体の重鎖定常領域は本分野の常識で、ヒト定常領域由来の定常領域を含んでもよく、さらにヒト由来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントの重鎖定常領域を含む。前記のヒト化抗体の軽鎖定常領域は本分野の常識で、ヒト定常領域由来の定常領域を含んでもよく、さらにヒト由来のκ鎖、λ鎖またはそのバリアントの軽鎖定常領域を含む。
前記の一本鎖抗体は本分野の通常の一本鎖抗体で、前記の重鎖可変領域、軽鎖可変領域および１５〜２０個アミノ酸の短鎖ペプチドを含む。
前記の抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片は、本分野の通常の抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片で、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域および重鎖定常領域のＦｄ断片を含む。好ましくは、前記の抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片はＦａｂおよびＦ（ａｂ’）である。
前記の単一ドメイン抗体は本分野の通常の単一ドメイン抗体で、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
前記の単一領域抗体は本分野の通常の単一領域抗体で、重鎖可変領域のみを含む。
ここで、前記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体の製造方法は本分野の通常の製造方法である。前記製造方法は、好ましくは、当該ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体を組み換え発現する発現形質転換体から分離すること、またはタンパク質配列を人工合成することによって得るものである。前記の当該ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体を組み換え発現する発現形質転換体から分離することによって得る方法は、好ましくは、前記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体をコードする核酸分子を組み換えベクターにクローニングし、得られた組み換え発現形質転換体を培養し、分離・精製して前記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体を得るものである。本発明の代表的なヒト化抗ＴＰＢＧ抗体の製造は実施例１に記載されている。
ヒト化抗体は広義的にキメラ抗体でもあり、中では、抗原結合の役割を担う可変領域の残基は、ヒト以外の種からの相補性決定領域、短縮された相補性決定領域、または抗原結合に関与する任意のほかの残基を含み、またほかの可変領域の残基、たとえばフレームワーク領域の残基および定常領域の少なくとも一部はヒト抗体の配列由来のものである。ヒト化抗体のフレームワーク領域の残基および定常領域の残基の一つの部分集合はヒト以外の由来でもよい。ヒト化抗体の可変領域は、ヒト化の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域とも記述される。ヒト以外の種は、一般的に、抗原によって免疫接種するための種で、たとえばマウス、ラット、ウサギ、ヒト以外の霊長類、またはほかのヒト以外の哺乳動物種が挙げられる。ヒト化抗体は、一般的に、従来のキメラ抗体よりも免疫原性が低く、かつヒトに施用されると、改善された安定性を示す。
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原結合に関与する抗体の可変領域の残基である。通常のＣＤＲを標識するための番号付けシステムはいくつかあり、たとえばＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義やＡｂＭ定義が含まれる。要約すると、Ｋａｂａｔ定義は配列の変異性に基づいたもので、Ｃｈｏｔｈｉａ定義はループ構造の位置に基づいたもので、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの方法の間の折衷のものである。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｂＭアルゴリズムによると、軽鎖可変領域は３つのＣＤＲ領域を有し、そのＣＤＲ１は２４〜３４番目のアミノ酸（ＣＤＲ１−Ｌ）、ＣＤＲ２は５０〜５６番目のアミノ酸（ＣＤＲ２−Ｌ）、ＣＤＲ３は８９〜９７番目のアミノ酸（ＣＤＲ３−Ｌ）に位置する。可変領域の長さによって、異なる中枢または異なるサブグループにおいて、２７番目は１〜６個のアミノ酸が、９５番目も１〜６個のアミノ酸があり、これらは元の番号にアルファベットを加えて番号を付け、たとえば２７Ａ、２７Ｂ、９５Ａ、９５Ｂなどになる。Ｋａｂａｔ定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲは３１と３５Ｂ番目（ＣＤＲ１−Ｈ） 、５０と６５番目（ＣＤＲ２−Ｈ）、および９５と１０２番目（ＣＤＲ３−Ｈ）の残基で定義される（Ｋａｂａｔ番号による）。Ｃｈｏｔｈｉａ定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲは２６と３２番目（ＣＤＲ１−Ｈ） 、５２と５６番目（ＣＤＲ２−Ｈ）、および９５と１０２番目（ＣＤＲ３−Ｈ）の残基で定義される（Ｃｈｏｔｈｉａ番号による）。ＡｂＭ定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲは２６と３５Ｂ番目（ＣＤＲ１−Ｈ） 、５０と５８番目（ＣＤＲ２−Ｈ）、および９５と１０２番目（ＣＤＲ３−Ｈ）の残基で定義される（Ｋａｂａｔ番号による）。軽鎖可変領域と同じように、３５番目、５２番目、８２番目および１００番目も複数のアミノ酸があり、Ａ、Ｂ、Ｃ…などで番号を付けられる。Ｍａｒｔｉｎら（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ９２６８−９２７２； Ｍａｒｔｉｎ ら（１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０３： １２１−１５３； Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（ １９９２ ） ｌｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ １： １２６； Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， 第１４１−１７２頁を参照する。
特異性決定残基（ＳＤＲ）は抗原と直接相互作用するＣＤＲにおける残基である。ＳＤＲは高度可変残基に該当する。Ｐａｄｌａｎら（ １９９５） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９： １３３−１３９）を参照する。
フレームワークの残基は軽鎖可変領域または重鎖可変領域の一部で、高度可変残基（高度可変残基は相補性決定領域またはＣＤＲを指すことが多い）またはＣＤＲの残基以外の抗体の可変領域の残基で、当該可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）の支持体として作用する。フレームワークの残基は自然に存在するヒトの抗体からのものでもよいが、たとえばマウス由来抗体ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２または２８Ｄ４のフレームワーク領域とほぼ類似するヒト抗体のフレームワーク領域が挙げられる。また、代表的な個体の配列の間の共通配列のフレームワーク領域の人工配列を使用することもできる。ヒト化するためのフレームワークを選択する時、ヒトで幅広く見られる配列はよく見られない配列よりも好適かもしれない。ヒトフレームワークのレシピエントの配列のほかの突然変異を発生させることによって、抗原の接触に関わるとされているマウス残基および／または抗原結合部位の構造完全性に関わる残基を回復させるか、あるいは抗体の発現を改善することができる。ペプチドの構造の予測はヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の分析に用いることによって、ヒト化の設計によって導入される翻訳後タンパク質修飾部位を同定・回避することができる。
前記のヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）のベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、グラフティング、短縮されたＣＤＲのグラフティング、特異性決定残基（ＳＤＲ）のグラフティングやＦｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎアセンブリを含む、様々な方法のうちのいずれかによって製造することができる。
前記のヒト化抗体はスーパーヒト化抗体も含み、それはヒト化抗体の製造方法で、当該方法はヒトフレームワーク配列を分析点としてはなく、ヒト以外の抗体の標準ＣＤＲ構造の形態とヒト抗体、特にヒト胚胎系配列がコードするヒト抗体のＣＤＲ構造の形態の比較によるもので、その中から適切なヒトフレームワーク配列の候補のヒト抗体配列を割り出すことができる。たとえば、ヒト残基はＣＤＲにおける非ヒト残基を置き換えることでき、その一つまたは複数の変化はすでにＣＤＲに導入されている。ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）の前提の一つは、マウス由来抗体の可変領域の免疫原性がその表面残基によるものであることで、かつ残基の可動性および溶媒露出度がその抗原決定基になる基本条件である。既存の抗体結晶の構造データの分析結果の統計によると、配列のマッチング部位において、ヒトとマウスの抗体の可変領域の残基の溶媒露出度分布に対する忠実度が９８％に達するということで、異種間で免疫反応を誘導する残基は残りの種特異性溶媒および表面残基によるものであることが示されている。そのため、マウス特異性の表面残基をヒト由来のものに置き換えると、ヒト由来抗体の表面プロフィールをシミュレートし、ヒト免疫系の認識を回避することによって、ヒト化の目的を実現させることができる。簡単に言うと、ベニヤリングはヒトアミノ酸配列で再構築される抗体の溶媒に露出する表面によってげっ歯類動物やほかのヒト以外の抗体における潜在的な免疫原性のアミノ酸配列を減少するという概念である。Ｐａｄｌａｎ （ １９９１ ） Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８： ４８９−９８０を参照する。ヒト以外の抗体における表面に露出する溶媒露出性の残基の外来フレームワーク残基（前記残基はヒト抗体のフレームワーク領域における同位置にあるものとは異なる）を同定し、そしてヒト抗体における同位置にあるアミノ酸で同定された残基を置き換えることによって、ベニヤリングを行い、すなわち、ベニヤリングされた抗体は、その表面の残基は主にヒト由来配列で、内部に包まれる残基は主に最初のマウス由来配列である。ＣＤＲのグラフティングはドナー抗体（たとえばヒト以外の抗体）のＣＤＲでレシピエント抗体（たとえば必要なフレームワーク残基を含むヒト抗体またはほかの抗体）の一つまたは複数のＣＤＲを置き換えることによって行われる。レシピエント抗体は候補のドナー抗体とレシピエント抗体の間のフレームワーク残基の類似性に基づいて選択することができる。たとえば、Ｆｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ法によれば、関連するヒト以外の抗体の各フレームワーク領域と実質的に配列相同性を持つヒトフレームワーク領域を同定し、そしてヒト以外の抗体のＣＤＲをこれらの異なるヒトフレームワーク領域の複合体にグラフティングする。上記方法を合わせることによって、任意の必要な配列の抗ＴＰＢＧ抗体を生成することができる。
また、本発明は、上記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体をコードする核酸であって、前記重鎖可変領域をコードする核酸、および／または前記軽鎖可変領域をコードする核酸を含むものを提供する。
好ましくは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表における配列番号２、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表における配列番号１、配列番号５、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号３９で示され、前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表における配列番号３、配列番号７、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５で示される。
さらに好ましくは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２１で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表の配列番号３１で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２１で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示されるか、
あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示される。
上記のように、上記ヌクレオチド配列の番号は表１−２に示される通りである。
ここで、表１−２における数字は配列表おける配列番号で、たとえばｈ１２Ｂ１２−１の重鎖タンパク質の可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１７で、ｈ１２Ｂ１２−１の軽鎖タンパク質の可変領域のヌクレオチド配列は配列番号２５である。
前記核酸の製造方法は本分野の通常の製造方法で、好ましくは、遺伝子クローニング技術によって上記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体をコードする核酸分子を得るか、または全配列を人工的に合成する方法によって上記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体をコードする核酸分子を得る工程を含む。
当業者には、上記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体をコードする核酸に適当に置換、欠失、変更、挿入または添加を導入することによって一つのポリヌクレオチドのホモログを提供することができることがわかる。本発明において、ポリヌクレオチドのホモログは、当該ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体をコードする核酸の一つまたは複数のヌクレオチドに対して抗体の活性を保つ範囲で置換、欠失または添加を行うことによって調製することができる。
また、本発明は前記核酸を含む組み換え発現ベクターを提供する。
ここで、前記組み換え発現ベクターは本分野の通常の方法、すなわち、本発明に記載の核酸分子を様々な発現ベクターに連結して構築することによって得ることができる。前記の発現ベクターは本分野の通常の様々なベクターで、前記核酸分子を担持することができればよい。前記ベクターは好ましくは様々なプラスミド、コスミド、ファージやウイルスベクターを含む。
また、本発明は上記組み換え発現ベクターを含む組み換え発現形質転換体を提供する。
ここで、前記組み換え発現形質転換体の製造方法は本分野の通常の製造方法で、好ましくは、上記組み換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換させて得る方法である。前記の宿主細胞は本発明の通常の様々な宿主細胞で、上記組み換え発現形質転換体が安定して自己複製し、かつ担持される前記の核酸が有効に発現されるようにさせることができればよい。好ましくは、前記宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１またはＢＬ２１細胞（一本鎖抗体またはＦａｂ抗体を発現する）、またはＣＨＯ−Ｋ１細胞（全長ＩｇＧ抗体を発現する）である。前記組み換え発現プラスミドを宿主細胞に形質転換させれば、本発明の好適な組み換え発現形質転換体を得ることができる。ここで、前記形質転換方法は本発明の通常の形質転換方法、好ましくは化学的形質転換法、ヒートショック法または電気的形質転換法である。
さらに、本発明は上記組み換え発現ベクターを含む細胞または細胞系を提供する。好ましくは、前記の細胞は哺乳動物またはヒト細胞で、より好ましくはＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−ｌ細胞またはＣＯＳ細胞である。異種構築体を前記の細胞内に形質転換して安定細胞系の製造に使用する方法は本分野で既知のものである。前記の非哺乳動物の宿主細胞は昆虫細胞が好ましい（Ｐｏｔｔｅｒら，（１９９３） Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０（２−３） ： １０３−１１２） 。前記の抗体は遺伝子組み換え動物（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ （２００２） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＪ． １３（６）： ６２５−６２９）または遺伝子組み換え植物（Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇら，（２００３ ） Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ６０ （３） ： ４３３−４５）において製造してもよい。
また、本発明は、ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体の製造方法であって、上記組み換え発現形質転換体、または細胞、または細胞系を培養し、培養物からヒト化抗ＴＰＢＧ抗体を得る工程を含む方法を提供する。
また、本発明は、共役的に細胞毒剤に連結した上記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体を含む免疫複合体を提供する。
好ましくは、前記の免疫複合体において、上記の１当量のタンパク質はｘ当量のリンカーを介してｙ当量の細胞毒剤に連結し、式１の構造を有する。
（ただし、Ａｂは上記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体で、Ｌはリンカーで、Ｄは細胞毒剤で、前記ｘは本分野の通常の架橋度で、ｘは自然数で、好ましくは１〜２０の整数で、ｙは０または自然数で、好ましくは０〜２０の整数で、ｘおよびｙはそれぞれ独立に１〜２、または２〜４、または３〜５、または４〜８、または８〜２０的整数が好ましく、ｘとｙの比率は１：１が好ましい。）
前記Ｌは本分野の通常のリンカー（架橋剤またはカップリング剤とも呼ばれる）である。前記Ｌは２つの官能基、すなわち、抗体と反応する基と、薬物と反応する基（たとえば、アルデヒドまたはケトン）を含む。
薬物はリンカー分子を介して上記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体と複合する。前記Ｌは、細胞に入ると放出され、活性エステル、炭酸塩類、カルバメート類、イミンリン酸エステル、オキシム類、ヒドラゾン類、アセタール類、オルトエステル類、アミノ類、短鎖ペプチド断片またはヌクレオチド断片のような官能基を含むが、これらに限定されない。
好ましくは、前記Ｌは主に式２の構造を含み、Ｌから脱離基が脱離した、相応する残りの部分である。
（ただし、Ａｌｋ1およびＡｌｋ2は独立に結合または分岐または無分岐の（Ｃ1−Ｃ10）アルキレン鎖で、Ｓｐ1は−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＲ’−、−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2）2Ｎ−、または−Ｘ−Ａｒ’−Ｙ−（ＣＨ2）n−Ｚで、ここで、Ｘ、ＹおよびＺは独立に結合、−ＮＲ’−、−Ｓ−または−Ｏ−で、条件はｎ＝０の場合、ＹおよびＺのうちの少なくとも１つが必ず結合であることで、かつＡｒ’は（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ基、（Ｃ1−Ｃ4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’または−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’のうちの１、２または３個の基で任意に置換された１，２−、１，３−または１，４−フェニレン基で、ｎは０〜５の整数で、条件はＡｌｋ1が結合の場合、Ｓｐ1は結合であることで、Ｒ’は−ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ基、（Ｃ1−Ｃ4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、（Ｃ1−Ｃ3）ジアルキルアミノ基、または（Ｃ1−Ｃ3）トリアルキルアンモニウム−Ａのうちの１個または２個の基で任意に置換された分岐または無分岐の（Ｃ1−Ｃ5）鎖で、ここで、Ａは塩を形成する薬学的に許容されるアニオンで、Ａｒは（Ｃ1−Ｃ6）アルキル基、（Ｃ1−Ｃ5）アルコキシ基、（Ｃ1−Ｃ4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’’または−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’のうちの１、２または３個の基で任意に置換された１，２−、１，３−または１，４−フェニレン基で、ここで、ｎおよびＲ’は上記の定義の通りであるか、あるいはＡｒは１，２−、１，３−、１，４−、１，５−、１，６−、１，７−、１，８−、２，３−、２，６−または２，７−ナフチレン基で、ここで、ナフチレン基またはフェノチアジンはそれぞれ任意に（Ｃ1−Ｃ6）アルキル基、（Ｃ1−Ｃ5）アルコキシ基、（Ｃ1−Ｃ4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、または−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’のうちの１、２、３または４個の基で置換され、ここで、ｎおよびＲ’は上記の定義の通りで、条件はＡｒがフェノチアジンの場合、Ｓｐ1は窒素のみと連結する結合であることである。
Ｓｐ2は結合、−Ｓ−または−Ｏ−で、条件はＡｌｋ2が結合の場合、Ｓｐ2は結合であることである。
Ｚ1はＨ、（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基、あるいは（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基、（Ｃ1−Ｃ5）アルコキシ基、（Ｃ1−Ｃ4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’または−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’のうちの１、２、または３個の基で任意に置換されたフェニル基で、ここで、ｎおよびＲ’は上記の定義の通りである。
Ｓｐは直鎖または分岐鎖の２価または３価の（Ｃ1−Ｃ18）基、２価または３価のアリール基またはヘテロアリール基、２価または３価の（Ｃ3−Ｃ18）シクロアルキル基またはヘテロシクロアルキル基、２価または３価のアリールまたはヘテロアリール−アリール（Ｃ1−Ｃ18）基、２価または３価のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル−アルキル（Ｃ1−Ｃ18）基、あるいは２価または３価の（Ｃ2−Ｃ18）不飽和のアルキル基で、ここで、ヘテロアリール基はフリル基、チエニル基、Ｎ−メチルピロリル基、ピリジル基、Ｎ−メチルイミダゾリル基、オキサゾリル基、ピリミジニル基、キノリニル基、イソキノリニル基、Ｎ−メチルカルバゾリル基、アミノクマリン基、またはフェナジリル基が好ましく、かつ、ここで、Ｓｐが３価の基である場合、Ｓｐはさらに低級（Ｃ1−Ｃ5）ジアルキルアミノ基、低級（Ｃ1−Ｃ5）アルコキシ基、ヒドロキシ基、または低級（Ｃ1−Ｃ5）アルキルチオ基で任意に置換されてもよく、かつＱは＝ＮＨＮＣＯ−、＝ＮＨＮＣＳ−、＝ＮＨＮＣＯＮＨ−、＝ＮＨＮＣＳＮＨ−または＝ＮＨＯ−である。）
好ましくは、Ａｌｋ1は分岐または無分岐の（Ｃ1−Ｃ5）アルキレン鎖で、Ｓｐ1は結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−または−ＮＲ’で、ここで、Ｒ’は上記の定義の通りで、条件はＡｌｋ1が結合の場合、Ｓｐ1は結合であることである。
Ａｒは（Ｃ1−Ｃ6）アルキル基、（Ｃ1−Ｃ5）アルコキシ基、（Ｃ1−Ｃ4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’または−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’のうちの１、２または３個の基で任意に置換された１，２−、１，３−または１，４−フェニレン基で、ここで、ｎおよびＲ’は上記の定義の通りであるか、あるいはＡｒはそれぞれＣ1−Ｃ6）アルキル基、（Ｃ1−Ｃ5）アルコキシ基、（Ｃ1−Ｃ4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’または−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’のうちの１、２、３または４個の基で任意に置換された１，２−、１，３−、１，４−、１，５−、１，６−、１，７−、１，８−、２，３−、２，６−または２，７−ナフチレン基である。
Ｚ1は（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基、あるいは（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基、（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ基、（Ｃ1−Ｃ4）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’または−Ｓ（ＣＨ2）nＣＯＮＨＲ’のうちの１、２、または３個の基で任意に置換されたフェニル基で、Ａｌｋ2およびＳｐ2はいずれも結合で、かつＳｐおよびＱは上記のみで定義された通りである。上記の結合の意味は共役結合である。
前記Ｌはマレイミドカプロイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ、ＭＣ）、マレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ）または４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）が好ましい。
前記Ｄは本分野の通常の細胞毒剤で、好ましくは細胞毒素、化学治療剤、放射性同位元素、治療性核酸、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤・アポトーシス促進剤または細胞溶解酵素から選ばれる。
ここで、前記細胞毒素は本分野の通常の細胞毒素で、一般的に細胞の機能を抑制または阻害し、かつ／または細胞の破壊につながる活性剤である。好ましくは抗生物質、チューブリン重合の阻害剤、アルキル化剤、タンパク質合成阻害剤、タンパク質キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼまたはサイクリンから選ばれる。より好ましくはドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、カルビシン、ノガラマイシン、メノガリル、ピラルブシン、バルルビシン、アザシチジン、ゲムシタビン、トリフルリジン、アンシタビン、エノシタビン、アザシチジン、ドキシフルリジン、ペントスタチン、ブロモウリジン、カペシタビン、クラドリビン、デシタビン、フロクスウリジン、フルダラビン、グーゲロチン、ピューロマイシン、テガフール、チアゾフリン、アドリアマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ナイトロジェンマスタード、プレドニゾン、プロカルバジン、メトトレキサート、フルオロウラシル、エトポシド、タキソール、タキソール類似体、プラチン類（たとえばシスプラチンやカルボプラチン）、マイトマイシン、チオテパ、タキサン、ダウノルビシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、タモキシフェン、ドラスタチン、オーリスタチンおよびその誘導体、ヘミアステルリン、エスペラミシンまたはマイタンシン系化合物から選ばれ、最も好ましくはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−３−チオ−１−オキソプロピルマイタンシン（ＤＭ１）から選ばれる。
中では、前記化学治療剤は本分野の通常の化学治療剤で、好ましくはアルキル化剤、アルキルスルホネート系化学治療剤、アジリジン系化学治療剤、ビニルアミド系およびメチルメラミン系化学治療剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロ尿素系化学治療剤、抗生物質、抗代謝物、葉酸系化学治療剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、アンドロゲン、抗アドレナリン薬、葉酸補充剤、マイタンシノール、多糖複合体、タキサン、プラチン類似体またはレチノイド、あるいは、その薬学的に許容される塩、酸および誘導体から選ばれる。
前記のアルキル化剤は本分野の通常のアルキル化剤で、好ましくはチオテパまたはシクロホスファミドから選ばれる。前記のアルキルスルホネート系化学治療剤は本分野の通常のアルキルスルホネート系化学治療剤で、好ましくはブスルファン、インプロスルファンまたはピポスルファンから選ばれる。前記のアジリジン系化学治療剤は本分野の通常のアジリジン系化学治療剤で、好ましくはベンゾドーパ、カルボコン、メツレデパまたはウレデパから選ばれる。前記ビニルアミド系およびメチルメラミン系化学治療剤は本分野の通常のビニルアミド系およびメチルメラミン系化学治療剤で、好ましくはアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスファミド、トリエチレンチオホスファミドまたはトリメチロールメラミンから選ばれる。前記のナイトロジェンマスタードは本分野の通常のナイトロジェンマスタードで、好ましくはクロラムブシル、クロルナファジン、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、イホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メチロールエタノオキシド、フェニルアラニンマスタード、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミドまたはウラシルマスタードから選ばれる。前記ニトロ尿素系化学治療剤は本分野の通常のニトロ尿素系化学治療剤で、好ましくはカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンまたはラニムスチンから選ばれる。前記抗生物質は本分野の通常の抗生物質で、好ましくはアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシンｃ、カリケアミシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトロルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシ、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、 ジノスタチンまたはゾルビシンから選ばれる。前記の抗代謝物は本分野の通常の抗代謝物で、好ましくはメトトレキセートまたは５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）から選ばれる。前記の葉酸系化学治療剤は本分野の通常の葉酸系化学治療剤で、好ましくはデノプテリン、プテロプテリンまたはトリメトレキセートから選ばれる。前記のプリン類似体は本分野の通常のプリン類似体で、好ましくはフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリンまたはチオグアニンから選ばれる。前記のピリミジン類似体は本分野の通常のピリミジン類似体で、好ましくはアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンまたは５−ＥＵから選ばれる。前記のアンドロゲンは本分野の通常のアンドロゲンで、好ましくはカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタンまたはテストラクトンから選ばれる。前記の抗アドレナリン薬は本分野の通常の抗アドレナリン薬で、好ましくはアミノグルテチミド、ミトタンまたはトリロスタンから選ばれる。前記の葉酸補充剤は本分野の通常の葉酸補充剤で、好ましくはフロリン酸、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、アムサクリン、アトリムスチン、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジダジコン、エルフォルニシン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナンまたはロニダミンから選ばれる。前記のマイタンシノールは本分野の通常のマイタンシノールで、好ましくはマイタンシン、アンサマイトシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジドまたはプロカルバジンから選ばれる。前記の多糖複合体は本分野の通常の多糖複合体で、好ましくはラゾキサン、リゾマイシン（ｒｈｉｚｏｍｙｃｉｎ）、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジクオン、２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン系マイコトキシン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド、シクロホスファミドまたはチオテパから選ばれる。より好ましくはＴ−２トキシン、ムコノマイシンＡ、シクロスポリンＡまたはアングイジンから選ばれる。前記タキサンは本分野の通常のタキサンで、好ましくはタキソール、非水添ヒマシ油、タキソールのアルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、ドセタキセル、クロラムブシル、ゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリンまたはメトトレキセートから選ばれる。前記のプラチン類似体は本分野の通常のプラチン類似体で、好ましくはシスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ノバントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎ）、テニポシド、エダトラキサート、ダウノマイシン、アミノプテリン、カペシタビン、イバンドロネート、ＣＰＴ−１１、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００またはジフルオロメチルオルニチンから選ばれる。前記のレチノイドは本分野のレチノイドで、好ましくはレチノイン酸である。
ここで、前記放射性同位元素は本分野の通常の放射性同位元素で、好ましくは上記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体と直接結合したもの、またはキレート剤を介して上記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体と結合したものである。より好ましくは上記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体のシステイン残基と直接結合したものである。好ましくは、前記放射性同位元素は放射線治療に適するα放出体、β放出体やオージェ電子および診断に適する陽電子放出体やγ放出体から選ばれる。より好ましくは前記放射性同位元素はフッ素１８（18Ｆ）、銅６４（64Ｃｕ）、銅６５（65Ｃｕ）、ガリウム６７（67Ｇａ）、ガリウム６８（68Ｇａ）、臭素７７（77Ｂｒ）、臭素８０ｍ（80mＢｒ）、ルテニウム９５（95Ｒｕ）、ルテニウム９７（97Ｒｕ）、ルテニウム１０３（103Ｒｕ）、ルテニウム１０５（105Ｒｕ）、テクネチウム９９ｍ（99mＴｃ）、水銀１０７（107Ｈｇ）、水銀２０３（203Ｈｇ）、ヨウ素１２３（123Ｉ）、ヨウ素１２４（124Ｉ）、ヨウ素１２５（125Ｉ）、ヨウ素１２６（126Ｉ）、ヨウ素１３１（131Ｉ）、ヨウ素１３３（133Ｉ）、インジウム１１１（111Ｉｎ）、インジウム１１３（113Ｉｎ）、レニウム９９ｍ（99mＲｅ）、レニウム１０５（105Ｒｅ）、レニウム１０１（101Ｒｅ）、レニウム１８６（186Ｒｅ）、レニウム１８８（188Ｒｅ）、テルル１２１ｍ（121mＴｅ）、テルル１２１ｍ（99mＴｅ）、テルル１２２ｍ（122mＴｅ）、テルル１２５ｍ（125mＴｅ）、ツリウム１６５（165Ｔｍ）、ツリウム１６７（167Ｔｅ）、ツリウム１６８（168Ｔｅ）、イットリウム９０（90Ｙ）、ビスマス２１３（213Ｂｉ）、亜鉛２１３（213鉛）またはアクチニウム２２５（225Ａｃ）、あるいはこれらから誘導される窒化物または酸化物から選ばれる。
ここで、前記治療性核酸は本分野の通常の核酸で、好ましくは免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤・アポトーシス促進剤をコードする遺伝子。前記治療剤は、前記治療剤、その誘導体ならびに前記治療剤の薬学的に許容される塩、酸および誘導体を含む。
ここで、前記の免疫調節剤は本分野の通常の免疫調節剤で、すなわち、液性免疫応答（たとえば抗原特異性抗体の生成）および細胞を介する免疫応答（たとえばリンパ球の増殖）を含む免疫応答を引き起こす試薬である。好ましくはサイトカイン、成長因子、ホルモン、抗ホルモン薬、免疫抑制剤またはコルチコステロイドから選ばれる。前記サイトカインは本分野の通常のサイトカインで、好ましくはキサンチン、インターロイキンまたはインターフェロンから選ばれる。前記成長因子は本分野の通常の成長因子で、好ましくはＴＮＦ、ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦから選ばれる。前記のホルモンは本分野の通常のホルモンで、好ましくはエストロゲン、アンドロゲンまたはプロゲスチンから選ばれる。より好ましくは前記のエストロゲンはスチルベストロールまたはエストラジオールである。より好ましくは前記のアンドロゲンはテストステロンまたはフルオキシメステロンである。より好ましくは前記のプロゲスチンは酢酸メゲストロールまたは酢酸メドロキシプロゲステロンである。前記のコルチコステロイドは本分野の通常のコルチコステロイドで、好ましくはプレドニゾン、デキサメタゾンまたはヒドロコルチゾンから選ばれる。前記抗ホルモン薬は本分野の通常の抗ホルモン薬で、ホルモンの腫瘍に対する作用を遮断し、サイトカインの生成を抑制し、自身の抗原発現を下方調節するか、ＭＨＣ抗原を遮断することができる免疫抑制剤である。好ましくは抗エストロゲン薬、抗アンドロゲン薬または抗アドレナリン薬から選ばれる。より好ましくは前記抗エストロゲン薬はタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェンまたはトレミフェンから選ばれる。前記抗アンドロゲン薬はフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドまたはゴセレリンから選ばれる。前記免疫抑制剤は本分野の通常の免疫抑制剤で、好ましくは２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン系、アザチオプリン、シクロホスファミド、ブロモクリプチン、ダナゾール、ダプソン、グルタルアルデヒド、ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体、シクロスポリンＡ、糖質コルチコステロイドのようなステロイド、ストレプトキナーゼ、ＴＧＦβ、ラパマイシン、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体断片、サイトカイン受容体拮抗剤またはＴ細胞受容体抗体から選ばれる。より好ましくは前記サイトカイン受容体拮抗剤は抗インターフェロン抗体、抗ＩＬ１０抗体、抗ＴＮＦα抗体または抗ＩＬ２抗体から選ばれる。
中では、前記の抗血管新生剤は本分野の通常の抗血管新生剤で、好ましくはファルネシル基転移酵素阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ｂＦＧＦ阻害剤、ステロイドスルファターゼ阻害剤、インターロイキン−２４、トロンボスポンジン、メタロスポンジン（ｍｅｔａｌｌｏｓｐｏｎｄｉｎ）タンパク質、Ｉ型インターフェロン、インターロイキン−１２、プロタミン、アンギオスタチン、ラミニン、エンドスタチンまたはプロラクチン断片から選ばれる。より好ましくは２−メトキシエストラジオールビススルファメート（２−ＭｅＯＥ２ｂｉｓＭＡＴＥ）である。
ここで、前記抗増殖剤・アポトーシス促進剤は本分野の通常の抗増殖剤・アポトーシス促進剤で、好ましくはＰＰＡＲ−γ作動剤、レチノイド、トリテルペン系化合物、ＥＧＦ受容体阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、テロメアターミナルトランスフェラーゼ阻害剤、鉄キレート剤、アポプチン、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）の阻害剤、ＴＮＦ−α／ＦＡＳリガンド／ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドおよびそのシグナル伝達の活性化物またはＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ生存経路シグナル阻害剤から選ばれる。前記ＰＰＡＲ−γ作動剤は本分野の通常のＰＰＡＲ−γ作動剤で、好ましくはシクロペンテノンプロスタグランジン（ｃｙＰＧ）である。前記トリテルペン系化合物は本分野の通常のトリテルペン系化合物で、好ましくはシクロアルタン、ルピナン、ウルサン、オレアナン、フリーデラン、ダンマラン、ククルビタシン、リモニン類似体またはトリテルペン系化合物から選ばれる。前記ＥＧＦ受容体阻害剤は本分野の通常の受容体阻害剤で、好ましくはＨＥＲ４、ラパマイシンまたは１，２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ）から選ばれる。前記の鉄キレート剤は本分野の通常の鉄キレート剤で、好ましくは３−アミノピリジン−２−カルボアルデヒドチオセミカルバゾンである。前記のアポプチンは本分野の通常のアポプチンで、好ましくは鶏貧血ウイルスのウイルスタンパク質３−ＶＰ３である。前記ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ生存経路シグナル阻害剤は本分野の通常のＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ生存経路シグナル阻害剤で、好ましくはＵＣＮ−０１またはゲルダナマイシンである。
ここで、前記細胞溶解酵素は本分野の通常の細胞溶解酵素で、好ましくはリボヌクレアーゼである。
本発明において、式１では、ｘ＝ｙ＝ｎであることが好ましい。よって、
一つの好適な実施例において、−（Ｌ）x−（Ｄ）yは、
で、ここで、ｍは１〜１０で、好ましくはｍは５で、すなわち、マレイミドカプロイル（ＭＣ）である。
一つの好適な実施例において、−（Ｌ）x−（Ｄ）yは、
である。
一つの好適な実施例において、−（Ｌ）x−（Ｄ）yは、
である。
最も好ましくは、前記Ｄはチューブリン重合阻害剤であるモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）で、かつ前記リンカーＬはマレイミドカプロイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ、ＭＣ）で、前記免疫複合体の構造は式３で表される。
ここで、ｍＡｂは上記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体である。
あるいは、前記Ｌは４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミドエステルで、ＤはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−３−チオ−１−オキソプロピルマイタンシン（ＤＭ１）で、前記免疫複合体の構造は式４で表され、
あるいは、前記Ｌはマレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルアルコールで、ＤはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）で、前記免疫複合体の構造は式５で表される。
ここで、ｎは自然数で、好ましくは１〜２０の整数で、より好ましくは１〜２、または２〜４、または３〜５、または４〜８、または８〜２０の整数である。
前記の免疫複合体の製造方法は本分野の通常のもので、好ましくはＤｏｒｏｎｉｎａ，２００６， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７，１１４−１２４に記載の製造方法を使用する。好ましくは前記の製造方法によって１０％未満と最低限の低複合画分（ＬＣＦ、ｌｏｗ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を有する免疫複合体が生成する。
本発明の一つの好適な実施例において、前記の製造方法は、上記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体をｐＨが６．５〜８．５のホウ酸ナトリウム緩衝液で透析した後、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）をＴＣＥＰと上記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体のモル比が２〜１０になるように入れ、室温で１〜４時間還元させ、反応液Ａを得る工程と、反応液Ａから余分の上記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体を除去して反応液Ｂを得る工程と、反応液ＢにＭＣ−ＭＭＡＦを、ＭＣ−ＭＭＡＦと精製されたヒト化抗ＴＰＢＧ抗体のモル比が５〜２０になるように入れ、１０〜３７℃で４時間反応させる工程とを含む。
前記の免疫複合体は本分野で既知の任意の物理的形態で存在してもよいが、清澄な溶液が好ましい。
また、本発明は、上記の免疫複合体と、薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物を提供する。好ましくは前記の薬物組成物は、さらに、ほかの抗腫瘍抗体、たとえば癌の免疫・循環の過程における標的に対するほかの抗体を活性成分として含み、前記のほかの抗体は抗ＰＤ−１抗体が好ましい。ここで、癌の免疫・循環は、具体的に、（死亡）癌細胞からの抗原の放出、腫瘍抗原の提示、始動および活性化、Ｔ細胞の腫瘍部位への輸送、Ｔ細胞の腫瘍への浸潤、Ｔ細胞の癌細胞に対する認識および癌細胞の殺滅を含む（詳細はＣｈｅｎ Ｄ Ｓ， Ｍｅｌｌｍａｎ Ｉ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｍｅｅｔｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ−Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｃｙｃｌｅ［Ｊ］． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ２０１３， ３９（１）：１−１０．を参照する）。本発明における免疫複合体ＡＤＣは癌の免疫・循環における第１段階［（死亡）癌細胞の抗原の放出］で作用を発揮し、抗ＰＤ−１抗体は癌の免疫・循環における第７段階（癌細胞の殺滅）で作用を発揮する。
前記の薬学的に許容される担体は本分野の通常の担体で、前記の担体は任意の適切な生理学的にまたは薬学的に許容される薬物助剤でもよい。前記の薬物助剤は本分野の通常の薬物助剤で、好ましくは薬学的に許容される賦形剤、充填剤または希釈剤などを含む。より好ましくは、前記の薬物組成物は０．０１〜９９．９９％の上記ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体および０．０１〜９９．９９％の薬用担体を含み、前記百分率は前記薬物組成物で占める質量百分率である。
本発明に記載の薬物組成物の投与経路は胃腸外投与、注射投与または経口投与が好ましい。前記注射投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射または皮下注射などの経路を含むことが好ましい。前記の薬物組成物は本分野の通常の様々な剤形で、好ましくは固体、半固体または液体の様態で、水溶液、非水溶液または懸濁液でもよく、より好ましくは錠剤、カプセル、顆粒剤、注射剤または輸液剤などである。より好ましくは血管内、皮下、腹膜内または筋肉内で施用される。好ましくは前記薬物組成物はエアゾール剤または噴霧剤として、すなわち、経鼻で施用されてもよい。あるいは、鞘内、髄内または心室内で施用されてもよい。より好ましくは前記の薬物組成物は皮膚透過、経皮、局部、腸内、膣内、舌下または経直腸で施用されてもよい。
本発明に係る化合物の投与量のレベルは必要な診断または治療の結果に達するような組成物の量によって調整することができる。施用プランは単回の注射または多回の注射でもよく、あるいは調整してもよい。選択される投与量のレベルおよびプランは前記薬物組成物の活性および安定性（すなわち、半減期）、製剤、施用経路、ほかの薬物または治療との組み合わせ、検出および／または治療される疾患または病症、ならびに治療される被験者の健康状況および以前の医療歴などを含む様々な要素によって合理的に調整される。
本発明の前記薬物組成物の治療有効投与量は、最初に細胞培養実験または動物モデル、たとえばげっ歯類動物、ウサギ、イヌ、ブタおよび／または霊長類動物において見積もることができる。動物モデルは適切な施用の濃度範囲および経路の測定にも使用することができる。その後、ヒトにおいて施用される有用な投与量および経路を決めるのに使用してもよい。一般的に、施用有効量または投与量の決定と調整およびいつ、そしてどのようにこのような調整をするかという評価は当業者に既知のものである。
組み合わせ治療法について、上記ヒト化ＴＰＢＧ抗体、上記免疫複合体および／またはほかの治療剤または診断剤はそれぞれ単一の薬剤として、予期の治療または診断に適する任意の時間範囲内で使用してもよいが、前記治療剤または診断剤は、ほかの抗腫瘍抗体、たとえば癌の免疫・循環の過程における標的に対するほかの抗体でもよく、前記の抗体は抗ＰＤ−１抗体が好ましい。そのため、これらの単一の薬剤は基本的に同時に（すなわち、単一の製剤としてまたは数分間や数時間内で）または順番に連続的に施用してもよい。たとえば、これらの単一の薬剤は一年内、あるいは１０、８、６、４または２か月内、あるいは４、３、２、または１週間内、あるいは５、４、３、２または１日内で施用してもよい。
製剤、投与量、施用プランおよび測量可能な治療結果の別途の指導は、Ｂｅｒｋｏｗら、（２０００）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（メルクマニュアル医学百科）およびＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．， Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ； Ｅｂａｄｉ （１９９８） ＣＲＣ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（臨床薬理学マニュアル）などの著作を参照する。
本発明は、抗腫瘍薬物の製造における上記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体の使用を提供する。
本発明は、抗腫瘍薬物の製造における上記の免疫複合体の使用を提供する。
本発明は、抗腫瘍薬物の製造における上記の薬物組成物の使用を提供する。
上記の使用において、前記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体、前記の免疫複合体または前記の薬物組成物は、癌の免疫・循環の過程における標的に対する抗体と併用することが好ましく、前記の抗体は抗ＰＤ−１抗体が好ましい。
前記の腫瘍は通常の腫瘍で、好ましくはＴＰＢＧタンパク質を過剰発現する腫瘍で、より好ましくは肺扁平上皮癌・肺腺癌（非小細胞肺癌）、浸潤性乳癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、子宮頸部扁平上皮癌、浸潤性子宮内膜腺癌、浸潤性膵臓癌、卵巣癌、膀胱扁平上皮癌、絨毛癌、気管支癌、乳癌、子宮頸癌、膵臓癌または精嚢癌である。
また、本発明は、ＴＰＢＧタンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法であって、上記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体を被験サンプルと体外で接触させ、上記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体と前記被験サンプルの結合を検出する工程を含む方法を提供する。
前記の過剰発現の意味は本分野の通常のもので、好ましくは被験サンプルにおいて、細胞をローサイトメトリーによって検出すると、上記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値がサブタイプＩｇＧのＭＦＩ値の３倍以上であるということである。
前記結合の検出手段は本分野の通常の検出手段、好ましくはＦＡＣＳによる検出である。
本発明に記載の「ＴＰＢＧ陽性」の細胞は、ＴＰＢＧタンパク質を過剰発現する細胞、たとえばＮＣＩ−Ｈ１５６８細胞株である。反対に、「ＴＰＢＧ陰性」の細胞と呼ばれ、たとえば腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｈ１７７０が挙げられる。
本分野の常識に合うことを前提に、上記各好適な条件を任意に組み合わせれば、本発明の各好適な実例が得られる。
本発明で用いられる試薬および原料はいずれも市販品として得られる。
本発明の積極的な進歩効果は以下の通りである。本発明に係るＴＰＢＧ抗体はヒト化抗体で、ヒトＴＰＢＧ抗原に対して少なくとも約１×１０-7 Ｍ〜約１×１０-12 Ｍの結合親和力を有し、前記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体およびその複合体は、体内においてＴＰＢＧ発現細胞を標的とする特異的結合を示すこともできる。本発明のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体は、タンパク質レベルおよび細胞レベルでＴＰＢＧタンパク質受容体の細胞外領域に結合することができる。前記のヒト化ＴＰＢＧ抗体がＭＣ−ＭＭＡＦのような小分子化合物と複合して複合体を得ると、前記複合体は有効にＴＰＢＧ陽性細胞に対して細胞毒性の殺傷作用を果たすことができる。また、ヒト化ＴＰＢＧ抗体は小分子化合物、たとえばＭＭＡＦを飲食作用によって細胞に持ち込み、そして細胞内で分解して小分子化合物を放出することで、細胞毒性の殺傷作用を果たすことができる。そのため、前記のヒト化ＴＰＢＧ抗体は抗体複合薬の製造に使用すると、有効に腫瘍細胞を殺傷し、腫瘍の治療に有用である。たとえば、抗ＰＤ−１抗体と併用して治療すると、顕著にマウスの生存期間を延ばし、かつ組み合わせ治療後、腫瘍が完全に緩和されたマウスは体内で免疫記憶が形成する。また、複合抗体は高いクリアランス、低い消失半減期および曝露量を示し、非小細胞肺癌患者から誘導された異種移植腫瘍ＰＤＸのマウス体内における成長に顕著な抑制作用がある。
図１はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２重鎖可変領域ｈ１２Ｂ１２．ＶＨ１およびそのバリアントと１２Ｂ１２キメラ抗体ＶＨおよびヒトＶＨエクソンｈＶＨ３−４８／ＪＨ−６の配列の比較である。枠の箇所はＣＤＲである。 図２はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２重鎖可変領域ｈ１２Ｂ１２．ＶＨ２およびそのバリアントと１２Ｂ１２キメラ抗体ＶＨおよびヒトエクソンＶＨエクソンｈＶＨ３−３０／ＪＨ−６の配列の比較である。枠の箇所はＣＤＲである。 図３はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２軽鎖可変領域ｈ１２Ｂ１２．Ｖｋ１およびそのバリアントと１２Ｂ１２キメラ抗体ＶｋおよびヒトエクソンＶｋエクソンＢ３／Ｊｋ−２の配列の比較である。枠の箇所はＣＤＲである。 図４はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２軽鎖可変領域ｈ１２Ｂ１２．Ｖｋ２およびそのバリアントと１２Ｂ１２キメラ抗体ＶｋおよびヒトエクソンＶｋエクソンＡ２／Ｊｋ−２の配列の比較である。枠の箇所はＣＤＲである。 図５はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体２８Ｄ４重鎖可変領域ｈ２８Ｄ４．ＶＨ１およびそのバリアントと２８Ｄ４キメラ抗体ＶＨおよびヒトエクソンＶＨエクソンｈＶＨ３−１１／ＪＨ−６の配列の比較である。枠の箇所はＣＤＲである。 図６はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体２８Ｄ４軽鎖可変領域ｈ２８Ｄ４．Ｖｋ１およびそのバリアントと２８Ｄ４キメラ抗体ＶｋおよびヒトエクソンＶｋエクソンＯ１８／Ｊｋ−５の配列の比較である。枠の箇所はＣＤＲである。 図７Ａと７ＢはＥＬＩＳＡによるヒト化抗体１２Ｂ１２バリアントとヒトＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図７Ａと７ＢはＥＬＩＳＡによるヒト化抗体１２Ｂ１２バリアントとヒトＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図８Ａと８ＢはＥＬＩＳＡによるヒト化抗体２８Ｄ４バリアントとヒトＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図８Ａと８ＢはＥＬＩＳＡによるヒト化抗体２８Ｄ４バリアントとヒトＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図９ＡはＦＡＣＳによるヒト化１２Ｂ１２バリアントと表面にヒトＴＰＢＧタンパク質を発現する安定発現細胞系ＣＨＯＫ１−ｈＴＰＢＧの結合反応の検出である。 図９ＢはＦＡＣＳによるヒト化１２Ｂ１２バリアントと表面にカニクイザルＴＰＢＧタンパク質を発現する安定発現細胞系ＣＨＯＫ１−ｃＴＰＢＧの結合反応の検出である。 図９ＣはＦＡＣＳによるヒト化１２Ｂ１２バリアントと表面にマウスＴＰＢＧタンパク質を発現する安定発現細胞系ＣＨＯＫ１−ｃＴＰＢＧの結合反応の検出である。 図９ＤはＦＡＣＳによるヒト化１２Ｂ１２バリアントとＴＰＢＧ陰性の細胞系ＣＨＯ−ｋ１の結合反応の検出である。 図１０ＡはＦＡＣＳによるヒト化２８Ｄ４バリアントと表面にヒトＴＰＢＧタンパク質を発現する安定発現細胞系ＣＨＯＫ１−ｈＴＰＢＧの結合反応の検出である。 図１０ＢはＦＡＣＳによるヒト化２８Ｄ４バリアントと表面にカニクイザルＴＰＢＧタンパク質を発現する安定発現細胞系ＣＨＯＫ１−ｃＴＰＢＧの結合反応の検出である。 図１０ＣはＦＡＣＳによるヒト化２８Ｄ４バリアントと表面にマウスＴＰＢＧタンパク質を発現する安定発現細胞系ＣＨＯＫ１−ｃＴＰＢＧの結合反応の検出である。 図１０ＤはＦＡＣＳによるヒト化２８Ｄ４バリアントとＴＰＢＧ陰性の細胞系ＣＨＯ−ｋ１の結合反応の検出である。 図１１Ａはヒト化抗体１２Ｂ１２バリアントおよびその抗体薬物複合体のＴＰＢＧ陽性の腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｈ１５６８に対する細胞殺傷活性の検出である。 図１１Ｂはヒト化抗体２８Ｄ４バリアントおよびその抗体薬物複合体のＴＰＢＧ陽性の腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｈ１５６８に対する細胞殺傷活性の検出である。 図１２Ａはヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体のＴＰＢＧ陽性の腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｈ１５６８に対する細胞殺傷活性の検出である。 図１２Ｂはヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体のＴＰＢＧ弱陽性の腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｈ１９７５に対する細胞殺傷活性の検出である。 図１２Ｃはヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体のＴＰＢＧ陽性の腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に対する細胞殺傷活性の検出である。 図１３Ａは異なる投与量のヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＦ抗体薬物複合体のＮＣＩ−Ｈ１９７５マウス異種移植腫瘍モデルの体内薬力学実験における腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図１３Ｂは異なる投与量のヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＦ抗体薬物複合体のＮＣＩ−Ｈ１９７５マウス異種移植腫瘍モデルの体内薬力学実験におけるマウス体重の変化を示すグラフである。 図１４Ａは異なるリンカー−毒素に複合したヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＦ、２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥおよび２８Ｄ４−３−ＤＭ１の抗体薬物複合体の同一の投与量でのＮＣＩ−Ｈ１９７５マウス異種移植腫瘍モデルの体内薬力学実験における腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図１４Ｂは異なるリンカー−毒素に複合したヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＦ、２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥおよび２８Ｄ４−３−ＤＭ１の抗体薬物複合体の同一の投与量でのＮＣＩ−Ｈ１９７５マウス異種移植腫瘍モデルの体内薬力学実験におけるＮＣＩ−Ｈ１９７５マウス異種移植腫瘍モデルの体内薬力学実験におけるマウス体重の変化を示すグラフである。 図１５Ａは異なるリンカー−毒素に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＦ、１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＥおよび１２Ｂ１２−１２−ＤＭ１の抗体薬物複合体の異なる投与量でのＮＣＩ−Ｈ１５６８マウス異種移植腫瘍モデルの体内薬力学実験における腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図１５Ｂは異なるリンカー−毒素に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＦ、１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＥおよび１２Ｂ１２−１２−ＤＭ１の抗体薬物複合体の異なる投与量でのＮＣＩ−Ｈ１５６８マウス異種移植腫瘍モデルの体内薬力学実験におけるマウス体重の変化を示すグラフである。 図１６Ａは異なるリンカー−毒素に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＦ、１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＥおよび１２Ｂ１２−１２−ＤＭ１の抗体薬物複合体の異なる投与量でのＭＤＡ−ＭＢ−４６８マウス異種移植腫瘍モデルの体内薬力学実験における腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図１６Ｂは異なるリンカー−毒素に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＦ、１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＥおよび１２Ｂ１２−１２−ＤＭ１の抗体薬物複合体の異なる投与量でのＭＤＡ−ＭＢ−４６８マウス異種移植腫瘍モデルの体内薬力学実験におけるマウス体重の変化を示すグラフである。 図１７はヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ複合体のラットにおける薬物動態学の分析である。 図１８Ａはヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２−３のＰＤＸ腫瘍組織切片における染色である。図１８Ｂは陰性対照の抗体ｈＩｇＧのＰＤＸ腫瘍組織切片における染色である。 図１９Ａはヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ複合体の異なる投与量での非小細胞肺癌患者から誘導された異種移植腫瘍モデル（ＰＤＸ）における腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図１９Ｂはヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ複合体の異なる投与量での非小細胞肺癌患者から誘導された異種移植腫瘍モデル（ＰＤＸ）におけるマウス体重の変化を示すグラフである。 図２０Ａはヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ抗体薬物複合体または／および抗ＰＤ−１の組み合わせ治療後の腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図２０Ｂはヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ抗体薬物複合体または／および抗ＰＤ−１の組み合わせ治療のマウスの生存に対する影響を示す寿命のグラフである。 図２０Ｃはヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ抗体薬物複合体または／および抗ＰＤ−１の組み合わせ治療後のマウス個体の腫瘍体積の変化を示すグラフである。 図２０Ｄはヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ抗体薬物複合体または／および抗ＰＤ−１の組み合わせ治療後の腫瘍が完全に緩和されたマウスへのＣＴ２６−ＴＰＢＧの再接種を示す図である。
具体的な実施形態
以下、実施例の形によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を記載された実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法および条件、あるいは商品の説明書に従って選ばれた。
実施例に記載の室温は本分野の通常の室温で、一般的に１０〜３０℃である。
特別に説明しない限り、実施例に記載のＰＢＳはＰＢＳリン酸緩衝液で、ｐＨ７．２である。
実施例１ キメラ抗体１２Ｂ１２と２８Ｄ４およびヒト化ＴＰＢＧ抗体の製造
一．マウス由来抗体１２Ｂ１２と２８Ｄ４の製造
（一）免疫原Ａ（ヒト由来ＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質）の製造
ヒト由来ＴＰＢＧタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列３２−３５５（Ｓｅｒ３２−Ｓｅｒ３５５）をコードするヌクレオチド配列（ここで、ヒト由来ＴＰＢＧタンパク質をコードするヌクレオチド配列のＧｅｎｅｂａｎｋにおける番号はＧｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＡＡＨ３７１６１．１である）を、ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片（ｈＦｃ）を持つｐＣｐＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、Ｖ０４４−５０）にクローニングして既に確立された標準分子生物学方法によってプラスミドを製造した。具体的な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．（１９８９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照する。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣから購入）に対して一過性形質移入（ポリエーテルイミドＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）を行ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）によって、３７℃で増幅培養を行った。４日後細胞培養液を収集し、遠心で細胞成分を除去し、ＴＰＢＧタンパク質の細胞外領域を含有する培養上清液を得た。培養上清液をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）に仕込み、同時に紫外（ＵＶ）検出装置によって紫外吸収値（Ａ２８０ｎｍ）の変化をモニタリングした。仕込み後、ＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で、紫外吸収値がベースラインに戻るまでプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄し、さらに０．１ Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．５）で溶離させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶離したｈＦｃタグ付きのＴＰＢＧタンパク質（すなわち、ヒト由来ＴＰＢＧ−ｈＦｃ）を収集した。ＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で４℃の冷蔵庫において一晩透析した。透析後のタンパク質を０．２２μｍで無菌ろ過した後、分注して−８０℃で保存し、すなわち、精製されたヒト由来ＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質を得た。
ヒト由来ＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質は、使用前に一連の品質管理の検出、たとえばそのタンパク質の濃度、純度、分子量、生物活性などの検出が必要で、その結果、ヒト由来ＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質は各項目の指標が良好で、抗原として後のＴＰＢＧ抗体を製造する試験を行うことができることがわかった。
（二）免疫原Ｂの製造
ヒト由来ＴＰＢＧ全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ここで、ヒト由来ＴＰＢＧタンパク質をコードするヌクレオチド配列のＧｅｎｅｂａｎｋにおける番号はＧｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＡＡＨ３７１６１．１である）は、ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）にクローニングしてプラスミドを製造した。ＨＥＫ２９３細胞系（ＡＴＣＣから購入）に対してプラスミドの形質移入（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）を行った後、０．５μｇ／ｍｌの１０％（ｗ／ｗ）牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地で２週間選択培養し、有限希釈法によって９６ウェルプレートでサブクローニングを行い、そして３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2で培養し、約２週間後、一部の単一のクローンウェルを選んで６ウェルプレートで増幅した。増幅されたクローンを既知のＴＰＢＧ抗体（Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号＃ＳＡＢ１４０４４８５）に対してフローサイトメトリー分析法によって選別した。生長が良く、蛍光強度が高く、単一クローンの細胞系を選んで続いて増幅培養して液体窒素で冷凍保存し、すなわち、免疫原Ｂを得た。具体的な選択の結果は表２に示す通りで、ＩｇＧサブタイプの対照はマウスＩｇＧ対照である。表２では、一連のＴＰＢＧ陽性発現のＨＥＫ２９３細胞系を得たことが示された。表２の結果から、２９３Ｆ−ｈＴＰＢＧ ５Ｅ５はＴＰＢＧ高発現細胞株で、中では、抗ＴＰＢＧ抗体で標識された細胞の平均細胞蛍光強度は２８０．５で、移動度は９８．５％であった。
（三）ハイブリドーマ細胞の製造と抗体の選別
Ａ．免疫原Ａによる免疫
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌマウスまたはＳＪＬ／ＪｏｒｌｌｃｏＣｒｌマウス（いずれも上海ＳＬＡＣ社から購入）を使用し、マウスはＳＰＦ条件において飼育した。初回免疫の場合、上記（一）で製造された免疫原Ａをフロイント完全アジュバントで乳化した後、腹腔に０．２５ｍＬ、すなわち、各マウスに５０μｇ／匹ずつ、免疫原Ａのタンパク質を注射した。強化免疫の場合、免疫原Ａをフロイント不完全アジュバントで乳化した後、腹腔に０．２５ｍＬ、すなわち、各マウスに５０μｇ／匹ずつ、免疫原Ａを注射した。初回免疫と１回目の強化免疫の間は２週間の間隔で、その後の毎回の強化免疫は３週間おきに行われた。毎回の強化免疫の１週間後、採血し、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって血清における免疫原Ａの抗体力価および特異性を検出し、結果を表３に示す。表３では、免疫原Ａで免疫されたマウスの免疫後の血清がいずれも免疫原Ａに対して異なる程度の結合があり、抗原抗体反応を示し、中でも、最高の希釈度が１００万程度であったことが示された。ここで、ブランク対照は１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡで、中では、バッチとは２回目の強化免疫から７日目のマウス血清を表し、表におけるデータはＯＤ450nm値である。
Ｂ．免疫原Ｂによる免疫
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌマウスまたはＳＪＬ／ＪｏｒｌｌｃｏＣｒｌマウス（いずれも上海ＳＬＡＣ社から購入）を使用し、マウスはＳＰＦ条件において飼育した。上記（二）のヒト由来ＴＰＢＧ全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するｐＩＲＥＳプラスミドで形質移入されたＨＥＫ２９３細胞系を参照し、ヒト由来ＴＰＢＧを含有するＨＥＫ２９３安定細胞系（２９３Ｆ−ｈＴＰＢＧ ５Ｅ５）を得た（形質移入はＸ−ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔが使用され、Ｒｏｃｈｅ社から購入され、カタログ番号はＣａｔ ＃０６ ３６６ ２３６ ００１で、そして説明書に従って操作された）。Ｔ−７５細胞培養瓶において９０％コンフルエンスまで増幅培養したら、培地を吸い捨て、ＤＭＥＭ基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２回洗浄した後、無酵素細胞分解液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）によって３７℃で細胞が培養シャーレの壁から脱落可能になるまで処理し、細胞を収集した。ＤＭＥＭ基礎培地で２回洗浄し、細胞の計数を行った後、細胞をリン酸塩緩衝液で２×１０7細胞／ｍＬに希釈した。各マウスに毎回の免疫の時０．５ｍＬの細胞懸濁液を腹腔注射した。１回目と２回目の強化免疫の間は２週間の間隔で、その後の毎回の免疫は３週間おきに行われた。１回目の免疫以外、毎回の免疫の１週間後、採血し、ＦＡＣＳによって血清における抗体力価および特異性を検出した。２回目の強化免疫後、ＦＡＣＳによる血清における抗体力価が１：１０００以上に達した。
Ａ〜Ｂ工程が完成する前に、選ばれた各マウスに最後の免疫として１００μｇの精製された免疫原Ａ（免疫原Ａに免疫反応が生じるマウス）またはヒト由来ＴＰＢＧを含有するＨＥＫ２９３安定細胞系（免疫原Ｂに免疫反応が生じるマウス）を腹腔注射し、５日後マウスを殺処分し、脾臓細胞を収集した。最終濃度が１％（ｗ／ｗ）になるようにＮＨ4ＯＨを入れ、脾臓細胞に混ざった赤血球を分解させ、脾臓細胞懸濁液を得た。ＤＭＥＭ基礎培地で１０００回／分で遠心して細胞を３回洗浄した後、生細胞数５：１の比率でマウス骨髓腫細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）と混合し、高効率電気融合方法によって（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ， ＶＯＬ． ２２０を参照する）細胞融合を行った。融合した細胞を２０％（ｗ／ｗ）牛胎児血清、１×ＨＡＴを含有するＤＭＥＭ培地に希釈した。１×１０5／２００μＬ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに入れ、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2、３７℃インキュベーターに置いて培養した。１４日後、ＥＬＩＳＡおよびＡｃｕｍｅｎ（マイクロプレート細胞検出法）によって細胞融合プレートの上清を選別し、ＥＬＩＳＡにおけるＯＤ450nm＞１．０かつＡｃｕｍｅｎにおけるＭＦＩ値＞１００の陽性クローンを２４ウェルプレートに続服し、１０％（ｗ／ｗ）ＨＴ牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2の条件で増幅培養した。３日培養した後、２４ウェルプレートにおいて増幅培養された培養液を遠心し、上清液を収集し、上清液に対して抗体のサブタイプの分析を行い、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳによってＴＰＢＧタンパク質およびＴＰＢＧ陽性細胞に対する結合活性を確認した。
２４ウェルプレートの選別結果に基づき、ＥＬＩＳＡ実験におけるＯＤ450nm＞１．０、ＦＡＣＳ実験におけるＭＦＩ値＞５０かつ間接細胞毒性殺傷実験におけるハイブリドーマ細胞培養上清液のＴＰＢＧ陽性細胞に対する殺傷率が５０％に達したハイブリドーマ細胞を条件に合致する陽性クローンとし、条件に合致したハイブリドーマ細胞を有限希釈法によって９６ウェルプレートでサブクローニングを行い、１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2の条件において培養した。サブクローニングから１０日後ＥＬＩＳＡおよびＡｃｕｍｅｎによって初期選別を行い、単一陽性クローンを選んで２４ウェルプレートで培養を続けた。３日後、ＦＡＣＳによって抗原結合陽性を確認して生物活性を評価し、評価基準はＥＬＩＳＡ実験におけるＯＤ450nm＞１．０かつＦＡＣＳ実験におけるＭＦＩ値＞５０であった。
２４ウェルプレートのサンプルの検出結果から、最適なクローンを選択し、そして１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）において３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2の条件で当該最適なクローンを増幅培養し、液体窒素で凍結保存して、本発明のハイブリドーマ細胞を得、そして後のリード抗体の獲得、抗体の生産と精製に使用される。
（四）リード抗体の生産と精製
ハイブリドーマ細胞が生成した抗体濃度は約１〜１０μｇ／ｍＬと低く、抗体濃度の変化が大きかった。そして、培地における細胞培養で生じた多くのタンパク質および培地に含まれる牛胎児血清の成分は、多くの生物活性分析方法にいずれも異なる程度の干渉があるため、小規模（１〜５ｍｇ）で抗体の生産と精製を行う必要がある。
上記（三）で得られたハイブリドーマ細胞をＴ−７５細胞培養瓶に接種して生産培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）で３代馴化継代した。その生長状態が良くなったら、細胞を培養回転瓶に接種した。各２Ｌの培養回転瓶に２００ｍＬの生産培地を入れ、接種細胞密度は１．０×１０5個／ｍＬであった。蓋をしっかりし、回転瓶を３７℃インキュベーターにおける回転装置に置き、回転数を３回／分とした。連続して１４日回転培養した後、細胞培養液を収集し、ろ過で細胞を除去し、そして培養上清液が清澄になるまで０．４５μｍのろ膜でろ過し、清澄なハイブリドーマ細胞の培養上清液を得た。清澄なハイブリドーマ細胞の培養上清液はすぐに精製するか、−３０℃で凍結保存することができる。
得られた培養上清液（２００ ｍＬ）におけるＴＰＢＧ抗体を２ｍＬプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）によって精製した。プロテインＧカラムは、まず平衡緩衝液（ＰＢＳリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で平衡化した後、培養上清液をプロテインＡカラムに仕込み、流速を３ｍＬ／分に制御した。仕込みが終了した後、平衡緩衝液でプロテインＧカラムを洗浄し、平衡緩衝液の体積は、プロテインＡカラムのベッド体積の４倍であった。溶離液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．５）でプロテインＡカラムに結合したＴＰＢＧ抗体を溶離させ、紫外検出器によって溶離状況をモニタリングした（Ａ280nm紫外吸収ピーク）。溶離した抗体を収集し、１０％（ｖ／ｖ）の１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を入れてｐＨを中和した後、すぐＰＢＳリン酸緩衝液で一晩透析し、２日目に液置換を１回行い、続いて３時間透析した。透析されたＴＰＢＧ抗体を収集し、０．２２μｍのフィルターによって無菌ろ過を行い、無菌で保存し、すなわち、精製されたＴＰＢＧ抗体を得た。
精製されたＴＰＢＧ抗体に対してタンパク質の濃度（Ａ280nm／１．４）、純度、内毒素（Ｌｏｎｚａキット）などの検出・分析を行ったが、結果は表４に示すように、表４では、抗体の最終製品の内毒素濃度が１．０ＥＵ／ｍｇ以内であったことが示された。
（五）リード抗体の同定
Ａ．酵素結合免疫吸着実験（ＥＬＩＳＡ）によるＴＰＢＧ抗体とＴＰＢＧタンパク質の結合の検出
得られた精製されたＴＰＢＧ抗体とヒト由来ＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質を反応させた。
上記（一）で製造されたヒト由来ＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質をＰＢＳで最終濃度が１．０μｇ／ｍＬになるように希釈した後、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに入れた。プラスチック膜で密封して４℃で一晩インキュベートし、２日目にプレートを洗浄液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ］で２回洗浄し、ブロッキング液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０および１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ］を入れて室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨て、精製されたＴＰＢＧ抗体を１００μＬ／ウェルで入れた。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ］で３回洗浄した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識された二次抗体（Ｓｉｇｍａから購入）を入れ、３７℃で２時間インキュベートした後、洗浄液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ］でプレートを３回洗浄した。ＴＭＢ基質を１００μＬ／ウェル入れ、室温で３０分間インキュベートした後、停止液（１．０Ｎ ＨＣｌ）を１００μＬ／ウェル入れた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４ｐｌｕｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅから購入）によってＡ450nm値を読み取ったが、結果は表５に示すように、精製されたＴＰＢＧ抗体とＴＰＢＧ組み換えタンパク質がＥＬＩＳＡレベルで結合したことがわかった。表５において、ＩｇＧ対照は対照マウスＩｇＧで、表におけるデータはＯＤ450nm値で、ブランクの意味はプレートにＰＢＳ緩衝液のみある場合のＯＤ450nm値である。
Ｂ．フローサイトメトリー実験（ＦＡＣＳ）によるＴＰＢＧ抗体とＴＰＢＧ発現細胞の結合の検出
ヒト由来ＴＰＢＧ全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ここで、ヒト由来ＴＰＢＧタンパク質をコードするアミノ酸配列およびヌクレオチド配列のＧｅｎｅｂａｎｋにおける番号はそれぞれＧｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ： ＡＡＨ３７１６１．１およびＧｅｎｅ ＩＤ： ７１６２である）は、ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）にクローニングしてプラスミドを製造した。その後、ヒト由来ＴＰＢＧ全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するｐＩＲＥＳプラスミドをＣＨＯ−ｋ１細胞株（ＡＴＣＣから購入）に形質移入し（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、ヒト由来ＴＰＢＧを含有するＣＨＯ−ｋ１安定細胞株（ここで、ＣＨＯｋ１−ｈＴＰＢＧ安定細胞株と呼ぶ）を得た。同じように、サル由来ＴＰＢＧ全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ここで、サル由来ＴＰＢＧタンパク質をコードするアミノ酸配列およびヌクレオチド配列のＧｅｎｅｂａｎｋにおける番号はそれぞれＧｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ： ＢＡＥ００４３２．１およびＧｅｎｅ ＩＤ： １０２１３２１４９である）は、ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）にクローニングしてプラスミドを製造した。その後、サル由来ＴＰＢＧ全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するｐＩＲＥＳプラスミドをＣＨＯ−ｋ１細胞株（ＡＴＣＣから購入）に形質移入し（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、サル由来ＴＰＢＧを含有するＣＨＯ−ｋ１安定細胞株（ここで、ＣＨＯｋ１−ｃＴＰＢＧ安定細胞株と呼ぶ）を得た。同じように、マウス由来ＴＰＢＧ全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ここで、マウス由来ＴＰＢＧタンパク質をコードするアミノ酸配列およびヌクレオチド配列のＧｅｎｅｂａｎｋにおける番号はそれぞれＧｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ： ＣＡＡ０９９３１．１およびＧｅｎｅ ＩＤ： ２１９８３である）は、ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）にクローニングしてプラスミドを製造した。その後、マウス由来ＴＰＢＧ全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するｐＩＲＥＳプラスミドをＣＨＯ−ｋ１細胞株（ＡＴＣＣから購入）に形質移入し（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、マウス由来ＴＰＢＧを含有するＣＨＯ−ｋ１安定細胞株（ここで、ＣＨＯｋ１−ｍＴＰＢＧ安定細胞株と呼ぶ）を得た。
ＦＡＣＳによって血清におけるＴＰＢＧ抗体の力価および特異性を検出したが、検出方法は上記（二）「免疫原Ｂの製造」におけるＨＥＫ２９３−ｈＴＰＢＧ安定細胞株を同定する方法を参照する。検出結果は表６に示す。表６の結果から、ＣＨＯｋ１−ｈＴＰＢＧ安定細胞株、ＣＨＯｋ１−ｃＴＰＢＧ安定細胞株およびＣＨＯｋ１−ｍＴＰＢＧ安定細胞株の細胞膜に、それぞれヒト、サルまたはマウスのＴＰＢＧタンパク質が過剰発現され、ＴＰＢＧ抗体の選別に有用であることが示された。
ＣＨＯｋ１−ｈＴＰＢＧ安定細胞株、ＣＨＯｋ１−ｃＴＰＢＧ安定細胞株、ＣＨＯｋ１−ｍＴＰＢＧ安定細胞株（すなわち、表６で示されたＣＨＯｋ１−ｈＴＰＢＧ ３Ａ２Ｆ１、ＣＨＯｋ１−ｃＴＰＢＧ ３Ｆ１３Ｇ４およびＣＨＯｋ１−ｍＴＰＢＧ ３Ａ３）およびＣＨＯ−ｋ１細胞をそれぞれＴ−７５細胞培養瓶において９０％コンフルエンスまで増幅培養したら、培地を吸い捨て、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２回洗浄した後、無酵素細胞分解液（Ｖｅｒｓｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）によって処理し、そして細胞を収集した。ＨＢＳＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、細胞の計数を行った後、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で２×１０6個細胞／ｍＬに希釈し、１０％ヤギ血清ブロッキング液を入れ、前記百分率は質量百分率で、氷の上で３０分間インキュベートした後、ＨＢＳＳ緩衝液で２回遠心洗浄した。収集された細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ、前記百分率は質量百分率である）で２×１０6個細胞／ｍＬに懸濁させ、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートに入れ、上記（四）で得られた精製されたＴＰＢＧ抗体の被験サンプルを１００μＬ／ウェル入れ、氷の上で２時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心洗浄し、１００μＬ／ウェルの蛍光（Ａｌｅｘａ ４８８）で標識された二次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を入れ、氷の上で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回遠心洗浄し、１００μＬ／ウェルの固定液［４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド］を入れて細胞を懸濁させ、１０分間後ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心洗浄した。１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を懸濁させ、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ社から購入）によって検出して結果を分析した。ソフト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）によってデータ分析を行い、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。さらにソフト（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５）によって分析し、データのフィッティングを行い、ＥＣ５０値を計算した。分析結果は表７に示す。表７におけるデータは、ＭＦＩから算出されたＥＣ５０値である。表７では、ＴＰＢＧ抗体が細胞表面のＴＰＢＧタンパク質に結合することができることが示された。
（六）競争ＥＬＩＳＡによるＴＰＢＧ抗体と抗原のエピトープ分布の検出・分析
抗体の抗原に対する結合部位を同定するため、競争ＥＬＩＳＡ法によって上記ＴＰＢＧ抗体に対して群分けを行った。
精製された被験抗体をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬ／ウェルで９６ウェル高吸着マイクロプレートを被覆し、４℃で一晩被覆した後、２５０μＬのブロッキング液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０および１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ］で室温で１時間ブロッキングし、各ウェルに０．０５μｇ／ｍＬのビオチンで標識された組み換えＴＰＢＧタンパク質を入れた。同時に５μｇ／ｍＬの競争抗体、すなわち、上記で得られた精製されたＴＰＢＧ抗体を入れ、そのクローン番号はそれぞれ１２Ｂ１２Ｃ７Ｃ３および２８Ｄ４Ｅ６Ａ９で、そして２５〜３７℃で１〜２時間インキュベートした。洗浄液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ］でプレートを３回洗浄し、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識されたストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａから購入）を入れた。３７℃で０．５時間インキュベートした後、プレートを洗浄液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ］で３回洗浄した。ＴＭＢ基質を１００μＬ／ウェル入れ、室温で３０分間インキュベートした後、停止液（１．０Ｎ ＨＣｌ）を１００μＬ／ウェル入れた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４ｐｌｕｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅから購入）によってＡ450nm値を読み取った。Ａ450nm値から、抗体同士の間の競争率を算出したが、結果は表８に示す。競争率の数値が高いほど、２つの抗体の抗原表面が近いことを示す。
結果から、１２Ｂ１２Ｃ７Ｃ３および２８Ｄ４Ｅ６Ａ９はエピトープが違うことが示された。
（七）軽・重鎖可変領域のアミノ酸配列の測定
全ＲＮＡ分離：遠心で上記（三）で製造されたハイブリドーマ細胞を５×１０7個の細胞を収集し、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌを入れて均一に混合して１．５ｍＬ遠心管に移し、室温で５分間静置した。０．２ｍＬのクロロホルムを入れ、１５秒振とうし、１０分間静置した後、４℃で１２０００ｇで５分間遠心し、上清を取って新しい１．５ｍＬ遠心管に移した。０．５ｍＬのイソプロパノールを入れ、管における液体を軽く均一に混合し、室温で１０分間静置した後、４℃で１２０００ｇで１５分間遠心し、上清を捨てた。１ｍＬの７５％（ｖ／ｖ）エタノールを入れ、軽く沈殿を洗浄し、４℃で１２０００ｇで５分間遠心した後、上清を捨て、沈殿物を自然乾燥し、ＤＥＰＣで処理されたＨ2Ｏを入れて溶解させ（５５℃水浴で溶解を１０分間促進した）、全ＲＮＡを得た。
逆転写とＰＣＲ：１μｇの全ＲＮＡを取り、２０μＬ系を調製し、逆転写酵素を入れた後４２℃で６０分間反応させ、７℃で１０分間反応させて反応を停止させた。１μＬのｃＤＮＡ、各プライマー２５ｐｍｏｌ、１μＬのＤＮＡポリメラーゼおよび相応する緩衝系、２５０μｍｏｌのｄＮＴＰｓを含む５０μＬのＰＣＲ系を調製した。９５℃で予備変性３分、９５℃で変性３０秒、５５℃でアニーリング３０秒、７２℃で伸長３５秒で３５サイクル後、余分に７２℃で５分伸長するように、ＰＣＲプログラムを設定し、ＰＣＲ産物を得た。ここで、逆転写に使用されたキットはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘで、Ｔａｋａｒａから購入され、カタログ番号はＲＲ０３６で、ＰＣＲに使用されたキットはＱ５ハイフィデリティーポリメラーゼを含み、ＮＥＢから購入され、カタログ番号はＭ０４９２であった。
クローニングと配列決定：５μＬのＰＣＲ産物を取ってアガロースゲル電気泳動によって検出し、陽性と検出されたサンプルをカラム回収キットによって精製し、ここで、回収キットはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） Ｇｅｌ ＆ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐで、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬから購入され、カタログ番号は７４０６０９であった。連結反応：サンプル５０ｎｇ、Ｔベクター５０ｎｇ、リガーゼ０．５μＬ、緩衝液１μＬ、反応系１０μＬを１６℃で半時間反応させて連結産物を得た。ここで、連結のキットはＴ４ ＤＮＡリガーゼで、ＮＥＢから購入され、カタログ番号はＭ０４０２であった。５μＬの連結産物を１００μＬの感受性細胞（Ｅｃｏｓ １０１ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、Ｙｅａｓｔｅｒｎから購入、カタログ番号ＦＹＥ６０７）に入れ、氷浴で５分間置き、その後、４２℃で水浴で１分間ヒートショックさせ、氷の上に１分間置いた後６５０μＬの抗生物質のないＳＯＣ培地を入れ、３７℃でチェーカーで２００ＲＰＭの速度で３０分間蘇生させた。２００μＬを取って抗生物質を含有するＬＢ固体培地に塗布して３７℃のインキュベーターで一晩培養した。次の日に、Ｔベクターを使用してプライマーＭ１３ＦとＭ１３Ｒで３０μＬのＰＣＲ系を調製し、集落のＰＣＲを行い、ピペットチップの先端で集落を取ってＰＣＲ反応系に吹き込み、かつ０．５μＬを取ってもう一つの１００ｎＭアンピシリンを含有するＬＢ固体培養シャーレに接種して菌株を保存した。ＰＣＲ反応終了後、５μＬを取ってアガロースゲル電気泳動によって検出し、陽性のサンプルに対して配列決定および分析を行った［Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照する］。
結果から、前記１２Ｂ１２Ｃ７Ｃ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号２で示され、軽鎖可変領域の配列は、配列表における配列番号４で示されることが示された。
ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のうちの３１番目〜３５番目で示され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のうちの５０番目〜６６番目で示され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のうちの９９番目〜１０９番目で示され、
前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４のうちの２４番目〜３８番目で示され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４のうちの５４番目〜６０番目で示され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４のうちの９３番目〜１０１番目で示される。
前記２８Ｄ４Ｅ６Ａ９の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号６で示され、軽鎖可変領域の配列は配列表における配列番号８で示される。
ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６のうちの３１番目〜３５番目で示され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６のうちの５０番目〜６６番目で示され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６のうちの９９番目〜１０９番目で示され、
前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８のうちの２４番目〜３４番目で示され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８のうちの５０番目〜５６番目で示され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８のうちの８９番目〜９７番目で示される。
ヌクレオチドの配列決定の結果：
１２Ｂ１２Ｃ７Ｃ３の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１で示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号３で示され、
２８Ｄ４Ｅ６Ａ９の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号５で示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号７で示され、
ここで、１２Ｂ１２Ｃ７Ｃ３の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１のうちの９１番目〜１０５番目で示され、
１２Ｂ１２Ｃ７Ｃ３の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１における１４８番目〜１９８番目で示され、
１２Ｂ１２Ｃ７Ｃ３の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１における２９５番目〜３２７番目で示され、
１２Ｂ１２Ｃ７Ｃ３の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３のうちの７０番目〜１１４番目で示され、
１２Ｂ１２Ｃ７Ｃ３の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３のうちの１６０番目〜１８０番目で示され、
１２Ｂ１２Ｃ７Ｃ３の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３のうちの２７７番目〜３０３番目で示され、
２８Ｄ４Ｅ６Ａ９の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５のうちの９１番目〜１０５番目で示され、
２８Ｄ４Ｅ６Ａ９の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５のうちの１４８番目〜１９８番目で示され、
２８Ｄ４Ｅ６Ａ９の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５のうちの２９５番目〜３２７番目で示され、
２８Ｄ４Ｅ６Ａ９の軽タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７のうちの７０番目〜１０２番目で示され、
２８Ｄ４Ｅ６Ａ９の軽タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７のうちの１４８番目〜１６８番目で示され、
２８Ｄ４Ｅ６Ａ９の軽タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７のうちの２６５番目〜２９１番目で示される。
二．マウス−ヒトキメラ抗体１２Ｂ１２と２８Ｄ４の製造
配列番号２、４には、それぞれ抗ＴＰＢＧマウスモノクローナル抗体１２Ｂ１２の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列が挙げられた。配列番号６、８には、それぞれ抗ＴＰＢＧマウスモノクローナル抗体２８Ｄ４の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列が挙げられた。
１）プラスミドの構築と用意：上記マウス由来リード抗体の重鎖可変領域を、シグナルペプチドおよびヒト由来重鎖抗体ＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクター（ここで、発現ベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、組み換え工程も上海睿智化学によって完成された）に組み込み、ＴＰＢＧ抗体の軽鎖可変領域を、シグナルペプチドおよびヒト由来抗体軽鎖κ定常領域を含む発現ベクター（ここで、発現ベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、組み換え工程も上海睿智化学によって完成された）に組み込み、組み換えプラスミド（上記プラスミド組み換えの実験原理および工程は「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル（第三版）」、（米）Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら著）を得て配列決定によって検証した。アルカリ溶解法キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬから購入）によって高純度の組み換えプラスミドを中スケールで抽出し、質量が５００μｇ以上で、０．２２μｍろ膜（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅから購入）でろ過し、形質移入に備えた。
２）細胞の形質移入：培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を培養した。シェーカーは３７℃、１３０ＲＰＭおよび８％ ＣＯ2（ｖ／ｖ）とした。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍは形質移入時１０％（ｖ／ｖ）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）になるように入れ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｆ６８含有Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地、すなわち、培地Ａを得た。５ｍＬの培地Ａを取って２００μｇ／ｍＬのＰＥＩ（Ｓｉｇｍａから購入）と均一に混合し、培地Ｂを得た。５ｍＬの培地Ａを取って１００μｇの工程（１）で得られた組換えプラスミド（ここで、上記重鎖組み換えプラスミドと軽鎖組み換えプラスミドが通常のように等比率で混合した混合組み換えプラスミド）と均一に混合し、培地Ｃを得た。５分間後、培地Ｂと培地Ｃを合併して混合し、１５分間静置し、混合液Ｄを得た。１０ｍＬの混合液Ｄをゆっくり１００ｍＬの２９３Ｅ細胞を含有する培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍに２９３Ｅの細胞密度が１．５×１０6個／ｍＬになるように入れ、ＰＥＩが集中しすぎないように添加しながら振とうし、シェーカーに入れて培養した。翌日に、最終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）になるようにペプトンを入れた。５〜７日目に、培養液の抗体価を検出した。６〜７日目に、遠心（３５００ＲＰＭ、３０分）で上清を収集し、０．２２μｍろ膜でろ過し、ろ過された細胞上清液を得て精製に提供した。
３）抗体の精製：連続的に生産される内毒素のないクロマトグラフィーカラムおよびプロテインＡフィラーについて、０．１Ｍ ＮａＯＨで３０ｍｉｎ処理するか、あるいは５倍カラム体積の０．５Ｍ ＮａＯＨで洗浄した。長期間で未使用のカラムフィラーおよびクロマトグラフィーカラムは少なくとも１Ｍ ＮａＯＨで１ｈ浸漬させ、内毒素のない水で中性になるまで洗浄し、１０倍カラム体積の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００でカラムフィラーを洗浄した。５倍カラム体積のＰＢＳで平衡化した後、ろ過された細胞上清液をカラムにかけ、必要によって通過液を収集した。カラムにかけた後、５倍カラム体積のＰＢＳで洗浄した。５倍カラム体積の０．１Ｍ ｐＨ ３．０のグリシン−ＨＣｌで溶離させ、溶離液を収集し、そしてすぐに１／１０体積のｐＨ ８．５の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１．５Ｍ ＮａＣｌ）で中和した。抗体を得た後、内毒素の汚染を防ぐために、１×ＰＢＳで一晩透析した。透析終了後、分光光度計またはキットによって濃度を測定し、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって抗体の純度を測定し、内毒素検出キット（Ｌｏｎｚａから購入）によって抗体の内毒素含有量を検出した。
それぞれ精製されたＴＰＢＧキメラ抗体１２Ｂ１２および２８Ｄ４を得た。
三．ヒト化ＴＰＢＧ抗体の製造
Ｇｅｒｍｌｉｎｅデータベースから上記キメラ抗体１２Ｂ１２または２８Ｄ４の非ＣＤＲ領域に最適にマッチするヒト抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の鋳型を選出した。ヒト化ＴＰＢＧ抗体のヒトアクセプター配列はヒトエクソンＶH、ＪH、ＶkおよびＪk配列から選ばれる。ここで、１２Ｂ１２抗体の重鎖可変領域の鋳型は、ヒト抗体の重鎖ＶHエクソンのＶＨ３−４８およびＶＨ３−３０、ＪHエクソンのＪH−６で、軽鎖可変領域の鋳型はヒト抗体の軽鎖ＶKエクソンのＢ３およびＡ２、ＪKエクソンの／ＪK−２である。ここで、２８Ｄ４抗体の重鎖可変領域の鋳型は、ヒト抗体の重鎖ＶHエクソンのＶＨ３−１１、ＪHエクソンのＪH−６で、軽鎖可変領域の鋳型は、ヒト抗体の軽鎖ＶKエクソンのＯ１８およびＡ２、ＪKエクソンのＪK−５である。
Ｋａｂａｔ定義で確定されたキメラ抗体１２Ｂ１２または２８Ｄ４の重鎖と軽鎖のＣＤＲはそれぞれ選ばれたヒト鋳型に移植し、ヒト鋳型のＣＤＲ領域に代え、ヒト 化された抗体を得た。その後、マウス由来抗体の３次元構造を元に、残基を包埋し、ＣＤＲ領域と直接相互作用がある残基、およびＶＬとＶＨの配座に大きく影響するフレームワークの残基に対して、復帰突然変異を行って、ヒト化された抗体を得た。要するに、ヒト化ＶHまたはＶLドメインを跨ぐ合成のオーバーラップオリゴヌクレオチドを形成し、そしてＰＣＲオーバーラップエクステンションによって各ドメインを組み立てた。ＰＣＲ産物に挿入された制限部位を利用して、ＶHドメインをシグナルペプチドおよびヒト由来抗体の重鎖ＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターに、ＶLドメインをシグナルペプチドおよびヒト由来抗体の軽鎖κ定常領域を含む発現ベクターに位置指定クローニングし、得られた組み換えプラスミドを配列決定によって検証し、アルカリ溶解法キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬから購入）によって高純度の組み換えプラスミドを中スケールで抽出し、質量が５００μｇ以上で、０．２２μｍろ膜（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅから購入）でろ過し、形質移入に備えた。
ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体バリアントの重鎖および軽鎖の可変領域と、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域ならびにキメラ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の配列の比較は図１〜６に示す通りで、ここで、図１はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２の重鎖可変領域ｈ１２Ｂ１２．ＶＨ１およびそのバリアントと１２Ｂ１２キメラ抗体ＶＨおよびヒトＶＨエクソンｈＶＨ３−４８／ＪＨ−６の配列の比較で、図２はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２の重鎖可変領域ｈ１２Ｂ１２．ＶＨ２およびそのバリアントと１２Ｂ１２キメラ抗体ＶＨおよびヒトＶＨエクソンｈＶＨ３−３０／ＪＨ−６の配列の比較で、図３はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２の軽鎖可変領域ｈ１２Ｂ１２．Ｖｋ１およびそのバリアントと１２Ｂ１２キメラ抗体ＶｋおよびヒトＶｋエクソンＢ３／Ｊｋ−２の配列の比較で、図４はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２の軽鎖可変領域ｈ１２Ｂ１２．Ｖｋ２およびそのバリアントと１２Ｂ１２キメラ抗体ＶｋおよびヒトＶｋエクソンＡ２／Ｊｋ−２の配列の比較で、図５はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体２８Ｄ４の重鎖可変領域ｈ２８Ｄ４．ＶＨ１およびそのバリアントと２８Ｄ４キメラ抗体ＶＨおよびヒトＶＨエクソンｈＶＨ３−１１／ＪＨ−６の配列の比較で、図６はヒト化抗ＴＰＢＧ抗体２８Ｄ４の軽鎖可変領域ｈ２８Ｄ４．Ｖｋ１およびそのバリアントと２８Ｄ４キメラ抗体ＶｋおよびヒトＶｋエクソンＯ１８／Ｊｋ−５の配列の比較である。
ヒト重鎖可変領域の鋳型ＶＨ３−４８／ＪＨ６（配列番号９）
ＶＨ３−４８：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ；
ＪＨ６：ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
ヒト重鎖可変領域の鋳型ＶＨ３−３０／ＪＨ６（配列番号１０）
ＶＨ３−３０：
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ；
ＪＨ６：ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
ヒト軽鎖可変領域の鋳型Ｂ３／Ｊｋ２（配列番号１１）
Ｂ３：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣ；
ＪＫ２：ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
ヒト軽鎖可変領域の鋳型Ａ２／Ｊｋ２（配列番号１２）
Ａ２：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＨＳＤＧＫＴＹＬＹＷＹＬＱＫＰＧＱＰＰＱＬＬＩＹＥＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣ；
ＪＫ２：ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
ヒト重鎖可変領域の鋳型ＶＨ３−１１／ＪＨ６（配列番号１３）
ＶＨ３−１１：
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ；
ＪＨ６：ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。
ヒト軽鎖可変領域の鋳型Ｏ１８／Ｊｋ５（配列番号１４）
Ｏ１８：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ；
ＪＫ５：ＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ。
数箇所のフレームワークの位置を選んで改めてマウスドナー残基を導入した。ＶＨドメインへのマウスフレームワークのドナー残基の導入またはＶＬドメインへのヒトＣＤＲ残基の導入の異なる組み合わせによって、数種類のヒト化 １２Ｂ１２および２８Ｄ４のバリアントを生成した。下記表９と表１０にこれらのバリアントを簡単にまとめた。ここで、表９と表１０で示されたのはこれらの可変領域で、定常領域が含まれていない。表９、１０において、ｃから始まるのはキメラ抗体で、ｈから始まるのはヒト化抗体である。ここで、ドナーのフレームワークの残基および復帰突然変異の欄で示された、たとえば各ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２の重鎖可変領域ｈ１２Ｂ１２．ＶＨ１およびそのバリアントにおける「Ａ９３Ｓ」とは、図１で示された９３番目のアミノ酸が「Ａ」アラニンから「Ｓ」セリンに突然変異したことを表し、復帰突然変異の部位はフレームワーク領域に位置し、これを例として挙げ、逐一の説明を省略する。
各ヒト化抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列に基づいてｃＤＮＡ（すなわち、それぞれ配列表における配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５で示される配列）を合成し、重鎖ｃＤＮＡはＦｓｐＡＩおよびＡｆｅＩで、軽鎖ｃＤＮＡはＦｓｐＡＩおよびＢｓｉｗＩで消化した後、ｃＤＮＡ断片をＦｓｐＡＩ／ＡｆｅＩまたはＦｓｐＡＩ／ＢｓｉｗＩ酵素切断部位でそれぞれシグナルペプチドおよびヒト由来重鎖抗体ＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターおよびシグナルペプチドおよびヒト由来抗体の軽鎖κ定常領域を含む発現ベクター（ここで、発現ベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、組み換え工程も上海睿智化学によって完成された）に挿入し、プラスミドを組み換えて配列決定によって検証し、アルカリ溶解法キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬから購入）によって高純度の組み換えプラスミドを中スケールで抽出し、質量が５００μｇ以上で、０．２２μｍろ膜（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅから購入）でろ過し、形質移入に備えた。
形質移入前に、培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を培養した。形質移入の時、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍに１０％（ｖ／ｖ）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を、Ｆ６８の最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）になるように入れ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｆ６８含有Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地、すなわち、培地Ａを得た。５ｍＬの培地Ａを取って２００μｇ／ｍＬのＰＥＩ（Ｓｉｇｍａから購入）と均一に混合し、培地Ｂを得た。５ｍＬの培地Ａを取って１００μｇ／ｍＬの重鎖および軽鎖の組み換えプラスミド（重鎖組み換えプラスミドと軽鎖組み換えプラスミドの質量比は１：１〜１：３の範囲内である）と均一に混合し、培地Ｃを得た。５分間後、培地Ｂと培地Ｃを合併して混合し、１５分間静置し、混合液Ｄを得た。１０ｍＬの混合液Ｄをゆっくり１００ｍＬの２９３Ｅ細胞を含有する培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍに２９３Ｅの細胞密度が１．５×１０6個／ｍＬになるように入れ、ＰＥＩが集中しすぎないように添加しながら振とうし、３７℃、１３０ＲＰＭおよび８％ ＣＯ2（ｖ／ｖ）にセットしたシェーカーに入れて培養した。翌日に、最終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）になるようにペプトンを入れた。５〜７日目に、培養液の抗体価を検出した。６〜７日目に、遠心（３５００ＲＰＭ、３０分）で上清を収集し、０．２２μｍろ膜でろ過し、ろ過された細胞上清液を得て精製に提供した。
抗体を精製する時、連続して生産された内毒素のないクロマトグラフィーカラムおよびＰｒｏｔｅｉｎ Ａフィラー（ＧＥから購入）に対し、５倍カラム体積の０．５Ｍ ＮａＯＨで洗浄した。その後、５倍カラム体積のＰＢＳ（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４）で中性まで平衡化した後、ろ過された細胞上清液をカラムにかけ、必要によって通過液を収集した。カラムにかけた後、５倍カラム体積のＰＢＳで洗浄した。５倍カラム体積の０．１Ｍ ｐＨ ３．０のグリシン−ＨＣｌで溶離させ、溶離液を収集し、そしてすぐに溶離液に０．１倍体積のｐＨ ８．５の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１．５Ｍ ＮａＣｌ）を入れてＴＰＢＧ抗体を中和した。上記で使用された溶液はいずれも新しく調製されたものである。ＴＰＢＧ抗体を得た後、内毒素の汚染を防ぐように、１×ＰＢＳで４時間透析した。透析終了後、分光光度計またはキットによって濃度を測定し、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって抗体の純度を測定し、内毒素検出キット（Ｌｏｎｚａから購入）によって抗体の内毒素含有量を検出した。そして、得られたＴＰＢＧ抗体に対して特性の同定を行った（操作手順は下記実施例２、実施例３、実施例４に記載の通りである）。
実施例２ 酵素結合免疫吸着実験（ＥＬＩＳＡ）によるヒト化ＴＰＢＧ抗体とＴＰＢＧタンパク質の結合の検出
実施例１で得られた精製されたヒト化ＴＰＢＧ抗体とヒト由来ＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質を反応させたが、方法の詳細は実施例１における（五）リード抗体の同定を参照し、結果は図７〜８および表１１〜１２で示される通りで、表１１および表１２はそれぞれｈ１２Ｂ１２バリアントおよびｈ２８Ｄ４バリアントのＯＤ450nm値から算出されたＥＣ５０値で、精製されたヒト化ＴＰＢＧ抗体のバリアントがＴＰＢＧ組み換えタンパク質とＥＬＩＳＡレベルで良い結合があったことが示された。ここで、図７Ａおよび７Ｂは精製されたヒト化ｈ１２Ｂ１２バリアントとヒト由来ＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質の結合反応で、図８Ａおよび８Ｂは精製されたヒト化ｈ２８Ｄ４バリアントとヒト由来ＴＰＢＧ−ｈＦｃタンパク質の結合反応である。
実施例３ ヒト化ＴＰＢＧ抗体の特徴づけ分析（Ｂｉａｃｏｒｅ）
ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体の結合特異性および親和力を評価するために、ＣＭ５チップに固定されたヒトＴＰＢＧ抗原でＢｉａｃｏｒｅ分析を行った。 Ｂｉａｃｏｒｅ技術は抗体と表層に固定されたＴＰＢＧ抗原が結合した後の表層における回折率の変化を利用する。表面から回折されたレーザーを介する表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を合わせて検出した。シグナル動態学の結合速度と解離速度の分析によって非特異性と特異性の相互作用が区別される。キメラ抗体１２Ｂ１２および２８Ｄ４を対照とした。
Ｂｉａｃｏｒｅの結果から、ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２および２８Ｄ４の各バリアントは、キメラ抗体１２Ｂ１２および２８Ｄ４と非常に類似するＫＤ値を有することが示され、これによってヒト化抗ＴＰＢＧ抗体はキメラ抗体と比べ、抗原結合活性が顕著に低下しなかったことが証明された。
実施例４ フローサイトメトリー実験（ＦＡＣＳ）によるＴＰＢＧ抗体とＴＰＢＧ発現細胞の結合の検出
ヒト由来ＴＰＢＧのＣＨＯ−ｋ１安定細胞株（ＣＨＯｋ１−ｈＴＰＢＧ安定細胞株）、サル由来ＴＰＢＧのＣＨＯ−ｋ１安定細胞株（ＣＨＯｋ１−ｃＴＰＢＧ安定細胞株）およびマウス由来ＴＰＢＧのＣＨＯ−ｋ１安定細胞株（ＣＨＯｋ１−ｍＴＰＢＧ安定細胞株）の製造方法、フローサイトメーターによる検出方法および結果の読み取りの詳細は、実施例１の（五）「リード抗体の同定」を参照する。
分析結果は表１４、１５および図９、１０に示される通りで、図９Ａ〜Ｄ、１０Ａ〜Ｄのデータは細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。表１４、１５におけるデータは、ＭＦＩから算出されたＥＣ５０値である。表１４、１５では、ヒト化ＴＰＢＧ抗体バリアントは表面にヒトＴＰＢＧタンパク質を発現する細胞および表面にカニクイザルＴＰＢＧタンパク質を発現する細胞と特異的に結合したが、マウスＴＰＢＧタンパク質を発現する細胞およびＴＰＢＧ発現陰性のＣＨＯ−ｋ１と結合しなかったことが示された。
実施例５ ヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体の体外薬力学実験
実施例１で得られた精製されたヒト化ＴＰＢＧ抗体バリアントをＭＣ−ＭＭＡＦと複合させた。抗体をｐＨが６．５〜８．５のホウ酸ナトリウム緩衝液で透析した後、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を、ＴＣＥＰと精製されたＴＰＢＧ抗体のモル比が３になるように入れ、室温で１時間還元させ、反応液Ａを得た。反応液ＡをＧ２５カラムで脱塩させ（ＧＥから購入）、余分のＴＣＥＰを除去し、反応液Ｂを得た。反応液ＢにＭＣ−ＭＭＡＦ（南京連寧から購入）を、ＭＣ−ＭＭＡＦと精製されたヒト化抗ＴＰＢＧ抗体のモル比が１０になるように入れ、室温で４時間反応させた。さらに余分のＭＣ−ＭＭＡＦを中和するためにシステインを入れ、そしてＧ２５カラムで脱塩して余分の小分子を除去した。精製されたヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体を得た（複合方法はＤｏｒｏｎｉｎａ，２００６， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７，１１４−１２４を参照する）。それぞれＨＰＬＣ−ＨＩＣおよびＨＰＬＣ−ＳＥＣによって薬物の薬物抗体比や純度などのパラメーターを分析した後、体外細胞毒性分析を行った。すべてのヒト化ＴＰＢＧ抗体複合体の薬物抗体比（ＤＡＲ）は３．０〜５．０であった。ここで、ＤＡＲ（ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ）とは、抗体が複合した後、１つの抗体分子に担持する小分子薬物の平均数量のことである。
ヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体はそれぞれ完全培地で勾配希釈し、９６ウェル細胞培養プレートに２０００細胞／ウェルで１００μＬのＴＰＢＧ陽性の非小細胞肺癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ１５６８（ＡＴＣＣから購入、カタログ番号＃ＣＲＬ−５８７６）細胞懸濁液を入れて一晩培養した後、各ウェルにそれぞれ１０μＬの異なる濃度の精製されたＴＰＢＧ抗体薬物複合体の希釈液を入れ、続いて５日培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａから購入され、使用方法は製品説明書を参照した）によって細胞の活力を検出した。
結果は表１６、１７および図１１に示される通りで、ここで、表１６のＩＣ５０とは薬物で作用させた後、細胞の活性が抑制される半数効果量で、細胞の活性を検出することによって細胞の殺傷活性を反映させることができる。ここで、図１１Ａはヒト化抗体１２Ｂ１２バリアントおよびその抗体薬物複合体のＴＰＢＧ陽性の腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｈ１５６８に対する細胞殺傷活性の検出で、図１１Ｂはヒト化抗体２８Ｄ４バリアントおよびその抗体薬物複合体のＴＰＢＧ陽性の腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｈ１５６８に対する細胞殺傷活性の検出である。結果から、ヒト化ＴＰＢＧ抗体バリアントの抗体薬物複合体はＴＰＢＧ陽性のＮＣＩ−Ｈ１５６８細胞に対して殺傷作用があったが、複合してなかったヒト化抗体バリアントはＴＰＢＧ陽性のＮＣＩ−Ｈ１５６８細胞に対して殺傷作用がなかった。
実施例６ 異なるリンカー−毒素が複合した抗体薬物複合体
実施例１で得られた精製されたヒト化抗体１２Ｂ１２−１２および２８Ｄ４−３を、それぞれＭＣ−ＭＭＡＦまたはＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと複合させた。抗体をｐＨが６．５〜８．５のホウ酸ナトリウム緩衝液で透析した後、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を、ＴＣＥＰと精製されたＴＰＢＧ抗体のモル比が３になるように入れ、室温で１時間還元させ、反応液Ａを得た。反応液ＡをＧ２５カラムで脱塩させ（ＧＥから購入）、余分のＴＣＥＰを除去し、反応液Ｂを得た。反応液ＢにＭＣ−ＭＭＡＦまたはＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（南京連寧から購入）を、ＭＣ−ＭＭＡＦまたはＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと精製されたヒト化ＴＰＢＧ抗体のモル比が１０になるように入れ、室温で４時間反応させた。さらに余分のＭＣ−ＭＭＡＦまたはＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを中和するためにシステインを入れ、そしてＧ２５カラムで脱塩して余分の小分子を除去した。精製されたヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体を得た（複合方法はＤｏｒｏｎｉｎａ，２００６， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７，１１４−１２４を参照する）。それぞれＨＰＬＣ−ＨＩＣおよびＨＰＬＣ−ＳＥＣによって薬物の薬物抗体比や純度などのパラメーターを分析した後、体外細胞毒性分析および体内薬力学分析を行った。すべてのヒト化ＴＰＢＧ抗体複合体の薬物抗体比（ＤＡＲ）は３．０〜５．０であった。ここで、ＤＡＲ（ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ）とは、抗体が複合した後、１つの抗体分子に担持する小分子薬物の平均数量のことである。
実施例１で得られた精製されたヒト化抗体１２Ｂ１２−１２および２８Ｄ４−３を、それぞれ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）と複合させた。抗体をｐＨが６．５〜７．４のリン酸塩緩衝液で透析した後、体積比が３０％のＤＭＡの存在下においてＳＭＣＣを、ＳＭＣＣと精製されたＴＰＢＧキメラ抗体のモル比が８になるように入れ、室温で１時間反応させ、反応液Ａを得た。反応液ＡをＧ２５カラムで脱塩させ（ＧＥから購入）、余分の小分子を除去し、反応液Ｂを得た。反応液Ｂに最終体積が１０％になるようにＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）を入れた後、ＤＭ１（化学名はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−３−チオ−１−オキソプロピルマイタンシンである）を、ＤＭ１と精製されたＴＰＢＧ抗体のモル比が９になるように入れ、室温で３．５時間反応させ、反応液Ｃを得た。反応液ＣをＧ２５カラムで脱塩させ（ＧＥから購入）、余分の小分子を除去し、精製されたヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体を得た（複合方法はＵＳ５２０８０２０を参照する）。ＬＣ−ＭＳによって薬物の薬物抗体比を、ＳＥＣによって抗体薬物複合体の純度などのパラメーターを分析した後、体外細胞毒性分析および体内薬力学分析を行った。すべてのヒト化ＴＰＢＧ抗体複合体の薬物抗体比（ＤＡＲ）は３．０〜５．０であった。ここで、ＤＡＲ（ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ）とは、抗体が複合した後、１つの抗体分子に担持する小分子薬物の平均数量のことである。
実施例７ ヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体の体外薬力学実験
実施例６で得られた精製されたヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体は、それぞれ完全培地で勾配希釈し、９６ウェル細胞培養プレートに２０００細胞／ウェルで１００μＬのＴＰＢＧ陽性の非小細胞肺癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ１５６８（ＡＴＣＣから購入、カタログ番号＃ＣＲＬ−５８７６）細胞懸濁液を入れて一晩培養した後、各ウェルにそれぞれ１０μＬの異なる濃度の精製されたＴＰＢＧ抗体薬物複合体の希釈液を入れ、続いて５日培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａから購入され、使用方法は製品説明書を参照した）によって細胞の活力を検出した。同時にＴＰＢＧ弱発現の非小細胞肺癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＡＴＣＣから購入、カタログ番号＃ＣＲＬ−５９０８）および乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣから購入、カタログ番号＃ＨＴＢ−１３２）で細胞殺傷活性検出を行ったが、方法は上記と同様である。
結果は表１８および図１２に示される通りで、ここで、表１８のＩＣ５０とは、薬物で作用させた後、細胞の活性が抑制される半数効果量で、細胞の活性を検出することによって細胞の殺傷活性を反映させることができる。ここで、図１２Ａはヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体のＴＰＢＧ陽性の腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｈ１５６８に対する細胞殺傷活性の検出で、図１２Ｂはヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体のＴＰＢＧ弱陽性の腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｈ１９７５に対する細胞殺傷活性の検出で、図１２Ｃはヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体のＴＰＢＧ陽性の腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に対する細胞殺傷活性の検出である。結果から、ヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体がＴＰＢＧ陽性細胞に対して殺傷作用があったことが示された。異なる小分子毒素が複合した精製されたヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体が、ＴＰＢＧ陽性の細胞のいずれに対しても異なる程度の殺傷作用があり、ＭＣ−ＭＭＡＦが複合したＴＰＢＧキメラ抗体薬物複合体が低いＩＣ５０を有し、これによってその細胞殺傷能力が最も強いことが示された。
実施例８ 非小細胞肺癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ１９７５のマウス異種移植腫瘍モデル
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの右脇の皮下にＮＣＩ−Ｈ１９７５（非小細胞肺癌細胞株、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−５９０８）を（２×１０6個）２００μｌ接種し、７〜１０日で腫瘍が２００ｍｍ3に成長したら、体重、腫瘍が大きすぎるものおよび小さすぎるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムに７匹ずつ数組に分けた。群分けは表１９に示すように、異なる投与量の実施例６で製造されたヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＦ抗体薬物複合体の治療群、および同一の投与量のヒト化１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＦとヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＦ抗体薬物複合体の治療群であった。群分けは表２０に示すように、異なるリンカー−毒素に複合したヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＦ、２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥおよび２８Ｄ４−３−ＤＭ１の抗体薬物複合体の同一の投与量の治療群であった。Ｄ０から尾静脈に抗体を注射し、４日おきに１回、計４回投与し、週に２回腫瘍体積を測定し、マウス重量を量り、データを記録した。腫瘍体積（Ｖ）の計算式は、Ｖ＝１／２×ａ×ｂ2で、ここで、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅を表す。
結果を図１３Ａおよび図１３Ｂに示す。図１３Ａは異なる投与量のヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＦ抗体薬物複合体の治療後の腫瘍体積の変化を示すグラフで、図１３Ｂは異なる投与量のヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＦ抗体薬物複合体の治療後のマウス体重の変化を示すグラフである。結果から、未治療のマウスと比べ、すべての治療マウスは腫瘍体積が顕著に減少し、かつ投与量の増加とともに腫瘍体積の減少が顕著になり、１０ ｍｇ／ｋｇ投与量の治療群では腫瘍体積が投与後の３５日で腫瘍がほぼなくなり、後の持続的な観察で腫瘍が再びゆっくり成長し始めたことが示された。さらに、ヒト化抗体１２Ｂ１２−１２と２８Ｄ４−３に複合したＭＣ−ＭＭＡＦ抗体薬物複合体は１０ ｍｇ／ｋｇ投与量の治療群では効果が同等であった。
結果を図１４Ａおよび図１４Ｂに示す。図１４Ａは異なるリンカー−毒素に複合したヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＦ、２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥおよび２８Ｄ４−３−ＤＭ１の抗体薬物複合体の同一の投与量での治療後の腫瘍体積の変化を示すグラフで、図１４Ｂは異なるリンカー−毒素に複合したヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＦ、２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥおよび２８Ｄ４−３−ＤＭ１の抗体薬物複合体の同一の投与量での治療後のマウス体重の変化を示すグラフである。結果から、同一の投与量において、未治療のマウスと比べ、ＭＣ−ＭＭＡＦおよびＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥに複合したヒト化２８Ｄ４−３抗体薬物複合体の治療群では、マウスの腫瘍体積が顕著に減少し、かつ投与後の５０日で、ヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＦ治療群では、腫瘍が一旦消退してからゆっくり再び成長し、ヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥの治療群では腫瘍がほぼ消退したことが示された。未治療のマウスと比べ、ＳＭＣＣ−ＤＭ１に複合したヒト化２８Ｄ４−３抗体薬物複合体の治療群ではマウスの腫瘍体積が減少しなかった。これによって、異なるリンカー−毒素が複合した抗体薬物複合体はＮＣＩ−Ｈ１９７５腫瘍成長に対する抑制能力が異なることがわかる。
実施例９ 非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ１５６８のマウス異種移植腫瘍モデル
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの右脇の皮下に、ＮＣＩ−Ｈ１５６８（非小細胞肺癌細胞株、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−５８７６）を（１×１０7個）２００μｌ接種し、７〜１０日で腫瘍が２００ｍｍ3に成長したら、体重、腫瘍が大きすぎるものおよび小さすぎるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムに６匹ずつ数組に分けたが、群分けは表２１に示すように、異なるリンカー−毒素に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＦ、１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＥおよび１２Ｂ１２−１２−ＤＭ１抗体薬物複合体の異なる投与量の治療群であった。Ｄ０から尾静脈に抗体を注射し、４日おきに１回、計４回投与し、週に２回腫瘍体積を測定し、マウス重量を量り、データを記録した。腫瘍体積（Ｖ）の計算式は、Ｖ＝１／２×ａ×ｂ2で、ここで、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅を表す。
結果を図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。図１５Ａは異なるリンカー−毒素に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＦ、１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＥおよび１２Ｂ１２−１２−ＤＭ１抗体薬物複合体の異なる投与量での治療後の腫瘍体積の変化を示すグラフで、図１５Ｂは異なるリンカー−毒素に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＦ、１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＥおよび１２Ｂ１２−１２−ＤＭ１抗体薬物複合体の異なる投与量での治療後のマウス体重の変化を示すグラフである。結果から、未治療のマウスと比べ、すべての治療マウスは腫瘍体積が顕著に減少したことが示された。高投与量の１０ｍｇ／ｋｇ治療群は低投与量の２ｍｇ／ｋｇ治療群と比べ、ＮＣＩ−Ｈ１５６８腫瘍に対する抑制能力が強かった。また、１０ ｍｇ／ｋｇ投与量で投与後の３５日で、ＭＣ−ＭＭＡＦおよびＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥに複合したヒト化１２Ｂ１２−１２抗体薬物複合体の治療群では、腫瘍がほぼ消退したが、ＳＭＣＣ−ＤＭ１に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２抗体薬物複合体の治療群では、腫瘍が一旦小さくなってからゆっくり再び成長した。これによって、異なるリンカー−毒素が複合した抗体薬物複合体は、ＮＣＩ−Ｈ１５６８腫瘍成長に対する抑制能力が異なることがわかる。
実施例１０ 乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４６８のマウス異種移植腫瘍モデル
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣから購入、カタログ番号＃ＨＴＢ−１３２）細胞を、Ｌ−１５基礎培地に懸濁させて５０％ Ｍａｔｒｉｇｅｌを入れ、ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスの右脇の皮下に（１×１０7個）２００μｌ接種し、７〜１０日で腫瘍が２００ｍｍ3に成長したら、体重、腫瘍が大きすぎるものおよび小さすぎるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムに６匹ずつ数組に分けたが、群分けは表２２に示すように、異なるリンカー−毒素に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＦ、１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＥおよび１２Ｂ１２−１２−ＤＭ１抗体薬物複合体の異なる投与量の治療群であった。Ｄ０から尾静脈に抗体を注射し、４日おきに１回、計４回投与し、週に２回腫瘍体積を測定し、マウス重量を量り、データを記録した。腫瘍体積（Ｖ）の計算式は、Ｖ＝１／２×ａ×ｂ2で、ここで、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅を表す。
結果を図１６Ａおよび図１６Ｂに示す。図１６Ａは異なるリンカー−毒素に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＦ、１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＥおよび１２Ｂ１２−１２−ＤＭ１抗体薬物複合体の異なる投与量での治療後の腫瘍体積の変化を示すグラフで、図１６Ｂは異なるリンカー−毒素に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＦ、１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＥおよび１２Ｂ１２−１２−ＤＭ１抗体薬物複合体の異なる投与量での治療後のマウス体重の変化を示すグラフである。結果から、未治療のマウスと比べ、すべての治療群のマウスは腫瘍体積が顕著に減少したことが示された。また、２ｍｇ／ｋｇ投与量で投与後の４３日で、ＭＣ−ＭＭＡＦおよびＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥに複合したヒト化１２Ｂ１２−１２抗体薬物複合体の治療群では、腫瘍がほぼ消退したが、ＳＭＣＣ−ＤＭ１に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２抗体薬物複合体の治療群では腫瘍が一旦小さくなってからゆっくり再び成長した。これによって、異なるリンカー−毒素が複合した抗体薬物複合体はＮＣＩ−Ｈ１５６８腫瘍成長に対する抑制能力が異なることがわかる。
実施例１１ ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体薬物複合体のラット血清における安定性
尾静脉から単回で３ｍｇ／ｋｇのヒト化２８Ｄ４−ＭＭＡＥ複合体をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（上海ＳＬＡＣ実験動物有限公司から購入）に注射した後、それぞれ投与前、注射後１０分、１時間、４時間、８時間ならびに１、２、４、７、１４、２１および２８日で全血を２００μｌ採取し、回転数１４０００で５分間遠心した後、血清を単離し、ＥＬＩＳＡ方法によってそれぞれ血清における抗ＴＰＢＧ全抗体（全抗体は単独抗体および複合抗体を含む）および少なくとも１つの細胞毒性薬物を担持した複合体の濃度を測定した。血清における全ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体の濃度は、ＥＬＩＳＡによって検出したが、抗ヒトＦｃ抗体で捕獲して西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とカップリングされた抗マウスＦｃ抗体で検出した。血清における少なくとも１つの細胞毒性薬物を担持した複合体の濃度は、ＥＬＩＳＡによって検出したが、抗ＭＭＡＥ抗体で捕獲して西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とカップリングされた抗マウスＦｃ抗体で検出し、ここで、抗ＭＭＡＥ抗体（商品名ａｎｔｉ−ＭＭＡＦ−ｍＩｇＧ１、上海睿智化学研究有限公司から購入）は、ハイブリドーマ技術によって製造された。それぞれ抗ヒトＦｃ抗体および抗ＭＭＡＥ抗体をＰＢＳで所定の濃度（２〜５μｇ／ｍｌ）に希釈した後、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに被覆し、４℃で一晩被覆させた。ウェルにおける液体を捨てて回転乾燥し、ブロッキング液（ＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を入れて、室温で１時間ブロッキングした後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、使用に備えた。ＰＢＳＴで標準品を所定の濃度に希釈し、血清サンプルを必要によって適切に希釈し、２００μｌ／ウェルの希釈された被験血清サンプルまたは標準品を上記被覆された９６ウェルプレートに入れ、室温で１〜３時間インキュベートし、上清を捨てた後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、ＰＢＳで西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とカップリングされた抗マウスＦｃ抗体を適切な濃度に希釈し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに入れて３７℃で３０分間インキュベートし、上清を捨てた後ＰＢＳＴで３回洗浄した。各ウェルに１００μｌずつＴＭＢ呈色液を入れ、室温で５〜１０分間インキュベートした。各ウェルに１００μｌずつ２Ｎ硫酸停止液を入れて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによってＯＤ ４５０ｎｍ／６３０ｎｍの比を測定した。ＩＶ静注、１次消失および見掛け速度定数を有する２コンパートメントモデル（Ｍｏｄｅｌ ８，ＷｉｎＮｏｎｌｉｎｅａｒ Ｐｒｏ ｖ．５．０．１， Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）によって各動物からの異なるサンプリング時点での血清における全抗体および複合体の濃度データおを分析し、ヒト化抗ＴＰＢＧ抗体薬物複合体の体内安定性を分析した。
ラットにおいて行われた２８日の薬物動態学分析の結果は、図１７および表２３に示す。表２３において、ＣＬは合計クリアランスを表し、ＣＬ値が高いほど、代謝または除去が速いことを示す。Ｖｓｓは安定状態における見掛け分布容積を表し、Ｖｓｓ値が高いほど、組織分布が広いことを示す。Ｖ１は中央コンパートメントの分布容積を表し、当該値は実験動物の体重１ｋｇあたりの血清体積に近いはずである。α ｔ１／２は分布相半減期を表し、当該値は分布速度に関連する。β ｔ１／２は除去相半減期を表し、当該値は除去速度に関連する。ＡＵＣは濃度−時間曲線下面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ ｃｕｒｖｅ）を表し、被験物の血清における曝露量を示し、一般的に、曝露量が薬力学に直接関連する。
結果から、複合抗体と全抗体は類似する薬物動態学の特徴、たとえば長い半減期および非線形分布や除去などの特徴を有することがわかる。違いは、全抗体と比べ、複合抗体は高いクリアランス（ＣＬ）および低い消失半減期（β ｔ1/2）と曝露量（ＡＵＣ）示すことにあるが、これは従来のＡＤＣ薬物の代謝に合致し、ＡＤＣ薬物は、複数の分子からなる混合物で、異質性が高く、一部の複合体は血液循環の過程で分解するか、免疫反応を誘発することで、生体にＡＤＣ薬物に対する抗体を生じさせることによって、ＡＤＣ薬物が除去されるからと分析される。
実施例１２ ヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体のヒト腫瘍患者から誘導された異種移植腫瘍モデル（ＰＤＸ）における薬力学実験
ＰＤＸモデルは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のヒト由来の腫瘍モデル（患者の腫瘍組織をマウス上体内に接種し、マウスによって提供される環境に依存して成長した一つの異種移植モデルである。本発明のＰＤＸモデルは上海睿智化学研究有限公司から購入）である。免疫組織化学によって、ＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデルにおけるＴＰＢＧの発現を評価した。つまり、ＰＤＸモデルの新鮮な腫瘍組織を液体窒素で快速凍結した後、−８０℃の冷蔵庫に保存した。切片機で切片し、室温で４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。室温で３％過酸化水素水で５分間インキュベートすることによって、内因性ペルオキシダーゼをブロッキングした。室温で５％牛胎児血清で１５分間インキュベートすることによって、非特異性タンパク質の結合部位をブロッキングした。室温で組織切片をヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２−１２または同じタイプの対照抗体ｈＩｇＧと室温で１時間インキュベートした。室温で西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ヒト二次抗体であるＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏから購入）で３０分間インキュベートし、ＤＡＢで５分間呈色させた後、切片を水道水が入れてある槽に入れて反応を停止された。ヘマトキシリンで１０秒二次染色した後、水道水で３回洗浄した。塩酸アルコールで１秒分別した後、水道水で３回洗浄した。それぞれ７５％アルコールで２分間、９５％アルコールで２分間、１００％アルコールで３回脱水させ、キシレンで毎回２分間で３回処理した。その後、中性樹脂で封じ、顕微鏡によって染色の結果を観察して撮影した。ＰＤＸモデルにおけるＴＰＢＧの発現量は、図１８Ａ−Ｂに示される通りで、ここで、図１８Ａはヒト化抗ＴＰＢＧ抗体１２Ｂ１２−３のＰＤＸモデルの腫瘍組織切片における染色で、図１８Ｂは陰性対照抗体ｈＩｇＧのＰＤＸモデルの腫瘍組織切片における染色である。図１８に示された結果から、ＰＤＸモデルが後の薬力学実験に使用可能であった。
液体窒素保存タンクから凍結保存されたＰ１世代（上記ＰＤＸモデルの第一世代の腫瘍組織サンプル）の腫瘍サンプル（ＦＰ１）を取り出し、解凍後ＳＣＩＤマウス（北京ＶＩＴＡＬ ＲＩＶＥＲ実験動物有限公司から購入）の体内に皮下接種し、ＦＰ１＋１と名付け、毎日マウスの健康状態をモニタリングして、最初は目視検査で週に２回腫瘍成長をモニタリングした。週に２〜３回マウス体重を記録した。週に２〜３回腫瘍直径をノギスで測定した。腫瘍体積の計算公式は、Ｖ ＝ １／２ × ａ×ｂ2で、ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長径および短径を表す。腫瘍が１０００ ｍｍ3に成長したら、マウスを安楽死させ、新鮮な腫瘍組織を取り出し、小さいブロックに切ってメスのヌードマウスの体内に接種し、この方法によって３回以上継代してから薬力学実験に使用した（ＦＰ１＋３）。
６〜８週齢で１６〜１９ｇのメスＮｕ／Ｎｕマウスを購入し（北京ＶＩＴＡＬ ＲＩＶＥＲ実験動物有限公司から購入）、動物が届いたらＳＰＦ級動物部屋においてＩＶＣ（独立送風システム）かごで７日飼育した後、実験を開始した。マウスの個体差によって腫瘍組織の成長速度が異なるため、腫瘍体積の最小分散でランダムに群分けができるように、少なくとも５０％多い動物数で用意した。上記蘇生させた腫瘍組織をメスＮｕ／Ｎｕマウスに接種し、毎日マウスの健康状態をモニタリングして、最初は目視検査で週に２回腫瘍成長をモニタリングし、そして週に２〜３回マウス体重を記録した。腫瘍が触れられるようになったら、週に２〜３回腫瘍直径をノギスで測定して腫瘍体積を計算した。腫瘍が１００ｍｍ3に成長したら、体重、腫瘍が大きすぎるものおよび小さすぎるものを除去し、腫瘍体積によってマウスをランダムに１０匹ずつ分けたが、群分けは表２４に示すように、異なるリンカー−毒素に複合したヒト化１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＦ、１２Ｂ１２−１２−ＭＭＡＥおよび１２Ｂ１２−１２−ＤＭ１抗体薬物複合体の異なる投与量の治療群であった。Ｄ０から尾静脈に抗体を注射し、４日おきに１回、計４回投与し、週に２回腫瘍体積を測定し、マウス重量を量り、データを記録した。腫瘍体積（Ｖ）の計算式は、１／２×ａ×ｂ2で、ここで、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅を表す。
結果を図１９Ａおよび図１９Ｂに示す。図１９Ａはヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ複合体の異なる投与量で治療後の腫瘍体積の変化を示すグラフで、図１９Ｂはヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ複合体の異なる投与量で治療後の動物体重の変化を示すグラフである。結果から、未治療群では、マウスの腫瘍体積が持続的に成長し、実験の３５日目に腫瘍体積が１０００ｍｍ3を超えたので安楽死させた。未治療群のマウスと比べ、すべての治療群ではマウスの腫瘍体積が顕著に減小し、投与から３日後腫瘍の成長が抑制されるようになり、投与から１０日後腫瘍の成長が顕著に抑制され、かつ投与から２８日後と投与量１、３、１０ｍｇ／ｍｌの異なる投与量群のいずれでも腫瘍が完全に消退し、そしてそれから１か月続いた観察では腫瘍が消退した状態が維持したが、これによって抗ＴＰＢＧ抗体ＭＭＡＥ薬物複合体が非小細胞肺癌患者から誘導された異種移植腫瘍ＰＤＸのマウス体内における成長に顕著な抑制作用を有する。
実施例１３ ヒト化ＴＰＢＧ抗体薬物複合体と抗ＰＤ−１抗体の組み合わせ治療による腫瘍成長に対するの抑制のマウス体内における免疫記憶の形成
ヒト由来ＴＰＢＧのＣＴ２６安定細胞株（ＣＴ２６−ｈＴＰＢＧ安定細胞株）（上海睿智化学研究有限公司から購入）、製造方法およびフローサイトメーターによる検出方法は、実施例１の（二）「免疫原Ｂの製造」と同様で、ここで、マウス結腸癌細胞ＣＴ２６はＡＴＣＣから購入された。
ＣＴ２６−ＴＰＢＧ細胞を（１×１０6個）５０μｌでＢａｌｂ／ｃマウスの右脇の皮下に接種し、接種から５〜７日後、腫瘍体積が５０〜１００ｍｍ3の動物を３２匹選択し、腫瘍体積によってマウスをランダムに４群に８匹ずつ分けた。それぞれ溶媒対照群、単独のヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ抗体薬物複合体の治療群、単独の抗−ＰＤ−１治療群、およびヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ抗体薬物複合体と抗−ＰＤ−１の組み合わせ治療群であった。群分けは表２５に示す。
ヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ抗体薬物複合体を尾静脈に注射し、群分けの当日（Ｄ０と定義される）に１回投与した。抗−ＰＤ−１抗体はＤ０から腹腔に週に２回、計８回注射投与し、週に２回マウス体重を記録し、かつノギスで腫瘍の長径・短径を測定し、Ｖ＝１／２ａ × ｂ2という式で腫瘍体積Ｖを算出したが、ここで、ａ、ｂはそれぞれ腫瘍の長径、短径をいう。腫瘍体積が２０００ｍｍ3に達した動物は実験の終点に達したと見なし、安楽死させ、そして動物の生存時間に対して生存期間を分析した。
各群の腫瘍成長曲線では、投与からＤ１４日の時点で、溶媒対照群と比べ、各投与群のいずれでも腫瘍成長が顕著に抑制され、かつ併用治療群では、腫瘍抑制作用が顕著に単独の薬物治療群よりも優れたことが示された（図２０Ａ、ｐ値＜０．００１、２元配置反復測定分散分析）。腫瘍体積が２０００ｍｍ3に達した時点を実験終点とする生存期間の分析では、溶媒対照群と比べ、ヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ抗体薬物複合体と抗−ＰＤ−１の単独薬物治療および併用治療は顕著に腫瘍担持マウスの生存期間を延ばし、かつ併用治療が顕著に単独薬物治療よりも優れたことが示された（図２０Ｂ、ｐ値＜０．０５、ログランク検定）。また、各群の単独の腫瘍成長状況を分析した結果、対照群および各単独薬物治療群のいずれでも腫瘍が６０日内で２０００ｍｍ3に達したが、逆に、併用治療群では、投与Ｄ１２の時点で腫瘍が完全に消退した現象が現れ、Ｄ６０に達した時点で、併用治療群では計３匹の動物は腫瘍が完全になくなり、その完全緩和率が３７．５％に達したことが示された（図２０Ｃ）。投与からＤ１０６の時点で同様の数量のＣＴ２６−ｈＴＰＢＧ細胞を、３匹の完全に緩和したマウスの左脇の皮下に接種し、２回目の３０日接種の研究期間内で各マウスはいずれも腫瘍が形成しなかったが、これらのマウス体内にすでに免疫記憶が形成したことが示唆された（図２０Ｄ）。
上記のように、ヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ抗体薬物複合体がＣＴ２６−ｈＴＰＢＧマウスモデルに対する抗−ＰＤ−１抗体の抗腫瘍活性を顕著に増強させる。両者の併用の完全緩和率が３７．５％に達する。ヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ抗体薬物複合体または抗−ＰＤ−１抗体の単独治療と比べ、ヒト化２８Ｄ４−３−ＭＭＡＥ抗体薬物複合体と抗−ＰＤ−１抗体の併用治療はマウスの生存期間を顕著に延ばし、かつ組み合わせ治療後、腫瘍が完全に緩和されたマウスは体内で免疫記憶が形成する。
以上、本発明の具体的な実施形態を記述したが、当業者にとって、これらは例示の説明だけで、本発明の原理と実質に反しないという前提下において、これらの実施形態に対して様々な変更や修正をすることができる。そのため、本発明の保護範囲は添付の請求の範囲によって限定される。

Claims (20)

  1. （ａ）ヒト抗体のフレームワーク領域の残基を含むフレームワーク領域と、
    （ｂ）配列番号４または８で示されるマウス由来抗体の軽鎖可変領域の一つまたは複数のＣＤＲ、あるいは配列番号２または６で示されるマウス由来抗体の重鎖可変領域の一つまたは複数のＣＤＲと、
    を含むことを特徴とするヒト化抗ＴＰＢＧ抗体。
  2. 前記のヒト抗体のフレームワーク領域は、ヒト抗体の重鎖のフレームワーク領域およびヒト抗体の軽鎖のフレームワーク領域を含み、前記ヒト抗体の軽鎖のフレームワーク領域は、１）Ｏ２、Ｏ１２、Ｏ１８、ＤＰＫ２、ＤＰＫ３、ＤＰＫ４、ＤＰＫ５、ＤＰＫ６、ＤＰＫ７、ＤＰＫ８、ＤＰＫ９、ＤＰＫ１０、Ａ２、ＤＰＫ１３、ＤＰＫ１５、ＤＰＫ１６、ＤＰＫＩ８、ＤＰＫ１９、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２３、Ｂ３、ＤＰＫ２５、ＤＰＫ２６またはＤＰＫ２８系列におけるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域、ならびに２）Ｊｋ断片Ｊｋ１、Ｊｋ２、Ｊｋ３、Ｊｋ４またはＪＫ５系列におけるＦＲ４領域を含み、
    ならびに／あるいは、前記ヒト抗体の重鎖のフレームワーク領域は、１）ＤＰ４、ＤＰ７、ＤＰ８、ＤＰ９、ＤＰ１０、ＤＰ３１、ＤＰ３３、ＶＨ３−１１、ＤＰ４５、ＤＰ４６、ＤＰ４７、ＤＰ４８、ＶＨ３−３０、ＤＰ５０、ＶＨ３−４８、ＤＰ５３、ＤＰ５４、ＤＰ６５、ＤＰ６６、ＤＰ６７、ＤＰ６８またはＤＰ６９系列におけるＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３領域、ならびに２）ＪＨ断片ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ４ｂ、ＪＨ５またはＪＨ６系列におけるＦＲ４領域を含み、
    好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のうちの３１番目〜３５番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１のうちの９１番目〜１０５番目で示され、
    前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のうちの５０番目〜６６番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１のうちの１４８番目〜１９８番目で示され、
    前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のうちの９９番目〜１０９番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１のうちの２９５番目〜３２７番目で示され、
    および／または、前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４のうちの２４番目〜３８番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３のうちの７０番目〜１１４番目で示され、
    前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４のうちの５４番目〜６０番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３のうちの１６０番目〜１８０番目で示され、
    前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４のうちの９３番目〜１０１番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３のうちの２７７番目〜３０３番目で示され、
    あるいは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６のうちの３１番目〜３５番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５のうちの９１番目〜１０５番目で示され、
    前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６のうちの５０番目〜６６番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５のうちの１４８番目〜１９８番目で示され、
    前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６のうちの９９番目〜１０９番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５のうちの２９５番目〜３２７番目で示され、
    および／または、前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表の配列番号８のうちの２４番目〜３４番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号７のうちの７０番目〜１０２番目で示され、
    前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８のうちの５０番目〜５６番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７のうちの１４８番目〜１６８番目で示され、
    前記マウス由来抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８のうちの８９番目〜９７番目で示され、より好ましくは、前記マウス由来抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７のうちの２６５番目〜２９１番目で示される、
    ことを特徴とする請求項１に記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体。
  3. 前記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体は、少なくとも１つの重鎖可変領域および／または少なくとも１つの軽鎖可変領域を含み、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号２、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０で示され、前記の軽鎖可変領域は、配列表における配列番号４、配列番号８、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号４２、配列番号４４または配列番号４６で示され、
    好ましくは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列表における配列番号１、配列番号５、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号３９で示され、前記の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列表における配列番号３、配列番号７、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５で示され、
    あるいは、前記の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号２、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、前記の軽鎖可変領域は、配列表における配列番号４、配列番号８、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号４２、配列番号４４または配列番号４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、
    好ましくは、前記の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号１、配列番号５、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号３９で示されるヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、前記の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号３、配列番号７、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５で示されるヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列である、
    ことを特徴とする請求項２に記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体。
  4. 前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２１で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号２９で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２１で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示される配列であるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示される配列で、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示される配列である、
    ことを特徴とする請求項３に記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体。
  5. 前記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体は、さらに、ヒト由来抗体の重鎖定常領域および／またはヒト由来抗体の軽鎖定常領域を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体。
  6. 前記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体は、抗体の全長タンパク質、抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体または単一領域抗体であるか、
    あるいは、前記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であるか、
    あるいは、前記のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体はスーパーヒト化抗体またはダイアボディである、
    ことを特徴とする請求項１に記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体。
  7. 請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体をコードし、
    好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸および／または前記軽鎖可変領域をコードする核酸を含み、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４０で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１、配列番号５、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号３９で示され、
    好ましくは、前記軽鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号４、配列番号８、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号４２、配列番号４４または配列番号４６で示され、より好ましくは、前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３、配列番号７、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５で示される、
    ことを特徴とする核酸。
  8. 前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は配列表の配列番号２４で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２５で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２１で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２１で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域の核酸がコードするアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６で示され、より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５で示される、
    ことを特徴とする請求項７に記載の核酸。
  9. 請求項７または８に記載の核酸を含む組み換え発現ベクター。
  10. 請求項９に記載の組み換え発現ベクターを含む組み換え発現形質転換体。
  11. 請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体の製造方法であって、請求項１０に記載の組み換え発現形質転換体を培養し、培養物からヒト化抗ＴＰＢＧ抗体を得る工程を含むことを特徴とする方法。
  12. 共役的に細胞毒剤に連結した請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体を含む、ことを特徴とする免疫複合体。
  13. １当量の請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体は、ｘ当量のリンカーを介してｙ当量の細胞毒剤に連結し、式１で表される構造を有することを特徴とする請求項１２に記載の免疫複合体。
    Ａｂ−（Ｌ）x− （Ｄ）y
    式 １
    （ただし、Ａｂは請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体で、Ｌはリンカーで、Ｄは細胞毒剤で、ｘは自然数で、好ましくは１〜２０の整数で、ｙは０または自然数で、好ましくは０〜２０の整数で、ｘおよびｙはそれぞれ独立に１〜２、または２〜４、または３〜５、または４〜８、または８〜２０的整数がより好ましく、ｘとｙの比率は１：１が好ましい。）
  14. 前記リンカーＬは、活性エステル、炭酸塩類、カルバメート類、イミンリン酸エステル、オキシム類、ヒドラゾン類、アセタール類、オルトエステル類、アミノ類、短鎖ペプチド断片またはヌクレオチド断片である、ことを特徴とする請求項１３に記載の免疫複合体。
  15. 前記リンカーＬは、マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルアルコール（ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）から選ばれ、ならびに／あるいは、前記Ｄは、細胞毒素、化学治療剤、放射性同位元素、治療性核酸、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤・アポトーシス促進剤または細胞溶解酵素から選ばれる、ことを特徴とする請求項１４に記載の免疫複合体。
  16. 前記式１において、ｘ＝ｙ＝ｎで、前記免疫複合体の構造が式３または式４または式５で表される、ことを特徴とする請求項１２〜１５のいずれかに記載の免疫複合体。
    （式３において、ｍは１〜１０で、好ましくは、ｍは５で、すなわち、マレイミドカプロイルで、ＤはモノメチルアウリスタチンＦである。）
    （式４において、Ｌは４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミドエステルで、ＤはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−３−チオ−１−オキソプロピルマイタンシン（ＤＭ１）である。）
    （式５において、Ｌはマレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルアルコールで、ＤはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。）
    （ここで、ｎは自然数で、好ましくは１〜２０の整数で、より好ましくは１〜２、または２〜４、または３〜５、または４〜８、または８〜２０の整数である。）
  17. 請求項１２〜１６のいずれかに記載の免疫複合体と、薬学的に許容される担体とを含み、好ましくはさらにほかの抗腫瘍抗体を活性成分として含み、前記の抗体は抗ＰＤ−１抗体が好ましい、ことを特徴とする薬物組成物。
  18. 成分Ａおよび成分Ｂを含み、前記の成分Ａは請求項１〜６に記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体、または請求項１２〜１６のいずれかに記載の免疫複合体、または請求項１７に記載の薬物組成物で、前記の成分Ｂはほかの抗腫瘍抗体または前記ほかの抗腫瘍抗体を含む薬物組成物であり、前記の抗体は抗ＰＤ−１抗体が好ましい、ことを特徴とするキット。
  19. 抗腫瘍薬物の製造における請求項１〜６に記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体、または請求項１２〜１６のいずれかに記載の免疫複合体、または請求項１７に記載の薬物組成物または請求項１８に記載のキットの使用。
  20. 請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体を被験サンプルと体外で接触させ、請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗ＴＰＢＧ抗体と前記被験サンプルの結合を検出する工程を含む、ことを特徴とするＴＰＢＧタンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法。
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