JP2020514349A - 癌の処置のための併用治療剤におけるａｐｅ１／ｒｅｆ−１阻害剤の使用 - Google Patents

癌の処置のための併用治療剤におけるａｐｅ１／ｒｅｆ−１阻害剤の使用 Download PDF

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Abstract

脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ／酸化還元（レドックス）因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）のレドックス機能を阻害するのに特異的なＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤を含む併用治療剤が本願明細書に開示される。この併用治療剤は、種々の癌、及び他の血管新生媒介性疾患（例えば、網膜疾患、心血管疾患）を処置するために使用することができる。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年３月２０日出願の米国仮出願第６２／４７３，５２８号、及び２０１７年６月１６日出願の米国仮出願第６２／５２１，０８２号に基づく優先権を主張する。これらの出願は、参照によりその全体を本願明細書に援用する。
配列表の提出を裏付ける陳述
ファイル名「ＩＵＲＴＣ＿２０１７−１０９−０４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のファイルを含有するコンピューター可読形式の配列表が本願明細書に提示され、これを、参照により本願明細書に援用する。このファイルは、（マイクロソフトウインドウズ（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ ＷＩＮＤＯＷＳ）（登録商標）エクスプローラー（ＥＸＰＬＯＲＥＲ）で調べたところ）サイズが６，４０６バイトである。この配列表は配列番号１〜配列番号３３からなる。
本開示は、全体として、種々の癌を処置するための併用治療剤における脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ／酸化還元（レドックス）因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤の使用に関する。特に、本開示は、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、悪性末梢神経鞘腫、白血病等の癌、及び他の血管新生媒介性疾患（例えば、網膜疾患、心血管疾患）を処置するための併用治療剤における、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のレドックス活性（本明細書中では「Ｒｅｆ−１」ともいう）の非常に選択的な阻害剤であるＡＰＸ３３３０（以前はＥ３３３０として知られていた）の使用に関する。
脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ／酸化還元（レドックス）因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）は、もともとは、酸化的損傷及びアルキル化による損傷の塩基除去修復（ＢＥＲ）経路の修復において非常に重要な役割を果たすエンドヌクレアーゼとして特定された。後に、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１は、特定の転写因子の活性を調節するレドックスシグナル伝達タンパク質として認識された。それ以降、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のさらなる機能が明らかにされてきている。修復及びレドックス活性におけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重性及び中核的位置により、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１は、治療的調節のための独特の標的となっている。
ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１エンドヌクレアーゼ活性は、すべての細胞においてＤＮＡ損傷応答にとって不可欠であり、このため、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１は細胞の機能及び生存における非常に重要な非常に重要なファクターとなっている。この修復機能は大腸菌からヒトまで保存されてきている。しかしながら、レドックスシグナル伝達機能は哺乳動物においてのみ見られる。
ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達は、ＳＴＡＴ３、ＨＩＦ−１α、ＮＦ−κΒ、ＡＰ−１、ｐ５３、及び他のいくつかを含めて数多くの転写因子に影響を及ぼす。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達は、特定の転写因子の中の酸化されたシステイン残基をそれらのトランス活性化の一部として還元する高度に制御されたプロセスである（図１）。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１発現は多くの腫瘍型で増加し、その変化は、腫瘍細胞における成長、遊走、及び薬物耐性の上昇又は増大、並びに患者生存の低下と関連づけられている。
ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１が影響を及ぼす経路が理由で、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１は、腫瘍シグナル伝達における非常に重要な節点（ノード）として見え（図２）、従って、抗癌治療についての第１標的である。しかしながら、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のエンドヌクレアーゼ機能又はレドックス機能のみを標的とする特異的阻害剤を創製するためにＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の活性を解き明かすことは困難である。特に、天然源から単離されたいくつかの化合物がＲｅｆ−１レドックスシグナル伝達阻害剤として提案されてきているが、Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達を直接又は特異的に阻害すると示されたものはない。これらの天然化合物の一例であるレスベラトロールは上記他の化合物の典型例である。そのインビボ効力は、大きくばらつくバイオアベイラビリティー及び低い分子特異性に起因してせいぜい散発的である。別の天然のＲｅｆ−１レドックス阻害剤とされるクルクミンは、相手を選ばない化合物として確立されているが、様々な分子と相互作用して、数多くの生物学的アッセイにおいて偽陽性の結果を与える。従って、これらは特異的な又は実行可能なＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックス阻害剤ではない。
しかしながら、近年、化合物ＡＰＸ３３３０（以前はＥ３３３０と呼ばれていた）が特異的ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックス阻害剤として特定されている。ＡＰＸ３３３０は、Ｒｅｆ−１のエンドヌクレアーゼ活性に影響を及ぼさない、このタンパク質のレドックス活性の直接的で非常に選択的な阻害剤として広く十分に特徴づけられている（図６）。ＡＰＸ３３３０を用いた処置は、インビトロモデル及びインビボモデルの両方において、限定的な毒性で腫瘍の成長及び進行を示している。
ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１等の標的をさらに評価して、相関的バイオマーカー研究を含めて併用治療剤を合理的に設計し、これによって治療法の選択肢が限られたままになっている癌患者のための処置を提供することは好都合であろう。さらに、単独で投与された場合の治療剤の効果と比較して共阻害が細胞死の劇的な増強につながる、２つの標的の合成の併用治療剤を特定することはさらに有益であろう。
本開示は、全体として、種々の癌を処置するための併用治療剤における、選択的なＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤ＡＰＸ３３３０及びこれから誘導される化合物（例えば、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４）の使用に関する。この併用治療剤は、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、悪性末梢神経鞘腫、白血病等の癌、及び他の血管新生媒介性疾患（例えば、網膜疾患、心血管疾患）を処置することが見出されている。
従って、１つの態様では、本開示は、脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ／酸化還元（レドックス）因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤と第２治療剤とを含む併用治療剤であって、上記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤がＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のレドックス機能を阻害する併用治療剤に関する。
別の態様では、本開示は、癌の処置のための併用治療剤の使用であって、上記併用治療剤が脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ／酸化還元（レドックス）因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤と第２治療剤とを含み、上記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤がＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のレドックス機能を阻害する使用に関する。
さらに別の態様では、本開示は、処置を必要とする被験者における網膜疾患の処置のための併用治療剤の使用であって、上記併用治療剤が脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ／酸化還元（レドックス）因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤と第２治療剤とを含み、上記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤が、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のエンドヌクレアーゼ機能又はレドックス機能を阻害する使用に関する。
さらに別の態様では、本開示は、心血管疾患、細菌性感染症、胃の炎症性障害、及び神経変性疾患からなる群から選択される疾患の処置のための併用治療剤の使用に関する。
本開示の以下の詳細な説明を考慮すると、本開示は、よりよく理解され、上述の特徴、態様及び利点以外の特徴、態様及び利点が明らかになるであろう。このような詳細な説明は、以下の図面を参照する。
図１はＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重機能を描く。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１はレドックスシグナル伝達及びＤＮＡ修復に関与する多機能タンパク質である。このレドックスシグナル伝達機能（Ｒｅｆ−１）は、特定の転写因子（ＴＦ）の中の酸化されたシステイン残基の還元を担い、細胞成長、炎症、血管新生、及び他の細胞機能に関与する遺伝子の転写活性の上昇及び上方制御につなげる。上記ＤＮＡ修復機能（ＡＰＥ１）は、塩基除去修復においてエンドヌクレアーゼ活性を担い、ＤＮＡのホスホジエステル骨格をグリコシラーゼによって作り出された脱塩基部位で切断する。これらの切断によって脱塩基部位が適切なヌクレオチド塩基で置き換えられることが可能になり、ＤＮＡ塩基除去修復プロセスを完了する。 図２は、腫瘍細胞におけるノードとしてのＲｅｆ−１シグナル伝達及び関連経路における有望な阻害剤を描く。Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達はＳＴＡＴ３、ＨＩＦ−１α、及びＮＦ−κΒ等の転写因子のトランス活性化を促進する。Ｒｅｆ−１をＡＰＸ３３３０で阻害することは、下流の遺伝子の発現を低下させ、腫瘍細胞成長の停止及び／又は（細胞）死につながる。加えて、Ｒｅｆ−１によって影響を受けるシグナル伝達経路及びこれらの経路によって上方制御される酵素を阻害するための他の方法は、Ｒｅｆ−１阻害の細胞毒性効果及び細胞増殖抑制効果を増強することが示された。 図３Ａ及び図３Ｂは、Ｒｅｆ−１及びＪａｋ／ＳＴＡＴのシグナル伝達の二重標的化が三次元共培養モデルにおいてＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害することを描く。図３Ａは、ＣＡＦの存在下及び不存在下で三次元培養物において成長したＰａ０３Ｃ低継代患者由来腫瘍細胞を示す。スフェロイドは、ルキソリチニブ単独で、及びルキソリチニブとＡＰＸ３３３０（４０μＭ）とを組み合わせて処置され、腫瘍（赤色チャネル）及びＣＡＦ１９番号１（緑色チャネル）の面積が１２日後に培養物中で、ｎ＝４で定量され、倍率変化は、腫瘍単独スフェロイドにおける薬物処置済み対培地のみの比較を指す。図３Ｂは、プレーティング後８〜１０日目の三次元アッセイにおけるルキソリチニブ（１２．５μＭ）処置の４時間後のｐＳＴＡＴ３ Ｙ７０５残渣についての免疫ブロットによるＳＴＡＴ３活性化の阻害の確認を描く。全ＳＴＡＴ３タンパク質は、負荷対照として、及び両方の細胞型におけるＳＴＡＴ３のレベルの基準として提供される。代表的なウエスタンブロットは、ｎ＝３から示される。 図４は、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の多機能性に起因するヒト疾患におけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の効果を描き、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１は広い範囲のヒト疾患に影響する。Ｒｅｆ−１の発現の変化は、複数の転写因子に対するその制御に影響を及ぼし、種々の癌、網膜疾患、心血管疾患、胃疾患及び神経変性疾患につながる。同様に、改変されたＡＰＥ１ ＤＮＡ修復機能は、様々な癌及び神経変性疾患の進行に影響を及ぼす。 図５は、酸化的ＤＮＡ損傷を含めた抗癌処置が感覚神経機能を変えることを描く。これらの薬剤としては、シスプラチン、オキサリプラチン、電離放射線及び他の薬物が挙げられる。ＲＯＳ、活性酸素種；Ｐｔ、白金付加物；ＡＰＥ１、脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ。 図６Ａは、感覚神経対腫瘍細胞の、ＡＰＥ１レドックス阻害の差異的役割を描く。腫瘍細胞において、Ｒｅｆ−１レドックス阻害は、腫瘍成長、生存、遊走及び腫瘍炎症に対して複数の下流効果を及ぼす。ＤＲＧニューロン等の感覚神経細胞では、ＡＰＸ３３３０の添加は、細胞に対して負の効果を及ぼさず、ＤＮＡ ＢＥＲ経路を誘発した酸化的ＤＮＡ傷害剤（例えばシスプラチン、オキサリプラチン）に対するＲｅｆ−１ ＤＮＡ修復活性の増強を通して生存及び機能保護を促す（図６Ａ）。下側右のパネルでは、ＡＰＸ３３３０は、腫瘍保有マウスへのシスプラチンの全身投与によって誘導される神経毒性を減弱させる。 図６Ｂ〜図６Ｅは、感覚神経対腫瘍細胞の、ＡＰＥ１レドックス阻害の差異的役割を描く。図６Ｂは、ＤＲＧ内でのＤＮＡ損傷に対するシスプラチン及びＡＰＸ３３３０の効果の検討のための処置概念図式を描く。神経芽細胞腫細胞が６週齢の雄のＮＳＧマウスの右側腹部に皮下移植され、腫瘍量が１５０ｍｍ３以上になるまで増殖するようにされた。次に、マウスは、シスプラチン±ＡＰＸ３３３０処置を用いる処置について無作為化された。シスプラチン及びＡＰＸ３３３０は、３週間（０日目〜１７日目）同時に投与され、神経細胞毒性のエンドポイントを、シスプラチンの最後の用量の後のいくつかの時間点においてマウスのＤＲＧ内で評価した。図６Ｃは、２４日目及び３１日目のｐＨ２Ａ．Ｘ免疫反応性を実証する代表的なブロットである。図６Ｄ及び図６Ｅは、ｐＨ２Ａ．Ｘ免疫反応性の定量化を描く。星印は、ｐ＜０．０５でチューキー（Ｔｕｋｅｙ）の事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定される、１８日目と２４日目との間の統計的有意性を示す。十字架は、ｐ＜０．０５でボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）の事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによって決定される、Ｖｅｈ／Ｖｅｈ群とＶｅｈ／Ｃ ｉｓ群との間の統計的有意性を示す。 図７は、ＡＰＸ３３３０が様々な癌において幅広い有望性を有することを描く。支持する前臨床データは、略図（右から２番目の縦列の箱）に掲載されている各薬物と組み合わせたＡＰＸ３３３０について、及び各適応症（一番右の箱）について存在する。＊抗腫瘍活性に加えて、ＡＰＸ３３３０は、ニューロンへの酸化的損傷を引き起こす薬剤と一緒に投与されるとき、神経防護作用をもたらす。 図８Ａ〜図８Ｃは、ｓｉＲＮＡノックダウン後の細胞におけるＡＰＥ１発現及びバッチ効果を描く。図８Ａは、２０ｎＭ ｓｉＲＮＡを用いたＡＰＥ１ノックダウン後のＰａ０３Ｃ細胞の代表的なウエスタンブロット及び濃度測定分析である。ビンキュリンが負荷対照として使用される。ｓｉＡＰＥ１試料は、ＳＣＲ対照試料と比較して１０％ＡＰＥ１レベルを有していた。図８Ｂは、未補正遺伝子発現データの主成分分析を描く。図８Ｃは、補正後の遺伝子発現データの主成分分析を描く。細胞周期注釈付き遺伝子を用いたバッチ効果の補正の後、ＳＣＲ１群及びＳＣＲ２群は、ｘ軸に沿って一緒になり、単一のＳＣＲ群を形成する。 図９Ａ〜図９Ｂは、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑの結果及び分析の比較を描く。図９Ａは、ＳＣＲ、検出可能ｓｉＡＰＥ１及び検出不能ｓｉＡＰＥ１の試料における百万リードあたりのＡＰＥ１ ＲＮＡ発現カウント（ＣＰＭ）の差を説明するバイオリンプロットである。図９Ｂは、この分析における２つの群としてＳＣＲ細胞及びｓｉＡＰＥ１細胞を用いる平均発現及び倍率変化プロットを描く。 図９Ｃは、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑの結果及び分析の比較を描く。図９Ｃは、この分析においてＳＣＲ細胞、検出可能ｓｉＡＰＥ１細胞及び検出不能ｓｉＡＰＥ１細胞を用いる平均発現及び倍率変化プロットを描く。この分析は３つの別個の群を使用するが、このプロットは、グラフの限界のため、平均発現及び倍率変化の算出のためにＳＣＲ及びｓｉＡＰＥ１を使用することに留意されたい。 図１０Ａ〜図１０Ｇは、ＡＰＥ１レベルに関連して差異的に発現される遺伝子の特定を描く。図１０Ａは、ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータに対して実施された３つの分析及びそれらの間の重複遺伝子を示すベン図である。６つの遺伝子がすべての３つの分析で有意に変化した（図１０Ｂ）ＴＭＥＭ４５Ａ、（図１０Ｃ）ＴＭＥＭ１２６Ａ、（図１０Ｄ）ＴＭＥＭ１５４、（図１０Ｅ）ＣＯＭＭＤ７、（図１０Ｆ）ＩＳＹＮＡ１及び（図１０Ｇ）ＴＮＦＡＩＰ２。これらの遺伝子は発現の増大変化を示す。というのも、ＡＰＥ１レベルはＳＣＲから検出可能（しかし低下している）ｓｉＡＰＥ１へ、そして検出不能ｓｉＡＰＥ１へとさらに低下するからである。 図１１Ａは、重複する過剰出現標準経路を描く。図１１Ａは、ＳＣＲ／検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１結果に対するＩＰＡ分析後の２０個の最も有意に過剰出現した経路を描く。ｘ軸は、過剰出現経路において差異的に発現された遺伝子の数を示す。ｙ軸上の経路ラベルの隣にある百分率は、ＳＣＲ細胞とｓｉＡＰＥ１細胞との間で差異的に発現されるその経路における遺伝子の百分率を示す。 図１１Ｂは、重複する過剰出現標準経路を描く。図１１Ｂは、ＥＩＦ２経路における変化を描く。このＥＩＦ２経路は、７０個のＤＥＧによるＡＰＥ１ノックダウンによって最も影響を受ける経路であった。ｓｉＡＰＥ１細胞においてより高く発現される遺伝子としてはｅＩＦ５及びｅＩＦ４Ｅが挙げられ、他方で、対照細胞においてより高く発現されるものとしてはｅＩＦ２γ、ｅＩＦ３、ＧＡＤＤ３４、Ｇ−アクチン、及び４０Ｓリボソームサブユニットが挙げられる。差異的に発現されると特定された遺伝子又は複合体は、丸で囲まれており、太字になっている。 図１１Ｃは、重複する過剰出現標準経路を描く。図１１Ｃは、ＥＩＦ２経路に関与する１細胞あたりのＤＥＧの発現の変化を示すヒートマップである。色を示す箱は、示された発現の規格化された変化に対応する。 図１２Ａ〜図１２Ｄは、Ｐａ０３Ｃ細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲによるｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑの検証を描く。図１２Ａは、ＳＣＲ／ｓｉＡＰＥ１検証後のｑＲＴ−ＰＣＲ検証のために選ばれた遺伝子を描く。図１２Ｂは、ｑＲＴ−ＰＣＲ検証のために選ばれたすべての３つの分析において統計的に有意な遺伝子を描く。 図１２Ｃ〜図１２Ｄは、Ｐａ０３Ｃ細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲによるｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑの検証を描く。図１２Ｃは、Ｐａ０３Ｃ細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した選択された遺伝子の発現を示す。この細胞は、ｓｉＲＮＡノックダウン後に採取され、８０％以上のＡＰＥ１タンパク質レベルの低下について評価された。各グラフは３つの独立の実験の結果であり、ＳＣＲと比較したｓｉＡＰＥ試料中の平均倍率変化±ＳＤ（標準偏差）を示す。＊ｐ＜０．０５（ＡＮＣＯＶＡモデル）。図１２Ｄは検証分析を描く。ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ後のｌｏｇ２倍率変化（ｘ軸）とｑＲＴ−ＰＣＲ（ｙ軸）との間の関係。Ｒ２＝０．８２。傾きの線形回帰分析はｐ＜０．０００１を与えた。 図１３Ａ及び図１３Ｂは、ＰＤＡＣ細胞及びＣＡＦに対するドセタキセル又はトラメチニブと組み合わせたＲｅｆ−１の効果を描く。図１３Ｂでは、ＣＡＦの存在下での減少した効力のため、より高い用量のドセタキセルを共培養において使用した。 図１４Ａ〜図１４Ｃは、ＡＰＸ３３３０及びゲムシタビン（Ｇｅｍ）を用いた三次元スフェロイド及びインビボでの組み合わせ研究を描く。癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ１９）との共培養における低継代患者由来ＰＤＡＣ細胞（Ｐａ０３Ｃ、図１４Ａ）が、ＡＰＸ３３３０（５０μΜ）と組み合わせた増加する量のＧｅｍで処置された。図１４Ｂはグラフ表示である：＊すべてのＧｅｍ＋ＡＰＸ３３０処置は、腫瘍においてＧｅｍ単独とは有意に異なる（ｐ＜０．０１）。図１４Ｃは、処置後３０日目の腫瘍量を描く。ＡＰＸ３３３０（２５ｍｇ／ｋｇ）は、以前に公開されたように、動物モデルにおいて、ＰａＣａ−２及びＰａｎｃ２５３の患者由来細胞の両方で腫瘍量を低下させる。 図１５Ａ〜図１５Ｂは、ＨＣＴ−１１６細胞株に対するＡＰＸ３３３０及びＣＰＩ−６１３の効果を描く。 図１５Ｃは、ＨＣＴ−１１６細胞株に対するＡＰＸ３３３０及びＣＰＩ−６１３の効果を描く。 図１６Ａ〜図１６Ｃは、ｓｉＲＮＡノックダウン後の選択された遺伝子の発現に対して様々な変化を呈する、異なるＰＤＡＣ細胞株を描く。選択された遺伝子の発現が、（図１６Ａ）Ｐａ０２Ｃ細胞、（図１６Ｂ）Ｐａｎｃ１０．０５細胞及び（図１６Ｃ）Ｐａｎｃ１９８細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲによって評価された。これらの細胞はｓｉＲＮＡノックダウン後に採取され、８０％以上のＡＰＥ１タンパク質レベルにおける低下について評価された。各グラフは３つの独立の実験の結果であり、ＳＣＲと比べたｓｉＡＰＥ試料における平均倍率変化±ＳＤを示す。＊ｐ＜０．０５（ＡＮＣＯＶＡモデル）。 図１６Ｃ〜図１６Ｄは、ｓｉＲＮＡノックダウン後の選択された遺伝子の発現に対して様々な変化を呈する、異なるＰＤＡＣ細胞株を描く。選択された遺伝子の発現が、（図１６Ｃ）Ｐａｎｃ１９８細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲによって評価された。図１６Ｄは、４つの異なるＰＤＡＣ細胞株間でのｑＲＴ−ＰＣＲの重複する結果を示すベン図である。ＣＯＭＭＤ７、ＩＴＧＡ１、ＲＡＢ３Ｄ及びＴＮＦＡＩＰ２はすべての４つの細胞株で有意に変化した。ＰＰＩＦ及びＳＩＰＡ１は、Ｐａ０３Ｃ細胞、Ｐａ０２Ｃ細胞及びＰａｎｃ１０．０５細胞で差異的に発現された。ＴＡＰＢＰは、Ｐａ０３Ｃ及びＰａｎｃ１０．０５において差異的に発現された。ＰＲＤＸ５、ＩＳＹＮＡ１、ＢＣＲＰ及びＮＯＴＣＨ３は、Ｐａ０３ＣとＰａ０２Ｃとの間で共通であった（ＢＣＲＰ及びＮＯＴＣＨ３は、上記細胞株間で反対方向に変化した）が、ＣＩＲＢＰはＰａ０３Ｃにおいて差異的に発現されただけであった。 図１７は、膵臓癌の三次元スフェロイドモデルにおける親化合物ＡＰＸ３３３０、並びに類似体化合物ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４の単剤効力を描く。グラフはＮ＝３の標準偏差を伴う平均である。 図１８は、ＡＰＸ３３３０及びナパブカシン（ＢＢＩ−６０８−ＳＴＡＴ３阻害剤）が、膵臓癌の患者由来の三次元スフェロイドモデル（腫瘍＋ＣＡＦ）において相乗的な腫瘍死滅を有することを示す。示されている濃度はマイクロモル濃度単位である；Ｎａｐａ ０．１２５μＭ、ＡＰＸ３３３０ ２５又は３５μＭ、及びＡＰＸ２００９ ３．５μＭ。 図１９Ａ及び図１９Ｂは、三次元スフェロイドモデル（腫瘍及びＣＡＦ）におけるＳＴＡＴ３ｉナパブカシンと組み合わせたＡＰＸ３３３０が膵腫瘍細胞の相乗的な死滅を有していたことを示す。 図２０Ａ及び図２０Ｂは、三次元スフェロイドモデル（腫瘍及びＣＡＦ）におけるＳＴＡＴ３ｉナパブカシンと組み合わせたＡＰＸ３３３０及びＡＰＸ２００９が相乗的な腫瘍細胞死滅を実証したことを示す。示されている濃度はマイクロモル濃度単位である；Ｎａｐａ ０．１２５μＭ、ＡＰＸ３３３０ ２５μＭ、及びＡＰＸ２００９ ３．５μＭ。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図２１Ａ及び図２１Ｂは、Ｒｅｆ−１及びＳＴＡＴ３の二重標的化が、遺伝的ＰＤＡＣモデルにおいてインビトロ（図２１Ａ）及びインビボ（図２１Ｂ）で増強された死滅を生じることを描く。 図２２Ａ〜図２２Ｃは、ＣＡ９及びＡＰＥ１の二重標的化が三次元共培養膵臓癌腫瘍モデルにおいてＰＤＡＣ腫瘍を死滅させることを示す。 図２３Ａ〜図２３Ｂは、ＰＤＡＣ三次元共培養モデルにおけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤との併用治療剤を描く。図２３Ａは、ＡＰＸ３３３０＋オバトクラックス（Ｂｃｌ２拮抗薬）の併用治療剤を描く。図２３Ｂは、ＡＰＸ３３３０＋エンチノスタット（ＨＤＡＣ１及び３阻害剤）の併用治療剤を描く。 図２３Ｃ〜図２３Ｄは、ＰＤＡＣ三次元共培養モデルにおけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤との併用治療剤を描く。図２３Ｃは、ＡＰＸ３３３０＋アキシチニブ（ＴＫＩ阻害剤）の併用治療剤を描く。図２３Ｄは、ＡＰＸ３３３０＋オバトクラックス（Ｂｃｌ２拮抗薬）の併用治療剤を描く。 図２３Ｅは、ＰＤＡＣ三次元共培養モデルにおけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤との併用治療剤を描く。図２３Ｅは、ＡＰＸ３３３０＋エンチノスタット（ＨＤＡＣ１及び３阻害剤）の併用治療剤を描く。 図２４Ａ〜図２４Ｂは、ＰＤＡＣ三次元共培養モデルにおけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤とＣＰＩ−６１３、ミトコンドリア標的（ｍｉｔｏ ｔａｒｇｅｔｅｄ）ＴＣＡ回路阻害剤（図２４Ａ）又はＳＴＡＴ３阻害剤ナパブカシン（図２４Ｂ）との併用治療剤を描く。 図２４Ｃは、ＰＤＡＣ三次元共培養モデルにおけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤とＳＴＡＴ３阻害剤ナパブカシン（図２４Ｃ）との併用治療剤を描く。 図２５は、膵臓癌の三次元モデルにおけるＡＰＸ３３３０と組み合わせたルキソリチニブの効果を描く。 図２６は、膵臓癌の三次元共培養モデルにおけるｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）のリン酸化に対するルキソリチニブの効果を描く。特に、ウエスタンブロットは、ルキソリチニブ（１２．５ｍＭ）の４時間後のｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）を描く。 図２７は、腫瘍成長遅延に対する側腹部共培養モデルにおけるＲｕｘ＋ＡＰＸの併用治療の効果を描く。 図２８Ａ及び図２８Ｂは、併用治療が共培養腫瘍においてＣＡＦを死滅させなかったことを描く。 図２９Ａ〜図２９Ｇは、オキサリプラチンと組み合わせたＡＰＸ３３３０の抗腫瘍性効力を描く。 図３０Ａ及び図３０Ｂは、マウス結腸細胞株ＭＣ−３８におけるＳＴＡＴ３阻害剤ナパブカシン及びＡｐｅ１レドックス阻害剤ＡＰＸ２０１４の薬物組み合わせ効果を描く。 図３１Ａは、ヒト腺癌結腸浮遊細胞株Ｃｏｌｏ−２０１におけるＰＤＨ及びα−ＫＤＨ代謝阻害剤ＣＰＩ−６１３並びにＡｐｅ１レドックス阻害剤ＡＰＸ３３３０の相乗的な薬物組み合わせ効果を描く。図３１Ａは単剤効果を描く。 図３１Ｂ〜図３１Ｅは、ヒト腺癌結腸浮遊細胞株Ｃｏｌｏ−２０１におけるＰＤＨ及びα−ＫＤＨ代謝阻害剤ＣＰＩ−６１３並びにＡｐｅ１レドックス阻害剤ＡＰＸ３３３０の相乗的な薬物組み合わせ効果を描く。図３１Ｂは併用治療剤効果を描く。図３１Ｃは、組み合わせＥＣ５０（μΜ）を描く。図３１Ｄは、用量組み合わせのチョウ−タラレイ指数（Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ Ｉｎｄｅｘ）を描く。図３１Ｅは相乗作用用量を描く。 図３２Ａは、ヒト癌腫結腸細胞株ＨＣＴ−１１６におけるＰＤＨ及びα−ＫＤＨ代謝阻害剤ＣＰＩ−６１３並びにＡｐｅ１レドックス阻害剤ＡＰＸ３３３０（本明細書中でＥ３３３０とも呼ばれる）の相乗的な薬物組み合わせ効果を描く。図３２Ａは単剤効果を描く。 図３２Ｂ〜図３２Ｅは、ヒト癌腫結腸細胞株ＨＣＴ−１１６におけるＰＤＨ及びα−ＫＤＨ代謝阻害剤ＣＰＩ−６１３並びにＡｐｅ１レドックス阻害剤ＡＰＸ３３３０（本明細書中でＥ３３３０とも呼ばれる）の相乗的な薬物組み合わせ効果を描く。図３２Ｂは併用治療剤効果を描く。図３２Ｃは、組み合わせＥＣ５０（μΜ）を描く。図３２Ｄは、用量組み合わせのチョウ−タラレイ指数を描く。図３２Ｅは相乗作用用量を描く。 図３３Ａは、ヒト癌腫結腸細胞株ＨＣＴ−１１６におけるＰＤＨ及びα−ＫＤＨ代謝阻害剤ＣＰＩ−６１３並びにＡｐｅ１レドックス阻害剤ＡＰＸ３３３０の相乗的な薬物組み合わせ効果を描く。図３３Ａは単剤効果を描く。 図３３Ｂ〜図３３Ｅは、ヒト癌腫結腸細胞株ＨＣＴ−１１６におけるＰＤＨ及びα−ＫＤＨ代謝阻害剤ＣＰＩ−６１３並びにＡｐｅ１レドックス阻害剤ＡＰＸ３３３０の相乗的な薬物組み合わせ効果を描く。図３３Ｂは併用治療剤効果を描く。図３３Ｃは、組み合わせＥＣ５０（μΜ）を描く。図３３Ｄは、用量組み合わせのチョウ−タラレイ指数を描く。図３３Ｅは相乗作用用量を描く。 図３４Ａは、ヒト癌腫結腸細胞株ＨＣＴ−１１６におけるＰＤＨ及びα−ＫＤＨ代謝阻害剤ＣＰＩ−６１３並びにＡｐｅ１レドックス阻害剤ＡＰＸ２０１４の相乗的な薬物組み合わせ効果を描く。図３４Ａは単剤効果を描く。 図３４Ｂ〜図３４Ｅは、ヒト癌腫結腸細胞株ＨＣＴ−１１６におけるＰＤＨ及びα−ＫＤＨ代謝阻害剤ＣＰＩ−６１３並びにＡｐｅ１レドックス阻害剤ＡＰＸ２０１４の相乗的な薬物組み合わせ効果を描く。図３４Ｂは併用治療剤効果を描く。図３４Ｃは、組み合わせＥＣ５０（μΜ）を描く。図３４Ｄは、用量組み合わせのチョウ−タラレイ指数を描く。図３４Ｅは相乗作用用量を描く。 図３５Ａは、ヒト癌腫結腸細胞株ＨＣＴ−１１６におけるＧＬＳ１代謝阻害剤ＣＢ−８３９並びにＡｐｅ１レドックス阻害剤ＡＰＸ３３３０の相乗的な薬物組み合わせ効果を描く。図３５Ａは単剤効果を描く。 図３５Ｂ〜図３５Ｅは、ヒト癌腫結腸細胞株ＨＣＴ−１１６におけるＧＬＳ１代謝阻害剤ＣＢ−８３９並びにＡｐｅ１レドックス阻害剤ＡＰＸ３３３０の相乗的な薬物組み合わせ効果を描く。図３５Ｂは併用治療剤効果を描く。図３５Ｃは、組み合わせＥＣ５０（μΜ）を描く。図３５Ｄは、用量組み合わせのチョウ−タラレイ指数を描く。図３５Ｅは相乗作用用量を描く。 図３６Ａ及び図３６Ｂは、シスプラチン耐性膀胱細胞株ＢＬＣＡｂ００１に対するＡＰＸ２０１４＋／−シスプラチンの３日間の処置の効果を描く。 図３７Ａ及び図３７Ｂは、シスプラチン耐性膀胱細胞株ＢＬＣＡｂ００２に対するＡＰＸ２０１４＋／−シスプラチンの３日間の処置の効果を描く。 図３８Ａ及び図３８Ｂは、膀胱細胞株Ｔ２４に対するＡＰＸ２０１４＋／−ナパブカシンの効果を描く。 図３９Ａ及び図３９Ｂは、膀胱細胞株Ｔ２４に対するＡＰＸ２００９＋／−ナパブカシンの効果を描く。 図４０Ａ及び図４０Ｂは、膀胱細胞株ＳＣａＢＥＲに対するＡＰＸ２０１４＋／−ナパブカシンの効果を描く。 図４１Ａ及び図４１Ｂは、膀胱細胞株ＳＣａＢＥＲに対するＡＰＸ２００９＋／−ナパブカシンの効果を描く。 図４２Ａ〜図４２Ｈは、ＰＤＡＣ細胞におけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１−ＨＩＦ−１−ＣＡ９シグナル伝達軸（シグナル経路）の重要性を描く。図４２Ａは、０．２％酸素に２４時間曝露された、患者由来のＰＤＡＣ腫瘍細胞株１０．０５、Ｐａ０２Ｃ、及びＰａ０３Ｃ、並びに膵臓ＣＡＦ細胞株ＣＡＦ１９を示す。ＣＡ９タンパク質レベルがウエスタンブロットにより比較された（酸素正常状態と低酸素との間のすべての細胞株差につきｐ＜０．０５）。図４２Ｂは、低酸素条件（０．２％Ｏ２）下でのＰＤＡＣ細胞株におけるＳＬＣ−０１１１についてのＬＣ５０値が各細胞株においてＣＡ９誘導と逆相関する（Ｒ２＞０．９９）ことを示す。図４２Ｃは、単層（二次元）で成長し、酸素正常状態又は０．２％Ｏ２で２４時間培養され、ウエスタンブロット解析のために採取された１０．０５細胞を描く。１０．０５細胞単独又はＣＡＦ１９細胞との共培養における１０．０５細胞は、三次元培養物において１２日間成長し、ウエスタンブロット解析のために採取された。すべての４つの試料から等しい量のタンパク質が使用された。単独及びＣＡＦを伴う三次元培養物中のＣＡ９レベルは、低酸素曝露の単層培養物におけるよりも（それぞれ）２．５倍及び６．２倍大きかった。図４２Ｄ〜図４２Ｆは、示されたｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ三次元スフェロイドの中で培養された１０．０５細胞を示す。細胞は、ノックダウンを確認するために８日目にウエスタンブロット解析用に採取された（図４２Ｄ、ＣＡ９に対するｓｉＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１及びｓｉＣＡ９効果並びにＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１に対するｓｉＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１効果につきｐ＜０．０５）。蛍光強度（図４２Ｅ）及び面積（図示せず）を三次元培養物成長の４日目、８日目、及び１２日目に測定した（１２日目のノックダウン群とＳＣとの間の差につきｐ＜０．００１、１２日目のｓｉＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１とｓｉＣＡ９との差につきｐ＜０．０５）。各群からの代表的な蛍光像は１２日目に記録された（図４２Ｆ）。図４２Ｇ〜図４２Ｈは、ＡＰＸ３３３０で処置され、タンパク質−ＤＮＡ架橋及び採取に先立って０．２％Ｏ２に１２時間曝露された１０．０５細胞を描く。ＨＩＦ１ａ及び非特異的結合についての対照（ウサギＩｇＧ；ＤＭＳＯ＋低酸素試料に対して実施された）のＩＰが、核エキスを使用して実施された。ＣＡ９プロモーターのＨＢＳ含有領域に対するｑＰＣＲが実施された（図４２Ｇ、＊＊ｐ＜０．０１）。ＣＡ９プロモーターのＨＢＳ含有領域に対するＰＣＲが、ＩＰ試料並びにインプット（ｉｎｐｕｔ）ＤＮＡ（ＩＰにロードした量の１％；ＤＭＳＯ＋低酸素試料に対して実施された）及び陰性対照（Ｈ２Ｏ）を使用して実施され、これらの試料は、臭化エチジウムを用いて１％アガロースゲル上で検出された（図４２Ｈ、予想される産物サイズ＝２４９ｂｐ）。 図４３Ａ〜図４３Ｅは、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１又はＣＡ９の阻害によるＣＡ９の遮断を描く。図４３Ａ及び図４３Ｂは、ＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９、ＡＰＸ２０１４、及び負の類似体ＲＮ７−５８で処置され、採取並びにＣＡ９ ｍＲＮＡ（図４３Ａ）レベル及びタンパク質（図４３Ｂ）レベルの分析に先立って０．２％Ｏ２に２４時間曝露された１０．０５細胞を示す（各ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤の試験した最高濃度でのＣＡ９ ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの差につきＤＭＳＯに対してｐ＜０．０１）。図４３Ｃは、採取及びウエスタンブロット解析に先立って三次元スフェロイドにおいて１２日間培養された１０．０５細胞を示す。培養物は、４日目及び８日目に、示された濃度のＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９、ＡＰＸ２０１４、及び負の類似体ＲＮ７−５８で処置された（各ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤の試験した最高濃度でのＣＡ９発現の差につきＤＭＳＯに対してｐ＜０．０５）。図４３Ｄ及び図４３Ｅは、示されたｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたか又は示された濃度のＡＰＸ２００９又はＡＰＸ２０１４で処置され、０．２％Ｏ２に４８時間に曝露された１０．０５細胞を示す。細胞内ｐＨの変化は、ｐＨ感受性蛍光染料（ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄチャネル、図４３Ｄ）を使用して定量され、ｐＨ媒介性蛍光変化は、盲検の第三者によって撮像された（図４３Ｅ）。 図４３Ｆ〜図４３Ｉは、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１又はＣＡ９阻害を介したＣＡ９の遮断を描く。図４３Ｆ〜図４３Ｉは、１０．０５（図４３Ｆ及び図４３Ｈ）又はＰａ０３Ｃ（図４３Ｇ及び図４３Ｉ）の腫瘍細胞（ＣＡＦを伴う）を用いた三次元共培養物が、増加する濃度のＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９、及びＡＰＸ２０１４（Ｆ〜Ｇ）又はＳＬＣ−０１１１及びＦＣ１２−５３１Ａ（図４３Ｈ及び図４３Ｉ）で１２日間処置され、蛍光強度が測定されたことを示す。 図４４Ａ〜図４４Ｆは、三次元培養物の特性解析並びにＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１及びＣＡ９を二重標的とすることの効果を描く。図４４Ａ〜図４４Ｆは、ＣＡＦとともに１２日間培養され、ＩＨＣ用に採取された１０．０５細胞又はＰａ０３Ｃ細胞からなるスフェロイドを描く。これらの培養物に由来する切片を有するスライドは、示された抗体／染料で染色された。抗体染色物（図４４Ｂ及び図４４Ｄ〜図４４Ｆ）はヘマトキシリンを用いて対比染色された。画像は１，６００倍の拡大率で示されている。 図４５Ａ〜図４５Ｒは、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達阻害が、第二世代阻害剤を用いたＣＡ９阻害に対する三次元ＰＤＡＣ腫瘍スフェロイドの感受性を高めることを描く。１０．０５細胞及びＰａ０３Ｃ細胞は、ＣＡＦ１９細胞とともに三次元培養物中へプレーティングされ、これらのスフェロイドにおける細胞成長が、プレーティング後４日目、８日目、１２日目、及び１６日目に蛍光強度によって測定された。スフェロイド共培養物におけるＣＡＦ細胞の成長に対する腫瘍細胞の成長が、異なる蛍光標識を使用してこの２つの細胞型において別個に評価された。三次元培養物は、測定後４日目、８日目、及び１２日目に、ＦＣ１２−５３１Ａ＋ＡＰＸ３３３０（図４５Ａ〜図４５Ｆ）、ＡＰＸ２００９（図４５Ｇ〜図４５Ｌ）、又はＡＰＸ２０１４（図４５Ｍ〜図４５Ｒ）を用いて処置された。各実験内の蛍光強度データは１６日目のＤＭＳＯ対照（Ｃｔｒｌ）に対して規格化され、１６日目の読み取り値が比較された。群間の差は、チューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定を使用して決定された：＊ｐ＜０．０５対ＤＭＳＯ；＊＊ｐ＜０．０１対ＤＭＳＯ；＊＊＊ｐ＜０．００１対ＤＭＳＯ；＋ｐ＜０．０５対ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤；＋＋ｐ＜０．０１対ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤；＋＋＋ｐ＜０．００１対ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤；Λｐ＜０．０５対ＦＣ１２−５３１Ａ；ΛΛｐ＜０．０１対ＦＣ１２−５３１Ａ；ΛΛΛｐ＜０．００１対ＦＣ１２−５３１Ａ。グラフはＮ＝３の標準偏差を伴う平均である。これらのスフェロイドにおける腫瘍（赤色チャネル）細胞及びＣＡＦ（緑色チャネル）細胞の蛍光像は、１６日目に記録した。 図４６は経路概略である。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達は、ＨＩＦ−１及び特定の他の転写因子のトランス活性化に寄与する。ＨＩＦ１αは低酸素条件下で安定化され、ＨＩＦ−１の形成及びその後のＣＡ９の発現につながる。ＣＡ９は、炭酸水素イオントランスポーター及び細胞内ＣＡと協調し、細胞内ｐＨを安定化する。（ＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９、又はＡＰＸ２０１４を用いた）ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達阻害は、ＨＩＦ−１媒介性ＣＡ９発現を減弱させ、（ＳＬＣ−０１１１又はＦＣ１２−５３１Ａを用いた）ＣＡ９阻害に対する腫瘍細胞の感受性を高める。
特段の記載がない限り、本願明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本願明細書に記載される方法及び材料と類似又は等価のいずれの方法及び材料も本開示の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
癌
Ｒｅｆ−１の多機能性は、疾患、特に癌におけるその広範囲の役割を示唆する。Ｒｅｆ−１は癌において上方制御される（表１、図４）。この増加は、しばしば、腫瘍形成（腫瘍化）、癌の悪性度、血管新生の増加、放射線治療に対する抵抗性及び化学療法に対する抵抗性、並びに全体的な予後不良と関連付けされる。このため、Ｒｅｆ−１及びＲｅｆ−１が制御する転写因子は、抗癌治療についての第１標的となる。
前立腺癌
Ｒｅｆ−１過剰発現を呈するもっとも広く研究されている癌のうちの１つは、前立腺癌である。過剰発現は、免疫組織学的には、細胞質におけるＲｅｆ−１についてポジの細胞染色のより高い百分率、及びＲｅｆ−１核染色の強度の増大として見られる。
前立腺癌におけるＲｅｆ−１レドックスシグナル伝達の主要標的の１つはＳＴＡＴ３であり、ＳＴＡＴ３は前立腺癌において構成的に活性である。ＳＴＡＴ３阻害は、前立腺癌細胞の成長を抑制する。逆に、ＳＴＡＴ３活性化は、全生存率に悪影響を及ぼし、無再発生存期間（ＲＦＳ）を縮める。去勢抵抗性前立腺癌で亡くなった患者から採取した転移性試料の９５％はｐＳＴＡＴ３について陽性であり、最も高い発現は骨転移試料で見られた。まとめて考えると、これは、前立腺癌の悪性度及び進行におけるｐＳＴＡＴ３の非常に重要な役割を支持する。
ＳＴＡＴ３の下流標的はサバイビンであり、その発現の増加も、前立腺癌の悪性度と関連付けられる。前立腺生検組織におけるサバイビンのｍＲＮＡ発現レベルは、癌性組織における有意に高いサバイビン発現を示し、このことは、より高いグレードの癌及び高悪性の表現型と相関する。前立腺癌細胞株におけるサバイビンのｓｉＲＮＡノックダウンは、細胞増殖を低下させ、アポトーシス誘導剤シスプラチンに対する化学療法感受性を高める。サバイビン発現の減少の効果はインビボにも広がる。ｓｉＲＮＡサバイビンノックダウン細胞を皮下注射されたマウスは、対照と比較して有意に小さい腫瘍を呈する。
興味深いことに、Ｒｅｆ−１レドックス特異的阻害剤ＡＰＸ３３３０及びＡＰＸ２００９は、ＮＦ−κＢ活性に影響を及ぼすことにより、前立腺癌細胞においてサバイビンｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルを低下させた。これらの阻害剤は、細胞増殖も低下させた。インビボで、ＡＰＸ２００９は、サバイビンタンパク質レベル及び細胞増殖を低下させた。
このエビデンスに基づき、ＳＴＡＴ３及びサバイビンの両方が、抗前立腺癌治療のための第１標的として見えてくる。しかしながら、これまでは、それらは、単剤治療としてはほどほどの成功を収めてきたにすぎない。それゆえ、Ｒｅｆ−１レドックス機能及びＳＴＡＴ３／サバイビンの両方を阻害することという有望な組み合わせは、前立腺癌に不可欠な抗アポトーシス経路の包括的な制御因子及び下流エフェクターの両方を標的とする道を提供する。
１つの好適な実施形態では、本開示は、前立腺癌を処置するための、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル １，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ−メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４））と、ＳＴＡＴ３阻害剤（例えば、ナパブカシン）との組み合わせに関する。別の実施形態では、前立腺癌を処置するための、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤とサバイビン阻害剤（例えば、ＹＭ１５５）との組み合わせが開示される。
結腸癌
米国における癌関連死の２番目に多い原因である結腸癌は、細胞質内Ｒｅｆ−１のレベルの上昇を呈する。転移した結腸直腸癌の肝臓腫瘍組織において、Ｒｅｆ−１発現の増加は患者予後の低さに対応する。コロニー形成アッセイでは、ｓｉＲＮＡ Ｒｅｆ−１ノックダウンは、電離放射線照射（ＩＲ）に対する結腸癌細胞の感受性を有意に高める。さらには、インビボでの皮下異種移植片も、腫瘍組織内Ｒｅｆ−１ ｓｉＲＮＡ処置の後の腫瘍成長の低下及び放射線増感を示す。
結腸癌におけるＲｅｆ−１レドックスシグナル伝達の重要性は、Ｒｅｆ−１レドックス阻害剤ＡＰＸ３３３０が結腸癌幹細胞（ＣＣＳＣ）に及ぼす効果によって強調される。ＡＰＸ３３３０（以降、「ＡＰＸ」と呼ばれる）は、インビトロでＣＣＳＣ成長を有意に低下させ、代謝拮抗性化学療法剤である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の細胞毒性を増強する。ＣＣＳＣを皮下注射された異種移植マウスにおいて、ＡＰＸ３３３０の腫瘍内投与は、腹腔内に送達された５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に対する腫瘍応答を高める。これは、ＡＰＸ３３３０がＲｅｆ−１の非常に重要なレドックス活性を阻害することにより、他の結腸癌処置を増強するすることができるということを示す。
加えて、以下に示すように、ＡＰＸ３３３０が、ミトコンドリア酵素ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＫＤＧＨ）を阻害することが知られているリポ酸類似体であるＣＰＩ−６１３と組み合わされた場合、結腸癌細胞において有意な死滅効果があった。
１つの好適な実施形態では、本開示は、結腸癌を処置するための、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤（ＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４）と、化学療法剤（例えば、５−ＦＵ）との組み合わせに関する。別の実施形態では、結腸癌を処置するための、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤とＰＤＨ及び／又はＫＤＧＨの阻害剤（例えば、ＣＰＩ−６１３）との組み合わせが開示される。
卵巣癌
卵巣癌におけるＲｅｆ−１発現は広く研究されている。Ｒｅｆ−１発現は、悪性の患者組織試料において増加するが、この増加の場所に関して研究は様々である。
いくつかの研究は、主に、細胞質における発現の増加を示す。それらの研究では、Ｒｅｆ−１の細胞質内の場所は、卵巣腫瘍進行と相関する。加えて、進行した（ステージＩＩＩ／ＩＶの）癌を有する患者は、ステージＩ／ＩＩの患者よりも、有意に高いＲｅｆ−１発現及び有意に低い全生存率を有する。細胞質内Ｒｅｆ−１が増加した患者は、白金製剤である化学療法剤に対してより抵抗性もある。別の研究は、Ｒｅｆ−１核発現の増加を認め、ここでもステージＩ／ＩＩの患者と比べてステージＩＩＩ／ＩＶの患者で増加は大きかった。他の研究では、核内Ｒｅｆ−１発現及び細胞質内Ｒｅｆ−１発現の両方が増加したが、Ｒｅｆ−１発現と癌ステージとの間で相関は見られなかった。まとめて考えると、これらの研究は、Ｒｅｆ−１発現は明らかに卵巣癌において役割を果たすが、組織試料の不均一性のために、Ｒｅｆ−１の役割が核内の場所におけるのか細胞質内の場所におけるのかを判別することは困難であるということを強調する。
しかしながら、Ｒｅｆ−１の発現の低下は、卵巣癌細胞に対して明確な効果を有する。Ａ２７８０（核内ＡＰＥ１）細胞及びＣＰ７０（細胞質内ＡＰＥ１）細胞におけるＲｅｆ−１ノックダウンは、ともにシスプラチンへの感受性を高める。ＳＫＯＶ３細胞及びＡ２７８０細胞では、Ｒｅｆ−１ ｓｉＲＮＡは、細胞増殖、コロニー形成、遊走及び浸潤を有意に低下させる。同様に、ＳＫＯＶ−３ｘ卵巣細胞のＲｅｆ−１ ｓｉＲＮＡ処置は、その成長を有意に低下させ、同じことがＡＰＸ３３３０レドックス阻害によって起こる。マウスに皮下移植されたＲｅｆ−１ ｓｉＲＮＡ細胞は、対照腫瘍と比べて著しく低下した成長、つまり腫瘍倍加時間の３．２倍増（５日間から１５日間超へ）を示す。この腫瘍はグルコース代謝の低下も呈する。合わせて考えると、成長を阻害するため、及び他の抗癌剤の活性を増強するための手段として卵巣癌においてＲｅｆ−１を標的とすることにつき、強い主張をすることができる。
非小細胞肺癌
Ｒｅｆ−１は、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）における予後マーカーと長らく考えられてきた。というのも、患者腫瘍試料においてＲｅｆ−１タンパク質レベルは上方制御されるからである。組織試料における核内Ｒｅｆ−１発現は、患者にとってよりよい生存の機会を提示する。細胞質内のＲｅｆ−１及びｍＲＮＡ発現は、患者生存の悪さ及びより短いＲＦＳと強く相関する。免疫組織化学及び免疫ブロットの両方が、ステージＩ ＮＳＣＬＣが再発した患者において細胞質内Ｒｅｆ−１発現の増加及び核内Ｒｅｆ−１発現の減少を示す。処置後の血清Ｒｅｆ−１レベルは、全生存と逆相関している。
Ｒｅｆ−１は、ＮＳＣＬＣで一般に使用される白金系薬物に影響を及ぼす。ＮＳＣＬＣにおけるＲｅｆ−１発現の増加はシスプラチン処置に対する抵抗性をもたらすが、Ａ５４９癌細胞におけるＲｅｆ−１ ｓｉＲＮＡノックダウンは、シスプラチン細胞毒性を有意に増強する。Ｒｅｆ−１を発現しない腫瘍を有する患者は、白金−パクリタキセル療法及びシスプラチン−ドセタキセル−ゲムシタビン処置に対してより良好に応答し、進行及び全生存の時間がより長くなる。
Ｒｅｆ−１を低下させることでＮＳＣＬＣにおける他の抗癌処置の効力を高めるというエビデンスが存在する。インビトロ及びインビボにおいてＡ５４９細胞中でＲｅｆ−１レベルを低下させると、光線力学療法の有効性を高める。ｓｈＲＮＡによるＲｅｆ−１ノックダウンは、Ａ５４９細胞の増殖を阻害するアルカロイド化合物であるオキシマトリンの抗腫瘍活性を増強する。
まとめて考えると、これは、Ｒｅｆ−１がＮＳＣＬＣ進行において極めて重要な役割を果たすということを実証し、これを標的とすることは、種々の化学療法的処置と組み合わせた場合に、より良好な患者予後につながるであろう。
１つの実施形態では、本開示は、ＮＳＣＬＣを処置するためのＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤（例えば、ＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４）と、化学療法剤（例えば、パクリタキセル、シスプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン）との組み合わせに関する。別の実施形態では、ＮＳＣＬＣを処置するためのＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤と光線力学療法との組み合わせが開示される。
悪性末梢神経鞘腫
悪性末梢神経鞘腫（ＭＰＮＳＴ）は、致死的になりうる、一般的ではない神経起源の癌である。これまでの多くの研究にもかかわらず、既存の化学療法剤は、ＭＰＮＳＴ処置において成功を収めていない。最近の研究は、Ｒｅｆ−１レドックス標的ＨＩＦ−１α及び特にＳＴＡＴ３を、ＭＰＮＳＴを進行させることに関与させている。
リン酸化ＳＴＡＴ３発現は、疾患発症段階で悪性の疾患を示唆しうる。組織マイクロアレイは、原発性ＭＰＮＳＴにおけるＳＴＡＴ３発現が、より悪い疾患特異的な全生存及び無イベント生存（期間）と関連付けられるということを示した。ＥＧＦＲ過剰発現のマウスモデルでは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３阻害剤及びｓｈＲＮＡによるＳＴＡＴ３ノックダウンの両方が腫瘍形成を予防した。
別の研究では、４つのＭＰＮＳＴ株におけるＳＴＡＴ３活性化の阻害は、癒傷、細胞遊走、浸潤、及び腫瘍形成の低下を生じた。このＳＴＡＴ３活性化の阻害は、ＨＩＦ−１α発現も低下させた。独立のｓｈＲＮＡ媒介性ＨＩＦ−１αノックダウンも癒傷、細胞遊走、浸潤、及び腫瘍形成を低下させ、これは、ＳＴＡＴ３／ＨＩＦ−１αシグナル伝達経路がＭＰＮＳＴにおける腫瘍形成を担うことを示した。
さらには、ＳＴＡＴ３の下流標的サバイビンは、ＭＰＮＳＴにおいて増幅される。サバイビンは、ＭＰＮＳＴ組織試料において高く発現される。ｓｉＲＮＡによるサバイビンノックダウンは、細胞成長を低下させ、細胞周期の進行を阻害し、アポトーシスを増加させる。加えて、サバイビン阻害剤ＹＭ１５５は、インビボで、ＭＰＮＳＴ異種移植成長及び転移を抑制する。
ＭＰＮＳＴにおけるＳＴＡＴ３−ＨＩＦ−１α経路の役割は、ＭＰＮＳＴを処置するための有望な方法としてのＳＴＡＴ３及び／又はＨＩＦ−１α阻害の考えを支持する。サバイビンのような下流マーカーも、有望な標的として見えてくる。Ｒｅｆ−１はＳＴＡＴ３及びＨＩＦ−１αを制御する。それゆえ、Ｒｅｆ−１を標的にすることは、複数の標的を阻害することになり、ＭＰＮＳＴについての実行可能な処置に対する期待を提供することになろう。加えて、Ｒｅｆ−１及びＳＴＡＴ３又はＨＩＦ−１αのいずれかの二重標的化の可能性は、ＭＰＮＳＴ進行に不可欠である経路を完全に取り除くことの潜在力を示唆する。
１つの実施形態では、本開示は、ＭＰＮＳＴを処置するための、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤（例えば、ＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４）と、ＳＴＡＴ３阻害剤（例えば、ナパブカシン）との組み合わせに関する。別の実施形態では、ＭＰＮＳＴを処置するための、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤とＨＩＦ−１αとの組み合わせが開示される。さらに別の実施形態では、本開示は、ＭＰＮＳＴを処置するための、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤と、サバイビン阻害剤（例えば、ＹＭ１５５）との組み合わせに関する。
白血病
白血病におけるＲｅｆ−１の役割に焦点を合わせた研究はほとんどない。これまで、唯一の公開された研究は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）におけるＲｅｆ−１の役割及びＲｅｆ−１と全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、又はＲＡ）及びレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）転写因子との関係に集中している。ＲＡＲαは、レドックス依存的にそのＤＮＡ結合部位（ＲＡＲＥ）に結合する。研究は、ＲＡＲ−ＲＡＲＥ結合はＡＰＸ３３３０を用いたＲｅｆ−１レドックス阻害を通してブロックされるということを明示する。加えて、ＡＴＲＡにＡＰＸ３３３０を添加すると、ＡＰＬ細胞のアポトーシス及び細胞分化が３倍増加する。これらの結果は、ＡＴＲＡとの併用治療においてＡＰＸ３３３０を使用することの潜在力を示す。これは、２つのこと、つまり第一に、ＡＴＲＡが使用される、白血病についての新しい処置の組み合わせ、及び第二に、同様か又は増加した治療効果を維持しながらのＡＴＲＡ用量の減少を成し遂げうる。この後者の点は重要である。というのも、より少量のＲＡを用いてＲＡ誘導前骨髄球分化を増加させることができることによって、ＲＡ分化症候群の毒性を回避することができるはずだからである。ＲＡの用量を減らすことは重要な臨床的意味を有し、この治療法の望ましくない副作用のいくつか、例えば分化症候群を取り除くのに役立つであろう。
最近の研究は、Ｒｅｆ−１がＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）において高く発現されるということを示す。レドックス特異的阻害剤ＡＰＸ３３３０によるＲｅｆ−１の遮断は、初代細胞、再発し化学療法耐性である細胞、及びＴ−ＡＬＬのマウスモデル由来の細胞を含めた白血病Ｔ細胞の生存能を強力に阻害する。白血病細胞のアポトーシスは生存促進性遺伝子の下方制御と関連付けられるが、Ｒｅｆ−１レドックス阻害はこの白血病細胞のアポトーシスを促す。これらのデータは、Ｔ細胞ＡＬＬでの複数の転写プログラムの制御におけるＲｅｆ−１の役割を明示し、かつＲｅｆ−１レドックス機能の崩壊は、高リスクの再発した白血病を含めた白血病Ｔ細胞を標的にするための効率的な戦略を代表するということを示唆する。
最後に、ＴＥＴ２変異を用いて前白血病の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞を末期のＡＭＬに変換することを研究している研究者は、このプロセスにおけるＲｅｆ−１の重大な役割を特定している。Ｔｅｔ２欠損幹細胞は、野生型対照と比べて一次レシピエント及び二次レシピエントの両方におけるより高い再増殖及び生着能力によって明らかにされるとおり、炎症性負荷に対する抵抗性を実証している。野生型対照は、ストレスを受けると、生着全体において著しい減退を示す。このプロセスは、ＮＦ−κΒ経路を呼び起こし、Ｒｅｆ−１がこの経路を制御する。ＡＰＸ３３３０はＮＦ−κΒ機能をブロックし、これは、クローン性造血を持つ健康な個体でたびたび見られるＡＭＬ関連のエピジェネティック変異を保有するマウスにおいて、炎症を減少させ、前ＡＭＬからＡＭＬそのものへの進行を逆転させる。これらのデータは、ＡＰＸ３３３０処置が、クローン性造血の徴候を示すＴＥＴ２変異を保有する正常な個体、並びに急性骨髄性白血病、骨髄増殖性疾患及び骨髄異形成症候群を有するＴＥＴ２変異を持つ患者にとって臨床的に有益であろうということを示唆する。
要約すれば、白血病におけるＲｅｆ−１についての研究は固形腫瘍について実施された研究のあとをついて行っているが、最近の研究は、それらの研究された白血病におけるＲｅｆ−１レドックスシグナル伝達の重要な役割及びＡＰＸ３３３０の有効性を明らかにしつつある。
１つの実施形態では、本開示は、Ｔ−ＡＬＬを処置するための、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤（例えば、ＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４）と、ＮＦ−κΒ阻害剤（例えば、ナパブカシン）との組み合わせに関する。いくつかの特定の実施形態では、処置対象の患者は、クローン性造血の徴候を示すＴＥＴ２変異を保有している。
いくつかの実施形態では、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤（例えば、ＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４）と、ＮＦ−κΒ阻害剤との組み合わせは、急性骨髄性白血病、骨髄増殖性疾患又は骨髄異形成症候群をも有するＴＥＴ２変異を持つ患者を処置するために使用することができる。
網膜疾患
Ｒｅｆ−１のレベルの上昇は癌に限定されない（図４）。高められたＲｅｆ−１は、加齢性白内障において示唆されてきた。Ｒｅｆ−１レベルは、対照よりも、患者の水晶体上皮細胞においてより高く、不透明度が悪くなるほどＲｅｆ−１レベルは下がる。
Ｒｅｆ−１は、発育中のマウスの網膜、並びに網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、網膜周皮細胞、脈絡膜内皮細胞（ＣＥＣ）及び網膜血管内皮細胞（ＲＶＥＣ）において高く発現される。Ｒｅｆ−１阻害剤ＡＰＸ３３３０を使用することは、Ｒｅｆ−１レドックス活性がインビトロでＲＶＥＣ増殖、遊走及び血管新生のために必要とされるということを示す。同様に、ＡＰＸ３３３０処置は、インビトロにおいて、霊長類細胞でＣＥＣにおける増殖、遊走及び血管新生を低下させ、そしてベバシズマブと組み合わされた場合に付加的効果を有していた。酸化された低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）を使用してストレスを受けたＲＰＥは、ＡＰＸによって増殖減退及び老化から助け出された。
成人のヒトＲＰＥ細胞株では、ＡＰＸ３３３０は、血管新生における炎症と関連付けられる主要な要因であるＮＦ−κＢの転写活性を低下させた。ＡＰＸ３３３０は、ＨＩＦ−１αの活性化もブロックし、その下流標的ＶＥＧＦの発現を低下させた。ＮＦ−κＢ及びＨＩＦ−１αを介したＶＥＧＦ発現は、血管新生を伴う加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、これは滲出型ＡＭＤとしても知られる、の特徴である脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）を主に担う。
超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）ノックアウトマウスがＡＰＸの単回の硝子体注射で処置されると、ＣＮＶが減少する。ＡＰＸ３３３０は、レーザー誘導ＣＮＶを有するマウスにおいても抗血管新生効果を示す。
血管新生は、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び糖尿病性網膜症（ＤＲ）を含めた他の網膜疾患の主要要素でもある。血管新生を調節するためのＲｅｆ−１のレドックス能により、血管新生は、それらの疾患において研究する価値があるものになっている。興味深いことに、ＨＩＦ−１α及びＶＥＧＦの両方がＲＯＰ及びＤＲにおいて増加する。ＲＯＰ及びＤＲのマーカーである網膜血管新生は、ＨＩＦ−１α又はＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡで処置されると、虚血性網膜症を持つマウスにおいて著しく低下した。
しかしながら、ＨＩＦ−１αについての、新薬開発につながるような標的を創出する困難さが論じられてきた。加えて、眼球の抗ＶＥＧＦ治療は常に有効であるとは限らず、望まれない副作用につながる可能性がある。Ｒｅｆ−１のレドックス活性を阻害することは、滲出型ＡＭＤ、ＲＯＰ及びＤＲのような網膜疾患においてＨＩＦ−１α及びＶＥＧＦを調節することができる、より有効な独立の処置又は補助的処置であるとわかる可能性がある。
他の疾患
Ｒｅｆ−１は、いくつかの他の疾患において役割を果たすことも示されている。心血管疾患及び血圧の制御におけるＲｅｆ−１の関与は、Ｒｅｆ−１発現レベルの増加を示す大動脈縮窄誘導過敏性ラットモデルによって説明される。さらには、ヘテロ接合Ｒｅｆ−１＋／−マウスは高血圧及び弱まった内皮依存性血管弛緩を呈する。Ｒｅｆ−１は、自殺的なオートインテグレーション（ａｕｔｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を阻害することによりＨＩＶ病変形成に関与するタンパク質のＳＥＴ複合体の一部である。この結果、Ｒｅｆ−１をノックダウンすることはＨＩＶ感染を阻害する。
Ｒｅｆ−１は、ヘリコバクター・ピロリ（ピロリ菌）感染に対する胃細胞応答にも示唆されている。Ｒｅｆ−１発現レベルは、ヒトの胃の上皮細胞においてピロリ菌感染後に上昇する。ピロリ菌誘導ＲＯＳ及び下流の活性化された遺伝子は、Ｒｅｆ−１欠損細胞においては対照と比べて高く、Ｒｅｆ−１過剰発現はこれらの効果を逆転させる。加えて、Ｒｅｆ−１ ｓｉＲＮＡノックダウンは、胃上皮細胞においてピロリ菌及びＴＮＦ−αに誘導されるＡＰ−１及びＮＦ−ΚＢ ＤＮＡ結合、並びにＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現及びタンパク質分泌を阻害した。まとめて考えると、このことは、胃の炎症性障害及び敗血症においてＲｅｆ−１を示唆する。
別の特に興味を引く領域は、神経変性疾患（ＮＤ）である。アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）及び脳虚血等のＮＤは、すべてＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１機能障害によって影響を受ける。
Ｒｅｆ−１タンパク質レベルは、ＡＤ患者の中前頭皮質及び大脳皮質由来の核エキスでは、対照と比べて上昇し、Ｒｅｆ−１レドックス活性は、増加した酸化的ストレスに対する代償機構と見られる。しかしながら、ＡＤ患者の末梢血単核球ではＡＰＥ１エンドヌクレアーゼ活性の低下が見られ、これは、塩基除去修復（ＢＥＲ）の悪化を示唆する。これは、Ｒｅｆ−１が特定の疾患内で有することができる異なる役割を強調する。同様に、上昇した酸化的ストレス及びＤＮＡ損傷を呈する疾患であるＡＬＳの患者の中枢神経系においてＲｅｆ−１レベルは上昇する。ＰＤでは、遺伝子変異体を介したＲｅｆ−１機能の喪失は、それが、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの喪失につながる増加した酸化的ストレスに寄与する危険因子であるということを示唆する。ロテノン及びＭＰＰ＋（１−メチル−４−フェニルピリジニウム）はともにＰＤモデルを模擬するために使用されるが、このロテノン及びＭＰＰ＋（１−メチル−４−フェニルピリジニウム）で処置された細胞において、Ｒｅｆ−１は上方制御される。Ｒｅｆ−１の上方制御はこれらの細胞においてニューロン死から保護する。
脳虚血後、Ｒｅｆ−１の上方制御は、海馬神経細胞を細胞減少及びＤＮＡ断片化から保護する。逆に、ＤＮＡ修復を失ったＲｅｆ−１を有する遺伝子導入ラットは、虚血傷害から保護されない。Ｒｅｆ−１コンディショナルノックアウトマウスは、より大きい梗塞量（ｉｎｆｒａｃｔ ｖｏｌｕｍｅ）及び脳虚血後の空間機能及び認知機能の回復の減少を呈する。
これらの知見は、Ｒｅｆ−１によって影響を受ける幅広い範囲の疾患を強調し、このことは、Ｒｅｆ−１が多くの疾患を処置及び管理するための有望な標的であることを示唆する。
併用治療剤
さらに、これらの知見は、これらの第２治療剤との併用治療剤における、ＡＰＸ３３３０及びＡＰＸ２００９等のＲｅｆ−１特異的阻害剤の使用を支持する。具体的には、ＡＰＸ３３３０及び／又はＡＰＸ２００９は、ＳＴＡＴ３、ＨＩＦ１α、ＣＡ９、ＶＥＧＦ、ＮＦκＢ、ＪＡＫ２、Ｂｃｌ−２、ＰＴＥＮ、ＷＮＴ／β−カテニン、エンドスタチンの阻害剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、及び光線力学療法（ＰＤＴ）など、並びにこれらの組み合わせと組み合わせることができる。より具体的には、例示的な組み合わせとしては、表２及び表３に記載されたものから選択される第２治療剤のうちの１以上を伴うＡＰＸ３３３０及び／又はＡＰＸ２００９が挙げられる。
本開示の併用治療剤において使用するための上記Ｒｅｆ−１阻害剤（例えば、ＡＰＸ３３３０）及び第２治療剤の好適な投薬量は、例えば、個体の年齢及び体重、処置を必要とする少なくとも１つの正確な癌／疾患、疾患の重症度、組み合わされるべき具体的なＲｅｆ−１阻害剤及び／又は第２治療剤、組成物の性質、投与経路並びにこれらの組み合わせを含めたいくつかの因子に依存することになる。最終的に、好適な投薬量は、例えば、医師、獣医、科学者、及び他の医療の専門家及び研究の専門家等の当業者によって容易に決定されうる。例えば、当業者は、低投薬量で開始して、これを、所望の処置予後又は結果に到達するまで増やすことができる。あるいは、当業者は、高投薬量で開始して、これを、所望の処置予後又は結果を成し遂げるために必要な最少投薬量に到達するまで減らすことができる。
加えて、いくつかの好適な実施形態では、当該併用治療剤は、薬学的に許容できる担体、例えば、賦形剤、ビヒクル、希釈剤、及びこれらの組み合わせを含むことができる。例えば、当該併用治療剤が経口投与されることになる場合には、当該併用治療剤は錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、若しくはシロップとして処方されてもよく、又は非経口投与のためには、当該併用治療剤は、注射剤（筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、心室内、静脈内、硝子体内）、点滴調剤、又は座薬として処方されてもよい。これらの組成物は、従来の手段によって調製することができ、所望に応じて、上記活性化合物（すなわち、ＡＰＸ３３３０及び第２治療剤）は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁助剤、乳化剤、コーティング剤、又はこれらの組み合わせ等のいずれの従来の添加剤と混合されてもよい。
本開示のＲｅｆ−１阻害剤及び第２治療剤並びに／又は医薬担体を含む併用治療剤は、必要としている個体のサブセットに投与することができる。１つの実施形態では、本願明細書で使用する場合、「必要としている個体」は、癌、特に表１に収載されている前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、骨肉腫、結腸癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫等のリスクにあるか、又はそれらの癌を有している個体を指す。他の実施形態では、「必要としている個体」は、網膜疾患（例えば、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ））のリスクにあるか、又はこれらの網膜疾患を有している個体を指す。さらに他の実施形態では、「必要としている個体」は、心血管疾患、細菌性感染症、胃の炎症性障害、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）、脳虚血）のリスクにあるか、又はそれらの疾患を有している個体を指す。加えて、「必要としている個体」は、本願明細書で、これらの疾患及び／又は障害のうちのいずれか１つのリスクにあるか、又は医療専門家によってこれらの疾患及び／又は障害のうちのいずれか１つを有していると診断された個体を指すためにも使用される。従って、いくつかの実施形態では、本願明細書に開示される方法は、母集団のサブセットに向けられ、その結果、これらの実施形態において、母集団のすべてが当該方法から利益を受けるわけではない可能性がある。上記のことに基づき、本開示の方法実施形態のうちのいくつかは、特定された個体の特定のサブセット又はサブクラス（つまり、本明細書に注記される１以上の具体的な状態に対処することにおいて援助を「必要としている」個体のサブセット又はサブクラス）に向けられるので、すべての個体が本願明細書に記載される個体のサブセット又はサブクラスの中に入るとは限らない。特に、上記必要としている個体はヒトである。例えば、この必要としている個体は、例えば非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、乳牛、ブタ、及び当業者に公知の他の種類の研究用動物等の研究用動物であってもよい。
コンビナトリアル薬物アプローチのための追加的経路の特定
分子治療の限定的な成功における提案された要因は、腫瘍試料、とりわけ膵腫瘍又は神経膠芽腫等の悪性の腫瘍試料において見られる不均一性である。これは、複数の経路に影響を及ぼすことができる中心的な（節点となる）タンパク質、例えばＲｅｆ−１を標的とする戦略の必要性を明確に示す。Ｒｅｆ−１を含む新規な標的及び合理的に設計された併用治療剤の評価が、相関性バイオマーカー研究を含めて、癌において非常に重要である。なぜなら、一部の癌患者のための治療法の選択肢は限られたままになっているからである。
化学療法剤の高められた致死的なペアを解明するために、２つの包括的アプローチが利用される。それらには、化合物の作用機序に基づく合理的な仮説主導の組み合わせ、並びに組み合わせて使用すると癌細胞を脆弱にしうる特定の遺伝子発現プロファイル又はプロテオミクスシグネチャーを明らかにする「ビッグデータ」の応用が含まれる。本明細書では、上昇した致死率をもたらすＲｅｆ−１調節を引き起こす併用治療剤に注目する。
多くの研究は、Ｒｅｆ−１阻害と組み合わせたＤＮＡ傷害剤の相乗作用を調べてきた。おそらくは、これらの研究における相乗作用の支配的な機構は、Ｒｅｆ−１のＤＮＡ修復機能の遮断に起因しており、この遮断は、細胞を化学療法剤によって引き起こされるＤＮＡ損傷に応答することができないようにする。本明細書中以降、Ｒｅｆ−１レドックス機能の阻害又はＲｅｆ−１ ｓｉＲＮＡを用いた処置（表３）の公開された研究が論じられる。
癌細胞における公知の機能に基づいて治療薬をＲｅｆ−１とペアにすること
第一に、仮説主導のアプローチを使用して、Ｒｅｆ−１阻害剤と組み合わせた化学療法剤を試験して、増加した致死率についてスクリーニングする。このアプローチは、腫瘍細胞生存についてＲｅｆ−１機能と相互作用するかＲｅｆ−１機能に依存する別の鍵となる経路と合わせて、同時にＲｅｆ−１シグナル伝達に作用することを伴う。この２つの組み合わせは、単独で投与された場合のそれらの効果と比べて、上昇した致死率、劇的に高められた細胞死を作り出すはずである。
このアプローチを使用して、Ｒｅｆ−１シグナル伝達と組み合わせてＳＴＡＴ３シグナル伝達に作用することが、膵臓癌細胞株の生存率及び遊走能に劇的に影響を及ぼすということが見いだされた（図３）。
異なる癌のいくつかの研究は、低酸素症又は血管新生等の腫瘍促進プロセスにおけるＲｅｆ−１の阻害を伴う併用治療剤が有効であるという考えを支持する。低酸素症及び血管新生によって特徴づけられる骨肉腫モデルでは、エンドスタチンと組み合わせたＲｅｆ−１の阻害はＶＥＧＦ発現及び微小血管密度の低下を伴いインビボ効力を実証する。
Ｒｅｆ−１及び低酸素を伴う別の高められた致死的なペアは、Ｒｅｆ−１阻害とＨＩＦ−１α標的ＣＡ９の阻害との組み合わせである。膵臓三次元共培養モデルを使用すると、Ｒｅｆ−１及びＣＡ９を用いた二重標的化（図２）の後に腫瘍スフェロイド面積が減少する。増強の機構は、同時のＣＡ９及びＲｅｆ−１の遮断によって持続されるｐＨの上昇並びに低酸素条件に適応する能力が腫瘍において遮断されることに起因すると考えられる。
最後に、ドキソルビシン感受性結腸癌細胞とドキソルビシン耐性結腸癌細胞とを比較する研究は、低酸素がＰｇｐ（Ｐ−糖タンパク質）及びＢＣＲＰ（乳癌抵抗性タンパク質）の発現を増強すること、並びに低酸素条件下でドキソルビシンにＡＰＸ３３３０を添加することは、ＨＩＦ活性を有意に減弱することができ、Ｐｇｐ及びＢＣＲＰの上方制御をブロックすることができるということを明示する。Ｐｇｐ及びＢＣＲＰ発現のこの減少は、とりわけ親細胞において、観察されたドキソルビシン蓄積の増加に役割を果たす可能性がある。これらの結果は、Ｒｅｆ−１のレドックス機能の遮断がＨＩＦシグナル伝達を遮断すると、ドキソルビシンに対する結腸癌細胞の応答が増強される可能性があるということを示唆する。
最近の研究は、ＡＴ−１０１（ゴシポール）をシスプラチンと逐次的に使用することにより、シスプラチンに対するＮＳＣＬＣ細胞株の感受性を高めようとした。ＡＴ−１０１は、多くの様式で抗腫瘍性効果を奏する。ＡＴ−１０１は、ＢＨ３模倣物であり、Ｒｅｆ−１のＤＮＡ修復及びレドックス活性を阻害することも示されている。ＳＴＡＴ３活性のＲｅｆ−１のレドックス阻害を通しての抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ＸＬの遮断は、この組み合わせで見られる増強された細胞死滅及び腫瘍成長に寄与する。さらには、ＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９では、ＡＰＥ１発現のｓｉＲＮＡ阻害は、シスプラチンに対するＡ５４９細胞の感受性を有意に高め、細胞アポトーシスを増加させた。これらの研究の両方が、Ｒｅｆ−１機能を、シスプラチンに対する細胞の応答において、とりわけＳＴＡＴ３を通してのアポトーシスシグナル伝達において非常に重要であると指摘する。
対照的に、ＡＰＥ１修復又はＲｅｆ−１レドックス活性のいずれかの阻害剤と組み合わせたシスプラチンに曝露された乳癌細胞株における最近の研究では、シスプラチン耐性が上昇した。それらの結果が、Ｒｅｆ−１が同時に阻害されるときシスプラチンに対するより大きい応答を明示する他の研究と異なる理由を、ミスマッチ修復タンパク質（ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＬＨ１、及びＥＲＣＣ１）の同時の下方制御が説明する可能性があると著者らは推測する。テーラーメイド医療を追求して、これらの前臨床研究は、化学療法後の細胞特異的シグナル伝達及びＤＮＡ傷害剤の後に起こるＤＮＡ修復経路間のクロストークを解明することの重要性を明示する。シスプラチンレジメンへのＲｅｆ−１阻害剤の追加を考慮することなど新しい処置の組み合わせが提案されるときには、これらの要因は考慮される必要があるだろう。
最後に、ＡＰＸ３３３０を介したＲｅｆ−１阻害及びＲｅｆ−１のｓｉＲＮＡノックダウンはともに、膵臓癌細胞においてβ−カテニンを上方制御する。ＷＮＴ／β−カテニン阻害剤であるＩＷＲ−１がＡＰＸとペアにされるとき、増強された細胞毒性が起こった。
これらの研究は、癌生存経路の見かけ上「離れた走路」がどのように交差することができるか、それらの交差点がどのようにＲｅｆ−１を伴うか、そしてこれらの交差点から生じる非常に興味を惹く治療可能性を示す。
Ｒｅｆ−１を伴う併用治療剤を予測するためのビッグデータのマイニング
新しい処置選択肢を見出すための第２の選択肢は、ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）及びＣＣＬＥ（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ）等の公的に入手可能なデータセットをマイニングして、癌処置の状況において利用するための有効な併用治療を（コンピューター上で）解明することである。ゴールは、特に処置の選択肢がほとんどない悪性の癌について、増加しているようである致命的な標的の選択を加速することである。
例えば、歴史的には膵臓癌において、新しい標的薬は標準治療薬、ゲムシタビンとペアにされたであろう。しかし、複数の癌関連経路の選択的な阻害剤をゲムシタビンに添加することは、生存を有意に延ばさず、統計的に有意であるが、５年生存率を延ばすこともしなかった。現在のオミクスの時代では、ショットガンアプローチではなく、「ビッグデータ」を、増加した致死率及び有効な薬物組み合わせを予測するために使用することができる。
ＨｅＬａ細胞におけるＲｅｆ−１ノックダウン後の転写プロファイリング及びプロテオミクスプロファイリングを組み合わせた研究は、Ｒｅｆ−１調節後に差異的に発現されるいくつかの経路を明らかにする。これらの経路としては、ＤＮＡ損傷、ミトコンドリア機能、及び微小管安定化が挙げられる。Ｒｅｆ−１ノックダウン後のＤＮＡ修復タンパク質の下方制御は、ＤＮＡ傷害剤へのＲｅｆ−１阻害剤の添加が癌細胞にとって有害であるということの別の立証である。
上述の研究は、ミトコンドリア機能における下方制御も明示する。ミトコンドリアは、Ｒｅｆ−１調節後の細胞の疾患又は健康の重要な指標として浮かび出てくる。それゆえ、抗アポトーシスの機構を標的とする薬物は、Ｒｅｆ−１阻害と組み合わされると、有効である可能性がある。このような薬物としては、Ｂｃｌ−２阻害剤又はＹＭ−１５５（サバイビン阻害剤）が挙げられよう。最後に、上記プロテオミクスの研究は、Ｒｅｆ−１阻害が増加した致死率として有用である可能性がある別の領域を示唆する。Ｒｅｆ−１発現の欠如は、アクチン等の微小管安定化タンパク質に影響を及ぼし、線維の適正な組織化を妨げる。ドセタキセル、パクリタキセル、及びビンブラスチンを含めたいくつかの一般に使用される化学療法剤は微小管動力学を混乱させる。それゆえ、これらの薬剤は、Ｒｅｆ−１阻害とペアにすることができるという明るい見通しを示す。
Ｒｅｆ−１ ＤＮＡ修復及びＣＩＰＮ；レドックス機能を変えることによる間接的な連結
化学療法剤誘発末梢ニューロパチー（ＣＩＰＮ）は、抗癌治療の最も高頻度に見られる用量制限毒性の１つである。癌患者の９０％までが、抗癌処置の間又は抗癌処置の後のどこかの時点で化学療法剤誘発末梢ニューロパチー（ＣＩＰＮ）を経験する。実際、６つの最も一般的な悪性腫瘍に対して使用される抗癌剤は、ＣＩＰＮに対する実質的なリスクをもたらす。これらの薬物としては、限定はされないが、白金剤、タキサン類、ビンカアルカロイド類、プロテアソーム阻害剤、免疫刺激剤及びさらに新しくは、標的治療薬が挙げられる。目下のところ、ＣＩＰＮを予防又は処置するための承認された処置はなく、従って、神経毒性は、一部の患者にとっては用量を制限するものとなりうる。白金薬物、特にシスプラチン及びオキサリプラチンは、小児及び成人の癌に対する多くの標準治療処置（ＳＯＣ）レジメンの重要な成分である。例えば、オキサリプラチンは、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ及びＦＯＬＦＯＸプロトコルの一部である。
ＣＩＰＮは、処置が完了した後も持続する可能性がある。癌患者の４０％までが、処置が終わった後５年ＣＩＰＮと格闘し続け、１０％が２０年を超えた後も症候を示したままとなる。従って、ＣＩＰＮは、癌サバイバーシップ、生活の質に直接影響を及ぼし、癌が再発した場合に将来の処置の選択肢を限定する可能性がある。
培養した感覚神経の実験モデルを使用した以前の研究では、ＣＩＰＮとＤＮＡの損傷及び修復との間に因果関係が確立された。ＡＰＥ１の発現を低下させることによりＤＮＡ塩基除去修復（ＢＥＲ）経路の活性を低下させることで、抗癌処置によって生み出される神経毒性が増加し、他方、ＡＰＥ１の活性を増大させることで、その神経毒性が低下することが実証された。加えて、ＡＰＥ１のレドックスシグナル伝達機能ではなくてＡＰＥ１のＤＮＡ修復機能が感覚神経の生存及び機能にとって非常に重要であることが実証された。小分子レドックス阻害剤ＡＰＸ３３３０が電離放射線（ＩＲ）、シスプラチン、及びオキサリプラチンによって引き起こされる酸化的ＤＮＡ損傷から感覚神経を保護するということがさらに実証された（図５）。
これは疑問を投げかける。Ｒｅｆ−１レドックス特異的阻害剤はＤＮＡ修復活性にどのように影響を及ぼすのか？と。ＡＰＸ３３３０はＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のレドックス機能の標的阻害剤であるが、感覚神経の状況では、ＡＰＸ３３３０はこのタンパク質のＤＮＡ修復（ＡＰエンドヌクレアーゼ）活性も増強することができるように思われる（図６）。これは直観に反したように思われるが、ＡＰＸ３３３０は、上記タンパク質を経時的にほどかせる（アンフォールドの状態にする）。このアンフォールディングは、第一にＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のアミノ末端を変えて、そのタンパク質のフォールド／アンフォールドの状態の平衡を撹乱させ、修復活性を促進することにより、そのタンパク質と下流の転写因子標的との相互作用に影響を及ぼす。Ｒｅｆ−１レドックス活性からのＡＰＥ１のこの離脱は、ＡＰＥ１修復エンドヌクレアーゼ活性を増強しうる。単離された感覚神経がＡＰＸ３３３０に曝露されると、Ｒｅｆ−１エンドヌクレアーゼ活性の濃度依存的な増加が起こるが、これは腫瘍細胞では認められない。本願明細書で論じられるように、ＡＰＸ３３３０は、電離ＩＲ、シスプラチン及びオキサリプラチン等の剤によって誘発されるＤＮＡ損傷及び活性酸素種（ＲＯＳ）産生から感覚神経を保護するということが見出された。
神経毒性に対するあらゆる推定上の治療薬の非常に重要な特性は、投与された処置（１種又は複数種）の抗癌機能を損なわないということである。重要なことには、ＡＰＸ３３３０によるＤＮＡ修復活性の増強は、有糸分裂細胞では認められなかった。ＡＰＸ３３３０が、腫瘍細胞株、患者由来の細胞株、及び動物モデルにおける腫瘍の成長及び／又は生存に悪影響を及ぼすということが示された。それゆえ、ＡＰＸ３３３０は、腫瘍細胞に対する抗癌剤の効果を変えることなく、分裂終了細胞を保護することができるであろうという可能性がある（図６）。加えて、ＡＰＸ３３３０は、インビボでシスプラチン又はオキサリプラチンの腫瘍死滅効力に影響を及ぼさず、その上、ＡＰＸ３３３０は、酸化的ＤＮＡ損傷からＤＲＧニューロンを保護する。さらなるトランスレーショナルリサーチがさらにこれらの知見を裏付けると、ＡＰＸ３３３０は、酸化的ＤＮＡ損傷のＢＥＲ修復を促進し感覚神経を保護する、ヒトにおける神経防護作用機構として提案されうる。健康な細胞では、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のレドックス機能ではなく、ＤＮＡ修復機能が感覚神経の生存／機能のために必要であるように思われる。そのことは腫瘍細胞とは反対である。まとめて考えると、これらのデータは、ＡＰＸ３３３０が、処置を損なうことなく癌治療に対して神経防護作用を有することができるという考えを支持する。
実施例１
いくつかの研究がＡＰＥ１によって制御される遺伝子、及び具体的にはそのレドックスシグナル伝達機能を検討しているが、ＡＰＥ１によって制御される遺伝子の包括的なリストを作成することは困難であることが明らかになっている。というのも、ＡＰＥ１は細胞生存能にとって必須であるからである。特に、マウスにおけるＡＰＥ１ノックアウトは、着床後５日齢〜９日齢の間に胚性致死をもたらす。従って、安定なＡＰＥ１ノックアウト細胞株を生成することはこれまでに可能ではない。
このジレンマを回避するためのアプローチは、コンディショナルノックアウト及びｓｉＲＮＡノックダウンを利用してきた。ｓｉＲＮＡによるＡＰＥ１ノックダウンは有用であるが、このアプローチは不均一な母集団を生み出し、異なる量のＡＰＥ１タンパク質を持つ細胞を生じる。加えて、ｓｉＲＮＡノックダウンは一過性であり、ＡＰＥ１発現は経時的に回復する。この結果、混合母集団でＡＰＥ１ ｓｉＲＮＡを使用して得られる情報の量には限界がある可能性がある。
この問題に対処して、ＡＰＥ１によって制御される有望な多くのエフェクターに対する変化をより正確に検出するために、この実施例では、単細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）を利用して、以前はＡＰＥ１に結び付けられていなかった新しい経路を特定する。
方法
細胞培養
Ｐａ０３Ｃ、Ｐａ０２Ｃ、Ｐａｎｃ１０．０５及びＰａｎｃ１９８（Ｐａ２０Ｃ）をジョンズ・ホプキンズ大学（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＡｎｉｒｂａｎ Ｍａｉｔｒａ博士から得た。すべての細胞を３７℃で５％ＣＯ２の中で維持し、１０％血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ；ローガン（Ｌｏｇａｎ）、ユタ州）を伴うＤＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州）の中で成長させた。細胞株の同一性は、種についてのＤＮＡフィンガープリント分析（ＩＤＥＸＸ ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ、コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、ミズーリ州）及びベースライン短鎖縦列反復配列分析試験によって確認した。すべての細胞株は、１００％ヒトであり、９マーカー短鎖縦列反復配列分析が記録されている。それらは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）を含まないことも確認した。
ＡＰＥ１及びスクランブルｓｉＲＮＡを用いた形質移入
使用したｓｉＲＮＡは、スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ：ＳＣＲ）（５’ ＣＣＡＵＧＡＧＧＵＣＡＧＣＡＵＧＧＵＣＵＧ ３’、５’ ＧＡＣＣＡＵＧＣＵＧＡＣＣＵＣＡＵＧＧＡＡ ３’）（配列番号１）及びｓｉＡＰＥ１（５’ ＧＵＣＵＧＧＵＡＣＧＡＣＵＧＧＡＧＵＡＣＣ ３’（配列番号２）、５’ ＵＡＣＵＣＣＡＧＵＣＧＵＡＣＣＡＧＡＣＣＵ ３’）（配列番号３）であった。すべてのｓｉＲＮＡトランスフェクションを、６穴プレートの１ウェルあたり１×１０５細胞をプレーティングし、その細胞を一晩接着させることにより実施した。翌日、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州）を使用して、製造業者が示したプロトコルに従って１０〜５０ｎＭの濃度でＡＰＥ１及びＳＣＲ ｓｉＲＮＡの中でトランスフェクトした。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、ｓｉＲＮＡ、及びリポフェクタミンをその細胞に１６時間残し、次いで１０％血清を伴う通常のＤＭＥＭ培地を添加した。トランスフェクション（形質移入）の３日後に細胞をＲＮＡ及びタンパク質の発現についてアッセイした。
ウエスタンブロット解析
細胞可溶化物全体に対して、細胞を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液（サンタクルーズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、カリフォルニア州）に溶解し、タンパク質を定量し、電気泳動にかけた。以下の抗体を使用して免疫ブロットを実施した：ＡＰＥ１（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、リトルトン（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ）、コロラド州）及びビンキュリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州）。ｑＲＴ−ＰＣＲ実験については、さらなる分析について考慮されるために、ＡＰＥ１発現はスクランブル対照と比べて少なくとも８０％減少させた。
単細胞ＲＮＡ配列決定
形質移入から３日後、ＳＣＲ／ｓｉＡＰＥ１細胞を採取し、９６穴マイクロ流体Ｃ１フリューダイム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）アレイ（フリューダイム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）、サウスサンフランシスコ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、カリフォルニア州、米国）にロードした。すべてのチャンバーを視覚的に評価し、死細胞又は複数の細胞を含有するすべてのチャンバーを排除した。ＳＭＡＲＴｅｒシステム（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ）、カリフォルニア州）を使用して、捕捉した単細胞からｃＤＮＡを生成した。ｄｓｃＤＮＡの量及び質を、高感度ＤＮＡチップ（Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ Ｃｈｉｐ）とともにアジレントバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）（アジレントテクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、サンタクララ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）、カリフォルニア州、米国）を使用して評価した。全部で４８のＳＣＲ及び４８のｓｉＡＰＥ１細胞を配列決定のために選んだ。Ｐｕｒｄｕｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙが、Ｎｅｘｔｅｒａキット（イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州）を使用してライブラリーを準備した。ストランドネスを特定しない（ｕｎｓｔｒａｎｄｅｄ）２×１００ｂｐのリードを、ＨｉＳｅｑ２５００を使用して、ラピッドランモードにて１レーンで配列決定した。ＲＮＡ−ｓｅｑデータは、未決定の受入番号を通して、遺伝子発現オムニバス（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ：ＧＥＯ）で入手可能である。
バイオインフォーマティクス及び統計解析
リードクオリティ（ｒｅａｄ ｑｕａｌｉｔｙ）をＦａｓｔＱＣバージョン０．１１．２を使用して観察し、その後、ＦａｓｔＸ−Ｔｏｏｌｋｉｔバージョン０．０．１３．２を使用してクオリティートリミング（ｑｕａｌｉｔｙ ｔｒｉｍｍｉｎｇ）を実施した。３０のＦａｓｔＸトリムスコア（ｔｒｉｍｓｃｏｒｅ）及び５０のトリム長を使用した。Ｔｏｐｈａｔ２を使用して、トリミングしたリードをヒトゲノムと配列比較した（ＥＮＳＥＭＢＬバージョンＧｒＣｈ３８．ｐ７）。１つのミスマッチを許容した。ＨＴＳｅｑバージョン０．６．１のｈｔｓｅｑ−ｃｏｕｎｔスクリプトを実行して、各遺伝子に位置するリードの数をカウントした。この分析では、ＨＴＳｅｑは、Ｂｉｏｐｙｔｈｏｎバージョン２．７．３を使用した。どの遺伝子が差異的に発現されたかを決定するために、ＲパッケージＢＰＳＣを使用した。これは、単細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータを解析するために特に設計されている。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓを利用して、ネットワーク分析を実施した（ＩＰＡ、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）、レッドウッドシティ（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ）、ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ）。ＩＰＡを使用して、上流制御因子分析（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）、標準経路分析（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）、機械的ネットワーク分析（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）、因果ネットワーク分析（ｃａｕｓａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎａｌｙｓｉｓ）、及び下流効果分析（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した（ｐ値＜０．０５について、結果を有意とみなした）。各タイプのネットワーク分析のアルゴリズム及び詳細は、Ｋｒａｍｅｒ，Ａ．ら、Ｃａｕｓａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１４年、３０（４）：５２３−３０頁に提示されている。
ｑＲＴ−ＰＣＲ反応
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、上記ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ分析から特定した種々の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定した。形質移入後、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア州）を製造業者の使用説明書に従って使用して、全ＲＮＡを細胞から抽出した。ランダムヘキサマー及びＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州）を使用して、ＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡ（ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ）を得た。ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ検出システム（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、カリフォルニア州）でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲマスターミックス（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州）を使用して、定量ＰＣＲを実施した。リボソームタンパク質Ｌ６（ＲＰＬ６）（Ｐａ０３Ｃ）又はアクチン（Ｐａｎｃ１０．０５、Ｐａｎｃ１９８、Ｐａ０２Ｃ）を基準遺伝子として使用する比較Ｃｔ（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ）法を使用して、相対定量的ｍＲＮＡレベルを決定した。ｑＲＴ−ＰＣＲのために使用したプライマーは、表４に詳細に記載されている。各試料につき実験を少なくとも三重に実施した。２−ΔΔＣＴ法及び共分散（ＡＮＣＯＶＡ）モデルの分析を使用して統計解析を実施した。
結果
ＡＰＥ１ノックダウン細胞のｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ分析
ＡＰＥ１のｓｉＲＮＡノックダウンは、ウエスタンブロット法によって検出されたとおり、ＡＰＥ１タンパク質の完全喪失をもたらさず、ｓｉＡＰＥ１試料において、図８Ａに示す代表的なウエスタンブロットによって示されるとおり、スクランブル対照（ＳＣＲ）と比べて１０〜２０％のＡＰＥ１タンパク質発現が観測された。２０ｎＭ ｓｉＲＮＡを使用した。というのも、これよりも高いレベルはオフターゲット（非特異的）効果、及びＡＰＥ１機能と関連しない細胞死滅をもたらすからである。それゆえ、それぞれの個々の細胞内のＡＰＥ１タンパク質の量に特異的に関連する遺伝子発現の変化を明瞭に特定するために、ＡＰＥ１ ｓｉＲＮＡノックダウン後の細胞に対して単細胞ＲＮＡ−ｓｅｑを実施した。
細胞周期注釈付き遺伝子を使用したバッチ効果の補正
試料調製の制約に起因して、ｓｉＡＰＥ１細胞及びＳＣＲ細胞を３バッチに分けた。１つのバッチはｓｉＡＰＥ１を含有し、２つのバッチはＳＣＲ細胞（ＳＣＲ１及びＳＣＲ２）を含有していた。細胞バッチ間の差を、ｓｃＬＶＭ Ｒパッケージを適用することにより補正した。ｓｃＬＶＭと併用して、Ｂｉｏｍａｒｔ Ｒパッケージを使用して、細胞周期注釈付き遺伝子（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ−ａｎｎｏｔａｔｅｄ ｇｅｎｅ）のリストを得た。具体的には、遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ：ＧＯ）用語ＧＯ：０００７０４９を使用して、「細胞周期」という注釈名（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｎａｍｅ）を付けて１８９個の遺伝子を特定した。これらの１８９遺伝子のうち、すべての細胞にわたって低発現を呈する遺伝子の除去（遺伝子検出率品質管理フィルタリング（ｇｅｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ））に起因して、１０２個だけが、分析にとどまっている遺伝子と合致した。細胞周期交絡を考慮するために潜在変数モデルをフィッティングし、処置及び対照の共変量もそのモデルに組み込んだ。フィッティング後の潜在変数モデルを使用すると、細胞周期交絡を低減して、補正後のデータセットを計算することが可能であった。
実例として、図８Ｂのプロットは、細胞周期について補正する前の２つの主成分を明示し、このデータにおける最も影響を及ぼす変動因（すなわち、ｘ軸は６．８４％の全変動を表す）が、ＳＣＲ１細胞及びＳＣＲ２細胞が分離される際に沿う軸に対応するということを示す。対照的に、２番目に影響を及ぼす変動因（すなわち、ｙ軸は４．５７％の全変動を表す）が、ｓｉＡＰＥ１細胞及びＳＣＲ細胞が分離される際に沿う軸に対応する。
細胞周期補正後の主成分プロット（図８Ｃ）では、ＳＣＲ１細胞及びＳＣＲ２細胞はより高い類似性を示し、これは、今回はｓｉＡＰＥ１及びＳＣＲ細胞が分離する際に沿う軸に対応する最大の変動因（すなわち、横軸は４．８８％の全変動を表す）を生じる。細胞周期補正を使用して、細胞周期注釈付き遺伝子に帰属される変動を、ｓｉＡＰＥ１処置とスクランブル対照との間の差に帰属される変動を除去することなく、有効に除去した。従って、細胞間の最大の変動因はＡＰＥ１ノックダウンに帰属した。
ｓｉＡＰＥ１ノックダウン及びＳＣＲ対照細胞における遺伝子の差異的発現
最初に、４８個のＳＣＲ細胞及び４８個のｓｉＡＰＥ１細胞を、配列決定のために捕捉した。２つのＳＣＲ及びｓｉＡＰＥ１細胞を、それぞれ、捕捉部位に複数の細胞が存在したため、配列決定の前に廃棄した。細胞検出率（各細胞において検出された遺伝子の百分率）及び遺伝子検出率（与えられた遺伝子が発現された細胞の百分率）を統計的品質管理のために使用した。５％という閾値を両方の検出率について使用し、これにより９４個の細胞及び１５，３５１個の遺伝子のデータセットを得た。１細胞あたりのメジアン数リードを０．９５百万として、１細胞あたりのリードの総数を１百万に規格化した。上述の細胞周期補正を実施した後、さらに３つの異常（外れ）細胞を除去した。というのも、それらは、いくつかの遺伝子について極端に高い発現カウントを有してＰＣＲバイアスの徴候を明示したからである。すべての品質管理手段及び外れ値（細胞）の除去の後、１細胞あたりに検出した遺伝子の数は、元の（すなわち、細胞周期交絡について補正する前の）遺伝子発現カウントを使用して、７０９５．７と平均した。各遺伝子について、ゼロではない遺伝子カウントの平均細胞数は、元の遺伝子発現カウントを使用して、４２．１であった。
ＳＣＲ群の中の残りの４６細胞における平均ＡＰＥ１発現は、百万あたり１０１．６リードであった。ｓｉＡＰＥ１細胞（ｎ＝４５）のうちで、２５細胞はＡＰＥ１発現が検出できず、ＡＰＥ１カウントはゼロであった。残りの２０細胞は、弱められたＡＰＥ１発現を示し、百万あたり平均で３７．７リードだった。これらの群の各々における細胞の分布を示すバイオリンプロットは、図９Ａで見ることができる。
発現差異解析のために一般に使用される利用可能なソフトウェアパッケージは多く存在するが、ＲＮＡ−ｓｅｑ実験から生じるカウントデータの分布についてどのような仮定がなされているかという点に関して、それらソフトウェアパッケージ間で重要な差がある。正規分布していないデータをモデル化するために一般化線形モデルを使う２つのそのようなＲパッケージは、ｅｄｇｅＲ及びＢＰＳＣである。パッケージｅｄｇｅＲは、過分散（より大きい分散）のポアソン分布（負の二項分布としても知られる）を用いてカウントをモデル化し、このことは、バルクのＲＮＡ−ｓｅｑと比べてこのデータにははるかに多くのゼロカウントが存在する（ゼロ過剰と呼ばれる現象）ため、単細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータには適切ではない可能性がある。ｅｄｇｅＲを使った実験結果は、非常に多くの差異的に発現される遺伝子を生じ、潜在的に高い偽発見率（データは示さず）を伴った。あるいは、ＲパッケージＢＰＳＣは、上記モデルにおいて追加のパラメータを使用して単細胞データにおけるゼロ過剰を十分に考慮することができるより柔軟なβ−ポアソン分布においてカウントをモデル化する。それゆえ、この実施例では、ＳＣＲ細胞（ｎ＝４６）とｓｉＡＰＥ１ノックダウン細胞（ｎ＝４５）との間の発現差異解析のためにＢＰＳＣ Ｒパッケージを使用した。
この実施例の後半で追加の実験計画の比較を容易にするために、ベースライン発現差異解析のために使用した一般化モデルの線形成分の明確な数式表現は、下記によって与えられる。
上記式において、μｉｊは、ｊ番目の遺伝子についてのｉ番目の細胞のβ−ポアソンカウント分布の期待値であり、β０は切片であり、β１はｌｏｇ（百万あたりのカウント）による遺伝子発現である。表現Ｉ［ｓｉＡＰＥ１］ｉは、細胞がｓｉＡＰＥ１ノックダウン群に属するときに１という値をとる指標変数である。このとき、ｊ番目の遺伝子の差異的発現は、以下のとおりの帰無仮説（Ｈ０と表す）及び対立仮説（Ｈ１と表す）を使用して検定できる。
上記の統計的設計のための１つの表現だけしか含まれていないが、このモデルは単純線形回帰よりも精緻であるということを強調する価値がある。というのも、データについて行った分布の仮定が基本的に異なるからである。この統計的設計を用いて、ＢＰＳＣ Ｒパッケージは、偽発見率カットオフ５％を用いて、上記ｓｉＡＰＥ１細胞とＳＣＲ細胞との間の１，９５０個の差異的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）を報告した。
これらの差異的に発現される遺伝子の７１．７％が、ｓｉＡＰＥ１細胞においてより低い発現レベルを有した。比較では、配列決定したすべての遺伝子の５８．５％がｓｉＡＰＥ１細胞においてより低い発現を有していたが、これらの遺伝子の多くは、全体的に非常に低い発現を有していた（図９Ｂ）。有意でない発現の変化を示した遺伝子に対する統計的に有意な増加／減少した発現を示した遺伝子の数に関してフィッシャーの正確確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ Ｔｅｓｔ）を使用すると、１０−１６というｐ値が得られ、非常に有意な結果となった。このことは、上記ＤＥＧに対するＡＰＥ１ノックダウンの支配的な阻害効果が、外的要因（細胞生存率等）に起因して引き起こされる可能性があるあらゆる全体的な発現の減少よりも大きいということを示した。
細胞内のＡＰＥ１レベルに関する差異的に発現される遺伝子の特定
ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑを実施することの利点の１つは、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑによってそれぞれの個々の細胞におけるＡＰＥ１発現を見ることが可能になることである。それゆえ、この情報を使用して、検出不能ＡＰＥ１（ＡＰＥ１のゼロ発現を示す細胞と定義する）又は検出可能ＡＰＥ１（ゼロより大きいＡＰＥ１の発現を示す細胞と定義する）のいずれかを有するとして、ｓｉＡＰＥ１群内の細胞を分類することが可能であった。すでに触れたように、ｓｉＡＰＥ１群内で、２５個の検出不能ＡＰＥ１を示す細胞（以降、検出不能ｓｉＡＰＥ１と呼ぶ）及び２０個の検出可能だが低下したＡＰＥ１発現を呈する細胞（本明細書中で以降、検出可能ｓｉＡＰＥ１と呼ぶ）が存在した。
ｓｉＡＰＥ１細胞の上記概要説明によって、３つの異なるカテゴリとして、ＳＣＲ対照、検出可能ｓｉＡＰＥ１及び検出不能ｓｉＡＰＥ１細胞を考慮することが可能になった。検出可能ｓｉＡＰＥ１細胞が検出不能ｓｉＡＰＥ１細胞及びＳＣＲ対照細胞の両方と区別できると考えられるならば、このようなモデルは適切である。この場合のモデルは下記によって与えられる。
上記式中、表現Ｉ［ｓｉＡＰＥ１］ｉＩ［ＡＰＥ１＞０］ｉは、ｉ番目の細胞がｓｉＡＰＥ１群に属しかつゼロではないＡＰＥ１発現を有する（検出可能ｓｉＡＰＥ１）ときに、１という値をとる。表現Ｉ［ｓｉＡＰＥ１］ｉＩ［ＡＰＥ１＞０］ｉは、ｉ番目の細胞がｓｉＡＰＥ１群に属しかつ検出可能ＡＰＥ１の発現を有しない（検出不能ｓｉＡＰＥ１）ときに、１という値をとる。ｊ番目の遺伝子の差異的発現についての検定を、帰無仮説及び対立仮説を使用して実施した。
このモデルは、結合有意性（ｊｏｉｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）について検定できる２つのパラメータを有しているが、最初のＳＣＲ／ｓｉＡＰＥ１モデルは、検定するための１つのパラメータしか有していなかった。両方のパラメータの単一の検定で結合有意性を見積もることは可能であるが、ＳＣＲ対照に対する検出不能ｓｉＡＰＥ１群と検出可能ｓｉＡＰＥ１群との間の個々の差異を把握するために、パラメータ特異的な有意性を計算した。実際に、これらのパラメータの各々を別々に検定し、それらの結合有意性を、フィッシャー法（Ｆｉｓｈｅｒ’ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して得られたｐ値として報告した。ｊ番目の遺伝子に対するβ１ｊ、β２ｊの検定に対応する２つのｐ値ｐ１ｊ、ｐ２ｊについては、統合検定統計量（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｅｓｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ）は下記として記述される。
上記式中、Ｆは、帰無仮説のもとでは、自由度４のカイ二乗確率変数として分布する。統合ｐ値（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐ−ｖａｌｕｅ）ｐ＊は、それゆえ下記として計算される。
上記式中、Ｐχ４ ２はχ４ ２確率変数の累積分布関数を表し、Ｆ＊は、各遺伝子についての計算されたｐ値を使用するだけの上のＦと同様に計算される経験的な検定統計量である。フィッシャー法は、上記のとおり、対照と比べたときの２つの群の差異的発現の一貫した方向の仮定を強制しないということに触れておく価値がある。差異的発現の方向（正又は負）は検出可能ｓｉＡＰＥ１群及び検出不能ｓｉＡＰＥ１群の間で一貫しているはずだという仮定を直接上記分析の統計的設計に組み込むことは有用であるかもしれないが、これらのアイデアは、さらには追求しなかった。
この分析は、ＳＣＲ細胞と検出可能ｓｉＡＰＥ１細胞との間、ＳＣＲ細胞と検出不能ｓｉＡＰＥ１細胞との間、又はＳＣＲ細胞とｓｉＡＰＥ１細胞の両カテゴリとの間に存在する可能性がある差異の検出を可能にする。共同解析（ｊｏｉｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、１つのパラメータが有意でないと報告され、他は有意であると報告される可能性がある場合に、単独の異常値（外れ値）を警戒し、遺伝子が差異的に発現されると報告されるのを防ぐ。加えて、ＳＣＲ群から検出可能ｓｉＡＰＥ１群へ、検出不能ｓｉＡＰＥ１群へ移動するにつれてＤＥＧの発現変化の方向が一貫していると予想されるので、この実験計画は、結果の解釈を支援し、外れ値によって潜在的に影響を受ける遺伝子を特定するのに役立つ。このＳＣＲ／検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１の分析は、５％の偽発見率を用いて２，８３７個の遺伝子を特定した。上記ＳＣＲ／ｓｉＡＰＥ１分析で特定した１，９５０個のＤＥＧのうちで、１，９４５個（９９．７％）がこの引き続く分析において差異的に発現されることが判明した。加えて、このＤＥＧの７２．１％は下方制御され（図９Ｃ）、ＳＣＲ／ｓｉＡＰＥ１分析で下方制御された７１．７％と同様であった。この一貫性は、特定したＤＥＧの数の増加がこのより正確な統計モデルに起因することを示しており、それを好ましい分析にすることを示す。
どの遺伝子が検出可能ｓｉＡＰＥ１細胞と検出不能ｓｉＡＰＥ１細胞との間で差異的に発現されるかを検討するためにも分析を実施した。この分析は、上記２つの細胞群のより少ない試料サイズに起因して、統計的に力不足であった。それは、６０個だけのＤＥＧが特定されるという結果を生じ、これは、とりわけＳＣＲ対照細胞と比べた場合には、検出可能ｓｉＡＰＥ１細胞及び検出不能ｓｉＡＰＥ１細胞が同様の遺伝子発現パターンを有することを示唆していた。ＤＥＧをＳＣＲ／検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１の結果と比較すると、４２個の遺伝子が重複することが判明し、他方、ＳＣＲ／ｓｉＡＰＥ１分析では、６個の遺伝子だけが重複していた（図１０Ａ）。これらの６つの遺伝子（ＴＭＥＭ４５Ａ、ＴＭＥＭ１２６Ａ、ＴＭＥＭ１５４、ＣＯＭＭＤ７、ＩＳＹＮＡ１及びＴＮＦＡＩＰ２）は、すべての３つの分析の間で重複する数少ない遺伝子であった。１細胞あたりのＡＰＥ１発現に関するこれらの遺伝子の発現を図示するバイオリンプロットを図１１Ｂ〜図１１Ｇに示す。すべての３つの分析におけるこれらの６つの遺伝子の存在は、ＡＰＥ１レベルが低下するにつれて、これらの６つの遺伝子の発現レベルがさらに変化するということを確認した。
差異的に発現される遺伝子の臨床的関連の決定
この実施例の１つの包括的な目的は、ＡＰＥ１阻害と、改変されたＡＰＥ１発現によって大きな影響を受ける経路に作用する臨床的に承認された薬物との有望な組み合わせを、最初は膵臓癌において、しかし最終的には他の癌において確認することであった。このゴールに向かって、異なる分析によって特定したＤＥＧの臨床的関連を、癌ゲノムアトラス（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ：ＴＣＧＡ）を使用して検討した。ＴＣＧＡは、癌患者由来の腫瘍遺伝子発現及び臨床成績等のデータを含んでいる。検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１分析で検出した少数のＤＥＧに起因して、検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１分析をこのＴＣＧＡ分析から除外した。ＳＣＲ／ｓｉＡＰＥ１分析及びＳＣＲ／検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１分析の両方を利用した。このＴＣＧＡ分析を実施することで、この実施例で特定したＤＥＧの臨床的関連の測定が可能になり、上記２つの分析のための性能測定基準も提供された。
ＲＴＣＧＡツールボックスを使用して、ＴＣＧＡからのデータを解析した。この解析では、配列決定の時点での遺伝子の発現レベルが膵臓癌を有する患者の死までの日数に統計的に有意に関連する場合に、その遺伝子は臨床的に関連するとして定義される。遺伝子の統計的有意性は、臨床試験及び生物統計学における一般に使用されるモデルであるコックス比例ハザード回帰モデル（Ｃｏｘ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｈａｚａｒｄｓ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ）を使用して決定する。具体的には、（配列決定の時点でまだ生きている患者に起因する打ち切りを考慮する）死までの日数の成績を、Ｒパッケージ生存を使用するバルクＲＮＡ−Ｓｅｑを介して、患者腫瘍試料の規格化された遺伝子発現データ上に回帰した。上記分析における発現レベルのみを使用し、すべての腫瘍の種類及びステージにわたって、一回に１つの遺伝子をモデル化した。すべてにおいて、１７８個の患者腫瘍試料が含まれ、全部で２０，５０１個の遺伝子を考慮した。命名規則及び品質管理手順に起因して、１０，２９２個だけが、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ分析において配列決定した遺伝子の総数と生存成績のＴＣＧＡ分析との間で共通していた。それゆえ、この解析については、考察はこれらの１０，２９２個の遺伝子だけに限定する。この理由のため、両方の発現差異解析について下記で報告した差異的に発現される遺伝子の総数は、これまでの節で報告したものよりも少ない。
ＴＣＧＡ分析は、５％の偽発見率を使用して、死までの時間に統計的に有意に関連する１，６２７個の遺伝子を生じた。ＳＣＲ／ｓｉＡＰＥ１分析から考慮した１，４８６個のＤＥＧのうち、２４６個の遺伝子（１６．６％）が臨床的に関連すると判明した。ＳＣＲ／検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１分析は、利用可能な２，１１５個のＤＥＧのうち、３４５個の臨床的に関連する遺伝子（１６．３％）を特定した。
ＳＣＲ／検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１分析は、臨床的に関連する遺伝子の全体百分率に変化がなく臨床的に関連するより多くのＤＥＧを特定した。これは、この解析にユニークな８５６個の遺伝子が統計的例外ではなく、より厳格な統計モデルに起因して特定された信頼のおける結果であることをさらに立証する。この結果のため、すべての以下の分析を、上記ＳＣＲ／検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１の結果を用いて実施した。
癌関連経路における遺伝子発現パターン
インジェヌイティーパスウェイアナリシス（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ ｐａｔｈｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＩＰＡ）を使用して、上記ＳＣＲ／検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１分析でこれまでに特定したＤＥＧに基づいて、ＡＰＥ１によって制御される経路を決定した。全経路解析結果を表５に示す。全部で１０４個の標準経路を、片側のフィッシャーの正確確率検定を使用して、過剰出現と特定した。図１１Ａに提示したデータは、２０個の最も統計的に有意な過剰出現経路を明示し、そのうちの６個は、これまでＡＰＥ１に結び付けられていなかった。７０個のＤＥＧを伴うＥＩＦ２シグナル伝達経路（ｐ値＝１．５８×１０−１８）は、ＡＰＥ１ノックダウンによって最も影響を受ける経路であることが判明した。影響を受けた遺伝子を伴う経路の概説を図１１Ｂに提示し、７０個のＤＥＧ及び各細胞におけるそれらの発現を強調するヒートマップを図１１Ｃに示す。他のこれまでに結び付けられていなかった経路は、５５個のＤＥＧを伴うｍＴｏｒ経路（ｐ値＝３．９８×１０−１２）並びに４２個のＤＥＧを伴うｅＩＦ４及びｐ７０５６Ｋシグナル伝達の制御経路（ｐ値＝３．６３×１０−９）であった。これらの経路は、エンドサイトーシス経路を介するウイルス侵入、Ｒｈｏによるアクチンベースの運動性の制御及びプトレシン分解経路とともに、今では、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑデータに基づいて推定的にＡＰＥ１に結び付けられており、細胞内のＡＰＥ１のすでに多様な役割を広げている。全体では、これまでＡＰＥ１と関連付けられていなかった４４個の経路を、この実施例で特定した。これらの結果は、明確な遺伝子発現及び経路相互作用を決定する上での単細胞ＲＮＡ−ｓｅｑの重要性を強調する。
ＡＰＥ１ノックダウンによって影響を受けるいくつかの重要な経路は、以前の観察を確認し、それゆえ上記結果に対する検証を与えた。例えば、ＡＰＥ１によって制御されることが示されているＨＩＦ１αシグナル伝達経路は、上記経路分析で有意に（ｐ値＝０．００６）下方制御されることが判明した。同様に、ミトコンドリア機能障害（ｐ値＝８．１２×１０−６）及びハンチントン病シグナル伝達（ｐ値＝４．０７×１０−４）経路は、ともに、トップ１０の、ＡＰＥ１ノックダウンによって影響を受ける有意に過剰出現された経路である。ミトコンドリア機能障害経路は３７個のＤＥＧを有し、他方で、ハンチントン病シグナル伝達経路には４２個のＤＥＧがある。ミトコンドリア機能障害は、ハンチントン病の病態において役割を果たすと考えられており、先行研究は、ＡＰＥ１がミトコンドリア機能の維持にとって重要であることを明示している。ＡＰＥ１が、ミトコンドリアのＤＮＡ修復機能に関与することも公知である。ＡＰＥ１がこれらの経路に影響することが知られているが、この実施例は、ＡＰＥ１ノックダウンによって影響を受ける経路における遺伝子を示唆することにより、細胞内のＡＰＥ１の理解を広げる。
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用したｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ結果の検証
ＳＣＲ／ｓｉＡＰＥ１分析のｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ結果は、ｓｉＲＮＡノックダウン後のＰａ０３Ｃ細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲを実施することにより検証した。明確な経路由来でかつノックダウン後に様々な変化を示す遺伝子のパネルを選んだ（図１２Ａ）。これらの遺伝子は、ＳＣＲ／ｓｉＡＰＥ１分析及びＳＣＲ／検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１分析の両方において存在した。ｓｉＲＮＡノックダウンの効率を、選んだスクランブル対照と比べてＡＰＥ１発現の８０％を超える低下を呈した試料のみを用いて、ウエスタンブロットを使用して評価した。
加えて、すべての分析（ＳＣＲ／ｓｉＡＰＥ１、検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１及びＳＣＲ／検出可能ｓｉＡＰＥ１／検出不能ｓｉＡＰＥ１）において差異的に発現され統計的に有意であった３つの遺伝子の検証を実施した。すべての３つの分析でのこれらの遺伝子の存在（図１２Ｂ）は、ＡＰＥ１ノックダウンが大きいほど、それらの発現がより劇的に変化することを示す。
ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑにおいて統計的に有意な、増加又は減少した発現を示した遺伝子は、ｑＲＴ−ＰＣＲ後に同じ方向の変化を呈し（図１２Ｃ）、ＣＩＲＢＰ、ＣＯＭＭＤ７、ＩＳＹＮＡ１、ＩＴＧＡ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＤＸ５、ＲＡＢ３Ｄ、ＳＩＰＡ１、ＴＡＰＢＰ及びＴＮＦＡＩＰ２のｍＲＮＡレベルにおいて減少が見られた。ＢＣＲＰ及びＰＰＩＦの発現は、ノックダウン後に有意に増加した。ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑからの倍率変化をｑＲＴ−ＰＣＲ倍率変化に対して図１２Ｄにプロットした。Ｒ２値０．８２及びｐ＜０．０００１（線形回帰分析）で、倍率変化は一貫しており、上記単細胞ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ研究の正当性を立証することを確認した。
加えて、「関連性マップ（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ ｍａｐ）」プロジェクトは、クエリ遺伝子発現シグネチャーを、ヒト細胞を種々の薬剤で処置することから導かれた遺伝子発現プロファイルのデータベースに対して比較して、類似性を特定し薬物の機構を予測した。類似の遺伝子発現プロファイルを有する細胞株の薬物感受性データを組み込むことを使用して、有効な併用治療を予測した。Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ、ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ ｃｃｌｅ／ｈｏｍｅ）は、１，０３６個の癌細胞株のベースライン遺伝子発現データ及び５０４個の細胞株にわたって抗癌剤に対する薬理学的プロファイル（ＩＣ５０、ＡＵＣ）を備えている。基準としてのＣＣＬＥ遺伝子発現プロファイルセットを、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＧＤＳＣ）及びＣａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐｏｒｔａｌ（ＣＴＲＰ、ｈｔｔｐ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｔｒｐ／）からのデータとともに使用した。ＣＣＬＥ細胞株の遺伝子発現及びＲｅｆ−１ノックダウン単細胞の遺伝子発現を規格化し、ランク付けした。高い相関は、ＣＣＬＥ細胞で有効である薬物は、Ｒｅｆ−１シグナル伝達が阻害される細胞において有効であるという相対的に高い可能性を有するであろうということを示した。Ｒｅｆ−１単細胞と有意に高い相関（相関＞０．５）を持つＣＣＬＥ細胞株を特定した後、これらのＣＣＬＥ細胞株に対して高い効力（ＩＣ５０＜１μΜ）を有するこれらの薬物の頻度を数えた。この計算的なスクリーニング戦略を使用して、表６は、Ｒｅｆ−１阻害に最も有効であると予測される薬物を、最大数の細胞株を有していた薬物の順に記載する。表６中の薬剤は、さらなる分析のためにＡＰＸ３３３０との併用治療において利用されることになる。
実施例２
この実施例では、ドセタキセル及びトラメチニブと組み合わせたＲｅｆ−１阻害を分析した。
Ａｒｐｉｎ，Ｃ．ら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５、７９４−８０５（２０１６）；Ｌｏｇｓｄｏｎ，Ｐ．ら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５、２７２２−２７３２（２０１６）；Ｃａｒｄｏｓｏ，Ａ．ら、ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７、ｅ４７４２（２０１２）；及びＫｅｌｌｅｙ，Ｍ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ３５９、３００−３０９（２０１６）で調製された標準の三次元（３Ｄ）共培養アッセイを使用して、腫瘍細胞及び癌関連線維芽細胞に対する上記組み合わせの細胞毒性を評価した。
図１４に示すように、ドセタキセル及びトラメチニブと組み合わせたＲｅｆ−１阻害は、いずれの薬剤単独よりも有効であることが示された。ドセタキセルはＲｅｆ−１阻害と相乗作用しそうな最大数のＣＣＬＥ細胞株（１１５株）を与えたため、ドセタキセルを選んだ。トラメチニブは、ＣＣＬＥ株におけるＰＤＡＣ株の存在率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）（１４％）が上記計算的なスクリーニング戦略から明らかになったため、選んだ。
実施例３
この実施例では、ゲムシタビンと組み合わせたＡＰＸ３３３０によるＲｅｆ−１の阻害を分析した。
実施例２に記載した標準の三次元共培養アッセイを使用して、腫瘍細胞及び癌関連線維芽細胞に対する上記組み合わせの細胞毒性を評価した。
このアプローチの科学的仮定は、１）ＰＤＡＣ死滅に対して増大した効果を生じるＡＰＸ３３３０と組むべき化学療法剤を与える計算的アプローチ；及び２）ＡＰＸ３３３０の添加がゲムシタビンの効果を高めたことを実証する、ＡＰＸ３３３０及びゲムシタビンを用いた三次元研究及びインビボ研究、に基づく。三次元スフェロイドモデル（図１４Ａ及び図１４Ｂ）では、ＣＡＦとの共培養における患者由来の腫瘍株Ｐａ０３Ｃに対するゲムシタビン及びＡＰＸ３３３０の用量依存的組み合わせ効果が実証された。ＡＰＸ３３３０単独によるＣＡＦの面積の減少があったが、この効果は、ゲムシタビンの添加によって増強されなかった（緑の棒参照、図１４Ｂ）。
加えて、インビボでＡＰＸ３３３０をゲムシタビンと組み合わせることの有益な効果が実証された（図１４Ｃ）。ＡＰＸ３３３０（２５ｍｇ／ｋｇ）を標準用量のゲムシタビン（３５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせ、膵腫瘍量を低下させることにおけるＡＰＸ３３３０の「相加」効果を実証した。図１４Ｃ中のデータは、屠殺時の腫瘍量である。併用治療剤は刺激性が良好であった。単剤のみと比べて、ＡＰＸ３３３０とゲムシタビンとの併用治療においては、腫瘍量が有意に減少した。単剤であれ組み合わせであれ、すべての処置は、ビヒクル対照とは有意に異なった。これらのデータは、異種移植モデルにおいてＡＰＸ３３３０がゲムシタビンと組み合わされたときの新規な組み合わせ効果を実証するだけでなく、ＡＰＸ３３３０及び表６中のＦＤＡ承認薬を用いる併用療法を調べることを支持する。
実施例４
この実施例では、ＰＤＨ／ＫＤＧＨ阻害剤ＣＰＩ−６１３と組み合わせたＡＰＸ３３３０によるＲｅｆ−１の阻害を分析した。
実施例２に記載した標準の三次元共培養アッセイを使用して、腫瘍細胞及び癌関連線維芽細胞に対する上記組み合わせの細胞毒性を評価した。
図１５Ａ〜図１５Ｃに示すように、１００μΜ及び７５μΜのＣＰＩ−６１３と組み合わせたときの０．２μΜ、０．８μΜ、１．６μΜ、３．１μΜ、６．３μΜのＡＰＸ３３３０を使用すると、ＨＣＴ−１１６結腸癌細胞の、５０％を超える死滅があった。
実施例５
この実施例では、ＡＰＥ１ ｓｉＲＮＡノックダウンに応答したＰＤＡＣ細胞株の遺伝子発現の差を分析した。
次に、ＡＰＥ１ ｓｉＲＮＡノックダウンの効果を、他のＰＤＡＣ低継代患者由来細胞において分析した。これらの遺伝子に対するＡＰＥ１ノックダウンの効果は、図１６Ａ〜図１６Ｄに示すように、異なる患者株間で異なり、ＰＤＡＣ患者の肝転移から生成した細胞株であるＰａ０２Ｃは、同様にＰＤＡＣ肝転移から単離したＰａ０３Ｃ細胞とほぼ類似の遺伝子発現パターンを示した。Ｐａ０２Ｃ細胞では、ＢＣＲＰ、ＣＯＭＭＤ７、ＩＳＹＮＡ１、ＩＴＧＡ１、ＰＲＤＸ５、ＲＡＢ３Ｄ、ＳＩＰＡ１及びＴＮＦＡＩＰ２がすべて発現の低下をはっきり示したのに対し、ＮＯＴＣＨ３及びＰＰＩＦは、ノックダウン後に有意に増加した（図１６Ａ）。興味深いことに、ＢＣＲＰ及びＮＯＴＣＨ３の発現の変化は有意であったが、それらは、Ｐａ０３Ｃ細胞で見られた変化と反対方向であった。
初代ＰＤＡＣ腫瘍由来のＰａｎｃ１０．０５細胞は、Ｐａ０３Ｃ細胞と類似の結果を呈し、１２個の遺伝子のうち８つが類似の発現の変化を示した（図１６Ｂ）。ＣＯＭＭＤ７、ＩＴＧＡ１、ＲＡＢ３Ｄ、ＳＩＰＡ１、ＴＡＰＢＰ及びＴＮＦＡＩＰ２は減少を示したが、ＢＣＲＰ及びＰＰＩＦ発現を増加させた。対照的に、ＣＩＲＢＰ、ＩＳＹＮＡ１、ＮＯＴＣＨ３及びＰＲＤＸ５は、Ｐａｎｃ１０．０５細胞では、発現の変化を示さない。
同じく初代腫瘍由来のＰａｎｃ１９８細胞は、最も異なる結果を生成した（図１６Ｃ）。ＢＣＲＰ、ＣＩＲＢＰ、ＩＳＹＮＡ１、ＮＯＴＣＨ３、ＰＲＤＸ５、ＰＰＩＦ、ＳＩＰＡ１及びＴＡＰＢＰについては、発現の変化が見られなかった。ＣＯＭＭＤ７、ＩＴＧＡ１、ＲＡＢ３Ｄ及びＴＮＦＡＩＰ２は、すべて有意に低下した発現を示した。ＣＯＭＭＤ７、ＩＴＧＡ１、ＲＡＢ３Ｄ及びＴＮＦＡＩＰ２は、試験したすべての４つの患者由来の細胞株において有意に変化した（図１６Ｄ）。
６つの遺伝子だけが上記３つの分析の間で重複し（ＴＭＥＭ４５Ａ、ＴＭＥＭ１２６Ａ、ＴＭＥＭ１５４、ＣＯＭＭＤ７、ＩＳＹＮＡ１及びＴＮＦＡＩＰ２）（図１０Ａ）、これは、これらの６つの遺伝子のみが、ＡＰＥ１レベルが低下するにつれて、さらに影響を受けたことを明示する。これは予期されない結果であった。というのも、多数の遺伝子は、ＡＰＥ１レベルが低下するにつれてさらに変化すると予想されたからである。従って、これらの結果は、ＡＰＥ１が（ｓｉＡＰＥ１細胞中のＡＰＥ１転写物の数に対して）少なくとも８０％低下するとき、ＡＰＥ１ノックダウン後のほとんど遺伝子の発現の変化は明らかであること、及びＡＰＥ１のさらなる低下は、ほとんどの遺伝子をさらに有意に増加又は減少させないことを示す。いくつかの下方制御された遺伝子の場合は、これは、最初のＡＰＥ１ノックダウン（検出可能ｓｉＡＰＥ１細胞）がそれらの発現をほとんどゼロまですでに低下させたからであり、これは、ＡＰＥ１のさらなる低下（検出不能ｓｉＡＰＥ１細胞）がそれらの遺伝子に対して効果を及ぼさないということを意味する。
考察
ＢＣＲＰ（乳癌耐性タンパク質）／ＡＢＣＧ２は、癌細胞の多剤耐性を担うタンパク質の１つであるＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターである。ＰＤＡＣでは、高いＢＣＲＰ発現は、発癌、腫瘍進行、早期再発及び低い生存に対応する。いくつかの化学療法薬はＢＣＲＰに対する基質であり、このことは、細胞からのそれら化学療法薬の排出及び細胞内でのそれら化学療法薬の蓄積の減少を生じる。特に興味を惹く影響を受ける薬物は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）であり、この５−ＦＵは、現在ではＰＤＡＣ患者に対する治療レジメンの一部である。それゆえ、ＡＰＥ１ノックダウンがＢＣＲＰ発現に影響を及ぼすという発見は、ＰＤＡＣにおいて生存を改善するための将来の薬物の組み合わせを見据えた場合、非常に重要である。Ｐａ０２Ｃと遺伝子的に類似の腫瘍においてＡＰＥ１標的薬を５−ＦＵと組み合わせることは、ＢＣＲＰ発現の減少に起因して、この組み合わせに良好に反応するはずである。結腸癌幹細胞における研究は、５−ＦＵ及びＡＰＥ１の阻害剤ＡＰＸ３３３０をインビボで使用する場合、実際に劇的に増加した細胞死滅を示した。
名の由来となったＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の高度に保存されたメンバーであるＮＯＴＣＨ３は、細胞生存、増殖、分化、発育及び恒常性維持に関与するとされてきた。Ｎｏｔｃｈ３タンパク質レベルの上昇は、ＰＤＡＣ患者についての予後マーカーとして特定されており、腫瘍浸潤の増加、転移及び患者生存の短縮につながる。このため、Ｎｏｔｃｈ３は、新規な癌治療のための標的になっている。γ−セクレターゼ阻害剤及びＤＬＬ４抑制抗体はともに、Ｎｏｔｃｈ３の上流のタンパク質を標的にし、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害につながる。Ｎｏｔｃｈ３をＡＰＥ１によって影響を受けると特定することは、ＡＰＥ１標的治療をこれらの阻害剤と組み合わせて、ＰＤＡＣにおけるＮＯＴＣＨ３の発現及び機能に対するＡＰＥ１阻害の効果を増強する（Ｐａ０３Ｃにおいて）か又は弱める（Ｐａ０２Ｃにおいて）という可能性を開く。
検証した１０個の他の遺伝子のうちで、それらのうちの４つ、ＣＯＭＭＤ７、ＩＴＧＡ１、ＲＡＢ３Ｄ及びＴＮＦＡＩＰ２は、すべての４つの患者細胞株において発現の減少を示した（図１６Ｄ）。ＣＯＭＭＤ７、ＩＴＧＡ１、ＲＡＢ３Ｄ及びＴＮＦＡＩＰ２はすべて、ＰＤＡＣを含めて種々の癌において上方制御されることが示されている。これらの変化がすべてのＰＤＡＣ試料において共通であろうと想定することはできないが、この一貫性は、これらの遺伝子のいくつかが、複数のＰＤＡＣ腫瘍亜型にわたって、及び他の型の腫瘍において潜在的に有用であると思われる、ＡＰＥ１ベースの治療又は併用治療に対する有望な標的又はバイオマーカーを作製することができるだろうということを示唆する。さらには、これらの遺伝子は、ＡＰＥ１ノックダウンによって影響を受けるこの最初の実施例で特定した遺伝子の一部分を代表する。以前はＡＰＥ１と関連付けられていなかった経路の特定、及び以前はＡＰＥ１と結び付けられていなかったＤＥＧを呈する公知の経路の特定は、ＡＰＥ１ベースの併用治療剤に対する新規な標的を開く。実際に、特定した経路のいくつかをＡＰＥ１阻害と組み合わせて標的にする初期実験は、有望であるように思われる。
実施例６
ＡＰＸ３３３０及び関連ファミリー（系統群）の化合物に基づくさらなるＲｅｆ−１レドックス阻害剤の開発に着手した。構造活性相関（ＳＡＲ）に基づいていくつかの類似体を合成した。変更点としては、ジメトキシベンゾキノンのナフトキノン環への変更、カルボン酸の修飾、二重結合上の炭素鎖の短縮、及び水素又は種々のハロゲンによる環構造上のメチル基の置換が挙げられる。ＡＰＸ３３３０は生理的ｐＨでは帯電した分子として存在し、カルボン酸のアミド誘導体追加は、ＡＰＸ３３３０の物理的特性を変えた。また、親油性炭素鎖が二重結合上で短縮され、これにより、新しい化合物の親油性はより低くなる。これらの変更点は、インビトロ試験の際にＡＰＸ３３３０よりも大きい効力を呈する新しい化合物（例えば、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４）を与えた。
この実施例では、類似体、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４、並びにＡＰＸ３３３０、の効力を膵臓癌の三次元スフェロイドモデルにおいて分析した。
共培養モデル：三次元スフェロイドモデルを作製するために、Ｓｅｍｐｅｒｅら、Ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ ｔｈｅｒａｐｙ ２０１１、１２（３）、１９８−２０７；Ａｒｐｉｎら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０１６、１５（５）、７９４−８０５；及びＬｏｇｓｄｏｎら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０１６、１５（１１）、２７２２−２７３２に記載されている超低接着９６穴プレート（コーニングライフサイエンシーズ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））中の５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン（Ｌｏｇａｎ）、ユタ州）が追加され３％成長因子低減マトリゲル（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｍａｔｒｉｇｅｌ：ＲＧＦ、ビーディーバイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を含有するＤＭＥＭ成長培地の中で、三次元腫瘍スフェロイド培養物を成長させた。これらのスフェロイド培養物を、腫瘍細胞単独で、又はＣＡＦ（癌関連線維芽細胞）の存在下で腫瘍細胞を用いて成長させた。培養時間全体にわたって成長を追跡し、培養物中の細胞型を識別するために、腫瘍細胞をＴｄＴｏｍａｔｏ（赤色チャネル）で安定的に形質導入し、ＣＡＦをＥＧＦＰ（緑色チャネル）で安定的に形質導入した。患者細胞の不均一性及びユニークな遺伝子的特徴を保存するために、これらの修飾を新鮮な低継代細胞で実施し、成長速度は非感染細胞と同様であった。三次元スフェロイド培養物を、Ｌｏｇｓｄｏｎ、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０１６、１５（１１）、２７２２−２７３２及びＬｉｎｄｂｌｏｍら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０１２、４０（１）、１８−３２に記載されているＴｈｅｒｍｏ ＡｒｒａｙＳｃａｎハイコンテントイメージングシステムを使用して、プレーティング後４日目、８日目及び１２日目に分析した。ＴｄＴｏｍａｔｏ及びＥＧＦＰについてのフィルターを用い、ＡｒｒａｙＳｃａｎシステムによって２．５倍の拡大率で三次元培養物画像を得た。腫瘍及びＣＡＦの強度及び面積の定量化を、これらの三次元画像の二次元投影図を使用して成し遂げた。スフェロイドを、ＡｒｒａｙＳｃａｎ分析／撮像後４日目及び８日目に処置した。三次元スフェロイド培養物の共焦点画像を、Ｌｏｇｓｄｏｎら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０１６、１５（１１）、２７２２−２７３２にこれまでに記載されたとおり、共焦点／２光子Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ−１０００ ＭＰＥシステム（オリンパスサイエンティフィックソリューションズアメリカ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ａｍｅｒｉｃａ）；ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マサチューセッツ州）を用い、Ｉｎｄｉａｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ施設（インディアナポリス、インディアナ州）で記録した。
これらのスフェロイド培養物を、Ｐａｎｃ１０．０５腫瘍細胞単独で、又はＣＡＦ（癌関連線維芽細胞）の存在下でＰａｎｃ１０．０５腫瘍細胞を用いて成長させた。Ｐａ０３Ｃ細胞を、単独で、又はＣＡＦ１９細胞とともに三次元培養物へとプレーティングした。スフェロイドを、ＡｒｒａｙＳｃａｎ分析／撮像後４日目及び８日目に、増加する濃度のナパブカシン、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、２５μΜ又は３５μΜのＡＰＸ３３３０で、又はナパブカシン及びＡＰＸ３３３０の組み合わせで処置した。これらのスフェロイドにおける腫瘍細胞成長を、プレーティング後４日目、８日目、及び１２日目に、蛍光強度（及び面積、データは示さず）によって測定した。三次元培養物を、測定後４日目及び８日目に、ＡＰＸ３３３０（一番上の列）、ＡＰＸ２００９（真ん中の列）、又はＡＰＸ２０１４（一番下の列）で処置した。グラフは、Ｎ＝３の標準偏差を伴う平均である。
図１７に示すように、ＡＰＸ３３３０及びその第二世代化合物は、細胞成長、細胞増殖を低下させた。さらに、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４は、より低い投薬量で投与される場合であっても、ＡＰＸ３３３０と同程度に有効であるように思われた。
実施例７
この実施例では、ＡＰＸ３３０及びＳＴＡＴ３阻害剤ナパブカシン（ＢＢ１−６０８−ＳＴＡＴ３阻害剤）の組み合わせを、その腫瘍死滅能について、実施例６に記載した膵臓癌の患者由来の三次元スフェロイドモデルにおいて分析した。
図１８に示すように、ＡＰＸ３３３０及びナパブカシンの組み合わせは、相乗的な腫瘍死滅効果を有していた。
実施例８
この実施例では、実施例６で調製したＰＤＡＣ三次元共培養モデルにおけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤との併用治療剤を分析した。
Ｐａ０３Ｃ腫瘍細胞及びＰａｎｃ１０．０５腫瘍細胞を、ＣＡＦの存在下で、三次元培養物において成長させた。スフェロイドを、４日目及び８日目に（黒矢印）、単剤、ビヒクル（ＤＭＳＯ）又は標的薬の組み合わせのいずれかで処置し、腫瘍（赤色）及びＣＡＦ（緑色）の強度を、３〜４日ごとに培養物中で、実施例７に記載したように定量した。
図１９Ａ及び図１９Ｂに示すように、ＡＰＸ３３３０及びナパブカシンの組み合わせは、膵腫瘍細胞に対して相乗的な腫瘍死滅効果を有していた。
加えて、ＡＰＸ３３０、又はその類似体ＡＰＸ２００９、及びＳＴＡＴ３阻害剤ナパブカシン（ＢＢ１−６０８−ＳＴＡＴ３阻害剤）の組み合わせを、同じ方法論を使用して、その腫瘍死滅能についてＰＤＡＣ三次元共培養モデルにおいて分析した。図２０Ａ及び図２０Ｂに示すように、ＡＰＸ３３３０及びナパブカシンの組み合わせも、ＡＰＸ２００９及びナパブカシンの組み合わせもともに、いずれの薬剤単独と比べて相乗的な腫瘍死滅効果を有していた。
実施例９
この実施例では、ＡＰＸ３３０及びＳＴＡＴ３阻害剤ナパブカシンの組み合わせを、インビトロ及びインビボで、その腫瘍死滅能について遺伝的ＰＤＡＣモデルにおいて分析した。
ＧＥＭＭ由来のマウスＫＰＣ（ＫｒａｓＬＳＬ．Ｇ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋；Ｐｄｘ１Ｃｒｅｔｇ／＋）細胞において、Ｎａｐａ誘発細胞毒性の増強を、ＡＰＸ３３３０をナパブカシンに添加した場合に観察した（図２１Ａ）。アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）増殖ベースのアッセイは、ＡＰＸ及びナパブカシンの組み合わせとの３日間のインキュベーションの後のこれらの薬剤の相乗性を実証する。
患者由来の腫瘍細胞（Ｐａ０３Ｃ）及びＣＡＦを一緒に注入して使用した非常に増殖性が高く悪性度が高いインビボ共培養モデルを用いた試験的研究において、ＡＰＸ３３３０及びＮａｐａの共処置は、腫瘍成長を有意に４６％阻害した（図２１Ｂ、ｐ＝０．０１２）。併用治療の効果を見るために亜致死性用量の単剤を使用し、併用治療は、マウスでは刺激性良好であった。腫瘍量は、処置の２週間後に有意に低下する。
実施例１０
この実施例では、ＡＰＸ３３０及びＣＡ９阻害剤ＳＬＣ−０１１１の組み合わせを、その腫瘍死滅能について、実施例６に記載したように調製した三次元共培養膵臓癌腫瘍モデルにおいて分析した。
Ｐａ０３Ｃ細胞及び１０．０５細胞を、ＣＡＦ１９細胞とともに三次元培養物中へプレーティングし、これらのスフェロイドにおける腫瘍細胞成長を、プレーティング後４日目、８日目、１２日目、及び１６日目に蛍光強度によって測定した。三次元培養物を、測定後４日目、８日目、及び１２日目に、ＡＰＸ３３３０及びＳＬＣ−０１１１で処置した。群の間の差を、チューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定を使用して判定した：＊＊＊ｐ＜０．００１対ＤＭＳＯ；＋＋ｐ＜０．０１対ＡＰＸ３３３０；＋＋＋ｐ＜０．００１対ＡＰＸ３３３０；ΛΛρ＜０．０１対ＳＬＣ−０１１１；ΛΛΛρ＜０．００１対ＳＬＣ−０１１１。グラフはＮ＝３の標準偏差を伴う平均である。これらのスフェロイドにおけるＰａ０３Ｃ腫瘍細胞（赤色チャネル）及びＣＡＦ（緑色チャネル）の蛍光像を１２日目に記録した。
図２２Ａ〜図２２Ｃに示すように、ＣＡ９及びＡＰＥ１の二重標的化は、いずれの薬剤単独よりも良好にＰＤＡＣ腫瘍を死滅させる。
実施例１１
この実施例では、ＡＰＸ３３０及び１つの他の治療薬（例えば、Ｂｃｌ２拮抗薬、ＨＤＡＣ１及び３阻害剤、ＴＫＩ阻害剤）の組み合わせを、その腫瘍死滅能について、実施例６に記載したように調製した三次元共培養膵臓癌腫瘍モデルにおいて分析した。
Ｐａ０３Ｃ腫瘍細胞及びＰａｎｃ１０．０５腫瘍細胞を、ＣＡＦ（癌関連線維芽細胞）の存在下で、三次元培養物において成長させた。スフェロイドを、４日目及び８日目に、単剤、ビヒクル（ＤＭＳＯ）又は標的薬の組み合わせのいずれかで処置し、腫瘍（赤色）及びＣＡＦ（緑色）の面積を、１２日後に培養物中で定量した。結果を、図２３Ａ〜図２３Ｅに示す。
実施例１２
この実施例では、ＡＰＸ３３０と、ＳＴＡＴ３阻害剤ナパブカシン又はＴＣＡ回路阻害剤ＣＰＩ−６１３のいずれか１つとの組み合わせを、その腫瘍死滅能について、実施例６に記載した三次元共培養膵臓癌腫瘍モデルにおいて分析した。
Ｐａ０３Ｃ腫瘍細胞及びＰａｎｃ１０．０５腫瘍細胞を、ＣＡＦの存在下で、三次元培養物において成長させた。スフェロイドを、４日目及び８日目（黒矢印）に、単剤、ビヒクル（ＤＭＳＯ）又は標的薬の組み合わせのいずれかで処置し、腫瘍（赤色）及びＣＡＦ（緑色）の面積を、１２日後に培養物中で定量した。結果を図２４Ａ〜図２４Ｃに示す。
実施例１３
この実施例では、ＡＰＸ３３３０及びＳＴＡＴ３阻害剤ルキソリチニブの併用治療剤を、ＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害することについて分析した。
最初に、ルキソリチニブが上記三次元共培養モデルにおいてｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）のリン酸化をブロックすることを確認した。ＳＴＡＴ３活性化の阻害の確認は、プレーティング後８〜１０日の三次元アッセイにおいて、ルキソリチニブ処置（１２．５μΜ）の４時間後にｐＳＴＡＴ３ Ｙ７０５残渣についての免疫ブロットによって行った。全ＳＴＡＴ３タンパク質を、負荷対照として、及び両方の細胞型におけるＳＴＡＴ３のレベルの基準として提供する。ｎ＝３から代表的なウエスタンブロットを示す（図２６参照）。
実施例６に記載した三次元共培養膵臓癌腫瘍モデルを使用して、低継代患者由来腫瘍細胞、Ｐａ０３Ｃを、ＣＡＦの存在下及び不存在下で三次元培養物において成長させた。スフェロイドを、ルキソリチニブ単独で、及びＡＰＸ３３３０（４０μΜ）と組み合わせたルキソリチニブで処置し、腫瘍（赤色チャネル）及びＣＡＦ１９番号１（緑色チャネル）の面積を、１２日後に培養物中でｎ＝４で定量したが、これは代表的なプロットである。
図２５に示すように、Ｒｅｆ−１／ＡＰＥ１及びＪａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達の二重標的化は、上記三次元共培養モデルにおいてＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害した。
実施例１４
この実施例では、ＡＰＸ３３３０及びＳＴＡＴ３阻害剤ルキソリチニブの併用治療剤を、側腹部共培養モデルにおいて、腫瘍成長を遅らせることについて分析した。
特に、図２７に示すように、患者由来のＰａ０３Ｃ腫瘍を用いたインビボ効力実験は、インビボで有意な腫瘍成長遅延を示した。ＡＰＸ３３３０と組み合わせたルキソリチニブ（Ｒｕｘ）は、患者由来の株及びＣＡＦを用いたこの高悪性度の共培養モデルにおいて、腫瘍量の減少も示した。
実施例１５
この実施例では、ＡＰＸ３３３０及びＳＴＡＴ３阻害剤ルキソリチニブの併用治療剤を、この処置がマウスのＰＤＡＣの共培養モデルにおいてすべてのＣＡＦを死滅させるわけではないことを確認するために分析した。
ＣＡＦに対するマーカーとしてのビメンチンを用いる免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して、上記併用治療が、共培養モデルにおいてすべてのＣＡＦを死滅させるわけではないことを確認した。ビメンチンに対する染色を、屠殺時に実施した。
腫瘍組織の免疫組織化学染色の方法：組織を、１０％ＮＢＦ中で、室温で一晩固定し、その後、この組織を、Ｌｅｉｃａ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｖａｃｕｕｍ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒの内部で段階的濃度のアルコールを経由してキシレンに移した。組織をパラフィン中に包埋し、その後、厚さ５ｍｍの切片に切断し、正に帯電したスライド上に載置し、６０℃で加熱した。次に、このスライドをキシレン中で脱パラフィンし、段階的濃度のアルコールを経由して水へと再水和した。このスライドをＴａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ダコ（Ｄａｋｏ））に、９０℃（水浴中）で２０分間浸漬することにより抗原賦活化を実施し、室温で１０分間冷却し、水中で洗浄し、次いで免疫染色に進んだ。スライドを、タンパク質ブロッキング溶液（ダコ（Ｄａｋｏ））で３０分間ブロックした。後のすべての染色工程を、自動化Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｅｒ上でＤａｋｏ ＦＬＥＸ ＳＹＳＴＥＭを使用して実施し、インキュベーションを室温で行い、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたＴｒｉｓ緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＴＢＳ − Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ）をすべての洗浄及び希釈のために使用した。一次抗体は抗マウスビメンチン及びｐ−ＳＴＡＴ３であった。染色特異性を確認するために、一次抗体と同じ濃度を使用して、アイソタイプ対照で対照切片を処置した。スライド全体のデジタル撮像のために、Ａｐｅｒｉｏ ＳｃａｎＳｃｏｐｅ ＣＳシステムを使用した。このシステムは、すべてのスライドを２０倍で撮像した。次に、対照及び処置群を統計学的差異について評価した。結果を図２８Ａ及び図２８Ｂに示す。
移植した腫瘍の処置を、移植後１１日目に開始した。特に、移植した共培養物は、２．５×１０６腫瘍細胞±５×１０６ＣＡＦを含んでおり、腫瘍細胞：ＣＡＦの比が１：２になっていた。この腫瘍は、約２００ｍｍ３の初期平均腫瘍サイズを有していた。次に、このマウスに４％Ｃｒ：ＥｔＯＨ中の５０ｍｇ／ｋｇ ＡＰＸ３３３０ ＢＩＤ、４％Ｃｒ：ＥｔＯＨ中の５０ｍｇ／ｋｇ Ｒｕｘ ＳＩＤ ｐｍ、又はこれらの薬剤の組み合わせのいずれかを投与した。処置スケジュールは、腫瘍が２０００ｍｍ３の平均サイズに到達するまで、５日間処置すること、次いで処置しない２日間を与えることからなっていた。処置しない場合には、このマウスは、２６日目に２７００ｍｍ３の平均腫瘍サイズに到達し、Ｒｕｘ又はＡＰＸ３３３０の処置だけでは、マウスは、２８日目に１７５０ｍ３の平均サイズに到達し、併用治療剤の場合には、マウスは、３１日目に１２００ｍｍ３の平均サイズに到達した。
実施例１６
この実施例では、結腸癌同所性腫瘍におけるＡＰＸ３３３０を伴うオキサリプラチンの抗癌効力を分析した。
免疫正常（ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マウスに、マウスＣ２６結腸癌細胞を盲腸に注射した（図２９Ａ）。動物をオキサリプラチン、又はＡＰＸ３３３０を伴うオキサリプラチンのいずれかで処置し、腫瘍サイズを、ビヒクル対照と比べて決定した（図２９Ｂ）。オキサリプラチン及びＡＰＸ３３３０で処置したマウスにおいては、オキサリプラチン単独で処置したマウスと比べて、劇的かつ有意に増加した腫瘍細胞死滅があった（図２９Ｂ及び図２９Ｄ）。加えて、ＡＰＸ３３３０処置は、ＣＲＣマウスの結腸におけるオキサリプラチン誘発性の筋層間神経細胞減少を軽減した（図２９Ｃ）。
実施例１７
この実施例では、ＡＰＸ２０１４及びＳＴＡＴ３阻害剤ナパブカシンの併用治療剤を、その腫瘍死滅能について、マウス結腸細胞株ＭＣ−３８において分析した。
ＭＣ−３８細胞（Ｙｕｎｈｕａ Ｌｉｕ）を、９６穴組織培養プレートに、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、１ウェルあたり２０００細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩成長させた。培地を、７５０ｎＭ〜４７ｎＭの５点広がりで系列的に１：２に希釈しかつＥＣ３０（３．０μＭ）のＡＰＸ２０１４、若しくはＥＣ１０（２．０μＭ）のＡＰＸ２０１４を加えた（ｓｐｉｋｅｄ）ナパブカシン（ＳＥＬＬＥＣＫ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）、又は単剤のみを含有するＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ薬物培地に交換した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベーションした。培地を、ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ＋１０％アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）蛍光性細胞生存指示薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標））に交換し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベーションし、次いで蛍光リーダー（ＳＹＮＥＲＧＹ（商標） Ｈ４ ＢｉｏＴｅｋ）上で読み取った。結果を図３０Ａに示す。図３０Ｂは、ＡＰＸ２０１４単剤の効果を示す。示したデータは、３つの別個の細胞毒性アッセイの平均であり、各アッセイは培地のみ対照に対して規格化している。
実施例１８
この実施例では、ＡＰＸ３３３０並びにＰＤＨ及びα−ＫＤＨ代謝阻害剤ＣＰＩ−６１３の併用治療剤、を、その腫瘍死滅能について、ヒト腺癌結腸浮遊細胞株Ｃｏｌｏ−２０１において分析した。
Ｃｏｌｏ−２０１（Ｙｕｎｈｕａ Ｌｉｕ）を、９６穴組織培養プレートに、ＲＰＭＩ＋ピルビン酸ナトリウム＋１０％ＦＢＳ中、１ウェルあたり２０００細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩成長させた。２倍（２×）薬物培地ＲＰＭＩ＋ピルビン酸ナトリウム＋５％ＦＢＳを、ＣＰＩ−６１３（Ａｐｅｘｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）７５μＭ若しくは５０μＭを加えた７５μＭ〜６．３μＭの５点広がりのＡＰＸ３３３０（Ａｐｅｘｉａｎ）の投薬量、又は単剤のみで添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベーションし、次いで１０％Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（アラマーブルー）蛍光性細胞生存指示薬（インビトロジェン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）（商標））をプレートに直接添加した。指示薬を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベーションし、次いで蛍光リーダー（ＳＹＮＥＲＧＹ（商標） Ｈ４ ＢｉｏＴｅｋ）上で読み取った。図３１Ａは、ＡＰＸ３３３０及びＣＰＩ−６１３の単剤の効果を示す。図３１Ｂは、ＡＰＸ３３３０及びＣＰＩ−６１３の相乗的な組み合わせ効果を示す。図３１Ｃは、ＡＰＸ３３３０及びＣＰＩ−６１３ ＥＣ５０（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を示す。図３１Ｄは、用量組み合わせのチョウ−タラレイ指数（Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ Ｉｎｄｅｘ：ＣＩ）（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を描く。図３１Ｅは、５０μＭ ＣＰＩ−６１３又は７５μＭ ＣＰＩ−６１３を加えたＡＰＸ３３３０の相乗的な薬物組み合わせ（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を描く。薬物組み合わせの相乗作用は、５０μＭ ＣＰＩ−６１３を加えた場合に、７５μＭ及び５０μＭのＡＰＸ３３３０投薬量で認められた。７５μＭ ＣＰＩ−６１３を加えた場合に、１つのＡＰＸ３３３０投薬量（６．３μＭ）を除きすべてで相乗作用が認められた。示したデータは、３つの別個の細胞毒性アッセイの平均であり、各アッセイは培地のみ対照に対して規格化している。
実施例１９
この実施例では、ＡＰＸ３３３０並びにＰＤＨ及びα−ＫＤＨ代謝阻害剤ＣＰＩ−６１３の併用治療剤を、その腫瘍死滅能について、ヒト癌腫結腸細胞株ＨＣＴ−１１６において分析した。
ＨＴＣ−１１６（Ｙｕｎｈｕａ Ｌｉｕ）を、９６穴組織培養プレートに、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、１ウェルあたり２０００細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩成長させた。薬物培地ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳを、ＣＰＩ−６１３（Ａｐｅｘｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）７５μＭ若しくは５０μＭを加えた７５μＭ〜６．３μＭの５点広がりのＡＰＸ３３３０（Ａｐｅｘｉａｎ）の投薬量、又は単剤のみで添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベーションした。培地を、ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ＋１０％Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ蛍光性細胞生存指示薬（インビトロジェン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）（商標））に交換し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベーションし、次いで蛍光リーダー（ＳＹＮＥＲＧＹ（商標） Ｈ４ ＢｉｏＴｅｋ）上で読み取った。図３２Ａは、ＡＰＸ３３３０及びＣＰＩ−６１３の単剤の効果を示す。図３２Ｂは、ＡＰＸ３３３０及びＣＰＩ−６１３の相乗的な組み合わせ効果を示す。図３２Ｃは、ＡＰＸ３３３０及びＣＰＩ−６１３ ＥＣ５０（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を示す。図ｄ３２Ｄは、用量組み合わせのチョウ−タラレイ指数（ＣＩ）（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を描く。図３２Ｅは、５０μＭ ＣＰＩ−６１３又は７５μＭ ＣＰＩ−６１３を加えたＡＰＸ３３３０の相乗的な薬物組み合わせ（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を描く。薬物組み合わせの相乗作用は、５０μＭ ＣＰＩ−６１３を加えた場合に、７５μＭ及び５０μＭのＡＰＸ３３３０投薬量で認められた。７５μＭ ＣＰＩ−６１３を加えた場合に、１つのＡＰＸ３３３０投薬量（６．３μＭ）を除きすべてで相乗作用が認められた。示したデータは、３つの別個の細胞毒性アッセイの平均であり、各アッセイは培地のみ対照に対して規格化している。
実施例２０
この実施例では、ＡＰＸ３３３０並びにＰＤＨ及びα−ＫＤＨ代謝阻害剤ＣＰＩ−６１３の併用治療剤を、その腫瘍死滅能について、ヒト癌腫結腸細胞株ＨＣＴ−１１６において分析した。
ＨＴＣ−１１６（Ｙｕｎｈｕａ Ｌｉｕ）を、９６穴組織培養プレートに、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、１ウェルあたり２０００細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩成長させた。薬物培地ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳを、ＣＰＩ−６１３（Ａｐｅｘｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１００μＭ若しくは７５μＭを加えた１００μＭ〜０．４μＭの１０点広がりのＡＰＸ３３３０（Ａｐｅｘｉａｎ）の投薬量、又は単剤のみで添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベーションした。培地を、ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ＋１０％Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ蛍光性細胞生存指示薬（インビトロジェン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）（商標））に交換し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベーションし、次いで蛍光リーダー（ＳＹＮＥＲＧＹ（商標） Ｈ４ ＢｉｏＴｅｋ）上で読み取った。図３３Ａは、ＡＰＸ３３３０及びＣＰＩ−６１３の単剤の効果を示す。図３３Ｂは、ＡＰＸ３３３０及びＣＰＩ−６１３の相乗的な組み合わせ効果を示す。図３３Ｃは、ＡＰＸ３３３０及びＣＰＩ−６１３ ＥＣ５０（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を示す。図３３Ｄは、用量組み合わせのチョウ−タラレイ指数ＣＩ）（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を描く。図３３Ｅは、１００μＭ ＣＰＩ−６１３又は７５μＭ ＣＰＩ−６１３を加えたＡＰＸ３３３０の相乗的な薬物組み合わせ（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を描く。１００μＭ ＣＰＩ−６１３を加えた場合に、すべてのＡＰＸ３３３０投薬量で薬物組み合わせの相乗作用が認められた。７５μＭ ＣＰＩ−６１３を加えた場合に、１００μＭ〜１２．５μＭのＡＰＸ３３３０投薬量で相乗作用が認められた。示したデータは、３つの別個の細胞毒性アッセイの平均であり、各アッセイは培地のみ対照に対して規格化している。
実施例２１
この実施例では、ＡＰＸ２０１４並びにＰＤＨ及びα−ＫＤＨ代謝阻害剤ＣＰＩ−６１３の併用治療剤を、その腫瘍死滅能について、ヒト癌腫結腸細胞株ＨＣＴ−１１６において分析した。
ＨＴＣ−１１６（Ｙｕｎｈｕａ Ｌｉｕ）を、９６穴組織培養プレートに、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、１ウェルあたり２０００細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩成長させた。薬物培地ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳを、ＣＰＩ−６１３（Ａｐｅｘｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）７５μＭ若しくは５０μＭを加えた２５μＭ〜１．６μＭ５点広がりのＡＰＸ２０１４（Ａｐｅｘｉａｎ）の投薬量、又は単剤のみで添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベーションした。培地を、ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ＋１０％Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ蛍光性細胞生存指示薬（インビトロジェン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）（商標））に交換し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベーションし、次いで蛍光リーダー（ＳＹＮＥＲＧＹ（商標） Ｈ４ ＢｉｏＴｅｋ）上で読み取った。図３４Ａは、ＡＰＸ２０１４及びＣＰＩ−６１３の単剤の効果を示す。図３４Ｂは、ＡＰＸ２０１４及びＣＰＩ−６１３の相乗的な組み合わせ効果を示す。図３４Ｃは、ＡＰＸ２０１４及びＣＰＩ−６１３ ＥＣ５０（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を示す。図３４Ｄは、用量組み合わせのチョウ−タラレイ指数ＣＩ）（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を描く。図３４Ｅは、５０μＭ ＣＰＩ−６１３又は７５μＭ ＣＰＩ−６１３を加えたＡＰＸ２０１４の相乗的な薬物組み合わせ（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を描く。５０μＭ ＣＰＩ−６１３を加えた場合に、ＡＰＸ２０１４投薬量では薬物組み合わせの相乗作用は確認できなかった。７５μＭ ＣＰＩ−６１３を加えた場合に、１つのＡＰＸ２０１４投薬量（１２．５μＭ）のみで相乗作用が認められた。示したデータは、３つの別個の細胞毒性アッセイの平均であり、各アッセイは培地のみ対照に対して規格化している。
実施例２２
この実施例では、ＡＰＸ３３３０及びＧＬＳ１代謝阻害剤ＣＢ−８３９の併用治療剤を、その腫瘍死滅能について、ヒト癌腫結腸細胞株ＨＣＴ−１１６において分析した。
ＨＴＣ−１１６（Ｙｕｎｈｕａ Ｌｉｕ）を、９６穴組織培養プレートに、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、１ウェルあたり２０００細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩成長させた。薬物培地ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳを、ＣＢ−８３９（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を１０００ｎＭ、又は５００ｎＭ加えたか又は単剤のみの１００μＭ〜０．４μＭの１０点広がりのＡＰＸ３３３０（Ａｐｅｘｉａｎ）の投薬量で添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベーションした。培地を、ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ＋１０％アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）蛍光性細胞生存指示薬（インビトロジェン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）（商標））に交換し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベーションし、次いで蛍光リーダー（ＳＹＮＥＲＧＹ（商標） Ｈ４ ＢｉｏＴｅｋ）上で読み取った。図３５Ａは、ＡＰＸ３３３０及びＣＢ−８３９単剤の効果を描く。図３５Ｂは、ＡＰＸ３３３０及びＣＢ−８３９の相乗的な組み合わせ効果を描く。図３５Ｃは、ＡＰＸ３３３０及びＣＢ−８３９ ＥＣ５０（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を示す。図３５Ｄは、用量組み合わせのチョウ−タラレイ指数ＣＩ）（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を示す。図３５Ｅは、１０００ｎＭ ＣＢ−８３９又は５００ｎＭ ＣＢ−８３９（５点のみ）を加えたＡＰＸ３３３０の相乗的な薬物組み合わせ（ＣａｌｃｕＳｙｎ）を描く。１０００ｎＭを加えた場合に、ＡＰＸ３３３０投薬量１００μＭ〜２５μＭで薬物組み合わせの相乗作用が認められた。５００ｎＭ ＣＢ−８３９を加えた場合に、ＡＰＸ３３３０投薬量１００μＭ〜５０μＭで相乗作用が認められた。示したデータは、３つの別個の細胞毒性アッセイの平均であり、各アッセイは培地のみ対照に対して規格化している。
実施例２３
この実施例では、ＡＰＸ３３３０及びシスプラチンの併用治療剤を、その腫瘍死滅能について、シスプラチン耐性膀胱細胞株ＢＬＣＡｂ００１において分析した。
ＢＬＣＡｂ００１（シスプラチン耐性）細胞株を、増加する濃度のＡＰＸ２０１４及びシスプラチンで、単剤として及び組み合わせで処置し、９６時間生存率アッセイでアッセイした。ＡＰＸ２０１４の濃度は、示したシスプラチン用量と組み合わせて６ｍＭ〜０．３８ｍＭの範囲である（図３６Ａ）。６ｍＭ〜３ｍＭの用量が併用効果（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）＞１．０で、相乗的であることが示された。単剤としてのシスプラチンの濃度は、２．５ｍＭ〜０．０４ｍＭの範囲である（図３６Ｂ）。
実施例２４
この実施例では、ＡＰＸ３３３０及びシスプラチンの併用治療剤を、その腫瘍死滅能について、シスプラチン耐性膀胱細胞株ＢＬＣＡｂ００２において分析した。
ＢＬＣＡｂ００２（シスプラチン感受性）細胞株を、増加する濃度のＡＰＸ２０１４及びシスプラチンで、単剤として及び組み合わせで処置し、９６時間生存率アッセイでアッセイした。ＡＰＸ２０１４の濃度は、示したシスプラチン用量と組み合わせて６ｍＭ〜０．３８ｍＭの範囲である（図３７Ａ）。６ｍＭ〜１．５ｍＭの用量が併用効果＞１．０で、相乗的であることが示された。単剤としてのシスプラチンの濃度は２．５ｍＭ〜０．０４ｍＭの範囲である（図３７Ｂ）。
実施例２５
この実施例では、ＡＰＸ２０１４及びナパブカシン（ＳＴＡＴ３阻害剤）の併用治療剤を、その腫瘍死滅能について、膀胱細胞株、Ｔ２４において分析した。
Ｔ２４膀胱癌細胞を、ＡＰＸ２０１４（２．５ｍＭ又は５．０ｍＭ）の存在下又は不存在下で、増加する濃度のナパブカシンで７２時間処置した。次いで、この細胞を固定し、メチレンブルーで染色し、相対細胞数を分光測光によって算出した。結果を図３８Ａ及び図３８Ｂに示す。
実施例２６
この実施例では、ＡＰＸ２００９及びナパブカシン（ＳＴＡＴ３阻害剤）の併用治療剤を、その腫瘍死滅能について、膀胱細胞株Ｔ２４において分析した。
Ｔ２４膀胱癌細胞を、ＡＰＸ２００９（２．５ｍＭ又は５．０ｍＭ；３．５ｍＭ又は７ｍＭ）の存在下又は不存在下で、増加する濃度のナパブカシンで７２時間処置した。次いで、この細胞を固定し、メチレンブルーで染色し、相対細胞数を分光測光によって算出した。結果を図３９Ａ及び図３９Ｂに示す。
実施例２７
この実施例では、ＡＰＸ２０１４及びナパブカシン（ＳＴＡＴ３阻害剤）の併用治療剤を、その腫瘍死滅能について、膀胱細胞株ＳＣａＢＥＲにおいて分析した。
ＳＣａＢＥＲ膀胱癌細胞を、ＡＰＸ２０１４（２．５ｍＭ又は５．０ｍＭ）の存在下又は不存在下で、増加する濃度のナパブカシンで７２時間処置した。次いで、この細胞を固定し、メチレンブルーで染色し、相対細胞数を分光測光によって算出した。結果を図４０Ａ及び図４０Ｂに示す。
実施例２８
この実施例では、ＡＰＸ２００９及びナパブカシン（ＳＴＡＴ３阻害剤）の併用治療剤を、その腫瘍死滅能について、膀胱細胞株ＳＣａＢＥＲにおいて分析した。
ＳＣａＢＥＲ膀胱癌細胞を、ＡＰＸ２００９（２．５ｍＭ又は５．０ｍＭ；３．５ｍＭ又は７ｍＭ）の存在下又は不存在下で、増加する濃度のナパブカシンで７２時間処置した。次いで、この細胞を固定し、メチレンブルーで染色し、相対細胞数を分光測光によって算出した。結果を図４１Ａ及び図４１Ｂに示す。
実施例２９
この実施例では、ＡＰＸ２００９及びＣＡ９阻害の併用治療剤を、その腫瘍死滅能について、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）において分析した。
細胞培養：この実施例で使用した低継代患者由来ＰＤＡＣ細胞株及び膵臓癌関連線維芽細胞をＡｎｉｒｂａｎ Ｍａｉｔｒａ博士（ジョンズ・ホプキンズ大学（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））から受け取り、Ｌｏｇｓｄｏｎら（２０１６ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５（１１）：２７２２−２７３２）、Ｆｉｓｈｅｌら（２０１１ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０（９）：１６９８−１７０８）、Ｓｕら（２０１１ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５０：８２−９２）、及びＺｈａｎｇら（２０１３ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５２（１７）：２９５５−２９６６）に記載されるように維持した。細胞をＳＴＲ分析（ＩＤＥＸＸ ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈによるＣｅｌｌＣｈｅｃｋ）のために提出し、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）混入について規定どおりに試験した。細胞株は、１２回以上は継代させず、その後は新鮮なストックを蘇生させた。単層実験における低酸素条件は、Ｒｕｓｋｉｎｎ Ｉｎｖｉｖｏ２ ２００低酸素ワークステーション（Ｂａｋｅｒ Ｒｕｓｋｉｎｎ；サンフォード（Ｓａｎｆｏｒｄ）、メイン州）中で、０．２％酸素で発生させた。単層培養物における細胞増殖及び生存率を、アラマーブルー（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ）アッセイを用いて測定した。三次元腫瘍スフェロイド培養物の成長を、Ｌｏｇｓｄｏｎら（２０１６ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５（１１）：２７２２−２７３２）、Ｓｅｍｐｅｒｅら（２０１１ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ ＆ Ｔｈｅｒ １２（３）：１９８−２０７）、及びＡｒｐｉｎら（２０１６ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５（５）：７９４−８０５）に記載されているように実施し、定量した。
ウエスタンブロット解析：免疫ブロットを、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；リトルトン（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ）、コロラド州）、ＣＡ９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；ダラス（Ｄａｌｌａｓ）、テキサス（Ｔｅｘａｓ））、アクチン（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ；フリーモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）、カリフォルニア州）、及びビンキュリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）；セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州）に対する抗体を使用して実施した。すべての試料を、Ｌｏｇｓｄｏｎら（２０１６ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５（１１）：２７２２−２７３２）及びＦｉｓｈｅｌら（２０１１ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０（９）：１６９８−１７０８）に記載されているように、処理し、同時並行で実施した。
ｓｉＲＮＡトランスフェクション：ＰＤＡＣ細胞を、Ｌｏｇｓｄｏｎら（２０１６ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５（１１）：２７２２−２７３２）、Ｆｉｓｈｅｌら（２０１１ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０（９）：１６９８−１７０８）、及びＡｒｐｉｎら（２０１６ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５（５）：７９４−８０５）にこれまでに記載されたとおりにｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。使用したｓｉＲＮＡは、スクランブル対照及びｓｉＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１（配列番号１〜配列番号３）、並びにＯｒｉＧｅｎｅ（ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州）Ｔｒｉｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｉＣＡ９であった。
阻害剤：小分子阻害剤を、Ｌｏｇｓｄｏｎら（２０１６ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５（１１）：２７２２−２７３２）、Ｆｉｓｈｅｌら（２０１１ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０（９）：１６９８−１７０８）、Ｓｕら（２０１１ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５０：８２−９２）、及びＺｈａｎｇら（２０１３ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５２（１７）：２９５５−２９６６）にこれまでに記載されたとおりに調製し、使用した。ＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９、及びＡＰＸ２０１４（Ａｐｅｘｉａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；インディアナポリス、インディアナ州）を、構造的には類似しているがＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達活性を阻害しない（Ｓｈａｈら、２０１７ ＮＰＪ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １；Ｋｅｌｌｅｙら、２０１７ Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎ Ｒｅｓ １２（１）：７２−７４；Ｋｅｌｌｅｙら、２０１６ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３５９（２）：３００−０３９；Ｆｉｓｈｅｌら、２０１１ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０（９）：１６９８−１７０８）陰性対照として使用したＲＮ７−５８（Ａｐｅｘｉａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）とともに使用して、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達を阻害した。ＣＡ９阻害は、ＳＬＣ−０１１１及びＦＣ１２−５３１Ａ（Ｌｏｇｓｄｏｎら（２０１６ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５（１１）：２７２２−２７３２）；Ｓｕｐｕｒａｎら、２０１５ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １０（６）：５９１−５９７；Ｃｈｅｎら、２０１７ Ａｍ Ｓｏｃ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ；Ｋｏｅｎｉｇら、２０１７ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ５３、Ｓ８８；Ｆｉｓｈｅｌら（２０１１ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０（９）：１６９８−１７０８）を用いて成し遂げた。これらの化合物のすべてを最小毒性でマウスに投与したが、進行中の研究は、それらの安全性及び効力を、単独で、及び他の薬剤と組み合わせてインビボで評価している。
ＣｈＩＰアッセイ：クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を、Ｍａｇｎａ ＣｈＩＰキット（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を使用して実施した。免疫沈降（ＩＰ）を、ＨＩＦ１α（Ｎｏｖｕｓ）に対するポリクローナル抗体又はウサギＩｇＧ対照（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を使用して実施した。ＣＡ９プロモーター中のＨＩＦ−１結合部位（ＨＢＳ）への結合を、ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））においてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用してｑＰＣＲによって測定した。ＣｈＩＰ ｑＰＣＲのために使用したプライマー配列は以下のとおりであった：ＣＡ９ ＨＢＳ−Ｆｗｄ（５’ − ＣＴＣＡＣＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＣＴＡ − ３’）（配列番号３２）及びＣＡ９ ＨＢＳ−Ｒｅｖ（５’ − ＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＣＴＡＧ − ３’）（配列番号３３）。各試料からの架橋ＤＮＡの１％を、試料にわたってｑＰＣＲシグナルを規格化するための対照（インプット）として評価した（ＩＰなし）。
ｐＨアッセイ：細胞内ｐＨを、Ｌｏｇｓｄｏｎら（２０１６ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５（１１）：２７２２−２７３２）に記載されているとおり、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＡＭ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）を用いて測定した。ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＡＭに曝露した細胞の蛍光像を、Ｌｏｇｓｄｏｎら（２０１６ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５（１１）：２７２２−２７３２）にこれまでに記載されたとおり、Ｉｎｄｉａｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ施設（インディアナポリス、インディアナ州）にある共焦点／２光子Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ−１０００ＭＰＥシステム（（オリンパスサイエンティフィックソリューションズアメリカ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ａｍｅｒｉｃａ）；ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マサチューセッツ州）を用いて記録した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ：ｍＲＮＡレベルを、Ｌｏｇｓｄｏｎら（２０１６ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５（１１）：２７２２−２７３２）、Ｆｉｓｈｅｌら（２０１１ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０（９）：１６９８−１７０８）、Ｆｉｓｃｈｅｒら（２０１５ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０（５）：３０５７−３０６８）にこれまでに記載されたとおり、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した。比較Ｃｔ定量法（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、ＲＰＬＰ０及びＢ２Ｍを基準遺伝子として用いてｍＲＮＡレベルを定量化した。ＣＡ９、ＲＰＬＰ０、及びＢ２Ｍに対するプライマーは市販されている（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））。実験を、各試料につき三重に実施した。
免疫組織化学（ＩＨＣ）：プレーティング後１２日目に三次元スフェロイド培養物を採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ハットフィールド（Ｈａｔｆｉｅｌｄ）、ペンシルベニア州）で固定し、７０％エタノールで透過処理した。固定／透過処理した三次元培養物をＨｉｓｔｏＧｅｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）中で凝固させた。ＨｉｓｔｏＧｅｌプラグをパラフィンに包埋し、Ｋｅｉｔｈ Ｃｏｎｄｏｎ博士（インディアナ大学医学部（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）；インディアナポリス、インディアナ州）の研究室によってスライドを調製した。試料を、特定の抗体を用いてインディアナ大学医学部研究免疫組織化学施設（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（インディアナポリス、インディアナ州）によって染色した。
統計解析：３群以上を用いた実験における比較は、事後の多重比較検定（適宜、Ｔｕｋｅｙ、Ｄｕｎｎｅｔｔ、又はＳｉｄａｋ）を用いて解析した。Ｌｏｇｓｄｏｎら（２０１６ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １５（１１）：２７２２−２７３２）、ＭｃＨｕｇｈ（２０１１ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１（３）：２０３−２０９）、及びＳｔｅｖｅｎｓら（２０１７ ＰｌｏＳ Ｏｎｅ １２（４）：ｅ０１７６１２４）。ｐ＜０．０５の場合に、群間の差は有意であると考えた。統計解析は、マイクロソフトエクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）及びプリズム（Ｐｒｉｓｍ）（バージョン６．０ｆ、著作権２０１４ グラフパッドソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）、ラホヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州）を用いて実施した。
結果
ＰＤＡＣ細胞におけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１−ＨＩＦ−１−ＣＡ９シグナル伝達軸（シグナル経路）
ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１及び／又はＣＡ９阻害に対する異なるＰＤＡＣ患者株の応答を特徴づけるために、小分子阻害剤ＳＬＣ−０１１１又はｓｉＲＮＡによるＣＡ９の阻害の効果を、患者由来の細胞において評価した。ＣＡ９は低酸素調節性酵素として十分に確立されているが、低酸素条件下で誘導されるＣＡ９発現のレベルは、患者株間でばらつく。それゆえ、低継代患者由来ＰＤＡＣ細胞株（１０．０５、Ｐａ０２Ｃ、及びＰａ０３Ｃ）の選択物における相対的ＣＡ９発現を、０．２％酸素への曝露の２４時間後に、正常酸素圧状態でインキュベーションした細胞と比べて決定した。低酸素曝露は、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ１９）を含めてすべての細胞株で有意にＣＡ９タンパク質レベルを誘導した（２．５〜２１．５倍）（図４２Ａ）。しかしながら、ＣＡ９は、１０．０５細胞（酸素正常状態に対して２１．５倍）において最も強く誘導され、Ｐａ０３Ｃ細胞は、最低レベルの低酸素誘導ＣＡ９タンパク質（酸素正常状態に対して２．５倍）を有していた。注目すべきことに、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１発現は、これらの細胞において、低酸素曝露によって有意な影響を受けなかった。１０．０５細胞の強いＣＡ９誘導が理由で大多数の機構的実験を１０．０５細胞において評価し、ＣＡ９が弱いＰａ０３Ｃ細胞の中で繰り返し、応答を確認し比較した。
フェーズＩ臨床試験を最近終了したＣＡ９阻害剤であるＳＬＣ−０１１１の効力を、比較のために、低酸素条件下で異なるＰＤＡＣ細胞株中で評価した。試験した患者由来のＰＤＡＣ細胞株の３つすべてが、低酸素曝露の間、１００μΜ未満のＳＬＣ−０１１１についてのＬＣ５０を有していたのに対し（図４２Ｂ）、最も感受性が高い細胞株は１０．０５であり、１０．０５は低酸素曝露後に最高レベルまでＣＡ９発現を誘導する（図４２Ａ）。実際、低酸素下でのＣＡ９タンパク質の誘導は、試験した細胞株では、低酸素下でのＳＬＣ−０１１１のＬＣ５０と逆相関し（Ｒ２＞０．９９）（図４２Ｂ）、これは、ＣＡ９誘導の増加がＰＤＡＣ細胞におけるＣＡ９阻害に対する感受性の上昇を予測しうるということを示す。
単層で成長した膵臓癌細胞と三次元腫瘍スフェロイドで成長した膵臓癌細胞とにおけるＣＡ９の誘導を比較した。１０．０５単層培養物における低酸素チャンバーを用いた０．２％低酸素への曝露後、ＣＡ９は約２１倍誘導された（図４２Ａ及び図４２Ｃ）。ＣＡＦを伴うか又は伴わない三次元腫瘍スフェロイド系を用いると、ＣＡ９発現は、これらのスフェロイド培養物が正常酸素圧状態で成長したにもかかわらず、低酸素性単層培養物に対してそれぞれ２．５倍及び６．２倍さらに増加した（図４２Ｃ）。この三次元培養物モデルの関連性に基づき、ＣＡ９及びＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の阻害の効果をこの系でさらに評価した。
ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１及びＣＡ９の発現のノックダウンを三次元スフェロイド培養物において評価し、この関連する微小環境におけるＰＤＡＣ細胞の成長及び生存がＣＡ９及びＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の発現に依存するか否かを判定した。スフェロイドを８日目に採取して、ＣＡ９及びＡＰＥ１のノックダウンが続いていることを確認した。各ｓｉＲＮＡはその標的遺伝子／酵素産物の発現を有意に低下させ、このことは、この三次元培養物の継続期間全体にわたって、これらの酵素のノックダウンが続くことを確認した。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ノックダウンも、ｓｉＣＡ９培養物で見られた程度と同程度にＣＡ９発現を減少させた（図４２Ｄ、図１Ｄ）。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１及び／又はＣＡ９の低下したレベルは、蛍光強度及び面積によって測定した三次元腫瘍スフェロイド成長を有意に約５０〜８０％（ｐ＜０．００１）遅延させた（図４２Ｅ及び図４２Ｆ）。これらの結果は、ＰＤＡＣ腫瘍成長におけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１及びＣＡ９発現の重要性を確認する。加えて、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ノックダウンは、三次元腫瘍スフェロイド成長をＣＡ９ノックダウンよりも有意に大きく遅延させ、このことは、ＰＤＡＣ腫瘍成長を減弱することについて、ＣＡ９の阻害だけでは、これらの酵素を二重標的にすることほどには効率的ではない可能性があるということを示した。
ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達の阻害は、ＨＩＦ−１媒介性ＣＡ９転写及びその後の発現を減少させた（図４２Ｄ）。これが、ＨＩＦ１αがＣＡ９プロモーターに結合することに対する直接の効果の結果であるか否かを判定するために、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを実施して、ＨＩＦ−１−ＤＮＡ相互作用を検討した。１０．０５細胞をＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達阻害剤ＡＰＸ３３３０で処置し、０．２％Ｏ２に１２時間曝露した。ＨＩＦ１αの免疫沈降（ＩＰ）は、ＣＡ９プロモーター中のＨＩＦ−１結合部位（ＨＢＳ）に結合するＨＩＦ１αの、低酸素条件下での４．３倍増加を明らかにしたが、ＣＡ９プロモーター中のＨＩＦ−１結合部位（ＨＢＳ）に結合するＨＩＦ１αは、ＡＰＸ３３３０で処置した細胞では約６０％減少した（図４２Ｇ及び図４２Ｈ）。これらのデータは、ＨＩＦ１αとＣＡ９プロモーターとの相互作用が低酸素によって誘導されること、及びこれらの低酸素誘導相互作用がＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達阻害によって減弱されたことを明らかにし、このことは、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達が低酸素条件下でＨＩＦ−１媒介性ＣＡ９転写を制御する作用機序をさらに確認させる。
ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１又はＣＡ９の阻害によるＣＡ９の遮断
標的選択性を判定するために、ＡＰＸ３３３０の類似体であるＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４、並びにＳＬＣ−０１１１の類似体であるＦＣ１２−５３１Ａを使用した。これらの類似体のすべてが、低酸素条件下でそれらの親化合物に勝る改善された細胞毒性を明確に示した（表７）。
低酸素誘導のＣＡ９ ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルを、１０．０５細胞においてＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９、ＡＰＸ２０１４、及び不活性な類似体ＲＮ７−５８を用いた処置の後に評価した。すべての３つの阻害剤によるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の阻害は、低酸素誘導のＣＡ９ ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの濃度依存的減少を生じ、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４ではＡＰＸ３３３０よりも１０倍少なく必要とされ（図４３Ａ及び図４３Ｂ）、このことは、これらの類似体がＡＰＸ３３３０よりも強力なＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達の阻害剤であることを示した。不活性な類似体（ＲＮ７−５８）は、１００μΜであっても低酸素誘導ＣＡ９発現に影響を及ぼさず、このことは、他の化合物で見られた効果にＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達活性が選択的に寄与していることをさらに確認した。
ＣＡ９タンパク質発現に対するＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックス阻害の効果も、三次元腫瘍スフェロイドにおいて測定した。１０．０５細胞を１２日間三次元培養物において成長させ、４日目及び８日目にＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４、又は不活性な類似体（ＲＮ７−５８）で処置した。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックス阻害は、三次元腫瘍培養物におけるＣＡ９の発現タンパク質を濃度依存的に有意に減少させた（図４３Ｃ）。重要なことに、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４ ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤は、スフェロイド培養物においてＣＡ９発現を減弱させるためには、ＡＰＸ３３３０と比べて１０倍少ない濃度しか必要とされず、このことは、これらの化合物の効力をさらに検証する。不活性な類似体（ＲＮ７−５８）は、ＰＤＡＣスフェロイド培養物におけるＣＡ９発現に影響を及ぼさず、このことは、ＨＩＦ１α活性に対するＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達阻害剤の効果の特異性を再び裏付ける。
ＣＡ９発現は、腫瘍細胞成長にとって重要であり、ＣＡ９は、細胞内ｐＨを安定させて、低酸素条件下で代謝変化に応答して起こる酸性化を弱めることにより機能する。ＣＡ９活性についての機能的マーカーとして、細胞内ｐＨに対するＣＡ９の効果を評価した。低酸素曝露（０．２％Ｏ２に４８時間）は、１０．０５細胞において細胞内ｐＨに有意な影響を及ぼさず（図４３Ｄ及び図４３Ｅ）、このことは、これらの細胞がｐＨに対する低酸素の効果を補うことを示す。しかしながら、ＣＡ９発現がｓｉＲＮＡによって低下するとき、結果は、ｐＨ感受性のｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＡＭ染料の蛍光の増加によって測定されるとおり、低酸素曝露細胞における細胞内ｐＨの有意な低下であった（図４３Ｄ及び図４３Ｅ）。これらのデータは、ＣＡ９がこれらの細胞においてｐＨを制御することを担うという結論を支持する。
ＡＰＸ３３３０及びＳＬＣ−０１１１は、単剤では、ＡＰＸ３３３０は５０μΜ以下、又はＳＬＣ−０１１１は１００μΜ以下の濃度で細胞内ｐＨに影響を及ぼさず、低酸素性ＰＤＡＣ細胞を酸性化するために両方の化合物の組み合わせが必要である。それゆえ、ＡＰＸ３３３０類似体、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４、を使用して、十分に強力な阻害剤が与えられればＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックス阻害だけで低酸素性ＰＤＡＣ細胞において細胞内ｐＨをシフトさせることができるか否かを判定した。８μΜ ＡＰＸ２００９又は５μΜ ＡＰＸ２０１４のいずれかを用いた処置だけで有意な蛍光（細胞生存に対して規格化した）の増加を生じ、単剤のＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達阻害による細胞内ｐＨの低下を示す（図２Ｄ〜図２Ｅ）。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害後のＣＡ９発現の減少に起因して、これらのデータは、細胞を酸性化するにはＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達阻害だけで十分であったことを示す。合わせて考えると、図４３Ｄ及び図４３Ｅのデータは、ｓｉＲＮＡ又はＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックス阻害のいずれかによるＣＡ９発現の減少が低酸素性ＰＤＡＣ細胞において細胞内酸性化を生じるということを示していた。
これらの機構的結果に従って、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達阻害剤ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４の効果を、１０．０５（図４３Ｆ）又はＰａ０３Ｃ（図４３Ｇ）腫瘍細胞を使用した三次元ＰＤＡＣ腫瘍及びＣＡＦの共培養物においてＡＰＸ３３３０と比較した。これらの類似体の各々が、この三次元腫瘍スフェロイドモデルにおいてＡＰＸ３３３０よりも４〜５０倍低いＬＣ５０を呈し（表７）、このことは、それらが、その腫瘍成長阻害効果においてＡＰＸ３３３０と比べて改善された効力を有するということを示唆する。同様に、ＣＡ９阻害剤ＳＬＣ−０１１１のより強力な類似体ＦＣ１２−５３１Ａは、この三次元腫瘍スフェロイドモデルにおいて、ＳＬＣ−０１１１よりも約１５倍低いＬＣ５０を呈し（図４３Ｈ及び図４３Ｉ、表７）、その腫瘍成長阻害効果におけるＳＬＣ−０１１１に勝る改善された効力を実証した。驚くべきことに、表７に示すように、ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４は、親化合物ＡＰＸ３３３０と比べて単剤としてはより強力であった。組み合わせ研究において、類似体ＡＰＸ２００９及びＡＰＸ２０１４は、より良好な組み合わせ効果を成し遂げるためにはるかに低い濃度で使用することができよう。
三次元培養物におけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１及びＣＡ９の二重標的化の効果
Ｈ＆Ｅ染色、ビメンチン（共培養内でＣＡＦを検出するため）、及びＭａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（マッソントリクローム）を使用して三次元スフェロイド培養物の特性解析を実施した（図４４Ａ〜図４４Ｃ）。これらのデータは、三次元共培養物において腫瘍細胞がＣＡＦよりも密に充填されていることを示し、マッソントリクローム染色は、ＣＡＦがコラーゲン等の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分を沈着させていることを示し、ＰＤＡＣ患者で見られた線維性腫瘍を表すものとしてのこのモデルの妥当性を示した。注目すべきことに、試験したすべての三次元培養物において、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１染色は主として核で起こり、培養物全体にわたって腫瘍細胞において均一であるように見えた（図４４Ｄ）。さらには、低酸素マーカーＣＡ９及びグルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ−１）は、異なる領域で陽性を示し（図４４Ｅ及び図４４Ｆ）、スフェロイド培養物内の低酸素の差異的ゾーンを示した。これらのデータは、この三次元腫瘍スフェロイドモデルにおいてＰＤＡＣ細胞を培養することは、低酸素状態を外部から誘導する必要なしにＣＡ９を発現する低酸素性細胞を生じるということを明らかにした。
ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達阻害は、第二世代阻害剤を用いたＣＡ９阻害に対する三次元ＰＤＡＣ腫瘍スフェロイドの感受性を高めた。
ＡＰＸ３３３０及びＳＬＣ−０１１１を用いた併用治療は、ＰＤＡＣ腫瘍細胞及びＣＡＦをともに含有する三次元共培養物において、共培養の１２日目に、スフェロイド共培養物中のＣＡＦに対する最小効果を伴って腫瘍細胞成長を有意に減弱した。上記化合物の経時的な成長阻害効果を特徴づけて、最適のレジメンを決定するために、培養の時間を１６日間に延ばし、各処置後の成長についてアッセイした。両方の患者由来の細胞株において、上記併用治療剤は、単独療法よりも有効であった。ＳＬＣ−０１１１も、三次元共培養物において１０μΜのＡＰＸ２００９又は０．６μΜのＡＰＸ２０１４と組み合わせたところ、これらは５０μΜのＡＰＸ３３３０と同様の結果を示した。
ＰＤＡＣ細胞におけるＣＡ９阻害及びＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害の効果をさらに判定するために、ＳＬＣ−０１１１類似体ＦＣ１２−５３１Ａを用いた。このＦＣ１２−５３１Ａは、このモデルにおいて、上記腫瘍細胞におけるＳＬＣ−０１１１と同じ傾向を示したが、同様の効果を成し遂げるためには実質的により低い濃度しか必要でなかった（３μΜ ＦＣ１２−５３１Ａ対５０μΜ ＳＬＣ−０１１１）。具体的には、３μΜ ＦＣ１２−５３１Ａ単独療法は、Ｐａ０３Ｃ共培養物において腫瘍細胞成長に有意に影響を与えたが、１０．０５共培養物では有意な影響を与えず、ＦＣ１２−５３１Ａは、１０．０５共培養物及びＰａ０３Ｃ共培養物の両方において、三次元腫瘍細胞成長に対するＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９、及びＡＰＸ２０１４の効果を有意に増強した（図４５Ａ〜図４５Ｒ）。これらのデータは、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達及びＣＡ９活性の二重標的化による増強されたＰＤＡＣ腫瘍細胞死滅を示す一方で、改善された効力を有する新規な阻害剤を推進する結果の妥当性を示し、このことは、最も強力な組み合わせ（０．６μΜ ＡＰＸ２０１４＋３μΜ ＦＣ１２−５３１Ａ、図４Ｍ〜図４Ｒ）のように、使用する各薬物のナノモル〜低マイクロモル濃度を可能にする。
これらの結果は、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達を、ＨＩＦ−１媒介性転写を経由してＣＡ９の発現及び活性へとつなぐＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１調節ノード（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｏｄｅ）の腕を明らかにする（図４６）。具体的には、本明細書中に提示した結果は、三次元ＰＤＡＣ腫瘍培養物においてＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達及びＣＡ９活性を二重標的にして、スフェロイド共培養物において腫瘍細胞の増強された死滅を生じるために、臨床化合物の新規な類似体を使用して、このシグナル伝達軸（シグナル経路）の重要性を広げる。本明細書中に提示した結果は、ＨＩＦ−１とその主要な転写標的のうちの１つのプロモーターとの、低酸素に誘導される相互作用がＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レドックスシグナル伝達阻害後に低下することを初めて示し（図４２Ｃ）、ＨＩＦ−１媒介性転写に対するＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の寄与を理解する上で鍵となる橋を提供する。

Claims (23)

  1. 脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ／酸化還元（レドックス）因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤と第２治療剤とを含む併用治療剤であって、前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤がＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のレドックス機能を阻害し、前記第２治療剤が、Ｂ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ−２）阻害剤、ＰＴＥＮ阻害剤、ＷＮＴ／β−カテニン阻害剤、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）阻害剤、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤、光線力学療法（ＰＤＴ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される併用治療剤。
  2. 前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤が、５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル １，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ−メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の併用治療剤。
  3. 前記第２治療剤が、ドキソルビシン、エンドスタチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ボルテゾミブ、メシル酸イスピネシブ、ＳＮ−３８、トポテカン、パクリタキセル、ブリオスタチン１、トラメチニブ、ＬＡＱ８２４、ビンブラスチン、ＢＥＺ２３５、パノビノスタット、メトトレキセート、テムシロリムス、ＦＫ８６６、アファチニブ、トザセルチブ、イリノテカン、ＧＳＫ２１２６４５８、ＣＰＩ−６１３、γ−セクレターゼ阻害剤、ＤＬＬ４抑制抗体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の併用治療剤。
  4. （２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ−メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）と第２治療剤とを含む併用治療剤であって、前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤が、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のレドックス機能を阻害する併用治療剤。
  5. 前記第２治療剤が炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）阻害剤である請求項１に記載の併用治療剤。
  6. 前記ＣＡ９阻害剤が、ＳＬＣ−０１１１、ＦＣ１３−５５５Ａ、ＦＣ１２−５３１Ａ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項５に記載の併用治療剤。
  7. 前記第２治療剤がシグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）阻害剤である請求項１に記載の併用治療剤。
  8. 前記ＳＴＡＴ３阻害剤がナパブカシン、ルキソリチニブ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項７に記載の併用治療剤。
  9. 前記第２治療剤が白金製剤である請求項１に記載の併用治療剤。
  10. 前記白金製剤が、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項７に記載の併用治療剤。
  11. 癌の処置のための、請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の併用治療剤の使用。
  12. 前記癌が、前立腺癌、膵臓癌、膵管腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、骨肉腫、胚細胞性腫瘍、結腸癌／結腸直腸癌、膀胱癌、頭頸部癌、胃癌／胃食道癌、神経外胚葉性腫瘍、横紋筋肉腫、膵胆管癌、成人神経膠腫、非小細胞肺癌、肝細胞癌、多発性骨髄腫、食道癌、乳癌、小児上衣腫、及び黒色腫からなる群から選択される請求項１１に記載の使用。
  13. 前記癌が結腸癌であり、前記併用治療剤が、５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル １，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤と、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ＣＰＩ−６１３、オキサリプラチン、ナパブカシン、ＣＰ−８３９及びこれらの組み合わせからなる群から選択される第２治療剤とを含む請求項１１に記載の使用。
  14. 前記癌が白血病であり、前記併用治療剤が、５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル １，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤と、レチノイン酸である第２治療剤とを含む請求項１１に記載の使用。
  15. 前記癌が悪性末梢神経鞘腫であり、前記併用治療剤が、５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル １，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤と、サバイビン阻害剤である第２治療剤とを含む請求項１１に記載の使用。
  16. 前記癌が非小細胞肺癌であり、前記併用治療剤が、５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル １，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤と、Ｂｃｌ−２阻害剤、光線力学療法及びこれらの組み合わせからなる群から選択される第２治療剤とを含む請求項１１に記載の使用。
  17. 前記癌が前立腺癌であり、前記併用治療剤が、５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル １，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤と、サバイビン阻害剤である第２治療剤とを含む請求項１１に記載の使用。
  18. 処置を必要とする被験者における網膜疾患の処置のための、請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の併用治療剤の使用。
  19. 前記網膜疾患が、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ））及び虚血性網膜症からなる群から選択される請求項１８に記載の使用。
  20. 心血管疾患、細菌性感染症、胃の炎症性障害及び神経変性疾患からなる群から選択される疾患の処置のための、請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の併用治療剤の使用。
  21. 前記疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）、脳虚血及びこれらの組み合わせからなる群から選択される神経変性疾患である請求項２０に記載の使用。
  22. 脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ／酸化還元（レドックス）因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）発現を低下させるための低分子阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）。
  23. 膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の処置のための、請求項２２に記載の低分子阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）の使用。
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