JP2020512301A - 心臓血管疾患の治療のためのハーブ・ミネラル製剤及びその調製方法 - Google Patents

Abstract

心臓血管疾患の治療のためのハーブ・ミネラル製剤及びその調製方法を本明細書に開示する。開示したハーブ・ミネラル製剤には、心臓血管疾患の治療を促進するハーブ及びミネラル成分が含まれる。心臓血管疾患には、心臓及び血管に関連するあらゆる症状が含まれる。さらに、開示した製剤は、抗酸化剤、抗ストレス剤、脂質低下剤、アテローム発生剤、血圧降下剤、アポトーシス抑制剤及び心臓保護剤としても有用であり得る。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年２月２７日に提出されたインド仮出願２０１７４１００６９５５に基づき、それに由来し、その内容を参照により本明細書に援用する。

技術分野
本明細書に開示される実施形態は、心臓血管及び関連する合併症の治療及び予防に有効なハーブ・ミネラル製剤に関する。また、そのような製剤の調製方法にも関する。

心臓血管疾患（ＣＶＤ）は、世界的に主要な死亡原因の１つであることが分かっている。それは、心臓と血管に関連する一群の疾患である。また、それは、冠動脈疾患、心臓血管疾患、高血圧性心臓疾患、末梢動脈疾患などの疾患を含んでいる。

動脈にプラークが蓄積する状態であるアテローム性動脈硬化症は、ＣＶＤの主な原因である。ＣＶＤの危険因子には、高血圧（ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、ストレス、高脂血症、糖尿病、運動不足、肥満などが含まれる。これらは、ＣＶＤを防ぐために調整できる危険因子である。老齢、性別、家族歴など、調整できない他の危険因子も存在する。

確立された危険因子を軽減することにより、ほとんどのＣＶＤを予防できる。健康的な食事の維持、アルコール消費量の制限、禁煙、砂糖消費量の削減、ストレス管理など、特定のライフスタイルの変更を実施するだけで、ＣＶＤの発症リスクを軽減するのに役立つ場合がある。しかしながら、ライフスタイルの変更では、ＣＶＤの予防に不十分であることが判明した場合、薬剤又は医療処置が必要になる場合がある。

世界的に主要な死亡原因の１つであるため、ＣＶＤを治療できる薬物を開発するための広範な研究が行われている。現代医学は、そのためのさまざまな薬を提供している。これらの薬剤による治療は、ＣＶＤの種類によって異なる。さまざまな種類の薬剤には、ＡＣＥ阻害薬、抗不整脈薬、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、ジゴキシン、利尿薬、硝酸塩などが含まれる。しかしながら、ＣＶＤの管理は生涯にわたって努力する場合があり、また、薬剤を多く使用する必要がある場合がある。多く使用する場合、逆症療法的介入はしばしば不利な又は望ましくない副作用をもたらす。

あるいは、心臓血管疾患の治療では、アーユルヴェーダの介入も知られている。多くのハーブ製剤が、さまざまなハーブの治癒特性に関する知識に基づいて開発されている。しかしながら、そのような製剤の有効性には議論の余地がある。したがって、心臓血管疾患を治療／管理する効果的な方法が必要である。

開示された実施形態の目的
本明細書に開示される実施形態の主な目的は、心臓血管疾患を治療するための組成物及び方法を提供することである。

本明細書に開示される実施形態の第２の目的は、心臓血管疾患を予防するための組成物及び方法を提供することである。

本明細書に開示される実施形態の別の目的は、ハーブ・ミネラル製剤及びその調製方法を提供することである。

本明細書の実施形態のこれらの及び他の目的は、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮すると、よりよく認識及び理解されるであろう。しかしながら、以下の説明は、好ましい実施形態及びその多数の具体的な詳細を示しているが、限定ではなく例示として与えられていることを理解されたい。本明細書の実施形態の範囲内で、その精神から逸脱することなく、多くの変更及び改変を行うことができ、本明細書の実施形態はそのようなすべての改変を含む。

本明細書に開示される実施形態は、添付図面に示されており、その全体を通して、同様の参照文字は、様々な図の対応する部分を示している。本明細書の実施形態は、図面を参照して以下の説明からよりよく理解されるであろう。

図１（ａ）は、スワルナ・マクシカ・バスマ（Ｓｗａｒｎａ Ｍａｋｓｉｋａ Ｂｈａｓｍａ）の調製のフローチャートを示す。 図１（ｂ）は、アブラカ・バスマ（Ａｂｈｒａｋａ Ｂｈａｓｍａ）の調製のフローチャートを示す。 図１（ｃ）は、ロハ・バスマ（Ｌｏｈａ Ｂｈａｓｍａ）の調製のフローチャートを示す。 図１（ｄ）は、ムクタ・スクティ・バスマ（Ｍｕｋｔａ ｓｕｋｔｉ Ｂｈａｓｍａ）の調製のフローチャートを示す。 図１（ｅ）は、プラバラ・バスマ（Ｐｒａｖａｌａ Ｂｈａｓｍａ）の調製のフローチャートを示す。

図２は、強化錠剤の調製のフローチャートを示す。

図３は、ＣＫ−ＭＢ活性に対する試験薬物の効果を示す。

図４は、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼに対する試験薬物の効果を示す。

図５は、Ｍｇ２＋ＡＴＰアーゼに対する試験薬物の効果を示す。

図６は、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼに対する試験薬物の効果を示す。

図７は、脂質過酸化物含有量に対する試験薬物の効果を示す。

図８は、スーパーオキシドジスムターゼ活性に対する試験薬物の効果を示す。

図９は、ＧＳＨ活性に対する試験薬物の効果を示す。

図１０は、ＧＰＸ活性に対する試験薬物の効果を示す。

図１１は、アポトーシスマーカーに対する試験薬物の効果を示す。

図１２は、収縮期血圧に対する試験薬物の効果を示す。

図１３は、弛緩期血圧に対する試験薬物の効果を示す。 上記は、本明細書に開示される実施形態に従う。

詳細な説明
本明細書の実施形態ならびにその様々な特徴及び有利な詳細は、添付の図面に示され、以下の説明で詳述される非限定的な実施形態を参照してより完全に説明される。周知の構成要素及び処理技術の説明は、本明細書の実施形態を不必要に不明瞭にしないように省略されている。本明細書で使用される例は、単に、本明細書の実施形態を実施できる方法の理解を容易にし、さらに当業者が本明細書の実施形態を実施できるようにすることを意図している。したがって、実施例を、本明細書の実施形態の範囲を限定するものと解釈すべきではない。

本明細書の実施形態により、治療的有用性のあるハーブ・ミネラル製剤、及び該製剤の調製方法が達成される。本明細書に開示されているハーブ・ミネラル製剤は、心臓血管疾患及び心臓血管系に関連する合併症の治療及び予防に有用である。本明細書の様々な実施形態では、心臓血管疾患には、心臓不整脈、虚血性心臓疾患、冠動脈疾患、弁欠損など、心臓及び血管に関連するあらゆる状態が含まれ得る。さらに、心臓血管系に関する合併症は、高血圧、高血糖、高脂血症などを含むＣＶＤの危険因子に関連すると一般的に知られているか、又はそのような危険因子と考えられるあらゆる症状であり得る。開示された製剤には、抗酸化剤、抗ストレス剤、脂質低下剤、抗アテローム発生（ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ）剤、血圧降下剤、アポトーシス抑制剤及び心臓保護剤としての用途もまた見出される。したがって、本明細書に開示される実施形態は、心臓血管疾患の治療／予防のための方法を達成する。心臓血管疾患のリスクを低減する方法の実施形態もまた開示される。

製剤
本明細書に開示される実施形態は、ハーブ及びミネラルを有するハーブ・ミネラル製剤を提供する。一実施形態では、ハーブ・ミネラル製剤は、ハーブ成分及びミネラル成分を含む。別の実施形態では、ハーブ・ミネラル製剤は、ハーブ成分、ミネラル成分及び適切な賦形剤を含む。

ハーブ成分
一実施形態では、ハーブ成分は、以下のハーブ、もしくはこれらの抽出物、又はこれらのハーブから抽出された活性成分を含む：テルミナリア・アルジュナ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ａｒｊｕｎａ）、シダ・ロンビフォリア（Ｓｉｄａ ｒｏｍｂｉｆｏｌｉａ）、ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）、ティノスポラ・コーディフォリア（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）、プニカ・グラナツム（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、エンベリア・リベス（Ｅｍｂｅｌｉａ ｒｉｂｅｓ）、ルビア・コルディフォリア（Ｒｕｂｉａ ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）、ナルドスタキス・ジャタマンシ（Ｎａｒｄｏｓｔａｃｈｙｓ ｊａｔａｍａｎｓｉ）、エンブリカ・オフィキナリス（Ｅｍｂｌｉｃａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、テルミナリア・チェブラ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃｈｅｂｕｌａ）、テルミナリア・ベレリカ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｂｅｌｌｅｒｉｃａ）、ピペル・ロンガム（Ｐｉｐｅｒ ｌｏｎｇｕｍ）、ピペル・ニグラム（Ｐｉｐｅｒ ｎｉｇｒｕｍ）、ジンギベル・オフィキナリス（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ボルハビア・ディフューザ（Ｂｏｅｒｈａｖｉａ ｄｉｆｆｕｓａ）、バンブー・マンナ（Ｂａｍｂｏｏ ｍａｎｎａ）、マドゥカ・インディカ（Ｍａｄｈｕｋａ ｉｎｄｉｃａ）、アザディラクタ・インディカ（Ａｚｈａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）、ピクロリザ・クロア（Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｋｕｒｒｏａ）、ホーリー・バジル（Ｈｏｌｙ ｂａｓｉｌ）、コミフォラ・ムクル（Ｃｏｍｍｉｐｈｏｒａ ｍｕｋｕｌ）、ステレオスペルマム・スアベオレンス（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｒｍｕｍ（Ｓｔｅｒｉｏｓｐｅｒｍｕｍ） ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）、プレムナ・ムクロナタ（Ｐｒｅｍｎａ ｍｕｃｒｏｎａｔａ）、グメリナ・アルボレア（Ｇｍｅｌｉｎａ ａｒｂｏｒｅａ）、エーグル・マーメロス（Ａｅｇｌｅ ｍａｒｍｅｌｏｓ）、オロキシルム・インディクム（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）、デスモディウム・ガンゲチクム（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ ｇａｎｇｅｔｉｃｕｍ）、ウラリア・ピクタ（Ｕｒａｒｉａ ｐｉｃｔａ）、ソラナム・インディクム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）及びソラナム・キサントカルプム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｘａｎｔｈｏｃａｒｐｕｍ）。

一実施形態では、ハーブ成分は、ハーブ全体を含んでもよいし、あるいは、根、果実、茎、葉、根茎などのハーブの特定の部分を含んでもよい。一実施形態では、ハーブ成分は、以下のもの又はそれらの抽出物を含む：テルミナリア・アルジュナの茎皮；シダ・ロンビフォリア、ウィタニア・ソムニフェラ、ルビア・コルディフォリア、ナルドスタキス・ジャタマンシ、ボルハビア・ディフューザ、ピクロリザ・クロア、ステレオスペルマム・スアベオレンス、プレムナ・ムクロナタ、グメリナ・アルボレア、エーグル・マーメロス、オロキシルム・インディクム、ソラナム・インディクムの根；エンベリア・リベス、エンブリカ・オフィキナリス、テルミナリア・チェブラ、テルミナリア・ベレリカ、ピペル・ロンガム、ピペル・ニグラム、トリビュラス・テレストリス（Ｔｒｉｂｕｌｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の果実；アザディラクタ・インディカの皮；ソラナム・キサントカルプム、ウラリア・ピクタ、デスモディウム・ガンゲチクムの植物；ティノスポラ・コーディフォリアの茎；プニカ・グラナツムの果実果皮；ジンギベル・オフィキナリスの根茎；バンブー・マンナの滲出物；マドゥカ・インディカの花；ホーリー・バジルの葉及びコミフォラ・ムクルのゴム樹脂。しかしながら、ハーブ成分に、ハーブ・ミネラル製剤の意図される機能を特に妨げることなく、葉、花などのハーブの他の部分が含まれることもまた特許請求の範囲内である。

本明細書に開示されるハーブ（全体又は一部）は、当分野で一般的に知られている任意の形態で製剤に含まれ得る。例えば、ハーブは、抽出物を得るために処理され、乾燥、粉末化、ペレット化、濃縮などされ得る。一実施形態では、ハーブは乾燥及び粉末化され、製剤にさらに組み込まれる。

一実施形態では、ハーブ成分は、８〜１２重量％の範囲の量のテルミナリア・アルジュナ、２〜６重量％の範囲の量のシダ・ロンビフォリア、２〜６重量％の範囲の量のウィタニア・ソムニフェラ、２〜６重量％の範囲の量のティノスポラ・コーディフォリア、２〜６重量％の範囲の量のプニカ・グラナツム、２〜６重量％の範囲の量のエンブリカ・オフィキナリス及び２〜６重量％の範囲の量のコミフォラ・ムクルを含む。さらに、別の実施形態では、ハーブ成分は、以下のもののうち少なくとも１種を、好ましくは、４重量％以下（≦４重量％）の量で含む：エンベリア・リベス、ルビア・コルディフォリア、ナルドスタキス・ジャタマンシ、テルミナリア・チェブラ、テルミナリア・ベレリカ、ピペル・ロンガム、ピペル・ニグラム、ジンギベル・オフィキナリス、ボルハビア・ディフューザ、バンブー・マンナ、マドゥカ・インディカ、アザディラクタ・インディカ、ピクロリザ・クロア、ホーリー・バジル、ステレオスペルマム・スアベオレンス、プレムナ・ムクロナタ、グメリナ・アルボレア、エーグル・マーメロス、オロキシルム・インディクム、デスモディウム・ガンゲチクム、ウラリア・ピクタ、ソラナム・インディクム、ソラナム・キサントカルプム及びトリビュラス・テレストリス。

ミネラル成分
一実施形態では、ミネラル成分は、スワルナ・マクシカ・バスマ（Ｓｗａｒｎａ Ｍａｋｓｉｋａ ｂｌａｓｍａ）、アブラカ・バスマ（Ａｂｈｒａｋａ ｂｈａｓｍａ）、ロハ・バスマ（Ｌｏｈａ ｂｈａｓｍａ）、ムクタスクティ・バスマ（Ｍｕｋｔａｓｕｋｔｉ ｂｈａｓｍａ）、及びプラバラ・バスマ（Ｐｒａｖａｌａ ｂｈａｓｍａ）などのバスマ又はか焼（ｃａｌｃｉｎｅｄ）調製物を含む。あるいは、ミネラル成分は、鉄、雲母、黄銅鉱及びサンゴ（ｃｏｒａｌ）のうち少なくとも１種からなる群から選択され得る。開示される実施形態では、バスマは、ハーブ成分と共に、心臓血管疾患及び関連する合併症の治療に有用な生物学的に利用可能なハーブ・ミネラル複合体を形成する。別の実施形態では、ミネラル成分はシラジット（Ｓｈｉｌａｊｉｔ）をさらに含む。しかしながら、ハーブ・ミネラル製剤は、ハーブ・ミネラル製剤の意図される機能を特に妨げることなく、代替物として又は追加的に、他の同様のか焼調製物又はミネラルを含むこともまた本明細書で提供される特許請求の範囲内にある。

一実施形態では、ミネラル成分は、１〜４重量％の範囲のシラジットを含む。別の実施形態では、ミネラル成分は、２重量％以下（≦２重量％）の量のムクタスクティ・バスマ、２重量％以下（≦２重量％）の量のロハ・バスマ、３重量％以下（≦３重量％）の量のアブラカ・バスマ、２重量％以下（≦２重量％）の量のスワルナマクシカ・バスマ（Ｓｗａｒｎａｍａｋｓｉｋａ ｂｈａｓｍａ）及び２重量％以下（≦２重量％）の量のプラバラ・バスマを含む。

本明細書の様々な実施形態では、開示される製剤は、適切な賦形剤をさらに含み得る。適切な賦形剤のリストには、当技術分野で一般的に知られている溶媒、結合剤、潤滑剤、ハーブ担体、油及び塩が含まれる。一実施形態では、賦形剤はアカシアゴムを含む。

さらに、開示される製剤の様々な実施形態に含まれ得るハーブ成分及びミネラル成分の量は、０〜１２重量％の範囲であり得る。一実施形態では、製剤は、テルミナリア・アルジュナ（８〜１２重量％）、シダ・ロンビフォリア（２〜６重量％）、ウィタニア・ソムニフェラ（２〜６重量％）、ティノスポラ・コーディフォリア（２〜６重量％）、プニカ・グラナツム（２〜６重量％）、エンブリカ・オフィキナリス（２〜６重量％）及びコミフォラ・ムクル（２〜６重量％）、シラジット（１〜４重量％）、ムクタスクティ・バスマ（Ｍｕｋｔａｓｕｋｔｉ ｂｈａｓｍａ）（≦２重量％）、ロハ・バスマ（Ｌｏｈａ ｂｈａｓｍａ）（≦２重量％）、アブラカ・バスマ（Ａｂｈｒａｋａ ｂｈａｓｍａ）（≦３重量％）、スワルナマクシカ・バスマ（Ｓｗａｒｎａｍａｋｓｉｋａ ｂｈａｓｍａ）（≦２重量％）及びプラバラ・バスマ（Ｐｒａｖａｌａ ｂｈａｓｍａ）（≦２重量％）を含む。

別の実施形態では、製剤は、以下のもののうち少なくとも１種を、好ましくは、４重量％以下（≦４重量％）の量でさらに含む：エンベリア・リベス、ルビア・コルディフォリア、ナルドスタキス・ジャタマンシ、テルミナリア・チェブラ、テルミナリア・ベレリカ、ピペル・ロンガム、ピペル・ニグラム、ジンギベル・オフィキナリス、ボルハビア・ディフューザ、バンブー・マンナ、マドゥカ・インディカ、アザディラクタ・インディカ、ピクロリザ・クロア、ホーリー・バジル、ステレオスペルマム・スアベオレンス、プレムナ・ムクロナタ、グメリナ・アルボレア、エーグル・マーメロス、オロキシルム・インディクム、デスモディウム・ガンゲチクム、ウラリア・ピクタ、ソラナム・インディクム、ソラナム・キサントカルプム及びトリビュラス・テレストリス。

さらに、アカシアゴムの量は、賦形剤としての活性を発揮するのに適した任意の量であり得る。一実施形態では、製剤は、製剤５００ｍｇ当たり０〜５０ｍｇの範囲、好ましくは１０重量％のアカシアゴムを含み得る。

しかしながら、成分の量がわずかに変動しても、ハーブ・ミネラル製剤の意図される機能を特に妨げることなく、実施できることは明らかである。

本明細書に開示されるハーブ・ミネラル製剤は、経口投与に適するように様々な剤形に製剤化することができる。ハーブ・ミネラル製剤は、粉末、錠剤、ペレット、ロゼンジ、顆粒、カプセル、溶液、エマルジョン、懸濁液の形態で、又は使用に適した他の任意の形態であり得る。一実施形態では、ハーブ・ミネラル製剤は、経口投与に適した粉末の形態で製剤化される。別の実施形態では、ハーブ・ミネラル製剤は、錠剤、好ましくは５００ｍｇの錠剤の形態で製剤化される。例えば：表１は、５００ｍｇの錠剤中の各成分の量を示している。

本明細書では、ＣＶＤ及び関連する合併症を治療／予防するための錠剤をさらに開示する。一実施形態では、錠剤は、表１に示すように、ハーブ成分、ミネラル成分、及び賦形剤を有する５００ｍｇの錠剤である。

開示される錠剤形態のハーブ・ミネラル製剤（「薬物」又は「試験薬物」とも呼ばれる）の実施形態は、当分野で一般的に知られている方法によって、例えば、物理化学的に、植物成分について分析された。分析及び得られた結果については、例示のみを目的として以下に実施例として含まれており、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するように解釈すべきではない。特許請求の範囲から逸脱することなく、材料及び方法の両方に対して多くの改変を実施できることは、当業者には明らかであろう。

例１：
物理化学的調査：灰分、錠剤硬度、崩壊時間、アルコール可溶性抽出値及びクロロホルム可溶性抽出値のような物理化学的調査は、アーユルヴェーダ（Ａｙｕｒｖｅｄａ）のインド薬局方（Ｉｎｄｉａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）に与えられたパラメーターに従って分析された。錠剤の崩壊時間は、錠剤崩壊機（Ｉ．Ｐ．Ｓｔｄ．Ｒｏｔｅｋ）を使用して確認し、錠剤の硬度は錠剤硬度試験機（Ｓｅｃｏｒ．Ｉｎｄｉａ）を使用して調べた。各実験を３回繰り返した。表２は、該物理化学分析の結果を示している。

例２：
植物成分試験：グリコシド、ステロイド、サポニン、タンパク質、タンニンなどの様々な植物成分をスクリーニングするために試験を行った。

表３は、植物成分について行われた定性分析の結果を示している。この試験では、疾患を治すことができる薬物を作ることができる、アルカロイド、ステロイド、グリコシドなどの存在が示された。

方法
本明細書では、ハーブ・ミネラル製剤を調製する方法の実施形態を開示する。一実施形態では、該方法は、以下の工程を含む：
グラインダーでバスマ及びシラジットを粉砕する工程；
微粉末化ハーブを前記グラインダーに添加する工程；及び
粉砕を継続しながら、粉砕煎剤（ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ）を添加して、粉砕塊を得る工程。

バスマには、ムクタスクティ・バスマ、ロハ・バスマ、アブラカ・バスマ、スワルナマクシカ（Ｓｗａｒｎａｍａｋｓｉｋａ）・バスマ及びプラバラ・バスマのうちの少なくとも１種が含まれる。バスマとシラジットとの混合物は、半固体形態であり得る。一実施形態では、粉砕は、約３時間の持続期間、実施し得る。

さらに、微粉末化ハーブには、微粉末化した以下のものが含まれる：テルミナリア・アルジュナの茎皮、シダ・ロンビフォリアの根、ウィタニア・ソムニフェラの根、ルビア・コルディフォリアの根、ナルドスタキス・ジャタマンシの根、ボルハビア・ディフューザの根、ピクロリザ・クロアの根、ステレオスペルマム・スアベオレンスの根、プレムナ・ムクロナタの根、グメリナ・アルボレア、エーグル・マーメロスの根、オロキシルム・インディクムの根、ソラナム・インディクムの根、エンベリア・リベスの果実、エンブリカ・オフィキナリスの果実、テルミナリア・チェブラの果実、テルミナリア・ベレリカの果実、ピペル・ロンガムの果実、ピペル・ニグラムの果実、トリビュラス・テレストリスの果実、アザディラクタ・インディカの皮、ソラナム・キサントカルプムの植物、ウラリア・ピクタの植物、デスモディウム・ガンゲチクムの植物、ティノスポラ・コーディフォリアの茎、プニカ・グラナツムの果実果皮、ジンギベル・オフィキナリスの根茎、バンブー・マンナの滲出液、マドゥカ・インディカの花、ホーリー・バジルの葉及びコミフォラ・ムクルのゴム樹脂。

粉砕煎剤は、選択したハーブ（粉砕ハーブとも呼ばれる）の煎剤である。一実施形態では、粉砕煎剤は、以下のものからなる群から選択される１種又はそれ以上の粉砕ハーブの煎剤である：テルミナリア・アルジュナ、アスパラガス・ラセモサス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、アサフェティダ（Ａｓａｆｅｔｉｄａ）、クミン・シミナム（Ｃｕｍｉｎｕｍ ｃｙｍｉｎｕｍ）、プルンバゴ・ロゼア（Ｐｌｕｍｂａｇｏ ｒｏｓｅａ）、バリオスペルマム・モンタナム（Ｂａｌｉｏｓｐｅｒｍｕｍ ｍｏｎｔａｎｕｍ）、オシマム・サンクタム（Ｏｃｉｍｕｍ ｓａｎｃｔｕｍ）、アロエベラ（Ａｌｏｅｖｅｒａ）、プランタゴ・オバタ（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｏｖａｔａ）、ステレオスペルマム・スアベオレンス、プレムナ・ムクロナタ、グメリナ・アルボレア、エーグル・マーメロス、オロキシルム・インディクム、デスモディウム・ガンゲチクム、ウラリア・ピクタ、ソラナム・インディクム、ソラナム・キサントカルプム及びトリビュラス・テレストリス。

煎剤は、当分野で一般的に知られている任意の煎じ方によって得ることができる。一実施形態では、粉砕煎剤の調製方法は以下の工程を含む：
粉砕ハーブを浸漬する工程、例えば、粉末化した以下のものを浸漬する工程；テルミナリア・アルジュナの乾燥皮、アスパラガス・ラセモサスの生根、アサフェティダの樹脂、クミン・シミナムの乾燥果実、プルンバゴ・ロゼアの乾燥根、バリオスペルマム・モンタナムの乾燥根、オシマム・サンクタムの乾燥葉、アロエベラの生葉、プランタゴ・オバタの乾燥種、ステレオスペルマム・スアベオレンスの乾燥根、プレムナ・ムクロナタの乾燥根、グメリナ・アルボレアの乾燥根、エーグル・マーメロスの乾燥根、オロキシルム・インディクムの乾燥根、デスモディウム・ガンゲチクムの乾燥植物、ウラリア・ピクタの乾燥植物、ソラナム・インディクムの乾燥根、ソラナム・キサントカルプムの乾燥植物及びトリビュラス・テレストリスの乾燥果実、ならびに
浸漬したハーブの混合物を濃縮する工程。

一実施形態では、浸漬は、粉砕ハーブを１６部の水に一晩、浸漬することにより実施し得る。さらなる実施形態では、濃縮は、高温にて、好ましくは、約８０℃〜８５℃にて、残りの液体が１／８になるまで沸騰させることにより実施し得る。濃度は、Ｂｒｉｘメーターを使用して確認し得る。

さらに、粉砕煎剤を添加した後、粉砕を継続する。一実施形態では、粉砕を、約７２時間、好ましくは１２０ｒｐｍで継続して、粉砕塊を得る。一実施形態では、調製方法は、粉砕塊に賦形剤を添加する工程をさらに含んでもよく、ここでは、粉砕を３時間、継続しながら、粉砕煎剤に溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）ことによって、アカシアゴムを粉砕塊に添加して、半固体の塊を得ることができる。調製方法は、５０℃〜６０℃で、好ましくは熱風オーブン内にて乾燥する工程；湿式造粒する工程；及びパンチングして５００ｍｇの錠剤を得る工程をさらに含み得る。図２は、強化錠剤を調製するためのフローチャートを示す。表４は、粉砕に必要なハーブ（粉砕ハーブ）の実施形態を示す。

開示されるハーブ・ミネラル製剤の様々な実施形態で使用されるバスマは、当分野で一般的に知られている方法によって調製することができる。バスマは、スワルナマクシカ（Ｓｗａｒｎａｍａｋｓｈｉｋａ）、雲母、鉄、真珠貝（ｐｅａｒｌ ｏｙｓｔｅｒ）などの真正標準ミネラルを出発材料として選択すること；熱風オーブンで乾燥すること；粉砕、クエンチング、沸騰などによりミネラルを精製すること；ハーブ煎剤と粉砕すること；ディスクに調製すること；ディスクを乾燥すること；シャラバサム・プータ（Ｓｈａｒａｖａｓａｍ ｐｕｔａ）を調製すること；シャラバサム・プータをガジャ・プータ（Ｇａｊａ ｐｕｔａ）に供すること；及び冷却後にディスクを粉末化することによって調製することができる。当分野で一般的に知られているように、ディスクを粉末化した後、粉末に、再びハーブ煎剤との粉砕を数多く繰り返し、続いてディスクに調製し；ディスクを乾燥し；シャラヴァサム・プータを調製し；シャラヴァサム・プータをガジャ・プータに供し；そして、バスマが得られるまで粉末化する。繰り返しの回数は、０〜３０回の間で変化させることができる。一実施形態では、方法は、バスマが得られるまで、３０回も繰り返される。

バスマの調製に使用される出発材料には、当分野で一般的に使用される標準ミネラルが含まれ得る。一実施形態では、スワルナ・マクシカ・バスマ（Ｓｗａｒｎａ Ｍａｋｓｈｉｋａ Ｂｈａｓｍａ）の調製物は、出発材料としてスワルナ・マクシカ（ｓｗａｒｎａ ｍａｋｓｈｉｋａ）を含む。図１（ａ）は、スワルナ・マクシカ（ｓｗａｒｎａ ｍａｋｓｈｉｋａ）を出発材料として使用して、スワルナ・マクシカ・バスマ（Ｓｗａｒｎａ Ｍａｋｓｈｉｋａ Ｂｈａｓｍａ）を調製するためのフローチャートを示す。

別の実施形態では、アブラカ・バスマ（Ａｂｈｒａｋａ ｂｈａｓｍａ）の調製物は、出発材料として雲母を含む。図１（ｂ）は、出発材料として雲母を使用して、アブラカ・バスマ（Ａｂｈｒａｋａ Ｂｈａｓｍａ）を調製するためのフローチャートを示す。一実施形態では、ロハ・バスマ（Ｌｏｈａ Ｂｈａｓｍａ）の調製物は、出発材料として鋼鉄を含む。図１（ｃ）は、出発材料として鋼鉄を使用して、ロハ・バスマを調製するためのフローチャートを示す。さらに、一実施形態では、ムクタスクティ・バスマ（Ｍｕｋｔａｓｕｋｔｉ Ｂｈａｓｍａ）の調製物は、出発材料として真珠貝を含む。図１（ｄ）は、出発材料として真珠貝の混合物を使用して、ムクタスクティ・バスマ（Ｍｕｋｔａｓｕｋｔｉ Ｂｈａｓｍａ）を調製するためのフローチャートを示す。一実施形態では、プラバラ・バスマ（Ｐｒａｖａｌａ Ｂｈａｓｍａ）の調製物は、出発材料としてサンゴを含む。図１（ｅ）は、出発材料としてサンゴを使用して、プラバラ・バスマを調製するためのフローチャートを示す。

一実施形態では、ミネラルの精製は、ミネラルを岩塩及びレモン汁と混合し、部分的に酸化されて赤みがかった粉末になるまで強熱することを含み、それは、スワルナ・マクシカ・バスマ（Ｓｗａｒｎａ ｍａｋｓｈｉｋａ Ｂｈａｓｍａ）の調製にさらに使用される。別の実施形態では、ミネラルの精製は、牛乳におけるミネラルのクエンチングを含み、それは、アブラカ・バスマの調製にさらに使用される。

さらに別の実施形態では、ミネラルの精製は、トリファラ（Ｔｒｉｐｈａｌａ）煎剤におけるミネラルのクエンチングを含み、これは、ロハ・バスマの調製にさらに使用される。さらに別の実施形態では、ミネラルの精製は、カンジカ（Ｋａｎｊｉｋａ）（酸（ｓｏｕｒ）を入れた粥（ｇｒｕｅｌ））におけるミネラルのクエンチングを含み、これは、ムクタ・スクティ・バスマ（Ｍｕｋｔａ ｓｕｋｔｉ Ｂｈａｓｍａ）の調製にさらに使用される。

さらに、一実施形態では、ミネラルの精製は、ミネラルをバリラ（Ｂａｒｉｌｌａ）のアルカリ性溶液中で沸騰させることを含み、それは、プラバラ・バスマ（Ｐｒａｖａｌａ ｂｈａｓｍａ）の調製にさらに使用される。

使用されるハーブ煎剤は、バスマの調製にて粉砕のために一般的に使用される任意のハーブ煎剤であり得る。一実施形態では、ハーブ煎剤は、ニンブ・スワラサ（Ｎｉｍｂｕ Ｓｗａｒａｓａ）（レモン汁）及びクラサ・クワサ（Ｋｕｌａｔｈａ Ｋｗａｔｈａ）（ドリコス・ビフロルス（Ｄｏｌｏｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ）の煎剤）のうちの少なくとも１種を含み、それは、スワルナ・マクシカ・バスマ（Ｓｗａｒｎａ Ｍａｋｓｈｉｋａ ｂｈａｓｍａ）の調製に有用である。別の実施形態では、ハーブ煎剤は、以下のもののうち少なくとも１種を含み、それは、Ａｂｈｒａｋａ Ｂｈａｓｍａの調製に有用である：アルカ・クシーラ（Ａｒｋａ Ｋｓｈｅｅｒａ）（カロトロピス・プロケラ（ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ（ｃａｌｏｔｒｏｐｅｓ） ｐｒｏｃｅｒａ）のラテックス）、スヌーヒ・クシーラ（Ｓｎｕｈｉ Ｋｓｈｅｅｒａ）（ユーフォルビア・キリン角（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｎｅｒｉｉｆｏｌｉａ）のラテックス）、ヴァータ・クシーラ（Ｖａｔａ Ｋｓｈｅｅｒａ）（ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）のラテックス）、カカマチ・ラサ（Ｋａｋａｍａｃｈｉ Ｒａｓａ）（ヤマホウズキ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）の植物全体の生汁）、ゴクシュラ・クワサ（Ｇｏｋｓｈｕｒａ Ｋｗａｔｈａ）（トリビュラス・テレストリスの果実の煎剤）、アパマルガ・ラサ（Ａｐａｍａｒｇａ Ｒａｓａ）（ケイノコヅチ（Ａｃｈｙｒａｎｔｈｕｓ ａｓｐｅｒａ）の植物の汁）、ヴァータ・プラロア・スワラサ（Ｖａｔａ Ｐｒａｒｏｈａ Ｓｗａｒａｓａ）（ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）の気根の汁）、ゴムトラ（Ｇｏｍｕｔｒａ）（牛尿）、トゥルシー・スワラサ（Ｔｕｌａｓｉ Ｓｗａｒａｓａ）（カミメボウキ（Ｏｃｉｍｕｍ ｓａｎｃｔｕｍ）の葉の生汁）、カダリ・シパ・ジャラ（Ｋａｄａｌｉ Ｓｈｉｐｈａ Ｊａｌａ）（オオバコ（ｐｌａｎｔａｉｎ）の根茎の汁）、エランダ・パトラ・ラサ（Ｅｒａｎｄａ ｐａｔｒａ ｒａｓａ）（トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の葉の汁）、及びグダ（Ｇｕｄａ）（ヤシ糖（Ｊａｇｇｅｒｙ））。一実施形態では、ハーブ煎剤は、トリファラ・カシャヤ（Ｔｒｉｐｈａｌａ Ｋａｓｈａｙａ）（テルミナリア・チェブラ、テルミナリア・ベレリカ及びエンブリカ・オフィキナリスの果実の煎剤）を含み、それは、ロハ・バスマの調製に有用である。一実施形態では、ハーブ煎剤は、アロエベラ（Ａｌｏｅ Ｖｅｒａ）汁を含み、それは、ムクタスクティ・バスマ（Ｍｕｋｔａｓｕｋｔｉ Ｂｈａｓｍａ）の調製に有用である。別の実施形態では、ハーブ煎剤は、アロエ・ベラ（葉の生汁）、セスバニア・セバン（Ｓｅｓｂａｎｉａ ｓｅｂａｎ）（葉の生汁）、アスパラガス・ラセモサス（根の生汁）及び牛乳のうち少なくとも１種を含み、それは、プラバラ・バスマの調製に有用である。

処理
本明細書では、心臓血管疾患を治療／予防する方法の実施形態を開示する。また、ＣＶＤのリスクを低減する方法の実施形態も開示する。

一実施形態では、該方法は、ハーブ成分、ミネラル成分及び適切な賦形剤を有する組成物を患者に投与することを含み、
ハーブ成分は、テルミナリア・アルジュナ（８〜１２重量％）、シダ・ロンビフォリア（２〜６重量％）、ウィタニア・ソムニフェラ（２〜６重量％）、ティノスポラ・コーディフォリア（２〜６重量％）、プニカ・グラナツム（２〜６重量％）、エンブリカ・オフィキナリス（２〜６重量％）、コミフォラ・ムクル（２〜６重量％）のハーブならびにテルミナリア・アルジュナ、シダ・ロンビフォリア、ウィタニア・ソムニフェラ、ティノスポラ・コーディフォリア、プニカ・グラナツム、エンベリア・リベス、ルビア・コルディフォリア、ナルドスタキス・ジャタマンシ、エンブリカ・オフィキナリス、テルミナリア・チェブラ、テルミナリア・ベレリカ、ピペル・ロンガム、ピペル・ニグラム、ジンギベル・オフィキナリス、ボルハビア・ディフューザ、バンブー・マンナ、マドゥカ・インディカ、アザディラクタ・インディカ、ピクロリザ・クロア、ホーリー・バジル、コミフォラ・ムクル、ステレオスペルマム・スアベオレンス、プレムナ・ムクロナタ、グメリナ・アルボレア、エーグル・マーメロス、オロキシルム・インディクム、デスモディウム・ガンゲチクム、ウラリア・ピクタ、ソラナム・インディクム及びソラナム・キサントカルプムからなる群から選択される少なくとも１種のハーブを含み；そして
ミネラル成分は、シラジット（１〜４重量％）、ならびにムクタスクティ・バスマ（Ｍｕｋｔａｓｕｋｔｉ ｂｈａｓｍａ）（≦２重量％）、ロハ・バスマ（Ｌｏｈａ ｂｈａｓｍａ）（≦２重量％）、アブラカ・バスマ（Ａｂｈｒａｋａ ｂｈａｓｍａ）（≦３重量％）、スワルナマクシカ・バスマ（Ｓｗａｒｎａｍａｋｓｉｋａ ｂｈａｓｍａ）（≦２重量％）及びプラバラ・バスマ（Ｐｒａｖａｌａ ｂｈａｓｍａ）（≦２重量％）のうち少なくとも１種を含む。

一実施形態では、患者は、心臓血管疾患を有する／これらを有する疑いのある人を含む、そのような治療を必要とする任意の個人であり得る。さらに、患者は、心臓及び血管に関連する合併症を有する／これらを有する疑いのある任意の個人であり得る。一実施形態では、心臓血管疾患には、心不整脈（ｃａｒｄｉａｃ ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ）、虚血性心臓疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、冠動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、弁欠損（ｖａｌｖｅ ｄｅｆｅｃｔｓ）、僧帽弁逸脱（ｍｉｔｒａｌ ｖａｌｖｅ ｐｒｏｌａｐｓｅ）などが含まれる。さらに、患者は、心臓血管疾患の傾向がある又はこれのリスクがある任意の個人、例えば、高血圧、肥満、高血糖などを有する個人であり得る。

一実施形態では、ＣＶＤを治療／予防する方法は、開示された製剤を患者に投与することを含み、開示された製剤は、抗酸化剤、抗ストレス剤、脂質低下剤、抗アテローム形成剤（ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔ）、血圧降下剤、アポトーシス抑制剤及び心臓保護剤のうち少なくとも１種として作用する。

開示された治療方法は、治療の主要なラインとして、又は他のＣＶＤ治療方法の補助として使用され得る。一実施形態では、この方法は、ＣＶＤを有する各個人の健康状態の改善に役立ち得る。

試験薬物の投与量及び治療計画は、患者に応じて異なり得る。開示された製剤は、急性経口毒性試験、及び挙動と神経系に対するそれの影響を確認する試験に供した。この試験により、最大可能用量である６０００ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量でさえも、試験薬物に毒性がないことが証明された。また、挙動や神経系に有害な影響を及ぼさないこともわかった。

実施例により以下に記載されるように、開示された製剤（試験薬物又は試験製品とも呼ばれる）は、前臨床試験及び臨床試験により心臓保護活性の有効性についてさらに評価された。本明細書に開示される製剤の実施形態は、例示のみを目的として以下の実施例を参照することによりさらに説明されており、本明細書の実施形態の範囲を限定するものと解釈すべきではない。特許請求の範囲から逸脱することなく、材料及び方法の両方に対して多くの改変を実施し得ることは、当業者には明らかであろう。

例３：前臨床試験
この試験の目的は、イソプロテレノール（ＩＳＰ）が誘導する心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）の実験モデルに対する試験製品の心臓保護活性を分析することであった。Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ及びＭｇ２＋ＡＴＰアーゼのような膜結合酵素に対する試験薬物の効果を調査した。ＩＳＰが誘導する心筋梗塞におけるアポトーシス及びプレアポトーシスマーカー遺伝子発現に対する試験薬物の作用を分析した。また、ＣＫ−ＭＢ活性及び酸化ストレスマーカーに対する試験薬物の効果も評価した。

実験の詳細：
動物：試験用に、体重１５０〜２００ｇのオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット３５匹を選択した。動物を、周囲温度２３±２℃、及び相対湿度４０〜６５％の換気の良い部屋で、１２時間明／１２時間暗サイクルの人工光周期で個々のポリカーボナートケージに収容した。標準的なげっ歯動物用ペレット飼料（Ｎｕｔｒｉｌａｂ Ｒｏｄｅｎｔ、Ｔｅｔｒａｇｏｎ Ｃｈｅｍｉｅ、インド）と精製水（ＲＩＯＳ、ＵＳＡ）を不断給餌により与えた。実験動物は、実験前に実験室条件に７日間順応させた。試験プロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＥＣ）によって承認された。

実験グループ及び設計：ラットを、体重について無作為に５つのグループに分けた。ＩＳＰ（１２０ｍｇ／ｋｇ）をラットに１９日目と２１日目に皮下注射して、実験的心筋梗塞を誘導した。試験薬物は、試験全体を通じて経口投与した。
グループＩ（正常対照）：０．５％ＣＭＣ
グループＩＩ（陽性対照）：０．５％ＣＭＣ＋ＩＳＰ（１２０ｍｇ／ｋｇ）
グループＩＩＩ（標準）：カルベジロール（２ｍｇ／ｋｇ／日、ｐ．ｏ）＋ＩＳＰ（１２０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）
グループＩＶ（低用量）：試験薬物（５０ｍｇ／ｋｇ／日、ｐ．ｏ）＋ＩＳＰ（１２０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）
グループＶ（高用量）：試験薬物（１００ｍｇ／ｋｇ／日、ｐ．ｏ）＋ＩＳＰ（１２０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）

体重の変化を毎週記録した。実験の終わりに、血液を採取し、生化学的調査のために血漿を分離した。動物を安楽死させ、解剖して臓器（心臓、腎臓、副腎）を取り出し、重量を計測した。心臓ホモジェネートをさらなる分析に使用し、以下の様々な例に示すように、ＬＶを、アポトーシスマーカー遺伝子発現の分析のために分離した。

生化学的パラメーター
例３（ａ）：ＣＫ−ＭＢ（クレアチニンキナーゼ−ＭＢ）
ＣＫ−ＭＢ活性は、半自動生化学分析装置を使用してキット法（Ｓｐｉｎｒｅａｃｔ、スペイン）により測定した。

ＣＫ−ＭＢ活性に対する試験薬物の影響：図３は、ＣＫ−ＭＢ活性を示す。ＩＳＰで誘導されたラットは、正常なラットと比較して、ＣＫ−ＭＢ活性の有意な上昇（Ｐ＜０．０１）を示したが、試験薬物による前処理によりその活性は低下した（Ｐ＜０．０１）。

ＩＳＰ誘導ラットの血清マーカー酵素ＣＫ−ＭＢは、心筋傷害の重症度を評価するための指標として役立つ。心筋の湿潤重量の増加に伴って、この活性が増加し、アポトーシス経路が開始されたことを確認する。薬物により得られる心臓保護の程度は、ＣＫ−ＭＢ活性の有意な低下に関連している。したがって、試験薬物での前処理により、著しく高い心臓保護効果が得られ、心筋膜の完全性が維持される。

例３（ｂ）：Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ
試薬
１． トリスＨＣｌ（１８４ｍＭ）ｐＨ−７．５：蒸留水５０ｍｌ中１．４４９ｇ
２． ＫＣｌ（５０ｍＭ）：蒸留水１０ｍｌ中３７．２７５ｍｇ
３． ＥＤＴＡナトリウム（１ｍＭ）：蒸留水１０ｍｌ中４ｍｇ
４． ＮａＣｌ（６００ｍＭ）：蒸留水１０ｍｌ中３５０．６４ｍｇ
５． １０％ＴＣＡ：蒸留水１００ｍｌ中１０ｇ
６． １５％メタ重硫酸ナトリウム：蒸留水５０ｍｌ中７．５ｇ
７． ２０％硫酸ナトリウム：蒸留水１０ｍｌ中２ｇ
８． ５Ｎ Ｈ２ＳＯ４：蒸留水１００ｍｌ中Ｈ２ＳＯ４、１３．５ｍｌ
９． モリブデン酸アンモニウム（２．５％）：５Ｎ硫酸１００ｍｌ中２．５ｇ
１０． ＡＮＳＡ（０．１％）：１５％メタ重硫酸ナトリウム３９ｍｌ中１００ｍｇ。その後、２０％亜硫酸ナトリウム１ｍｌを加え、蒸留水で体積を１００ｍｌにした。

プロトコル：Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼは、トリスＨＣｌ緩衝液２５０μｌを採取し、続いて、１ｍＭのＮａ．ＥＤＴＡを５０μｌと共に６００ｍＭのＮａＣｌを５０μｌ、５０ｍＭのＫＣｌ（ＫＣＬ）を５０μｌ、及び８０ｍＭのＡＴＰを５０μｌ、加えることによりアッセイした。反応混合物を３７℃で１０分間プレインキュベートした。その後、１０％ホモジェネート２５μｌを単独で試験用に加え、さらに３７℃で１時間、インキュベートした。１０％ＴＣＡを添加して、直ちに反応を停止させた。それに対応して、対照反応速度は、反応を停止させた後に、１０％ホモジェネート２５μｌのみを加えることにより評価した。沈殿物は、３５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離することにより除去した。上清５０μｌに、蒸留水１０７５μｌ、モリブデン酸アンモニウム１２５μｌ及びＡＮＳＡ５０μｌを添加し、３７℃で１０分間、インキュベートした。上清を除いた全ての試薬を含むブランクに対して、青色の強度を、分光光度計を使用して、６４０ｎｍにて読み取った。結果は、遊離したＰｉのμｇ／分／タンパク質のｍｇで表される。

膜結合酵素：Ｎａ ^＋ Ｋ ^＋ ＡＴＰアーゼに対する試験薬物の効果：図４は、Ｎａ^＋Ｋ^＋ＡＴＰアーゼ活性を示す。ＩＳＰ誘導ラットでは、Ｎａ^＋Ｋ^＋ＡＴＰアーゼの有意な（Ｐ＜０．０１）減少を示すことが観察された。一方、試験薬物（５０及び１００ｍｇ／ｋｇ）による前処理では、用量に関係なく、Ｎａ^＋Ｋ^＋ＡＴＰアーゼ活性の有意な（Ｐ＜０．０１）上昇が示された。

膜結合酵素であるＮａ^＋Ｋ^＋ＡＴＰアーゼは、筋肉の収縮及び弛緩中のナトリウムイオン流入及びカリウムイオン流出（ｒｅｆｌｅｘ）の原因となる。ＩＳＰによる心筋梗塞の誘導では、ナトリウムイオンの流入を抑制し、それによって心筋の収縮と弛緩が妨げられた。試験薬物による前処理では、Ｎａ^＋Ｋ^＋ＡＴＰアーゼ活性の増加において参照薬物であるカルベジロールと同等であった。

例３（ｃ）：Ｍｇ２＋ＡＴＰアーゼ
試薬：
１． トリスＨＣｌ（０．１Ｍ）ｐＨ−７．４：蒸留水１００ｍｌ中１．５７６ｇ
２． ＫＣｌ（０．１Ｍ）：蒸留水１０ｍｌ中７４．５５ｍｇ
３． ＭｇＣｌ２（０．１Ｍ）：蒸留水１０ｍｌ中２００ｍｇ
４． ＡＴＰ（８０ｍＭ）：蒸留水１０ｍｌ中４４０ｍｇ
５． １０％ＴＣＡ：蒸留水１００ｍｌ中１０ｇ
６． １５％メタ重硫酸ナトリウム：蒸留水５０ｍｌ中７．５ｇ
７． ２０％硫酸ナトリウム：蒸留水１０ｍｌ中２ｇ
８． ５ＮのＨ２ＳＯ４：蒸留水１００ｍｌ中Ｈ２ＳＯ４が１３．５ｍｌ
９． モリブデン酸アンモニウム（２．５％）：５Ｎ硫酸１００ｍｌ中２．５ｇ。
１０． ＡＮＳＡ（０．１％）：１５％メタ重硫酸ナトリウム３９ｍｌ中１００ｍｇ。その後、２０％亜硫酸ナトリウム１ｍｌを加え、蒸留水で体積を１００ｍｌにした。

プロトコル：総ＡＴＰアーゼは、トリスＨＣＬ緩衝液０．７５ｍｌを採取し、続いて、１００ｍＭのＭｇＣｌ_２５０μｌと共に１００ｍＭのＫＣｌを５０μｌ、及び８０ｍＭのＡＴＰを５０μｌ、加えることによりアッセイした。反応混合物を３７°Ｃで２分間、プレインキュベートした。その後、１０％ホモジェネート５０μｌを単独で試験用に加え、さらに３７℃で２０分間インキュベートした。１０％ＴＣＡ５００μｌを添加して、反応を直ちに停止させた。これに対応して、対照反応速度は、反応を停止させた後に、１０％ホモジェネート５０μｌのみを添加することにより評価した。沈殿物は、３５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離することにより除去した。上清５０μｌに、蒸留水１０７５μｌ、モリブデン酸アンモニウム１２５μｌ及びＡＮＳＡ５０μｌを添加し、１０分間、３７℃でインキュベートした。上清を除いた全ての試薬を含むブランクに対して、青色の強度を、分光光度計を使用して、６４０ｎｍにて読み取った。結果は、遊離したＰｉのμｇ／分／タンパク質のｍｇで表される。

膜結合酵素：Ｍｇ ^２＋ ＡＴＰアーゼに対する試験薬物の効果：図５は、Ｍｇ^２＋ＡＴＰアーゼ活性を示す。ＩＳＰ誘導ラットは、正常対照ラットと比較して、Ｍｇ^２＋ＡＴＰアーゼの有意な（Ｐ＜０．０１）減少を示すことが観察された。一方、試験薬物（５０及び１００ｍｇ／ｋｇ）による前処理では、用量に関係なく、Ｍｇ^２＋ＡＴＰアーゼ活性の有意な（Ｐ＜０．０１）上昇が示された。Ｍｇ^２＋ＡＴＰアーゼは、細胞内、Ｍｇ^２＋レベルを調整する。試験薬物による前処理では、Ｍｇ^２＋ＡＴＰアーゼ活性の増加において参照薬物であるカルベジロールと同等であった

例３（ｄ）：Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ
試薬：
１． トリスＨＣｌ（０．１Ｍ）ｐＨ−７．４：蒸留水１００ｍｌ中１．５７６ｇ
２． ＫＣｌ（０．１Ｍ）：蒸留水１０ｍｌ中７４．５５ｍｇ
３． ＣａＣｌ２（０．１Ｍ）：蒸留水１０ｍｌ中１４７．０２ｍｇ
４． ＡＴＰ（８０ｍＭ）：蒸留水１０ｍｌ中４４０ｍｇ
５． １０％ＴＣＡ：蒸留水１００ｍｌ中１０ｇ
６． １５％メタ重硫酸ナトリウム：蒸留水５０ｍｌ中７．５ｇ
７． ２０％硫酸ナトリウム：蒸留水１０ｍｌ中２ｇ
８． ５ＮのＨ２ＳＯ４：蒸留水１００ｍｌ中Ｈ２ＳＯ４が１３．５ｍｌ
９． モリブデン酸アンモニウム（２．５％）：５Ｎ硫酸１００ｍｌ中２．５ｇ。
１０． ＡＮＳＡ（０．１％）：１５％メタ重硫酸ナトリウム３９ｍｌ中１００ｍｇ。その後、２０％亜硫酸ナトリウム１ｍｌを加え、蒸留水で容量を１００ｍｌにした。

プロトコル：Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼは、トリスＨＣＬ緩衝液０．７５ｍｌを採取し、続いて、１００ｍＭのＫＣｌを５０μｌ、１００ｍＭのＣａＣｌ_２を５０μｌ、及び８０ｍＭのＡＴＰを５０μｌ、加えることによりアッセイした。反応混合物を３７°Ｃで２分間プレインキュベートした。その後、１０％ホモジェネート５０μｌを単独で試験用に加え、さらに３７℃で２０分間インキュベートした。１０％ＴＣＡ５００μｌを添加して、反応を直ちに停止させた。これに対応して、対照反応速度は、反応を停止させた後に、１０％ホモジェネート５０μｌのみを添加することにより評価した。沈殿物は、３５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離することにより除去した。上清５０μｌに、蒸留水１０７５μｌ、モリブデン酸アンモニウム１２５μｌ及びＡＮＳＡ５０μｌを添加し、１０分間、３７℃でインキュベートした。上清を除いた全ての試薬を含むブランクに対して、青色の強度を、分光光度計を使用して、６４０ｎｍにて読み取った。結果は、遊離したＰｉのμｇ／分／タンパク質のｍｇで表される。

Ｃａ ^２＋ ＡＴＰアーゼに対する試験薬物の効果：図６は、Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ活性を示す。ＩＳＰを投与したラットでは、正常対照ラットと比較して、Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ活性が増加することが観察された。一方、試験薬物による前処理では、Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼ活性の低下が示され、結果は用量濃度とは無関係であった。

細胞内カルシウム（Ｃａ^２＋）レベルは、Ｃａ^２＋ＡＴＰアーゼにより維持及び調整される。ＩＳＰ処理ラットでは、増強されたＣａ^２＋ＡＴＰアーゼ及び細胞内Ｃａ^２＋過多は、アデニル酸シクラーゼの作用と相関する可能性がある。ｃＡＭＰによるＣａ^２＋チャネルタンパク質のリン酸化は、心筋へのＣａ^２＋の流入を増加させ、それにより心筋に負担をかけると予想される。発明者らの研究では、試験薬物を予め補充することにより、ＩＳＰ注入に起因するＣａ^２＋ＡＴＰアーゼの変動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ）に対して強力な耐性を示した。

酸化ストレス−ＩＳＰ誘導心筋梗塞に対する試験薬物の抗酸化剤能
例３（ｅ）：脂質ヒドロペルオキシド（ＬＰＯ）
試薬：
１． チオバルビツール酸（ＴＢＡ）（０．８％）：０．５ＮのＨＣｌ中０．８ｇｍｓ
２． ブチル化ヒドロキシルトルエン（０．０５％）：メタノール中０．０５ｇｍｓ。
３． 生理食塩水（０．９％）：蒸留水１００ｍｌ中０．９ｇ

プロトコル：この方法は、実験ラットの心臓ホモジェネート０．５ｍｌを、生理食塩水０．８ｍｌ、ＢＨＴ０．５ｍｌ及びＴＢＡ試薬３．５ｍｌと共に沸騰水浴中で１．５（１１／２）分間加熱することを含む。冷却後、溶液を２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、得られた沈殿物を除去した。上清の吸光度は、生物的試料を除いたすべての試薬を含むブランクに対して分光光度計を使用して５３２ｎｍにて測定した。値はｍｇ／組織のｇで表された（Ｏｋｈａｗａ Ｈら、１９７９）。

脂質過酸化（チオバルビツール酸反応性物質）：図７は、ＬＰＯ含有量を示す。ＩＳＰ誘導ラットは、正常対照ラットと比較した場合、心臓ＴＢＡＲＳのレベルの有意な増加を示した。試験薬物での前処理により、ＩＳＰ誘導ラットの心臓ＴＢＡＲＳのレベルが大幅に低下することが示された。結果は、標準薬物であるカルベジロールと同等であった。

ＩＳＰ処理では、フリーラジカル部分が、最終的には、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を高める酸素と反応するそのキニーネ代謝物を介して生成されることが知られている。好気性代謝の非常に有毒な副産物であるＲＯＳは、細胞膜及び脂質過酸化物の形成を促進する高分子と広範囲に反応して、組織の損傷を引き起こすことが知られている。脂質過酸化は、心筋壊死における重要な病原性事象であり、脂質ヒドロペルオキシドの蓄積により、心臓構成要素の損傷がもたらされる。イソプロテレノール投与後の発明者らの研究で観察された脂質過酸化の最終生成物であるＭＤＡのレベルの増加は、フリーラジカルが介在する膜損傷による可能性がある。発明者らの発見により、試験薬物には脂質過酸化阻害活性があることが示唆される。

例３（ｆ）：スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）
試薬：
１．ピロリン酸ナトリウム緩衝液（０．０２５Ｍ）：蒸留水１００ｍｌ中１．１１５ｇ。
２．フェナゾニウムメトスルファート（ＰＭＳ）（１８６μＭ）：蒸留水１０ｍｌ中３ｍｇ（９３０μＭ）。その後、１：５希釈を行って１８６μＭを得た。
３．ニトロブルーテトラゾリウム（塩化物）（ＮＢＴ）（３００μＭ）：リン酸緩衝液１０ｍｌ中３ｍｇ。
４． ＮＡＤＨ（７８０μＭ）：リン酸緩衝液１０ｍｌ中６ｍｇ。

プロトコル：スーパーオキシドジスムターゼは、心臓ホモジェネート０．０５ｍｌを採取し、ピロリン酸ナトリウム緩衝液（０．０２５Ｍ、ＰＨ８．３）０．３ｍｌ、ＰＭＳ（１８６μＭ）０．０２５ｍｌ及びＮＢＴ（ＰＨ８．３の緩衝液中で３００μＭ）０．０７５ｍｌを添加することによりアッセイした。ＮＡＤＨ（ＰＨ８．３の緩衝液中で７８０μＭ）０．０７５ｍｌの添加により反応を開始した。３０℃（３００Ｃ）で９０秒間、インキュベートした後、氷酢酸０．２５ｍｌの添加により反応を停止させた。次に、反応混合物を激しく攪拌し、ｎ−ブタノール２．０ｍｌと振盪した。混合物を１０分間静置し、遠心分離した。ｎ−ブタノール１．５ｍｌを単独でブランクとして使用した。色素原の色強度は５６０ｎｍで読み取った（Ｋａｋｋａｒ、Ｐ．ら、１９８４）。

スーパーオキシドジスムターゼ活性：図８はＳＯＤ活性を示す。ＩＴは、正常対照ラットと比較した場合、ＩＳＰ誘導ラットでは、スーパーオキシドジスムターゼレベルが減少したことが観察された。試験薬物での前処理では、ビヒクル処理したＩＳＰ誘導ラットと比較した場合、ＳＯＤレベルの用量依存的増加が示された。試験薬物処置したもの（ラット）のＳＯＤレベルは、標準薬物であるカルベジロール処置ラットのＳＯＤレベルと同等であった。

スーパーオキシドアニオン及び他の活性酸素種により、ラット心筋では、酸化ストレスと一般的に呼ばれる酸化環境が生成される。フリーラジカル消去抗酸化剤の中で、ＳＯＤは酸化的損傷に対する細胞防御であると考えた。その結果、ＩＳＰ投与後のＳＯＤレベルの低下は、試験薬物による前処理によって大幅に改善されると考えた。

例３（ｇ）：ＧＳＨ及びグルタチオンペルオキシダーゼ活性
グルタチオンペルオキシダーゼ［ＧＰＸ］
試薬：
１． アジ化ナトリウム（１０ｍＭ）：蒸留水２５ｍｌ中１６ｍｇ
２． ＧＳＨ（２ｍＭ）：蒸留水５０ｍｌ中３０．７３２ｍｇ。
３． Ｈ２Ｏ２（１ｍＭ）：蒸留水１０００ｍｌ中２９μｌ
４． １０％ＴＣＡ：蒸留水１００ｍｌ中１０ｇ
５． Ｋ．ＥＤＴＡ（０．４ｍＭ）：蒸留水１００ｍｌ中１６ｍｇ
６． トリスＨＣＬ緩衝液（０．４ｍＭ）：蒸留水１００ｍｌ中６．３０４ｇ
７． ＤＴＮＢ（０．６ｍＭ）：ＰＯ４緩衝液５０ｍｌ中１２ｍｇ。

プロトコル：グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）は、アジ化ナトリウム１００μｌと共に０．４ｍＭのＫ．ＥＤＴＡ、トリスＨＣＬ緩衝液（０．４Ｍ）を２００μｌ及び酵素調製物（溶血産物）２００μｌを採取し、十分に混合することによりアッセイした。その後、還元型グルタチオン溶液（２ｍＭ）２００μｌ、続いて、Ｈ２Ｏ２を０．１ｍｌ加えた。１０％ＴＣＡ０．５ｍｌを加えることにより、全体の反応を停止させた。沈殿物は、４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離することにより除去した。吸光度は、分光光度計を使用して４１２ｎｍにて読み取った。これに対応して、非酵素反応速度は、酵素試料を緩衝液で置き換えることにより評価した。結果は、消費されたＧＳＨのｍｇ／分／タンパク質のｍｇとして表される（Ｒｏｔｒｕｃｋ、Ｊら、１９７３）。

還元型グルタチオン［ＧＳＨ］
試薬：
１． ５％ＴＣＡ：蒸留水１００ｍｌ中５ｇ。
２． リン酸緩衝液（ｐＨ：８）０．２Ｍ
３． ＤＴＮＢ（０．６ｍＭ）：ＰＯ４緩衝液５０ｍｌ中１２ｍｇ。

プロトコル：グルタチオン含有量は、該方法に従って推定された（Ｍｏｒｅｎら、１９７９）。血清０．２５ｍｌを等量の氷冷５％ＴＣＡに加えた。沈殿物は、４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離することにより除去した。上清のアリコート１ｍｌに、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８．０を０．２５ｍｌ及びＤＴＮＢ（０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８．０中０．６ｍＭ）０．５ｍｌを加えて、十分に混合した。吸光度は、分光光度計を使用して４１２ｎｍにて読み取った。値はｍｇ／組織のｇで表した。

ＧＳＨ及びグルタチオンペルオキシダーゼ活性：正常ラット及びＩＳＰ誘導ラットの心臓におけるＧＳＨ活性を図９に示し、ＧＰＸ活性を図１０に示す。ラットのＩＳＰ誘導心筋梗塞では、正常対照グループと比較して、陽性対照グループの抗酸化剤レベルが有意に（ｐ＜０．０１）減少し、ＧＳＨ、ＧＰＸ活性が有意に増加したことを示した。ＩＳＰ誘導ラットに対する用量依存的試験薬物での前処理により、陽性対照グループと比較して、これらの酵素の活性は有意に増加した。グルタチオンは、過酸化水素の還元により、フリーラジカル媒介傷害から心筋を保護することが知られており、心臓壊死の誘導の間、還元型グルタチオンレベルは減少することになる（Ｋｏｃａｋ、Ｈ．ら、１９９２）。心筋梗塞では、酸化ストレスに対する保護メカニズムにより、ＧＳＨレベルは低下する。ＩＳＰの投与により、血漿及び心臓組織のＧＳＨレベルが低下することがわかった（Ｊｉら、１９８８）。ＧＰＸ及びＧＳＨ（ＧＳＴ）の活性は、ＩＳＰ誘導ラットで著しく低下する。心臓におけるＧＰＸの内因性酵素不活性化により、酸化型グルタチオンが蓄積する（Ｆｅｒｒａｒｉ Ｒら、１９８５）。スルフヒドリル基を含む酵素による酸化型グルタチオンの不活性化は、タンパク質合成を阻害する（Ｊｉら、１９８８）。現在の研究では、ＩＳＰ誘導心筋梗塞グループの試験薬物での前処理に対して、ＧＳＨ、ＧＰＸの活性が用量に依存して増加することにより、フリーラジカルによって引き起こされる伸縮性細胞損傷に対する試験薬物の抗酸化剤能が示された。

例３（ｉ）：ビウレット法による総タンパク質。
試薬：
１． ０．２Ｎ水酸化ナトリウム
２． １％酒石酸カリウムナトリウム中の０．５％硫酸銅（ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ）。
３． ストックビウレット溶液：０．２ＮのＮａＯＨ４０ｍｌ中に酒石酸カリウムナトリウム４．５ｇを溶解する。次に、ＣｕＳＯ_４１．５ｇを加え、完全に溶解させる。最後に、５００ｍｇのＫＩを加え、０．２ＮのＮａＯＨで体積を１００ｍｌにする。
４． ワーキングビウレット溶液：ストックビウレット溶液から１：５に希釈。
５． ストックタンパク質溶液：ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）５０ｍｇを正確に秤量し、蒸留水に溶かし、標準フラスコで５０ｍｌにする。
６． ワーキング標準：ストック溶液１０ｍｌを標準フラスコ中で蒸留水にて５０ｍｌに希釈する。この溶液の１ｍｌには２００μｇのタンパク質が含まれている。

プロトコル：タンパク質は、０．２ｍｌの生理食塩水、１０％ホモジェネートを採取し、続いて、ワーキングビウレット試薬１．２５ｍｌを添加して、アッセイすることにより、推定した。前記のものを室温で１５分間、インキュベートした。色強度を５４０ｎｍにて読み取った。

イソプロテレノール（ＩＳＰ）を注射したラット（陽性対照）は、対照ラットと比較して、総タンパク質レベルの有意な（Ｐ ＜０．００１）減少を示した。ＩＳＰ注射ラットへの試験薬物の投与（低用量）では、総タンパク質レベルは有意な（Ｐ＜０．０５）増加を示し、高用量の試験薬物グループ及び標準グループ（カルベジロール−２ｍｇ／ｋｇ）の両方では、タンパク質レベルは非常に有意に（ほぼ正常レベルに）増加することが観察された。

イソプロテレノールを注射したラットにおいて血清総タンパク質のレベルが減少したのは、イソプロテレノールによってフリーラジカルの産生が増加したことに起因する可能性がある。試験薬物を投与した場合、ＩＳＰ注射ラットと比較して、血清タンパク質レベルが用量依存的に改善した。この改善は、標準グループの改善に匹敵する。表５は、総タンパク質に対する試験薬物の効果を示す。

例３（ｊ）：逆転写酵素（ＲＴ）
カスパーゼ、Ｂａｘ、ＢＣｌ２及びｐ５３のｍＲＮＡ発現レベルを決定するために、ＰＣＲを実施した。要するに、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を使用して、左心室（心臓）から総ＲＮＡを抽出した。均質化後、該チューブを１０分間、インキュベートし、１０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。クロロホルム２００μｌを上清に加え、室温で５分間、インキュベートし、１２０００ｒｃｆで２０分間、遠心分離した。次に、イソプロピルアルコール５００μｌを上清に加えて、全ＲＮＡを沈殿させ、１０分間、インキュベートした後、１２０００ｒｃｆで１５分間、遠心分離した。上清を注意深くデカントし、ペレットを７５％エタノールで３回洗浄し、１２０００ｒｃｆで１５分間、遠心分離し、ペレットを風乾させた。ペレットをＲＮアーゼフリーの水２０μｌに再懸濁し、使用するまで−８０℃で保存した。単離したＲＮＡを、ＰＣＲマスターサイクラーグラジエントを使用して、逆転写及び重合反応させて、ｃＤＮＡを得た。形成されたｃＤＮＡをアガロースゲルにセットして、８０Ｖで３０分間電気泳動を行い、形成されたバンドを使用して、遺伝子発現を分析した。２００ナノグラムのＲＮＡを、製造者の指示書（Ｇｅｎｅｔ Ｂｉｏ、韓国）に従って、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に使用した。各ＰＣＲ反応（４２℃で３０秒間、９４℃で５分間（１サイクル）；９４℃で１分間、カスパーゼ（５６．０）、Ｂａｘ（５８．８）、Ｂｃｌ２（５６．７）及びｐ５３（５７．９）で１分間、７２℃で１分間（３５サイクル）；そして最後の伸長反応フェーズは７４℃で１０分間）に対して以下の配列決定を実施した。

タンパク質の遺伝子配列（５’−３’）は以下の通りである。
Ｂａｘ−
フォワードプライマー−ＧＡＧＴＧＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＡＴＴＧ
リバースプライマー−ＴＧＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＣＧＧＴＧＡＣ
Ｂｃｌ２−
フォワードプライマー−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴ
リバースプライマー−ＣＣＡＣＣＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＡＧＧ
カスパーゼ３−
フォワードプライマー−ＣＴＧＧＡＣＴＧＣＧＧＴＡＴＴＧＡＧ
リバースプライマー−ＧＧＧＴＧＣＧＧＴＡＧＡＧＴＡＡＧ
Ｐ５３−
フォワードプライマー−ＧＧＡＴＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧ
リバースプライマー−ＡＧＴＧＡＡＧＧＧＡＣＴＡＧＣＡＴＴＧＴＣ

データ分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、４．０３（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳ）を使用して実施した。データは、平均±ＳＥＭで表した。平均差は、一元配置分散分析（ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及び事後検定（ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）としてＴｕｋｅｙの多重比較で分析した。０．０５未満の確率値を、統計的有意性基準とした。

アポトーシスマーカーに対する試験薬物の効果：図１１は、アポトーシスマーカーの遺伝子発現を示している。ＩＳＰによる心筋梗塞の誘導により、アポトーシスマーカーであるカスパーゼ３、Ｐ５３及びＢａｘの発現が増加し、抗アポトーシスマーカーＢＣＬ−２の発現が減少した。アポトーシスのカスケードでは、カスパーゼ３の発現の増加により他のカスパーゼのリン酸化をもたらすが、一方で、Ｐ５３はＢＣＬ−２の発現を阻害し、逆にＢａｘの発現を高める。Ｂａｘは、順に、シトクロムＣを阻害し、それにより、活性酸素種の産生を高める。ＢＣＬ−２タンパク質及びＢａｘタンパク質は、さまざまなアポトーシス刺激の細胞生存シグナルを調節することが知られている（Ｓｕｔｔｏｎら、１９９７）。この後、発明者らは、ＩＳＰ誘導ラットでの試験薬物による処置における可能性のある成果について調査した。試験薬物による処置により、ＢＣＬ−２の発現は著しく増加し、一方、カスパーゼ−３、Ｐ５３及びＢａｘの発現は減少した。

臨床的観察：グループ間で死亡は観察されなかった。イソプロテレノールで誘導したラットは、心拍数と動悸の増加を示した。筋肉の剛性が動物にて観察され、動物の運動と活動が減少した。眼球の突出である眼球突出は、イソプロテレノールの誘導後に非常に顕著であった。それらは、呼吸速度の増加を示した。さらに、心筋梗塞の症状は、ＩＳＰ注射動物ではっきりと現れ、これらの臨床的徴候のオフセットは陽性対照では拡大した。

試験薬物の体重に対する効果：表６は、３週間の動物の体重を示す。０日目、７日目及び１４日目の実験グループ間で、有意な体重変化は観察されなかったが、２１日目の体重に有意な変化があった。

臓器重量に対する試験薬物の効果：表７は、様々なグループの臓器重量を示す。処置グループ間で、腎臓と副腎の重量に有意な差は観察されなかった。ＩＳＰ誘導ＭＩラットは、正常なラットと比較して、心臓重量の増加（２４％）を示したが、試験薬物での処置により、その変化は変わった。

例４：臨床試験
既に血圧降下剤を服用している男性８６人及び女性７４人を含む１５０人の高血圧患者に、既存のアロパシー薬と共に試験薬物を服用するよう助言した。彼らを、６週間の期間、研究した。

用量：２つの錠剤（５００ｍｇ×０２）を、１日に２回、食後に水で飲んだ。

結果と観察：
表８は、試験薬物投与前ならびに３週間後及び６週間後の平均Ｂ．Ｐを示す（ｎ＝１５０）。

図１２は、収縮期Ｂ．Ｐに対する試験薬物の効果を示す。図１３は、弛緩期Ｂ．Ｐに対する試験薬物の効果を示す。

試験薬物を使用した後、収縮期と弛緩期の両方の安静時脈拍数及び血圧は、有意な減少を示した。血圧の低下とアロパシー薬の投与量の削減に役立つことに加えて、一般的な健康感もあった。試験薬物で６か月間治療した後、多くの場合、他の血圧降下薬の投与量が効果的に減少した。

注：軽度の僧帽弁逆流を伴う僧帽弁逸脱の場合、試験製品を８ヶ月間投与した場合、２Ｄ超音波心臓検査により、僧帽弁逸脱が完全に解消され、僧帽弁逆流は観察されないことが確認された。患者は症状が無くなり、心室腔と心拍出量は正常範囲内であった。

前述の研究により、試験製品に毒性がないことが証明された。前臨床試験では、イソプロテレノール誘導心筋梗塞実験モデルにおいて、試験製品が抗アポトーシス経路を介してその心臓保護作用を発揮することが示される。臨床試験では、試験薬物の血圧降下作用、心臓保護作用、弁矯正作用が確認される。

特定の実施形態の前述の説明は、本明細書の実施形態の包括的な性質を十分に明らかにするので、他の人は、現在の知識を適用することにより、一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を様々な用途に容易に改変及び／又は適応させることができ、したがって、そのような適応及び改変は、開示された実施形態の等価物の意味及び範囲内で理解されるべきであり、そのことが意図される。本明細書で使用される表現又は用語は説明のためのものであり、限定のためではないことを理解されたい。したがって、本明細書の実施形態を好ましい実施形態に関して説明したが、当業者は、本明細書に記載の実施形態の精神及び範囲内で修正を加えて本実施形態を実施できることがわかるであろう。

Claims (23)

1. 以下の成分を含む、心臓血管疾患の治療及び管理のための製剤：
   テルミナリア・アルジュナ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ａｒｊｕｎａ）、シダ・ロンビフォリア（Ｓｉｄａ ｒｏｍｂｉｆｏｌｉａ）、ウィタニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）、ティノスポラ・コーディフォリア（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）、プニカ・グラナツム（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）、エンブリカ・オフィキナリス（Ｅｍｂｌｉｃａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）及びコミフォラ・ムクル（Ｃｏｍｍｉｐｈｏｒａ ｍｕｋｕｌ）、又はそれらの抽出物を含むハーブ成分；ならびに
   シラジット及びバスマを含むミネラル成分。
2. テルミナリア・アルジュナが８〜１２重量％の範囲の量で存在し、シダ・ロンビフォリアが２〜６重量％の範囲の量で存在し、ウィタニア・ソムニフェラが２〜６重量％の範囲の量で存在し、ティノスポラ・コーディフォリアが２〜６重量％の範囲の量で存在し、プニカ・グラナツムが２〜６重量％の範囲の量で存在し、エンブリカ・オフィキナリスが２〜６重量％の範囲の量で存在し、そしてコミフォラ・ムクルが２〜６重量％の範囲の量で存在する、請求項１に記載の製剤。
3. ハーブ成分が、エンベリア・リベス（Ｅｍｂｅｌｉａ ｒｉｂｅｓ）、ルビア・コルディフォリア（Ｒｕｂｉａ ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）、ナルドスタキス・ジャタマンシ（Ｎａｒｄｏｓｔａｃｈｙｓ ｊａｔａｍａｎｓｉ）、テルミナリア・チェブラ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃｈｅｂｕｌａ）、テルミナリア・ベレリカ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｂｅｌｌｅｒｉｃａ）、ピペル・ロンガム（Ｐｉｐｅｒ ｌｏｎｇｕｍ）、ピペル・ニグラム（Ｐｉｐｅｒ ｎｉｇｒｕｍ）、ジンギベル・オフィキナリス（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ボルハビア・ディフューザ（Ｂｏｅｒｈａｖｉａ ｄｉｆｆｕｓａ）、バンブー・マンナ（Ｂａｍｂｏｏ ｍａｎｎａ）、マドゥカ・インディカ（Ｍａｄｈｕｋａ ｉｎｄｉｃａ）、アザディラクタ・インディカ（Ａｚｈａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）、ピクロリザ・クロア（Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｋｕｒｒｏａ）、ホーリー・バジル（Ｈｏｌｙ ｂａｓｉｌ）、ステレオスペルマム・スアベオレンス（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｒｍｕｍ（Ｓｔｅｒｉｏｓｐｅｒｍｕｍ） ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）、プレムナ・ムクロナタ（Ｐｒｅｍｎａ ｍｕｃｒｏｎａｔａ）、グメリナ・アルボレア（Ｇｍｅｌｉｎａ ａｒｂｏｒｅａ）、エーグル・マーメロス（Ａｅｇｌｅ ｍａｒｍｅｌｏｓ）、オロキシルム・インディクム（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）、デスモディウム・ガンゲチクム（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ ｇａｎｇｅｔｉｃｕｍ）、ウラリア・ピクタ（Ｕｒａｒｉａ ｐｉｃｔａ）、ソラナム・インディクム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）、ソラナム・キサントカルプム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｘａｎｔｈｏｃａｒｐｕｍ）、及びトリビュラス・テレストリス（Ｔｒｉｂｕｌｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）；又はそれらの抽出物からなる群から選択される少なくとも１種のハーブをさらに含む、請求項１に記載の製剤。
4. ハーブが、≦４重量％の量で存在する、請求項３に記載の製剤。
5. ミネラル成分が、ムクタスクティ・バスマ（Ｍｕｋｔａｓｕｋｔｉ ｂｈａｓｍａ）、ロハ・バスマ（Ｌｏｈａ ｂｈａｓｍａ）、アブラカ・バスマ（Ａｂｈｒａｋａ ｂｈａｓｍａ）、スワルナマクシカ・バスマ（Ｓｗａｒｎａｍａｋｓｉｋａ ｂｈａｓｍａ）及びプラバラ・バスマ（Ｐｒａｖａｌａ ｂｈａｓｍａ）からなる群から選択される少なくとも１種のバスマを含む、請求項１に記載の製剤。
6. シラジットが、１〜３重量％の範囲の量で存在する、請求項１に記載の製剤。
7. ムクタスクティ・バスマが≦２重量％の量で存在し、ロハ・バスマが≦２重量％の量で存在し、アブラカ・バスマが≦３重量％の量で存在し、スワルナマクシカ・バスマが≦２重量％の量で存在し、そしてプラバラ・バスマが≦２重量％の量で存在する、請求項５に記載の製剤。
8. 適切な賦形剤、好ましくはアカシアゴム（ｇｕｍ ａｃａｃｉａ）をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
9. 製剤が、粉末の形態である、請求項１に記載の製剤。
10. 製剤が、錠剤の形態である、請求項１に記載の製剤。
11. 錠剤が、５００ｍｇの錠剤の形態である、請求項１０に記載の製剤。
12. 心臓血管疾患を治療及び予防するための薬剤の調製における請求項１に記載の製剤の使用。
13. 心臓血管疾患のリスクを低減するための薬剤の調製における請求項１に記載の製剤の使用。
14. 以下の工程を含む、請求項１に記載の製剤の調製方法：
    バスマ及びシラジットを粉砕する工程；
    微粉末化ハーブを添加する工程；及び
    粉砕を継続しながら、粉砕煎剤を添加して、粉砕塊を得る工程。
15. バスマが、ムクタスクティ・バスマ、ロハ・バスマ、アブラカ・バスマ、スワルナマクシカ・バスマ及びプラバラ・バスマからなる群から選択される、請求項１４に記載の製剤の調製方法。
16. 微粉末化ハーブが、微粉末形態の以下のものを含む、請求項１４に記載の製剤の調製方法：テルミナリア・アルジュナ（乾燥茎皮）、シダ・ロンビフォリア（乾燥根）、ウィタニア・ソムニフェラ（乾燥根）、ルビア・コルディフォリア（Ｒｕｂｉａ ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）（乾燥根）、ナルドスタキス・ジャタマンシ（Ｎａｒｄｏｓｔａｃｈｙｓ ｊａｔａｍａｎｓｉ）（乾燥根）、ボルハビア・ディフューザ（Ｂｏｅｒｈａｖｉａ ｄｉｆｆｕｓａ）（乾燥根）、ピクロリザ・クロア（Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｋｕｒｒｏａ）（乾燥根）、ステレオスペルマム・スアベオレンス（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｒｍｕｍ（Ｓｔｅｒｉｏｓｐｅｒｍｕｍ） ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）（乾燥根）、プレムナ・ムクロナタ（Ｐｒｅｍｎａ ｍｕｃｒｏｎａｔａ）（乾燥根）、グメリナ・アルボレア（Ｇｍｅｌｉｎａ ａｒｂｏｒｅａ）（乾燥根）、エーグル・マーメロス（Ａｅｇｌｅ ｍａｒｍｅｌｏｓ）（乾燥根）、オロキシルム・インディクム（Ｏｒｏｘｙｌｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）（乾燥根）、ソラナム・インディクム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）（乾燥根）、エンベリア・リベス（Ｅｍｂｅｌｉａ ｒｉｂｅｓ）（乾燥果実）、エンブリカ・オフィキナリス（乾燥果実）、テルミナリア・チェブラ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃｈｅｂｕｌａ）（乾燥果実）、テルミナリア・ベレリカ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｂｅｌｌｅｒｉｃａ）（乾燥果実）、ピペル・ロンガム（Ｐｉｐｅｒ ｌｏｎｇｕｍ）（乾燥果実）、ピペル・ニグラム（Ｐｉｐｅｒ ｎｉｇｒｕｍ）（乾燥果実）、トリビュラス・テレストリス（Ｔｒｉｂｕｌｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（乾燥果実）、アザディラクタ・インディカ（Ａｚｈａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）（乾燥皮）、ソラナム・キサントカルプム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｘａｎｔｈｏｃａｒｐｕｍ）（乾燥植物）、ウラリア・ピクタ（Ｕｒａｒｉａ ｐｉｃｔａ）（乾燥植物）、デスモディウム・ガンゲチクム（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ ｇａｎｇｅｔｉｃｕｍ）（乾燥植物）、ティノスポラ・コーディフォリア（乾燥茎）、プニカ・グラナツム（乾燥果実果皮）、ジンギベル・オフィキナリス（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（乾燥根茎）、バンブー・マンナ（Ｂａｍｂｏｏ ｍａｎｎａ）（滲出物）、マドゥカ・インディカ（Ｍａｄｈｕｋａ ｉｎｄｉｃａ）（乾燥花）、ホーリー・バジル（Ｈｏｌｙ ｂａｓｉｌ）（乾燥葉）及びコミフォラ・ムクル（ゴム樹脂）。
17. 粉砕煎剤が、以下のものからなる群から選択される少なくとも１種のハーブの煎剤である、請求項１４に記載の製剤の調製方法：テルミナリア・アルジュナ、アスパラガス・ラセモサス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、アサフェティダ（Ａｓａｆｅｔｉｄａ）、クミン・シミナム（Ｃｕｍｉｎｕｍ ｃｙｍｉｎｕｍ）、プルンバゴ・ロゼア（Ｐｌｕｍｂａｇｏ ｒｏｓｅａ）、バリオスペルマム・モンタナム（Ｂａｌｉｏｓｐｅｒｍｕｍ ｍｏｎｔａｎｕｍ）、オシマム・サンクタム（Ｏｃｉｍｕｍ ｓａｎｃｔｕｍ）、アロエベラ（Ａｌｏｅｖｅｒａ）、プランタゴ・オバタ（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｏｖａｔａ）、ステレオスペルマム・スアベオレンス、プレムナ・ムクロナタ、グメリナ・アルボレア、エーグル・マーメロス、オロキシルム・インディクム、デスモディウム・ガンゲチクム、ウラリア・ピクタ、ソラナム・インディクム、ソラナム・キサントカルプム及びトリビュラス・テレストリス。
18. 治療的有効量の請求項１に記載の製剤を投与することを含む、心臓血管疾患のリスクを低減する方法。
19. 治療的有効量の請求項１に記載の製剤を投与することを含む、心臓血管疾患を治療及び予防する方法。
20. 製剤が、好ましくは、５００ｍｇの錠剤２個の用量で、１日２回投与される、請求項１９に記載の心臓血管疾患を治療及び予防する方法。
21. 治療的有効量の請求項１に記載の製剤を投与することを含む、心臓血管疾患を治療及び予防する方法。
22. 治療的有効量が、５００〜１０００ｍｇであり、１日１〜３回投与される、請求項１９に記載の心臓血管疾患を治療及び予防する方法。
23. 製剤が、心臓血管疾患の治療のために処方された少なくとも１種の他の薬剤の投与と共に投与される、請求項１９に記載の心臓血管疾患を治療／予防する方法。