JP2020198792A

JP2020198792A - Method of detecting nontuberculous mycobacteria by pcr

Info

Publication number: JP2020198792A
Application number: JP2019106407A
Authority: JP
Inventors: 真 ▲高▼石; Makoto Takaishi
Original assignee: Daiken Iki Co Ltd
Current assignee: Daiken Iki Co Ltd
Priority date: 2019-06-06
Filing date: 2019-06-06
Publication date: 2020-12-17

Abstract

To provide a technique that can detect MAC, M. kansasii, and M. kansasii subspecies by differentiating them from each other.SOLUTION: A primer set targets an ITS region of each of MAC, M. kansasii and M. kansasii subspecies. In the primer set, a cross reaction does not occur among the three species.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、ＰＣＲによる細菌検出技術に関するものである。 The present invention relates to a technique for detecting bacteria by PCR.

非結核性抗酸菌（ｎｏｎ−ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ；ＮＴＭ）とは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；以下、Ｍ．ツベルクローシスと略すこともある。）群とらい菌群を除いた培養可能な抗酸菌の総称である。 Non-tuberculous mycobacteria (NTM) is a cultivable anti-acid excluding the tubercle bacillus (Mycobacterium tuberculosis; hereinafter, sometimes abbreviated as M. tuberculosis) group and the leprosy group. It is a general term for bacteria.

非結核性抗酸菌の中でも、マイコバクテリウムアビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ、以下、Ｍ．アビウムと略すこともある）、マイコバクテリウムイントラセルラーエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、以下、Ｍ．イントラセルラーエと略すこともある）は、ヒトに対する感染例が最も多い。両者は非常によく似ており、区別がつきにくいことから、両者をあわせてマイコバクテリウムアビウムコンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ；、以下、ＭＡＣと略すこともある）と呼ばれている。 Among nontuberculous mycobacteria, Mycobacterium avium (hereinafter sometimes abbreviated as M. avium) and Mycobacterium avium intracellulare (hereinafter, abbreviated as M. avium). There are also cases of human infection. Since they are very similar and difficult to distinguish, they are collectively called Mycobacterium avium complex (hereinafter, sometimes abbreviated as MAC).

次いで、マイコバクテリウムカンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉ、以下、Ｍ．カンサシイと略すこともある）のヒトに対する感染も多い。 Next, there are many infections of Mycobacterium kansashii (hereinafter sometimes abbreviated as M. kansashii) to humans.

そして、ＭＡＣとＭ．カンサシイは、それぞれ感受性を示す抗菌剤の種類が異なることが知られている。
したがって、結核菌、ＭＡＣ、及びＭ．カンサシイを互いに区別して検出することが、非結核性抗酸菌感染症の治療にとって非常に重要である。 And MAC and M.M. It is known that Kansashii has different types of antibacterial agents that exhibit sensitivity.
Therefore, M. tuberculosis, MAC, and M. tuberculosis. Distinguishing and detecting Kansashii from each other is very important for the treatment of nontuberculous mycobacterial infections.

現在、結核や非結核性抗酸菌への感染の疑いがある人に対しては、塗抹検査、培養検査、核酸増幅検査、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションなどでの検査が主流である。
中でも核酸増幅検査、特にポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）による検査は、正確性が高く簡便なため、ＰＣＲを利用した非結核性抗酸菌の検出方法が種々提案されてきている。
例えば、特許文献１（特表２０１３−５０２９２２号公報）には、結核菌と非結核性抗酸菌とを区別して検出するためのプライマーと、該プライマーを用いたマルチプレックスリアルタイムＰＣＲによる検出方法が開示されている。 Currently, for people suspected of being infected with tuberculosis or nontuberculous mycobacteria, smear tests, culture tests, nucleic acid amplification tests, DNA-DNA hybridization and other tests are the mainstream.
Among them, a nucleic acid amplification test, particularly a test by a polymerase chain reaction (PCR), is highly accurate and simple, and therefore various methods for detecting nontuberculous mycobacteria using PCR have been proposed.
For example, Patent Document 1 (Japanese Patent Laid-Open No. 2013-502922) describes a primer for distinguishing between tubercle bacilli and nontuberculous mycobacteria and a detection method by multiplex real-time PCR using the primer. It is disclosed.

また特許文献２（特開２０１７−２１２９９１号公報）には、Ｍ．アビウムを特異的に検出するためのプライマーと、該プライマーを用いたＰＣＲによるＭ．アビウムの検出方法が記載されている。 Further, in Patent Document 2 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2017-212991), M.I. A primer for specifically detecting Abium and M. avium avium by PCR using the primer. The method for detecting Abium is described.

特表２０１３−５０２９２２号公報Special Table 2013-502922 特開２０１７−２１２９９１号公報JP-A-2017-212991

感染症の治療のためには、菌種の同定が重要になるが、特許文献１に記載の検出方法は、結核菌と非結核性抗酸菌とを区別して検出するものであり、非結核性抗酸菌の何れの菌種なのかについては、同定することができない。
そのため、結核菌と非結核性抗酸菌とを区別するのみならず、非結核性抗酸菌の何れの菌種なのかを同定する技術が求められていた。 Identification of the bacterial species is important for the treatment of infectious diseases, but the detection method described in Patent Document 1 distinguishes between tubercle bacilli and nontuberculous mycobacteria and detects nontuberculosis. It is not possible to identify which type of mycobacteria is.
Therefore, a technique for not only distinguishing between tubercle bacilli and nontuberculous mycobacteria but also identifying which type of nontuberculous mycobacteria is required has been required.

上記課題解決のため、本発明者は、医療機関から提供を受けた、非結核性抗酸菌の菌株から得られたゲノムＤＮＡサンプルを協力研究機関から入手した。そして、それらのサンプル全てにおいて、ゲノムＤＮＡ中の一部遺伝子領域の塩基配列を解析した。 In order to solve the above problems, the present inventor obtained a genomic DNA sample obtained from a strain of nontuberculous mycobacteria provided by a medical institution from a collaborative research institution. Then, in all of these samples, the nucleotide sequences of some gene regions in the genomic DNA were analyzed.

その結果、１６ＳｒＲＮＡと２３ＳｒＲＮＡの間に位置する領域であるｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒ領域（ＩＴＳ）は菌種同定に有用であることが判明した。
具体的には、複数菌株の全ゲノムＤＮＡの解析結果から、抗酸菌という類似した菌群に属する結核菌、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイをお互いに区別するためには、１６ＳｒＤＮＡによる菌種分類などよりもＩＴＳ配列を基にした分類の方が有用であることが分かった。 As a result, it was found that the international transcribed spacer region (ITS), which is a region located between 16S rRNA and 23S rRNA, is useful for bacterial species identification.
Specifically, from the analysis results of whole-genome DNA of a plurality of strains, tubercle bacilli belonging to a similar group of acid-fast bacilli, MAC, M. In order to distinguish Kansashii from each other, it was found that classification based on ITS sequence is more useful than classification based on 16S rDNA.

さらに、本発明者によるＩＴＳ領域の塩基配列の解析により、医療機関等においてＭ．カンサシイであるとして保存されていた菌株の中には、同種に分類できない菌株、言い換えればＭ．カンサシイ亜種というべきものが含まれることもわかった。
このことからも、ＩＴＳ領域に基づく菌種同定の有用性が示唆された。 Furthermore, by analyzing the base sequence of the ITS region by the present inventor, M.I. Among the strains preserved as Kansashii, strains that cannot be classified into the same species, in other words, M.I. It was also found that it contained what could be called a Kansashii subspecies.
This also suggested the usefulness of bacterial species identification based on the ITS region.

また、同一菌種でも、株間の塩基配列が多様性に富むことが分かっているが、本発明者による全ゲノムＤＮＡの解析結果から、ＩＴＳ領域には他の遺伝子領域と比べて、菌種を区別できる程度の変異が有り、かつ同一菌種内での変異が少ないことが示唆された。 In addition, it is known that even with the same bacterial species, the base sequences between strains are rich in diversity, but from the analysis results of whole genomic DNA by the present inventor, the bacterial species are found in the ITS region as compared with other gene regions. It was suggested that there were distinguishable mutations and that there were few mutations within the same bacterial species.

また、本発明者による解析の結果、同一菌種内の変異ごとにＩＴＳ領域の塩基配列は複数のグループに分類できることが分かった。
以上の知見より、ＩＴＳ領域を標的としたＰＣＲは菌種同定に有用であるが、同一菌種を構成する複数のグループに共通した塩基配列を同定した上でプライマーやプローブを設計しなければ、ある菌種に属するにも関わらず、検出から漏れるグループが発生する可能性があることが新たに判明した。 In addition, as a result of analysis by the present inventor, it was found that the nucleotide sequence of the ITS region can be classified into a plurality of groups for each mutation within the same bacterial species.
Based on the above findings, PCR targeting the ITS region is useful for bacterial species identification, but if a primer or probe is not designed after identifying a nucleotide sequence common to multiple groups constituting the same bacterial species, It was newly found that there may be a group that is not detected even though it belongs to a certain bacterial species.

以上の通り、非結核性抗酸菌をＰＣＲにより検出するためには、同一菌種内の変異ごとにＩＴＳ領域の塩基配列は複数のグループに分類できることを考慮して、同一菌種に分類される菌株を漏れなく検出可能であり、かつ、菌種間での交差性の無いプライマーを設計する必要があることが本発明者により判明した。 As described above, in order to detect nontuberculous mycobacteria by PCR, the nucleotide sequences of the ITS region can be classified into multiple groups for each mutation in the same strain, and they are classified into the same strain. It has been found by the present inventor that it is necessary to design a primer that can detect all strains and has no cross-reactivity between bacterial species.

本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであり、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）とは区別して検出可能であることはもとより、非結核性抗酸菌の中でもＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種をそれぞれ区別して検出することができる技術を提供することを課題とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and is not only detectable separately from Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), but also among nontuberculous mycobacteria, MAC, M. tuberculosis. Kansashii and M.M. An object of the present invention is to provide a technique capable of detecting each subspecies of Kansashii separately.

本発明者は、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．カンサシイ亜種について、合計数百株のＩＴＳ領域の塩基配列の解析結果を精査し、それぞれの菌種・菌群の間に存在するＩＴＳ領域内の変異の位置を把握した。その結果、ＩＴＳ領域の塩基配列に基づいて分類された菌種のグループは複数あるものの、同一菌種に共通し、かつ異なる菌種と区別可能な塩基配列領域が存在することがわかった。これに基づき、それぞれの菌種を漏れなく検出可能であり、かつ、菌種間での交差性が無いプライマーを設計し、本発明を完成させた。 The inventor of the present invention is MAC. Kansashii, M.D. For the Kansashii subspecies, the analysis results of the nucleotide sequences of the ITS region of a total of several hundred strains were examined closely, and the positions of mutations in the ITS region existing between each bacterial species and bacterial group were grasped. As a result, it was found that although there are a plurality of bacterial species groups classified based on the nucleotide sequence of the ITS region, there is a nucleotide sequence region common to the same bacterial species and distinguishable from different bacterial species. Based on this, we designed a primer that can detect each bacterial species without omission and that has no cross-reactivity between bacterial species, and completed the present invention.

すなわち、上記課題を解決する本発明は、以下のプライマーセットａ〜ｃから選ばれる１種以上のプライマーセットを含むことを特徴とする、マイコバクテリウム属細菌検出用キットである。 That is, the present invention that solves the above problems is a kit for detecting Mycobacterium spp., Which comprises one or more primer sets selected from the following primer sets a to c.

＜プライマーセットａ＞
マイコバクテリウムアビウムコンプレックスのＩＴＳ領域の少なくとも一部を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットであり、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする、マイコバクテリウムアビウムコンプレックス検出用プライマーセット。 <Primer set a>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying at least a part of the ITS region of the Mycobacterium avium complex.
The forward primer and the reverse primer are a primer set for detecting Mycobacterium avium complex, which anneals to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a base sequence complementary thereto.

＜プライマーセットｂ＞
マイコバクテリウムカンサシイのＩＴＳ領域の少なくとも一部を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットであり、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーは、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする、マイコバクテリウムカンサシイ検出用プライマーセット。 <Primer set b>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying at least a part of the ITS region of Mycobacterium kansa cake.
The forward primer and the reverse primer are a primer set for detecting Mycobacterium kansashii, which anneals to the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 or a base sequence complementary thereto.

＜プライマーセットｃ＞
マイコバクテリウムカンサシイ亜種のＩＴＳ領域の少なくとも一部を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットであり、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーは、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする、マイコバクテリウムカンサシイ亜種検出用プライマーセット。 <Primer set c>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying at least a part of the ITS region of the Mycobacterium Kansa cake subspecies.
A primer set for detecting Mycobacterium kansashii subspecies, wherein the forward primer and the reverse primer are annealed to the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 or a base sequence complementary thereto.

プライマーセットａは、結核菌はもとより、Ｍ．カンサシイやＭ．カンサシイ亜種と交差性を示すことなく、Ｍ．アビウムとＭ．イントラセルラーエをまとめてＭＡＣとして検出することができるプライマーセットである。
プライマーセットｂは、結核菌はもとより、ＭＡＣやＭ．カンサシイ亜種と交差性を示すことなく、Ｍ．カンサシイを検出することができるプライマーセットである。
そして、プライマーセットｃは、結核菌はもとより、ＭＡＣやＭ．カンサシイと交差性を示すことなく、Ｍ．カンサシイ亜種を検出することができるプライマーセットである。 Primer set a includes not only tubercle bacilli but also M. tuberculosis. Kansashii and M. Without showing cross-reactivity with the Kansashii subspecies, M. Avium and M. avium. It is a primer set that can detect intracellular as a MAC.
Primer set b includes not only tubercle bacilli but also MAC and M. tuberculosis. Without showing cross-reactivity with the Kansashii subspecies, M. It is a primer set that can detect Kansashii.
Then, the primer set c includes not only tubercle bacilli but also MAC and M. tuberculosis. Without showing crossing with Kansashii, M. It is a primer set that can detect Kansashii subspecies.

したがって、本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットによれば、ＭＡＣと、Ｍ．カンサシイと、Ｍ．カンサシイ亜種とを互いに区別して、かつ、結核菌と区別して検出することが可能である。 Therefore, according to the kit for detecting Mycobacterium spp. Of the present invention, MAC and M.I. Kansashii and M. It is possible to detect the subspecies of Kansashii separately from each other and from Mycobacterium tuberculosis.

本発明の好ましい形態では、
前記プライマーセットａが下記プライマーセットａ−１であり、
前記プライマーセットｂが下記プライマーセットｂ−１であり、
前記プライマーセットｃが下記プライマーセットｃ−１である。 In a preferred embodiment of the invention
The primer set a is the following primer set a-1.
The primer set b is the following primer set b-1.
The primer set c is the following primer set c-1.

＜プライマーセットａ―１＞
配列番号４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと
配列番号５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。 <Primer set a-1>
A primer set comprising a forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.

＜プライマーセットｂ−１＞
配列番号９で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと
配列番号１０で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。 <Primer set b-1>
A primer set comprising a forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.

＜プライマーセットｃ−１＞
以下のプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３から選ばれるプライマーセット。 <Primer set c-1>
A primer set selected from the following primer sets c-1-1 to c-1--3.

＜プライマーセットｃ−１−１＞
配列番号１４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号１５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット、 <Primer set c-1-1>
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 and
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15.

＜プライマーセットｃ−１−２＞
配列番号１６で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号１５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット、 <Primer set c-1-2>
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15.

＜プライマーセットｃ−１−３＞
配列番号１７で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号１０で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。 <Primer set c-1-3>
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 and
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.

このように、プライマーセットａ―１、プライマーセットｂ−１、プライマーセットｃ−１から選ばれるプライマーセットを用いる形態とすることで、ＭＡＣと、Ｍ．カンサシイと、Ｍ．カンサシイ亜種とを互いに区別して、より精度よく非結核性抗酸菌の検出が可能となる。 As described above, by using the primer set selected from the primer set a-1, the primer set b-1, and the primer set c-1, the MAC and M.I. Kansashii and M. By distinguishing from the Kansashii subspecies, it becomes possible to detect nontuberculous mycobacteria more accurately.

本発明の好ましい形態では、前記プライマーセットａ〜ｃから選ばれる２種以上のプライマーセットを含む。
このように２種以上のプライマーセットを含む形態とすることで、検体に含まれる病原菌をより精度よく同定することができるマイコバクテリウム属細菌検出用キットを提供することができる。 A preferred embodiment of the present invention includes two or more primer sets selected from the primer sets a to c.
By forming a form containing two or more types of primer sets in this way, it is possible to provide a kit for detecting Mycobacterium spp., Which can more accurately identify pathogens contained in a sample.

本発明の好ましい形態では、さらに以下のプライマーセットｄを含む。 A preferred embodiment of the present invention further comprises the following primer set d.

＜プライマーセットｄ＞
マイコバクテリウムツベルクローシスのＩＴＳ領域の少なくとも一部を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットであり、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーは、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０で表される塩基配列と同一又は相補な塩基配列にアニールする、マイコバクテリウムツベルクローシス検出用プライマーセット。 <Primer set d>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying at least a part of the ITS region of Mycobacterium tuberculosis.
A primer set for detecting Mycobacterium tuberculosis, wherein the forward primer and the reverse primer are annealed to the same or complementary base sequence as the base sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20.

プライマーセットｄは、非結核性抗酸菌（ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．カンサシイ亜種）と区別して、Ｍ．ツベルクローシスを検出可能にするプライマーセットである。
プライマーセットｄを含む形態とすることで、検体に含まれる病原菌が結核菌であるのか、非結核性抗酸菌であるのか、を確定的に判断することができる。また、プライマーセットａ〜ｃの何れかによる非結核性抗酸菌の検出結果が、結核菌の交差反応による偽陽性でないことを判断することができる。 Primer set d distinguishes from nontuberculous mycobacteria (MAC, M. kansashii, M. kansashii subspecies) and M. A primer set that makes it possible to detect tuberculosis.
By adopting the form containing the primer set d, it is possible to definitively determine whether the pathogen contained in the sample is a tubercle bacillus or a nontuberculous mycobacteria. In addition, it can be determined that the detection result of the nontuberculous mycobacteria by any of the primer sets a to c is not a false positive due to the cross reaction of the tubercle bacilli.

本発明の好ましい形態では、前記プライマーセットｄが下記プライマーセットｄ−１である。 In a preferred embodiment of the present invention, the primer set d is the following primer set d-1.

＜プライマーセットｄ−１＞
配列番号２１で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと
配列番号２２で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。 <Primer set d-1>
A primer set comprising a forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 and a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 22.

プライマーセットｄ−１を含む形態とすることで、検体におけるＭ．ツベルクローシスの有無をより正確に判断可能なマイコバクテリウム属細菌検出用キットを提供することができる。 By forming a form containing the primer set d-1, M.I. It is possible to provide a kit for detecting Mycobacterium spp., Which can more accurately determine the presence or absence of tuberculosis.

本発明の好ましい形態では、さらに、下記対照・標準用テンプレートｅと、下記プライマーセットｅと、を含む。 A preferred embodiment of the present invention further includes the following control / standard template e and the following primer set e.

＜対照・標準用テンプレートｅ＞
結核菌及び非結核性抗酸菌のゲノムＤＮＡの塩基配列には含まれない、特有の塩基配列を有するテンプレートＤＮＡ。 <Control / standard template e>
A template DNA having a unique base sequence that is not included in the base sequence of the genomic DNA of Mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacteria.

＜プライマーセットｅ＞
前記特有の塩基配列を増幅するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセット。 <Primer set e>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying the unique base sequence.

このように対照・標準用テンプレートを含む形態によれば、シングルプレックスＰＣＲの場合にはポジティブコントロールとして、又はマルチプレックスＰＣＲの場合には内部標準を置いたうえでのマイコバクテリウム属細菌の検出が可能となる。 In this way, according to the form including the control / standard template, the detection of Mycobacterium spp. Is detected as a positive control in the case of singleplex PCR or with an internal standard in the case of multiplex PCR. It will be possible.

本発明の好ましい形態では、前記対照・標準用テンプレートｅが、下記対照・標準用テンプレートｅ−１であり、
前記プライマーセットｅが、下記プライマーセットｅ−１である。 In a preferred embodiment of the present invention, the control / standard template e is the following control / standard template e-1.
The primer set e is the following primer set e-1.

＜対照・標準用テンプレートｅ−１＞
好熱菌のゲノムＤＮＡ <Control / standard template e-1>
Genomic DNA of thermophiles

＜プライマーセットｅ−１＞
タングステン含有酸化還元酵素又はフェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡ領域を増幅するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセット。 <Primer set e-1>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying a genomic DNA region encoding a tungsten-containing oxidoreductase or ferredoxin oxidase.

タングステン含有酸化還元酵素遺伝子とフェレドキシンオキシダーゼ遺伝子は好熱菌特有の遺伝子である。そのため、本発明の検出対象である非結核性抗酸菌、結核菌と交差することが無い。 The tungsten-containing oxidoreductase gene and the ferredoxin oxidase gene are genes peculiar to thermophiles. Therefore, it does not intersect with the nontuberculous mycobacteria and tubercle bacilli that are the detection targets of the present invention.

本発明の好ましい形態では、前記プライマーセットｅ−１が下記プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３から選ばれるプライマーセットである。 In a preferred embodiment of the present invention, the primer set e-1 is a primer set selected from the following primer sets e-1-1 to e-1--3.

＜プライマーセットｅ−１−１＞
タングステン含有酸化還元酵素をコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットであり、
配列番号２３で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号２４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。 <Primer set e-1-1>
A primer set that targets genomic DNA encoding a tungsten-containing redox enzyme.
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 23,
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 24.

＜プライマーセットｅ−１−２＞
フェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットであり、
配列番号２５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号２６で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。 <Primer set e-1-2>
A set of primers that targets genomic DNA encoding ferredoxin oxidase.
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 25,
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 26.

＜プライマーセットｅ−１−３＞
フェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットであり、
配列番号２７で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号２８で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。 <Primer set e-1-3>
A set of primers that targets genomic DNA encoding ferredoxin oxidase.
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 27,
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 28.

本発明の好ましい形態では、さらに、前記プライマーセットによる増幅産物を検出するための検出用プローブを含む。 A preferred embodiment of the present invention further comprises a detection probe for detecting the amplification product of the primer set.

本発明の好ましい形態では、上記プライマーセットａ−１と下記プローブａとの組み合わせ、及び／又は、
上記プライマーセットｂ−１若しくは上記プライマーセットｃ−１と、下記プローブｂ／ｃとの組み合わせ、
を含む。 In a preferred embodiment of the present invention, the combination of the primer set a-1 and the probe a below and / or
A combination of the primer set b-1 or the primer set c-1 and the probe b / c below,
including.

＜プローブａ＞
配列番号２９又は配列番号３０で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むプローブ。 <Probe a>
A probe containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30 or a base sequence complementary thereto.

＜プローブｂ／ｃ＞
配列番号３１又は配列番号３２で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むプローブ。 <Probe b / c>
A probe containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 32 or a base sequence complementary thereto.

上述のプライマーセットとプローブの組合せを採用することで、検出対象であるＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．カンサシイ亜種を精度よく検出することができる。 By adopting the combination of the above-mentioned primer set and probe, MAC, M.M. Kansashii, M.D. Kansashii subspecies can be detected accurately.

本発明の好ましい形態では、さらに上記プライマーセットｄ−１と下記プローブｄとの組み合わせを含む。 A preferred embodiment of the present invention further comprises a combination of the primer set d-1 and the probe d below.

＜プローブｄ＞
配列番号３３又は配列番号３４で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むプローブ。 <Probe d>
A probe containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 34 or a base sequence complementary thereto.

このようにＭ．ツベルクローシスを検出するためのプライマーセット及びプローブの組合せを含む形態とすることで、よりＭ．ツベルクローシスと区別して、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ又はＭ．カンサシイ亜種を特異的に検出することの判断が可能となる。 In this way, M. By including a combination of a primer set and a probe for detecting tuberculosis, M.I. Distinguished from tuberculosis, MAC, M.I. Kansashii or M. It is possible to determine whether to specifically detect the Kansashii subspecies.

さらに上記対照・標準用テンプレートｅ−１と、上記プライマーセットｅ−１−２と、下記プローブｅとの組み合わせを含む。 Further, the combination of the control / standard template e-1, the primer set e-1-2, and the probe e below is included.

＜プローブｅ＞
配列番号３６で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むプローブ。 <Probe e>
A probe containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 36 or its complementary base sequence.

本発明は、上述のマイコバクテリウム属細菌検出用キットを使用して、マイコバクテリウム属細菌を検出する方法であって、
上記プライマーセットａ〜ｃから選ばれる１種以上のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程を含むことを特徴とする、マイコバクテリウム属細菌を検出する方法にも関する。 The present invention is a method for detecting a Mycobacterium genus using the above-mentioned Mycobacterium genus bacterium detection kit.
It also relates to a method for detecting a bacterium belonging to the genus Mycobacterium, which comprises a nucleic acid amplification step of performing a nucleic acid amplification reaction using one or more kinds of primer sets selected from the primer sets a to c.

本発明の好ましい形態では、前記核酸増幅工程において、
上記プライマーセットａ〜ｃの何れかによる核酸増幅反応と、
上記対照・標準用テンプレートｅを鋳型とする上記プライマーセットｅによる核酸増幅反応と、
を同一反応系において実行する。 In a preferred embodiment of the present invention, in the nucleic acid amplification step,
Nucleic acid amplification reaction by any of the above primer sets a to c,
Nucleic acid amplification reaction by the primer set e using the control / standard template e as a template,
Is carried out in the same reaction system.

このように内部標準となる核酸増幅反応と検出対象をターゲットとする核酸増幅反応を同一反応系（すなわちマルチプレックス）で実行する形態とすることで、簡易迅速な試験が可能となる。 By implementing the nucleic acid amplification reaction as an internal standard and the nucleic acid amplification reaction targeting the detection target in the same reaction system (that is, multiplex) in this way, a simple and rapid test becomes possible.

本発明によれば、結核菌と区別して検出することができることのみならず、ＭＡＣ、Ｍ．アビウム及びＭ．カンサシイ亜種のそれぞれを互いに区別して検出することが可能である。 According to the present invention, not only can it be detected separately from Mycobacterium tuberculosis, but also MAC, M. tuberculosis. Abium and M. avium. It is possible to detect each of the Kansashii subspecies separately from each other.

本発明に係るＭＡＣ検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ検出プライマーセット、及びＭ．ツベルクローシス検出プライマーセットを用いたＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。MAC detection primer set according to the present invention, M.D. Kansashii detection primer set, and M. It is a graph which shows the change of the Ct value when the DNA template concentration is changed in PCR using the tuber closis detection primer set. 本発明に係るＭＡＣ検出プライマーセットを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。It is a graph which shows the result of the cross-activity test using the MAC detection primer set which concerns on this invention. 本発明に係るＭ．カンサシイ検出プライマーセットを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。M.I. It is a graph which shows the result of the cross activity test using the Kansashii detection primer set. 本発明に係るＭ．ツベルクローシス検出プライマーセット用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。M.I. It is a graph which shows the result of the cross activity test using the tuber closis detection primer set. 本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットを用いたＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。M.I. It is a graph which shows the change of the Ct value at the time of changing the DNA template concentration in PCR using the Kansashii subspecies detection primer set. 本発明に係るＭ．カンサシイ検出プライマーセットを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。M.I. It is a graph which shows the result of the cross activity test using the Kansashii detection primer set. 本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットのうちのひとつを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。M.I. It is a graph which shows the result of the cross activity test using one of the Kansashii subspecies detection primer sets. 本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットのうちのひとつを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。M.I. It is a graph which shows the result of the cross activity test using one of the Kansashii subspecies detection primer sets. 本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットのうちのひとつを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。M.I. It is a graph which shows the result of the cross activity test using one of the Kansashii subspecies detection primer sets. 本発明に係る対照・標準用検出プライマーセットを用いたＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。It is a graph which shows the change of the Ct value when the DNA template concentration is changed in PCR using the control / standard detection primer set which concerns on this invention. 本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットのうちのひとつの、交差活性試験の結果を表すグラフである。M.I. It is a graph which shows the result of the cross activity test of one of the Kansashii subspecies detection primer sets. 本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットのうちのひとつの、交差活性試験の結果を表すグラフである。M.I. It is a graph which shows the result of the cross activity test of one of the Kansashii subspecies detection primer sets. 本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットのうちのひとつの、交差活性試験の結果を表すグラフである。M.I. It is a graph which shows the result of the cross activity test of one of the Kansashii subspecies detection primer sets. 本発明に係る対照・標準用検出プライマーセットを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。It is a graph which shows the result of the cross-activity test using the detection primer set for control and standard which concerns on this invention. 本発明に係るＭＡＣ検出プライマーセットとＭＡＣ検出プローブを用いたシングルプレックスＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。It is a graph which shows the change of the Ct value when the DNA template concentration is changed in the singleplex PCR using the MAC detection primer set and the MAC detection probe which concerns on this invention. 本発明に係るＭ．カンサシイ検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ亜種検出プライマーセット、及び、Ｍ．カンサシイ検出プローブを用いたシングルプレックスＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。M.I. Kansashii Detection Primer Set, M.D. Kansashii Subspecies Detection Primer Set and M.D. It is a graph which shows the change of the Ct value at the time of changing the DNA template concentration in the single plex PCR using the Kansashii detection probe. 本発明に係るＭ．カンサシイ検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ亜種検出プライマーセット、及び、Ｍ．カンサシイ検出プローブを用いたシングルプレックスＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。M.I. Kansashii Detection Primer Set, M.D. Kansashii Subspecies Detection Primer Set and M.D. It is a graph which shows the change of the Ct value at the time of changing the DNA template concentration in the single plex PCR using the Kansashii detection probe. 本発明に係る対照・標準用検出プライマーセットと対照・標準用検出プローブを用いたシングルプレックスＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。It is a graph which shows the change of the Ct value when the DNA template concentration is changed in the single-plex PCR using the control / standard detection primer set and the control / standard detection probe which concerns on this invention. 本発明に係るＭＡＣ検出プライマーセット、ＭＡＣ検出プローブ、対照・標準用検出プライマーセット、対照・標準用検出プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲにおける、ＦＡＭで検出した時の増幅曲線を表すグラフである。It is a graph which shows the amplification curve at the time of detection by FAM in the multiplex PCR using the MAC detection primer set, MAC detection probe, control / standard detection primer set, and control / standard detection probe which concerns on this invention. 本発明に係るＭＡＣ検出プライマーセット、ＭＡＣ検出プローブ、対照・標準用検出プライマーセット、対照・標準用検出プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲにおける、ＲＯＸで検出した時の増幅曲線を表すグラフである。It is a graph which shows the amplification curve at the time of detection by ROX in the multiplex PCR using the MAC detection primer set, MAC detection probe, control / standard detection primer set, and control / standard detection probe which concerns on this invention. 本発明に係るＭ．カンサシイ検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ亜種検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ検出プローブ、対照・標準用検出プライマーセット、及び対照・標準用検出プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲにおける、ＦＡＭで検出した時の増幅曲線を表すグラフである。M.I. Kansashii Detection Primer Set, M.D. Kansashii Subspecies Detection Primer Set, M.D. It is a graph which shows the amplification curve at the time of detection by FAM in the multiplex PCR using a Kansashii detection probe, a control / standard detection primer set, and a control / standard detection probe. 本発明に係るＭ．カンサシイ検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ亜種検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ検出プローブ、対照・標準用検出プライマーセット、及び対照・標準用検出プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲにおける、ＲＯＸで検出した時の増幅曲線を表すグラフである。M.I. Kansashii Detection Primer Set, M.D. Kansashii Subspecies Detection Primer Set, M.D. It is a graph which shows the amplification curve at the time of detection by ROX in the multiplex PCR using the Kansashii detection probe, the control / standard detection primer set, and the control / standard detection probe.

１．マイコバクテリウム属細菌検出用キット
発明者は、既存のＰＣＲ法やＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの手法によって、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーエ及びＭ．カンサシイに分類されている菌株を複数種入手し、それぞれの菌株についてＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒ）領域の塩基配列を解析した。 1. 1. Kit for detecting Mycobacterium spp. The inventor used the existing PCR method, DNA-DNA hybridization, and other methods to obtain M. coli. Abium, M. avium. Intracellular and M. A plurality of strains classified as Kansashii were obtained, and the nucleotide sequence of the ITS (Internal Transcripted spacer) region was analyzed for each strain.

その結果、既存のＰＣＲ法やＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの手法によって同種に分類されている菌株であっても、ＩＴＳ領域には多数の変異が存在することがわかった。変異箇所ごとにＩＴＳ領域の配列を分類すると、Ｍ．アビウムは４種類、Ｍ．イントラセルラーエは１１種類に分類することができた。 As a result, it was found that there are many mutations in the ITS region even in the strains classified into the same species by the existing PCR method or DNA-DNA hybridization method. When the sequence of the ITS region is classified according to the mutation site, M. There are four types of Avium, M. avium. Intracellulare could be classified into 11 types.

さらに、同法によってＭ．カンサシイとして分類されていた菌株は、ＩＴＳ領域の配列に基づいて５種類に分類することができた。そして、最も多くの菌株が有していた１種のＩＴＳ領域の配列と、他の４種類のＩＴＳ領域の配列は大きく異なっていた。詳細な解析の結果、当該４種のＩＴＳ領域の配列を有する菌は、Ｍ．カンサシイに分類されるべきものではなく、いわばＭ．カンサシイ亜種というべきものであることが判明した。 Furthermore, according to the same method, M. The strains classified as Kansashii could be classified into 5 types based on the sequence of the ITS region. The sequences of one type of ITS region possessed by the most strains and the sequences of the other four types of ITS regions were significantly different. As a result of detailed analysis, the bacteria having the sequences of the four ITS regions were found to be M. et al. It should not be classified as Kansashii, so to speak, M. It turned out to be a Kansashii subspecies.

本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットの必須要素であるプライマーセットａ〜ｃは、以上の知見に基づき設計されたプライマーセットであり、１６ＳｒＲＮＡと２３ｓｒＲＮＡの間のスペーサー部分の領域に位置する、ＩＴＳ領域を標的とする。ＩＴＳ領域は、種間の多型性が高いため、ＩＴＳ領域を標的とすることにより、正確に菌種を同定することができる。 Primer sets a to c, which are essential elements of the kit for detecting Mycobacterium of the present invention, are primer sets designed based on the above findings, and are located in the region of the spacer portion between 16S rRNA and 23s rRNA. Target the ITS region. Since the ITS region is highly polymorphic between species, it is possible to accurately identify the bacterial species by targeting the ITS region.

（１）プライマー
本発明は必須要素としてプライマーセットａ〜ｃを含む。また、任意にプライマーセットｄを含む形態としてもよい。以下、それぞれのプライマーセットについて詳細に説明する。 (1) Primers The present invention includes primer sets a to c as essential elements. Moreover, you may optionally include the primer set d. Hereinafter, each primer set will be described in detail.

（１−１）プライマーセットａ
上述の通り、変異箇所ごとにＩＴＳ領域の配列を分類すると、Ｍ．アビウムは４種類、Ｍ．イントラセルラーエは１１種類、合計１５種類に分類することができる。Ｍ．アビウムとＭ．イントラセルラーエを区別することなく、ＭＡＣとしてまとめて検出するためには、ＩＴＳ領域の変異の影響を大きく受けず、前記合計１５種類のＩＴＳ領域を増幅することができるプライマーセットを設計する必要がある。 (1-1) Primer set a
As described above, when the sequences of the ITS region are classified according to the mutation sites, M.I. There are four types of Avium, M. avium. Intracellulare can be classified into 11 types, 15 types in total. M. Avium and M. avium. In order to collectively detect intracellular as a MAC without distinguishing them, it is necessary to design a primer set that is not significantly affected by mutations in the ITS region and can amplify the total of 15 types of ITS regions. is there.

さらには、ＭＡＣを特異的に検出するためには、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種と交差性を示さないプライマーセットを設計する必要がある。 Furthermore, in order to specifically detect MAC, M. tuberculosis (M. tuberculosis), M. tuberculosis. Kansashii and M.M. It is necessary to design a primer set that does not show cross-reactivity with the Kansashii subspecies.

このような条件を充足するプライマーセットを設計するため、上記合計１５種類のＩＴＳ領域の配列間で相同性が高く（つまり変異の数が少なく）、かつ、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．カンサシイ亜種のＩＴＳ領域の配列と相同性が低い領域を調査した。その結果、配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列が見出された。 In order to design a primer set that satisfies these conditions, the homology between the sequences of the above 15 types of ITS regions is high (that is, the number of mutations is small), and M. tuberculosis (M. tuberculosis). M. Kansashii, M.D. Regions with low homology to the sequence of the ITS region of the Kansashii subspecies were investigated. As a result, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 was found.

プライマーセットａは、ＭＡＣを検出するためのものであり、これら配列をターゲットとするプライマーセットである。つまり、プライマーセットａを構成するフォワードプライマーとリバースプライマーは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする。
プライマーセットａによれば、Ｍ．ツベルクローシス、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種と交差することなく、かつ、株間に存在する変異に左右されることなくＭＡＣをまとめて検出することができる。 The primer set a is for detecting MAC, and is a primer set that targets these sequences. That is, the forward primer and the reverse primer constituting the primer set a are annealed to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a base sequence complementary thereto.
According to the primer set a, M. Tubercrosis, M. et al. Kansashii and M.M. MACs can be detected collectively without crossing the Kansashii subspecies and without being influenced by mutations existing between strains.

配列番号１〜３で表される塩基配列において、「ｎ」で表される塩基は、上記合計１５種類のＩＴＳ領域の配列間で完全一致しない（つまり変異のある）塩基である。
つまり、プライマーセットａを具体的に設計する場合、フォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれは、配列番号１〜３で表される塩基配列において、「ｎ」をなるべく含まない領域の塩基配列又はその相補的な塩基配列にアニールするように設計することが好ましい。 In the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 3, the base represented by "n" is a base that does not completely match (that is, has a mutation) among the sequences of the above 15 types of ITS regions in total.
That is, when the primer set a is specifically designed, each of the forward primer and the reverse primer is a base sequence of a region containing as little "n" as possible in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 or complementary thereto. It is preferable to design so as to anneal to a proper base sequence.

具体的には、フォワードプライマー及びリバースプライマーがアニールする塩基配列のうち、「ｎ」が占める割合が、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下とすることが好ましい。
特に好ましくは、配列番号１〜３で表される塩基配列において、「ｎ」を含まない領域の塩基配列又はその相補的な塩基配列にアニールするようにフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計することが好ましい。 Specifically, the proportion of "n" in the base sequence to which the forward primer and the reverse primer are annealed is preferably 50% or less, more preferably 40% or less, more preferably 30% or less, still more preferably 20. % Or less, more preferably 10% or less, still more preferably 5% or less.
Particularly preferably, the forward primer and the reverse primer are designed so as to anneal to the base sequence of the region not containing "n" or the complementary base sequence thereof in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 3. ..

プライマーセットａを構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上とすることが好ましい。 The forward primer and the reverse primer constituting the primer set a are preferably 10 bases or more, more preferably 15 bases or more, and further preferably 18 bases or more, respectively.

プライマーセットａの具体的な態様として、プライマーセットａ−１を挙げることができる。 As a specific embodiment of the primer set a, the primer set a-1 can be mentioned.

プライマーセットａ―１を構成するフォワードプライマーは、配列番号４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。 The forward primer constituting the primer set a-1 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, preferably 15 bases or more, and more preferably 18 bases or more.

また、プライマーセットａ―１を構成するリバースプライマーは、配列番号５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。 The reverse primer constituting the primer set a-1 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, preferably 15 bases or more, and more preferably 18 bases or more.

（１−２）プライマーセットｂ
上述の通り、既存のＰＣＲ法やＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの手法によってＭ．カンサシイとして分類されていたものであっても、変異箇所ごとにＩＴＳ領域の配列を分類すると４種に分類することができた。このうち、１種はＭ．カンサシイと分類することが妥当であるが、残りの３種はＭ．カンサシイ亜種に分類するべきものであった。
このことから、Ｍ．カンサシイを特異的に検出するに当たっては、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）やＭＡＣと交差しないことはもとより、Ｍ．カンサシイ亜種とも交差しないプライマーセットを設計する必要がある。 (1-2) Primer set b
As described above, M.I. is used by existing methods such as PCR method and DNA-DNA hybridization. Even if it was classified as Kansashii, it was possible to classify it into four types by classifying the sequence of the ITS region for each mutation site. Of these, one is M.I. It is appropriate to classify it as Kansashii, but the remaining three species are M. It should have been classified as a Kansashii subspecies.
From this, M.M. In the specific detection of Kansashii, not only does it not intersect with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) or MAC, but also M. tuberculosis. It is necessary to design a primer set that does not intersect with the Kansashii subspecies.

このような条件を充足するプライマーセットを設計するため、Ｍ．カンサシイのＩＴＳ領域のうち、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ亜種のＩＴＳ領域の配列と相同性が低い領域を調査した。その結果、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列が見出された。 In order to design a primer set that satisfies these conditions, M.D. Among the ITS regions of Kansashii, Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), MAC, M. tuberculosis. Regions with low homology to the sequence of the ITS region of the Kansashii subspecies were investigated. As a result, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 was found.

プライマーセットｂは、Ｍ．カンサシイを検出するためのものであり、これら配列をターゲットとするプライマーセットである。つまり、プライマーセットｂを構成するフォワードプライマーとリバースプライマーは、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする。
プライマーセットｂによれば、Ｍ．ツベルクローシス、ＭＡＣ及びＭ．カンサシイ亜種と交差することなく、Ｍ．カンサシイを検出することができる。 Primer set b is M.I. It is a primer set for detecting Kansashii and targeting these sequences. That is, the forward primer and the reverse primer constituting the primer set b are annealed to the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 or a base sequence complementary thereto.
According to primer set b, M. Tubel closis, MAC and M. Without crossing the Kansashii subspecies, M. Kansashii can be detected.

プライマーセットｂを構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上とすることが好ましい。 The forward primer and the reverse primer constituting the primer set b are preferably 10 bases or more, more preferably 15 bases or more, and further preferably 18 bases or more, respectively.

プライマーセットｂの具体的な態様として、プライマーセットｂ−１を挙げることができる。 As a specific embodiment of the primer set b, the primer set b-1 can be mentioned.

プライマーセットｂ―１を構成するフォワードプライマーは、配列番号９で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。 The forward primer constituting the primer set b-1 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, preferably 15 bases or more, and more preferably 18 bases or more.

また、プライマーセットｂ―１を構成するリバースプライマーは、配列番号１０で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。 The reverse primer constituting the primer set b-1 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, preferably 15 bases or more, and more preferably 18 bases or more.

（１−３）プライマーセットｃ
上述の通り、既存のＰＣＲ法やＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの手法によってＭ．カンサシイとして分類されていたものであっても、変異箇所ごとにＩＴＳ領域の配列を分類すると５種に分類することができた。このうち、１種はＭ．カンサシイと分類することが妥当であるが、残りの４種はＭ．カンサシイ亜種に分類するべきものであった。
このことから、Ｍ．カンサシイ亜種を特異的に検出するに当たっては、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）やＭＡＣと交差しないことはもとより、Ｍ．カンサシイとも交差しないプライマーセットを設計する必要がある。 (1-3) Primer set c
As described above, M.I. is used by existing methods such as PCR method and DNA-DNA hybridization. Even if it was classified as Kansashii, it was possible to classify it into 5 types by classifying the sequence of the ITS region for each mutation site. Of these, one is M.I. It is appropriate to classify it as Kansashii, but the remaining four species are M. It should have been classified as a Kansashii subspecies.
From this, M.M. In the specific detection of the Kansashii subspecies, not only does it not intersect with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) or MAC, but also M. tuberculosis. It is necessary to design a primer set that does not intersect with Kansashii.

このような条件を充足するプライマーセットを設計するため、Ｍ．カンサシイ亜種のＩＴＳ領域のうち、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイのＩＴＳ領域の配列と相同性が低い領域を調査した。その結果、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３で表される塩基配列が見出された。 In order to design a primer set that satisfies these conditions, M.D. Among the ITS regions of the Kansashii subspecies, Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), MAC, M. tuberculosis. A region having low homology with the sequence of the ITS region of Kansashii was investigated. As a result, the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 was found.

プライマーセットｃは、Ｍ．カンサシイ亜種を検出するためのものであり、これら配列をターゲットとするプライマーセットである。つまり、プライマーセットｃを構成するフォワードプライマーとリバースプライマーは、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする。
プライマーセットｃによれば、Ｍ．ツベルクローシス、ＭＡＣ及びＭ．カンサシイと交差することなく、Ｍ．カンサシイ亜種を検出することができる。 Primer set c is M.I. It is a primer set for detecting Kansashii subspecies and targeting these sequences. That is, the forward primer and the reverse primer constituting the primer set c are annealed to the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 or a base sequence complementary thereto.
According to the primer set c, M. Tubel closis, MAC and M. Without crossing Kansashii, M. Kansashii subspecies can be detected.

配列番号１１〜１３で表される塩基配列において、「ｎ」で表される塩基は、上記合計４種類のＩＴＳ領域の配列間で完全一致しない（つまり変異のある）塩基である。
つまり、プライマーセットｃを具体的に設計する場合、フォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれは、配列番号１１〜１３で表される塩基配列において、「ｎ」をなるべく含まない領域の塩基配列又はその相補的な塩基配列にアニールするように設計することが好ましい。 In the base sequences represented by SEQ ID NOs: 11 to 13, the base represented by "n" is a base that does not completely match (that is, has a mutation) among the sequences of the above four types of ITS regions.
That is, when the primer set c is specifically designed, each of the forward primer and the reverse primer is a base sequence of a region containing as little "n" as possible in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 11 to 13, or a complement thereof. It is preferable to design so as to anneal to a proper base sequence.

具体的には、フォワードプライマー及びリバースプライマーがアニールする塩基配列のうち、「ｎ」が占める割合が、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下とすることが好ましい。
特に好ましくは、配列番号１１〜１３で表される塩基配列において、「ｎ」を含まない領域の塩基配列又はその相補的な塩基配列にアニールするようにフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計することが好ましい。 Specifically, the proportion of "n" in the base sequence to which the forward primer and the reverse primer are annealed is preferably 50% or less, more preferably 40% or less, more preferably 30% or less, still more preferably 20. % Or less, more preferably 10% or less, still more preferably 5% or less.
Particularly preferably, the forward primer and the reverse primer are designed so as to anneal to the base sequence of the region not containing "n" or the complementary base sequence thereof in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 11 to 13. ..

プライマーセットｃを構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上とすることが好ましい。 The forward primer and the reverse primer constituting the primer set c are preferably 10 bases or more, more preferably 15 bases or more, and further preferably 18 bases or more, respectively.

プライマーセットｃの具体的な態様として、プライマーセットｃ−１を挙げることができる。プライマーセットｃ−１は、以下のプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３から選ばれる。 As a specific embodiment of the primer set c, the primer set c-1 can be mentioned. The primer set c-1 is selected from the following primer sets c-1-1 to c-1--3.

プライマーセットｃ―１−１を構成するフォワードプライマーは、配列番号１４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
これに対応する、プライマーセットｃ―１−１を構成するリバースプライマーは、配列番号１５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。 The forward primer constituting the primer set c-1-1 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, preferably 15 bases or more, and more preferably 18 bases or more.
Correspondingly, the reverse primer constituting the primer set c-1-1 contains at least 10 consecutive bases, preferably 15 bases or more, more preferably 18 bases or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15.

プライマーセットｃ―１−２を構成するフォワードプライマーは、配列番号１６で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
これに対応する、プライマーセットｃ―１−１を構成するリバースプライマーは、配列番号１５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。 The forward primer constituting the primer set c-1-2 contains at least 10 consecutive bases, preferably 15 bases or more, and more preferably 18 bases or more in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16.
Correspondingly, the reverse primer constituting the primer set c-1-1 contains at least 10 consecutive bases, preferably 15 bases or more, more preferably 18 bases or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15.

プライマーセットｃ―１−３を構成するフォワードプライマーは、配列番号１７で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
これに対応する、プライマーセットｃ―１−３を構成するリバースプライマーは、配列番号１０で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。 The forward primer constituting the primer set c-1-3 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 17, preferably 15 bases or more, and more preferably 18 bases or more.
Correspondingly, the reverse primer constituting the primer set c-1-3 contains at least 10 consecutive bases, preferably 15 bases or more, more preferably 18 bases or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.

（１−４）プライマーセットｄ
本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットは、Ｍ．ツベルクローシスを検出するためのプライマーセットｄを含む形態としてもよい。
発明者は、Ｍ．ツベルクローシスのＩＴＳ領域の配列を解析し、Ｍ．ツベルクローシスを核酸増幅により特異的に検出可能であり、かつ、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種と相同性が低い（すなわち交差する可能性が低い）配列として、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０で表される塩基配列を同定した。 (1-4) Primer set d
The kit for detecting Mycobacterium of the present invention is described in M. It may be in the form of containing a primer set d for detecting tuberculosis.
The inventor is M.D. The sequence of the ITS region of Tubelcrosis was analyzed, and M. Tuber closis can be specifically detected by nucleic acid amplification, and MAC, M. et al. Kansashii and M.M. The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20 was identified as a sequence having low homology (that is, unlikely to intersect) with the Kansashii subspecies.

プライマーセットｄは、これら塩基配列にアニールするプライマーセットであり、Ｍ．ツベルクローシスのＩＴＳ領域の一部を特異的に増幅することができるものである。 Primer set d is a primer set that anneals to these base sequences. It is possible to specifically amplify a part of the ITS region of Tubercrosis.

プライマーセットｄをプライマーセットａ〜ｃの何れかと併用して核酸増幅することによって、検査対象に含まれる菌が、結核菌と非結核性抗酸菌の何れであるのかを精度よく判断することができる。 By using the primer set d in combination with any of the primer sets a to c to amplify the nucleic acid, it is possible to accurately determine whether the bacteria contained in the test target are tubercle bacilli or nontuberculous mycobacteria. it can.

プライマーセットｄとしては、以下のプライマーセットｄ−１を用いることが好ましい。プライマーセットｄ−１はＭ．ツベルクローシスのＩＴＳ領域に対する特異性が特に高いため、非結核性抗酸菌と交差することなく、Ｍ．ツベルクローシスを検出することを可能にする。 As the primer set d, it is preferable to use the following primer set d-1. Primer set d-1 is M.I. Due to the particularly high specificity of tuberculosis to the ITS region, M. tuberculosis did not intersect with nontuberculous mycobacteria. Allows detection of tuber closis.

プライマーセットｄ−１を構成するフォワードプライマーは、配列番号２１で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上の配列を含む。 The forward primer constituting the primer set d-1 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 21, more preferably 15 bases or more, still more preferably 18 bases or more.

プライマーセットｄ−１を構成するリバースプライマーは、配列番号２２で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上の配列を含む。 The reverse primer constituting the primer set d-1 contains a sequence of at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 22, more preferably 15 bases or more, still more preferably 18 bases or more.

（２）対照・標準
本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットは、核酸増幅反応のポジティブコントロール又は内部標準とするためのテンプレートＤＮＡとプライマーセットを備えていることが好ましい。これにより上記プライマーセットによる核酸増幅反応が正常に作動していることを確認するためのポジティブコントロールや、内部標準を置くことができる。 (2) Control / Standard The kit for detecting Mycobacterium spp. Of the present invention preferably includes a template DNA and a primer set for positive control of nucleic acid amplification reaction or as an internal standard. This makes it possible to set a positive control or an internal standard for confirming that the nucleic acid amplification reaction by the above primer set is operating normally.

標準のためのテンプレートＤＮＡとプライマーセットの組合せとしては、以下の対照・標準用テンプレートｅと下記プライマーセットｅとの組み合わせが好ましい。
このテンプレートＤＮＡとプライマーセットの組合せを使用することで、標準に係る核酸増幅反応について、検出対象である非結核性抗酸菌及び結核菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとする増幅反応への影響を抑制することができる。また、対照・標準用テンプレートと検出用テンプレートの増幅反応において、互いの反応に対しての交差反応を防ぐことができる。 As the combination of the template DNA and the primer set for the standard, the combination of the following control / standard template e and the following primer set e is preferable.
By using this combination of template DNA and primer set, it is possible to suppress the influence of the standard nucleic acid amplification reaction on the amplification reaction using the nontuberculous mycobacteria and tubercle bacillus genomic DNA as templates. Can be done. In addition, in the amplification reaction of the control / standard template and the detection template, it is possible to prevent cross-reaction with respect to each other's reaction.

対照・標準用テンプレートｅは、結核菌及び非結核性抗酸菌のゲノムＤＮＡの塩基配列には含まれない、特有の塩基配列を有するテンプレートＤＮＡである。 The control / standard template e is a template DNA having a unique base sequence that is not included in the base sequences of the genomic DNAs of Mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacteria.

そしてプライマーセットｅは、上述した対照・標準用テンプレートｅに特有の塩基配列を増幅するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセットである。 The primer set e is a primer set composed of a forward primer and a reverse primer for amplifying the base sequence peculiar to the control / standard template e described above.

対照・標準用テンプレートｅとしては、結核菌及び非結核性抗酸菌とは別種である特定の動物種のゲノムＤＮＡであり、かつ、当該動物種に特有のタンパク質をコードしているものが好ましい。
この場合、プライマーセットｅは、上述の特有のタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ領域を標的とするプライマーセットであることが好ましい。 The control / standard template e is preferably genomic DNA of a specific animal species different from M. tuberculosis and nontuberculous mycobacteria, and which encodes a protein specific to the animal species. ..
In this case, the primer set e is preferably a primer set that targets the genomic DNA region encoding the above-mentioned specific protein.

テンプレートＤＮＡとプライマーセットの組合せのより好ましい態様として、以下の対照・標準用テンプレートｅ−１と以下のプライマーセットｅ−１との組み合わせを挙げることができる。 As a more preferable aspect of the combination of the template DNA and the primer set, the combination of the following control / standard template e-1 and the following primer set e-1 can be mentioned.

対照・標準用テンプレートｅ−１は好熱菌ゲノムＤＮＡである。
また、プライマーセットｅ−１は、好熱菌に特有のタンパク質であるタングステン含有酸化還元酵素又はフェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡ領域を増幅するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセットである。 The control / standard template e-1 is a thermophile genomic DNA.
Further, the primer set e-1 is a primer set composed of a forward primer and a reverse primer for amplifying a genomic DNA region encoding a tungsten-containing oxidoreductase or ferredoxin oxidase, which is a protein peculiar to thermophiles.

プライマーセットｅ−１のより好ましい形態として、プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３を挙げることができる。 As a more preferable form of the primer set e-1, primer sets e1-1 to e-1-3 can be mentioned.

プライマーセットｅ−１−１は、タングステン含有酸化還元酵素をコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットである。
プライマーセットｅ−１−１を構成するフォワードプライマーは、配列番号２３で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含む。
また、プライマーセットｅ−１−１を構成するリバースプライマーは、配列番号２４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含む。 Primer set e-1-1 is a primer set that targets genomic DNA encoding a tungsten-containing oxidoreductase.
The forward primer constituting the primer set e-1-1 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 23, more preferably 15 bases or more, still more preferably 18 bases or more.
The reverse primer constituting the primer set e-1-1 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 24, more preferably 15 bases or more, and further preferably 18 bases or more.

プライマーセットｅ−１−２は、フェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットである。
プライマーセットｅ−１−２を構成するフォワードプライマーは、配列番号２５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含む。
また、プライマーセットｅ−１−２を構成するリバースプライマーは、配列番号２６で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含む。 Primer set e-1-2 is a primer set that targets genomic DNA encoding ferredoxin oxidase.
The forward primer constituting the primer set e-1-2 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 25, more preferably 15 bases or more, still more preferably 18 bases or more.
The reverse primer constituting the primer set e-1-2 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 26, more preferably 15 bases or more, and further preferably 18 bases or more.

プライマーセットｅ−１−３は、フェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットである。
プライマーセットｅ−１−３を構成するフォワードプライマーは、配列番号２７で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含む。
また、プライマーセットｅ−１−３を構成するリバースプライマーは、配列番号２８で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含む。 Primer set e-1-3 is a primer set that targets genomic DNA encoding ferredoxin oxidase.
The forward primer constituting the primer set e-1-3 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 27, more preferably 15 bases or more, still more preferably 18 bases or more.
The reverse primer constituting the primer set e-1-3 contains at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 28, more preferably 15 bases or more, and further preferably 18 bases or more.

なお、上記いずれのプライマーも、公知の方法で設計、合成することができる。
また、上記プライマーは、標識物質で標識されていてもよい。標識物質は、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなどの公知の標識物質を用いることができる。標識方法は、使用する標識物質に合わせて、公知の方法を適宜選択することができる。 Any of the above primers can be designed and synthesized by a known method.
Moreover, the above-mentioned primer may be labeled with a labeling substance. As the labeling substance, known labeling substances such as radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, and biotin can be used. As the labeling method, a known method can be appropriately selected according to the labeling substance to be used.

（３）プローブ
本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットによる核酸増幅反応の検出手段は限定されず、インターカレーター法やプローブ法などを制限なく採用することができる。
本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットによる核酸増幅反応をマルチプレックス反応系で実行する場合には、プローブ法により核酸増幅反応を検出することが好ましい。
そのため、本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットは、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を検出するための検出用プローブを含むことが好ましい。 (3) Probe The means for detecting the nucleic acid amplification reaction by the kit for detecting Mycobacterium of the present invention is not limited, and an intercalator method, a probe method, or the like can be adopted without limitation.
When the nucleic acid amplification reaction by the kit for detecting Mycobacterium of the present invention is carried out in a multiplex reaction system, it is preferable to detect the nucleic acid amplification reaction by the probe method.
Therefore, it is preferable that the kit for detecting Mycobacterium spp. Of the present invention includes a detection probe for detecting a nucleic acid amplification reaction by the primer set.

検出用プローブは、上述したプライマーセットによる核酸増幅反応を検出することができれば、配列は特に制限されない。以下、各プライマーセットを用いる場合に最適なプローブについて具体的に説明する。 The sequence of the detection probe is not particularly limited as long as it can detect the nucleic acid amplification reaction by the above-mentioned primer set. Hereinafter, the optimum probe when each primer set is used will be specifically described.

上記プライマーセットａ−１による核酸増幅反応を検出するためには、下記プローブａを採用することが好ましい。
プローブａは、配列番号２９又は配列番号３０で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含むプローブである。 In order to detect the nucleic acid amplification reaction by the primer set a-1, it is preferable to use the probe a below.
The probe a is a probe containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30 or its complementary base sequence, more preferably 15 bases or more, still more preferably 18 bases or more.

また、上記プライマーセットｂ−１若しくは上記プライマーセットｃ−１による核酸増幅反応を検出するためには、下記プローブｂ／ｃを採用することが好ましい。
プローブｂ／ｃは、配列番号３１又は配列番号３２で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含むプローブである。 Further, in order to detect the nucleic acid amplification reaction by the primer set b-1 or the primer set c-1, it is preferable to use the following probe b / c.
The probe b / c is a probe containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 32 or a complementary base sequence thereof, more preferably 15 bases or more, still more preferably 18 bases or more. is there.

また、上記プライマーセットｄ−１による核酸増幅反応を検出するためには、下記プローブｄを採用することが好ましい。
プローブｄは、配列番号３３又は配列番号３４で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含むプローブである。 Further, in order to detect the nucleic acid amplification reaction by the primer set d-1, it is preferable to use the probe d below.
The probe d is a probe containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 34 or a base sequence complementary thereto, more preferably 15 bases or more, still more preferably 18 bases or more.

また、上記プライマーセットｅ−１による核酸増幅反応を検出するためには、下記プローブｅを採用することが好ましい。
プローブｅは、配列番号３６で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含むプローブである。 Further, in order to detect the nucleic acid amplification reaction by the primer set e-1, it is preferable to use the probe e below.
The probe e is a probe containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 36 or a base sequence complementary thereto, more preferably 15 bases or more, still more preferably 18 bases or more.

上記いずれのプローブも、公知の方法で設計、合成することができる。
核酸増幅反応を検出ために必要なプローブへの修飾は公知のものを制限なく採用することができる。より具体的には、５´末端に蛍光物質、３´末端にクエンチャーを修飾する形態にあっては、蛍光物質とクエンチャーの組合せは公知のものを制限なく採用することができる。
蛍光標識物質としては、例えば、多くのリアルタイムＰＣＲ装置に内蔵されている、蛍光検出用フィルターに対応する、フルオレセイン（ＦＡＭ検出用フィルターに対応）や、ローダミン、ＪＵＮ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）、ＣＡＬＦｌｕｏｒＲｅｄ６１０（ＬＧＣバイオリサーチテクノロジーズ社）（いずれもＲＯＸ検出用フィルターに対応）を使用することができる。クエンチャーとしては、例えば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）クエンチャーやＢＨＱ（登録商標）クエンチャーなどが挙げられる。 Any of the above probes can be designed and synthesized by a known method.
As the modification to the probe required for detecting the nucleic acid amplification reaction, known ones can be adopted without limitation. More specifically, in the form of modifying the fluorescent substance at the 5'end and the quencher at the 3'end, a known combination of the fluorescent substance and the quencher can be adopted without limitation.
Examples of the fluorescent labeling substance include fluorescein (corresponding to the filter for FAM detection), rhodamine, and JUN (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), which are built in many real-time PCR devices and correspond to the filter for fluorescence detection. ), CAL Fluor Red 610 (LGC Bioresearch Technologies, Inc.) (both are compatible with ROX detection filters) can be used. Examples of the quencher include a Taqman (registered trademark) quencher and a BHQ (registered trademark) quencher.

（４）その他
本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットは、上述のプライマーセット、プローブ及び対照・標準用テンプレートの他に、例えばポリメラーゼ、バッファー、ｄＮＴＰ、純水などを含んでいても良い。 (4) Others The kit for detecting Mycobacterium spp. Of the present invention may contain, for example, polymerase, buffer, dNTP, pure water, etc., in addition to the above-mentioned primer set, probe, and control / standard template.

２．マイコバクテリウム属細菌検出方法
本発明のマイコバクテリウム属菌検出方法は、上述のマイコバクテリウム属細菌検出用キットを利用した検出方法である。 2. 2. Mycobacterium genus detection method The Mycobacterium genus detection method of the present invention is a detection method using the above-mentioned Mycobacterium bacterium detection kit.

本発明の検出方法は、上記プライマーセットａ〜ｃの何れか１種以上、より好ましくは２種以上、さらに好ましくは３種を用いて、核酸増幅反応を行う核酸増幅工程を含む。
本発明においては、上記プライマーセットｄを用いて、核酸増幅反応を行う核酸増幅工程を含んでいても良い。
また、ポジティブコントロール又は内部標準のために、対照・標準用テンプレートｅを鋳型としてプライマーセットｅを用いて、核酸増幅反応を行う核酸増幅工程を含んでいても良い。 The detection method of the present invention includes a nucleic acid amplification step of carrying out a nucleic acid amplification reaction using any one or more of the above primer sets a to c, more preferably two or more, and even more preferably three.
In the present invention, a nucleic acid amplification step of performing a nucleic acid amplification reaction using the primer set d may be included.
Further, for positive control or internal standard, a nucleic acid amplification step of carrying out a nucleic acid amplification reaction using a primer set e using a control / standard template e as a template may be included.

核酸増幅反応としては、ＰＣＲ法及びその変法（リアルタイムＰＣＲ法など）を際限なく採用することができる。反応系における各成分の濃度やサーマルサイクルのプログラムなど、核酸増幅反応の条件は限定されず、公知の方法により適宜設計することができる。 As the nucleic acid amplification reaction, a PCR method and a modified method thereof (real-time PCR method, etc.) can be adopted endlessly. The conditions of the nucleic acid amplification reaction, such as the concentration of each component in the reaction system and the program of the thermal cycle, are not limited, and can be appropriately designed by a known method.

核酸増幅工程において核酸増幅反応が生じたことの確認方法は特に制限されない。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供し、所望の長さの増幅産物が生じていることを確認する方法を採用してもよい。
中でもインターカレーター法やプローブ法により核酸増幅反応をリアルタイムに検出するリアルタイムＰＣＲ法を採用することが好ましい。 The method for confirming that the nucleic acid amplification reaction has occurred in the nucleic acid amplification step is not particularly limited. A method may be adopted in which the amplification product is subjected to agarose gel electrophoresis to confirm that an amplification product of a desired length is produced.
Above all, it is preferable to adopt a real-time PCR method that detects a nucleic acid amplification reaction in real time by an intercalator method or a probe method.

核酸増幅工程は、一つの反応系で一つの標的配列を増幅するシングルプレックスＰＣＲであってもよいし、一つの反応系で２つ以上の標的配列を増幅するマルチプレックスＰＣＲであってもよい。
本発明で用いるプライマーセットは、いずれもその対象とする菌種以外の菌種に交差せず、特異性が高いため、マルチプレックスＰＣＲとすることが好ましい。より好ましくは、高い特異性を保証し、また、非特異増幅の検出を抑制することができることから、プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲとする。
なお、本発明において、「マルチプレックス」とは、２種類の波長を読み取って検出する反応系のことを指す。また「シングルプレックス」とは、１種類の波長を読み取って検出する反応系のことを指す。 The nucleic acid amplification step may be a single-plex PCR that amplifies one target sequence in one reaction system, or a multiplex PCR that amplifies two or more target sequences in one reaction system.
The primer sets used in the present invention do not intersect with bacterial species other than the target bacterial species and have high specificity. Therefore, it is preferable to use multiplex PCR. More preferably, multiplex PCR using a probe is used because it guarantees high specificity and can suppress the detection of non-specific amplification.
In the present invention, "multiplex" refers to a reaction system that reads and detects two types of wavelengths. Further, the "single plex" refers to a reaction system that reads and detects one type of wavelength.

マルチプレックスＰＣＲとする場合にはプローブ法を採用することが好ましい。この場合、同一反応系で生じる２種以上の核酸増幅反応を区別して検出できるように、プローブに修飾する蛍光物質の蛍光波長が重複しないように調整する。
マルチプレックスＰＣＲとする場合には、例えば、以下のような形態とすることが好ましい。 In the case of multiplex PCR, it is preferable to adopt the probe method. In this case, the fluorescence wavelengths of the fluorescent substances modified in the probe are adjusted so as not to overlap so that two or more types of nucleic acid amplification reactions occurring in the same reaction system can be detected separately.
In the case of multiplex PCR, for example, the following form is preferable.

プライマーセットａ〜ｃの何れか１種以上、より好ましくは２種以上、さらに好ましくは３種以上による核酸増幅反応と、対照・標準用テンプレートｅを鋳型としてプライマーセットｅを用いた核酸増幅反応と、を同一反応系で行う形態としてもよい。
プライマーセットｅによる核酸増幅反応は内部標準として働くため、プライマーセットａ〜ｃの何れかによる核酸増幅反応が正常に動作していることを精度よく判別することができる。 Nucleic acid amplification reaction using any one or more of primer sets a to c, more preferably two or more, still more preferably three or more, and a nucleic acid amplification reaction using a primer set e using a control / standard template e as a template. , May be carried out in the same reaction system.
Since the nucleic acid amplification reaction by the primer set e acts as an internal standard, it is possible to accurately determine that the nucleic acid amplification reaction by any of the primer sets a to c is operating normally.

ＭＡＣを検出するためのプライマーセットａと、Ｍ．カンサシイを検出するためのプライマーセットｂと、による核酸増幅反応を同一の反応系で実行する形態とすることが好ましい。
この形態であれば、検査試料にＭＡＣとＭ．カンサシイの何れが含まれているのかを同一反応系で判別することができる。 Primer set a for detecting MAC and M.I. It is preferable that the nucleic acid amplification reaction by the primer set b for detecting Kansashii is carried out in the same reaction system.
In this form, MAC and M.M. It is possible to determine which of the Kansashii is contained in the same reaction system.

プライマーセットａとプライマーセットｂによる核酸増幅反応に加え、対照・標準用テンプレートｅを鋳型としてプライマーセットｅを用いた核酸増幅反応も同一反応系で実行する形態（トリプレックスＰＣＲ）としても良い。 In addition to the nucleic acid amplification reaction by the primer set a and the primer set b, the nucleic acid amplification reaction using the primer set e using the control / standard template e as a template may be executed in the same reaction system (triple PCR).

Ｍ．カンサシイを検出するためのプライマーセットｂと、Ｍ．カンサシイ亜種を検出するためのプライマーセットｃと、による核酸増幅反応を同一の反応系で実行する形態とすることが好ましい。
この形態であれば、検査対象にＭ．カンサシイとＭ．カンサシイ亜種の少なくとも何れかが含まれている場合に、これらを同一反応系で検出することができる。 M. Primer set b for detecting Kansashii and M.D. It is preferable that the nucleic acid amplification reaction by the primer set c for detecting the Kansashii subspecies is carried out in the same reaction system.
In this form, M.D. Kansashii and M. If at least one of the Kansashii variants is included, these can be detected in the same reaction system.

特に、Ｍ．カンサシイを検出するためのプライマーセットｂ−１と、Ｍ．カンサシイ亜種を検出するためのプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３から選ばれる１種以上、より好ましくは２種以上、さらに好ましくは３種と、による核酸増幅反応を同一の反応系で実行し、プローブｂ／ｃで検出する形態としてもよい。
上述の合計４種のプライマーセットによる核酸増幅反応は、プローブｂ／ｃにより一括して検出可能であるため、Ｍ．カンサシイとＭ．カンサシイ亜種を区別して検出する必要が無い場合には有用である。 In particular, M. Primer set b-1 for detecting Kansashii and M.D. The same reaction for nucleic acid amplification reaction with one or more, more preferably two or more, and even more preferably three, selected from the primer sets c1-1 to c-1-3 for detecting the Kansashii subspecies. It may be executed in the system and detected by the probe b / c.
Since the nucleic acid amplification reaction by the above-mentioned four kinds of primer sets can be collectively detected by the probe b / c, M.I. Kansashii and M. It is useful when it is not necessary to distinguish and detect Kansashii subspecies.

＜１＞マイコバクテリウム属菌のＩＴＳ領域の解析
複数の医療機関及び研究機関に保存されていた、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーエ、及びＭ．カンサシイの菌株を収集した。これら菌株のゲノムＤＮＡを抽出し、Ｍ．アビウムが１５０株分、Ｍ．イントラセルラーエが１３２株分、Ｍ．カンサシイが１２９株分のゲノムＤＮＡを調製した。
なお、これら菌株は、既存のＰＣＲ法やＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの手法に基づいて分類されたものである。 <1> Analysis of ITS region of Mycobacterium spp. M.M., which was stored in multiple medical institutions and research institutes. Abium, M. avium. Intracellular, and M.I. A strain of Kansashii was collected. Genomic DNA of these strains was extracted and M. Abium for 150 shares, M. avium. Intracellulare for 132 shares, M.D. Kansashii prepared 129 strains of genomic DNA.
These strains are classified based on existing methods such as PCR method and DNA-DNA hybridization.

調製したゲノムＤＮＡを基に、１６ＳｒＲＮＡと２３ＳｒＲＮＡとの間のＩＴＳ領域の塩基配列を解析した。
解析の結果、変異箇所ごとにＩＴＳ領域の配列を分類すると、Ｍ．アビウムは４種類、Ｍ．イントラセルラーエは１１種類に分類することができた。 Based on the prepared genomic DNA, the nucleotide sequence of the ITS region between 16S rRNA and 23S rRNA was analyzed.
As a result of the analysis, when the sequence of the ITS region was classified according to the mutation site, M. There are four types of Avium, M. avium. Intracellulare could be classified into 11 types.

また、Ｍ．カンサシイは、ＩＴＳ領域の配列を５種類に分類することができた。しかし、最も多くの菌株が有していたＩＴＳ領域の配列と、他の４種類のＩＴＳ領域の配列が大きく異なることが判明した。この４種類のＩＴＳ領域を有する菌株について１６ＳｒＲＮＡの変異領域による菌種同定を行ったところ、Ｍ．ｐｅｒｓｉｃｕｍであることが判明した。以降、Ｍ．ｐｅｒｓｉｃｕｍをＭ．カンサシイ亜種とする。以下、ＩＴＳ領域の塩基配列により分類された４種のＭ．カンサシイ亜種のそれぞれをＭ．カンサシイ亜種（１）〜（４）などということがある。 In addition, M. Kansashii was able to classify the sequences of the ITS region into five types. However, it was found that the sequence of the ITS region possessed by the most strains was significantly different from the sequence of the other four types of ITS regions. Strains having these four types of ITS regions were identified by the mutant region of 16S rRNA. It turned out to be cyclamen. Hereafter, M. Persicum is M. It is a subspecies of Kansashii. Hereinafter, four types of M.S. are classified according to the base sequence of the ITS region. Each of the Kansashii subspecies is M. It is sometimes called Kansashii subspecies (1) to (4).

また、ＩＴＳ領域の塩基配列により分類したＭ．カンサシイ及び４種のＭ．カンサシイ亜種に罹患した患者の治療実績を調べると、この分類に応じて薬剤感受性や薬剤耐性が異なることがわかった。
以上より、ＩＴＳ領域の塩基配列に基づく菌種同定は、菌種ごとの薬剤抵抗性などの表現型をも反映していることが示唆された。 In addition, M.D. classified according to the base sequence of the ITS region. Kansashii and 4 kinds of M. Examination of the treatment results of patients with the Kansashii subspecies revealed that drug sensitivity and drug resistance differ according to this classification.
From the above, it was suggested that the bacterial species identification based on the nucleotide sequence of the ITS region also reflects the phenotype such as drug resistance for each bacterial species.

さらに、既存のＰＣＲ法やＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション等の方法により、ある菌種であると判別されている菌株であっても、ＩＴＳ領域の塩基配列に基づく解析により明確に別菌種であると判定できるもの、すなわち、菌種同定が誤っているものが各菌において複数サンプルずつ存在した。
以上より、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション等の既存の方法による菌種同定よりも、ＩＴＳ領域に基づく菌種同定のほうが正確に菌種を同定することができることが示唆された。 Furthermore, even a strain that has been identified as a certain strain by an existing PCR method, DNA-DNA hybridization, or the like is clearly a different strain by analysis based on the base sequence of the ITS region. There were a plurality of samples in each bacterium that could be determined, that is, those in which the bacterial species identification was incorrect.
From the above, it was suggested that the bacterial species can be identified more accurately by the bacterial species identification based on the ITS region than by the bacterial species identification by the existing method such as DNA-DNA hybridization.

＜２＞プライマーセット及びプローブの設計
（１）ＭＡＣ
上述の通り、Ｍ．アビウムは４種類、Ｍ．イントラセルラーエは１１種類に分類することができた。
この合計１５種類のＩＴＳ領域のうち、相同性が高く（つまり変異が少なく）、かつ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．カンサシイ亜種、及びＭ．ツベルクローシスと相同性が低い領域を解析した。
その結果、領域１−１〜１−３の３つの領域が見出された。この領域の塩基配列を前記合計１５種類の配列に基づき一般化したものを表１に示す。 <2> Primer set and probe design (1) MAC
As mentioned above, M. There are four types of Avium, M. avium. Intracellulare could be classified into 11 types.
Of the 15 types of ITS regions in total, the homology is high (that is, there are few mutations), and M.I. Kansashii, M.D. Kansashii subspecies, and M. Regions with low homology to tuberculosis were analyzed.
As a result, three regions, regions 1-1 to 1-3, were found. Table 1 shows a generalization of the base sequence of this region based on the total of 15 types of sequences.

（２）Ｍ．カンサシイ
Ｍ．カンサシイのＩＴＳ領域のうち、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ亜種、及びＭ．ツベルクローシスと相同性が低い領域を解析した。
その結果、領域２−１〜２−３の３つの領域が見出された。この領域の塩基配列を表２に示す。 (2) M. Kansashii M. Among the ITS areas of Kansashii, MAC, M.M. Kansashii subspecies, and M. Regions with low homology to tuberculosis were analyzed.
As a result, three regions of regions 2-1 to 2-3 were found. The base sequence of this region is shown in Table 2.

（３）Ｍ．カンサシイ亜種
上述の通り、従来法によりＭ．カンサシイに分類されていた菌は、ＩＴＳ領域の塩基配列の解析により４種のＭ．カンサシイ亜種に分類することができた（Ｍ．カンサシイ亜種（１）〜（４））。
この４種のＩＴＳ領域のうち、相同性が高く（つまり変異が少なく）、かつ、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ、及びＭ．ツベルクローシスと相同性が低い領域を解析した。
その結果、領域３−１〜３−３の３つの領域が見出された。この領域の塩基配列を前記合計４種の配列に基づき一般化したものを表３に示す。 (3) M. Kansashii Subspecies As mentioned above, M. The bacteria classified as Kansashii are classified into four types of M. s. by analysis of the nucleotide sequence of the ITS region. It could be classified into the Kansashii subspecies (M. Kansashii subspecies (1) to (4)).
Of these four types of ITS regions, the homology is high (that is, there are few mutations), and MAC, M.I. Kansashii and M. Regions with low homology to tuberculosis were analyzed.
As a result, three regions of regions 3-1 to 3-3 were found. Table 3 shows a generalized base sequence of this region based on the above-mentioned four types of sequences.

（４）プライマーの設計
後述の実施例では表４に示すプライマーセットを使用した。表４のプライマーセットは、表１〜３に示した塩基配列及びその相補的な塩基配列にアニールするように設計した。なお、プライマーセットｃ−１−３は、Ｍ．カンサシイ亜種（３）と（４）をまとめて検出するように設計されている。 (4) Primer design In the examples described later, the primer set shown in Table 4 was used. The primer set in Table 4 was designed to anneal to the nucleotide sequences shown in Tables 1 to 3 and their complementary nucleotide sequences. In addition, the primer set c-1-3 was prepared by M.I. It is designed to detect the Kansashii subspecies (3) and (4) together.

（５）プローブの設計
後述の実施例では、表５に示すプローブを使用した。表５のプローブは、表４に示したプライマーセットによる核酸増幅反応を検出可能なように設計した。 (5) Probe design In the examples described later, the probes shown in Table 5 were used. The probes in Table 5 were designed to detect nucleic acid amplification reactions with the primer sets shown in Table 4.

プローブａは、表４のプライマーセットａ−１による核酸増幅反応を検出する。
プローブｂ／ｃは、表４のプライマーセットｂ−１、ｃ−１−１〜ｃ−１−３による核酸増幅反応を検出する。
プローブｅは、表４のプライマーセットｅ−１−２による核酸増幅反応を検出する。 Probe a detects the nucleic acid amplification reaction by the primer set a-1 in Table 4.
The probe b / c detects the nucleic acid amplification reaction by the primer sets b-1, c-1-1 to c-3-3 in Table 4.
The probe e detects the nucleic acid amplification reaction by the primer set e-1-2 in Table 4.

＜３＞実施例
表４及び表５に記載したプライマーセット及びプローブを使用して以下の試験を行った。 <3> Examples The following tests were performed using the primer sets and probes shown in Tables 4 and 5.

［実施例１］ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．ツベルクローシスの検出（シングルプレックス）
塩基配列の解析により菌種同定されているＭ．イントラセルラーエ、Ｍ．カンサシイ及びＭ．ツベルクローシスの菌株よりゲノムＤＮＡを抽出した。 [Example 1] MAC, M.I. Kansashii, M.D. Detection of tuberculosis (singleplex)
M. et al., Whose species have been identified by base sequence analysis. Intracellularae, M.D. Kansashii and M.M. Genomic DNA was extracted from the strain of Tubelcrosis.

鋳型ＤＮＡの濃度を種々変更し、以下の３通りの鋳型とプライマーセットの組合せで、リアルタイムＰＣＲを行った。この際、インターカレーターとしてＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いた。横軸にゲノムＤＮＡの量、縦軸にＣｔ値をプロットしたグラフを図１に示す。
Ｍ．イントラセルラーエのゲノムＤＮＡとプライマーセットａ―１（ＭＡＣ検出用）；
Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡとプライマーセットｂ―１（Ｍ．カンサシイ検出用）；
Ｍ．ツベルクローシスのゲノムＤＮＡとプライマーセットｄ−１（Ｍ．ツベルクローシス検出用） The concentration of the template DNA was variously changed, and real-time PCR was performed using the following three combinations of the template and the primer set. At this time, EvaGreen (registered trademark) was used as the intercalator. FIG. 1 shows a graph in which the amount of genomic DNA is plotted on the horizontal axis and the Ct value is plotted on the vertical axis.
M. Intracellularae genomic DNA and primer set a-1 (for MAC detection);
M. Kansashii genomic DNA and primer set b-1 (for M. Kansashii detection);
M. Genome DNA of tuberculosis and primer set d-1 (for detection of M. tuberculosis)

図１に示すように、プライマーセットａ−１、プライマーセットｂ−１、プライマーセットｄ−１による核酸増幅反応は、同条件において同程度の増幅速度を示した。そのため、これらプライマーセットは、同条件で検査をすることができる。
また、１０^１コピー／チューブの濃度でも検出することができ、感度が良い。 As shown in FIG. 1, the nucleic acid amplification reaction by the primer set a-1, the primer set b-1, and the primer set d-1 showed the same amplification rate under the same conditions. Therefore, these primer sets can be tested under the same conditions.
It can also be detected at a concentration of 10 ¹ copy / tube, and has good sensitivity.

［実施例２］ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．ツベルクローシス検出用プライマーの交差活性試験（シングルプレックス）
下記表６の菌種よりゲノムＤＮＡを抽出した。それぞれの菌種のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットａ−１（ＭＡＣ検出用）、プライマーセットｂ−１（Ｍ．カンサシイ検出用）、プライマーセットｄ−１（Ｍ．ツベルクローシス検出用）のそれぞれを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。この際、インターカレーターとしてＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いた。
プライマーセットａ−１を使用したときの結果を図２に、プライマーセットｂ−１を使用したときの結果を図３に、プライマーセットｄ−１を使用したときの結果を図４に示す。 [Example 2] MAC, M.I. Kansashii, M.D. Cross-activity test of primers for detecting tuberculosis (singleplex)
Genomic DNA was extracted from the bacterial species shown in Table 6 below. Using the genomic DNA of each bacterial species as a template, primer set a-1 (for MAC detection), primer set b-1 (for M. kansashii detection), and primer set d-1 (for M. tuberculosis detection) Real-time PCR was performed using each. At this time, EvaGreen (registered trademark) was used as the intercalator.
The result when the primer set a-1 is used is shown in FIG. 2, the result when the primer set b-1 is used is shown in FIG. 3, and the result when the primer set d-1 is used is shown in FIG.

図２、３及び４に示すように、プライマーセットａ―１、プライマーセットｂ−１、プライマーセットｄ−１の各検出プライマーセットは、それぞれが検出対象とする菌種のゲノムを鋳型としたときにのみ、強い増幅曲線の立ち上がりを示した。
この結果は、プライマーセットａ―１、プライマーセットｂ−１、プライマーセットｄ−１は、検出対象以外の菌種には交差反応を示すことなく、それぞれが検出対象とする菌種を特異的に検出することを可能とすることを示している。 As shown in FIGS. 2, 3 and 4, each of the detection primer sets of primer set a-1, primer set b-1, and primer set d-1 uses the genome of the bacterial species to be detected as a template. Only in the above showed the rise of a strong amplification curve.
As a result, the primer set a-1, the primer set b-1, and the primer set d-1 did not show a cross-reaction to the bacterial species other than the detection target, and each specifically selected the bacterial species to be detected. It shows that it is possible to detect.

［実施例３］Ｍ．カンサシイ亜種の検出（シングルプレックス）
３株のＭ．カンサシイ亜種からゲノムＤＮＡを抽出した。なお、これら３つの菌株は、ＩＴＳ領域の塩基配列に基づき、それぞれ別々のグループに分類されるものである。以下、３つの菌株をそれぞれＭ．カンサシイ亜種（１）〜（３）などと呼ぶ。 [Example 3] M.I. Detection of Kansashii subspecies (single plex)
3 strains of M. Genomic DNA was extracted from the Kansashii subspecies. In addition, these three strains are classified into different groups based on the base sequence of the ITS region. Hereinafter, each of the three strains is referred to as M. It is called Kansashii subspecies (1) to (3).

鋳型ＤＮＡの濃度を種々変更し、以下の３通りの鋳型とプライマーセットの組合せで、リアルタイムＰＣＲを行った。この際、インターカレーターとしてＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いた。横軸にゲノムＤＮＡの量、縦軸にＣｔ値をプロットしたグラフを図５に示す。
Ｍ．カンサシイ亜種（１）のゲノムＤＮＡとプライマーセットｃ−１−１；
Ｍ．カンサシイ亜種（２）のゲノムＤＮＡとプライマーセットｃ−１−２；
Ｍ．カンサシイ亜種（３）のゲノムＤＮＡとプライマーセットｃ−１−３ The concentration of the template DNA was variously changed, and real-time PCR was performed using the following three combinations of the template and the primer set. At this time, EvaGreen (registered trademark) was used as the intercalator. FIG. 5 shows a graph in which the amount of genomic DNA is plotted on the horizontal axis and the Ct value is plotted on the vertical axis.
M. Genomic DNA of Kansashii subspecies (1) and primer set c-1-1;
M. Genomic DNA of Kansashii subspecies (2) and primer set c-1-2;
M. Genomic DNA of Kansashii subspecies (3) and primer set c-1-3

図５からわかるように、プライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３は、同条件において同程度の増幅感度であるため、同条件で検査をすることができる。
また、１０^１コピー／チューブの濃度でも検出することができる。 As can be seen from FIG. 5, since the primer sets c1-1 to c-1-3 have the same amplification sensitivity under the same conditions, the inspection can be performed under the same conditions.
It can also be detected at a concentration of 10 ¹ copy / tube.

［実施例４］Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種検出用プライマーセットの交差活性試験（１）（シングルプレックス）
Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡと、Ｍ．カンサシイ亜種３株（Ｍ．カンサシイ亜種（１）〜（３））のゲノムＤＮＡを用意した。
それぞれの菌種のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットｂ−１（Ｍ．カンサシイ検出用）、プライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３（Ｍ．カンサシイ亜種（１）〜（３）検出用）のそれぞれを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。この際、インターカレーターとしてＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いた。 [Example 4] M.I. Kansashii and M.M. Cross-activity test of primer set for detecting Kansashii subspecies (1) (singleplex)
M. Kansashii's genomic DNA and M.I. Genomic DNAs of three Kansashii subspecies (M. Kansashii subspecies (1) to (3)) were prepared.
Primer set b-1 (for detecting M. kansashii), primer set c-1-1 to c-1-3 (M. kansashii subspecies (1) to (3)) using the genomic DNA of each bacterial species as a template. Real-time PCR was performed using each of (for detection). At this time, EvaGreen (registered trademark) was used as the intercalator.

プライマーセットｂ−１を使用したときの結果を図６に、プライマーセットｃ−１−１を使用したときの結果を図７に、プライマーセットｃ−１−２を使用したときの結果を図８に、プライマーセットｃ−１−３を使用したときの結果を図９に示す。 The result when the primer set b-1 is used is shown in FIG. 6, the result when the primer set c-1-1 is used is shown in FIG. 7, and the result when the primer set c-1-2 is used is shown in FIG. The results when the primer set c-1-3 was used are shown in FIG.

図６〜９に示すように、プライマーセットｂ−１（Ｍ．カンサシイ検出用）は、Ｍ．カンサシイ亜種のゲノムＤＮＡに対しては交差反応を示さなかった。
同じくプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３のそれぞれは、Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡに対しては交差反応を示さなかった。 As shown in FIGS. 6 to 9, the primer set b-1 (for detecting M. kansashii) was prepared by M. No cross-reactivity was shown for the genomic DNA of the Kansashii subspecies.
Similarly, each of the primer sets c1-1 to c-1-3 has M.I. No cross-reactivity was shown with the genomic DNA of Kansashii.

特に、図６、８及び９に示すように、プライマーセットｂ−１、プライマーセットｃ−１−２、プライマーセットｃ−１−３は、それぞれが検出対象とする菌種以外の菌種には交差反応を示さず、特異性が非常に高い。 In particular, as shown in FIGS. 6, 8 and 9, the primer set b-1, the primer set c-1-2, and the primer set c-1-3 are used for bacterial species other than the bacterial species to be detected. It does not show cross-reactivity and is very specific.

一方、プライマーセットｃ−１−１（Ｍ．カンサシイ亜種（１）検出用）は、検出対象とする菌種とは別のＭ．カンサシイ亜種と交差活性を示す（図７）。これは、プライマーセットｃ−１−１が標的とするＭ．カンサシイ亜種と、別のＭ．カンサシイ亜種が極めて近い類縁種であることに起因するものと考えられる。 On the other hand, the primer set c-1-1 (for detecting M. kansashii subspecies (1)) has M. cerevisiae different from the bacterial species to be detected. It shows cross-activity with the Kansashii subspecies (Fig. 7). This is the M. cerevisiae targeted by primer set c-1-1. Kansashii subspecies and another M. It is considered that this is due to the fact that the Kansashii subspecies is a closely related species.

［実施例５］対照・標準用テンプレート及びプライマーセットの検討（シングルプレックス）
好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のゲノムＤＮＡを使用した。
鋳型ＤＮＡの濃度を種々変更し、プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３（好熱菌に特有の遺伝が標的）のそれぞれについて、リアルタイムＰＣＲを行った。この際、インターカレーターとしてＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いた。横軸にゲノムＤＮＡの量、縦軸にＣｔ値をプロットしたグラフを図１０に示す。 [Example 5] Examination of control / standard template and primer set (singleplex)
Genomic DNA from Thermus thermophilus was used.
The concentration of the template DNA was variously changed, and real-time PCR was performed for each of the primer sets e1-1 to e-1-3 (targeting inheritance peculiar to thermophiles). At this time, EvaGreen (registered trademark) was used as the intercalator. FIG. 10 shows a graph in which the amount of genomic DNA is plotted on the horizontal axis and the Ct value is plotted on the vertical axis.

図１０に示すように、プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３は、いずれも同程度の検出感度であり、いずれのプライマーセットでも、好熱菌特有の遺伝子（タングステン含有酸化還元酵素遺伝子、またはフェレドキシンオキシダーゼ遺伝子）を感度よく検出することができる。
また、１０^１コピー／チューブの濃度でも検出することができる。 As shown in FIG. 10, the primer sets e1-1 to e-1-3 have the same detection sensitivity, and all the primer sets have genes peculiar to thermophiles (tungsten-containing oxidoreductase). Genes or ferredoxin oxidase genes) can be detected with high sensitivity.
It can also be detected at a concentration of 10 ¹ copy / tube.

［実施例６］Ｍ．カンサシイ亜種検出用プライマーセットの交差活性試験（１）（シングルプレックス）
下記表７の菌種のゲノムＤＮＡを抽出した。それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３（Ｍ．カンサシイ亜種（１）〜（３）検出用）のそれぞれを使用してリアルタイムＰＣＲを行うことで、交差活性試験を行った。結果を図１１〜１３に示す。 [Example 6] M.I. Cross-activity test of primer set for detecting Kansashii subspecies (1) (singleplex)
Genomic DNA of the bacterial species shown in Table 7 below was extracted. By performing real-time PCR using each genomic DNA as a template and each of the primer sets e1-1 to e-1-3 (for detection of M. kansashii subspecies (1) to (3)), A cross-activity test was performed. The results are shown in FIGS. 11-13.

図１１〜１３からわかるように、プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３は、検出対象である菌種以外の菌種との交差活性を示さないか、又は交差活性を示しても、サイクル数やプライマー濃度により調整可能な程度にしか示さない。 As can be seen from FIGS. 11 to 13, the primer sets e1-1 to e-1-3 do not show cross-activity with bacterial species other than the bacterial species to be detected, or even if they show cross-activity. , It is shown only to the extent that it can be adjusted by the number of cycles and the primer concentration.

また、プライマーセットｅ−１−１（Ｍ．カンサシイ亜種検出プライマーセット（１））は、別のＭ．カンサシイ亜種との交差活性を示すが（図１１参照）、これは、プライマーセットｅ−１−１が標的とするＭ．カンサシイ亜種と、別のＭ．カンサシイ亜種が極めて近い類縁種であることに起因するものと考えられる。 In addition, the primer set e-1-1 (M. kansashii subspecies detection primer set (1)) is a different M. It exhibits cross-activity with the Kansashii subspecies (see FIG. 11), which is the M.W. Kansashii subspecies and another M. It is considered that this is due to the fact that the Kansashii subspecies is a closely related species.

［実施例７］標準用プライマーセットの交差活性試験（シングルプレックス）
上記表７の菌種のゲノムＤＮＡを抽出した。それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーセットｅ−１−２（フェレドキシンオキシダーゼ遺伝子検出用）を使用してリアルタイムＰＣＲを行うことで、交差活性試験を行った。この際、インターカレーターとしてＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いた。結果を図１４に示す。 [Example 7] Cross-activity test (single plex) of standard primer set
Genomic DNA of the bacterial species shown in Table 7 above was extracted. A cross-activity test was performed by performing real-time PCR using each genomic DNA as a template and using a primer set e-1-2 (for detecting a ferredoxin oxidase gene). At this time, EvaGreen (registered trademark) was used as the intercalator. The results are shown in FIG.

図１４に示すように、プライマーセットｅ−１−２は好熱菌のゲノムＤＮＡを特異的に増幅し、他の菌種に対して交差活性を示さなかった。
この結果より、好熱菌のゲノムＤＮＡを対照・標準用テンプレートとするプライマーセットｅ−１−２による核酸増幅反応は、内部標準としての適正を有しており、マルチプレックスＰＣＲへの応用が十分に可能であることが示された。 As shown in FIG. 14, the primer set e-1-2 specifically amplified the genomic DNA of thermophiles and did not show cross-activity against other bacterial species.
From this result, the nucleic acid amplification reaction by the primer set e-1-2 using the genomic DNA of thermophile as a control / standard template is suitable as an internal standard, and its application to multiplex PCR is sufficient. It was shown that it is possible.

［実施例８］プローブ法によるＭＡＣの検出（シングルプレックス）
テンプレートであるＭ．アビウムのゲノムＤＮＡの濃度を種々変更し、プライマーセットａ−１（ＭＡＣ検出用）とプローブａ（ＭＡＣ検出用）を用いて、シングルプレックスＰＣＲによるＭＡＣの検出を行った。なお、プローブａは、５´末端をＦＡＭで蛍光標識したＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブとした。横軸にゲノムＤＮＡの量、縦軸にＣｔ値をプロットしたグラフを図１５に示す。 [Example 8] MAC detection by probe method (singleplex)
The template M. The concentration of the genomic DNA of Abium was variously changed, and MAC was detected by singleplex PCR using primer set a-1 (for MAC detection) and probe a (for MAC detection). The probe a was a Taqman® probe whose 5'end was fluorescently labeled with FAM. FIG. 15 shows a graph in which the amount of genomic DNA is plotted on the horizontal axis and the Ct value is plotted on the vertical axis.

図１５に示すように、プライマーセットａ−１とプローブａの組合せでは、種々のＤＮＡテンプレート濃度において、ＭＡＣを検出することができる。 As shown in FIG. 15, the combination of primer set a-1 and probe a can detect MAC at various DNA template concentrations.

［実施例９］プローブ法によるＭ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種の検出（シングルプレックス）
ＤＮＡテンプレートとして、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種由来のゲノムＤＮＡを使用した。 [Example 9] M.I. Kansashii and M.M. Detection of Kansashii subspecies (single plex)
As a DNA template, M. Kansashii and M.M. Genomic DNA from the Kansashii subspecies was used.

テンプレートとなるそれぞれのゲノムＤＮＡの濃度を種々変更し、プライマーセットｂ−１及びプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３の合計４種のプライマーセットの全てと、プローブｂ／ｃを同一反応系に加え、シングルプレックスなリアルタイムＰＣＲを行った。
Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡをテンプレートとしたときの結果を図１６に、Ｍ．カンサシイ亜種のゲノムＤＮＡをテンプレートとしたときの結果を図１７に示す。 The concentration of each genomic DNA used as a template is changed in various ways, and the probe b / c is the same as that of all four types of primer sets, primer set b-1 and primer sets c1-1 to c-1--3. In addition to the reaction system, single-plex real-time PCR was performed.
M. The results when the genomic DNA of Kansashii was used as a template are shown in FIG. FIG. 17 shows the results when the genomic DNA of the Kansashii subspecies was used as a template.

プローブｂ／ｃは、プライマーセットｂ−１及びプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３による増幅産物を検出するように設計されている。
この設計意図通り、図１６及び図１７からわかるように、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種のいずれのＤＮＡテンプレートを用いたときでも、増幅がみられた（図１６及び図１７）。
この結果から、Ｍ．カンサシイとＭ．カンサシイ亜種は、プライマーセットｂ−１及びプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３の全てと、プローブｂ／ｃを含んだ反応系で、プローブ由来の蛍光を測定することによって、まとめて検出することができる。 The probe b / c is designed to detect the amplification products of primer set b-1 and primer sets c1-1-1 to c-1--3.
As can be seen from FIGS. 16 and 17, M.I. Kansashii and M.M. Amplification was observed with any of the DNA templates of the Kansashii subspecies (FIGS. 16 and 17).
From this result, M. Kansashii and M. The Kansashii subspecies are summarized by measuring the fluorescence derived from the probe in a reaction system containing all of the primer sets b-1 and the primer sets c1-1 to c-1-3 and the probe b / c. Can be detected.

［実施例１０］プローブ法による対照・標準用テンプレート及びプライマーセットの検討（シングルプレックス）
好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ゲノムＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして用意した。
テンプレートとなる好熱菌ゲノムＤＮＡの濃度を種々変更し、プライマーセットｅ−１−２と、プローブｅを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。なお、プローブｅは、５´末端がＲＯＸ相当の蛍光特性を有する物質で標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとした。横軸にゲノムＤＮＡの量、縦軸にＣｔ値をプロットしたグラフを図１８に示す。 [Example 10] Examination of control / standard template and primer set by probe method (singleplex)
Thermophile genomic DNA was prepared as template DNA.
The concentration of the thermophile genomic DNA used as a template was variously changed, and real-time PCR was performed using the primer set e-1-2 and the probe e. The probe e was a TaqMan® probe whose 5'end was labeled with a substance having fluorescence characteristics equivalent to ROX. FIG. 18 shows a graph in which the amount of genomic DNA is plotted on the horizontal axis and the Ct value is plotted on the vertical axis.

図１８に示すように、プライマーセットｅ−１−２とプローブｅにより、高感度で好熱菌ゲノムＤＮＡを検出できる。
この結果より、好熱菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとした、プライマーセットｅ−１−２とプローブｅによる核酸増幅反応は、ポジティブコントロール又は内部標準としての適正を備えていることが示された。 As shown in FIG. 18, the primer set e-1-2 and the probe e can detect thermophile genomic DNA with high sensitivity.
From this result, it was shown that the nucleic acid amplification reaction by the primer set e-1-2 and the probe e using the thermophile genomic DNA as a template has appropriateness as a positive control or an internal standard.

［実施例１１］プローブ法によるＭＡＣと内部標準の検出（マルチプレックス）
テンプレートＤＮＡとして、Ｍ．アビウム（検出対象）及び好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のゲノムＤＮＡ（内部標準用）を用意した。
これら２種のテンプレートＤＮＡの濃度を種々変更し、プライマーセットａ−１（ＭＡＣ検出用）、プライマーｅ−１−２（内部標準用）、プローブａ（ＭＡＣ検出用）及びプローブｅ（内部標準用）を同一反応系に加え、マルチプレックスなリアルタイムＰＣＲを行った。
なお、プローブａは５´末端がＦＡＭで標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとした。同じく、プローブｅは５´末端がＲＯＸ相当の蛍光特性を有する物質で標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとした。 [Example 11] Detection of MAC and internal standard by probe method (multiplex)
As template DNA, M. Genomic DNA (for internal standard) of Mycobacterium avium (detection target) and Thermophilus (Thermus thermophilus) was prepared.
The concentrations of these two types of template DNA were variously changed, and primer set a-1 (for MAC detection), primer e-1-2 (for internal standard), probe a (for MAC detection), and probe e (for internal standard). ) Was added to the same reaction system, and multiplex real-time PCR was performed.
The probe a was a TaqMan® probe whose 5'end was labeled with FAM. Similarly, the probe e was a TaqMan® probe whose 5'end was labeled with a substance having fluorescence characteristics equivalent to ROX.

ＦＡＭの蛍光波長を検出した増幅曲線（ＭＡＣが検出対象）を表すグラフを図１９、ＲＯＸの蛍光波長を検出した増幅曲線（内部標準）を表すグラフを図２０に示す。 FIG. 19 shows a graph showing an amplification curve (MAC is a detection target) in which the fluorescence wavelength of FAM is detected, and FIG. 20 shows a graph showing an amplification curve (internal standard) in which the fluorescence wavelength of ROX is detected.

図１９及び２０に示すように、プライマーセットａ−１及びプローブａを使用したＭＡＣの検出系は、好熱菌ゲノムを増幅対象とした内部標準を含む場合であっても良好に動作することがわかった。 As shown in FIGS. 19 and 20, the MAC detection system using the primer set a-1 and the probe a may operate well even when the internal standard for the thermophile genome is included. all right.

なお、対照試験として、テンプレートＤＮＡとして、Ｍ．アビウム及び好熱菌のゲノムＤＮＡの何れか一方を反応系から除いた比較例も実施した。
その結果、テンプレートＤＮＡとして、Ｍ．アビウム（検出対象）を含まない比較例では、ＦＡＭの蛍光波長を検出しても増幅曲線の立ち上がりは観察されなかった。
逆にテンプレートＤＮＡとして、好熱菌ゲノム（内部標準用）を含まない比較例では、ＲＯＸの蛍光波長を検出しても増幅曲線の立ち上がりは観察されなかった。 As a control test, as a template DNA, M.I. A comparative example was also carried out in which either one of the genomic DNAs of Mycobacterium avium and thermophile was removed from the reaction system.
As a result, as template DNA, M.I. In the comparative example not containing Avium (detection target), the rise of the amplification curve was not observed even when the fluorescence wavelength of FAM was detected.
On the contrary, in the comparative example not including the thermophile genome (for internal standard) as the template DNA, the rise of the amplification curve was not observed even if the fluorescence wavelength of ROX was detected.

これら比較例の結果は、実施例１１で実証したマルチプレックスＰＣＲの反応系において、２種のプライマーセットのそれぞれが、検出対象ではないＤＮＡに対して交差反応を起こしておらず、検出対象であるゲノムＤＮＡに対して特異的に核酸増幅反応を起こしていることを示している。 The results of these comparative examples show that in the multiplex PCR reaction system demonstrated in Example 11, each of the two primer sets did not cross-react with the DNA that was not the detection target, and was the detection target. It shows that a nucleic acid amplification reaction is specifically caused with respect to genomic DNA.

［実施例１２］プローブ法によるＭ．カンサシイと内部標準の検出（マルチプレックス）
テンプレートＤＮＡとして、Ｍ．カンサシイ及び好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のゲノムＤＮＡ（内部標準用）を用意した。
これら２種のテンプレートＤＮＡの濃度を種々変更し、プライマーセットｂ−１（Ｍ．カンサシイ検出用）、プライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３（Ｍ．カンサシイ亜種検出用）、プライマーｅ−１−２（内部標準用）、プローブｂ／ｃ（Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種検出用）及びプローブｅ（内部標準用）を同一反応系に加え、マルチプレックスなリアルタイムＰＣＲを行った。
なお、プローブｂ／ｃは５´末端がＦＡＭで標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとした。同じく、プローブｅは５´末端がＲＯＸ相当の蛍光特性を有する物質で標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとした。 [Example 12] M.I. Kansashii and internal standard detection (multiplex)
As template DNA, M. Genomic DNA (for internal standards) of Kansashii and Thermus thermophilus was prepared.
The concentrations of these two types of template DNA were variously changed, and primer set b-1 (for detecting M. kansashii), primer set c-1-1 to c-1-3 (for detecting M. kansashii subspecies), and primers. Add e-1-2 (for internal standard), probe b / c (for detecting M. kansashii and M. kansashii variants) and probe e (for internal standard) to the same reaction system, and perform multiplex real-time PCR. It was.
The probe b / c was a TaqMan® probe whose 5'end was labeled with FAM. Similarly, the probe e was a TaqMan® probe whose 5'end was labeled with a substance having fluorescence characteristics equivalent to ROX.

ＦＡＭの蛍光波長を検出した増幅曲線（Ｍ．カンサシイ、Ｍ．カンサシイ亜種が検出対象）を表すグラフを図２１、ＲＯＸの蛍光波長を検出した増幅曲線（内部標準）を表すグラフを図２２に示す。 FIG. 21 shows a graph showing an amplification curve (M. kansashii and M. kansashii variants are detected targets) that detected the fluorescence wavelength of FAM, and FIG. 22 shows a graph showing an amplification curve (internal standard) that detected the fluorescence wavelength of ROX. Shown.

図２１及び２２に示すように、プライマーセットｂ−１、ｃ−１−１〜ｃ−１−３及びプローブｂ／ｃを使用したＭ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種の一括検出系は、好熱菌ゲノムを増幅対象とした内部標準を含む場合であっても良好に動作することがわかった。 As shown in FIGS. 21 and 22, M. cerevisiae using primer sets b-1, c-1-1 to c-1-3 and probe b / c. Kansashii and M.M. The batch detection system for the Kansashii subspecies was found to work well even when it contained an internal standard for the thermophile genome to be amplified.

なお、対照試験として、テンプレートＤＮＡとして、Ｍ．カンサシイ及び好熱菌のゲノムＤＮＡの何れか一方を反応系から除いた比較例も実施した。
その結果、テンプレートＤＮＡとして、Ｍ．カンサシイ（検出対象）を含まない比較例では、ＦＡＭの蛍光波長を検出しても増幅曲線の立ち上がりは観察されなかった。
逆にテンプレートＤＮＡとして、好熱菌ゲノム（内部標準用）を含まない比較例では、ＲＯＸの蛍光波長を検出しても増幅曲線の立ち上がりは観察されなかった。 As a control test, as a template DNA, M.I. A comparative example was also carried out in which either one of the genomic DNAs of Kansashii and Thermophile was removed from the reaction system.
As a result, as template DNA, M.I. In the comparative example not including Kansashii (detection target), the rise of the amplification curve was not observed even when the fluorescence wavelength of FAM was detected.
On the contrary, in the comparative example not including the thermophile genome (for internal standard) as the template DNA, the rise of the amplification curve was not observed even if the fluorescence wavelength of ROX was detected.

これら比較例の結果は、実施例１２で実証したマルチプレックスＰＣＲの反応系において、複数のプライマーセットのそれぞれが、検出対象ではないＤＮＡに対して交差反応を起こしておらず、検出対象であるゲノムＤＮＡに対して特異的に核酸増幅反応を起こしていることを示している。 The results of these comparative examples show that in the multiplex PCR reaction system demonstrated in Example 12, each of the plurality of primer sets did not cross-react with the DNA to be detected, and the genome to be detected was detected. It shows that a nucleic acid amplification reaction is specifically caused with respect to DNA.

なお、上記実施例１〜１２においては、シングルプレックスＰＣＲについては以下の表８、またマルチプレックスＰＣＲについては表９に示すポリメラーゼを使用した。いずれのポリメラーゼを使用した場合であっても同様の結果が得られた。図１〜２２に示した実験結果を表すグラフ等はその一例である。 In Examples 1 to 12, the polymerases shown in Table 8 below were used for singleplex PCR, and Table 9 was used for multiplex PCR. Similar results were obtained with either polymerase. The graphs and the like showing the experimental results shown in FIGS. 1 to 22 are an example.

配列番号１マイコバクテリウムアビウム−イントラセルラーエ
配列番号２マイコバクテリウムアビウム−イントラセルラーエ
配列番号３マイコバクテリウムアビウム−イントラセルラーエ
配列番号４ＭＡＣ用フォワードプライマー
配列番号５ＭＡＣ用リバースプライマー
配列番号６マイコバクテリウムカンサシイ
配列番号７マイコバクテリウムカンサシイ
配列番号８マイコバクテリウムカンサシイ
配列番号９Ｍ．カンサシイ用フォワードプライマー
配列番号１０Ｍ．カンサシイ用リバースプライマー
配列番号１１マイコバクテリウムカンサシイ亜種
配列番号１２マイコバクテリウムカンサシイ亜種
配列番号１３マイコバクテリウムカンサシイ亜種
配列番号１４Ｍ．カンサシイ亜種用フォワードプライマー
配列番号１５Ｍ．カンサシイ亜種用リバースプライマー
配列番号１６Ｍ．カンサシイ亜種用フォワードプライマー
配列番号１７Ｍ．カンサシイ亜種用フォワードプライマー
配列番号１８Ｍ．マイコバクテリウムツベルクローシス
配列番号１９Ｍ．マイコバクテリウムツベルクローシス
配列番号２０Ｍ．マイコバクテリウムツベルクローシス
配列番号２１Ｍ．ツベルクローシス用フォワードプライマー
配列番号２２Ｍ．ツベルクローシス用リバースプライマー
配列番号２３内部標準用フォワードプライマー
配列番号２４内部標準用リバースプライマー
配列番号２５内部標準用フォワードプライマー
配列番号２６内部標準用リバースプライマー
配列番号２７内部標準用フォワードプライマー
配列番号２８内部標準用リバースプライマー
配列番号２９ＭＡＣ用プローブ
配列番号３０ＭＡＣ用プローブ
配列番号３１Ｍ．カンサシイ用プローブ
配列番号３２Ｍ．カンサシイ用プローブ
配列番号３３Ｍ．ツベルクローシス用プローブ
配列番号３４Ｍ．ツベルクローシス用プローブ
配列番号３５内部標準用プローブ
配列番号３６内部標準用プローブ SEQ ID NO: 1 Mycobacterium abium-intracellularae SEQ ID NO: 2 Mycobacterium abium-intracellularae SEQ ID NO: 3 Mycobacterium abium-intracellularae SEQ ID NO: 4 MAC forward primer SEQ ID NO: 5 MAC reverse primer SEQ ID NO: 6 Mycobacterium kansashii SEQ ID NO: 7 Mycobacterium kansashii SEQ ID NO: 8 Mycobacterium kansashii SEQ ID NO: 9 M. Forward primer for Kansashii SEQ ID NO: 10 M. Reverse Primer for Kansashii SEQ ID NO: 11 Mycobacterium Kansashii Subspecies SEQ ID NO: 12 Mycobacterium Kansashii Subspecies SEQ ID NO: 13 Mycobacterium Kansashii Subspecies SEQ ID NO: 14 M. Forward primer for Kansashii subspecies SEQ ID NO: 15 M. Reverse primer for Kansashii subspecies SEQ ID NO: 16 M. Forward primer for Kansashii subspecies SEQ ID NO: 17 M. Forward primer for Kansashii subspecies SEQ ID NO: 18 M. Mycobacterium tuberculosis SEQ ID NO: 19 M. Mycobacterium tuberculosis SEQ ID NO: 20 M. Mycobacterium tuberculosis SEQ ID NO: 21 M. Forward primer for tuberculosis SEQ ID NO: 22 M. Reverse primer for tuberculosis SEQ ID NO: 23 Forward primer for internal standard SEQ ID NO: 24 Reverse primer for internal standard SEQ ID NO: 25 Forward primer for internal standard SEQ ID NO: 26 Reverse primer for internal standard SEQ ID NO: 27 Forward primer for internal standard SEQ ID NO: 28 Internal Standard reverse primer SEQ ID NO: 29 MAC probe SEQ ID NO: 30 MAC probe SEQ ID NO: 31 M.I. Probe SEQ ID NO: 32 for Kansashii. Probe SEQ ID NO: 33 for Kansashii M.I. Probe SEQ ID NO: 34 for tuberculosis. Probe for tuberculosis SEQ ID NO: 35 Probe for internal standard SEQ ID NO: 36 Probe for internal standard

Claims

A kit for detecting Mycobacterium spp., Which comprises one or more primer sets selected from the following primer sets a to c.
<Primer set a>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying at least a part of the ITS region of the Mycobacterium avium complex.
The forward primer and the reverse primer are a primer set for detecting Mycobacterium avium complex, which anneals to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a base sequence complementary thereto.

<Primer set b>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying at least a part of the ITS region of Mycobacterium kansa cake.
The forward primer and the reverse primer are a primer set for detecting Mycobacterium kansashii, which anneals to the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 or a base sequence complementary thereto.

<Primer set c>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying at least a part of the ITS region of the Mycobacterium Kansa cake subspecies.
A primer set for detecting Mycobacterium kansashii subspecies, wherein the forward primer and the reverse primer are annealed to the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 or a base sequence complementary thereto.

The primer set a is the following primer set a-1.
The primer set b is the following primer set b-1.
The kit for detecting Mycobacterium spp. Of the genus Mycobacterium according to claim 1, wherein the primer set c is the following primer set c-1.
<Primer set a-1>
A primer set comprising a forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.

<Primer set b-1>
A primer set comprising a forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.

<Primer set c-1>
A primer set selected from the following primer sets c-1-1 to c-1--3.
<Primer set c-1-1>
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 and
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15.

<Primer set c-1-2>
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15.

<Primer set c-1-3>
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 and
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.

The kit for detecting Mycobacterium genus according to claim 1 or 2, which comprises two or more kinds of primer sets selected from the primer sets a to c.

The kit for detecting Mycobacterium genus bacteria according to any one of claims 1 to 3, further comprising the following primer set d.
<Primer set d>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying at least a part of the ITS region of Mycobacterium tuberculosis.
A primer set for detecting Mycobacterium tuberculosis, wherein the forward primer and the reverse primer are annealed to the same or complementary base sequence as the base sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20.

The kit for detecting Mycobacterium spp. Of the genus Mycobacterium according to claim 4, wherein the primer set d is the following primer set d-1.
<Primer set d-1>
A primer set comprising a forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 and a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 22.

The kit for detecting Mycobacterium bacteria according to any one of claims 1 to 5, further comprising the following control / standard template e and the following primer set e.
<Control / standard template e>
A template DNA having a unique base sequence that is not included in the base sequence of the genomic DNA of Mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacteria.

<Primer set e>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying the unique base sequence.

The control / standard template e is the following control / standard template e-1.
The kit for detecting Mycobacterium spp. Of the genus Mycobacterium according to claim 6, wherein the primer set e is the following primer set e-1.
<Control / standard template e-1>
Genomic DNA of thermophiles

<Primer set e-1>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying a genomic DNA region encoding a tungsten-containing oxidoreductase or ferredoxin oxidase.

The kit for detecting Mycobacterium spp. According to claim 7, wherein the primer set e-1 is a primer set selected from the following primer sets e1-1 to e-1-3.
<Primer set e-1-1>
A primer set that targets genomic DNA encoding a tungsten-containing redox enzyme.
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 23,
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 24.

<Primer set e-1-2>
A set of primers that targets genomic DNA encoding ferredoxin oxidase.
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 25,
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 26.

<Primer set e-1-3>
A set of primers that targets genomic DNA encoding ferredoxin oxidase.
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 27,
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 28.

The kit for detecting Mycobacterium genus according to any one of claims 1 to 8, further comprising a detection probe for detecting an amplification product by the primer set.

Combination of the following primer set a-1 and the following probe a, and / or
A combination of the following primer set b-1 or the following primer set c-1 and the following probe b / c,
The kit for detecting Mycobacterium spp. Of the genus Mycobacterium according to claim 9.
<Primer set a-1>
A primer set comprising a forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.

<Primer set b-1>
A primer set comprising a forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.

<Primer set c-1>
A primer set selected from the following primer sets c-1-1 to c-1--3.
<Primer set c-1-1>
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 and
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15.

<Primer set c-1-2>
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15.

<Primer set c-1-3>
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 and
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.

<Probe a>
A probe containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 30 or a base sequence complementary thereto.

<Probe b / c>
A probe containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 32 or a base sequence complementary thereto.

The kit for detecting Mycobacterium spp. According to claim 9 or 10, further comprising a combination of the following primer set d-1 and the following probe d.
<Primer set d-1>
A primer set comprising a forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 and a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 22.

<Probe d>
A probe containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 34 or a base sequence complementary thereto.

The mycobacterium according to any one of claims 8 to 10, further comprising a combination of the following control / standard template e-1, the following primer set e-1-2, and the following probe e. Kit for detecting Mycobacterium.
<Control / standard template e-1>
Genomic DNA of thermophiles

<Primer set e-1-2>
A set of primers that targets genomic DNA encoding ferredoxin oxidase.
A forward primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 25,
A primer set comprising a reverse primer containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 26.

<Probe e>
A probe containing at least 10 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 36 or its complementary base sequence.

A method for detecting a Mycobacterium genus bacterium using the Mycobacterium genus bacterium detection kit according to any one of claims 1 to 12.
A method for detecting a bacterium belonging to the genus Mycobacterium, which comprises a nucleic acid amplification step of performing a nucleic acid amplification reaction using one or more primer sets selected from the primer sets a to c.

In the nucleic acid amplification step
Nucleic acid amplification reaction by any of the primer sets a to c and
Nucleic acid amplification reaction by the following primer set e using the following control / standard template e as a template,
The method for detecting a bacterium belonging to the genus Mycobacterium according to claim 13, wherein the method is carried out in the same reaction system.
<Control / standard template e>
A template DNA having a unique base sequence that is not included in the base sequence of the genomic DNA of Mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacteria.

<Primer set e>
A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying the unique base sequence.