JP2020193819A - 撮像装置および撮像方法 - Google Patents

Abstract

【課題】（i）励起光Ｌ１を暴露されることによって検体（１８）が受けるダメージを低減し、（ii）検体（１８）から生じる磁場の強度を高い位置解像度で検出する撮像装置を提供する。【解決手段】本発明の一態様に係る撮像装置（１００）は、窒素−空孔複合体中心を含有する第１領域（１１）と、励起光（Ｌ１）を反射する反射領域（１２）と、を備えるダイヤモンド基板（１０）を備え；反射領域（１２）は、（i）検体（１８）に到達する励起光（Ｌ１）の光量を、第１割合以下に減衰させ、（ii）マイクロ波部（４０）から第１領域（１１）に照射されるマイクロ波を、第２割合以上通過させる。【選択図】図１

Description

本発明は、撮像装置および撮像方法に関する。

ダイヤモンドに含まれる窒素−空孔複合体中心（ＮＶ中心）に緑色励起光（波長：５３２ｎｍ程度）を照射すると、赤色蛍光（波長：６３８〜８００ｎｍ程度）が放射される。このとき、前記ＮＶ中心にマイクロ波を照射し、その周波数を掃引すると（周波数：約２．７〜約３．０ＧＨｚの範囲）、ＮＶ中心の周囲の磁場の強さに対応した特定の周波数において、赤色蛍光が減弱する現象が知られている。この現象を利用して磁場を検出する技術が、光検出磁気共鳴である（Optically Detected Magnetic Resonance；ＯＤＭＲ）。

ＯＤＭＲを応用して、生物に由来する磁場を観測する技術が報告されている。例えば、非特許文献１は、磁性バクテリアに由来する磁場を観測したことを報告している。同文献に開示されている光学系は、ＮＶ中心層を含むダイヤモンド基板の底面から励起光を照射し、当該ダイヤモンド基板の上面と培養液との界面において、励起光を全反射させる構成である。そして、ＮＶ中心層から放射される蛍光を、ダイヤモンド基板の上面から観測している。

また、非特許文献２は、神経軸索を流れる神経電流によって生じる磁場を観測したことを報告している。同文献に開示されている光学系は、ダイヤモンド基板と神経軸索との間に金属層を設け、この金属層によって、ダイヤモンド基板の底面から入射してＮＶ中心層に照射される励起光を反射させている。また、前記の金属層は、ＮＶ中心層にマイクロ波を照射するマイクロ波電極の機能も果たしている。

その他、生体に由来する磁場を観測する技術とは異なるが、反射膜を備えるケースにダイヤモンドセンサを格納し、励起光および蛍光をケース内に閉じ込める技術も公開されている（特許文献１）。

特開２０１７−１４６１５８号公報

LeSage et al., "Optical magnetic imaging of living cells." 486 NATURE VOL496 25 APRIL 2013. Barry et al., "Optical magnetic detection of single-neuron action potentials using quantum defects in diamond" E6730 PNAS August 8, 2017 vol.114 no.32.

しかしながら、前述のような従来技術には、励起光を曝露されることによって観察対象（検体）が受けるダメージを軽減したり、検体から生じる磁場の強度を高い位置解像度で検出したりする点において、改善の余地が残されていた。具体的には、下記の通りである。

まず、図７の（ａ）を参照しながら、非特許文献１に開示されている撮像装置について検討する。この撮像装置では、励起光Ｌ１を、第２表面Ｓ２に浅い角度で入射させる。その結果、第２表面Ｓ２と検体保持部１５（水中にある）との界面で全反射が生じ、励起光Ｌ１は第１表面Ｓ１側に反射する。しかし、第２表面Ｓ２近傍（１００ｎｍ程度）では、励起光Ｌ１が滲み出してエバネセント光Ｅが生じている。

検体１８が細胞やタンパク質である場合、エバネセント光Ｅに長時間暴露された検体１８はダメージを受けてしまう（光障害）。例えば、非特許文献１によると、１時間程度の観察により、磁性バクテリアが光障害を受けるとされている。

また、非特許文献１に開示されている撮像装置は、励起光Ｌ１を全反射させるので、励起光Ｌ１を浅い角度で第２表面Ｓ２に入射させる必要がある。そのため、光学系が大型化する傾向にある。

次に、図７の（ｂ）および（ｃ）を参照しながら、非特許文献２に開示されている撮像装置について検討する。これらの撮像装置は、金属層がマイクロ波の侵入長に比べて充分に厚い点に特徴がある（１３μｍまたは２５μｍ）。また、これらの金属層は、励起光が検体に直接照射されることを防止する遮蔽層の機能と、マイクロ波電極としての機能とを果たしている。

このような厚みをもった金属層では、マイクロ波をほとんど通過させることはできない。また、金属層の厚みの分だけ、検体と第１領域との距離が離れてしまい、磁場の二次元的な位置解像度が低下してしまう。それゆえ、図７の（ｂ）および（ｃ）に例示される撮像装置では、μｍオーダーの対象（細胞、タンパク質など）の発生させる磁場を二次元的に検出するためには、適切であるとは言えない。

次に、図７の（ｄ）を参照しながら、特許文献１に開示されているダイヤモンドセンサ２００ａおよびダイヤモンドセンサケース２００ｂについて検討する。特許文献１に記載されている技術は、ダイヤモンドセンサケース２００ｂに反射領域３００を設ける構成となっている。この技術は、ダイヤモンドセンサケース２００ｂ内にて励起光および蛍光を反射させることによって、ダイヤモンドセンサ２００ａから取り出される蛍光の強度を高め、これによって、ダイヤモンドセンサ２００ａによる磁場の検出感度を高める技術である。つまり、前記技術は、ダイヤモンドセンサ２００ａの体積全体で平均的に検出される磁場の検出感度を高める技術であって、検体の磁場の二次元的な分布を提供するものではない。また、ダイヤモンドセンサ２００ａとダイヤモンドセンサケース２００ｂとの間にゴミなどが入り込むこともあるため、近接する検体を高感度で計測することに適していているとは言えない。

本発明の一態様は、（i）励起光を暴露されることによって検体が受けるダメージを低減し、（ii）検体から生じる磁場の強度を高い位置解像度で測定する撮像装置を提供することにある。

前記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る撮像装置は、窒素−空孔複合体中心を含有する第１領域を備えるダイヤモンド基板と；前記ダイヤモンド基板の第１表面側から該ダイヤモンド基板の前記第１領域に励起光を照射する光源部と；前記ダイヤモンド基板の第１表面と対向する第２表面側に検体を保持する検体保持部と；前記励起光を照射された前記第１領域から生じる蛍光であって、前記検体から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光の強度の二次元的な分布を蛍光画像として取得する蛍光画像取得部と；所定の周波数のマイクロ波を、前記第１領域に照射するマイクロ波部と、を備え；前記ダイヤモンド基板は、前記励起光を反射する反射領域をさらに備え；前記反射領域は、（i）前記第１領域と前記第２表面との間に設けられており、（ii）前記第２表面から前記検体保持部に保持されている前記検体に到達する前記励起光の光量を、第１割合以下に減衰させ、（iii）前記マイクロ波部から前記第２表面を経て前記第１領域に照射される前記マイクロ波を、第２割合以上通過させる。

また、本発明の一態様に係る撮像方法は、窒素−空孔複合体中心を含有する第１領域を備えるダイヤモンド基板に、検体を設置する設置工程と；前記第１領域に励起光を照射する光照射工程と；前記第１領域に、マイクロ波部からマイクロ波を照射するマイクロ波照射工程と；前記励起光を照射された前記第１領域から生じる蛍光であって、前記検体から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光の強度の二次元的な分布を蛍光画像として取得する蛍光画像取得工程と；を含み、前記ダイヤモンド基板は、前記励起光が入射する第１表面と、前記検体が設置される第２表面とを有しており、該第１表面と該第２表面とは対向しており；前記第１領域と前記第２表面との間には、前記励起光を反射する反射領域が設けられており；前記反射領域は、（i）前記第２表面から前記検体に到達する前記励起光の光量を、第１割合以下に減衰させ、（ii）前記マイクロ波部から前記第２表面を経て前記第１領域に照射される前記マイクロ波を、第２割合以上通過させる。

本発明の一態様によれば、（i）励起光を暴露されることによって検体が受けるダメージを低減し、（ii）検体から生じる磁場の強度を高い位置解像度で測定する撮像装置が提供される。

本発明の一態様に係る撮像装置の概要を説明する模式図である。 本発明の一態様に係る撮像装置の全体構成を表す模式図である。 本発明の一態様に係る撮像装置の主要部の構成を表す模式図である。 本発明の一実施形態において、反射領域内に設けられた基準位置領域を表す模式図である。 本発明の一態様に係る撮像方法を表すフローチャートである。 本発明の一態様に係る撮像装置によって超常磁性粒子を観察した磁場分布画像および明視野像である。 （ａ）は、非特許文献１に開示されている撮像装置の概要を説明する模式図である。（ｂ）および（ｃ）は、非特許文献２に開示されている撮像装置の概要を説明する模式図である。（ｄ）は、特許文献１に開示されているダイヤモンドセンサおよびダイヤモンドセンサケースを表す図である。

以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。

本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。

〔ダイヤモンド基板および反射層〕
まず、本発明の一実施形態に係る撮像装置に用いられるダイヤモンド基板について、特に反射層の構成の差異に着目しながら説明する。図１は、本発明の一実施形態に係る撮像装置１００の概要を説明する模式図である。

撮像装置１００において、ダイヤモンド基板１０は、第１領域１１および反射領域１２を備えている。また、ダイヤモンド基板１０の第２表面Ｓ２には、検体保持部１５が設けられている。検体保持部１５は、検体１８を保持する箇所であり、その周囲を培養液などで満たされていてもよい。ダイヤモンド基板１０の第１表面Ｓ１側から入射された励起光Ｌ１は、反射領域１２で反射し、反射光Ｌ１’として再び第１表面Ｓ１側に戻ってくる。第１領域１１で発生した蛍光Ｌ２も、第１表面Ｓ１側から観測する。

本発明の一実施形態に係る撮像装置１００においては、第１表面Ｓ１側から入射された励起光Ｌ１の大部分は、反射領域１２で反射して、反射光Ｌ１’として第１表面Ｓ１側に戻ってくる。反射領域１２を通過して第２表面Ｓ２の外部に漏洩する励起光Ｌ１は、エバネセント光Ｅよりも遥かに小さい。それゆえ、長時間（例えば、１時間〜数日間）の観察を続けても、検体１８が受けるダメージを低減することができる。

また、反射領域１２における反射は、屈折率の違いにより生じる全反射ではないので、励起光Ｌ１の入射角は、比較的自由に選択できる。その結果、光学系をより小型化する余地が生まれる。例えば、励起光Ｌ１を、通常の落射式照明により入射させることもできる。

さらに、撮像装置１００におけるダイヤモンド基板１０の反射領域１２は、厚みが非常に薄く、ダイヤモンド基板１０上に直接設けられている。それゆえ、従来技術よりも高い位置解像度で検体の磁場を検出することができる。

第１領域１１は、窒素−空孔複合体中心（ＮＶ中心）を含有している領域である。第１領域１１に励起光Ｌ１を照射することにより、第１領域１１から蛍光Ｌ２が放射される。第１領域１１の厚さは、検体１８の厚さと同程度以下にすることが好ましい（例えば、１０μｍ以下とすることができる）。このような厚みであれば、第１領域１１に到達する磁場の減衰（距離の３乗に比例）を抑えつつ、第１領域１１に含まれているＮＶ中心の絶対数も充分に確保できる。第１領域１１は、例えば、化学気相成長（Chemical Vapor Deposition；ＣＶＤ）によって作製することができる。

反射領域１２は、第１領域１１と第２表面Ｓ２との間に設けられている。反射領域１２と第２表面Ｓ２との間に、他の層を設けてもよい（例えば、生体親和性の膜１３）。

撮像装置１００において、励起光Ｌ１は、ダイヤモンド基板１０の第１表面Ｓ１側から照射され、反射領域１２にて反射される。それゆえ、第２表面Ｓ２側にある検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量は、第１割合以下に減衰する。検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量は、小さければ小さいほど好ましい。一例を挙げると、検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量は、第１領域１１に照射される励起光Ｌ１の光量の、１０^−３以下であることが好ましく、１０^−３．５以下であることがより好ましく、１０^−４以下であることがさらに好ましい。

なお、前記の説明における「第１割合」とは、「検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量／第１領域１１に照射される励起光Ｌ１の光量」の比の値である。「検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量」は、反射領域１２内を励起光Ｌ１が通過する際の光路長と、導体中を電磁波が進行する際の減衰率とから、計算することができる。

また、反射領域１２は、マイクロ波部４０から照射されるマイクロ波を、第２割合以上通過させる。反射領域１２を通過するマイクロ波は、大きければ大きいほど好ましい。一例を挙げると、反射領域１２を通過するマイクロ波は、マイクロ波部４０から照射されるマイクロ波の、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。

なお、前記の説明における「第２割合」とは、第２表面Ｓ２側から反射領域１２にマイクロ波を照射した際における、「反射領域１２を通過した直後のマイクロ波の強さ／反射領域１２を通過する直前のマイクロ波の強さ」の比の値である。この比は、反射領域１２の厚さおよび導電率に基づいて計算することができる。

ここで、撮像装置１００においては、第１表面Ｓ１側から第１領域１１へとマイクロ波を照射することも可能ではある。しかし、図２、３に示されているような光学系を採用する場合は、油浸対物レンズ２３が第１表面Ｓ１に近接して配置されることになる。すると、第１表面Ｓ１側から照射されるマイクロ波は、油浸対物レンズ２３の金属枠部に吸収されてしまい、強度が小さくなる。このため、前記のような光学系において、第１領域１１に効率よくマイクロ波を照射するためには、第２表面Ｓ２側から第１領域１１へとマイクロ波を照射することが好ましい。

以上に説明したように、反射領域１２は、励起光Ｌ１を第１割合以下に減衰させ、マイクロ波を第２割合以上通過させる。このような構成を達成するためには、反射領域１２の厚さを、所定の範囲に収めることが好ましい。

一実施形態において、反射領域１２の少なくとも一部の厚さをｄとすると、好ましくは（３×β）＜ｄ＜（α／３）であり、より好ましくは（５×β）＜ｄ＜（α／５）であり、さらに好ましくは（１０×β）＜ｄ＜（α／１０）である。ここで、αは、反射領域１２を形成する物質に対するマイクロ波の侵入長である。βは、反射領域１２を形成する物質に対する励起光Ｌ１の侵入長である。反射領域の厚みが前記の条件を満たすならば、検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量を第１割合以下に減衰させ、かつ、第２表面Ｓ２を経て第１領域１１に照射されるマイクロ波を第２割合以上通過させることができる。

なお、侵入長とは、（２ρ／ωμ）^１／２で表される値である（ρは導体の電気抵抗率、ωは電磁波の角周波数（＝２π×周波数）、μは導体の絶対透磁率である）。侵入長とは、電磁波が導体中に侵入できる深さを表している。表面からの深さが侵入長である地点における電流密度は、導体表面の電流密度の１／ｅになる（ｅは自然対数の底）。

他の実施形態において、前記反射領域の少なくとも一部の厚さをｄ１とし、ｄ２＝（α×β）^１／２とすると、好ましくは（１／１０）＜（ｄ１／ｄ２）＜１０であり、より好ましくは（１／５）＜（ｄ１／ｄ２）＜５であり、さらに好ましくは（１／３）＜（ｄ１／ｄ２）＜３である。なお、ｄ２とは、「反射領域１２に対する励起光Ｌ１の侵入長とマイクロ波の侵入長との相乗平均」を表している。

以上を鑑みると、反射領域１２の少なくとも一部の厚さは、材質にも左右されるが、９００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、または２００ｎｍ以下とすることができる。同様に反射領域１２の厚さは、１０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、または１００ｎｍ以上とすることができる。例えば、反射領域１２をチタン膜で実装する場合には、厚さを１００〜９００ｎｍとすることができる。反射領域１２を白金膜で実装する場合には、厚さを５０〜４５０ｎｍとすることができる。反射領域１２を金膜で実装する場合には、厚さを２５〜２２５ｎｍとすることができる。反射領域１２を銀膜で実装する場合には、厚さを２０〜１８０ｎｍとすることができる。反射領域１２を銅膜で実装する場合には、厚さを２０〜１８０ｎｍとすることができる。反射領域１２をアルミニウム膜で実装する場合には、厚さを２５〜２２５ｎｍとすることができる。

反射領域１２の少なくとも一部が前述した程度の厚さであるならば、励起光Ｌ１の大部分を反射し、マイクロ波の大部分を通過させることができる。さらに、反射領域１２が前述した程度の厚さであるならば、検体１８と第１領域１１との距離が充分に小さくなり、検体１８に由来する磁場を充分に透過させられる点においても好ましい。

一実施形態において、反射領域１２の少なくとも一部は、厚みが均一に形成されている。反射領域の厚みが均一であるならば、検体１８から生じる磁場をより高感度で検知することができる。これは、第１領域１１内のＮＶ中心の光検出磁気共鳴特性が、励起光の強度およびマイクロ波磁場の強度によって差異を生じるためである。このような差異が生じると、最適な感度を得る条件に差異が生じてしまう（もっとも、ある程度の差異ならば、視野内の座標点ごとの校正で補正が可能である）。例えば、反射領域１２の少なくとも一部における膜厚の最大値および最小値は、反射領域１２の少なくとも一部の厚さの平均値に対して、±３０％の範囲に収まっていることが好ましく、±２５％の範囲に収まっていることがより好ましく、±２０％の範囲に収まっていることがさらに好ましい。

なお、前述した反射領域１２の厚さに関する議論において、「反射領域１２の少なくとも一部」とは、例えば、励起光Ｌ１が照射される部分でありうる。あるいは、「反射領域１２の少なくとも一部」とは、基準位置領域１２ａ（後述）以外の部分でありうる。あるいは、「反射領域１２の少なくとも一部」とは、検体保持部１５が設けられる部分でありうる。好ましくは、「反射領域１２の少なくとも一部」とは、油浸対物レンズ２３の視野内に含まれている反射領域１２の一部であって、検体１８の観測範囲の少なくとも一部を包含している。

反射領域１２の材料は、特に限定されない。一実施形態において、反射領域１２は、金属層である。これは、金属は加工性に優れ、均一な膜厚を達成しやすいからである。一実施形態において、反射領域１２は、金、白金、アルミニウムまたはチタンを含む金属層である。他の実施形態において、反射領域１２は、金、白金、アルミニウムまたはチタンからなる金属層である。これらの金属は、生物に対する毒性が低いため、反射領域１２との接触により検体１８に与えられるダメージを軽減できる。なお、後述する生体親和性を有する膜１３を設ける場合には、反射領域１２の材料として、生物に対する毒性が相対的に高い物質（銀、銅など）を用いてもよい。

一実施形態において、ダイヤモンド基板１０の第２表面Ｓ２には、生体親和性を有する膜１３が設けられている。このような構成によれば、検体１８は、生体親和性を有する膜１３と接触することになる。それゆえ、ダイヤモンド基板１０（第１領域１１）との接触により検体１８に与えられるダメージを低減することができる。

生体親和性を有する膜１３の材料として利用可能な物質の具体例としては、コラーゲン、ポリリジン、フォトレジストが挙げられる。検体１８から生じる磁場の二次元的な解像度を高めるためには、生体親和性を有する膜１３の厚さは、生体親和性を維持する範囲で薄ければ薄いほどよい。一例を挙げると、生体親和性を有する膜１３の厚さは、１００ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、または１０ｎｍ以下とすることができる。なお、生体親和性を有する膜１３としてコラーゲンを塗布する場合、塗布液が弱酸性になることがあるので、反射領域１２は、酸に比較的強い物質であることが好ましい。具体的には、反射領域１２がチタンおよび金を含む方が、アルミニウムを含むよりも好ましい。

ダイヤモンド基板１０全体の厚さは、例えば、０．３ｍｍ程度とすることができる。この程度の厚さならば、ピンセットなどでの取扱が容易であり、かつ、充分な機械的強度を有していると言える。

〔撮像装置〕
次に、撮像装置１００の一実施形態について、図２、３を参照しながら説明する。図２は、本発明の一態様に係る撮像装置１００の全体構成を表す模式図である。図３は、撮像装置１００の主要部（ダイヤモンド基板１０の近傍）を表す模式図である。

撮像装置１００には、光源部２０と、蛍光画像取得部３０と、マイクロ波部４０が備えられている。撮像装置１００は、任意構成として、明視野画像取得部５０を備えていてもよい。

光源部２０は、ダイヤモンド基板１０の第１領域１１に、励起光Ｌ１を照射する。光源部２０は、例えば、波長５３２ｎｍ前後の励起光Ｌ１を放射する、レーザ光源である。光源部２０から照射された励起光Ｌ１は、広視野照明用レンズ２１、ダイクロイックミラー２２、油浸対物レンズ２３を経由して、第１領域１１に照射される。第１領域１１で発生した蛍光Ｌ２は、反射領域１２を超えて第２表面Ｓ２側へは進行できないので、油浸対物レンズ２３、ダイクロイックミラー２２、ノッチフィルタ２４、蛍光フィルタ２５、および結像レンズ２６を経由して、蛍光画像取得部３０に到達する。

油浸対物レンズ２３は、開口数（Numerical Aperture；ＮＡ）ができる限り大きいものを用いることが好ましい。開口数が大きければ、蛍光Ｌ２の集光効率が高まり、それゆえ、磁場検出の感度が高くなる。ただし、一般的に、開口数の大きい対物レンズは、作動長（Working Distance；ＷＤ）が短い。市販されている対物レンズの中では、作動長：０．３ｍｍ、開口数：１．３０、倍率：６０倍の対物レンズがバランスに優れていて好ましい。この観点からは、ダイヤモンド基板１０の厚さを０．３ｍｍ以下とすることが好ましい。

蛍光画像取得部３０は、第１領域１１から生じる蛍光Ｌ２を検知し、蛍光Ｌ２の強度の二次元的な分布を蛍光画像として取得する。第１領域１１にマイクロ波を照射しその周波数を掃引すると、検体１８から生じた磁場の強さに対応した特定の周波数において、蛍光Ｌ２が減弱する。蛍光画像取得部３０は、顕微鏡の視野内の二次元的な位置と、当該位置において蛍光Ｌ２が減弱する特定の周波数とを関連付けたデータ（蛍光画像）を生成する。このようなデータは、例えば、プロセッサ、マイクロ波発信機（マイクロ波部４０）、およびイメージセンサを組み合わせれば、得ることができる。その後、蛍光画像をさらに加工して、他のデータを生成してもよい。このようなデータの例としては、磁場の強さを二次元的に知覚できるようにしたデータが挙げられる（本明細書では、このデータを「磁場分布画像」と称する）。

マイクロ波部４０は、第１領域１１にマイクロ波を照射する。図２、３に示した例では、マイクロ波コイルとして、マイクロ波部を実装している。マイクロ波コイルは、２層プリント基板上に形成されているループコイルであって、当該２層プリント基板に垂直な面内に電流が流れるように構成されている（図３に即すると、上下方向に電流が流れるように構成されている）。その結果、ダイヤモンド基板１０に垂直な方向にマイクロ波が照射される。このとき、マイクロ波は電磁波であるから、ダイヤモンド基板１０の面内方向にマイクロ波の磁場が生成される（図３に即すると、マイクロ波部４０の間に、左右方向にマイクロ波の磁場が生成される）。

図３のように、マイクロ波部４０をダイヤモンド基板１０の両側面に配する構成とすれば、マイクロ波を第１領域１１の近くから照射できるので、より高感度な測定が可能となる。さらに、図３の構成では、反射領域１２がマイクロ波部４０を兼ねていない。そのため、反射領域１２を薄くすることができ、その結果、第１領域１１と検体１８との距離も近くなる。このことによっても、より高感度な測定が可能となる。

なお、このようにダイヤモンド基板１０の面内方向にマイクロ波の磁場を生成させる場合は、第１領域１１の表面が（１１１）面となっており、かつ、ＮＶ中心の軸が全て［１１１］方向（すなわち（１１１）面に垂直な方向）に配向しているときに、最も高感度に磁場を検出することができる。このような結晶構造の第１領域１１であれば、ＮＶ中心の軸がマイクロ波の磁場の生成方向と直交する。その結果、磁場の強さに応じた蛍光Ｌ２の変化が大きくなり、磁場の検知感度が上昇する。

撮像装置１００は、静磁場コイル４５を備えていてもよい。静磁場コイル４５は、ダイヤモンド基板１０に垂直な方向に静磁場を与える。このような静磁場を与えることにより、検体１８から生じる磁場がより検出しやすくなる。

ダイヤモンド基板１０をカバーグラス４３上に固定する際には、ダイヤモンド基板１０の端部のみを接着剤で固定することが好ましい。カバーグラス４３の底面とダイヤモンド基板１０とを接着剤で固定した場合、カバーグラス４３とダイヤモンド基板１０との間に接着剤の層が形成される。接着剤の層が形成されると、油浸対物レンズ２３からダイヤモンド基板１０までの距離が増加し、油浸対物レンズ２３の作動長に第１領域１１を収めきれなくなるおそれがあるため、ダイヤモンド基板１０の端部のみを接着剤で固定することが好ましい。

図３において、検体１８は、液体４８（培養液など）に液浸した状態になっている。このように液体４８中に検体１８を配置する場合は、液体４８が流出しないように、外壁４７を設ける。また、マイクロ波コイル（マイクロ波部４０）の配線層およびスルーホール（表側配線層と裏側配線層とを接続する構造）は、表面を撥水材で被覆しておくことが好ましい。もちろん、検体１８を、液体中以外（空気中など）に配置してもよい。

撮像装置１００は、任意構成で、明視野画像取得部５０を備えていてもよい。明視野画像取得部５０は、明視野による検体１８の画像を取得する。明視野画像取得部５０は、例えば、ＣＣＤカメラである。図２の例においては、明視野光源部５１（ＬＥＤなど）から照射された明視野用照明光Ｌ３は、広視野照明用レンズ５２、ダイクロイックミラー５３、および水浸対物レンズ５４を経由して、検体１８に到達する。その後、検体１８により反射されたり散乱されたりした光Ｌ４は、水浸対物レンズ５４、ダイクロイックミラー５３、結像レンズ５５を経由して、明視野画像取得部５０に到達する。明視野画像取得部５０は、検出した光から、明視野画像を生成する。

なお、明視野用照明光Ｌ３は、励起光Ｌ１よりも桁違いに微弱な光である。また、明視野用照明光Ｌ３は、検体１８に対する影響が最小となる波長を選ぶことができる。さらに、明視野用照明光Ｌ３は、観察が必要となる瞬間のみ照射すればよい。それゆえ、通常は、明視野用照明光Ｌ３が検体１８にダメージを及ぼすことはない。

明視野画像取得部５０が取得する明視野画像は、第２表面Ｓ２側の画像を取得することが好ましい。つまり、図２、３の水浸対物レンズ５４のように、明視野画像を取得するための対物レンズは、第２表面Ｓ２側に設置することが好ましい。これは、第２表面Ｓ２側からならば、反射領域１２によって、明視野画像の取得が妨げられないためである。逆に、第１表面Ｓ１側から明視野画像を取得しようとしても、反射領域１２がほとんど光を透過しないため、明視野画像を取得することは難しい。

図２、３のように、第１表面Ｓ１側に蛍光画像取得用の対物レンズ（油浸対物レンズ２３）を配置し、第２表面Ｓ２側に明視野画像取得用の対物レンズ（水浸対物レンズ５４）を配置することによって、検体１８の明視野画像と蛍光画像とを同時的に取得できる。

このように、撮像装置１００に明視野画像取得部５０を設ける場合は、反射領域１２の中に、基準位置領域１２ａを１箇所以上設けることが好ましい（図４を参照）。基準位置領域１２ａは、反射領域１２の中でも、反射領域１２を構成する材料の厚さが他の部分よりも薄く設けられている領域である。このような構成とすると、基準位置領域１２ａにおいては、より多くの励起光Ｌ１が反射領域１２を透過する。したがって、明視野画像取得部５０が取得する明視野画像には、励起光Ｌ１がより多く透過して見える領域が含まれるようになる。明視野画像おける励起光Ｌ１がより多く透過して見える領域は、基準位置領域１２ａに対応しているから、蛍光画像における位置と明視野画像における位置とを容易に対応付けることができる。

なお、蛍光画像における基準位置領域１２ａの位置は、例えば、検体保持部１５に、第２表面Ｓ２側から、位置合わせ用長波長光（蛍光フィルタ２５のカットオフ波長よりも長波長である赤色光）を照射することにより検出できる。位置合わせ用長波長光の照射は、同じ光量の励起光Ｌ１の照射よりは、検体１８に及ぼすダメージは少ない。しかし、基準位置領域１２ａを透過できるだけの光量が必要になるため、明視野用照明光Ｌ３よりは光量が大きい。それゆえ、位置合わせ用長波長光を長時間照射し続けると、やはり、検体１８にダメージを及ぼす場合がある。したがって、位置合わせ用長波長光は、位置合わせ時のみ、短時間だけ照射することが好ましい。この位置合わせは、図１の装置の装着後、一度のみ行えば充分である。位置合わせ用長波長光の光源および光路は、明視野用照明光と共通であってもよい。

〔撮像方法〕
本発明の一態様は、ダイヤモンド基板１０を利用した撮像方法である。以下、図５を参照しながら、前記撮像方法について説明する。

（Ｓ１０：設置工程）
Ｓ１０では、ダイヤモンド基板１０にある検体保持部１５に、検体１８を設置する。例えば、ダイヤモンド基板１０の上で観察対象となる細胞を培養することにより、設置工程は実施できる。あるいは、単に、検体保持部１５に検体１８を載置してもよい。

（Ｓ２０：光照射工程）
Ｓ２０では、ダイヤモンド基板１０の第１表面Ｓ１側から、第１領域１１に励起光Ｌ１を照射する。前述した通り、ダイヤモンド基板１０は反射領域１２を備えているので、励起光Ｌ１はほとんど反射され、検体保持部１５には第１割合以下しか到達できない。

（Ｓ３０：マイクロ波照射工程）
Ｓ３０では、ダイヤモンド基板１０の第１領域１１に、マイクロ波部４０からマイクロ波を照射する。照射するマイクロ波の周波数を掃引すると、特定の周波数において蛍光Ｌ２が大きく減弱するので、磁場の強さが検出できる。

（Ｓ４０：蛍光画像取得工程）
Ｓ４０では、検体１８から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光Ｌ２の強度の二次元的な分布を、蛍光画像として取得する。Ｓ３０においては、マイクロ波をダイヤモンド基板１０の全体に照射しているので、二次元的な蛍光画像が取得できる。なお通常は、Ｓ４０においても、励起光およびマイクロ波は照射されている。

本発明の一実施形態に係る撮像方法によれば、検体保持部１５に到達する励起光Ｌ１の光量を、従来よりも低減することができる。それゆえ、前記撮像方法は、光によりダメージを受ける検体の撮像に有利である。例えば、撮像対象が、細胞、タンパク質、細胞内小組織、ＤＮＡなどの生物検体である場合に有利である。同様の理由によって、長時間にわたる観察（例えば、１時間以上、１０時間以上、１日以上、場合によっては１週間以上）にも、前記撮像方法は有利に用いられる。

〔まとめ〕
本発明は、以下の構成を包含している。

＜１＞
窒素−空孔複合体中心を含有する第１領域１１を備えるダイヤモンド基板１０と、
前記ダイヤモンド基板１０の第１表面Ｓ１側から該ダイヤモンド基板１０の前記第１領域１１に励起光Ｌ１を照射する光源部２０と、
前記ダイヤモンド基板１０の第１表面Ｓ１と対向する第２表面Ｓ２側に検体を保持する検体保持部１５と、
前記励起光Ｌ１を照射された前記第１領域１１から生じる蛍光Ｌ２であって、前記検体１８から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光Ｌ２の強度の二次元的な分布を蛍光画像として取得する蛍光画像取得部３０と、
所定の周波数のマイクロ波を、前記第１領域に照射するマイクロ波部４０と、
を備え、
前記ダイヤモンド基板１０は、前記励起光Ｌ１を反射する反射領域１２をさらに備え、
前記反射領域１２は、
前記第１領域１１と前記第２表面Ｓ２との間に設けられており、
前記第２表面Ｓ２から前記検体保持部１５に保持されている前記検体１８に到達する前記励起光Ｌ１の光量を、第１割合以下に減衰させ、
前記マイクロ波部４０から前記第２表面Ｓ２を経て前記第１領域１１に照射される前記マイクロ波を、第２割合以上通過させる、
ことを特徴とする撮像装置１００。

前記構成によれば、検体１８に到達する励起光Ｌ１を低減できる。それゆえ、励起光Ｌ１を暴露されることによって検体１８が受けるダメージを低減できる。また、前記構成によれば、第１領域１１へのマイクロ波の到達が妨げられない。それゆえ、充分な強さのマイクロ波が、マイクロ波部４０から第１領域１１に到達できる。したがって、検体１８から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光Ｌ２を、高い位置解像度で測定することができる。

＜２＞
前記反射領域１２の少なくとも一部の厚さをｄとすると、（３×β）＜ｄ＜（α／３）である、
ことを特徴とする＜１＞に記載の撮像装置１００。
（ここで、αは前記反射領域１２を形成する物質に対する前記マイクロ波の侵入長であり；βは前記反射領域１２を形成する物質に対する前記励起光の侵入長である）。

前記構成によれば、反射領域１２は、検体１８に到達する励起光Ｌ１をより充分に低減する。また、前記構成によれば、反射領域１２は、より充分な強さのマイクロ波を、マイクロ波部４０から第１領域１１に到達させる。

＜３＞
前記反射領域の少なくとも一部の厚さをｄ１とし、ｄ２＝（α×β）^１／２とすると、（１／１０）＜（ｄ１／ｄ２）＜１０である、
ことを特徴とする請求項１または２に記載の撮像装置。

（ここで、αは前記反射領域を形成する物質に対する前記マイクロ波の侵入長であり；βは前記反射領域を形成する物質に対する前記励起光の侵入長である）。

前記構成によれば、＜２＞と同様の効果が得られる。

＜４＞
前記ダイヤモンド基板１０の前記第２表面Ｓ２には、生体親和性を有する膜１３が設けられており、
前記反射領域１２は、前記膜１３を介して前記検体１８と接している、
ことを特徴とする、＜１＞から＜３＞の何れかに記載の撮像装置１００。

前記構成によれば、検体１８は、生体親和性を有する膜１３と接触することになる。それゆえ、反射領域１２が生物に対する毒性が相対的に高い物質（銀、銅など）で構成されていたとしても、反射領域１２との接触により検体１８が受けるダメージを低減することができる。

＜５＞
前記検体１８の明視野画像を取得する明視野画像取得部５０をさらに備える、
ことを特徴とする＜１＞から＜４＞の何れかに記載の撮像装置１００。

前記構成によれば、検体１８から生じる磁場の強度を画像化した蛍光画像に加えて、検体１８の明視野画像をも取得することができる。

＜６＞
前記明視野画像取得部５０は、前記ダイヤモンド基板１０の前記第２表面Ｓ２側の明視野画像を取得する、
ことを特徴とする＜５＞に記載の撮像装置１００。

前記構成によれば、検体１８から生じる磁場の強度を画像化した蛍光画像と、検体１８の明視野画像とを、同時的に取得することができる。それゆえ、検体１８から生じる磁場の強度の測定と、検体１８の明視野観察とを、同時的に行うことができる。

＜７＞
前記反射領域１２は、厚さが他の部分よりも薄く設けられた基準位置領域１２ａを１つ以上備える、
ことを特徴とする＜６＞に記載の撮像装置１００。

前記構成によれば、基準位置領域１２ａは、励起光Ｌ１をより多く第２表面Ｓ２側に透過させる。同様に、基準位置領域１２ａは、位置合わせ用長波長光をより多く第１表面Ｓ１側に透過させる。それゆえ、基準位置領域１２ａを利用して、検体１８から生じる磁場の強度を画像化した蛍光画像と、検体１８の明視野画像との間の位置合わせが可能になる。

＜８＞
前記反射領域１２は、金属層である、
ことを特徴とする＜１＞から＜７＞の何れかに記載の撮像装置１００。

前記構成によれば、反射領域１２を容易に形成することができる。

＜９＞
前記反射領域１２の少なくとも一部は、厚みが均一に形成されている、
ことを特徴とする＜１＞から＜８＞の何れかに記載の撮像装置１００。

前記構成によれば、検体１８から生じる磁場をより高感度で検知することができる。

＜１０＞
窒素−空孔複合体中心を含有する第１領域１１を備えるダイヤモンド基板１０に、検体１８を設置する設置工程Ｓ１０と、
前記第１領域１１に励起光Ｌ１を照射する光照射工程Ｓ２０と、
前記第１領域１１に、マイクロ波部４０からマイクロ波を照射するマイクロ波照射工程Ｓ３０と、
前記励起光Ｌ１を照射された前記第１領域１１から生じる蛍光Ｌ２であって、前記検体１８から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光Ｌ２の強度の二次元的な分布を蛍光画像として取得する蛍光画像取得工程Ｓ４０と、
を含み、
前記ダイヤモンド基板１０は、前記励起光Ｌ１が入射する第１表面Ｓ１と、前記検体１８が設置される第２表面Ｓ２とを有しており、該第１表面Ｓ１と該第２表面Ｓ２とは対向しており、
前記第１領域１１と前記第２表面Ｓ２との間には、前記励起光Ｌ１を反射する反射領域１２が設けられており、
前記反射領域１２は、
前記第２表面Ｓ２から前記検体１８に到達する前記励起光Ｌ１の光量を、第１割合以下に減衰させ、
前記マイクロ波部４０から前記第２表面Ｓ２を経て前記第１領域１１に照射される前記マイクロ波を、第２割合以上通過させる、
ことを特徴とする、撮像方法。

前記構成によれば、＜１＞と同様の効果が得られる。

前記各項目で記載した内容は、他の項目においても適宜援用できる。本発明は前述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。したがって、異なる実施形態にそれぞれ開示されている技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても、本発明の技術的範囲に含まれる。

本明細書中に記載された学術文献および特許文献のすべてが、本明細書中において参考文献として援用される。

本発明の一実施形態に係る撮像装置により、検体から生じる磁場の強度を観測した。具体的には、培養液内に１μｍ径の超常磁性粒子を撤布して、図２に示す構成の撮像装置により磁場分布画像および明視野像を取得した。この磁場分布画像とは、磁場の強度の二次元的な分布を画像化したものであり、蛍光画像を処理して得られる。具体的な処理の方法としては、［Y.Hatano et al.:Phys.Status Solidi A,215,1800254 (2018)］に開示されている方法を採用した。

観測結果を図６に示す。図６の（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、観察開始直後、観察開始から３時間後、観察開始から６時間後、観察開始から１２時間後における、磁場分布画像である。また、図６の（ｅ）は、観察開始から８分後における、明視野像（上）および磁場分布画像（下）である。同図において、明視野像において四角い枠で囲った部分が、磁場分布画像の視野に該当する。このように、明視野像および磁場分布像を組み合わせた観察も、本発明の一実施形態に係る撮像装置によれば可能となる。これらの図から、以下のことが示唆される。

図６の（ａ）〜（ｄ）によると、観察開始時においては培養液中に分散していた超常磁性粒子が、時間経過につれて徐々に沈降し、ダイヤモンド基板表面上の磁場としてはっきりと観察されることがわかる。本実施例で使用した反射領域は厚さが薄いため（１００ｎｍのチタン膜）、磁場の強度の二次元的な分布をこのように鮮明に画像化することができる。

また、図６の（ｅ）上部の明視野像には、励起光がほとんど表れていない。つまり、第１領域に照射された励起光は、反射領域で反射され、検体保持部にはほとんど到達していない。したがって、細胞または細菌を観察対象とした際にも、励起光を曝露されたことに起因するダメージを軽減することが可能である。

本実施例で観察しているのは超常磁性粒子であるが、この観察は細胞および細菌などにも応用可能である。例えば、プローブを介して超常磁性粒子を生体分子に結合させれば、当該生体分子の動態を追跡することができる。

１０ ダイヤモンド基板
１１ 第１領域
１２ 反射領域
１２ａ 基準位置領域
１５ 検体保持部
１８ 検体
２０ 光源部
３０ 蛍光画像取得部
４０ マイクロ波部
５０ 明視野画像取得部
１００ 撮像装置
Ｌ１ 励起光
Ｌ２ 蛍光
Ｓ１ 第１表面
Ｓ２ 第２表面
Ｓ１０ 設置工程
Ｓ２０ 光照射工程
Ｓ３０ マイクロ波照射工程
Ｓ４０ 蛍光画像取得工程

Claims (10)

1. 窒素−空孔複合体中心を含有する第１領域を備えるダイヤモンド基板と、
   前記ダイヤモンド基板の第１表面側から該ダイヤモンド基板の前記第１領域に励起光を照射する光源部と、
   前記ダイヤモンド基板の第１表面と対向する第２表面側に検体を保持する検体保持部と、
   前記励起光を照射された前記第１領域から生じる蛍光であって、前記検体から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光の強度の二次元的な分布を蛍光画像として取得する蛍光画像取得部と、
   所定の周波数のマイクロ波を、前記第１領域に照射するマイクロ波部と、
   を備え、
   前記ダイヤモンド基板は、前記励起光を反射する反射領域をさらに備え、
   前記反射領域は、
   前記第１領域と前記第２表面との間に設けられており、
   前記第２表面から前記検体保持部に保持されている前記検体に到達する前記励起光の光量を、第１割合以下に減衰させ、
   前記マイクロ波部から前記第２表面を経て前記第１領域に照射される前記マイクロ波を、第２割合以上通過させる、
   ことを特徴とする撮像装置。
2. 前記反射領域の少なくとも一部の厚さをｄとすると、（３×β）＜ｄ＜（α／３）である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の撮像装置。
   （ここで、αは前記反射領域を形成する物質に対する前記マイクロ波の侵入長であり；βは前記反射領域を形成する物質に対する前記励起光の侵入長である）
3. 前記反射領域の少なくとも一部の厚さをｄ１とし、ｄ２＝（α×β）^１／２とすると、（１／１０）＜（ｄ１／ｄ２）＜１０である、
   ことを特徴とする請求項１または２に記載の撮像装置。
   （ここで、αは前記反射領域を形成する物質に対する前記マイクロ波の侵入長であり；βは前記反射領域を形成する物質に対する前記励起光の侵入長である）
4. 前記ダイヤモンド基板の前記第２表面には、生体親和性を有する膜が設けられており、
   前記反射領域は、前記膜を介して前記検体と接している、
   ことを特徴とする、請求項１から３の何れか１項に記載の撮像装置。
5. 前記検体の明視野画像を取得する明視野画像取得部をさらに備える、
   ことを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の撮像装置。
6. 前記明視野画像取得部は、前記ダイヤモンド基板の前記第２表面側の明視野画像を取得する、
   ことを特徴とする請求項５に記載の撮像装置。
7. 前記反射領域は、厚さが他の部分よりも薄く設けられた基準位置領域を１つ以上備える、
   ことを特徴とする請求項６に記載の撮像装置。
8. 前記反射領域は、金属層である、
   ことを特徴とする請求項１から７の何れか１項に記載の撮像装置。
9. 前記反射領域の少なくとも一部は、厚みが均一に形成されている、
   ことを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載の撮像装置。
10. 窒素−空孔複合体中心を含有する第１領域を備えるダイヤモンド基板に、検体を設置する設置工程と、
    前記第１領域に励起光を照射する光照射工程と、
    前記第１領域に、マイクロ波部からマイクロ波を照射するマイクロ波照射工程と、
    前記励起光を照射された前記第１領域から生じる蛍光であって、前記検体から生じる磁場の強度に応じて変化する蛍光の強度の二次元的な分布を蛍光画像として取得する蛍光画像取得工程と、
    を含み、
    前記ダイヤモンド基板は、前記励起光が入射する第１表面と、前記検体が設置される第２表面とを有しており、該第１表面と該第２表面とは対向しており、
    前記第１領域と前記第２表面との間には、前記励起光を反射する反射領域が設けられており、
    前記反射領域は、
    前記第２表面から前記検体に到達する前記励起光の光量を、第１割合以下に減衰させ、
    前記マイクロ波部から前記第２表面を経て前記第１領域に照射される前記マイクロ波を、第２割合以上通過させる、
    ことを特徴とする、撮像方法。