JP2020191806A - ナノデバイス、フォースセンサ、力の測定方法、および試薬キット - Google Patents
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Abstract
Description
[1]
ナノデバイスであって、
コイル構造および第1のハンドルを備え、
前記コイル構造が、スカフォールドおよび複数のステイプルを含み、
前記スカフォールドが、1本鎖ポリヌクレオチドであり、
前記ステイプルが、それぞれ、前記スカフォールドに相補的な塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記第1のハンドルが、前記スカフォールドに相補的な第1の塩基配列と前記スカフォールドに相補的でない第2の塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記スカフォールドが、前記ステイプルとのハイブリダイズにより架橋され、以て4ヘリックスバンドルコイルを形成しており、
前記ステイプルによる前記スカフォールドの架橋が、ヌクレオチドの二重螺旋の周期性と異なる周期性で実施され、
前記第1のハンドルが、前記コイル構造の一方の端部において、前記スカフォールドの
少なくとも2つのヘリックス形成部位とハイブリダイズしている、ナノデバイス。
[2]
さらに、第2のハンドルを備え、
前記第2のハンドルが、前記スカフォールドに相補的な第1の塩基配列と前記スカフォールドに相補的でない第2の塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記第2のハンドルが、前記コイル構造の他方の端部において、前記スカフォールドの少なくとも2つのヘリックス形成部位とハイブリダイズしている、前記ナノデバイス。
[3]
前記スカフォールドが、環状1本鎖ポリヌクレオチドである、前記ナノデバイス。
[4]
前記スカフォールドの長さが、7500〜8500残基である、前記ナノデバイス。
[5]
前記ステイプルの長さが、それぞれ、10〜100残基である、前記ナノデバイス。
[6]
前記ステイプルによる前記スカフォールドの架橋周期が、32残基である、前記ナノデバイス。
[7]
前記スカフォールドが、周期的にヌクレオチド残基の挿入および/または欠失を含む、前記ナノデバイス。
[8]
前記スカフォールドが、隣接する2つのヘリックス形成部位にヌクレオチド残基の挿入を含み、且つ、残りの2つのヘリックス形成部位にヌクレオチド残基の欠失を含む、前記ナノデバイス。
[9]
前記スカフォールドが、スカフォールドが32残基ごとに2残基のヌクレオチドの挿入または欠失を含む、前記ナノデバイス。
[10]
前記第1および/または第2のハンドルの長さが、それぞれ、20〜200残基である、前記ナノデバイス。
[11]
前記第1および/または第2のハンドル中の前記第1の塩基配列の長さが、それぞれ、10〜100残基である、前記ナノデバイス。
[12]
前記第1および/または第2のハンドル中の前記第2の塩基配列の長さが、それぞれ、10〜100残基である、前記ナノデバイス。
[13]
さらに、第1のアンチハンドルを備え、
前記第1のアンチハンドルが、前記第1のハンドル中の前記第2の塩基配列に相補的な塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドと、対象物に対する結合性を有する物質とを備える分子であり、
前記第1のアンチハンドルが、前記第1のハンドル中の前記第2の塩基配列とハイブリダイズしている、前記ナノデバイス。
[14]
さらに、第2のアンチハンドルを備え、
前記第2のアンチハンドルが、前記第2のハンドル中の前記第2の塩基配列に相補的な塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドと、対象物に対する結合性を有する物質とを備える分子であり、
前記第2のアンチハンドルが、前記第2のハンドル中の前記第2の塩基配列とハイブリダイズしている、前記ナノデバイス。
[15]
前記ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドが、DNAである、前記ナノデバイス。
[16]
前記ナノデバイスを備えるフォースセンサ。
[17]
前記ナノデバイスにかかる力を測定することを含む、力の測定方法。
[18]
前記力が、10〜60pNの力である、前記方法。
[19]
前記測定が、オリゴリジン−PEGの存在下で実施される、前記方法。
[20]
コイル構造および第1のハンドルを含む試薬キットであって、
前記コイル構造が、スカフォールドおよび複数のステイプルを含み、
前記スカフォールドが、1本鎖ポリヌクレオチドであり、
前記ステイプルが、それぞれ、前記スカフォールドに相補的な塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記第1のハンドルが、前記スカフォールドに相補的な第1の塩基配列と前記スカフォールドに相補的でない第2の塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記スカフォールドが、前記ステイプルとのハイブリダイズにより架橋され、以て4ヘリックスバンドルコイルを形成しており、
前記ステイプルによる前記スカフォールドの架橋が、ヌクレオチドの二重螺旋の周期性と異なる周期性で実施され、
前記第1のハンドルが、前記コイル構造の一方の端部において、前記スカフォールドの少なくとも2つのヘリックス形成部位とハイブリダイズできるように構成されている、試薬キット。
[21]
さらに、第2のハンドルを含み、
前記第2のハンドルが、前記スカフォールドに相補的な第1の塩基配列と前記スカフォールドに相補的でない第2の塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記第2のハンドルが、前記コイル構造の他方の端部において、前記スカフォールドの少なくとも2つのヘリックス形成部位とハイブリダイズできるように構成されている、前記試薬キット。
[22]
前記スカフォールドが、環状1本鎖ポリヌクレオチドである、前記試薬キット。
[23]
前記スカフォールドの長さが、7500〜8500残基である、前記試薬キット。
[24]
前記ステイプルの長さが、それぞれ、10〜100残基である、前記試薬キット。
[25]
前記ステイプルによる前記スカフォールドの架橋周期が、32残基である、前記試薬キット。
[26]
前記スカフォールドが、周期的にヌクレオチド残基の挿入および/または欠失を含む、前記試薬キット。
[27]
前記スカフォールドが、隣接する2つのヘリックス形成部位にヌクレオチド残基の挿入を含み、且つ、残りの2つのヘリックス形成部位にヌクレオチド残基の欠失を含む、前記試薬キット。
[28]
前記スカフォールドが、スカフォールドが32残基ごとに2残基のヌクレオチドの挿入または欠失を含む、前記試薬キット。
[29]
前記第1および/または第2のハンドルの長さが、それぞれ、20〜200残基である、前記試薬キット。
[30]
前記第1および/または第2のハンドル中の前記第1の塩基配列の長さが、それぞれ、10〜100残基である、前記試薬キット。
[31]
前記第1および/または第2のハンドル中の前記第2の塩基配列の長さが、それぞれ、10〜100残基である、前記試薬キット。
[32]
さらに、第1のアンチハンドルを含み、
前記第1のアンチハンドルが、前記第1のハンドル中の前記第2の塩基配列に相補的な塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドと、対象物に対する結合性を有する物質とを備える分子であり、
前記第1のアンチハンドルが、前記第1のハンドル中の前記第2の塩基配列とハイブリダイズできるように構成されている、前記試薬キット。
[33]
さらに、第2のアンチハンドルを含み、
前記第2のアンチハンドルが、前記第2のハンドル中の前記第2の塩基配列に相補的な塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドと、対象物に対する結合性を有する物質とを備える分子であり、
前記第2のアンチハンドルが、前記第2のハンドル中の前記第2の塩基配列とハイブリダイズできるように構成されている、前記試薬キット。
[34]
前記ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドが、DNAである、前記試薬キット。
本発明のナノデバイスは、コイル構造および少なくとも1つのハンドルを備えるナノデバイスである。
には、コイルバネ状のコイルを意味してよい。
リックスバンドルコイルである。ここでいう「ヘリックス」とは、ヌクレオチドの二重螺旋(具体的には、スカフォールドとステイプルがハイブリダイズして形成される二本鎖ヌクレオチド)を意味する。「4ヘリックスバンドルコイル」とは、4本のヘリックスが束ねられて(バンドル(bundle)されて)形成されたコイルを意味する。4本のヘリックスは、正方格子(square lattice)状に束ねられていてよい。すなわち、4本のヘリックスが正方格子状に束ねられ、さらに、束ねられた4本のヘリックスがコイル構造を形成してよい。説明の便宜上、4本のヘリックスを、それぞれ、「第1〜第4のヘリックス」ともいう。正方格子状に束ねられた第1〜第4のヘリックスおよび4ヘリックスバンドルコイルの模式図を図1に示す。スカフォールドは、より具体的には、ステイプルとのハイブリダイズにより架橋され、以てコイル構造を形成する。言い換えると、スカフォールドとステイプルのハイブリダイズにより第1〜第4のヘリックスが架橋され、以てコイル構造が形成される。第1〜第4のヘリックスは、それぞれ隣接するヘリックスと架橋される。第1のヘリックスは第2と第4のヘリックスに、第2のヘリックスは第3と第1のヘリックスに、第3のヘリックスは第4と第2のヘリックスに、第4のヘリックスは第1と第3のヘリックスに、それぞれ隣接してよい。すなわち、第1のヘリックスは第2と第4のヘリックスに、第2のヘリックスは第3と第1のヘリックスに、第3のヘリックスは第4と第2のヘリックスに、第4のヘリックスは第1と第3のヘリックスに、それぞれ架橋されてよい。すなわち、第1のヘリックスが第2と第4のヘリックスに、第2のヘリックスが第3と第1のヘリックスに、第3のヘリックスが第4と第2のヘリックスに、第4のヘリックスが第1と第3のヘリックスに、それぞれ架橋されることにより、第1〜第4のヘリックスが正方格子(square lattice)状に束ねられ、以てコイル構造が形成されてよい。4ヘリックスバンドルコイルを形成する条件については、例えば、特開2014-168831の記載
を参照できる。
0残基以下、9000残基以下、8500残基以下、または8000残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。スカフォールドの長さは、具体的には、例えば、6500〜10000残基、7000〜9000残基、または7500〜8500残基であってもよい。
。
ロスオーバであってよい。なお、線状スカフォールドの場合、当該線状スカフォールドを環状にしたと仮定した場合に上記のスカフォールドクロスオーバの条件を満たす部位を「スカフォールドクロスオーバ」とみなしてよい。
の第1〜第3のヘリックス形成部位が束ねられる、すなわち、コイル構造の第1〜第3のヘリックスが束ねられる。ステイプルによる架橋部位を、「ステイプルクロスオーバ」ともいう。
ォールドの架橋周期は、例えば、10.5残基の整数倍以外の周期(具体的には、21残基の整数倍以外の周期)であってよい。ステイプルによるスカフォールドの架橋周期は、具体的には、例えば、32残基であってよい。「ステイプルによるスカフォールドの架橋周期が32残基である」とは、スカフォールドが32残基ごとにステイプルによって架橋されていることを意味する。なお、架橋周期は、特記しない限り、ステイプルの残基数を基準とするものとする。すなわち、スカフォールドはヌクレオチドの挿入および/または欠失を含んでいてよいため、スカフォールドの残基数を基準とする架橋周期は、上記例示したステイプルの残基数を基準とする架橋周期の数値とは異なる場合がある。すなわち、例えば、スカフォールドの或るヘリックス形成部位が32残基ごとに2残基のヌクレオチドの挿入または欠失を含み、且つ架橋周期が32残基である場合、スカフォールドの当該或るヘリックス形成部位は34残基または30残基ごとに他のヘリックス形成部位(具体的には、隣接するヘリックス形成部位)と架橋されてよい。具体的には、例えば、スカフォールドの第1と第2のヘリックス形成部位が32残基ごとに2残基のヌクレオチドの挿入を含み、スカフォールドの第3と第4のヘリックス形成部位が32残基ごとに2残基のヌクレオチドの欠失を含み、且つ架橋周期が32残基である場合、スカフォールドの第1と第2のヘリックス形成部位は34残基の周期で架橋され、スカフォールドの第3と第4のヘリックス形成部位は30残基の周期で架橋され、スカフォールドの第1と第4のヘリックス形成部位は第1のヘリックス形成部位34残基に対し第4のヘリックス形成部位30残基の周期で架橋され、スカフォールドの第2と第3のヘリックス形成部位は第2のヘリックス形成部位34残基に対し第3のヘリックス形成部位30残基の周期で架橋されてよい。
ミ技術を利用して実施することができる。スカフォールドとステイプルのハイブリダイズによるコイル構造の形成は、具体的には、例えば、特開2014-168831の記載に従って実施
することができる。すなわち、例えば、スカフォールドとステイプルを混合し、高温(例えば80℃)から低温(例えば24℃)の範囲で徐々に温度を低下させることにより、コイル構造を形成することができる。
は、例えば、1つまたは2つのハンドルを備えていてよい。本発明のナノデバイスが1つのハンドルを備える場合、当該ハンドルを「第1のハンドル」ともいう。本発明のナノデバイスが2つのハンドルを備える場合、当該ハンドルをそれぞれ「第1および第2のハンドル」ともいう。言い換えると、本発明のナノデバイスは、第1のハンドルを備えていてよい。すなわち、本発明のナノデバイスは、具体的には、コイル構造および第1のハンドルを備えるナノデバイスであってよい。本発明のナノデバイスは、さらに、第2のハンドルを備えていてもよい。また、言い換えると、少なくとも1つのハンドルは、第1のハンドルを含んでいてよい。少なくとも1つのハンドルは、さらに、第2のハンドルを含んでいてよい。少なくとも1つのハンドルは、特に、第1および第2のハンドルからなるものであってよい。本発明のナノデバイスが複数のハンドル(例えば第1および第2のハンドル)を備える場合、下記のハンドルに関する記載は、特記しない限り、複数のハンドルにそれぞれ独立に適用できる。
イブリダイズできる。ハンドルとスカフォールドのハイブリダイズにより、スカフォールドが架橋されてもよい。
カフォールドクロスオーバに、より具体的には、スカフォールドクロスオーバの一部または全部の塩基配列に)ハイブリダイズしたハンドルの量の比率が、5%以下、2%以下、1%以下、または0%であることを意味してよい。
えば、短いコイル構造結合部位1つまたは2つと長いコイル構造結合部位1つを含むものであってもよい。
いてスカフォールドの第1と第4のヘリックス形成部位とハイブリダイズする」とは、ハンドルの2つのコイル構造結合部位が、コイル構造の端部に位置するスカフォールドクロスオーバの、第1のヘリックス形成部位の一部とみなされる塩基配列と第4のヘリックス形成部位の一部とみなされる塩基配列にそれぞれハイブリダイズすることを意味してよい。ハンドルが少なくとも2本のヘリックスに結合することにより、例えば、60pN等の後述するような強度の力の測定にも耐えるナノデバイスが得られる。
配列を含む。アンチハンドルは、特に、ハンドルのアンチハンドル結合部位に相補的な塩基配列からなるものであってよい。アンチハンドル中の、ハンドルのアンチハンドル結合部位に相補的な塩基配列を、「ハンドル結合部位」ともいう。アンチハンドルのハンドル結合部位は、具体的には、ハンドルのアンチハンドル結合部位の一部または全部の塩基配列に相補的であってよい。すなわち、「ハンドル結合部位」とは、具体的には、アンチハンドル中の、ハンドルのアンチハンドル結合部位の一部または全部の塩基配列に相補的な塩基配列を意味してよい。
挙げられる。ビオチン結合タンパク質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジンが挙げられる。ビオチンは、ビオチン結合タンパク質を備える対象物に対して結合性を有する。ビオチン結合タンパク質は、ビオチンを備える対象物に対して結合性を有する。細胞接着性ペプチドは、細胞等のインテグリンを備える対象物に対して結合性を有する。抗体は、対応するエピトープを備える対象物に対して結合性を有する。
キメラ配列等のそれらのキメラ配列であってもよい。スカフォールド、ステイプル、ハン
ドル、およびアンチハンドルは、いずれも、特に、DNAであってよい。なお、RNAにおける「U」塩基とDNAにおける「T」塩基は、配列同一性の算出の際に同一塩基とみなしてよい
。
は、本発明のナノデバイスの伸縮(具体的にはコイル構造の伸縮)の測定手段等の諸条件に応じて、適宜選択できる。例えば、ステイプルが検出用ラベル等の修飾を有していてもよく、ハンドルが検出用ラベル等の修飾を有していてもよく、アンチハンドルが検出用ラベル等の修飾を有していてもよい。ステイプルは、例えば、コイル構造が周期的に検出用ラベル等の修飾を有するように修飾されていてもよい。ステイプルは、例えば、コイル構造が128残基周期で検出用ラベル等の修飾を有するように修飾されていてもよい。本発明のナノデバイスが複数個の検出用ラベルを有するように修飾を実施することにより、例えば、高感度での検出が可能となり得る。修飾は、例えば、1本鎖オリゴヌクレオチドの末端になされていてよい。
は、それぞれ、結合(ハイブリダイズ)した場合に本発明のナノデバイスが形成されるように構成されていればよい。ハンドルとアンチハンドルは、結合(ハイブリダイズ)した状態で提供されてもよく、結合(ハイブリダイズ)していない状態で提供されてもよい。ハンドルとアンチハンドルが結合(ハイブリダイズ)していない状態で提供される場合、ハンドルとアンチハンドルは、それぞれ、結合(ハイブリダイズ)した場合に本発明のナノデバイスが形成されるように構成されていればよい。
本発明のフォースセンサは、本発明のナノデバイスを備えるフォースセンサである。
本発明の方法は、本発明のナノデバイスを用いた力の測定方法である。本発明の方法は、具体的には、本発明のナノデバイスにかかる力を測定することを含む、力の測定方法であってよい。本発明のナノデバイスは、例えば、本発明のフォースセンサの形態で用いることができる。
ハンドルとビオチン結合タンパク質を備える測定対象物とを結合することができる。また、例えば、細胞接着性ペプチドを備えるアンチハンドルを介して、ハンドルと細胞等のインテグリンを備える測定対象物とを結合することができる。
発明のナノデバイスを予めオリゴリジン−PEGでコーティングしてから利用することによ
り、本発明の方法をオリゴリジン−PEGの存在下で実施することができる。本発明の方法
をオリゴリジン−PEGの存在下で実施することにより、例えば、本発明のナノデバイスの
分解が防止される。本発明の方法をオリゴリジン−PEGの存在下で実施することにより、
特に、DNaseが存在する条件における本発明のナノデバイスの分解が防止される。DNaseが存在する条件としては、細胞培養条件が挙げられる。オリゴリジン−PEGにおけるリジン
の残基数は、例えば、2以上、3以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、または10以上であってもよく、20以下、15以下、12以下、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、または5以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。オリゴリジン−PEGにおけるリジンの残基数は、具体的には、例えば、2〜2
0、5〜15、または7〜12であってもよい。オリゴリジン−PEGにおけるPEG部分の分子量は、例えば、重量平均分子量として、1000以上、2000以上、3000以上、4000以上、5000以上、または7000以上であってもよく、20000以下、15000以下、10000以下、7000以下、5000以下、または4000以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。オリゴリジン−PEGにおけ
るPEG部分の分子量は、具体的には、例えば、重量平均分子量として、1000〜200
00、2000〜15000、または3000〜10000であってもよい。
するオリゴリジン−PEG中のリジン残基の比率に換算して、25%以上、50%以上、7
5%以上、または100%以上であってもよく、200%以下、150%以下、125%以下、または100%以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。オリゴリジン−PEGの使用量は、具体的には、例えば、本発明のナノデバイス中のリ
ン酸基の数に対するオリゴリジン−PEG中のリジン残基の比率に換算して、50〜100
%であってもよい。
位置を測定することにより、蛍光分子の位置の変位を測定することができ、以て本発明のナノデバイスの伸縮を測定することができる。蛍光分子の位置は蛍光シグナルの発生位置として測定することができる。具体的には、例えば、M. Iwaki et al. A programmable DNA origami nanospring that reveals force-induced adjacent binding of myosin VI heads. Nature Communications volume 7, Article number: 13715 (2016)に記載の手法により、蛍光スポットの形状変化に基づいて本発明のナノデバイスの伸縮を測定することができる。また、例えば、本発明のナノデバイスの伸縮に伴う蛍光強度の変化に基づき、本発明のナノデバイスの伸縮を測定することができる。すなわち、例えば、測定対象物間の距離の変化(すなわち本発明のナノデバイスの伸縮)に伴い蛍光強度が増大または減少するように構成し、蛍光強度の変化に基づいて本発明のナノデバイスの伸縮を測定することができる。また、本発明のナノデバイスの伸縮は、例えば、直接観察することもできる。具体的には、例えば、コイル構造の変化をクライオ電子顕微鏡等の電子顕微鏡を用いて直接観察することにより、本発明のナノデバイスの伸縮を測定することができる。
鎖DNA(配列番号1)を設計した。ステイプルおよびハンドルを、フリーソフトウェアCaDNAnoを用いて設計した。スカフォールドとステイプルは、第1〜第4のヘリックスが正方格子(square lattice)状に束ねられ、以てコイル構造(4ヘリックスバンドルコイル)が形成されるように構成した(図1)。ステイプルのデザインを図2に示す。ハンドルのデザインを図3に示す。アンチハンドルのデザインを図4に示す。本実施例においては、配列番号1の、17〜2106位が第1のヘリックス形成部位、2107〜2144位が第1と第2のヘリックス形成部位間のスカフォールドクロスオーバ、2145〜4234位が第2のヘリックス形成部位、4235〜4256位が第2と第3のヘリックス形成部位間のスカフォールドクロスオーバ、4257〜6104位が第3のヘリックス形成部位、6105〜6130位が第3と第4のヘリックス形成部位間のスカフォールドクロスオーバ、6131〜7978位が第4のヘリックス形成部位、7979〜8064位と1〜16位が第4と第1のヘリックス形成部位間のスカフォールドクロスオ
ーバである。なお、上述の通り、ハンドルの説明において、スカフォールドクロスオーバは、ヘリックス形成部位の一部とみなしてよい。ハンドルAは、第1と第4のヘリックス
形成部位にハイブリダイズするようにデザインした。ハンドルAは、具体的には、配列番
号1の1〜16位(第1のヘリックス形成部位の一部とみなしてよい)と7979〜7994位(第
4のヘリックス形成部位の一部とみなしてよい)にハイブリダイズするようにデザインした。ハンドルBは、第2と第3のヘリックス形成部位にハイブリダイズするようにデザイ
ンした。ハンドルBは、具体的には、配列番号1の2126〜2144位(第2のヘリックス形成
部位の一部とみなしてよい)と6105〜6117位(第3のヘリックス形成部位の一部とみなしてよい)にハイブリダイズするようにデザインした。ステイプル、ハンドルAとB、およびアンチハンドルAとBを、DNA合成メーカーから購入した。ステイプルの一部(フォースセ
ンサの端から128 bp毎に配置されたステイプル)は、蛍光色素Cy3で5’末端を修飾した形態で購入した。アンチハンドルAは、5’末端をチオール化した形態で購入した。アンチハンドルBは、3’末端をビオチン化した形態で購入した。購入したアンチハンドルAは、架
橋剤であるsmccを介して、細胞接着性のRGDモチーフを有するペプチド(RGDfK)を5’末
端に共有結合させた。
よびアンチハンドルを混合後、10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 14 mM MgCl2条件下にて市販のサーマルサイクラーを用いてアニーリングを行った。アニーリングは、80℃から60℃ま
で2時間かけて冷却し、続けて、60℃から24℃まで24時間かけて冷却することにより行っ
た。得られたナノ構造物は、2%のアガロースゲル電気泳動を行い、凝集した構造物や欠
損のある構造物を分離したのち、最も移動度の大きいシャープなバンドを切り出し、スピンカラムにて精製を行い、フォースセンサを得た。
有するPEG(ALAMANDA Polymers)とフォースセンサを、リジン残基の数とフォースセンサ内のリン酸基の数が1:16, 1:8, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1の比率となるように混合し室温で1分間静置した。アガロースゲル電気泳動にてフォースセンサの移動度を確認し、移動
度の少ない条件(すなわち、電気的に中性付近で、適度にPEGコートされ、センサの凝集
のない条件)を確認した。その結果、特に、上記比率が1:2〜1:1の場合にセンサの凝集を防ぎ、且つDNA分解酵素耐性が得られると期待された(図5)。また、特に、上記比率が4:1の場合にセンサの凝集が認められた(図5)。上記比率が1:2となる条件でPEGコートしたフォースセンサを以下の実験に用いた。
洗い、フォースセンサ200 pMとビオチン化RGDfK 100 nMを添加して、30分間室温でコートし、PBSで培養皿に固定されなかったフォースセンサを洗い流した。固定したフォースセ
ンサの密度を蛍光観察によって確認した(Olympus, IX83; 対物レンズx100; 励起波長,532 nm; 測定波長, 590 nm)(図6)。培養皿にラット新生児の心筋細胞を播種し、37℃、5% CO2下で24時間の培養を行った。上記観察条件にて心筋細胞に結合したフォースセンサの動態を蛍光観察し、蛍光スポットの形状変化に基づいてフォースセンサの伸縮の有無を確認した。すなわち、心筋細胞が拍動した場合、フォースセンサが培養皿に対して水平方向へ牽引され、以て蛍光スポットの形状変化が生じる。観察の結果、心筋細胞の拍動に合わせたフォースセンサの伸縮が確認された(図6)。
配列番号1:スカフォールドの塩基配列
配列番号2:ハンドルAの塩基配列
配列番号3:ハンドルBの塩基配列
配列番号4:アンチハンドルAの塩基配列
配列番号5:アンチハンドルBの塩基配列
Claims (34)
- ナノデバイスであって、
コイル構造および第1のハンドルを備え、
前記コイル構造が、スカフォールドおよび複数のステイプルを含み、
前記スカフォールドが、1本鎖ポリヌクレオチドであり、
前記ステイプルが、それぞれ、前記スカフォールドに相補的な塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記第1のハンドルが、前記スカフォールドに相補的な第1の塩基配列と前記スカフォールドに相補的でない第2の塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記スカフォールドが、前記ステイプルとのハイブリダイズにより架橋され、以て4ヘリックスバンドルコイルを形成しており、
前記ステイプルによる前記スカフォールドの架橋が、ヌクレオチドの二重螺旋の周期性と異なる周期性で実施され、
前記第1のハンドルが、前記コイル構造の一方の端部において、前記スカフォールドの少なくとも2つのヘリックス形成部位とハイブリダイズしている、ナノデバイス。 - さらに、第2のハンドルを備え、
前記第2のハンドルが、前記スカフォールドに相補的な第1の塩基配列と前記スカフォールドに相補的でない第2の塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記第2のハンドルが、前記コイル構造の他方の端部において、前記スカフォールドの少なくとも2つのヘリックス形成部位とハイブリダイズしている、請求項1に記載のナノデバイス。 - 前記スカフォールドが、環状1本鎖ポリヌクレオチドである、請求項1または2に記載のナノデバイス。
- 前記スカフォールドの長さが、7500〜8500残基である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のナノデバイス。
- 前記ステイプルの長さが、それぞれ、10〜100残基である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のナノデバイス。
- 前記ステイプルによる前記スカフォールドの架橋周期が、32残基である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のナノデバイス。
- 前記スカフォールドが、周期的にヌクレオチド残基の挿入および/または欠失を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のナノデバイス。
- 前記スカフォールドが、隣接する2つのヘリックス形成部位にヌクレオチド残基の挿入を含み、且つ、残りの2つのヘリックス形成部位にヌクレオチド残基の欠失を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のナノデバイス。
- 前記スカフォールドが、スカフォールドが32残基ごとに2残基のヌクレオチドの挿入または欠失を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のナノデバイス。
- 前記第1および/または第2のハンドルの長さが、それぞれ、20〜200残基である、請求項1〜9のいずれか1項に記載のナノデバイス。
- 前記第1および/または第2のハンドル中の前記第1の塩基配列の長さが、それぞれ、
10〜100残基である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のナノデバイス。 - 前記第1および/または第2のハンドル中の前記第2の塩基配列の長さが、それぞれ、10〜100残基である、請求項1〜11のいずれか1項に記載のナノデバイス。
- さらに、第1のアンチハンドルを備え、
前記第1のアンチハンドルが、前記第1のハンドル中の前記第2の塩基配列に相補的な塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドと、対象物に対する結合性を有する物質とを備える分子であり、
前記第1のアンチハンドルが、前記第1のハンドル中の前記第2の塩基配列とハイブリダイズしている、請求項1〜12のいずれか1項に記載のナノデバイス。 - さらに、第2のアンチハンドルを備え、
前記第2のアンチハンドルが、前記第2のハンドル中の前記第2の塩基配列に相補的な塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドと、対象物に対する結合性を有する物質とを備える分子であり、
前記第2のアンチハンドルが、前記第2のハンドル中の前記第2の塩基配列とハイブリダイズしている、請求項2〜13のいずれか1項に記載のナノデバイス。 - 前記ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドが、DNAである、請求項1〜14のい
ずれか1項に記載のナノデバイス。 - 請求項1〜15のいずれか1項に記載のナノデバイスを備えるフォースセンサ。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載のナノデバイスにかかる力を測定することを含む、力の測定方法。
- 前記力が、10〜60pNの力である、請求項17に記載の方法。
- 前記測定が、オリゴリジン−PEGの存在下で実施される、請求項17または18に記載
の方法。 - コイル構造および第1のハンドルを含む試薬キットであって、
前記コイル構造が、スカフォールドおよび複数のステイプルを含み、
前記スカフォールドが、1本鎖ポリヌクレオチドであり、
前記ステイプルが、それぞれ、前記スカフォールドに相補的な塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記第1のハンドルが、前記スカフォールドに相補的な第1の塩基配列と前記スカフォールドに相補的でない第2の塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記スカフォールドが、前記ステイプルとのハイブリダイズにより架橋され、以て4ヘリックスバンドルコイルを形成しており、
前記ステイプルによる前記スカフォールドの架橋が、ヌクレオチドの二重螺旋の周期性と異なる周期性で実施され、
前記第1のハンドルが、前記コイル構造の一方の端部において、前記スカフォールドの少なくとも2つのヘリックス形成部位とハイブリダイズできるように構成されている、試薬キット。 - さらに、第2のハンドルを含み、
前記第2のハンドルが、前記スカフォールドに相補的な第1の塩基配列と前記スカフォールドに相補的でない第2の塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、
前記第2のハンドルが、前記コイル構造の他方の端部において、前記スカフォールドの少なくとも2つのヘリックス形成部位とハイブリダイズできるように構成されている、請求項20に記載の試薬キット。 - 前記スカフォールドが、環状1本鎖ポリヌクレオチドである、請求項20または21に記載の試薬キット。
- 前記スカフォールドの長さが、7500〜8500残基である、請求項20〜22のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記ステイプルの長さが、それぞれ、10〜100残基である、請求項20〜23のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記ステイプルによる前記スカフォールドの架橋周期が、32残基である、請求項20〜24のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記スカフォールドが、周期的にヌクレオチド残基の挿入および/または欠失を含む、請求項20〜25のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記スカフォールドが、隣接する2つのヘリックス形成部位にヌクレオチド残基の挿入を含み、且つ、残りの2つのヘリックス形成部位にヌクレオチド残基の欠失を含む、請求項20〜26のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記スカフォールドが、スカフォールドが32残基ごとに2残基のヌクレオチドの挿入または欠失を含む、請求項20〜27のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記第1および/または第2のハンドルの長さが、それぞれ、20〜200残基である、請求項20〜28のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記第1および/または第2のハンドル中の前記第1の塩基配列の長さが、それぞれ、10〜100残基である、請求項20〜29のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記第1および/または第2のハンドル中の前記第2の塩基配列の長さが、それぞれ、10〜100残基である、請求項20〜30のいずれか1項に記載の試薬キット。
- さらに、第1のアンチハンドルを含み、
前記第1のアンチハンドルが、前記第1のハンドル中の前記第2の塩基配列に相補的な塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドと、対象物に対する結合性を有する物質とを備える分子であり、
前記第1のアンチハンドルが、前記第1のハンドル中の前記第2の塩基配列とハイブリダイズできるように構成されている、請求項20〜31のいずれか1項に記載の試薬キット。 - さらに、第2のアンチハンドルを含み、
前記第2のアンチハンドルが、前記第2のハンドル中の前記第2の塩基配列に相補的な塩基配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドと、対象物に対する結合性を有する物質とを備える分子であり、
前記第2のアンチハンドルが、前記第2のハンドル中の前記第2の塩基配列とハイブリダイズできるように構成されている、請求項21〜32のいずれか1項に記載の試薬キット。 - 前記ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドが、DNAである、請求項20〜33の
いずれか1項に記載の試薬キット。
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Citations (4)
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JP2014168831A (ja) * | 2013-03-04 | 2014-09-18 | Institute Of Physical & Chemical Research | ポリヌクレオチドを用いたコイル及びその製造方法 |
JP2017505104A (ja) * | 2013-11-08 | 2017-02-16 | デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート,インコーポレイテッド | インビボにおける薬剤送達のための核酸ナノ構造体 |
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2019
- 2019-05-27 JP JP2019098897A patent/JP7272643B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2010010862A1 (ja) * | 2008-07-22 | 2010-01-28 | 独立行政法人科学技術振興機構 | Rna-蛋白質複合体相互作用モチーフを利用して人工rnpナノ構造体を構築する方法 |
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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NANDHINI PONNUSWAMY ET AL.: "Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degrad", NAT. COMMUN., vol. 8:15654, JPN6023002060, 31 May 2017 (2017-05-31), pages 1 - 9, XP055749225, ISSN: 0004970367, DOI: 10.1038/ncomms15654 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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JP7272643B2 (ja) | 2023-05-12 |
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