JP2020180139A - 複数用量注射準備済樹状細胞ワクチンの製造 - Google Patents

複数用量注射準備済樹状細胞ワクチンの製造 Download PDF

Info

Publication number
JP2020180139A
JP2020180139A JP2020117004A JP2020117004A JP2020180139A JP 2020180139 A JP2020180139 A JP 2020180139A JP 2020117004 A JP2020117004 A JP 2020117004A JP 2020117004 A JP2020117004 A JP 2020117004A JP 2020180139 A JP2020180139 A JP 2020180139A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
antigen
cancer
dendritic cell
her2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2020117004A
Other languages
English (en)
Inventor
ジェイ ツェルニキ ブライアン
Brian J Czerniecki
ジェイ ツェルニキ ブライアン
ケイ コスキ ガリー
K Koski Gary
ケイ コスキ ガリー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2015/041022 external-priority patent/WO2016011422A2/en
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of JP2020180139A publication Critical patent/JP2020180139A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/49—Breast

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

【課題】注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンを生成する方法の提供。【解決手段】少なくとも１つの抗原を樹状細胞（ＤＣ）に接触させること、少なくとも１つのＴＬＲアゴニストでＤＣを活性化させること、ＤＣを、初回免疫化用量および複数のブースター用量を含む複数の用量に凍結保存することを含み、ＤＣが融解された場合、ＤＣが少なくとも１つのサイトカインの有効量を産生して、Ｔ細胞応答を発生させる方法。ＤＣを融解することをさらに含み、ＤＣが少なくとも１つのサイトカインの有効量を産生して、Ｔ細胞応答を発生させる方法。【選択図】図５

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年７
月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０２５，６７３号、２０１５年５月２２日
に出願された米国仮特許出願第６２／１６５，４４５号、２０１４年７月１７日に出願さ
れた米国仮特許出願第６２／０２５，６８５号、２０１４年７月２４日に出願された米国
仮特許出願第６２／０２９，７７４号の優先権を主張する。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された契約番号Ｒ０１ ＣＡ０９６９９７
の下で連邦政府の支援を受けてなされたものである。連邦政府は本発明に対して一定の権
利を保有する。
樹状細胞（ＤＣ）は、微生物または癌性細胞からさえもタンパク質抗原を獲得し、Ｔ細
胞にこれらの抗原を示し、または「提示」する白血球である。Ｔ細胞は、こうしてＤＣに
より活性化され、次いで、脅威に挑戦する全身性の免疫応答を開始する。微生物に対する
従来のワクチンは、ワクチン接種された個体内で多くの可能な手段によってＤＣ活性を高
め、ワクチン誘発性の免疫応答を増幅する、「アジュバント」として知られる添加剤を含
有する。しかしながら、癌に対するワクチンの必要条件は、多くの特有の問題を示す。例
えば、従来のアジュバントは、ＤＣが癌に対する最適の免疫を開始することを可能とする
適切なシグナルをＤＣに提供しない。腫瘍自体もまた、ＤＣの適切な活性化に影響を及ぼ
しうる環境を作り出す。
この問題に対する一般的な解決法は、癌患者からＤＣを取り出し、インビトロでそれら
に腫瘍抗原を取り込ませ、次いで、体にそれらを再投与する前に、該細胞に特有の活性化
シグナルを供給することである。これは、腫瘍環境の影響により排除された適切なＤＣ活
性化を確実にする。体に戻されると、ＤＣはＴ細胞と相互作用して強力な抗腫瘍性免疫を
開始する。追加の物質化を受けた（ｅｘｔｒａ−ｃｏｒｐｏｒｅａｌｉｚｅｄ）ＤＣは多
くの有効性の問題を解決したが、歴史的に見て、これは価格が実際上の制約となった。例
えば、ＤＣワクチンは生きた細胞からなるため、特別な細胞処理およびワクチン生産施設
が、治療を投与する医療センターの実際の場所において必要とされた。これは、治療を送
達するための高価で非効率的な方法であり、なぜなら、そのような処置を投与する各機関
が、特別な用途のための独自の施設を建設し、維持しなければならないからである。
現在、乳癌の管理は、早期診断と積極的な治療の組み合わせに依存し、これは、手術、
放射線療法、化学療法およびホルモン療法などの１つまたは複数の治療を含みうる。ハー
セプチン（トラスツズマブ）は、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２陽性乳癌細胞のための標的療法と
して開発され、（Ｔａｘｏｌの商品名で販売される）分裂抑制剤パクリタキセルを含む他
の治療とともに使用されることが多い。
単剤療法としてのハーセプチンの有効性は、３０％未満と推定されており；パクリタキ
セルなどの微小管安定化薬物とのコンビナトリアル治療は、有効性を約６０％まで増大さ
せる（Ｂｕｒｒｉｓら、２０００年、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２７：１９〜２３頁）。
ハーセプチンによる治療は、Ｃｄｋ阻害剤ｐ２７の蓄積およびその後のＧ１／Ｓ細胞周期
の停止を結果として生じ、パクリタキセルは、有糸分裂への移行を停止させ、これは細胞
死をもたらしうる。しかしながら、大きな期待にもかかわらず、高用量のハーセプチンま
たはパクリタキセルは、望ましくない副作用をもたらす。さらに、癌は、ハーセプチンお
よび／またはパクリタキセルに対する抵抗性ができることが多い。
Ｂｕｒｒｉｓら、２０００年、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２７：１９〜２３頁
したがって、最大限の治療ＤＣワクチンを生産するための組成物および有効な方法なら
びにハーセプチンを用いて癌を治療する新しい方法に対する、まだ満たされていない必要
性がある。よって、本技術分野には、乳癌および他の悪性腫瘍を治療または予防するため
のさらなる免疫治療的アプローチを有することが必要とされている。本発明はこのニーズ
を満たす。
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と合わせて読まれる場合
、より良く理解される。本発明を例解する目的で、現在好ましい実施形態が図面に示され
る。しかしながら、本発明は、図面に示された実施形態の配置および手段そのものに限定
されないと理解されるべきである。
凍結保存されたＤＣ１の解凍後の生存率および収率を示すチャートである。細胞が直接融解され、計数されたとき、細胞の回復率は平均８９％であり、生存率は９５％であった。 細胞の生存率（ｐ＝．４８０７）および回復率（ｐ＝．１２２０）において有意差がなかったことを示すチャートである。 両集団が同様の初期（ＬＰＳ添加後７時間）のＩＬ−１２ｐ７０分泌（ｐ＝．０７６８）を有したことを示すチャートである。集団は、３０時間の観察期間にわたって、同等のＩＬ−１２ｐ７０分泌レベルを示し続け、集団間で有意差はなかった。 集団間およびＩＬ−１β（ｐ＝０．７９６０）、ＩＬ−１α（ｐ＝０．０８４１）、Ｒａｎｔｅｓ（ｐ＝０．９０２）、ＭＤＣ（ｐ＝０．１５１４）、ＩＬ−８（ｐ＝０．７８４４）、ＭＩＰ−１α（ｐ＝．２６７３）、ＩＰ−１０（ｐ＝０．７３６６）、ＩＬ−６（ｐ＝０．２４）、ＴＮＦ−α（ｐ＝０．８９７２）、ＩＬ−５（ｐ＝０．０７３５）、ＩＬ−１５（ｐ＝０．８８７８）、ＩＬ−１０（ｐ＝．１９３７）、ＭＩＰ−１β（ｐ＝０．９２１７）の産生量に有意差はなかったことを示すチャートである。 凍結保存されたＤＣおよび凍結保存されなかったＤＣからのＩＦＮ−γの産生量を示すチャートである。 Ｔｈ１サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γは、乳癌細胞において相乗的に老化を誘導し、必要用量は、ＨＥＲ２発現と逆相関することを示す図である。図６Ａは、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌系統が、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αおよび１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γとともに５日間インキュベートされ、サイトカインの非存在下でさらに２回継代培養され、次いで、ＳＡ−β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）発現（老化マーカー）について染色され、未処理の対照細胞と比較された研究の結果を示す。対のサイトカインのみが老化を誘導した。上のパネルは、３つの独立した実験の１つからの代表的データの写真を示す。下のパネルは、濃度測定分析のヒストグラムを示す。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。対スチューデントｔ検定を用いてＰ値を計算した。 統計学的有意性は＊Ｐ＜０．０５で決定した。図６Ｂは図６Ａに記載の細胞の細胞ライセートをｐ１５ＩＮＫｂおよびｐ１６ＩＮＫ４ａ発現について分析したウエスタンブロッティング分析の写真を示す。ビンキュリンをローディング対照として使用した。図６Ｃは、Ｔ−４７Ｄ乳癌細胞が、未処理で（１）または以下の濃度のＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γ：１０ｎｇ／ｍｌおよび１００Ｕ／ｍＬ（２）、５０ｎｇ／ｍｌおよび５００Ｕ／ｍＬ（３）、７５ｎｇ／ｍｌおよび７５０Ｕ／ｍＬ（４）、１００ｎｇ／ｍｌおよび１０００Ｕ／ｍＬ（５）、とともに５日間インキュベートされ、サイトカインの非存在下でさらに２回継代培養され、次いで、細胞をＳＡ−β−ｇａｌについて染色し、対照未処理細胞または陽性対照としての８μＭエトポシドで処理したものと比較された（６）研究結果を示す。上のパネルは、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データの写真を示す。下のパネルは、６つの濃度測定分析のヒストグラムを示す。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。対スチューデントｔ検定を用いてＰ値を計算した。 統計学的有意性は＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１で決定した。図６Ｄは、Ｔｈ１サイトカインである、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αによる併用処置は、未処理の対照と比較して、より大きな老化をＳＫ−ＢＲ−３（１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α＋１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ）およびＴ−４７Ｄ（１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α＋１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ）細胞においてもたらし；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（２００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α＋２０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ）は、二重のＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α処理によって大きく影響を受けないままであった研究の結果を示すヒストグラムである。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。対スチューデントｔ検定を用いてＰ値を計算した。 統計学的有意性は＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１で決定した。 ＨＥＲ２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞において老化とアポトーシスを誘導することを示す図である。図７Ａの左パネルは、列挙された濃度のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γで５日間処理され、次いでサイトカインの非存在下でさらに２回継代培養された、ｗｔＨＥＲ２（ｐｃＤＮＡＨＥＲ２）または空のベクター（ｐｃＤＮＡ３）でトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、ＳＡ−β−ｇａｌ染色を行った濃度測定分析の結果を示すヒストグラムである。ヒストグラム上部の差し込み図は、ｐｃＤＮＡＨＥＲ２またはｐｃＤＮＡ３でトランスフェクトされ、かつＨＥＲ２特異的抗体によりプローブされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を分析してＨＥＲ２発現の有無を確かめたウエスタンブロット分析の写真である。ビンキュリンをローディング対照として使用した。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。対スチューデントｔ検定を用いてＰ値を計算した。統計学的有意性は＊＊＊Ｐ＜０．００１で決定した。図７Ａの右パネルは、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データの写真を示す。図７Ｂは、図７Ａに記載の細胞の細胞ライセートに対するｐ１５ＩＮＫｂ発現および切断カスパーゼ３発現についてのウエスタンブロッティング分析の写真を示す。ビンキュリンをローディング対照として使用した。 ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を併せて遮断した状態での発現が、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞において、Ｔｈ１サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによる老化誘導およびアポトーシスを亢進することを示す図である。図８Ａは、非標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ ＮＴ）、ＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡ、ＨＥＲ３ ｓｉＲＮＡまたはＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡおよびＨＥＲ３ ｓｉＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトされ、次いで、列挙された濃度のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γで５日間処理され、サイトカインの非存在下でさらに２回継代培養されたＳＫ−ＢＲ−３細胞において、ＳＡ−β−ｇａｌ染色を行った研究の結果を示す。左パネルは、濃度測定分析のヒストグラムを示す。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。対スチューデントｔ検定を用いてＰ値を計算した。統計学的有意性は＊＊＊Ｐ＜０．００１で決定した。差し込み図は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３特異的抗体でプローブした、ＮＴ ｓｉＲＮＡ、ＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡまたはＨＥＲ３ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＳＫ−ＢＲ−３細胞のウエスタンブロット分析の写真を示す。ビンキュリンをローディング対照として使用した。同様の結果が、３つの独立した実験において観察された。右パネルは、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データの写真を示す。図８Ｂは、図８Ａに記載の細胞の細胞ライセートをｐ１５ＩＮＫｂ発現および切断カスパーゼ３発現についてウエスタンブロッティング分析した研究の結果を示す。 ＨＥＲ２阻害およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体化阻害の組み合わせが、Ｔｈ１サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによるＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞における老化誘導およびアポトーシスを亢進することを示す図である。図９Ａは、（１）未処理、または、（２）１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αおよび１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ、（３）１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブ（Ｔｚｍ）＋ペルツズマブ（Ｐｅｒ）もしくは（４）両処理の組み合わせで５日間処理され、かつ、抗体およびサイトカインの非存在下でさらに２回継代培養されたＳＫ−ＢＲ−３細胞において行ったＳＡ−β−ｇａｌ染色の結果を示す。左パネルは濃度測定分析のヒストグラムである。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。対スチューデントｔ検定を用いてＰ値を計算した。統計学的有意性は＊＊＊Ｐ＜０．００１で決定した。右パネルは、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データを示す写真である。図９Ｂは、図９Ａに記載の細胞の細胞ライセートをｐ１５ＩＮＫｂ発現または切断カスパーゼ３発現についてウエスタンブロッティング分析した写真を示す。ビンキュリンをローディング対照として使用した。同様の結果が、３つの独立した実験において観察された。図９Ｃは、アネキシンＶおよびＰＩについて染色し、次いでフローサイトメトリーにより分析した、未処理または上記のように処理されたＳＫ−ＢＲ−３細胞のアポトーシスの誘導の研究の結果を示す。上パネルは、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データのプロットを示す。下パネルは、濃度測定分析のヒストグラムを示す。データは、３つの独立した実験からのアネキシンＶ＋ＰＩ＋細胞の平均±ＳＥＭとして表される。対スチューデントｔ検定を用いてＰ値を計算した。統計学的有意性は＊＊Ｐ＜０．０１で決定した。 トラスツズマブおよびペルツズマブによる併用処理は、ＨＥＲ２過剰発現ヒト乳癌細胞のＣＤ４＋Ｔｈ１介在性の老化およびアポトーシスを亢進することを示す図である。図１０Ａは、図１０Ａ。トランスウエルシステムを用いて、０．５×１０５個のＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブ（Ｔｚｍ）およびペルツズマブ（Ｐｅｒ）を含むかまたは含まずに、１）５×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞単独（ＣＤ４＋のみ）、２）ＣＤ４＋Ｔ細胞＋０．５×１０５個のＨＥＲ２クラスＩＩペプチド（ＤＣ Ｈ）または無関係のクラスＩＩＢＲＡＰまたはサバイビンペプチド（ＤＣ ＢもしくはＤＣ Ｓ）それぞれでパルスした１型極性化成熟ＤＣ、および３）ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ＨＥＲ２（ｉＤＣ Ｈ）でパルスした未成熟ＤＣとともに５日間、共培養した研究の結果を示す。次いで、細胞は、遮断抗体および免疫系細胞の非存在下で、さらに２回継代培養され、次いで、ＳＡ−β−ｇａｌ発現について染色され、未処理の対照細胞と比較された。上パネルは、濃度測定分析のヒストグラムである。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。対スチューデントｔ検定を用いてＰ値を計算した。統計学的有意性は＊＊＊Ｐ＜０．０００１で決定した。下のパネルは、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データの写真を示す。図１０Ｂは、上記のとおり共培養したＳＫ−ＢＲ−３細胞の細胞ライセートをｐ１５ＩＮＫｂ発現または切断カスパーゼ３発現についてウエスタンブロッティング分析した写真を示す。ｐ１５ＩＮＫ４ｂおよび切断カスパーゼ−３の発現の増加が観察され、これは、トラスツズマブおよびペルツズマブの存在下でＤＣ Ｈ／ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した場合、ＳＫ−ＢＲ−３細胞に老化およびアポトーシスが誘導されたが、ＤＣ Ｂ群、ＤＣ Ｓ群およびｉＤＣ Ｈ群からは誘導されなかったことを示唆する。ビンキュリンをローディング対照として使用した。結果は、３つの独立した実験の代表的なものである。写真は、図９Ａに記載の細胞の細胞ライセートをｐ１５ＩＮＫｂ発現または切断カスパーゼ３発現についてウエスタンブロッティング分析したものである。 Ｔｈ１サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γは、トラスツズマブおよびペルツズマブ抵抗性乳癌細胞を老化およびアポトーシス誘導に対して増感させることを示す図である。図１１Ａは、（１）未処理、または、（２）５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αおよび５００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ、（３）１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブ（Ｔｚｍ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒ）もしくは（４）同濃度のトラスツズマブ、ペルツズマブおよびＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの組み合わせで５日間処理し、次いで抗体およびサイトカインの非存在下でさらに２回継代培養したＨＣＣ−１４１９細胞およびＪＩＭＴ−１細胞においてＳＡ−β−ｇａｌ染色をそれぞれ行った結果を示す。上パネルは、濃度測定分析のヒストグラムである。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。対スチューデントｔ検定を用いてＰ値を計算した。統計学的有意性は＊＊Ｐ＜０．０１で決定した。下パネルの上部レイヤーは、ＨＣＣ−１４１９細胞における３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データの写真を示す。下パネルの下部レイヤーはＪＩＭＴ−１細胞における３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データの写真を示す。図１１Ｂは、図１１Ａに記載の細胞の細胞ライセートを、ＨＣＣ−１４１９細胞（左パネル）およびＪＩＭＴ−１細胞（右パネル）におけるｐ１５ＩＮＫｂまたは切断カスパーゼ３発現についてウエスタンブロッティングにより分析した結果を示す。ビンキュリンをローディング対照として使用した。同様の結果が、３つの独立した実験において観察された。 ＩＦＮ−γＲαおよびＴＮＦ−Ｒ１は、乳癌細胞株において、それらのＨＥＲ２レベルに依存せず、同レベルで発現されることを示す図である。固定化されたＭＣＦ−１０Ａ哺乳動物上皮細胞および乳癌細胞株（ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）における、ウエスタンブロットにより決定されたＩＦＮ−γＲα、ＴＮＦ−Ｒ１およびＨＥＲ２の発現を示す。ビンキュリンをローディング対照として使用した。同様の結果が、３つの独立した実験において観察された。 ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を併せて遮断した状態での発現が、Ｔｈ１サイトカインである、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによる老化誘導を、ＭＣＦ−７乳癌細胞において亢進することを示す図である。図１３Ａは、非標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ ＮＴ）、ＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡ、ＨＥＲ３ ｓｉＲＮＡ、またはＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡおよびＨＥＲ３ ｓｉＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトされ、次いで、列挙された濃度のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γで５日間処理され、サイトカインの非存在下でさらに２回継代培養されたＭＣＦ−７細胞においてＳＡ−β−ｇａｌ染色を行った研究の結果を示す。左パネルは濃度測定分析のヒストグラムを示す。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。対スチューデントｔ検定を用いてＰ値を計算した。統計学的有意性は＊＊＊Ｐ＜０．００１で決定した。差し込み図は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３特異的抗体によりプローブされた、ＮＴ ｓｉＲＮＡ、ＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡ、ＨＥＲ３ ｓｉＲＮＡ、またはＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡおよびＨＥＲ３ ｓｉＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のウエスタンブロット分析の写真である。ビンキュリンをローディング対照として使用した。同様の結果が、３つの独立した実験において観察された。右パネルは、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データの写真を示す。図１３Ｂは、図１３Ａに記載の細胞の細胞ライセートをｐ１５ＩＮＫｂ発現または切断カスパーゼ３発現についてウエスタンブロッティング分析した研究の結果を示す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。差しこみ図は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３特異的抗体でプローブされた、ＮＴ ｓｉＲＮＡ、ＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡまたはＨＥＲ３ ３ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＳＫ−ＢＲ−３細胞のウエスタンブロット分析の写真を示す。ビンキュリンをローディング対照として使用した。同様の結果が、３つの独立した実験において観察された。 Ｔｈ１により産生されたサイトカインの、ＳＫ−ＢＲ−３の老化およびアポトーシスに対する効果を示す図である。図１４Ａは、トランスウエルシステムを用いて、０．５×１０５個のＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１）５×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞単独（ＣＤ４＋のみ）、２）ＣＤ４＋Ｔ細胞＋０．５×１０５個のＨＥＲ２クラスＩＩペプチド（ＤＣ Ｈ）または無関係のクラスＩＩＢＲＡＦペプチド（ＤＣ Ｂ）それぞれでパルスした１型極性化成熟ＤＣ、および３）ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ＨＥＲ２（ｉＤＣ Ｈ）またはＢＲＡＦ（ｉＤＣ Ｂ）でパルスした未成熟ＤＣとともに５日間、共培養した研究の結果を示す。次いで、細胞は、免疫系細胞の非存在下で、さらに２回継代培養され、次いで、ＳＡ−β−ｇａｌ発現について染色され、未処理の対照細胞と比較された。ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して、ＣＤ４＋／ＤＣ Ｈで処置されたＳＫ−ＢＲ−３において誘導された老化は、特異的抗体でＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを中和することによって、部分的にレスキューされた（７５．２７％レスキュー）。上パネルは、濃度測定分析のヒストグラムである。データは、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の％として表され、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として表される。対スチューデントｔ検定を用いてＰ値を計算した。下パネルは、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データの対応する写真を示す。図１４Ｂは、ｐ１５ＩＮＫ４ｂおよび切断カスパーゼ−３の発現が増加したことを示すウエスタンブロットの写真を示し、ＤＣ Ｈ／ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した場合、ＤＣ Ｂ群、ｉＤＣ Ｈ群およびｉＤＣ Ｂ群と比較して、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の老化およびアポトーシスが誘導されることを示唆している。ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して、ＣＤ４＋／ＤＣ Ｈで処理したＳＫ−ＢＲ−３において誘導された老化およびアポトーシスは、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを特異的抗体で中和することによって、部分的にレスキューされた。ビンキュリンが、ローディング対照として使用された。結果は、３つの実験の代表的なものである。 乳癌細胞株における、へレグリンによるＡＫＴ活性化に対するトラスツズマブおよびペルツズマブの効果を示す図である。血清不足のＴ−４７Ｄ細胞、ＨＣＣ−１４１９細胞およびＪＩＭＴ−１細胞をトラスツズマブ（Ｔｚｍ）およびペルツズマブ（Ｐｅｒ １０μｇ／ｍｌ、９０分）で処理し、そして、（ＨＲＧ、２０ｎｇ／ｍｌ、５分）で刺激した。上パネルは、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的データを示す。データは、トラスツズマブおよびペルツズマブの非存在下でのＨＲＧ反応の％として表し、平均±Ｓ．Ｄ．として表す（ｎ＝３）。 図１６はワクチン接種の手順を示す。生検でＨＥＲ２陽性 ＤＣＩＳと診断された患者が試験に登録された。患者の単球は、白血球搬出法およびエルトリエーション法によって収集した。単球を迅速に１型ＤＣに成熟させ、ワクチン接種前の抗ＨＥＲ２ ＣＤ４ Ｔｈ１免疫応答を測定した。患者は週４〜６回のワクチン接種を受けた（＋／−抗エストロゲン療法）。患者の単球は、二回目の白血球搬出法およびエルトリエーション法によって再び回収され、ワクチン接種後の抗ＨＥＲ２ ＣＤ４ Ｔｈ１免疫応答が測定された。ワクチン接種後、患者は外科的切除を受けて残存疾患を治癒した。臨床応答は外科用検体で測定し、免疫応答は、センチネルリンパ節（ＳＬＮ）が得られた場合、センチネルリンパ節で測定した。 図１７Ａ〜１７Ｂは、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮγおよびＴＮＦα）、タモキシフェン代謝産物（４−ヒドロキシ−タモキシフェン、「４ＨＴ」）、またはその両方で処置したＳＫＢＲ３およびＭＣＦ７乳癌細胞株の結果を示す。ＳＫＢＲ３（ＥＲ陰 性）（図１７Ａ）は、Ｔｈ１サイトカイン処置に応答して抗腫瘍活性を増加させたが、抗エストロゲン処置または併用処置に応答して増加しなかった。ＭＣＦ７（ＥＲ陽性）（図１７Ｂ）は、Ｔｈ１サイトカイン治療または抗エストロゲン治療のいずれかに応答して抗腫瘍活性を増加させなかったが、その組み合わせは代謝活性の増加をもたらした。 図１８は、抗エストロゲン（「ＡＥ」）療法および抗ＨＥＲ２ ＤＣ１ワクチン接種併用試験の患者分布を示す。ＨＥＲ−２陽性は、免疫組織染色によるＨＥＲ−２タンパク質の発現強度が２＋または３＋の細胞＞５％と定義された。ＡＥ療法（タモキシフェン、レトロゾール、またはアナストロゾール）は、ＤＣワクチン接種と同時に与えられた。 図１９は、ＥＲ状態およびＡＥ治療（ＥＲ陰性；ＥＲ陽性 ＡＥなし；ＥＲ陽性 ＡＥあり）により患者を比較する病理学的完全奏功率を示すヒストグラムである。 図２０Ａ〜２０Ｂは、病理学的完全奏功（「ｐＣＲ」）（図２０Ａ）およびＥＲ状態およびＡＥ治療（図２０Ｂ）によって患者を比較する、研究患者のその後の乳房イベントを示す。 図２１Ａ〜２１Ｃは、末梢血で測定したＣＤ４＋全身性免疫応答を示す。Ｔｈ１応答（応答性（図２１Ａ）；応答レパートリー（図２１Ｂ）および累積応答（図２１Ｃ））の各評価指標で、抗ＨＥＲ２ ＤＣ１ワクチン接種後の免疫応答が有意に増加した。しかし、ワクチン接種前および接種後の免疫応答は、３つの群すべてにおいて同様であった。 図２２Ａ〜２２Ｃは、患者のセンチネルリンパ節で測定したＣＤ４＋局所的免疫応答を示す。ワクチン接種後の免疫応答は、各評価指標（応答性（図２２Ａ）、応答レパートリー（図２２Ｂ）または累積応答（図２２Ｃ））で、ＡＥ治療を受けなかったＥＲ陽性患者と比較して、ＡＥ治療を受けたＥＲ陽性患者において高かった。 図２３は、末梢血で測定したＣＤ８＋全身免疫応答を示す。ＥＲ陰性状態の患者および抗エストロゲン治療を伴うおよび伴わないＥＲ陽性状態の患者（ＥＲ陽性 ＡＥなし；ＥＲ陽性 ＡＥあり）の応答性が示される。 図２４は、ＢＲＡＦ−突然変異マウスメラノーマにおいてベラメフェニブ耐性を克服したＢＲＡＦＶ６００Ｅ−ＤＣ１ワクチンを示す。
本発明は、癌または他の障害の個別化された治療および予防のための、ＦＤＡにより承
認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンを生産するための組成物および方法
を提供する。一実施形態において、本発明は、ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗
原パルス１型極性化樹状細胞ワクチン（ＤＣ１）を生産するための組成物および方法を提
供する。
一実施形態において、抗原が取り込まれ、予備活性化された状態、つまり、「シリンジ
レディ」、すなわち、（例えば、ＦＤＡ命令による）追加の施設および品質管理／保証ス
テップを要求するいかなる追加の細胞プロセシングも必要としない、患者への即時注射に
好適な、複数用量用アリコートとして樹状細胞を凍結保存する方法が提供される。
一実施形態において、注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン、好ましくは、最大
効果を示す注射用複数用量抗原パルス１型極性化樹状細胞ワクチンを効率的に生産する方
法が提供される。
一実施形態において、ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワク
チンは、一人の患者の白血球搬出法においてＤＣを収集することによって生産される。好
ましくは、白血球搬出法および樹状細胞ワクチンの生産は、その初回免疫化用量および複
数の「ブースター」用量からなる活性化された抗原取り込みＤＣワクチンを作り出すため
にＤＣが操作される、集中型ワクチン生産施設であり得る第１の場所において実行される
。本発明の利益は、ＦＤＡ命令によるすべての品質管理／品質保証ステップが中央施設に
おいて実行されること、ならびに完成およびリリース後、すべてのワクチン用量が凍結保
存され、患者への連続的投与のために遠隔の医療センターへ発送されることである。一実
施形態において、本発明のＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワ
クチンは、投与現場においていかなる義務化された品質管理／品質保証ステップも必要と
しない。
別の態様において、本発明は、癌を治療するのに有効な治療が、腫瘍部位中の免疫細胞
が腫瘍細胞の攻撃においてより有効であるように、腫瘍における免疫応答を変化させるこ
とを含む、という発見に基づく。いくつかの場合において、有効な治療は、腫瘍部位中の
免疫細胞の遊走および活性を改善することを含む。よって、本発明は、癌を治療するため
の治療レジメンとして、樹状細胞ワクチンをＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のうちの１つま
たは複数を阻害する組成物（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブなど）とともに使用
する組成物および方法を提供する。一実施形態において、この治療レジメンは、樹状細胞
ワクチン、ＨＥＲ−２阻害剤、および、ケモカイン調節剤の使用を含む。
一実施形態において、本発明は、癌を治療するための治療レジメンとして、樹状細胞ワ
クチンをＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のうちの１つまたは複数の遮断とともに使用するた
めの組成物および方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、樹状細胞ワクチン
を、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの添加によるＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３の遮断ととも
に使用する組成物および方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、癌を治療す
るための治療レジメンとして、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの添加によるＨＥＲ−２およ
びＨＥＲ−３のうちの１つまたは複数を遮断する組成物および方法を提供する。
一実施形態において、本発明の治療レジメンは、抗発癌ドライバー（ｏｎｃｏｄｒｉｖ
ｅｒ）Ｔｈ１免疫応答（例えば、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）とＨＥＲ−２およびＨＥ
Ｒ−３のうちの１つまたは複数の発癌ドライバー遮断を誘導する併用療法を含む。
一実施形態において、本発明の治療レジメンは、癌を治療するために使用可能であり、
したがって、ある種の抗癌療法であると考えられる。別の実施形態において、本発明の治
療レジメンは、手術、化学療法、放射線療法（例えば、Ｘ線）、遺伝子療法、免疫療法、
ホルモン療法、ウイルス療法、ＤＮＡ療法、ＲＮＡ療法、タンパク質療法、細胞療法、ナ
ノ療法などを含むが、それに限定されない別の抗癌療法と併用することができる。
一実施形態において、本発明の治療レジメンは、他の抗癌療法を受ける前に使用される
。別の実施形態において、本発明の治療レジメンは、他の抗癌療法を受けるのと同時に使
用される。別の実施形態において、本発明の治療レジメンは、他の抗癌療法を受けた後に
使用される。
別の実施形態では、同時ネオアジュバントエストロゲン療法および抗ＨＥＲ２ ＤＣ１
ワクチン接種は、局所センチネルリンパ節における免疫応答およびＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽
性 ＤＣＩＳ患者における病理学的完全奏功の割合を増加させる。
定義
別段の定めのない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的および科学的用語は、
本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明
細書に記載されたものに類似するまたは等価な任意の方法および材料が本発明の実践また
は試験において使用可能であるが、好ましい方法および材料が記載される。
一般に、本明細書中で使用される専門語ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学およ
び核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室手順は、本技術分野で周知であ
り、一般に採用されるものである。
標準的技術が核酸およびペプチド合成に使用される。該技術および手順は、一般に、本
技術分野における慣用方法および多様な一般的参考文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋおよ
びＲｕｓｓｅｌｌ、２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ
、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら、２０１２年、
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ）に従って実行され、これらが本書類全体にわ
たって提供される。
本明細書中で使用される専門語ならびに以下に記載の分析化学および有機合成において
使用される実験室手順は、本技術分野で周知であり、一般に採用されるものである。標準
的技術およびその改変は、化学合成および化学分析のために使用される。
本明細書中で使用される以下の各用語は、この項におけるそれに関連した意味を有する
。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書中で、該冠詞の文法的目的語の１つまたは１つ
超（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例えば、「ａｎ ｅｌｅｍｅ
ｎｔ」は、１つの要素または１つ超の要素を意味する。
本明細書中で使用される「約」は、量、持続時間などの測定可能な値を指す場合、その
ような変動が開示された方法を実行するために適切である場合、特定された値からの±２
０％、または±１０％、または±５％、または±１％、または±０．１％の変動を包含す
ることを意図する。
生物、組織、細胞またはその構成要素の関係で使用される場合、用語「異常」は、少な
くとも１つの観察可能なまたは検出可能な特徴（例えば、年齢、治療、時間など）におい
て、「正常な」（期待される）各特徴を提示する生物、組織、細胞またはその構成要素と
異なる、生物、組織、細胞またはその構成要素を指す。１つの細胞または組織タイプにつ
いて正常なまたは期待される特徴は、異なる細胞または組織タイプについては異常である
かもしれない。
本明細書中で使用される用語「抗原」または「ａｇ」は、免疫応答を誘発する分子とし
て定義される。この免疫応答は、抗体産生もしくは特定の免疫担当細胞の活性化のいずれ
か、またはその両方を含みうる。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを
含む任意の高分子が抗原としての役目を果たすことを理解する。さらに、抗原は、組換え
またはゲノムＤＮＡに由来することができる。当業者は、本明細書中でこの用語が使用さ
れる場合、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的な
ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが「抗原」をコードすることを理解する。さらに、
当業者は、抗原が遺伝子の完全長のヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がな
いことを理解する。本発明が、２以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが
、それに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列が多様な組み合わせで配置
されて所望の免疫応答を誘発することは明白である。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子
」によりコードされる必要が全くないことを理解する。抗原が合成により生成可能である
かまたは生体サンプルに由来しうることは明白である。そのような生体サンプルは、組織
サンプル、腫瘍サンプル、細胞または生体体液を含むことができるが、それに限定されな
い。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞を活性化することができる細胞であり、単球／
マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）を含むが、それに限定されない。
「抗原を取り込んだＡＰＣ」または「抗原パルスＡＰＣ」は、抗原に曝露され、抗原に
より活性化されたＡＰＣを含む。例えば、ＡＰＣは、例えば、抗原の存在下での培養中、
インビトロで抗原取り込みをすることができる。ＡＰＣは、抗原への曝露によってインビ
ボで抗原を取り込むこともできる。「抗原を取り込んだＡＰＣ」は、従来、２つの方法の
うちの１つ：（１）抗原ペプチドとして知られる、小さなペプチド断片がＡＰＣの外側に
直接「パルス」される；または（２）ＡＰＣが全タンパク質またはタンパク質粒子ととも
にインキュベートされ、次いで、これがＡＰＣにより消化される、により調製される。こ
れらのタンパク質は、ＡＰＣによって小さなペプチド断片に消化され、最終的には、ＡＰ
Ｃ表面に運搬され、提示される。さらに、抗原を取り込んだＡＰＣは、抗原をコードする
ポリヌクレオチドを細胞中に導入することによっても作り出されうる。
「抗ＨＥＲ２応答」は、ＨＥＲ２タンパク質に対して特異的な免疫応答である。
「アポトーシス」は、プログラムされた細胞死のプロセスである。カスパーゼ−３は、
頻繁に活性化される細胞死プロテアーゼである。
本明細書中で使用される用語「自己免疫疾患」は、自己免疫応答に起因する障害として
定義される。自己免疫疾患は、不適切かつ過剰な自己抗原への反応の結果である。自己免
疫疾患の例としては、中でも、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎
、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、ジストロフィー型表皮水泡症、精
巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身
性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、
リウマチ関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺
炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が挙げられるが、それに限定され
ない。
本明細書中で使用される用語「自己の」は、それが後で再導入される個体と同じ個体に
由来する任意の材料を指すことを意味する。
本明細書中で使用される用語「Ｂ細胞」は、骨髄および／または脾臓に由来する細胞と
定義される。Ｂ細胞は、抗体を産生する形質細胞に発達する。
本明細書中で使用される用語「癌」は、その独特の形質−正常な制御の喪失−が未制御
の増殖、分化の喪失、局部組織への浸潤、および／または転移をもたらす細胞の過剰増殖
として定義される。例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚部癌、皮膚癌、膵臓癌
、結腸直腸癌、腎臓癌および肺癌が挙げられるが、それに限定されない。
「表面のＣＤ４＋ Ｔｈ１細胞」、「Ｔｈ１細胞」、「ＣＤ４＋ Ｔヘルパー１型細胞
」、「ＣＤ４＋ Ｔ細胞」などは、表面タンパク質ＣＤ４を発現し、かつサイトカインで
あるＩＦＮ−γを高レベルで産生するＴヘルパー細胞のサブタイプとして定義される。「
Ｔヘルパー細胞」も参照のこと。
「累積応答」は、所与の患者群からの６種全てのＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドすべて
からの反応性スポット（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析からの細胞１０６個あたりのスポ
ット形成細胞「ＳＦＣ」）の総和として表される、１つの患者群の総免疫応答を意味する
。
本明細書中で使用される用語「凍結保存された」または「凍結保存」は、凍結保存用培
地中に再懸濁され、約−７０℃以下の温度で凍結された細胞を指す。
「ＤＣワクチン接種」、「ＤＣ免疫化」、「ＤＣ１免疫化」などは、免疫系を利用して
特異的分子を認識し、それらに対する特異的応答を獲得するための自己樹状細胞を使用す
る戦略を指す。
用語「樹状細胞」（ＤＣ）は、インビボ、インビトロ、エクスビボまたは宿主もしくは
対象中に存在するか、あるいは造血幹細胞または単球に由来することができる抗原提示細
胞である。樹状細胞およびそれらの前駆細胞は、多様なリンパ器官、例えば、脾臓、リン
パ節から、ならびに骨髄および末梢血から単離することができる。ＤＣは、樹状細胞体か
ら複数の方向に広がる薄いシート（葉状仮足）を有する特徴的な形態を有する。典型的に
、樹状細胞は、高レベルのＭＨＣおよび共刺激（例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２）分子
を発現する。樹状細胞は、Ｔ細胞の抗原特異的な分化をインビトロで誘導することができ
、インビトロおよびインビボで一次Ｔ細胞応答を惹起することができる。
本明細書中で使用される「活性化ＤＣ」は、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストに曝露された
ＤＣである。活性化ＤＣは、抗原を取り込んでいても取り込んでいなくてもよい。
本明細書中で使用される用語「成熟ＤＣ」は、高レベルのＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０
（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）を含む分子を発現する樹状細胞と定義される。
対照的に、未成熟樹状細胞は、低レベルのＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およ
びＣＤ８６（Ｂ７．２）分子を発現し、まだなお抗原を取り込むことができる。「成熟Ｄ
Ｃ」は、インビボ、インビトロ、エクスビボまたはＤＣ１−極性化された（すなわち、完
全に細胞性免疫を促進することができる）宿主もしくは対象に存在する抗原提示細胞も指
す。
「疾患」は、動物の健康状態であって、ここで、該動物はホメオスタシスを維持するこ
とができず、該疾患が寛解させられないと、該動物の健康は悪化し続ける。
動物における「障害」は、該動物がホメオスタシスを維持することができる健康状態で
あるが、該障害が存在しないよりは好ましくない健康状態である。未治療で放置した場合
、障害は動物の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こさない。
患者により経験された疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の重症度また
は頻度が低減される場合、該疾患または障害は「緩和される」。
本明細書中で、「有効量」または「治療的有効量」は交換可能に使用され、本明細書に
記載の特別な生物学的結果を達成するために有効な化合物、製剤、材料または組成物の量
を指す。そのような結果は、本技術分野で好適な任意の手段によって決定されるウイルス
感染の阻止を含みうるが、それに限定されない。
本明細書に記載の「内因性」は、生物、細胞、組織または系に由来するかまたはその内
部で産生される任意の材料を指す。
本明細書に記載の用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系の外部から導入される
かまたは外部で産生される任意の材料を指す。
「エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性」癌は、ＥＲの発現についての試験で陽性の結果が
出る癌である。反対に「ＥＲ陰性」癌は、そのような発現についての試験で陰性の結果が
出る。ＥＲの状態の分析は、本技術分野で知られた任意の方法により実行することができ
る。
本明細書中で使用される用語「凍結保存用培地」は、細胞サンプル中の少なくともいく
らかの細胞が、融解後、回復され、生存能力のあるままでいられるように、凍結に備えて
細胞サンプルと混合された任意の培地を指す。
「ＨＥＲ２」は、ヒト上皮増殖因子受容体（「ＥＧＦＲ」）ファミリーのメンバーであ
る。ＨＥＲ２はヒト乳癌の約２０-２５％で過剰発現され、他の多くの癌で発現される。
「ＨＥＲ受容体」は、ＨＥＲ受容体ファミリーに属し、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１，ＨＥＲ
１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）
受容体を含む、受容体タンパク質チロシンキナーゼである。一般に、ＨＥＲ受容体は、細
胞外ドメインを含み、これは、ＨＥＲリガンドを結合し、ならびに／または別のＨＥＲ受
容体分子；脂溶性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；および
数個のリン酸化されうるチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナリングドメインと
二量体化しうる。ＨＥＲ受容体は、「天然配列」のＨＥＲ受容体またはその「アミノ酸配
列バリアント」でありうる。好ましくは、ＨＥＲ受容体は、天然配列のヒトＨＥＲ受容体
である。
「ＨＥＲ経路」は、ＨＥＲ受容体ファミリーによって仲介されるシグナリングネットワ
ークを指す。
「ＨＥＲ活性化」は、任意の１つまたは複数のＨＥＲ受容体の活性化またはリン酸化を
指す。一般に、ＨＥＲ活性化は、（例えば、ＨＥＲ受容体または基質ポリペプチド中のＨ
ＥＲ受容体リン酸化チロシン残基の細胞内キナーゼドメインにより引き起こされる）シグ
ナル伝達を結果として生じる。ＨＥＲ活性化は、目的のＨＥＲ受容体を含むＨＥＲダイマ
ーに結合しているＨＥＲリガンドにより仲介されうる。ＨＥＲダイマーに結合しているＨ
ＥＲリガンドは、ダイマー中の１つまたは複数のＨＥＲ受容体のキナーゼドメインを活性
化し、それによって、１つもしくは複数のＨＥＲ受容体中のチロシン残基のリン酸化およ
び／またはＡｋｔもしくはＭＡＰＫ細胞内キナーゼなどのさらなる基質ポリペプチド（複
数可）中のチロシン残基のリン酸化を結果として生じうる。
「ＨＥＲ２結合ペプチド」、「ＨＥＲ２ ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド」、「結合ペ
プチド」、「ＨＥＲ２ペプチド」、「免疫原性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド」、「抗原
結合ペプチド」、「ＨＥＲ２エピトープ」、「反応性ペプチド」などは、本明細書中で使
用される場合、全ヒト乳癌の約２０〜２５％に見出される標的であるＨＥＲ２／ｎｅｕタ
ンパク質の配列に由来するか、またはそれに基づくＭＨＣクラスＩＩペプチド、および、
その均等物をいう。ＨＥＲ２細胞外ドメイン「ＥＣＤ」とは、細胞外で、細胞膜に固定さ
れているか、または循環している、その断片を含むＨＥＲ２のドメインをいう。ＨＥＲ２
細胞内ドメイン「ＩＣＤ」は、細胞の細胞質内のＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のドメイン
を指す。好ましい実施形態によれば、ＨＥＲ２エピトープまたはそうでなければ結合ペプ
チドは、３つのＨＥＲ２ ＥＣＤペプチドおよび３つのＨＥＲ２ ＩＣＤペプチドを含む
６つのＨＥＲ２結合ペプチドを含む。
好ましいＨＥＲ２ ＥＣＤペプチドは、
ペプチド４２−５６：ＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（配列番号１）、
ペプチド９８−１１４：ＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬ（配列番号２）、および
ペプチド３２８−３４５：ＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬ（配列番号３）を含む
。
好ましいＨＥＲ２ ＩＣＤペプチドは、
ペプチド７７６−７９０：ＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬ（配列番号４）、
ペプチド９２７−９４１：ＰＡＲＥＩＰＤＬＬＥＫＧＥＲＬ（配列番号５）、および
ペプチド１１６６−１１８０：ＴＬＥＲＰＫＴＬＳＰＧＫＮＧＶ（配列番号６）を含む。
患者がＨＬＡ−Ａ２陽性／Ａ２．１血液型を有する実施形態では、ＭＨＣクラスＩペプチ
ドまたはエピトープは、
ペプチド３６９−３７７：ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号７）、および
ペプチド６８９−６９７：ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ（配列番号８）を含む。
「ＨＥＲ２陽性」は、ある種の乳癌ならびに多数の他のタイプの癌の分類または分子サ
ブタイプである。ＨＥＲ２陽性は、現在、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーション）アッセイによる遺伝子増幅および病理学的染色の強度で２＋または３＋によっ
て定義される。
「ＨＥＲ２陰性」は、ＦＩＳＨによる遺伝子増幅の欠如によって定義され、ほとんどの
場合０〜２＋の範囲の病的染色を包含することができる。
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患と定義される。代表的な過
剰増殖性疾患としては、癌または自己免疫疾患が挙げられるが、それに限定されない。他
の過剰増殖性疾患は、例えば、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、または炎症
性腸疾患を含みうる。
本明細書中で使用される用語「阻害する」は、例えば、対照値と比較して約１０パーセ
ント、活性または機能を抑制または遮断することを意味する。好ましくは、活性は、対照
値と比較して５０％、より好ましくは７５％、さらに好ましくは９５％抑制または遮断さ
れる。本明細書中で使用される「阻害する」は、分子、反応、相互作用、遺伝子、ｍＲＮ
Ａおよび／またはタンパク質の発現、安定性、機能または活性を、測定可能な量だけ低減
するかまたは完全に防止することも意味する。阻害剤は、例えば、タンパク質、遺伝子お
よびｍＲＮＡに結合して、部分的にまたは完全に、刺激を遮断し、活性化を減少させ、防
止し、遅延させ、不活性化し、脱感作し、または安定性、発現、機能および活性を下方制
御する化合物、例えば、アンタゴニストである。
本明細書中で使用される「指導用資料」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝え
るために使用される刊行物、記録、ダイアグラムまたは任意の他の表現媒体を含む。本発
明のキットの指導用資料は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を
入れた容器に添付され、または該核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を入れた容器と
ともに発送することができる。あるいは、指導用資料は、レシピエントによって指導用資
料および化合物が協同的に使用される意図をもって、容器とは別に発送されうる。
「単離された」は、自然の状態から変更されるまたは除去されることを意味する。例え
ば、生きている動物中に自然に存在する核酸またはペプチドは、「単離され」ていないが
、その自然の状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同一の核酸またはペプ
チドは、「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に純粋な形態
で存在しうるか、または例えば、宿主細胞などの非自然の環境中に存在しうる。
抗ＨＥＲ２ ＣＤ４＋ Ｔｈ１免疫応答について分析された各被験体群について、以下
のＣＤ４＋ Ｔｈ１応答（またはＴｈ１応答）の「評価指標」が定義される：（ａ）全体
の抗ＨＥＲ２応答性（１つ以上の反応性ペプチドに応答する被験体の割合（％）として表
される）；（ｂ）応答レパートリー（各被験者群によって認識される反応性ペプチドの平
均数として表される）；および、（ｃ）累積応答（各被験者群からの６つのＭＨＣクラス
ＩＩ結合ペプチドからの反応性スポット（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析からの１０６細
胞あたりのスポット形成細胞「ＳＦＣ」）の合計として表される）。
本明細書中で使用される用語「調節すること」により、治療または化合物の非存在下の
対象における応答のレベルおよび／またはその他は同一であるが未治療の対象における応
答のレベルと比較した、対象における応答のレベルの検出可能な増加または減少を仲介す
ることが意味される。この用語は、自然のシグナルまたは応答を攪乱させおよび／または
影響を及ぼし、それによって対象、好ましくはヒトにおいて有益な治療反応を仲介するこ
とを包含する。
本明細書で使用する乳癌の「ネオアジュバント療法」は、一次療法（すなわち、手術）
の前に与えられる治療を意味する。「アジュバント療法」は、長期生存の確率を増加させ
るための、一次療法後の治療である。
本明細書中で使用される「集団」は、均一な、実質的に均一な、または不均一な細胞の
培養物を含む、単離された培養物への言及を含む。一般に、「集団」は、「単離された」
細胞の培養物とも見なされうる。
本明細書中で使用される「組換え細胞」は、組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞で
ある。
「応答性」または「抗ＨＥＲ２応答性」は、本明細書中で交換可能に使用され、６つの
結合ペプチドの少なくとも１つに応答する被験体のパーセンテージを意味する。
「応答レパートリー」は、各対象群によって認識される反応性ペプチドの平均数（「ｎ
」）として定義される。
本明細書中で使用される「サンプル」または「生体サンプル」は、器官、組織、エキソ
ソーム、血液、血漿、唾液、尿および他の体液を含むが、これに限定されない、対象から
の生体物質を意味する。サンプルは、対象から得られた材料の任意の供給源でありうる。
「老化」は、もはや分裂することができないが、まだ生きて代謝的に活性である細胞を
指す。老化細胞の特徴は、本質的に不可逆的な増殖停止、およびＳＡ−β−ｇａｌ、Ｐ１
５ＩＮＫ４Ｂおよびｐ１６ＩＮＫ４ａの発現を含む。
本明細書中で使用される「シグナル１」は、一般に、活性化されたＤＣからＴ細胞へ伝
えられる第１の生化学的シグナルを指す。シグナル１は、ＤＣの表面において発現された
抗原によって提供され、Ｔ細胞受容体を通してＴ細胞により感知される。
本明細書中で使用される「シグナル２」は、ＤＣからＴ細胞に提供される第２のシグナ
ルを指す。シグナル２は、通常、（他の共刺激分子が知られているが）ＣＤ８０および／
またはＣＤ８６である、活性化されたＤＣにおける「共刺激」分子により提供され、表面
受容体ＣＤ２８を通してＴ細胞により感知される。
本明細書中で使用される「シグナル３」は、一般に、活性化されたＤＣにより提供され
た（通常はサイトカインである）可溶性タンパク質から生成されるシグナルを指す。これ
らは、Ｔリンパ球上の受容体を通して感知される。３番目のシグナルは、現在の脅威に最
もよく対処するために、どの形質的または機能的特徴を獲得すべきかをＴ細胞に指導する
。
本明細書中で使用される用語「特異的に結合する」により、抗体などの、別の分子また
は特徴を認識し、それに結合するが、サンプル中の他の分子または特徴を実質的に認識せ
ず、それに結合しない分子が意味される。
用語「対象」、「患者」、「個体」などは、本明細書において交換可能に使用され、本
明細書に記載の発明に受け入れられるインビトロまたはインサイチュいずれかの任意の動
物またはその細胞を指す。ある一定の非限定的な実施形態において、患者、対象または個
体はヒトである。
「Ｔ／Ｃ」は、トラスツズマブおよび化学療法として定義される。これは、乳癌手術前
／後にトラスツズマブと化学療法の両方を受ける患者を指す。
本明細書中で使用される用語「Ｔ細胞」は、様々な細胞性免疫応答に参加する胸腺由来
細胞と定義される。
細胞に関して本明細書中で使用される用語「Ｔヘルパー細胞」、「ヘルパーＴ細胞」、
「Ｔｈ細胞」などは、当業者により識別可能な様々な細胞タイプを含むリンパ球（白血球
の一種）の下位群を示す。特に、Ｔヘルパー細胞は、主要な機能が他のＢリンパ球および
Ｔリンパ球および／またはマクロファージの活性化および機能を促進することであるエフ
ェクターＴ細胞（Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７など）である。ヘルパーＴ細胞は、「Ｔ
ｈ１」または「タイプ１」および「Ｔｈ２」または「タイプ２」表現型として知られる２
つの主要なサブタイプの細胞に分化する。これらのＴｈ細胞は、他の白血球を刺激するか
またはそれと相互作用するサイトカイン、タンパク質またはペプチドを分泌する。本明細
書で使用する「Ｔｈ１細胞」、「ＣＤ４＋ Ｔｈ１細胞」、「ＣＤ４＋ Ｔヘルパー１型
細胞」、「ＣＤ４＋ Ｔ細胞」などは、表面糖タンパク質ＣＤ４を発現した成熟Ｔ細胞を
指す。ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞は、樹状細胞などの抗原提示ペプチド（「ＡＰＣ」）の
表面上に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化さ
れる。ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞は、ＭＨＣ抗原複合体により活性化されると、インター
フェロンγ（「ＩＦＮ−γ」）などのサイトカインを高レベルで分泌する。このような細
胞は、宿主細胞の内部に存在する、所定の疾患を引き起こす微生物に対して非常に有効で
あり、ヒト癌の抗腫瘍応答において非常に重要であると考えられている。
本明細書中で使用される「Ｔｈ１Ｔ細胞」は、高レベルのサイトカインＩＦＮ−γを産
生し、宿主細胞および癌の内部に生存する一定の病原微生物に対して効果が高いと考えら
れるＴ細胞を指す。
本明細書中で使用される「Ｔｈ１７Ｔ細胞」は、高レベルのサイトカインＩＬ−１７お
よびＩＬ−２２を産生し、粘膜表面上に生存する一定の病原微生物に対して効果が高いと
考えられるＴ細胞を指す。
「治療的有効量」は、患者に投与された場合に疾患の症状を寛解させる、本発明の化合
物の量である。「治療的有効量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、疾患の状態
およびその重症度、治療される患者の年齢などに依存して変動する。治療的有効量は、当
業者自身の知識および本開示を考慮して、当業者により日常的に決定することができる。
用語「治療する」、「治療すること」および「治療」は、本明細書に記載の治療的また
は予防的手段を指す。「治療」の方法は、疾患もしくは再発した疾患の１つもしくは複数
の症状を予防し、癒し、遅延させ、重症度を低減し、もしくは寛解させるため、またはそ
のような治療の非存在下での予測を超えて対象の生存を延長させるための、そのような治
療を必要とする対象、例えば、疾患もしくは障害に苦しむ対象、または最終的にそのよう
な疾患もしくは障害にかかる可能性がある対象への、本発明の組成物の投与を採用する。
本明細書中で使用される用語「Ｔｏｌｌ様受容体」または「ＴＬＲ」は、生来の免疫系
において役割を果たすタンパク質のクラスと定義される。ＴＬＲは、微生物由来の構造的
に保存された分子を認識する、単一膜貫通型非触媒作用性受容体である。ＴＬＲは、リガ
ンドに結合した際に、免疫細胞の反応を活性化する。
本明細書中で使用される用語「Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト」または「ＴＬＲアゴニス
ト」は、免疫細胞の反応を活性化するためにＴＬＲに結合するリガンドと定義される。
本明細書中で使用される用語「ワクチン」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好まし
くはヒトへのその投与後に、免疫応答を誘発するために使用される材料として定義される
。対象への導入に際して、ワクチンは、抗体、サイトカインの産生および／または他の細
胞応答を含むが、それに限定されない、免疫応答を誘発することができる。
範囲：本開示全体を通して、本発明の多様な態様が範囲の形式で表されうる。範囲の形
式における記載は、単に便利さおよび簡潔さのためであり、本発明の範囲への柔軟性のな
い制限と解釈されるべきでない。よって、範囲の記載は、すべての可能な部分的範囲なら
びにその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、
１から６までのような範囲の記載は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２か
ら４まで、２から６まで、３から６までなどの部分範囲ならびに例えば、１、２、２．７
、３、４、５、５．３および６などのその範囲内の個々の数を具体的に開示していると見
なされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず、当てはまる。
説明
本発明は、ＤＣの調製を含む。一実施形態において、ＤＣ調製物の純度は９０％超であ
る。別の実施形態において、ＤＣ調製物は、完全に活性化される。例えば、ＤＣは、サイ
トカインおよび／またはＴｏｌｌ様受容体リガンドによって活性化され、この状態は、本
発明の凍結保存技術によって完全に維持される。本発明のＤＣ調製物の利益は、１回の白
血球搬出（患者収集物）から、いかなる専門の細胞プロセシング施設またはさらなる品質
管理試験も要求されることなく、離れた治療場所において必要に応じて融解されうる、初
回ワクチン＋複数（例えば、１０以上）の「ブースター」用量に効率的に凍結保存される
ということである。
本明細書中で考慮されるとおり、本発明は、Ｔ細胞に対するより強いシグナルを生成し
て、より強力なＤＣに基づくワクチンを結果としてもたらす優れた機能性を有するＤＣを
生成し、凍結保存するための方法を提供する。そのような細胞を有効に凍結保存すること
によって、後の使用のためにサンプルを貯蔵し、融解することができ、それによって、ワ
クチン生産中の成分除去およびエルトリエーションプロセスを繰り返す必要性を低減する
ことができる。ＤＣを凍結することができ、次いで、後にそれらを融解することが可能で
あることは有益である。１ラウンドのワクチン生産が、小部分に分割され、凍結され、次
いで、数週間、数か月または数年にわたって、免疫を強化する「ブースター」接種を与え
るために、１回に１つずつ患者に投与されうることを意味するからである。
一実施形態において、本発明は、一人の患者の白血球搬出によりＤＣを収集することに
よって生産された、ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン
を含む。ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンは、初回免
疫化用量および複数の「ブースター」用量を含む。ＦＤＡにより承認された注射用複数用
量抗原パルス樹状細胞ワクチンは、凍結保存され、投与現場における特別な必要条件（例
えば、ＦＤＡ命令によるＱＣ／ＱＡステップ）なしで患者へ一連投与するために、離れた
医療センターに発送することができる。
本発明は、凍結保存され、続いて融解された活性化ＤＣが、新たに採取されて活性化さ
れたＤＣと同様に臨床的に有効となるように、抗原提示ならびに多様なサイトカインおよ
びケモカイン産生におけるそれらの効力ならびに機能性を融解後に保持する手法でこれら
の活性化ＤＣを凍結保存することにも関する。
本発明は、ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のうちの１つまたは複数を遮断するとともに抗
ＨＥＲ−２ ＣＤ４ Ｔｈ１細胞を活性化することによって、細胞における腫瘍老化およ
びアポトーシスを誘導することにも関する。よって、本発明は、ＨＥＲ−２発現性乳癌に
おける腫瘍老化を促進するために、ＨＥＲ−２に関する発癌ドライバー遮断によって抗発
癌ドライバーＴｈ１免疫応答を促進するための組み合わせおよび方法を含む。一実施形態
において、抗発癌ドライバーＴｈ１免疫応を促進することは、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−
γを含む。一実施形態において、ＨＥＲ−２に関する発癌ドライバー遮断は、トラスツズ
マブおよびペルツズマブを含むが、それに限定されない、ＨＥＲ−２を遮断する任意の組
成物を含む。
一実施形態において、ＨＥＲ−２発現性乳癌の老化を誘導するための、ＨＥＲ−２およ
びＨＥＲ−３の１つまたは複数の遮断とＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの添加とを組み合わ
せるための組成物および方法が提供される。一実施形態において、ＴＮＦ−αおよびＩＦ
Ｎ−γは、ＣＤ４ Ｔｈ１細胞から分泌される。
一実施形態において、ＨＥＲ２は、乳癌細胞の老化およびアポトーシスを誘導するＴＮ
Ｆ−αおよびＩＦＮ−γのメカニズムにおいて必要とされる。
一実施形態において、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γは、トラスツズマブおよびペルツズ
マブに対する感受性を乳癌抵抗性細胞に回復させる。一実施形態において、Ｔｈ１サイト
カインであるＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−αは、癌患者に広く影響を及ぼす治療剤に対する
抵抗性を取り消す。
ＤＣに基づく免疫療法
ＤＣは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての役目を果たす多能性単球に由来する。ＤＣは
、末梢組織において普遍的であり、そこで抗原を捕捉する準備ができている。抗原の捕捉
に際して、ＤＣは抗原を小ペプチドにプロセシングし、二次的リンパ器官に向かって移動
する。リンパ器官内で、ＤＣはナイーブＴ細胞に対して抗原ペプチドを提示し、それによ
って、Ｔ細胞分化を極性化させるシグナルのカスケードを開始する。曝露に際し、ＤＣは
、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ結合ペプチドのいずれかに結合した抗原分子を提示し
、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞をそれぞれ活性化する（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１年
、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：２７１〜２９６頁；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ
ら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ ３９２、２４５〜２５２頁；Ｓｔｅｉｎｍａｎら、２０
０７年、Ｎａｔｕｒｅ ４４９：４１９〜４２６頁；Ｇｉｎｈｏｕｘら、２００７年、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． ２０４：３１３３〜３１４６頁；Ｂａｎｅｒｊｅｃら、２００６年
、Ｂｌｏｏｄ １０８：２６５５〜２６６１頁；Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９９年、Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８９：６１１〜６１４頁；Ｒｅｉｄら、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｏ
ｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１１４〜１２１頁；Ｂｙｋｏｖｓｋａｉａら、１９９９
年、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ． ６６：６５９〜６６６頁；Ｃｌａｒｋら、２０００
年、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ． ２：２５７〜２７２頁）。
ＤＣは、適応免疫応答の誘導、協調および調節に関与し、免疫系の自然アームおよび適
応アームのエフェクター間の連絡を統合する役目も果たす。これらの特徴は、ＤＣを免疫
療法のための強力な候補とした。ＤＣは、マクロピノサイトーシスおよび受容体依存性エ
ンドサイトーシスによって環境をサンプリングする独特の能力を有する（Ｇｅｒｏｅｒら
、２００８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：１５５〜１６４頁；Ｓｔｏｉｔｚｎｅｒら
、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５７：１６６５
〜１６７３頁；Ｌａｎｚｅｖｅｃｃｈｉａ Ａ．、１９９６年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．８：３４８〜３５４頁；Ｄｅｌａｍａｒｒｅら、２００５年、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、３０７（５７１５）：１６３０〜１６３４頁）。
ＤＣは、その抗原提示能力を高めるために成熟シグナルも必要とする。ＤＣは、ＴＮＦ
−α、ＣＤ４０Ｌまたはカルシウムシグナル伝達物質などの追加の成熟シグナルを提供す
ることによって、（第２のシグナル分子としても知られる）ＣＤ８０およびＣＤ８６など
の表面分子の発現を上方制御する（Ｃｚｅｒｎｉｅｅｋｉら、１９９７年、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５９：３８２３〜３８３７頁；Ｂｅｄｒｏｓｉａｎら、２０００年、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２３：３１１〜３２０頁；Ｍａｉｌｌｉａｒｄら、２００４年、Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４、５９３４〜５９３７頁；Ｂｒｏｓｓａｒｔら、１９９８年、
Ｂｌｏｏｄ ９２：４２３８〜４２４７頁；Ｊｉｎら、２００４年、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ． ６５：９３〜１０３頁）。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびプロスタグ
ランジンＥ２（ＰＧＥ２）を含むサイトカインの混合物が、ＤＣを成熟させる能力を有す
ることが確立されている（Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、２０００年、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍ．Ｒｅ
ｓ． ２９２：３２５〜３３２頁）。ＤＣは、抗原でパルスされる前に、カルシウムイオ
ノフォアによっても成熟されうる。
ＰＫＲおよびＭＤＡ−５などの病原体認識受容体（Ｋａｌａｌｉら、２００８年、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８１：２６９４〜２７０４頁；Ｎａｌｌａｇａｔｌａら、２００
８年、ＲＮＡ Ｂｉｏｌ． ５（３）：１４０〜１４４頁）に加えて、ＤＣは、病原体か
らの危険性を感知することもできるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）として知られる一連の受
容体も含有する。これらのＴＬＲが誘発されると、一連の活性変化がＤＣにおいて誘発さ
れ、これがＴ細胞の成熟およびシグナル伝達をもたらす（Ｂｏｕｌｌａｒｔら、２００８
年、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５７（１１）：１５８９
〜１５９７頁；Ｋａｉｓｈｏら、２００３年、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ． ３（４）：
３７３〜３８５頁；Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３（５５
２８）：２５３〜２５６頁；Ｎａｐｏｉｉｔａｎｉら、２００５年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ． ６（８）：７６９〜７７６頁）。ＤＣは、ナチュラルキラーγ−δＴ細胞および
α−βＴ細胞などの細胞介在性応答の多様なアームを活性化し、拡張することができ、い
ったん活性化されると、ＤＣはその免疫化能力を保持する（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１
年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：２７１〜２９６頁；Ｂａｎｃｈｅｒｅａ
ｕら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５〜２５２頁；Ｒｅｉｄら、２０００年
、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２：１１４〜１２１頁；Ｂｙｋｏｖｓｋａ
ｉａら、１９９９年、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：６５９〜６６６頁；Ｃｌａｒ
ｋら、２０００年、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ． ２：２５７〜２７２頁）。
本発明は、好ましくは疾患過程の早期に使用された場合に、臨床的に有効な免疫応答を
誘発することのできるＴｏｌｌ様受容体アゴニストにより活性化された、成熟した、抗原
取り込みＤＣを含む。本発明のＤＣは、望ましいレベルのサイトカインおよびケモカイン
を産生し、さらに、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する能力を有する。
一実施形態において、抗原パルス樹状細胞ワクチンを大規模生産する方法が提供される
。一実施形態において、該方法は、急速に樹状細胞を成熟させること、該樹状細胞を凍結
保存すること、および凍結保存された細胞を融解することを含み、ここで、融解された樹
状細胞は、Ｔ細胞応答を発生させるのに有効な量の少なくとも１つのサイトカインを産生
する。
一実施形態において、樹状細胞の成熟は、該細胞をＩＦＮ−γおよびＬＰＳと接触させ
ることを含む。
一実施形態において、融解された細胞は、ＤＣ１表現型を維持して、Ｔｈ１に極性化さ
れた免疫応答を推進する。
一実施形態において、融解された細胞は、主としてＴ細胞を増感させる能力を維持する
。
抗原取り込み（抗原パルス）免疫細胞の生成
本発明は、抗原に曝露されたまたは抗原で「パルスされた」細胞を含む。例えば、ＤＣ
などのＡＰＣは、例えば、抗原の存在下でのエクスビボの培養によってインビトロで、ま
たは抗原への曝露によってインビボで抗体が取り込まれうる。
当業者は、ＡＰＣの表面上の抗原の提示を促進するために十分な時間、該ＡＰＣを抗原
に曝露するやり方で、ＡＰＣが「パルスされ」うることも容易に理解する。例えば、ＡＰ
Ｃは、抗原ペプチドとして知られ、ＡＰＣの外側に直接「パルス」される、小ペプチド断
片の形態の抗原に曝露することができるか（Ｍｅｌｉｔａ−Ｄａｍａｎｉら、１９９４年
）、またはＡＰＣは、全タンパク質もしくはタンパク質粒子とともにインキュベートする
ことができ、これらは次いでＡＰＣにより消化される。これらの全タンパク質は、ＡＰＣ
によって小ペプチド断片に消化され、最終的にＡＰＣ表面に運ばれて、提示される（Ｃｏ
ｈｅｎら、１９９４年）。ペプチドの形態の抗原は、本明細書に記載の標準的な「パルス
」技術によって細胞に曝露されうる。
いかなる特別な理論に束縛されることを望むものではないが、外来のまたは自己抗原の
形態の抗原は、該抗原の免疫原性形態を保持するために本発明のＡＰＣによってプロセシ
ングされる。抗原の免疫原性形態は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞により認識され、それを
刺激することのできる抗原の形態を生成するための、断片化による抗原のプロセシングを
意味する。好ましくは、そのような外来抗原または自己抗原は、ＡＰＣによってペプチド
にプロセシングされるタンパク質である。ＡＰＣによって生成される関連ペプチドは、免
疫原性組成物としての使用のために抽出され、精製されうる。ＡＰＣによってプロセシン
グされたペプチドは、ＡＰＣによってプロセシングされたタンパク質に対する寛容性を誘
発するためにも使用されうる。
本発明の「パルスＡＰＣ」としても知られる、抗原を取り込んだＡＰＣは、インビトロ
またはインビボでＡＰＣを抗原に曝露することによって生成される。ＡＰＣがインビトロ
でパルスされる場合、ＡＰＣは培養皿に播種され、抗原がＡＰＣに結合するために十分な
量で十分な時間、抗原に曝露されうる。抗原のＡＰＣへの結合を達成するために必要な量
および時間は、本技術分野で知られているかまたは本明細書に開示された方法を用いるこ
とによって決定されうる。当業者に知られた他の方法、例えば、イムノアッセイまたは結
合アッセイは、抗原への曝露後にＡＰＣ上の抗原の存在を検出するために使用されうる。
本発明のさらなる実施形態において、ＡＰＣは、ＡＰＣによる特定のタンパク質の発現
を可能とするベクターでトランスフェクトされうる。ＡＰＣによって発現されるタンパク
質は、次いでプロセシングされ、細胞表面上に提示されうる。次いで、トランスフェクト
されたＡＰＣは、ベクターによってコードされたタンパク質に対する免疫応答を生じさせ
るための免疫原性組成物として使用されうる。
本明細書の他の場所で検討されるとおり、ベクターは、それに対する免疫原性応答が望
まれるタンパク質をコードし、発現する特定のポリヌクレオチドを含むように調製される
。好ましくは、細胞を感染させるためにレトロウイルスベクターが使用される。より好ま
しくは、細胞を感染させるためにアデノウイルスベクターが使用される。
別の実施形態において、ベクターは、ＡＰＣ上の受容体によって認識されるタンパク質
またはその部分をコードするようにウイルスベクターを改変し、それによって該ベクター
によるＡＰＣ受容体の占有がベクターのエンドサイトーシスを開始し、ウイルスベクター
の核酸によってコードされた抗原のプロセシングおよび提示を可能とすることによって、
ＡＰＣを標的としうる。ウイルスにより送達される核酸は、ウイルスにとって自然のもの
であってよく、これは、ＡＰＣ上で発現された場合、次いでプロセシングされ、ＡＰＣの
ＭＨＣ受容体上に提示される。
本明細書において考慮されるとおり、多様な方法が、宿主細胞中へポリヌクレオチドを
トランスフェクトするために使用されうる。該方法は、リン酸カルシウム沈降法、リポフ
ェクション法、微粒子銃、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、コ
ロイド分散系（すなわち、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズな
らびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む、脂質に基づく
系）を含むが、それに限定されない。これらの方法は、本技術分野で理解され、当業者が
これらの方法を実行できるように、公開文献に記載されている。
別の実施形態において、抗原を取り込んだＡＰＣを別な方法で生成するために、抗原を
コードするポリヌクレオチドが発現ベクター中にクローニングされ、該ベクターをＡＰＣ
中に導入することができる。細胞中へ核酸を導入するための多様なタイプのベクターおよ
び方法が、利用可能な公開文献中で議論されている。例えば、発現ベクターは、物理的、
化学的または生物学的手段によって宿主細胞中へトランスフェクトすることができる。例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７年、Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。抗原をコードするポリヌク
レオチドを含む発現ベクターの導入が、パルスされた細胞をもたらすことは容易に理解さ
れる。
本発明は、タンパク質、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの形態の全抗原をＡＰＣに取り込むこ
とを含むが、それに限定されない、ＡＰＣをパルスするための多様な方法を含む。しかし
ながら、本発明は、ＡＰＣをパルスするために使用される特定の形態の抗原に限られると
理解されるべきでない。むしろ、本発明は、抗原を取り込んだＡＰＣを生成するための本
技術分野で知られた他の方法を包含する。好ましくは、ＡＰＣは、定義された抗原をコー
ドするｍＲＮＡでトランスフェクトされる。その配列が知られた遺伝子産物に対応するｍ
ＲＮＡは、適切なプライマーおよび転写反応と合わせた逆転写酵素−ポリメラーゼ（ＲＴ
−ＰＣＲ）を用いてインビトロで容易に生成することができる。ｍＲＮＡによるＡＰＣの
トランスフェクションは、パルスされたＡＰＣを生成するための他の抗原取り込み技術よ
りも有利である。例えば、顕微鏡的量の組織、すなわち、腫瘍組織からＲＮＡを増幅する
能力は、多数の患者へのワクチン接種のためのＡＰＣの用途を広げる。
抗原組成物がワクチンとして有用であるためには、抗原組成物は、細胞、組織または哺
乳動物（例えば、ヒト）における抗原への免疫応答を誘導しなければならない。本明細書
中で使用される「免疫学的組成物」は、抗原（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）、
抗原をコードする核酸（例えば、抗原発現ベクター）または抗原もしくは細胞の構成要素
を発現もしくは提示する細胞を含みうる。具体的な実施形態において、抗原組成物は、本
明細書に記載の任意の抗原のすべてもしくは一部、またはその免疫機能的等価物を含むか
またはコードする。他の実施形態において、抗原組成物は、追加の免疫刺激剤またはその
ような作用剤をコードする核酸を含む混合物中にある。免疫刺激剤は、追加の抗原、免疫
調節剤、抗原提示細胞またはアジュバントを含むが、それに限定されない。他の実施形態
において、１つまたは複数の追加の作用剤（複数可）が、任意の組み合わせで、抗原また
は免疫刺激剤に共有結合される。ある一定の実施形態において、抗原組成物は、ＨＬＡの
アンカーモチーフアミノ酸にコンジュゲーションされるかまたはそれを含む。
本明細書中で考慮されるワクチンは、その核酸組成および／または細胞の構成要素が変
動しうる。非限定例において、抗原をコードする核酸は、アジュバントと配合することも
できる。もちろん、本明細書に記載の多様な組成物が追加の構成要素をさらに含みうるこ
とは理解される。例えば、１つまたは複数のワクチン構成要素が脂質またはリポソーム中
に含まれうる。別の非限定例において、ワクチンは、１つまたは複数のアジュバントを含
みうる。本発明のワクチンおよびその多様な構成要素は、本明細書に開示されたまたは本
開示に照らして当業者に知られるであろう任意の方法によって調製されおよび／または投
与されうる。
本発明の抗原組成物が、固相合成による化学合成および化学反応の他の生成物からのＨ
ＰＬＣによる精製、または本発明の抗原を含むペプチドもしくはポリペプチドをコードす
る核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）のインビトロの翻訳システムもしくは生きた細胞にお
ける発現による生産を含むがそれに限定されない、本技術分野で周知の方法により作られ
うることは理解される。さらに、抗原組成物は、生体サンプルから単離された細胞の構成
要素を含むことができる。抗原組成物は、単離され、１つもしくは複数の望ましくない低
分子量の分子を除去するために大規模に透析されおよび／または所望のビヒクル中へのよ
り容易な配合のために凍結乾燥される。ワクチン成分にて追加のアミノ酸、突然変異、化
学修飾などが存在する場合、これらがエピトープ配列の抗原認識を実質的に妨害しないこ
とが好ましいということがさらに理解される。
本発明の１つまたは複数の抗原決定基に対応するペプチドまたはポリペプチドは、一般
に、少なくとも５アミノ酸残基または６アミノ酸残基の長さでなければならず、最大約１
０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個または
約５０個の残基を含みうる。ペプチド配列は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃ
Ａ）から入手可能なものなどの自動化ペプチド合成機を用いるペプチド合成のような当業
者に知られた方法によって合成されうる。
より長いペプチドまたはポリペプチドも、例えば、組換え手段によって調製されうる。
ある一定の実施形態において、例えば、本発明の多様な組成物および方法のための抗原組
成物をインビトロまたはインビボで生成するために、本明細書に記載の抗原組成物および
／または構成要素をコードする核酸が使用されうる。例えば、ある一定の実施形態におい
て、抗原をコードする核酸は、例えば、組換え細胞中のベクターに含まれる。核酸は、発
現されて抗原性配列を含むペプチドまたはポリペプチドを生成しうる。ペプチドまたはポ
リペプチドは、細胞から分泌されるか、または細胞の一部としてもしくは細胞内に含まれ
うる。
ある一定の実施形態において、抗原をコードする核酸により哺乳動物を形質転換するか
またはそれを接種することによって、免疫応答が促進されうる。次いで、標的哺乳動物内
に含まれる１つまたは複数の細胞が、哺乳動物への核酸の投与後に、該核酸によりコード
される配列を発現する。ワクチンは、例えば、抗原のペプチドまたはポリペプチド配列の
全部または一部をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）の形態であることも
できる。核酸によるインビボでの発現は、例えば、プラスミドタイプのベクター、ウイル
スベクターまたはウイルス／プラスミド構築物ベクターによることができる。
別の実施形態において、核酸は、適切な抗原またはその免疫機能的等価物をコードする
配列の全体または一部をコードするコード領域を含む。もちろん、核酸は、１つまたは複
数の免疫調節剤またはアジュバントを含むものを含むが、それに限定されない、追加の配
列を含みおよび／またはコードしうる。
抗原
本明細書中で考慮されるとおり、本発明は、免疫応答を誘発するためにＡＰＣに取り込
まれるのに好適な任意の抗原の使用を含みうる。一実施形態において、腫瘍抗原が使用さ
れうる。腫瘍抗原は、共通腫瘍抗原、および、ユニーク腫瘍抗原の２つの広いカテゴリー
分類することができる。共通抗原は、多くの腫瘍によって発現されるが、ユニーク腫瘍抗
原は、物理的または化学的発癌物質により誘導された突然変異に起因することができ、し
たがって、個々の腫瘍によってのみ発現される。ある一定の実施形態において、共通腫瘍
抗原が本発明のＤＣに取り込まれる。他の実施形態において、ユニーク腫瘍抗原が本発明
のＤＣに取り込まれる。
本発明との関連で、「腫瘍抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。あ
る態様において、本発明の過剰増殖性障害抗原は、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、
リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮
癌、子宮頚部癌、膀胱癌、腎臓癌および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの腺癌を含
むが、それに限定されない癌に由来する。
悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原としての役目を果たすことのできる多数のタンパク質
を発現する。これらの分子は、黒色腫中のＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびＧＰ１００
ならびに前立腺癌中の前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異抗原（ＰＳ
Ａ）などの組織特異抗原を含むが、それに限定されない。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥ
Ｒ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに
別の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫におい
て、腫瘍特異的イディオタイプイムノグロブリンは、個々の腫瘍に独特の真に腫瘍特異的
なイムノグロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３７などのＢ細胞分
化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原のいくつか
（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９．ＣＤ２０、イディオタイプ）は、大した成果のないモ
ノクローナル抗体による受動免疫療法のための標的として使用されてきた。
腫瘍抗原およびその抗原性癌エピトープは、初代臨床分離株、細胞株のような天然源か
ら精製され、単離されうる。癌ペプチドおよびその抗原性エピトープも、化学合成により
または本技術分野で知られた組換えＤＮＡ技術によって得られうる。化学合成のための技
術は、Ｓｔｅｗａｒｄら（１９６９年）；Ｂｏｄａｎｓｋｙら（１９７６年）；Ｍｅｉｅ
ｎｈｏｆｅｒ（１９８３年）；およびＳｃｈｒｏｄｅｒら（１９６５年）に記載されてい
る。さらに、Ｒｅｎｋｖｉｓｔら（２００１年）に記載のとおり、本技術分野においては
多数の抗原が知られている。アナログまたは人工的に修飾されたエピトープは具体的に記
載されないが、当業者は、本技術分野における標準的な手段によってそれらをどのように
得るかまたは生成するかを認識している。抗体によって同定され、Ｓｅｒｅｘ法（Ｓａｈ
ｉｎら（１９９７年）およびＣｈｅｎら（２０００年）を参照されたい）によって検出さ
れる他の抗原は、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈのデータベース中に確認される。
さらに別の実施形態において、本発明は、ＡＰＣによる提示のための微生物抗原を含み
うる。本明細書中で考慮される微生物抗原は、ウイルス、細菌または真菌起源でありうる
。感染性ウイルスの例としては：Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、（ＨＴＬＶ−ＩＩ
Ｉ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる）ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−Ｉ
ＩＩなどのヒト免疫不全症ウイルス；およびＨＩＶ−ＩＰなどの他の単離株）；Ｐｉｃｏ
ｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス
、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉ
ｄａｅ（例えば、胃腸炎を引き起こす菌株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳
炎ウイルス、ルベラウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デングウイルス、脳炎
ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）
；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水泡性口内炎ウイルス、ラビウイルス）；Ｆｉ
ｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例
えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウ
イルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂ
ｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンターウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルス
およびナイロウイルス）；Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉ
ｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；Ｂｉｒｎａ
ｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉ
ｒｉｄａ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリ
オーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（ほとんどのアデノウイルス）；Ｈｅｒｐ
ｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型、バリセラゾスタ
ーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄ
ａｅ（バリオーラウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄ
ｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）；および未分類ウイルス（例え
ば、海綿状脳症の病原体、（Ｂ型肝炎ウイルスの不完全サテライトと考えられる）デルタ
肝炎の病原体、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部感染した；クラス２＝非経
口感染した（すなわち、Ｃ型肝炎））；Ｎｏｒｗａｌｋおよび関連ウイルス、およびアス
トロウイルス）が挙げられる。
感染性細菌の例としては：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉ
ａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｓ（例えば、Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ． ａｖ
ｉｕｍ、Ｍ． ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ． ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ． ｇｏｒ
ｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇ
ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒ
ｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（
Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇ
ａｌａｃｔｉａｅ（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ ｇｒｏｕｐ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃ
ａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ａ
ｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｐｓ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、
病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｈａ
ｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、
ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｉｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ
、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓ
ｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔ
ｅｎｕｅ、ＬｅｐｔｏｓｐｉｒａおよびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉが挙
げられる。
感染性真菌の例としては：Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓ
ｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ，Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ
、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃ
ｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられる。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉを含む他の感染性
生物（すなわち、原生生物）。
ＤＣの活性化
（従前より臨床試験において優位を占めていた）従来のＤＣに基づくワクチンが、最終
的に無菌性炎症を刺激する、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＰＧＥ２およびＩＬ−１βの組み合わせ
を含むサイトカインカクテル混合物を使用して生成された成熟ＤＣからなる一方、ＤＣを
成熟させ、シグナル生成を刺激するために、本発明はその代わりにＴＬＲアゴニストを利
用する。
本発明のある態様によれば、ＴＬＲリガンドの組み合わせによるＤＣの刺激は、ＩＬ−
１２産生量の増大に導く。さらに、ＴＬＲアゴニストの組み合わせによるＤＣの活性化は
、より明白なＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞応答をもたらす（Ｗａｒｇｅｒら、２００６年、
Ｂｌｏｏｄ、１０８：５４４〜５５０頁）。したがって、本発明のＤＣは、ＴＬＲを誘発
するこれらのリガンドへの曝露によって、ＩＬ−１２などのＴｈ１駆動性サイトカインを
分泌することができる。例えば、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γに対するＴＬ
Ｒ３アゴニストであるポリ（Ｉ：Ｃ）の添加は、安定したレベルのＩＬ−１２産生を特徴
とする、強力な１型極性化ＤＣを生成することができる（Ｈｅｉｆｌｅｒら、１９９６年
、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６：６５９〜６６８頁）ある一定の実施形態におい
て、ＴＬＲアゴニストの曝露の前に抗原がＤＣに取り込まれる。他の実施形態において、
抗原はＴＬＲアゴニストの曝露に続いてＤＣに取り込むことができる。
本発明のある態様によれば、一人の患者の白血球搬出でＤＣを収集することによって、
注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンが生産され、ＤＣは細菌感染を刺激する生体
分子（例えば、ＬＰＳ）によって活性化される。この独特の活性化方法は、ＴＮＦ，ＩＬ
−６、ＰＧＥ２およびＩＬ−１βのサイトカインカクテルにより成熟されたＤＣ（「従来
の成熟」）においては認められない品質をＤＣに付与し、これは、無菌性の炎症も刺激す
る（Ｌｏｍｂａｒｄｉら、２００９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８２：３３７２〜３３
７９頁）。
一実施形態において、本発明のＤＣは、ＴＬＲ４アゴニスト、細菌性リポポリサッカラ
イド（ＬＰＳ）、ＴＬＲ７／８アゴニスト、レシミキド（ｒｅｓｉｍｉｑｕｏｄ）（Ｒ８
４８）および／またはＩＦＮ−γの組み合わせにより活性化することができる（Ａｍａｔ
ｉ ｅｔ ａｌ，、２００６年、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ、１２：４２４７〜４２
５４頁）。ＴＬＲ４アゴニストおよび細菌性ＬＰＳによってＤＣを活性化することによっ
て、従来の成熟方法を介して生成されたＤＣ１と少なくとも実質的に（表現型が）同一の
ＤＣが生成される。これらのＤＣは，ＣＤ８３，ＣＤ８０，ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ
を含む表面分子を高発現する。他の実施形態において、リポテイコ酸（ＬＴＡ）などのＴ
ＬＲ２アゴニスト、ポリ（Ｉ：Ｃ）などのＴＬＲ３アゴニストおよび／またはＭＰＬなど
のＴＬＲ４アゴニストが使用されうる。本明細書中で考慮されるとおり、任意のＴＬＲア
ゴニストまたはＴＬＲアゴニストの組み合わせが、そのようなリガンドが活性化ＤＣによ
るサイトカインおよびケモカインシグナルの生成を刺激するという条件で、ＤＣを活性化
するために使用することができる。本発明による使用のために、多くの他のＴＬＲアゴニ
ストが本技術分野で知られており、公開文献中に見られうる。
ＤＣと従来の方法で成熟されたＤＣの間に表現型の類似性があるとしても、本発明のＤ
Ｃは、多くの顕著な利点を示す。
凍結保存
培養開始および活性化後、細胞が採取され、ワクチンが凍結保存される。例えば、末梢
血単球が、白血球除去によって得られる。細胞は、ある期間、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−
４を含む血清フリー培地中で培養され、所望の抗原による細胞のパルスが続く。所望の抗
原で細胞をパルスした後、抗原でパルスされた樹状細胞がＩＦＮ−γ、続いてＴＬＲアゴ
ニスト（例えば、ＬＰＳ）とともにインキュベートされる。活性化された抗原パルス樹状
細胞が採取され、凍結保存用培地中で凍結保存され、液体窒素中で貯蔵される。一実施形
態において、凍結保存用培地は、５５％のプラズマライト、４０％のヒト血清アルブミン
および５％のＤＭＳＯを含む。
本発明の凍結保存態様は、ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞
ワクチンの生成を可能とする。本発明の利点は、複数用量抗原パルス樹状細胞が、Ｔ細胞
機能にとって決定的なシグナルを生成するそれらの能力を融解後に保持することである。
本明細書中で考慮されるとおり、本発明は、当業者により理解されるであろう多様な凍結
保存技術および凍結保存用培地を含む。例えば、ある一定の実施形態において、凍結保存
用培地は、５５％のプラズマライト、４０％のヒト血清アルブミンおよび５％のＤＭＳＯ
を含む。よって、本発明は、初回免疫化用量および複数の「ブースター」用量を含む、本
発明の複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンを中央集中エリアにおいて生産する能力を提
供する。したがって、複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンは、特別なＦＤＡの品質管理
／品質保証要件を要求されることなく、投与現場における患者への連続的投与のために離
れた医療センターに発送することができる。
一実施形態において、本発明の樹状細胞ワクチンは、複数回投与のためのアリコートで
凍結保存される。例えば、細胞は３０×１０６細胞／ｍＬの濃度で凍結保存される。例え
ば、細胞の体積に等しい容量の凍結保存用培地のバッグが準備される。迅速に作業しなが
ら、凍結保存用培地が細胞バッグに添加され、ラベルされた凍結バイアルに細胞が移され
る。一実施形態において、バイアルは速度制御冷凍庫を用いて凍結される。例えば、凍結
バイアルは、自動速度制御冷凍庫を用いて１℃／分で凍結され、気相窒素中に貯蔵される
。
一実施形態において、バイアルは、速度制御冷凍庫を用いて凍結される。バイアルは、
凍結チャンバー中に置かれ、液体窒素が電子ソレノイドバルブを通してチャンバーに入る
。蒸発はほとんど瞬時であるため、液体窒素がチャンバーに入る速度を制御することが、
熱が吸収され、凍結チャンバーおよびその内容物から除去される速度を直接制御する。
本明細書中で考慮されるとおり、本発明は、当業者に理解されるであろう多様な凍結保
存技術および凍結保存用培地を含む。例えば、ある一定の実施形態において、培養細胞の
ための凍結保存用培地は、約５５％のプラズマライト、約４０％のヒト血清アルブミンお
よび約５％のＤＭＳＯを含みうる。他の実施形態において、凍結保存用培地は、血清フリ
ーでありうる。ある一定の実施形態において、速度制御された凍結を使用することができ
、一方、他の実施形態は、例えば約−７０℃〜−８０℃にわたる温度の冷凍庫中に置かれ
た、凍結保存用培地と混合された細胞のバイアルが入った遮蔽容器の使用を含むことがで
きる。本発明は、そのような細胞の臨床応用をさらに容易化し、大規模な成分除去および
エルトリエーションステップを反復する必要性を低減する手法で活性化されたＤＣを保存
する方法を提供する。本明細書中で考慮されるとおり、凍結保存技術は、小規模および大
規模バッチの両方のために使用されうる。
活性化ＤＣの広範な用途を考慮する場合、凍結保存された活性化ＤＣの安定した供給を
提供する能力は、そのような細胞の多様な治療用途を容易化しうる、大きな利益を表す。
例えば、活性化ＤＣの大規模培養物は、細胞の個々の用量が後に任意の特定の免疫療法プ
ロトコールにおいて使用可能であるように、本発明の方法に従って、初回免疫化用量およ
び複数の「ブースター」用量を含む適切なサイズのアリコートで凍結保存されうる。ある
一定の実施形態において、活性化ＤＣは、約−７０℃以下の温度で２〜２４週間凍結保存
可能である。約−１２０℃以下などの、より低い温度においては、活性化ＤＣは少なくと
も１年以上、凍結保存されうる。
代表的な一実施形態において、ＤＣは、ヒト血清および約５％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）中
に懸濁される。あるいは、ウシ胎仔血清のような他の血清タイプが使用されうる。懸濁さ
れた細胞は、１．８ｍｌバイアルなどのより小さなサンプルに等分され、約−７０℃以下
で貯蔵可能である。他の実施形態において、凍結保存用培地は、約２０％の血清および約
１０％のＤＭＳＯを含むことができ、懸濁された細胞は、約−１８０℃で貯蔵可能である
。なおさらなる実施形態は、約５５％のプラズマライトおよび約５％のＤＭＳＯを含有す
る培地を含みうる。他の代表的な凍結保存用培地は、約１２％のＤＭＳＯおよび約２５〜
４０％の血清を含みうる。
本明細書に記載の本発明は、特定濃度の血清を含みうるが、当業者には、凍結保存用培
地中の血清の正確な量が変動してよく、いくつかの実施形態においては、全く存在しなく
てもよいが、一般的には、約１％〜３０％の範囲内であると理解されるべきである。もち
ろん、約５０％の細胞生存率および／または約５０％細胞回復率をもたらす任意の血清濃
度を、本発明の任意のＤＣ組成物中で使用することができ、ならびに本明細書に記載の任
意の凍結保存方法とともに使用することができる。選択された凍結保存用培地中の凍結保
存細胞を回復する場合、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７
０％、またはさらに少なくとも８０％の細胞生存率および細胞回復率が望まれる。
同様に、本明細書に記載の本発明は、特定濃度のＤＭＳＯを含みうるが、当業者は、い
くつかの実施形態においてＤＭＳＯが全く存在しなくてもよいが、他の実施形態において
は、約５％〜約２０％もの高い濃度が凍結保存用培地中で使用され、本明細書に記載の凍
結保存方法に含まれてよいことを認識すべきである。一般に、約５％から約１０％までの
間などの低濃度のＤＭＳＯが好ましい。しかしながら、融解後、少なくとも５０％の細胞
生存率および少なくとも５０％の細胞回復率、好ましくは少なくとも６０％、より好まし
くは約７０％、より好ましくは約８０％およびさらに好ましくは約９０％以上の細胞生存
率および回復率となる任意の濃度のＤＭＳＯが使用されうる。
本明細書に記載の本発明は、速度制御された凍結への言及を含みうるが、速度制御され
たまたは速度制御されない手法での凍結方法が日常的に使用可能であることは、当業者に
理解されるべきである。
本明細書に記載の多様な凍結保存媒体が、血清を含みうるかまたは血清フリーであって
よいことも、当業者に理解されるべきである。血清フリー培地の例としては、ＸＶＩＶＯ
１０、ＸＶＩＶＯ １５、ＸＶＩＶＯ ２０，ＳｔｅｍＰｒｏならびに任意の市販の血
清フリー培地が挙げられる。血清フリーの凍結用培地を利用する場合、本発明の凍結保存
方法は、一般に、抗原性である可能性のある感染性作用物質、抗体および外来タンパク質
、ならびに典型的に血清ベースの凍結用培地中に認められるいかなる他の外来分子を含ま
ない。
抗原を取り込んだ活性ＤＣの凍結保存は、ＴＬＲアゴニストによるＤＣの活性化後の任
意の時点で行うことができる。一実施形態において、活性化ＤＣは、ＴＬＲアゴニストへ
の曝露の約６〜８時間後に凍結保存される。好ましくは、活性化された細胞を凍結保存す
るために選ばれる時点は、細胞のシグナル生成、特にＩＬ−１２生成の最大化に基づくべ
きである。
本発明は、大規模な樹状細胞ワクチンを生産するための組成物および方法を提供する。
一実施形態において、樹状細胞ワクチンの大規模生産は、癌または他の障害の個別化され
た治療および予防のための、ＦＤＡにより承認された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞
ワクチンの生産を可能とする。一実施形態において、大規模な抗原パルス１型極性化樹状
細胞ワクチン（ＤＣ１）を生産するための組成物および方法が提供される。
一実施形態において、本発明は、抗原が取り込まれ、予備活性化された状態、つまり、
「シリンジレディ」、すなわち、（例えば、ＦＤＡ命令による）追加の施設および品質管
理／保証ステップを要求するいかなる追加の細胞プロセシングも必要としない、患者への
即時注射に好適な樹状細胞を大規模に凍結保存する方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン、好まし
くは、最大の有効性を示す注射用複数用量抗原パルス１型極性化樹状細胞ワクチンを効率
的に生産する方法を提供する。
組成物またはキット構成要素のパッケージング
本発明の組成物（またはキット構成要素）のための好適な容器は、バイアル、シリンジ
（例えば、使い捨てシリンジ）などを含む。これらの容器は、無菌的であるべきである。
組成物／構成要素がバイアル中に入れられる場合、バイアルはガラスまたはプラスチッ
ク材料で作られることが好ましい。バイアルは、組成物が加えられる前に滅菌されること
が好ましい。ラテックス感受性の患者の問題を回避するために、バイアルはラテックスを
含まない栓で密封されることが好ましく、すべてのパッケージング材料中にラテックスが
存在しないことが好ましい。バイアルは、単一用量のワクチンを含みうるか、または１つ
超の用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含みうる。好ましいバイアルは
、無色ガラスで作られる。
バイアルは、予め充填されたシリンジがキャップに挿入され、シリンジの内容物がバイ
アル中へ排出され、バイアルの内容物をシリンジに戻することができるように、適合され
たキャップ（例えば、ルアーロック）を有することができる。バイアルからシリンジを取
り外した後、次いで針が取り付けられ、組成物を患者に投与することができる。キャップ
は、キャップが利用可能となる前にシールまたはカバーをはずさなければならないように
、シールまたはカバーの内側に置かれることが好ましい。バイアルは、特に、複数用量バ
イアルについては、その内容物の無菌的な取り出しを許容するキャップを有しうる。
組成物／構成要素がシリンジ中に詰められる場合、シリンジは、それに取り付けられた
針を有しうる。針が取り付けられていない場合、組み立ておよび使用のために別の針がシ
リンジに供給されうる。そのような針は、さやに納められうる。安全針が好ましい。１イ
ンチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージの針が典型的である
。シリンジには、記録保持を容易化するために、ロット番号、シーズン（ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａ ｓｅａｓｏｎ）および内容物の使用期限を印刷することのできる剥離用ラベルが提
供されうる。シリンジ中のプランジャーは、吸入中にうっかりプランジャーが外れること
を防ぐために、ストッパーがあることが好ましい。シリンジは、ラテックスゴムのキャッ
プおよび／またはプランジャーを有しうる。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを
含有する。シリンジは、一般に、針の取り付け前に先端を剥ぐための先端キャップを有し
、先端キャップはブチルゴムで作られることが好ましい。シリンジおよび針が別々に包装
される場合、針はブチルゴムのさやを備えていることが好ましい。
容器は、例えば、子供への送達を容易化するために、半分の用量の体積を示すために印
をつけることができる。例えば、０．５ｍｌの用量を含有するシリンジは、０．２５ｍｌ
の体積を示す印を有しうる。
ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラス
よりもホウケイ酸ガラスで作られた容器を使用することが好ましい。
キットまたは組成物は、ワクチンの詳細、例えば、投与のための指示、ワクチン内の抗
原の詳細などを含むリーフレットとともに（例えば、同じ箱に）包装されうる。上記指示
は、例えば、ワクチン接種に続くアナフィラキシー反応の場合に、すぐに利用可能なアド
レナリンの溶液を保持することなどの警告も含みうる。
疾患を治療するための方法
本発明は、病原性微生物、自己免疫障害によって引き起こされる疾患および／または過
剰増殖性疾患の治療および／または予防の方法も包含する。
本発明の使用により治療または予防されうる疾患は、ウイルス、細菌、酵母、寄生虫、
原虫、癌細胞などにより引き起こされる疾患を含む。本発明の医薬組成物は、汎用の免疫
賦活剤（ＤＣ活性化組成物またはシステム）として使用することができ、したがって疾患
の治療における用途を有する。本発明の医薬組成物を利用して治療および／または予防さ
れることのできる代表的疾患としては、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性
肝炎、エプシュタインバー、ポリオ、ウイルス性脳炎、はしか、水痘、パピローマウイル
スなどのウイルス起源の感染症；肺炎、結核、梅毒などの細菌起源の感染症；またはマラ
リア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などの寄生虫
起源の感染症が挙げられるが、それに限定されない。
本発明の医薬組成物（形質導入ＤＣ、発現ベクター、発現構築物など）を用いて治療ま
たは予防されうる新生物発生前または過剰増殖状態は、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍
性大腸炎、乳房病変などを含むが、それに限定されない。
本発明の組成物を用いて治療されうる癌は、原発性または転移性黒色腫、腺癌、扁平上
皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホ
ジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、多発性骨
髄腫、神経芽細胞種、ＮＰＣ，膀胱癌、子宮頚部癌などを含むが、それに限定されない。
本発明のＤＣ活性化システムを用いて治療されうる他の過剰増殖性疾患は、リウマチ関
節炎、炎症性腸疾患、骨関節炎、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、
再狭窄、アテローム性動脈硬化、（腺腫様過形成、前立腺上皮内腫瘍などの）新生物発生
前の病変、インサイチュの癌腫、口腔内毛状白斑症または乾癬を含むが、それに限定され
ない。
本発明の組成物を用いて治療されうる自己免疫障害は、ＡＩＤＳ、アジソン病、成人呼
吸窮迫症候群、アレルギー、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、気管炎、胆嚢炎、クロ
ーン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、結節性紅斑
、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、エ
リテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗
しょう症、膵炎、多発性筋炎、リウマチ関節炎、強皮症、シェーグレン症候群および自己
免疫性甲状腺炎；癌、血液透析および体外循環の合併症；ウイルス、細菌、真菌、寄生虫
、原虫および寄生虫様感染症；ならびに外傷を含むが、それに限定されない。
治療方法において、本発明の組成物の投与は、「予防」または「治療」目的のいずれか
のためでありうる。予防的に与えられる場合、特定の実施形態においては、さらなる症状
が発生するのを予防するためまたは現在の症状が悪化するのを予防するために、１つまた
は複数の症状の発症後にワクチンが与えられるにもかかわらず、本発明の組成物は任意の
症状に先立って与えられる。組成物の予防的投与は、任意の後続の感染症または疾患を予
防または寛解させる役目を果たす。治療的に与えられる場合、医薬組成物は、感染症また
は疾患の症状の発症時またその後に与えられる。したがって、本発明は、病因物質への予
想される曝露または疾患状態のいずれかの前、あるいは感染症または疾患の開始後に与え
られうる。
組成物の有効量は、免疫応答の亢進のこの選ばれた結果を達成する量であり、そのよう
な量は、当業者により日常的に決定されうる。例えば、癌または病原体に対する免疫系の
不全を治療するのに有効な量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原への曝露に際して抗
原特異的な免疫応答の発生をもたらすのに必要な量でありうる。この用語は、「十分な量
」の同義語でもある。
任意の具体的な適用のための有効量は、治療される疾患もしくは状態、投与される具体
的組成物、対象のサイズおよび／または疾患もしくは状態の重症度などの因子に依存して
変動しうる。当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の具体的な組成物の有効量を
経験的に決定することができる。
治療適用
本発明は、凍結保存から融解された場合に、顕著なレベルのサイトカインおよびケモカ
インを産生する、抗原を取り込んだ活性化ＡＰＣの生成を含み、ここで、取り込まれた抗
原および活性化ＡＰＣは、哺乳動物、好ましくはヒトの免疫療法において使用される。Ａ
ＰＣによって提示された抗原への応答は、抗原に対する細胞溶解性Ｔ細胞応答、ヘルパー
Ｔ細胞応答、および／または抗原応答を、本技術分野で知られた方法を用いてモニターす
ることによって測定されうる。
本発明は、哺乳動物において免疫応答を亢進する方法であって、哺乳動物（例えば、患
者）から得られた単球から未成熟のＤＣを生成するステップ；未成熟のＤＣを、抗原性組
成物を含む組成物でパルスするステップ；抗原を取り込んだＤＣを少なくとも１つのＴＬ
Ｒアゴニストで活性化するステップ；活性化された、抗原を取り込んだＤＣを融解し、次
いで活性化された、抗原を取り込んだＤＣを、それを必要とする哺乳動物に投与するステ
ップを含む方法を含む。該組成物は、少なくとも１つの抗原を含み、さらに哺乳動物にお
けるエクスビボの免疫化および／またはインビボの治療のためのワクチンでありうる。好
ましくは、哺乳動物はヒトである。
エクスビボの手順は、本技術分野で周知であり、以下により完全に議論される。手短に
言えば、細胞は哺乳動物（好ましくはヒト）から単離される。細胞は、哺乳動物レシピエ
ントに投与されて、治療効果を提供する。哺乳動物レシピエントは、ヒトでありえ、細胞
は、レシピエントに関して自己のものでありうる。あるいは、細胞は、レシピエントに関
して同種、同系または異種のものでありうる。
一実施形態において、末梢血単球は、白血球除去およびエルトリエーションの組み合わ
せによって患者から得られる。単球は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含むＳＦＭ中で一
夜培養することができる。翌日、未成熟のＤＣが抗原でパルスされ、続いて、ＤＣがＩＦ
Ｎ−γおよびＬＰＳと接触させることができる。活性化ＤＣは、次いで、凍結保存用培地
中に懸濁され、免疫療法における使用の準備ができるまで凍結される。
凍結保存されたＤＣは、新たに活性化されたＤＣに匹敵する細胞の回復パーセントおよ
び生存パーセントを生じるために有効な条件下、エクスビボで培養することができる。凍
結保存されたサンプルから生成されたＤＣは、新たに調製されたＤＣと同様の安定性を示
すことができる。さらに、凍結保存された成熟ＤＣと新たに調製されたＤＣとの比較は、
実質的に同一の表現型ならびにシグナル生成プロフィールを示すことができる。本明細書
中で考慮されるとおり、ＤＣは、小規模および大規模の両方で、約−７０℃〜−８０℃の
温度で、本明細書に記載の多様な凍結保存用培地中、約２〜２４週間保存することができ
る。約−１２０℃未満の温度において、貯蔵時間は、ＤＣの細胞回復率、生存率および機
能性に影響を及ぼすことなく、無限にまたは少なくとも２４週間を超えて延長することが
できる。例えば、ある一定の実施形態において、活性化された細胞は、少なくとも１年間
保存することができ、シグナルを生成するそれらの能力を融解後になお保持することがで
きる。本明細書全体を通じて説明されるとおり、本発明は、細胞の融解に際して、有効な
回復および生存プロフィールを提供し、さらに、本明細書に記載の凍結保存条件は、ＤＣ
がそれらのシグナルプロフィールを保持する能力に影響しない。
代表的な実施形態において、凍結保存は、ＤＣの活性化後に、約５５％のプラズマライ
ト、約４０％のヒト血清アルブミンおよび約５％のＤＭＳＯを含む凍結保存用培地に細胞
を再懸濁することによって実行されうる。該混合物は、次いで、１．８ｍｌバイアルに等
分され、凍結チャンバー中で一夜、約−８０℃で凍結される。次いで翌日、バイアルは液
体窒素タンクに移すことができる。約２〜２４週間の凍結保存後、凍結されたＤＣは、融
解され、それらの回復率および生存率について検査することができる。そのようなＤＣの
回復率は、約７０％以上であり、生存率は、約７０％以上でありうる。他の実施形態にお
いて、ＤＣまたは単球でさえ、細胞活性化の前に凍結保存することができる。
あるいは、造血幹細胞および前駆細胞のエクスビボでの増殖のための手順が、その全体
が参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１９９，９４２号に記載
され、これは、本発明の細胞に適用することができる。米国特許第５，１９９，９４２号
に記載の細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリ
ガンドなどの他の因子が、細胞の培養および増殖のために使用可能である。
多様な細胞選択技術が、細胞を同定し、細胞集団から分離するために知られている。例
えば、モノクローナル抗体（または他の特異的な細胞結合性タンパク質）を、マーカータ
ンパク質または細胞上に認められる表面抗原タンパク質に結合するために使用することが
できる。数種のそのようなマーカーまたは細胞表面抗原が、本技術分野で知られている。
ワクチン製剤
本発明は、免疫療法における使用に好適なワクチン製剤をさらに含む。ある一定の実施
形態において、ワクチン製剤は、癌および感染性疾患のような疾患の予防および／または
治療のために使用される。一実施形態において、癌の予防および／または治療のための本
発明によるワクチンの患者への投与は、癌を除去するための外科手術の前もしくは後、癌
の治療のための化学療法の前もしくは後、および癌の治療のための放射線療法の前もしく
は後、およびその任意の組み合わせにおいて行われることができる。他の実施形態におい
て、ワクチン製剤は、別の組成物または医薬製品と併用してまたは組み合わせて投与され
うる。本発明が、癌を有さないが、癌を発症するリスクがあるかもしれない個体において
癌を予防するためにも使用可能であることは理解されるべきである。
本発明により調製された癌ワクチンの投与は、癌ワクチンの一部を形成する抗原の選択
によってある程度決定される、癌の予防または治療に広く適用可能である。本発明の実行
手順従って好適に治療されうる癌は、制限されることなく、肺、乳房、卵巣、子宮頸部、
結腸、頭部および頸部、膵臓、前立腺、胃、膀胱、腎臓、骨、肝臓、食道、胃食道、脳、
精巣、子宮の癌ならびに多様な白血病およびリンパ腫を含む。
一実施形態において、ワクチンは、治療される腫瘍または癌細胞に由来することができ
る。例えば、肺癌の治療において、肺癌ワクチンを生産するために、肺癌細胞が上記のよ
うに処理される。同様に、乳癌ワクチン、結腸癌ワクチン、膵臓癌ワクチン、胃癌ワクチ
ン、膀胱癌ワクチン、腎臓癌ワクチンなどが、ワクチンの生成源となった腫瘍または癌細
胞の予防および／または治療のための実行手順に従って、免疫療法剤として生産され、採
用される。
別の実施形態において、ワクチンは、前述のとおり、哺乳動物に影響を及ぼす多様な感
染性疾患を治療するために、病原体によって培地中に排出された関連抗原を収集すること
によって調製することもできる。同じ疾患を引き起こす様々な生物によって発現される免
疫原性および防御性抗原のタイプには不均一性があるため、重要な様々な抗原を発現する
生物のプールからワクチンを調製することによって、多価ワクチンが調製されうる。
本発明の別の実施形態において、ワクチンは、鼠径部リンパ節へのリンパ節内注射によ
って投与することができる。あるいは、ワクチンは、ワクチン標的に依存して、治療され
ている患者の四肢、上肢および下肢に皮内または皮下投与することができる。一般に、こ
のアプローチは、感染性疾患の予防または治療を含んで、黒色腫および他の癌のために満
足のいくものであるが、筋肉内または血流中などの他の投与経路も使用されうる。
さらに、ワクチンは、ワクチンの活性および患者の反応を強化するために、アジュバン
トおよび／または免疫調節剤とともに与えられることができる。そのようなアジュバント
および／または免疫調節剤は、当業者により理解されており、利用可能な公開文献中に手
軽に記載されている。
本明細書中で考慮されるとおり、生成されるワクチンのタイプに依存して、ワクチンの
生産は、所望により、バイオリアクターまたは発酵槽またはバルクで細胞を増殖させるた
めに好適な他のそのような容器もしくは装置中で細胞を培養することによって、スケール
アップすることができる。そのような装置においては、任意の材料または抗原が培地中で
分解される前にそのような材料または抗原を回収するために、培地が規則的に、頻繁にま
たは連続的に収集される。
所望により、本発明によって産生され、回収されたワクチンまたは抗原を含有し、持続
的または断続的な放出に好適な装置または組成物は、実際には、そのような材料の体内へ
の比較的遅いまたは時限放出のために、体内に埋め込まれるかまたは局所的にそこへ投与
されることもありうる。
ワクチン調製における他のステップは、特定のワクチンの要件を満たすために、個別化
することができる。そのような追加のステップは、当業者により理解される。例えば、収
集されたある抗原性材料は、濃縮され、いくつかの場合には、洗剤で処理され、移植にお
ける同種抗原を除去するために超遠心分離されうる。
併用療法
本発明は、癌を治療するのに有効な治療を提供し、ここで、該治療は、腫瘍部位におけ
る免疫細胞が腫瘍細胞の攻撃においてより有効であるように、腫瘍における免疫応答を変
化させることを含む。いくつかの場合において、有効な治療は、腫瘍部位における免疫細
胞の遊走および活性を改善することを含む。一実施形態において、樹状細胞ワクチンをＨ
ＥＲ２およびＨＥＲ３のうちの１つまたは複数の阻害剤と組み合わせて、癌を治療するた
めの治療レジメンとして使用する組成物および方法が提供される。別の実施形態において
、治療レジメンは、樹状細胞ワクチン、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のうちの１つまたは複数
の阻害剤、ならびにケモカイン調節剤の使用を含む。一実施形態において、ケモカイン調
節剤は、ケモカイン活性化剤である。ケモカイン活性化剤の一例は、ＴＬＲ８アゴニスト
である。
一実施形態において、癌を治療するための治療レジメンとして、樹状細胞ワクチンをＨ
ＥＲ−２およびＨＥＲ−３の遮断と組み合わせて使用する組成物および方法が提供される
。別の実施形態において、樹状細胞ワクチンを、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによるＨＥ
Ｒ−２およびＨＥＲ−３の遮断と組み合わせて使用する組成物および方法が提供される。
別の実施形態において、本発明は、癌を治療するための治療レジメンとして、ＴＮＦ−α
およびＩＦＮ−γを添加してＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３を両方とも遮断する組成物およ
び方法を提供する。
一実施形態において、治療レジメンは、癌を治療するために使用することができ、した
がって、あるタイプの抗癌療法と見なすことができる。別の実施形態において、治療レジ
メンは、手術、化学療法、放射線療法（例えば、Ｘ線）、遺伝子療法、免疫療法、ホルモ
ン療法、ウイルス療法、ＤＮＡ療法、ＲＮＡ療法、タンパク質療法、細胞療法およびナノ
療法を含むが、それに限定されない、別の抗癌または抗腫瘍療法との併用療法の関連にお
いて使用することができる。
一実施形態において、対象における癌の治療または予防のための別の癌医薬と組み合わ
せた治療レジメンが提供される。他の癌医薬は、本発明の治療レジメンとともに相乗的な
量でまたは多様な用量でまたは多様な時間スケジュールで投与される。本発明は、本発明
の治療レジメンのみの組み合わせまたは所望の癌医薬との組み合わせの併用に関するキッ
トおよび組成物にも関する。
一実施形態において、治療レジメンは、別の抗癌療法を受ける前に使用される。別の実
施形態において、治療レジメンは、別の抗癌療法を受けるのと同時に使用される。別の実
施形態において、治療レジメンは、別の抗癌療法を受けた後に使用される。
いくつかの実施形態において、本発明は、対象におけるＥＲ陰性の乳癌を治療する方法
を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象におけるＥＲ陰性であり、Ｈ
ＥＲ２陽性の乳癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、乳癌は、転
移性乳癌である。いくつかの実施形態において、乳癌は、ステージＩ、ステージＩＩまた
はステージＩＩＩにある。
別の実施形態において、治療レジメンは、癌を治療するために使用される現存の治療剤
と組み合わせて使用されうる。本明細書に別記された抗腫瘍性治療剤と組み合わせた本発
明の治療レジメンの潜在的治療効率を評価するために、これらの組み合わせは、本技術分
野で知られた方法に従って抗腫瘍活性について試験されうる。
一態様において、本発明は、治療レジメンが、化学療法剤、抗細胞増殖剤またはその任
意の組み合わせを含むが、それに限定されない、抗腫瘍剤などの治療剤と併用されうる。
本発明は、いかなる具体的な化学療法剤にも限定されるべきでない。むしろ、任意の化
学療法剤を本発明の治療レジメンとともに使用することができる。例えば、以下の非限定
的な代表的クラス：アルキル化剤；ニトロソウレア；代謝拮抗薬；抗腫瘍性抗生物質；植
物アルカロイド；タキサン；ホルモン剤および種々雑多な作用剤、の任意の慣用の化学療
法剤が本発明に含まれる。
アルキル化剤は、細胞中に存在する条件下で多くの電気陰性基にアルキル基をロードし
、それによってＤＮＡ複製を妨害して、癌細胞が繁殖するのを防ぐ、それらの能力のゆえ
にそのように名付けられる。ほとんどのアルキル化剤は、細胞周期に非特異的である。特
定の態様において、それらは、ＤＮＡ二重らせん鎖中のグアニン塩基を架橋することによ
って腫瘍成長を停止させる。非限定的な例としては、ブスルファン、カルボプラチン、ク
ロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、メ
クロレタミン、ヒドロクロライド、メルファラン、プロカルバジン、チオテーパおよびウ
ラシルマスタードが挙げられる。
代謝拮抗薬は、細胞周期の合成（Ｓ）期の間にＤＮＡ中への塩基の取り込みを防ぎ、正
常な発生および分裂を禁止する。代謝拮抗薬の非限定的な例としては、５−フルオロウラ
シル、６−メルカプトプリン、カペシタビン、シトシンアラビノシド、フロクスウリジン
、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサートおよびチオグアニンなどの薬物が挙げ
られる。
一般に、細胞分裂に必要な酵素を妨害することにより、または細胞を取り囲む膜を変化
させることによって細胞分裂を防ぐ、多様な抗腫瘍性抗生物質がある。このクラスに含ま
れるのは、ＤＮＡの構造を破壊し、その機能を終了させることによって細胞分裂を防ぐ、
ドキソルビシンなどのアンスラサイクリンである。これらの作用剤は、細胞周期に非特異
的である。抗腫瘍性抗生物質の非限定的な例としては、ダクチノマイシン、ダウノルビシ
ン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃおよびミトキサントロンが挙げ
られる。
植物アルカロイドは、有糸分裂を阻害もしくは停止させるか、または細胞増殖に必要な
タンパク質を細胞が作ることを防ぐ酵素を阻害する。しばしば使われる植物アルカロイド
は、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを含む。しかしな
がら、本発明は、これらの植物アルカロイドにのみ限定されると解釈されるべきでない。
タキサンは、細胞機能において重要な微小管と呼ばれる細胞構造に影響を及ぼす。正常
な細胞増殖において、細胞が分裂を開始したときに微小管が形成されるが、いったん細胞
が分裂を停止すると、微小管は解体または破壊される。タキサンは、癌細胞が微小管で詰
まり過ぎて、増殖し分裂できなくなるように、微小管が解体することを禁止する。非限定
的な代表的タキサンとしては、パクリタキセルおよびドセタキセルが挙げられる。
ホルモン剤およびホルモン様薬物は、例えば、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫を
含む、ある一定のタイプの癌のために利用される。それらはしばしば、それらの有効性を
高めるために、他のタイプの化学療法剤とともに採用される。性ホルモンは、女性または
男性ホルモンの作用または産生を変化させるために使用され、乳癌、前立腺癌および子宮
内膜癌の成長を遅くするために使用される。これらのホルモンの産生を阻害（アロマター
ゼ阻害剤）または作用を阻害（タモキシフェン）することは、しばしば治療の補助として
使用することができる。他のいくつかの腫瘍もホルモン依存性である。タモキシフェンは
、乳癌細胞の増殖を促進するエストロゲンの活性を妨害するホルモン剤の非限定例である
。
種々雑多な作用剤は、これらも本発明において有用なブレオマイシン、ヒドロキシウレ
ア、Ｌ−アスパラギナーゼおよびプロカルバジンのような化学療法剤を含む。
抗細胞増殖剤は、さらに、アポトーシス誘導剤または細胞毒性剤として定義することが
できる。アポトーシス誘導剤は、グランザイム、Ｂｃｌ−２ファミリーの一員、シトクロ
ームＣ、カスパーゼまたはそれらの組み合わせでありうる。代表的なグランザイムとして
は、グランザイムＡ，グランザイムＢ、グランザイムＣ、グランザイムＤ、グランザイム
Ｅ、グランザイムＦ、グランザイムＧ、グランザイムＨ、グランザイムＩ、グランザイム
Ｊ、グランザイムＫ、グランザイムＬ、グランザイムＭ、グランザイムＮまたはそれらの
組み合わせが挙げられる。他の特定の態様において、Ｂｃｌ−２ファミリーの一員は、例
えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、Ｂｏｋまたは
それらの組み合わせである。
さらなる態様において、カスパーゼは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、
カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ
９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カスパーゼ１
４またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、細胞毒性剤は、ＴＮＦ−α、
ゲロニン、プロジギオシン、リボソーム阻害タンパク質（ＲＩＰ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ菌体外毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ、Ｈｅｌｉｃｏｂ
ａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ＶａｃＡ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃ
ａ ＹｏｐＴ、Ｖｉｏｌａｃｅｉｎ、ジエチレントリアミン五酢酸、イロフルベン、Ｄｉ
ｐｔｈｅｒｉａ毒素、ミトギリン、リシン、ボツリヌス毒素、コレラ毒素、サポリン６ま
たはそれらの組み合わせである。
一実施形態において、治療レジメンは、抗腫瘍剤とともに使用され、ここで、抗腫瘍剤
は、抗腫瘍性アルキル化剤、抗腫瘍性代謝拮抗薬、抗腫瘍性抗生物質、植物由来抗腫瘍剤
、抗腫瘍性プラチナ錯体、抗腫瘍性カンプトテシン誘導体、抗腫瘍性チロシンキナーゼ阻
害剤、モノクローナル抗体、インターフェロン、生体応答修飾剤、ホルモン性抗腫瘍剤、
抗腫瘍性ウイルス剤、血管新生阻害剤、分化誘導薬、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ／ＡＫＴ阻害剤
、細胞周期阻害剤、アポトーシス阻害剤、ｈｓｐ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、ＤＮ
Ａ修復阻害剤、抗血管新生剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤
、タキサン、Ｈｅｒ−２を標的とする作用剤、ホルモンアンタゴニスト、成長因子受容体
を標的とする作用剤または薬学的に許容できるその塩である。いくつかの実施形態におい
て、抗腫瘍剤は、シタビン、カペシタビン、バロピシタビンまたはゲムシタビンである。
いくつかの実施形態において、抗腫瘍剤は、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｓｕｔｅｎｔ、Ｎｅｘａｖ
ａｒ、Ｒｅｃｅｎｔｉｎ、ＡＢＴ−８６９、Ａｘｉｔｉｎｉｂ、Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、
トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセル、ラパチニブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ラパチ
ニブ、タモキシフェン、ステロイド系アロマターゼ阻害剤、非ステロイド系アロマターゼ
阻害剤、Ｆｌｕｖｅｓｔｒａｎｔ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤、Ｃｅｔｕ
ｘｉｍａｂ、Ｐａｎｉｔｕｍｉｍａｂ、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）の
阻害剤、およびＣＰ−７５１８７１からなる群から選ばれる。
一実施形態において、抗腫瘍剤は、化学療法剤である。本明細書中で使用される化学療
法剤は、癌の治療において有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、チオテー
パおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ）などのアルキル化剤；ブスルファン、イ
ンプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（ｂ
ｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパなどのアジリジン；ア
ルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホ
スホラミドおよびトリメチルロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ
）を含むエチレンイミンおよびメチラミラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；ア
セトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナ
ビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ）；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒ
チン；ベツリン酸；（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ）、ＣＰＴ−１１（イ
リノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチンおよび９
−アミノカンプトテシンを含む）カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；（そ
のアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）ＣＣ−１０６５；
ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプト
フィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；（合成アナログ、ＫＷ−２１８
９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）デュオカルミシン；エリュテロビン；パンクラチスタチ
ン；サルコジクチン；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロラムブシル
、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロ
レタミン、メクロレタミンオキシドハイドロクロライド、メルファラン、ノベムビシン（
ｎｏｖｅｍｂｉｃｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラ
シルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォ
テムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジ
イン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特に、カリケアミシンγＩＩおよびカリケアミ
シンオメガＩＩ（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ、３３
：１８３〜１８６頁（１９９４年）を参照されたい）；ダイネミシンＡを含むダイネミシ
ン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン（クロモフォアおよび関連色素タン
パク質エンジイン抗生物質クロモフォア）などの抗生物質、アクラシノマイシン、アクチ
ノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシ
ン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイ
シン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ
−ノルロイシン、（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホ
リノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソー
ム注射剤（ＤＯＸＩＬ）、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ）
、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ）およびデオキシドキソルビシンを含
む）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、
マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマ
イシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロド
ルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノ
スタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ）、テガフール
（ＵＦＴＯＲＡＬ）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）、エポチロンおよび５−フルオロウ
ラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリ
ン、トリメトトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、
チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アムシタビン、アザシチジン、６−
アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エ
ノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；アミノグルテチミド、ミトタ
ン、トリロスタンなどの抗アドレナール；フォリン酸などの葉酸補充因子（ｆｏｌｉｃ
ａｃｉｄ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；
アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン、エ
ダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン
；エルフォルニチン；エリプチニウムアセテート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロ
キシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシン（ａｎｓａ
ｍｉｔｏｃｉｎｓ）などのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダ
モール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロ
ン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン、ＰＳＫポリサッカライド複合体（ＪＨＳ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾ
キシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸、トリアジコン；２，２’，
２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ
、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブ
ロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；ア
ラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテーパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（Ｔ
ＡＸＯＬ）、パクリタキセルのアルブミン改変された（ａｌｂｕｍｉｎ−ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｅｄ）ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）；
クロラムブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチ
ン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなどのプラチナ剤；チューブリンの重合化が
微小管を形成することを防ぐ、ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ）、ビンクリスチン（ＯＮ
ＣＯＶＩＮ）、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ、ＦＩＬＤＥＳＩＮ）およびビノレルビン
（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）を含むビンカス（ｖｉｎｃａｓ）；エトポシド（ＶＰ−１６）；
イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボビン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ノバント
ロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイ
ソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロ
テン（ＴＡＲＧＲＥＴＧＩＮ）を含むレチノイン酸などのレチノイド；クロドロネート（
例えば、ＢＯＮＥＦＯＳＯまたはＯＳＴＡＣ）、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ）、
ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ）、アレンドロネート
（ＦＯＳＡＭＡＸ）、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ）、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ
）またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ）などのビスホスホネート；トロキサシタビン
（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオ
チド、特に、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓおよび上皮成長因子受容体（ＥＧ
Ｆ−Ｒ）などの、異常な細胞増殖に関与するシグナリング経路における遺伝子の発現を阻
害するもの；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ．ＲＴＭ．ワクチンなどのワクチンおよび遺伝子療法ワ
クチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮワクチンおよびＶ
ＡＸＩＤワクチン；トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ）；ｒｍ
ＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ）；ＢＡＹ−４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ
）；ＳＵ−１１２４８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン；ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セ
レコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボ
ルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ）；ＣＣＬ−７７９；ティピファニブ（Ｒ１１５７７）；オ
ラフェニブ、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ）のような
Ｂｃｌ−２阻害剤；ピキサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；ならび
に上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸または誘導体；ならびにシクロホスファミ
ド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨ
ＯＰ、および５−ＦＵおよびロイコボビンと併用したオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩ
Ｎ）による治療レジメンの略語であるＦＯＬＦＯＸのような、上記のうちの２つ以上の併
用療法が挙げられる。
別の実施形態において、免疫療法の組み合わせを使用して、エストロゲン受容体陽性／
ＨＥＲ２陽性（ＥＲ陽性／ＨＥＲ陽性）ＤＣＩＳ乳癌患者を治療する。例えば、タモキシ
フェンなどの抗エストロゲン療法は、病理学的完全奏功を改善するためにａｍｔｉ−ＨＥ
Ｒ２樹状細胞ワクチンと組み合わせる。
本明細書に記載のこれらの方法は、決して包括的なものではなく、特定の適用に合う方
法は当業者に明らかである。さらに、組成物の有効量は、所望の効果を及ぼすことが知ら
れている化合物との類似によりさらに概算することができる。
実験例
本発明は、以下の実験例に関連してさらに詳細に説明される。これらの例は、例示の目
的のためにのみ提供され、別段の定めのない限り、制限的であることを企図されない。し
たがって、本発明は、以下の例に制限されると解釈されるべきでなく、本明細書に提供さ
れる教示の結果として明らかになる任意のおよびすべての変形を包含すると解釈されるべ
きである。
さらなる説明をせずとも、当業者は、先の記載および以下の実例を用いて、本発明を成
し、利用し、請求項に記載の方法を実践することができる。したがって、以下の実施例は
、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘し、決して本開示の残りの部分を制限すると
解釈されるべきでない。
（実施例１）
凍結保存した予備活性化複数用量樹状細胞ワクチン
これらの大規模なワクチンを生産できるように、腫瘍抗原でパルスした完全に活性化し
たＤＣ１ワクチンを生産し、それにより完全に活性化したＤＣ１ワクチンを複数用量シリ
ンジレディ６パックＤＣ１ワクチンとして凍結保存するプロセスを開発した。ＤＣ１は、
本明細書中に別記したように、ＤＣ１として凍結保存され、活性化される。例えば、それ
らを４０％のヒト血清アルブミンおよび５％のＤＭＳＯを含む５５％のプラズマライト培
地中で凍結保存する。これらのワクチンは、実験室で生成され、広範に試験され、患者へ
の投与のためにＦＤＡにより設定された品質基準を一貫して満たす。
本明細書に開示される実験および例において採用される材料および方法をここに記載す
る。
凍結保存のための完全に活性化されたＤＣの調製
新たにエルトリエーションした骨髄単球を、６ウエルマイクロプレート中で培養した（
１２×１０６細胞／ウエル）。培地は、Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）からなるものであった。添加したＧＭ
ＣＳＦの最終濃度は、５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ４は、１０００Ｕ／ｍｌであった。３７℃で
５％ＣＯ２中、細胞を一夜培養した。いくつかのバッチにおいて、１６〜２０時間後、細
胞を適切なペプチドでパルスし、さらに６〜８時間培養し、その後、１０００Ｕ／ｍｌの
ＩＦＮ−γを添加した。ＴＬＲアゴニスト、ＬＰＳ（ＴＬＲ４、１０ｎｇ／ｍｌ）または
Ｒ８４８（ＴＬＲ８、１μｇ／ｍｌ）で樹状細胞を成熟させた。成熟時間は、少なくとも
約６時間であった。その後、ＴＬＲアゴニストで活性化したＤＣは、凍結保存または直ち
に使用する準備ができていた。
Ｔｈ１極性化サイトカインＩＬ−１２の産生を誘導するために、サイトカインＩＦＮ−
γ、またはＴＬＲアゴニスト細菌性ＬＰＳおよび／またはＲ８４８の組み合わせでＤＣを
活性化する。これは、ＩＦＮ−γを産生するＴ細胞を誘導するはずである。あるいは、Ｄ
Ｃは、ＡＴＰ、細菌性ＬＴＡ，ＬＰＳおよびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の組み
合わせで活性化することができる。これは、ＩＬ−２３、ＩＬ−６およびＩＬ−１βの増
幅を引き起こし、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２分泌性Ｔｈ１７細胞により支配される免疫
応答をもたらすことができる。
ＤＣの凍結保存
優しくこすってＤＣを採取した。すべての培地および細胞を毎回、湿った氷に保持した
。約８００ＲＰＭで１０分間遠心分離することによって細胞を優しく洗浄した。細胞（例
えば、１０×１０６細胞）を、５％のＤＭＳＯを含む５５％のプラズマライト、４０％の
ヒト血清アルブミンの凍結用培地中で凍結保存し、液体窒素中に貯蔵した。
本明細書に表す実験の結果をここに記載する。
複数用量ＤＣ１ワクチン
細胞の回復率、生存率および無菌を評価するために、実験を行った。手短に言えば、白
血球除去と向流エルトリエーション法（ｃｏｕｎｔｅｒ ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｌｕｔｒｉ
ａｔｉｏｎ）の組み合わせによって末梢血単球を得て、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含
む血清フリー培地中で一夜培養した。翌日、それらをＨＥＲ−２ペプチド、次いで、ＩＦ
Ｎ−γ、続いてＬＰＳでパルスした。４０時間でＤＣ１を採取し、５％のＤＭＳＯを含む
５５％のプラズマライト、４０％のヒト血清アルブミンの凍結用培地中で凍結保存し、液
体窒素中に貯蔵した。１週間後、それらを融解し、生存率、収率、エンドトキシン検査お
よび無菌性培養を含む出荷基準を得た。１２個の培養はすべて、細菌の増殖がなく、エン
ドトキシン０．１ＥＵ未満であった。図１は、凍結保存したＤＣ１の生存率を示す。図１
に見られるように、細胞を直接融解し、計数した場合の細胞の回復率は、平均８９％であ
り、生存率は９５％であった。これらのデータは、ＤＣ１ワクチンの凍結保存および生存
率が、ＦＤＡが許容可能な７．５％未満のＤＭＳＯを含有する培地中で維持されることを
実証する。
凍結保存後に細胞機能が維持されることを観察した。複数用量ＤＣ１ワクチンの融解後
３６時間、ＩＬ−１２およびＴｈ１ケモカインが産生された。融解した細胞は、融解の６
時間後から３６時間後まで、高レベルのＩＬ−１２を産生した。ＩＬ−１２のこれらのレ
ベルは、凍結保存した単球から作った調製ＤＣ１ワクチンに匹敵する。
本明細書に表す結果は、乳癌のＨＥＲ−２腫瘍標的抗原に対して増感された、凍結保存
し、予備活性化した複数用量樹状細胞ワクチンが、治療上有効であることを実証する。し
かしながら、本発明は、さらに様々な病態生理学的状態に適用可能である。
複数用量シリンジレディパックＤＣ１ワクチンは、ＨＥＲ−２非発現性乳癌において使
用可能である。ＨＥＲ−２は、すべての乳癌の約２５％において発現される。検出可能な
レベルのＨＥＲ−２を産生しない乳癌は、ワクチン接種の影響を受けにくい可能性がある
。この制約に取り組むために、追加の標的タンパク質がワクチンに添加されうる。例えば
、高レベルのＨＥＲ−２を産生しない多くの乳癌は、代わりに、ＨＥＲ−１およびＨＥＲ
−３を含む他の関連タンパク質を産生する。いかなる特別な理論に束縛されることを望む
ものではないが、これらの他のタンパク質をワクチンに添加することは、これら他の乳癌
表現型の標的化を可能とすると考えられる。
複数用量シリンジレディパックＤＣ１ワクチンは、乳癌以外の他の癌タイプに使用可能
である。ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３などの予想される標的タンパク質は、
卵巣、前立腺、膵臓、結腸直腸、胃、頭部および頸部、および非小細胞肺癌、ならびに他
の一般的な癌を含む、他のタイプの癌にも存在しうる。
複数用量シリンジレディパックＤＣ１ワクチンは、ＨＩＶまたはＣ型肝炎ウイルスのよ
うな慢性の感染症を含むが、それに限定されない慢性の感染性疾患を治療するために使用
可能である。ここで、これらのウイルスに特異的なタンパク質は、ＨＥＲ−２または他の
癌タンパク質に取って代わり、これらの持続性感染に対する患者の免疫応答を動員するだ
ろう。亢進された免疫がウイルス負荷ならびに付随する疾患の症状および進行を大きく低
減するか、または感染を完全に解消することを助けることが可能である。
複数用量シリンジレディパックＤＣ１ワクチンは、自己免疫疾患を治療するために使用
可能である。リウマチ関節炎およびループスのような疾患は、免疫系が誤って体の正常組
織を攻撃するときに発症する。現行のワクチン／免疫療法製剤が、免疫応答を開始し、増
強するようにデザインされているにもかかわらず、いかなる特別な理論に束縛されること
を望むものではないが、病的な免疫応答のスイッチを切るようにＤＣを誘導するワクチン
の生産中に、インビトロのシグナルがＤＣに提供されうると考えられる。
（実施例２）
活性化ＤＣ１の凍結保存が、癌治療に適した大規模な樹状細胞ワクチンを作成する
樹状細胞に基づくワクチン療法は、様々な癌に対する将来有望な指向型療法である。Ｄ
ＣをＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増感を最適化して腫瘍エピトープを認識し、抗腫瘍
免疫を誘発する表現型にＤＣを成熟させるために、様々な戦略が採用されてきたが、イン
ターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）、Ｔｏｌｌ様
受容体（ＴＬＲ）４アゴニストを用いる血清フリー培地（ＳＦＭ）中の単球の迅速な成熟
を採用する方法を利用するように実験をデザインし、結果として、免疫応答をＴｈ１型応
答に極性化させ、ＩＬ−１２依存性メカニズムによって増感を誘発することのできる成熟
ＤＣを生じた。結果は、早期乳癌における補助療法として使用されるこのワクチン戦略の
能力を実証する。成熟した状態での樹状細胞（ＤＣ）の凍結乾燥は、個別化された治療の
より容易な作成および到達性を許容する。
樹状細胞の迅速な成熟
新たに成熟させたＤＣ（ＤＣ１）および成熟した状態で凍結乾燥し（ｃｒｙｏＤＣ）、
その後融解したＤＣを、生存率および回復率に関して、ならびにフローサイトメトリーに
よる細胞表面マーカーの発現によって決定した表現型の成熟度に関して比較した。樹状細
胞の機能を、多様なサイトカイン、特にインターロイキン１２ｐ７０（ＩＬ−１２ｐ７０
）の産生を測定することによって決定した。これらの細胞のナイーブＣＤ４＋およびＣＤ
８＋細胞を刺激する能力も評価した。
生存率（ｐ＝．４８０７）および回復率（ｐ＝．１２２０）において有意差はなかった
（図２）。
両集団は、同様の初期（ＬＰＳ添加後７時間）ＩＬ−１２ｐ７０分泌（ｐ＝．０７６８
）を有した。該集団は、３０時間の観察期間にわたって同等のＩＬ−１２ｐ７０分泌レベ
ルを示し、集団間で有意差はなかった（図３）。
集団およびＩＬ−１β（ｐ＝０．７６９０）、ＩＬ−１α（ｐ＝０．０８４１）、Ｒａ
ｎｔｅｓ（ｐ＝０．９０２）、ＭＤＣ（ｐ＝０．１５１４）、ＩＬ−１０（ｐ＝．１９３
７）、ＭｌＰ−１α（ｐ＝．２６７３）、ＩＰ−１０（ｐ＝０，７３６６）、ＩＬ−６（
ｐ＝０．２４）、ＩＬ−５（ｐ＝０．０７３５）、ＴＮＦ−β（ｐ＝０．９４２２）、Ｉ
Ｌ−１５（ｐ＝０．８８７８）、ＭＩＰ−１β（ｐ＝０．９２１７）、ＴＮＦ−α（ｐ＝
０．８９７２）、ＩＬ−８（ｐ＝０．７８４４）産生の間に有意差はなかった。（図４）
。
ＤＣ成熟度を意味する細胞表面マーカーは、ＤＣ１とｃｒｙｏＤＣ間で発現に有意差を
示さない。両集団は、非特異的なアロ抗原ＣＤ４＋Ｔ細胞応答ならびに抗原特異的なＣＤ
８＋Ｔ細胞認識とＴｈ１極性化応答を誘発した。ＣＤ８０、８３および８６は、ＤＣの成
熟を示し、発現には有意差がなかった。各集団と共培養した異なるドナー由来のＣＤ４＋
Ｔ細胞により機能的能力が誘導され、非特異的なアロ抗原応答およびＩＮＦ−γを分泌す
るＣＤ４＋Ｔ細胞を結果として生じた（ＤＣ１ １０７．４０ｎｇ／ｍＬおよびｃｒｙｏ
ＤＣ１ １２９．２３ｎｇ／ｍＬ）。２つの集団を腫瘍抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞と共
培養することによって惹起した抗原特異的な増感は、両群について同等のＩＦＮ−γ分泌
を誘発し、ＴＨ１極性化応答をもたらす（図５）。
本明細書に表される結果は、ＤＣ１の迅速な成熟方法が、機能的に成熟した状態で凍結
保存可能であり、表現型および機能を維持し、したがって、癌治療における世界的使用の
ためのシリンジレディＤＣ１を製造するために使用可能であることを実証する。
Ｔｈ１極性化免疫反応を推進するためにＤＣ１表現型を維持するとともに、本明細書に
表される結果は、ｃｒｙｏＤＣが主としてＴ細胞を増感する能力を維持したことを実証す
る。ＩＦＮ−γおよびＬＰＳによって成熟したＤＣ１が、サイトカインにより成熟したＤ
Ｃに比べて、主としてＣＤ４＋Ｔ細胞を増感する能力の亢進を示すため、これは、成熟戦
略にも関連している可能性がある。
凍結保存した成熟ＤＣの調製のための本プロトコールは、現行の適正製造規範ガイドラ
インに容易に適合することができ、それによって新たな治療の利用可能性を増大させる。
（実施例３）
ＣＤ４Ｔ細胞由来のサイトカインおよびＨｅｒｃｅｐｔｉｎが、ＨＥＲ−２高発現性乳癌
細胞をＣＤ８Ｔ細胞による殺滅に対して感受性とする
ＨＥＲ−２高発現性乳癌細胞が、これら癌細胞をＣＤ８Ｔ細胞に対して可視的とし、こ
れらの免疫細胞により殺滅可能とする細胞表面上の分子を下方制御することが実証されて
いる。ＣＤ４細胞により産生されるサイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ
−γ）および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）を、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎと併用した
場合、ＨＥＲ−２を中程度および高度に発現する乳癌細胞において、それらのクラスＩ分
子発現の増大を引き起こすことが示されている。この結果として、ＣＤ８Ｔ細胞は、乳癌
細胞をさらによく見ることができ、それらを殺滅しまたはサイトカインを産生してそれら
を殺滅することができる。
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎを樹状細胞ワクチン（例えば、ＤＣ１ワクチン）と組み合わせて使
用することの治療効果を評価するために治験をデザインした。
ＨｅｒｃｅｐｔｉｎをＤＣ１ワクチンと併用する第Ｉ相ＤＣ１Ｓワクチン試験をデザイ
ンした。例えば、ＨＥＲ−２高発現性ＤＣ１Ｓを有する患者のために、２つの用量のＨｅ
ｒｃｅｐｔｉｎと併用したＤＣ１ワクチンを第１週および第４週に受容するように、第Ｉ
相試験をデザインした。いかなる特別な理論に束縛されることを望むものではないが、Ｈ
ＥＲ−２発現性ＤＣ１Ｓを有する患者において、この組み合わせが完全奏効率を３０％か
ら５０％超まで増大させると考えられる。
さらに、第ＩＩＩ相ＤＣ１Ｓワクチン試験をデザインした。例えば、エストロゲン非依
存性（ＥＲ陰性）、ＨＥＲ−２陽性ＤＣ１Ｓを有する患者における乳癌の再発を予防する
ために、ワクチン試験を開発した。試験には３つの治療群：１）標準治療（手術および放
射線）、２）手術前にＤＣ１ワクチンを受容する、および３）手術前にＤＣ１ワクチン＋
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎを受容する、がある。いかなる特別な理論に束縛されることを望むも
のではないが、治療に対して完全に応答する患者は、手術後に放射線を回避することがで
きる。この試験が、ＤＣ１Ｓを有する患者におけるワクチンを用いた再発の予防を実証す
る役目を果たすとも考えられる。
さらに、早期の侵襲性ＨＥＲ−２陽性乳癌を有する患者における、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ
と併用する第Ｉ相ネオアジュバントＤＣ１ワクチンをデザインした。例えば、Ｈｅｒｃｅ
ｐｔｉｏｎとケモカイン調節剤（例えば、ケモカイン活性化剤）を伴うワクチンの組み合
わせが、ＨＥＲ−２発現性の小さな侵襲性乳癌を手術前に除去し、化学療法の必要性を回
避するか否かを試験するために、第Ｉ相試験をデザインした。いかなる特別な理論に束縛
されることを望むものではないが、免疫応答からブレーキを外す免疫抗体を添加する可能
性のある（手術前の）このネオアジュバント戦略が、乳癌の治療のための毒性のある化学
療法の必要性を排除し、したがって、免疫療法をこの疾患のためのケアの標準としうると
考えられる。すなわち、本明細書に開示される治療レジメンは、本発明のワクチンレジメ
ンによって修復可能な自然の免疫応答を用いて乳癌を根絶させるための探求を一歩前進さ
せる。本明細書中で議論するレジメンは、腫瘍内の免疫応答を変化させることによって免
疫細胞を腫瘍中へ推進し、免疫細胞のブレーキを外すことによって免疫細胞がより長く働
けるようにできる。ＤＣ１ワクチンをＨｅｒｃｅｐｔｉｎと組み合わせ、ケモカイン調節
剤も添加することは、乳房中の腫瘍内の免疫細胞の遊走および活性を改善すると考えられ
る。
いかなる特別な理論に束縛されることを望むものではないが、多くの癌において、多数
の優れた免疫戦闘細胞（ｉｍｍｕｎｅ−ｆｉｇｈｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）が存在すれば、患
者は任意のタイプの治療において成績向上すると考えられる。これは、腫瘍が除去される
前に、腫瘍と戦うために免疫細胞が腫瘍中に入れば、患者は、手術、化学療法および放射
線を含む他の治療において成績向上し、より良く反応する可能性があることを意味する。
いかなる特別な理論に束縛されることを望むものではないが、癌を治療するのに有効な
治療は、手術の前に腫瘍内の免疫応答を迅速に変化させて、乳癌および他のタイプの癌を
有する患者のアウトカムを改善する作用剤を含む。この戦略は、結腸癌、黒色腫、肺、脳
、膵臓、前立腺、食道などを含むが、それに限定されない多様な癌に適用可能である。
ワクチン接種後に乳房中へ遊走するタイプの免疫細胞、細胞を引き入れるタイプのケモ
カインおよび癌細胞の除去を助けるためにそれらが発現する分子を測定し、定量するため
の免疫蛍光アッセイを開発するために実験をデザインした。これらのアッセイは、複数の
細胞タイプが同時に可視化されることを可能とし、腫瘍の微小管胸内でそれらがどこに位
置するかを示す。ワクチン接種した患者のうちの少なくとも何人かにおいて、その腫瘍が
ケモカインを産生して、環境中へ細胞を動員して腫瘍細胞を殺滅することが観察されてい
る。
（実施例４）
ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３遮断の組み合わせ
本明細書中に表される結果は、ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３の遮断と効果的な抗ＨＥＲ
−２ＣＤ４＋ Ｔｈ１応答との組み合わせが、ＨＥＲ−２発現性乳癌の腫瘍老化およびア
ポトーシスを引き起こすのに非常に効果的であることを実証する。
ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３を一緒に遮断し、かつＣＤ４Ｔｈ１細胞由来のＴｈ１サイ
トカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの組み合わせを添加すると、ＨＥＲ−２発現
性乳癌の有意な老化およびアポトーシスを引き起こすことが観察された。これは、高度お
よび中程度にＨＥＲ−２を発現する乳癌細胞両方の様々な細胞株において確かめられた。
この結果は、この組み合わせが、予防および再発予防にとって有力なものでありうること
を実証する。
方法
細胞培養および処理
ヒト乳癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７Ｄ、ＨＣ
Ｃ−１４１９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、１０％ＦＢＳ（Ｃ
ｅｌｌｇｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）を追加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で増殖させた。ＪＩＭＴ−
１細胞はＯｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）のＤ
ｒ．Ｐｒａｖｉｎ Ｋａｕｍａｙａから贈呈されたものであり、１０％ＦＢＳを追加した
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｗａｌｈａｍ，
ＭＡ）中で増殖させた。正常な不死化ＭＣＦ−１０細胞をＫａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）から入手し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ
、１０μｇ／ｍｌのインスリン、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌのコレラ毒
素、３０ｍＭの重炭酸ナトリウム、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンおよび５％のウ
マ胎仔血清を追加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。すべ
ての細胞を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で増殖させた。
３００，０００個の乳癌細胞を、指示した濃度のヒト組換えＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびヒト組換えＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ）で５日間処理し、次いで、サイトカイン不存在下でさらに２回継代培養し
た。細胞を老化関連β−ガラクトシダーゼ酵素（ＳＡ−β−ｇａｌ）検出に供するか、ま
たは溶解し、ｐ１５ＩＮＫ４ｂ、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよび切断カスパーゼ−３についての
ウエスタンブロット分析に供した。
いくつかの場合において、細胞を１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩ
Ｎ（商標））およびペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（商標））（両方、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ
、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）で、指示した回数、処理した。この処理を、サイ
トカインまたはヒト組換えへレグリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と組み合わせた。
また、５００００個の癌細胞を、トランスウエルシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）の下のチャンバー中で、１０×１０５個のヒトＣＤ４＋
Ｔ細胞と共培養し、また、上のチャンバー中で、１０５個の成熟（すなわち、Ｉ型極性化
）または未成熟ヒトＤＣと共培養した。ＤＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞は、選抜した試験対象
（Ｓｈａｒｍａら、２０１２年、Ｃａｎｃｅｒ １１８：４３５４〜４３６２頁）から入
手した。成熟および未成熟ＤＣをクラスＩＩ由来ＨＥＲ２または対照の無関係（ＢＲＡＦ
およびサバイビン）ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）で５日間、３７℃でパルスした。対照ウ
エルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のみを含有した。さらに、ＤＣ／ＣＤ４＋Ｔ細胞共培養上清の存
在下で０．５×１０５個の細胞を５日間、３７℃でインキュベートした。両アプローチに
おいて、次いで、サイトカイン不存在下で細胞をさらに２回継代培養し、老化試験（ｐＨ
６におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性ならびにｐ１５ＩＮＫ４ｂおよびｐ１６ＩＮＫ４ａのウ
エスタンブロット）またはアポトーシス試験（切断されたカスパーゼ３のウエスタンブロ
ット）に供した。ＤＣおよびＤＣ４＋Ｔ細胞の共培養物とのインキュベーションの６０分
前に以下の抗体を添加してＴｈ１産生サイトカインを中和した：ポリクローナルヤギＩｇ
Ｇ抗ヒトＴＮＦ−α（０．７５ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−αあたり０．０６μｇ／ｍｌ）およ
びＩＦＮ−γ（５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γあたり０．３μｇ／ｍｌ）ならびに対応する陰
性対照としてのヤギＩｇＧアイソタイプ（すべてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから）。
プラスミドのトランスフェクション
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、２μｇのｗｔＨＥＲ２発現ベクター（ｐｃＤＮＡＨＥＲ
２）で４８時間、一過性にトランスフェクトした。対照として、２μｇの空のベクター（
ｐｃＤＮＡ３）で細胞をトランスフェクトした。両ベクターは、Ｄｒ．Ｍａｒｋ Ｇｒｅ
ｅｎｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐ
ｈｉａ、ＰＡ）の厚意により提供された。抗体を含まない完全培地中で、細胞をＴｕｒｂ
ｏｆｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）でトランス
フェクトした。導入効率を、トランスフェクションの４８時間後にウエスタンブロットに
より評価した。４８時間後、トランスフェクションした細胞を、０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４
１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む完全培地に移した。培養の１５日後
、限界希釈によってＧ４１８に耐性のコロニーを選択した。トランスフェクション効率は
ウェスタンブロットにより評価した。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トランスフェクション
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ＳＭＡＲＴ Ｐｏｏｌ：ＯＮ ＴＡＲＧＥＴ Ｐｌｕ
ｓ ＨＥＲ２ ｓｉＲＮＡ、ＨＥＲ３ ｓｉＲＮＡおよびＳＭＡＲＴ Ｐｏｏｌ：ＯＮ−
ＴＡＲＲＧＥＴｐｌｕｓ Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｏｏｌを、ＧＥ Ｄｈａｒｍ
ａｃｏｎ−（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ， ＣＯ）から購入した。以下の標的配列を使用した：
ＨＥＲ２：ＵＧＧＡＡＧＡＧＡＵＣＡＣＡＧＧＵＵＡ（配列番号：９）、ＧＡＧＡＣＣＣ
ＧＣＵＧＡＡＣＡＡＵＡＣ（配列番号：１０）、ＧＧＡＧＧＡＡＵＧＣＣＧＡＧＵＡＣＵ
Ｇ（配列番号：１１）、ＧＣＵＣＡＵＣＧＣＵＣＡＣＡＡＣＣＡＡ（配列番号：１２）；
ＨＥＲ３：ＧＣＧＡＵＧＣＵＧＡＧＡＡＣＣＡＡＵＡ（配列番号：１３）、ＡＧＡＵＵＧ
ＵＧＣＵＣＡＣＧＧＧＡＣＡ（配列番号：１４）、ＧＣＡＧＵＧＧＡＵＵＣＧＡＧＡＡＧ
ＵＧ（配列番号：１５）、ＵＣＧＵＣＡＵＧＵＵＧＡＡＣＵＡＵＡ（配列番号：１６）；
非標的化：ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＡＡ（配列番号：１７）、ＵＧＧＵＵＵ
ＡＣＡＵＧＵＵＧＵＧＵＧＡ（配列番号：１８）、ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＵ
ＧＡ（配列番号：１９）、ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＣＵＡ（配列番号：２０）
。３００，０００個の細胞を、血清フリー培地中、ＲＮＡｉ Ｍａｘ Ｌｉｐｏｆｅｃｔ
ａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈａｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｓｉＲＮＡ配列（２５ｎ
Ｍ）でトランスフェクトし、１時間後、培地に１０％のＦＢＳを追加した。１６時間後、
細胞を、４８時間の血清飢餓、続いて、様々な指定された処理、および発現レベルをチェ
ックするためのウエスタンブロットに供した。
ｐＨ６におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３％のホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで再度洗浄した
。新たに調製した、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）からの老化関連酸性
βガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）染色液とともに（ＣＯ２を含まずに）３７℃で
一夜、製造者の指示のとおりにインキュベートした。明視野顕微鏡（Ｅｖｏｓ Ｃｏｒｅ
ＸＬ、Ｂｏｔｈｅｌ、ＷＡ／４０Ｘ／２０４８×１５３６，３．２μｍ／ピクセル；３．
１Ｍｐ カラー／キャプチャ画像：カラーＴＩＦＦ、ＰＮＧ、ＪＰＧまたはＢＭＰ−２０
４８ｘ１５３６ピクセル）を用いて３００個の細胞をスコアリングした後、各サンプル中
のＳＡ−ｂ−ｇａｌ陽性（青色）細胞の割合（％）を測定した。
ウエスタンブロット分析
ＭＣＦ−１０Ａ、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＭＣＦ−７、Ｔ−４７ ＤまたはＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−２３１細胞からライセートを調製した。５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０
ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０％のグリセロール、７０％
のＴｅｒｇｉｔｏｌ、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＭｇ２Ｃｌおよびプロテアーゼ阻害剤
カクテルＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するバッファ
ー中で細胞を溶解した。ライセートを、４℃で１５分間、１２，０００×ｇで遠心分離し
た。タンパク質をサンプルバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈａｎｏｌｏｇｉｅｓ）に可溶
化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質をＰＶＤＦへエレクトロブロットした。以
下の抗体：すべて、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ、ＣＡ）からのｐ１５ＩＮＫ４ｂ（Ｋ−１８）、ｐ１６ＩＮＫ４ａ（５０．１）
、ＩＦＮ−γＲα（Ｃ−２０）、ＨＥＲ３（Ｃ−１７）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈか
らのビンキュリン（Ｖ９１３１）；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）からのＨＥＲ２（２９Ｄ８）、切断されたカスパーゼ３
（８Ｇ１０）およびＴＮＦ−Ｒ１（Ｃ２５Ｃ１）でメンブレンをイムノブロットした。洗
浄後、メンブレンをＨＲＰにコンジュゲートした二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕ
ｌｅｓ、ＣＡ）とともにインキュベートした。エンハンストケミルミネッセンス（ＥＣＬ
）ウエスタンブロッティング検出システムおよびＩｍａｇｅ Ｒｅａｄｅｒ ＬＡＳ−１
０００ Ｌｉｔｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｆｕｊｉ)を使用し
て、バンドを可視化・定量した。ウエスタンブロットの定量はＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗ
ａｒｅを使用して行った。
フローサイトメトリーによる細胞死の解析
ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、未処理とし、ＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α
（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、トラスツズマブ（１０μｇ／ｍｌ）およびペルツズマブ（
１０μｇ／ｍｌ）で処理し、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、トラスツズマブおよびペル
ツズマブの組み合わせで２４時間処理した。インキュベーション後、製造者の指示に従っ
てＦＩＴＣ−アネキシン Ｖ アポトーシス検出キット（ＢＤバイオサイエンシズ）を用
いて、アポトーシス誘導を検出した。手短に言えば、未処理のおよび処理したＳＫＢＲ−
３細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌの濃度でアネキシン Ｖ結合バ
ッファーに再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を５μｌのＰＩおよび５μｌのＦＩＴＣ
−アネキシン Ｖとともに、室温で１５分間、暗所でインキュベートした。インキュベー
ション後、１５０μｌのアネキシン Ｖ結合バッファーを添加し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ
Ｃ６フローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてアポトーシス誘導
を解析し、ＣＦｌｏｗ Ｐｌｕｓソフトウエアによりデータ解析した。ＵＶ照射した細胞
を陽性対照として使用した。
腫瘍発生試験
異種移植実験のために、ＳＫ−ＢＲ−３細胞（２００μｌのＰＢＳ中、２×１０６細胞
）を６週齢の雌性無胸腺（ヌード）マウス（Ｆｏｘｎｎｕ、Ｈａｒｌａｍ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、５頭のマウス／群）の側腹部に注射した。腫瘍が蝕知可能な場合、動物を
トラスツズマブおよびペルツズマブ（３０μｇ／ｋｇ）でｓ．ｃ．処置し、次いで、ｈｒ
ＴＮＦ−αおよびｈｒＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｋｇ）を週２回ｓ．ｃ．注射した。腫瘍形
成を蝕知によりモニターし、ｍｍ３で表した腫瘍体積をキャリパーで週２回測定した：幅
２×長さ／２。すべての動物実験を、施設のガイドラインを遵守して実行した。
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、独立スチューデントｔ検定（両側）を行った。０．０５
以下のＰ値が有意であると考えられた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜
０．００１。
結果
サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γが、相乗して乳癌細胞における老化を誘
導する
免疫系細胞が産生したサイトカインが、腫瘍細胞において特異的な老化応答を誘導する
ことができた場合には、ＳＫ−ＢＲ−３細胞をヒト組換え腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ
−α）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）単独またはその組み合わせとともに
３７℃において５日間インキュベートした。次いで、細胞をさらに２回継代培養し、老化
試験に供した。両サイトカインの組み合わせは、ウエスタンブロットにより検出した対照
未処理細胞または各サイトカイン単独に比べて増加した老化関連酸性βガラクトシダーゼ
（ＳＡ−β−ｇａｌ）染色（図６Ａ）ならびに老化関連マーカーｐ１５ＩＮＫ４ｂおよび
ｐ１６ＩＮＫ４ａの高発現（図６Ｂ）により認められる、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の老化誘導
をもたらした。同様の結果が、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７およびＴ−４７Ｄ乳癌細胞株（
データは示さない）において得られた。したがって、Ｔ−４７Ｄ細胞を、１０〜１００ｎ
ｇ／ｍｌの数種の濃度のＴＮＦ−α、および１００〜１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ、ま
たはその組み合わせで処理した。老化表現型の誘導は用量依存性であったことを観察した
（図６Ｃ）。同様の結果を、ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４およびＭＣＦ−７細胞におい
て認めた。
乳癌細胞中のＨＥＲ２発現レベルと老化を誘導するために必要なＴｈ１サイトカインであ
るＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの用量との間の逆相関
ＨＥＲ２発現レベルが、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによる５日間、３７℃における処
理、続いてサイトカインを含まずにさらに２回継代培養したことにより、ＳＫ−ＢＲ−３
、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞において
誘導された老化に役割を演じるか否かを決定するために実験をデザインした。実際に、高
いサイトカイン濃度を伴う中程度のＨＥＲ２発現細胞株（Ｔ−４７Ｄ、図６ＤおよびＭＣ
Ｆ−７、データは示さない）と比較して、低用量のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによって
、ＨＥＲ２高発現細胞株（ＳＫ−ＢＲ−３、図６ＤおよびＢＴ−４７４、データは示さな
い）においてＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の量が増大した。しかしながら、最高濃度のＴＮ
Ｆ−αおよびＩＦＮ−γでさえ、ＨＥＲ２低発現性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において
は老化を誘導することができなかった（図６Ｄ）。これらの結果は、老化を誘導するＴＮ
Ｆ−αおよびＩＦＮ−γとＨＥＲ２発現レベルの間の相関を明白に証明する。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞における、Ｔｈ１サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩ
ＦＮ−γ介在性の老化およびアポトーシスのためにＨＥＲ２が必要である
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、野生型ＨＥＲ２プラスミド（ｐｃＤＮＡＨＥＲ２）で安
定にトランスフェクトし、高濃度のＴＮＦ−α（２００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（
２０００Ｕ／ｍｌ）で５日間、３７℃で処理し、続いてサイトカイン非存在下でさらに２
回継代培養した場合にのみ、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞（図７Ａ）およびｐ１５ＩＮＫ４
ｂ発現（図７Ｂ）が強力に増加した。とりわけ，ＨＥＲ２−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を
高濃度のＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γとともに培養した場合に、比較的多くの青い老化細
胞があっただけでなく、細胞量が顕著に少なかったことがわかったため、実験を繰り返し
、活性カスパーゼ３を検出してアポトーシスを調べるために細胞をウエスタンブロットに
供した（図７Ｂ）。対照の空のベクター（ｐｃＤＮＡ３）によってトランスフェクトした
細胞の上昇濃度のＴＮＦ−α、７５〜２００ｎｇ／ｍｌおよびＩＦＮ−γ、７５０〜２０
００Ｕ／ｍｌの組み合わせによる、上記と同じ条件における処理は、ＳＡ−β−ｇａｌ染
色（図７Ａ）またはｐ１５ＩＮＫ４ｂおよび切断カスパーゼ３発現（図７Ｂ）により評価
した老化誘導に対して効果がなかった。この知見は、ＨＥＲ２が、乳癌細胞におけるＴＮ
Ｆ−αおよびＩＦＮ−γ誘導性老化およびアポトーシスのメカニズムに必要であることを
強固にする。
サイトカイン受容体は、乳癌細胞において同様のレベルで発現される
ＨＥＲ−２高発現性細胞株ＳＫ−ＢＲ−３およびＢＴ−４７４、中程度のＭＣＦ−７お
よびＴ−４７Ｄ、ならびに低度のＨＥＲ２正常不死化ＭＣＦ−１０乳癌細胞株のようなＨ
ＥＲ−２低発現性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株は、ウエスタンブロット解析により同
様のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α受容体発現を示した（図１２）。この結果は、これら２
つのサイトカイン受容体の発現レベルが、ＨＥＲ２発現レベルに依存しないことを実証す
る。これは、正常な乳房中の様々な相におけるこれらサイトカインの作用を説明する報告
に合致する。ＴＮＦ−αは、正常な乳腺の増殖、発達および枝分かれ形態形成に関与する
（Ｌｅｅら、２０００年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４１：３７６４〜３７７３頁
）。受容体ＴＮＦＲ１の発現は、ＴＮＦ−αにより誘導される乳房上皮細胞の増殖を仲介
し、ＴＮＦＲ２の活性化は、カゼイン蓄積を誘導する（Ｖａｒｅｌａら、１９９６年、Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７：４９１５〜４９２４頁）。同様に、ＩＦＮ−γの活
性型は、ほとんどすべての正常細胞の表面上に発現されるその受容体と相互作用する（Ｅ
ａｌｉｃｋら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２；６９８〜７０２頁；Ｆｒｒａｒら
、１９９３年、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：５７１〜６１１頁）。
ＨＥＲ２およびＨＥＲ３発現遮断の組み合わせが、乳癌細胞においてＴｈ１サイトカイン
であるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによる老化誘導を亢進する
サイトカインの組み合わせにより処理したＨＥＲ−２高発現性および中程度発現性細胞
株における老化およびアポトーシス表現型の亢進を示す先の結果が、ｓｉＲＮＡによるＨ
ＥＲ２およびＨＥＲ３のノックダウンの効果の研究を導いた。乳癌においてＨＥＲ２／Ｈ
ＥＲ３シグナリングを遮断することの治療効果は、数種の研究において実証されている（
Ｌｅｅ−Ｈｏｅｆｌｉｃｈら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４：５８７８〜８
７頁；Ｂｅｒｇｈｏｆｆら、２０１４年、Ｂｒｅａｓｔ １４：Ｓ０９６０〜９７７６頁
）。ＨＥＲ３欠失細胞におけるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの組み合わせ処理は、老化ま
たはアポトーシス細胞の数を亢進しなかったが、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３ｓｉＲＮＡによ
るダブルノックダウンは、ＳＫ−ＢＲ−３細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ染色（図８Ａ）
およびｐ１５ＩＮＫ４ｂ発現および活性カスパーゼ３発現レベル（図８Ｂ）を強力に増大
させた。同時に、活性カスパーゼ３のウエスタンブロットによって、ダブルノックダウン
およびサイトカインにより処理した細胞の高度なアポトーシ誘導を観察した（図８Ａ）。
同様の結果を、ＭＣＦ−７細胞（図１３）、ＢＴ４７４およびＴ４７Ｄ細胞において認め
た。
ＨＥＲ２阻害およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体化阻害の組み合わせが、ＳＫ−ＢＲ−３乳
癌細胞におけるＴｈ１サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの老化誘導および
アポトーシスを亢進する
トラスツズマブおよびペルツズマブは、ＨＥＲ２陽性乳癌を治療するために、クリニッ
クにおいて広く使用されてきた抗体である。翻訳的アプローチにおけるＴｈ１サイトカイ
ン誘導性の老化およびアポトーシスを研究するために、実験をデザインして、トラスツズ
マブおよびペルツズマブでＳＫ−ＢＲ−３細胞を前処理し、次いで、細胞をＴＮＦ−αお
よびＩＦＮ−γで５日間、３７℃において処理し、続いてサイトカインおよび抗体のない
状態でさらに２回継代培養した。サイトカインのみで処理した細胞と比較して、完全な処
理を受けた細胞において、ＳＡ−β−ｇａｌ染色により測定した青色の細胞の量が大きく
増加し（図９Ａ）、ウエスタンブロットにより測定したｐ１５ＩＮＫ４ｂの発現が増大し
たこと（図９Ｂ）を観察した。興味深いことに、この二重処理は、ウエスタンブロットに
よる活性カスパーゼ３発現の増加（図９Ｂ）およびフローサイトメトリー分析によるアネ
キシンｖおよびヨウ化プロピジウム陽性細胞の量の増加の両方によって、アポトーシスの
誘導に対しても顕著な効果を有した（図９Ｃ）。
ＣＤ４＋Ｔｈ１を介する、ＨＥＲ２過剰発現性ヒト乳癌細胞の老化およびアポトーシス
インビボで免疫系細胞によって産生されたサイトカインが腫瘍細胞における特異的な老
化およびアポトーシスも誘導できたことを確認するために、実験をデザインして、トラン
スウエル培養システムを用いてＨＥＲ２クラスＩＩペプチドで刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞と
ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞を共培養した。３７℃において５日間、細胞を共培養し、次いで
、免疫系細胞を含まない完全培地中でさらに２回継代培養した。この共培養は、ＳＡ−β
−ｇａｌ染色（図１０Ａ）の量の増加およびウエスタンブロットにより検出したｐ１５Ｉ
ＮＫ４ｂおよび切断されたカスパーゼ３の発現増加（図１０Ｂ）により証明された、ＳＫ
−ＢＲ−３細胞の老化およびアポトーシスをもたらした。未成熟の樹状細胞（ＤＣ）また
は成熟ＤＣプラス無関係のクラスＩＩ（ＢＲＡＦまたはサバイビン）ペプチドのいずれか
で刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の老化もアポトーシスも誘導すること
ができなかった（図１０）。
観察された老化およびアポトーシスは、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、トラスツズマブおよび
ペルツズマブの存在下、トランスウエル中、ＨＥＲ２クラスＩＩペプチドで刺激したＣＤ
４＋Ｔ細胞と共培養した場合に、大きく増強された。この結果は、ＳＡ−β−ｇａｌ染色
（図１０Ａ）ならびにｐ１５ＩＮＫ４ｂおよび切断されたカスパーゼ３の発現レベル（図
１０Ｂ）の増大によって明白に証明された。
別のアプローチとして、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞−成熟ＤＣの共培養物
からの上清と共培養し、同様の特異的老化応答を観察した。ＣＤ４＋Ｔ細胞−成熟ＤＣの
共培養上清から得た、Ｔｈ１分泌サイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＧ−αを、ＥＬＩＳ
Ａを用いて先に確認した。両実験アプローチにより、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを遮断
する中和抗体によって、ＳＫ−ＢＲ−３の老化およびアポトーシスを一部救済することが
できた（図１４）。
ＳＫ−ＢＲ−３細胞において、免疫系細胞の数の増加が、両アプローチによってより高
度なＳＡ−β−ｇａｌ染色、ｐ１５ＩＮＫ４ｂおよび切断されたカスパーゼ３の発現レベ
ルを誘導したため、この効果が用量依存的であったことも観察した。
Ｔｈ１サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γが、トラスツズマブおよびペルツ
ズマブ抵抗性乳癌細胞を、老化およびアポトーシス誘導に対して増感させる
Ｔｈ１サイトカインが老化およびアポトーシスを誘導できるメカニズムを引き続き解明
して、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γは、乳癌抵抗性細胞にトラスツズマブおよびペルツズ
マブに対する感受性を回復させることができたと考えられる。トラスツズマブおよびペル
ツズマブによる処理が、Ｔ−４７Ｄ感受性細胞とは反対に、２つの抵抗性細胞株、ＨＣＣ
−１４１９（Ｏ‘Ｂｒｉｅｎら、２０１０年、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．６：１
４８９〜５０２頁）およびＪＩＭＴ−１（Ｏ‘Ｂｒｉｅｎら、２０１０年、Ｍｏｌ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．６：１４８９〜５０２頁；Ｔｎｎｅｒら、２００４年、Ｍｏｌ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． １２：１５８５〜９２頁）においてＡＫＴの活性化を防止する
ことができなかった（図１６）。
ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによる処理は、ＨＣＣ−１４１９およびＪＩＭＴ−１細胞
において、用量依存的に老化およびアポトーシスを誘導した。細胞をトラスツズマブおよ
びペルツズマブで処理した場合、高用量であっても老化およびアポトーシスは認められな
かった（図１１）（データは示さない）。しかしながら、サイトカインおよび抗体による
二重処理は、ＨＣＣ−１４１９およびＪＩＭＴ−１細胞において、ＳＡ−β−ｇａｌアッ
セイによる老化を誘導し（図１１Ａ、１１Ｃ）、ｐ１５ＩＮＫ４ｂの発現を増大させた（
図１１Ｂ、１１Ｄ）。さらに、サイトカインと抗体の組み合わせは、ＨＣＣ−１４１９お
よびＪＩＭＴ−１細胞において、細胞死を有効に誘導した（図１１Ｂ、１１Ｄ）。この結
果は、Ｔｈ１サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γが、癌患者に広く影響を及
ぼす、治療剤に対する抵抗性を復帰させることができたことを実証する。
討論
本明細書では、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γが、用量依存的に乳癌細胞において老化お
よびアポトーシスを誘導することが実証されている。また、乳癌細胞におけるＨＥＲ２発
現レベルと、それらの細胞において老化を誘導するのに必要なＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−
の用量との間に逆相関があることも明らかにされている。サイトカイン受容体は、試験し
た全ての乳房細胞系において同様のレベルで発現し、これが異なった反応の原因ではない
ことが示唆されている。さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（低ＨＥＲ２レベル）が野生
型ＨＥＲ２プラスミドで安定にトランスフェクトされた場合にのみ、高用量のＴｈ１サイ
トカインが老化およびアポトーシスを誘導することができた。したがって、ＨＥＲ２を欠
くか、またはＨＥＲ２を非常に低いレベルで発現する細胞では、高用量のサイトカインで
さえも老化またはアポトーシスを誘導することができないため、ＨＥＲ２シグナル伝達が
老化およびアポトーシスを誘発するのに必要であるようである。しかし、ＨＥＲ２を高レ
ベルまたは中レベルで発現する細胞では、遺伝子をノックダウンすると、癌遺伝子中毒と
呼ばれる現象によって老化およびアポトーシスが誘導される。さらに、ＨＥＲ２およびＨ
ＥＲ３ ｓｉＲＮＡを組み合わせると、乳癌細胞におけるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−によ
って誘導される老化およびアポトーシスがさらに増強され、ＨＥＲ２シグナル伝達の欠如
のためにＨＥＲ３よりも一歩前進していることが示されている。
（実施例５）
抗エストロゲン療法と抗ＨＥＲ２樹状細胞ワクチン接種は、ＥＲ陽性／ＨＥＲ２陽性 Ｄ
ＣＩＳにおける病理学的完全奏効を改善する
樹状細胞（「ＤＣ」）の抗原提示能力は、抗腫瘍ワクチン接種におけるそれらの使用に
対する熱意をもたらした。本グループは、抗ＨＥＲ２ Ｔｈ１感作および誘引を促進する
ように独自に設計されたＨＥＲ２ペプチドパルス自己ＤＣワクチンを設計した。２０１５
年３月１３日に出願された米国特許出願第１４／６５８，０９５号、２０１５年１２月３
０日に出願された米国特許出願第１４／９８５，３０３号（これらの開示は参照によりそ
の全体が本明細書に組み込まれる）、Ｄａｔｔａ、Ｊ．ら、ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ ４：８ ｅ１０２２３０１（２０１５）ＤＯＩ：１０。 １０８０ ／ ２１６２４
０２Ｘ．２０１５。 １０２２３０１およびＤａｔｔａ、Ｊ．ら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ。 １７（１）：７１（２０１５）を参照。ＨＥＲ２陽性 ＤＣＩＳ（Ｈ
ＥＲ２陽性 非浸潤性乳管癌）患者における抗ＨＥＲ２ワクチンのネオアジュバント使用
後の実現可能性、安全性、および予備的臨床結果が報告されている。完全な腫瘍退行（病
理学的完全奏効（「ｐＣＲ」））が患者の１９％で誘導された。しかし、これらの結果は
、ホルモン非依存性（Ｅｒ陰性）ＤＣＩＳを有する患者に集中しており、ＥＲ陽性 ＤＣ
ＩＳを有する患者は、抗ＨＥＲ２ ＤＣワクチンに対して、ホルモン非依存性ＤＣＩＳを
有する患者よりも反応が低かったことを示唆した（Ｓｈａｒｍａ、Ａ。 Ｃａｎｃｅｒ
１１８（１７）：４３５４−６２（２０１２））。ＨＥＲ２とＥＲシグナル伝達経路との
間の広範な双方向クロストークは、癌細胞の増殖および生存の増強をもたらす（Ａｒｐｉ
ｎｏ、Ｇ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２９（２）：２１７−２３３（２
００８）およびＰｒａｔ、Ａ．、Ｎａｔ。Ｃｌｉｎ。Ｐｒａｃ Ｏｎｃｏｌ．５（９）：
５３１−５４２（２００８））。これらの２つの受容体の両方を組み合わせて標的化する
ことにより、それらが互いに活性化し続けるのを妨げる可能性がある。抗ＨＥＲ２ ＤＣ
ワクチン接種治療に抗エストロゲン（「ＡＥ」）療法を加えることは、ＨＥＲ２陽性／Ｅ
Ｒ陽性 ＤＣＩＳ患者における応答を改善すると仮定される。本明細書に報告された研究
では、抗ＨＥＲ２ ＤＣワクチン接種を受けたＥＲ陰性 ＤＣＩＳ患者（「ＥＲ陰性」）
、抗ＨＥＲ２ ＤＣワクチン接種のみを受けたＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者（ＥＲ陽性 ＡＥ
なし」）、および、抗ＨＥＲ２ ＤＣワクチンと同時の抗エストロゲン療法の両方を受け
たＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者（「ＥＲ陽性、ＡＥあり」）における臨床応答と免疫応答との
比較がなされた、
本明細書に提示された結果は、同時のネオアジュバント抗エストロゲン療法および抗Ｈ
ＥＲ２ ＤＣ１ワクチン接種が、ＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性 ＤＣＩＳにおける局所センチ
ネルリンパ節における免疫応答および病理学的完全奏効の割合を増加させることを実証す
る。これらの結果は、個別化・標的化された併用療法をさらに支持する。
方法
方法の要約：ＨＥＲ２陽性 ＤＣＩＳの患者８１人にネオアジュバント抗ＨＥＲ２ Ｄ
Ｃワクチンを投与した。切除された外科用標本で臨床応答を測定した。ワクチン接種前後
の末梢血およびワクチン接種後のセンチネルリンパ節において、免疫応答−抗ＨＥＲ２
ＣＤ４＋ Ｔｈ１応答−を測定した。抗ＨＥＲ２ワクチン接種のみを受けたＥＲ陰性患者
、抗ＨＥＲ２ワクチン接種を単独で受けたＥＲ陽性患者、および抗ＨＥＲ２ワクチン接種
と同時に抗エストロゲン療法を受けたＥＲ陽性患者の間で、臨床的および免疫的応答を比
較した。
実施される方法を以下に詳述する。
前臨床実験
乳癌細胞株ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２陽性 ３＋／ＥＲ陰性）およびＭＣＦ７（ＨＥＲ２陰
性 ２＋／ＥＲ陽性）を、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮγおよびＴＮＦα）、タモキシフ
ェン代謝産物（４−ヒドロキシタモキシフェン、「４ＨＴ」）、または両方で７２時間処
理した。アラマーブルーアッセイを介して代謝活性を測定した。
試験デザイン
ペンシルベニア大学の施設審査委員会の承認を得た後、ＨＥＲ２ペプチドパルスＤＣ１
ワクチン（ＮＣＴ００１０７０２１１およびＮＣＴ０２０６１３３２）の２つのネオアジ
ュバント臨床試験を行った。主な目的は、ＤＣ１ワクチン接種の実現可能性、安全性およ
び有効性を評価することであった。第２の目的は、臨床的および免疫的応答を評価するこ
とであった。これらの試験の予備的結果は、ワクチンが安全で、耐容性が高く、ＨＥＲ−
２発現の低下または根絶を誘導することを示した（Ｓｈａｒｍａ、Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ
１１８（１７）：４３５４−６２（２０１２）（「Ｓｈａｒｍａら））。予備的結果の
さらなるレビューは、ワクチン接種がホルモン非依存性（ＥＲ陰性）患者においてより有
効であることを示した［２０，２１］。前臨床データおよび臨床試験の予備的結果に基づ
いて、ホルモン依存性（ＥＲ陽性）ＤＣＩＳを有する後続のＥＲ陽性患者を同時ＡＥ療法
で治療するための補遺が承認された。
患者の選択
生検でＨＥＲ２陽性 ＤＣＩＳかつＥＣＯＧ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｔａｔｕｓ
Ｓｃｏｒｅが０または１であるであることがわかった１８歳以上の女性患者が試験に適
格であった。全ての組織標本は、一人の病理学者がその適格性を検討した。ＨＥＲ−２陽
性は、ＨＥＲ−２タンパク質の発現強度が２＋または３＋である細胞＞５％と定義された
。出産年齢の女性は、血清学的妊娠検査で陰性である必要であり、医学的に許容される形
態の避妊薬を使用する必要があった。心機能障害、ＨＩＶ、ＨｅｐＣ、凝固障害、または
既存の医学的疾患があったり、研究を干渉する可能性のある薬剤を服用している女性は、
試験から除外された。根治治療を受けた女性、またはＤＣＩＳが診断時に切除生検により
排除された女性は、この試験に適格ではなかった。試験に８１名の女性が登録され、ワク
チン接種治療を完了した。全８１人の患者は外科的切除を受け、切除標本を病理検査した
。免疫応答は、第２試験（ＮＣＴ０２０６１３３２）の患者で測定された。５４人の患者
うち５３人が、末梢血で測定されたワクチン接種前および接種後のＣＤ４＋免疫応答を示
し、４０人の患者が、センチネルリンパ節で測定されたワクチン接種後のＣＤ４＋免疫応
答を示し、２２人のＨＬＡ−Ａ２陽性患者が、末梢血で測定されたワクチン接種前および
接種後のＣＤ８＋免疫応答を示した。
ワクチン接種の手順
ワクチンの調製および送達は以前に詳細に記載されている。例えば、Ｓｈａｒｍａら、
Ｃｚｅｒｎｉｅｃｋｉ、Ｂ．Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ。 ６７（４）：１８４２−
５２（２００７）（Ｃｚｅｒｎｉｅｃｋｉら）、およびＫｏｓｋｉ、Ｇ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｔｈｅｒ。 ３５（１）５４−５６（２０１２）。ワクチン接種手順を図１６
に示す。簡単に説明すると、単球性樹状細胞前駆体は、タンデム白血球搬出／向流遠心溶
離によって患者から得た。単球を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ
Ｆ）（Ａｍｇｅｎ、Ｎｅｗｂｕｒｙ Ｐａｒｋ、ＣＡ）およびＩＬ−４を含む無血清培地
（ＳＦＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、３７℃で培養した。
翌日、６つのＨＥＲ２由来主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ結合ペプチド（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）
で細胞をパルスした：
３つの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ペプチド（ペプチド４２−５６：ＨＬＤＭＬＲＨＬＹ
ＱＧＣＱＶＶ（配列番号：１）；ペプチド９８〜１１４：ＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮ
ＹＡＬ（配列番号２）；およびペプチド３２８〜３４５：ＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶ
ＣＹＧＬ（配列番号３））、ならびに
３つの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）ペプチド（ペプチド７７６〜７９０：ＧＶＧＳＰＹＶ
ＳＲＬＬＧＩＣＬ（配列番号４）；ペプチド９２７−９４１：ＰＡＲＥＩＰＤＬＬＥＫＧ
ＥＲＬ（配列番号５）；およびペプチド１１６６−１１８０：ＴＬＥＲＰＫＴＬＳＰＧＫ
ＮＧＶ（配列番号６））。８〜１２時間後、１０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γ（Ｉｎｔｅｒ
ｍｕｎｅ、Ｂｒｉｓｂａｎｅ、ＣＡ）を加え、採取の６時間前に、臨床グレードのＬＰＳ
（国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＡｎｔｈｏｎｙ Ｓｕｆｆｒｅｄｉｎｉ博士からの贈呈）
）を添加して、Ｉ型樹状細胞（ＤＣ１）への迅速な成熟を完了させた。ＨＬＡ−Ａ２陽性
患者については、単球プールをＭＨＣクラスＩ結合ペプチド３６９−３７７および６８９
−６９７でパルスした。
週１回の１〜２千万個のＨＥＲ−２ペプチドパルスＤＣ１の注射を４〜６回、乳房、鼠
径部リンパ節、または乳房および鼠径リンパ節の両方に投与した。
毎週のワクチン接種の後、最低１〜２時間、有害作用について患者をモニタリングした
。すべての有害事象は国立がん研究所共通毒性基準（ＮＣＩ−ＣＴＣバージョン３．０）
によって分類され、ワクチン接種中に少なくとも毎週評価され、消失するまでモニタリン
グした。
臨床モニタリング
外科的切除（乳腺腫瘤摘出術（ｎ＝４８）または乳房切除術（ｎ＝３３））の時点で病
理学的応答を調べた。免疫化に対する病理学的完全奏効は、外科的切除時に残存ＤＣＩＳ
も侵襲性乳癌もないことと定義された。その後の乳房イベントの発生のために外科的切除
後に患者をモニタリングした。その後の乳房イベントは、同側または対側乳房で同定され
た病変（ＤＣＩＳまたは浸潤性乳癌）と定義された。
抗エストロゲン療法
ＥＲ陽性患者を抗エストロゲン療法で週４〜６回の抗ＨＥＲ２ ＤＣ１ワクチン接種と
同時に治療した。医師の研究者は、以下の抗エストロゲン療法のどれが各患者に最も適し
ているかを決定した：タモキシフェン（４−ヒドロキシタモキシフェン（「４ＨＴ」）（
ＮＯＬＶＡＤＥＸ（商標））；レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（商標））；アナストロゾー
ル（ＡＲＭＩＤＥＸ（商標））；エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（商標））；ラロキ
シフェン（ＥＶＩＳＴＡ（商標））；またはエストロゲンの作用を遮断または改変する他
の適切な抗エストロゲン剤。
免疫モニタリング
ＣＤ４＋ Ｔ細胞
全身性抗ＨＥＲ２ ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は、６種のＨＥＲ２由来の主要組織適合複合
体（ＭＨＣ）クラスＩＩ結合ペプチドペプチドをパルスした自己末梢血単核細胞（ＰＢＭ
Ｃ）から生成した。局所的抗ＨＥＲ２ ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は、ＳＬＮ生検を受けた４
０例の患者のセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）において測定された。ＩＦＮ−γの産生を既
に詳述されているとおりに酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを介し
て定量した。（Ｆｒａｃｏｌ、Ｍ．ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：
３２３３−９（２０１３））簡単に述べると、ＰＶＤＦ膜プレート（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｃ
ｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を抗ＩＦＮ−γ補足抗体（１Ｄ１Ｋ）で一晩コートした。翌
日、プレートをＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）で洗浄し、１０
％ヒト血清／ＤＭＥＭでブロックした後、ＳＬＮ細胞上の２×１０５個のＰＢＭＣを、未
刺激；ＨＥＲ２由来クラスＩＩペプチド（４２−５６，９８−１１４，３２８−３４５，
７７６−７９０，９２７−９４１，１１６−１１８０）（４μｇ）でパルス；抗ヒトＣＤ
３およびＣＤ２８抗体（０．５μｇ／ｍＬ）（陽性対照、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でパルス；のいずれかで各ウェルに播種し、次いで、３７℃
＋５％ＣＯ２で２４〜３６時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄した後、１
００μＬの検出抗体（１ｍｇ／ｍＬ； ７ Ｂ６−１−ビオチン）を各ウェルに添加し、
プレートを２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで再度洗浄した後、１００μＬ
の１：１０００希釈ストレプトアビジン−ＨＲＰを各ウェルに添加し、プレートをさらに
１時間インキュベートした。ＴＭＢ基質溶液を添加してスポット形成を明らかにした。自
動化リーダー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ＣＴＬ）を用いてスポット形成細胞（ＳＦＣ）を
計数した。
個々のＨＥＲ２クラスＩＩペプチドに対する陽性応答は、未刺激のバックグラウンドを
差し引いた後で最低２０個のＳＦＣ／２×１０５細胞かつ未刺激のバックグラウンドに対
して少なくとも２倍の増加と定義された。ＣＤ４＋ Ｔｈ１応答の定量には、下記３つの
評価指標を用いた：（１）全体的な応答率（１つ以上の１ペプチドに応答する患者の割合
）、（２）応答レパートリー（患者が応答するペプチドの数）、および（３）累積応答（
全６つのペプチドにわたるＳＦＣの合計）。
ＣＤ８＋ Ｔ細胞
全身性抗ＨＥＲ２ ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を、２２人のＨＬＡ−Ａ２陽性（ＨＬＡ．２
．１）患者において測定した。抗ＨＥＲ２ ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、Ｃｚｅｒｎｉｅｃ
ｋｉらにより既に詳細に説明されているように、インビトロ増感アッセイによって生成し
た。簡潔に述べると、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、凍結保存された１２０〜１４０個のリンパ球
細胞画分からネガティブ選択により選択した（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、バンクーバー、ＢＣ）。自己樹状細胞をＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む無
血清培地（ＳＦＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に懸濁し、クラ
スＩ ＨＥＲ２ペプチド（１０ｕｇ／ｍｌ）（３６９−３７７）でパルスし、次いでＣＤ
８＋ Ｔ細胞と１０：１の比で共培養した。２日目にＩＬ−２（３０ ＩＵ／ｍｌ）を添
加した。１０日目に、Ｔ細胞を採取し、クラスＩ ＨＥＲ２ペプチドまたは無関係の対照
（ｐ５３および結腸癌ペプチド）のいずれかをパルスしたＴ２標的細胞に対して試験した
。２４時間後、上清を採取し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって分析し
た。ＨＥＲ２クラスＩペプチドに対する陽性応答は、無関係のペプチド対照と比較して、
ＣＤ８＋ Ｔ細胞ＩＦＮγ産生の２倍の増加として定義された。
統計的方法
記述統計量および単変量ロジスティック回帰を用いて、人口統計および臨床データを評
価した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意があると考えた。Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ分析
を用いて、その後の乳房イベントの発症を比較した。すべての分析は、ＳＴＡＴＡ １２
．０／ＩＣ統計ソフトウェア（ＳＴＡＴＡ Ｃｏｒｐ、カレッジステーション、テキサス
州）で行った。
結果
結果の要約：ＥＲ陰性 ＤＣＩＳ患者およびエストロゲン治療を受けたＥＲ陽性 ＤＣ
ＩＳ患者の病理学的完全奏効率は３１．４％対２８．６％（ｐ＝１．００）であった。両
方の病理学的完全奏効率は、抗エストロゲン療法を受けていないＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者
に見られる病理学的完全奏効率（４．０％、ｐ＝０．０３５）よりも有意に高かった。末
梢血で測定された抗ＨＥＲ２ Ｔｈ１免疫応答は、ワクチン接種後に有意に増加したが、
３群すべてにおいて同様であった。しかし、センチネルリンパ節において、抗ＨＥＲ２
Ｔｈ１免疫応答は、抗ＨＥＲ２ワクチン接種のみの治療を受けたＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者
と比較して、抗ＨＥＲ２ワクチン接種および抗エストロゲン療法の組み合わせの治療を受
けたＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者で有意に高かった。
結果を以下に詳述する
前臨床実験
ＳＫＢＲ３乳癌細胞株（ＥＲ陰性）は、Ｔｈ１サイトカイン治療に応答して抗腫瘍活性
を増加させたが、抗エストロゲン治療に応答しなかった。さらに、抗エストロゲン治療を
Ｔｈ１サイトカイン治療に加えることは、図１７Ａに示されるように、代謝活性に影響を
及ぼさなかった。
逆に、ＭＣＦ７乳癌細胞株（ＥＲ陽性）は、Ｔｈ１サイトカイン治療または抗エストロ
ゲン治療のいずれかに応答して抗腫瘍活性を増加させなかった。しかし、Ｔｈ１サイトカ
イン治療と抗エストロゲン治療の併用は、図１７Ｂに示すように、代謝活性の増加をもた
らした。
試験：患者の選択と人口統計
臨床試験に参加した８１人の患者の年齢の中央値は５５歳（四分位範囲（ＩＱＲ）４７
〜６０歳）であり、ＢＭＩ中央値は２５．９（ＩＱＲ ２２．４〜３１．０）であり、大
部分の患者は閉経後（ｎ＝６８； ８４．０％）および白色（ｎ＝６５，８０．２％）で
あった。すべての対象患者は、生検時にＤＣＩＳと診断された。しかし、少数の患者（ｎ
＝１６，１９．８％）が、最終的な外科的切除時に早期浸潤性乳癌（病期Ｉ）を有するこ
とが判明した。対象となるすべての患者は、２＋（ｎ＝２８，３４．６％）または３＋（
ｎ＝５３，６５．４％）ＨＥＲ２陽性 ＤＣＩＳと診断された。ワクチン接種は、４７人
の患者の鼠径リンパ節（５８％）、１８人の患者（２２．２％）の乳房、１６人の患者（
２０％）の鼠径部リンパ節および乳房の両方に投与した。外科的切除は、乳腺腫瘤摘出術
（４８人の患者（５９．３％））および乳房切除術（３３人の患者の（４０．７％））に
より完了した。乳腺腫瘤摘出術を受けた患者のうち、３７．５％が術後放射線療法を受け
た。
このワクチンはグレード１〜２の有害事象のみで良好な耐容性を示した。最も一般的に
報告されたワクチン接種の有害事象は、疲労（ｎ＝４１，５０．６％）、注射部位反応（
ｎ＝３４，４２．０％）、悪寒／戦慄（ｎ＝２６，３２．１％）であった。副作用のため
に治験を完了することができなかった患者はいなかった。
図１８は、全コホートにおいて、３５人の患者（４３．２％）がＥＲ陰性であり、４６
人の患者（５６．８％）がＥＲ陽性であったことを示す。ＥＲ陽性の患者のうち、２５人
（５４．３％）がＤＣ１ワクチンのみを受け、２１人の患者（４５．７％）がＤＣ１ワク
チンとＡＥ併用療法を受けた。これらの治療群の人口統計的および臨床的特徴は、以下の
表１に要約され、群間に有意差は示さなかった。
ＨＥＲ２ワクチン接種に対する臨床的反応率
臨床的応答は、８１人の患者すべてで得られた。全体的に、８１人の免疫化された患者
のうち１８人（２２．２％）は、切除された外科用検体において疾患が残存していないこ
とが判明した。これらの患者は病理学的完全奏効（ｐＣＲ）を有すると考えられた。図１
９に示すように、ＥＲ陰性群の病理学的完全奏効はＥＲ陽性群よりも高かった。より具体
的には、ＥＲ陰性群（ｎ＝１１，３１．４％）およびＡＥ治療を受けたＥＲ陽性群（ｎ＝
６，２８．６％）におけるｐＣＲは類似していた（ｐ＝１．００）。しかし、ＡＥ治療を
受けていないＥＲ陽性群（ｎ＝１，４．０％）の病理学的完全奏効率は、ＥＲ陰性群（ｐ
＝０．０１）およびＡＥ治療を受けたＥＲ陽性群（ｐ＝０．０１）よりも有意に低かった
（図１９）。
病理学的完全奏効は、低い再発の危険性と相関する。例えば、Ｔａｎｉｏｋａ， Ｍ．
， ら’，Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １０３（３０；２９７−３０２（２０１０）を
参照。その後の胸部病変（片方の乳房に同定されたＤＣＩＳまたは浸潤性乳癌として定義
）は６人のワクチン接種患者（７．４％）において発生した。その後の乳房イベントを経
験した全ての患者が外科的切除時に同定された残存疾患を有していた（＜ｐＣＲ（図２０
Ａ））。患者のうち２人がＥＲ陰性 ＤＣＩＳを有していた。また患者のうち４人がＥＲ
陽性 ＤＣＩＳを有していたが、ＡＥ療法を受けなかった。ＥＲ陽性 ＤＣＩＳであり、
かつ、ＡＥ治療を受けた患者はその後の乳房イベントを経験しなかった（図２０Ｂ）。試
験の後半に登録されたＥＲ陽患者は、同時のワクチン接種およびＡＥ療法で治療されたた
め、これらの患者の追跡期間の中央値はより短かった。もちろん、これらの患者のモニタ
リングは継続する。
表１に示すように、乳腺腫瘤摘出率は３つの群全てにおいて同様であった。しかし、乳
腺腫瘤摘出後の放射線治療率は、ＡＥ治療を受けていなＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者群（５３
．８％，ｐ＝０．０６）よりも、ＡＥ療法を受けたＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者群（１８．７
５％）で低かった。ＡＥ療法を受けたＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者は、より低い放射線率にも
かかわらず、その後の乳房イベントの率が低下する。
ＨＥＲ２ワクチン接種に対する免疫応答率
ＣＤ４＋ Ｔｈ１反応：全身−末梢血
ワクチン接種前免疫およびワクチン接種後免疫応答は５３人の患者で測定された。全体
として、ワクチン接種前の３６．２５％からワクチン接種後の５６．２５％へ応答性が有
意に増加した（ｐ＝＜０．００１）。反応レパートリー中央値もワクチン接種前１（ＩＱ
Ｒ ０−２）からワクチン接種後２．９（ＩＱＲ ２−４）に有意に増加した（ｐ＝＜０
．００１）。最後に、累積応答の中央値は、ワクチン接種前５６．１（ＩＱＲ ２３．３
−１１１．７）からワクチン接種後１３３．１（ＩＱＲ ７５．６−２４０．３）に有意
に増加した（ｐ＝０．００２）。
応答率：ワクチン接種後、応答率は各群で有意に増加した（ＥＲ陰性 ５８．３％から
８７．５％、ｐ＜０．０１；ＡＥ治療なしのＥＲ陽性 ５０．０％から７５．０％、ｐ＜
０．０１；ＡＥ治療ありのＥＲ陽性 ５７．１％から９０．５％、ｐ＜０．０１）。ワク
チン接種前の応答率は、３つの群全てにおいて同様であった（ＥＲ陰性 ５８．３％、Ａ
Ｅ治療なしのＥＲ陽性 ５０．０％、ＡＥ治療ありのＥＲ陽性 ５７．１％、ｐ＝０．９
）。ワクチン接種後の応答率も、３つの群全てにおいて同様であった（ＥＲ陰性 ８７．
５％、ＡＥ治療なしのＥＲ陽性 ７５．０％、ＡＥ治療ありのＥＲ陽性 ９０．５％、ｐ
＝０．５、図２１Ａ）。
応答レパートリー：ワクチン接種後、応答レパートリーは各群で増加した（ＥＲ陰性
１から３、ｐ＝０．０５；ＡＥ治療なしのＥＲ陽性 ０から１．５、ｐ＝０．１；ＡＥ治
療ありのＥＲ陽性 １から３、ｐ＝０．０１）。ワクチン接種前の応答レパートリー中央
値は、３つの群全てにおいて同様であった（ＥＲ陰性 １（ＩＱＲ ０−２）、ＡＥ治療
なしのＥＲ陽性 ０（ＩＱＲ ０−１．５）、ＡＥ治療ありのＥＲ陽性 １（ＩＱＲ ０
−２）；ｐ＝０．５）。ワクチン接種後の応答レパートリー中央値も３つの群全てにおい
て同様であった（ＥＲ陰性 ３（ＩＱＲ ２−４．５）、ＡＥ治療なしのＥＲ陽性 １．
５（ＩＱＲ ０．５−３．５）、ＡＥ治療ありのＥＲ陽性 ３（ＩＱＲ ２−５）；ｐ＝
０．４ 図２１Ｂ）。
累積応答：ワクチン接種後、累積応答は各群で増加した（ＥＲ陰性 ５６．３から１４
９．７、ｐ＜０．０１；ＡＥ治療なしのＥＲ陽性 ４１．１から１７８．７、ｐ＜０．０
１；ＡＥ治療ありのＥＲ陽性 ５８．６から１００．９、ｐ＜０．０１）。ワクチン接種
前の累積応答中央値は、３群すべてにおいて同様であった（ＥＲ陰性 ５６．３（ＩＱＲ
２６．１−１１６．２）、ＡＥ治療なしのＥＲ陽性 ４１．１（ＩＱＲ ９．６−１６
８．６）、ＡＥ治療ありのＥＲ陽性 ５８．６（ＩＱＲ ２４．２−８７．９）、ｐ＝０
．８８６）。ワクチン接種後の累積応答中央値も、３群すべてにおいて同様であった（Ｅ
Ｒ陰性１４９．７（ＩＱＲ ９７．７−２４６．７）、ＡＥ治療なしのＥＲ陽性 １７８
．７（ＩＱＲ ６４．７−２７８．３）、ＡＥ治療ありＥＲ陽性 １００．９（ＩＱＲ
６７．５−１７４．４）、ｐ＝０．５ 図２１Ｃ）。
ＣＤ４＋ Ｔｈ１応答：局所−センチネルリンパ節
ワクチン接種後の免疫応答を４０人の患者で測定した。全体的に、応答性は８０％であ
り、応答レパートリー中央値は２（ＩＱＲ１−５）であり、累積応答の中央値は７６．５
であった（ＩＱＲ２３−１９７）。
応答率：ＡＥ治療を受けたＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性 ＤＣＩＳの患者では、ＡＥＲ治療
を受けていないＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者と比較して、応答率は有意に高か
った（９２．３％対４３％、ｐ＝０．０３、図２２Ａ）。
応答レパートリー：ＡＥ治療を受けたＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者では、Ａ
Ｅ治療を受けていないＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性 ＤＣＩＳと比較して、応答レパートリー
中央値も有意に高かった（４（ＩＱＲ ２−６）対０（ＩＱＲ ０−５）；ｐ＝０．０５
、図２２Ｂ）。
累積応答：ＡＥ治療を受けたＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者では、ＡＥ治療を
受けていないＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者と比較して、累積応答中央値も有意
に高かった（１０２（ＩＱＲ ６９−３５４）対２３（ＩＱＲ １−１００）；ｐ＝０．
０５、図２２Ｃ）。
ＣＤ８＋応答：全身−末梢血
ワクチン接種前ワクチン接種およびワクチン接種後ＣＤ８＋免疫応答は、２２人のＨＬ
Ａ−Ａ２＋患者において測定された。全体として、ワクチン接種前の１３．３％からワク
チン接種後の７２．７％（ｐ＝＜０．０００２）へ反応性が有意に上昇した。
応答率：ワクチン接種後、応答率は各群で有意に増加した（ＥＲ陰性 １２．５％から
７５％、ｐ＜０．０４；ＡＥ治療なしのＥＲ陽性 ０％から１００％、ｐ＜０．０３；Ａ
Ｅ治療ありのＥＲ陽性 ２０％から６０％、ｐ＜０．１７）。ワクチン接種前の応答率は
、３つの群全てにおいて同様であった（ＥＲ陰性 １２．５％、ＡＥ治療なしのＥＲ陽性
０％、ＡＥ治療ありのＥＲ陽性 ２０％、ｐ＝ ）。ワクチン接種後の応答率も、３つ
の群全てにおいて同様であった（ＥＲ陰性 ７５％、ＡＥ治療なしのＥＲ陽性 １００％
、ＡＥ治療ありのＥＲ陽性 ６０％、ｐ＝ 図２３）。
結論：本明細書に記載の研究は、抗ＨＥＲ２ ＤＣ１ワクチンがＥＲ陰性／ＨＥＲ陽性
ＤＣＩＳ患者において臨床的に有効であることを明らかに示している。抗ＨＥＲ２ Ｄ
Ｃ１ワクチンは、抗エストロゲン療法と併用しても安全であることも示されている。同時
のネオアジュバント抗エストロゲン療法および抗ＨＥＲ２ ＤＣ１ワクチン接種は、局所
センチネルリンパ節における免疫応答およびＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性 ＤＣＩＳ患者にお
ける病理学的完全奏効の割合を増加させることが示された。抗エストロゲンとの併用療法
は、その後の乳房イベントをも減少しうる。これらの結果は、ＤＣＩＳ療法において個別
のアプローチを提供し得る。これらの結果はさらに、抗ＨＥＲ２ ＤＣ１ワクチンと抗エ
ストロゲン治療との個別化・標的化された併用を支持する。当業者であれば、トラスツズ
マブおよびペルツズマブなどの抗ＨＥＲ２治療の他の抗増殖剤の組み合わせが可能である
ことを理解することができる。これらのアプローチは、広範な手術の必要性を制限し、放
射線療法を排除し、長期ホルモン治療を減少させる可能性がある。
（実施例６）
突然変異ＢＲＡＦを標的とする新規な樹状細胞ワクチンは、ベメラフェニブ耐性を克服し
、ＢＲＡＦ変異マウスメラノーマにおける生存を相乗的に改善する
ＢＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブ（ＰＬＸ）は、ＢＲＡＦ突然変異（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ
）黒色腫の生存を改善するが、抵抗性が一般的である。ＢＲＡＦＶ６００Ｅパルス型１型
極性樹状細胞ワクチン（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ−ＤＣ１）は、マウスＢＲＡＦＶ６００Ｅメ
ラノーマに影響を及ぼす抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導する。本発明者らは、ＢＲＡ
ＦＶ６００Ｅ−ＤＣ１とＰＬＸの組み合わせが相乗的な臨床応答を誘発するかどうかを調
べた。
方法
移植可能なＢＲＡＦＶ６００ＥＰＴＥＮ−／−黒色腫モデルがＣ５７Ｂｌ／６バックグ
ラウンドで開発された。Ｆｌｔ３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＣｐＧおよびＬ
ＰＳを用いて骨髄前駆体からＤＣ１を生成し、クラスＩ ＢＲＡＦＶ６００Ｅペプチドで
パルスした。未処理およびオボアルブミン−ＤＣ１対照に加えて、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ−
ＤＣ１（週１回の注射を２回）およびＰＬＸを単独でまたは指定された組み合わせで腫瘍
を有するマウスに投与した（それぞれｎ＝１０）。腫瘍増殖および生存率を測定した。脾
細胞からのＢＲＡＦＶ６００Ｅ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の誘導を、ＩＦＮ−γＥＬＩ
ＳＡによって評価した。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるサイトカインｍＲＮＡの定量は
、ＲＴ−ｑＰＣＲによって行った。
結果
図２４は、ＢＲＡＦＶＶ６００Ｅ−ＤＣ１＋ＰＬＸの組み合わせを（ＢＲＡＦＶＶ６０
０Ｅ−ＤＣ１の誘導と同時にまたはＢＲＡＦＶＶ６００Ｅ−ＤＣ１の誘導後に）投与した
マウスでは、劇的に腫瘍増殖が遅延し（Ｐ＜０．００１））、ＢＲＡＦＶＶ６００Ｅ−Ｄ
Ｃ１（４２日）、ＰＬＸ（４３．５日）、オボアルブミン−ＤＣ１（２８日）または未治
療（２４日）のコホートと比較して生存率中央値が改善（それぞれ、８６日および７３．
５日）（Ｐ＜０．００１）されたことを示す。３５％がＢＲＡＦＶＶ６００Ｅ−ＤＣ１＋
ＰＬＸ療法後に無病となり、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ腫瘍再曝露に対して免疫を維持した。Ｂ
ＲＡＦＶＶ６００Ｅ−ＤＣ１＋ＰＬＸは、個々の治療と比較して、インビトロでのＩＦＮ
−γ放出による測定で、ＢＲＡＦＶ６００Ｅパルス抗原提示細胞およびＢＲＡＦＶ６００
Ｅ腫瘍細胞の相乗的に改善された全身性ＣＤ８＋ Ｔ細胞認識を誘導した（ｐ＜０．００
１）。ＴＭＥにおいて、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ−ＤＣ１＋ＰＬＸは、ＰＤ−Ｌ１発現を減衰
させつつ、Ｔｈ１（ＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α）およびＴ細胞ホーミング（ＣＸＣＬ９／Ｃ
ＣＬ５）サイトカインのより高いｍＲＮＡレベルを生成した。ＣＤ８＋ＴＩＬのトラフィ
ッキングはＢＲＡＦＶ６００Ｅ−ＤＣ１＋ＰＬＸによって強化された。
結論として、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ−ＤＣ１ワクチンは、ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノーマ
におけるベムラフェニブ耐性を克服し、免疫および臨床応答を相乗的に改善する。そのよ
うな組み合わせは、当業者によって使用されるであろう。
本明細書中に引用された各特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照することに
より本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態に関して開示されたが、本発明
の他の実施形態および変形が、本発明の真の趣旨および範囲を離れることなく、他の当業
者によって考案されうることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのようなすべ
ての実施形態および等価な変形を含むと解釈されることを企図される。

Claims (65)

  1. 注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンを生成する方法であって、
    少なくとも１つの抗原を樹状細胞（ＤＣ）に接触させること、
    少なくとも１つのＴＬＲアゴニストで前記ＤＣを活性化させること、
    前記ＤＣを、初回免疫化用量および複数のブースター用量を含む複数の用量に凍結保存
    すること
    を含み、前記ＤＣが融解された場合、前記ＤＣが少なくとも１つのサイトカインの有効量
    を産生して、Ｔ細胞応答を発生させる、方法。
  2. 前記ＤＣを融解することをさらに含み、前記ＤＣが少なくとも１つのサイトカインの有
    効量を産生して、Ｔ細胞応答を発生させる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記抗原がウイルス抗原である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ＴＬＲアゴニストがＬＰＳである、請求項１に記載の方法。
  6. ＩＦＮ−γにより前記ＤＣを活性化することを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記凍結保存することが、前記ＤＣを、約５５％のプラズマライト、約４０％のヒト血
    清アルブミンおよび約５％のＤＭＳＯを含む凍結用培地中で凍結することを含む、請求項
    １に記載の方法。
  8. 前記凍結保存することが、前記ＤＣを、約−７０℃以下の温度で凍結することを含む、
    請求項７に記載の方法。
  9. 融解後のＤＣの回復率および生存率が、約７０％以上である、請求項１に記載の方法。
  10. 融解後のＤＣの回復率および生存率が、約８０％以上である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記ＤＣが少なくとも約１週間、凍結保存される、請求項１に記載の方法。
  12. 前記サイトカインがＩＬ−１２である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記ＤＣがキラー機能を示し、それによって前記ＤＣが標的細胞を溶解することができ
    る、請求項１に記載の方法。
  14. 哺乳動物において免疫応答を誘発するための、凍結保存された注射用複数用量抗原パル
    ス樹状細胞ワクチンであって、前記注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンが、
    少なくとも１つの抗原を取り込んだＤＣを含み、
    前記ＤＣが、少なくとも１つのＴＬＲアゴニストへの曝露によって活性化されており、
    前記ＤＣが、少なくとも１つのサイトカインの有効量を産生して、Ｔ細胞応答を発生さ
    せる、注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
  15. 前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワ
    クチン。
  16. 前記抗原がウイルス抗原である、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス樹状細
    胞ワクチン。
  17. 前記ＴＬＲアゴニストがＬＰＳである、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス
    樹状細胞ワクチン。
  18. 前記ＤＣがＩＦＮ−γへの曝露によって活性化されている、請求項１４に記載の注射用
    複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
  19. 前記ワクチンが、約５５％のプラズマライト、約４０％のヒト血清アルブミンおよび約
    ５％のＤＭＳＯを含む凍結用培地中、約−７０℃以下の温度で凍結保存されている、請求
    項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
  20. 融解後のＤＣの回復率および生存率が、約７０％以上である、請求項１４に記載の注射
    用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
  21. 融解後のＤＣの回復率および生存率が、約８０％以上である、請求項１４に記載の注射
    用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチン。
  22. 組成物が少なくとも約１週間、凍結保存される、請求項１４に記載の注射用複数用量抗
    原パルス樹状細胞ワクチン。
  23. 前記サイトカインがＩＬ−１２である、請求項１４に記載の注射用複数用量抗原パルス
    樹状細胞ワクチン。
  24. 哺乳動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項１４に記載の前記凍結保存
    された注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンの用量を、それを必要とする哺乳動物
    に投与することを含む、方法。
  25. 癌を有するかまたは発症するリスクのある対象を治療するための方法であって、そのよ
    うな治療を必要とする対象に、癌を治療するかまたは癌を発症するリスクを低減するのに
    有効な量の樹状細胞ワクチンおよびＨＥＲ−２の阻害剤を投与することを含む、方法。
  26. ケモカイン調節剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ケモカイン調節剤が、ＴＬＲアゴニストである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ケモカイン調節剤が、ＴＬＲ８アゴニストである、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記癌を治療するかまたは前記癌を発症するリスクを低減するのに有効な量の癌医薬を
    投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  30. 前記癌医薬が、手術、抗癌剤、化学療法剤、免疫療法剤およびホルモン療法からなる群
    から選ばれる、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、黒色腫、膵臓癌、消化管癌、脳癌
    およびその任意の組み合わせからなる群から選ばれる、請求項２５に記載の方法。
  32. 前記樹状細胞ワクチンが、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つのＴＬＲアゴニ
    ストと接触している、活性化された樹状細胞を含む、請求項２５に記載の方法。
  33. 前記樹状細胞ワクチンが、前記樹状細胞中の細胞内カルシウム濃度を上昇させる作用剤
    および活性化剤と接触している、活性化された樹状細胞を含む、請求項２５に記載の方法
    。
  34. 前記作用剤が、細胞質からのカルシウムの輸送を遮断することによって、細胞内カルシ
    ウムレベルを上昇させる、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記作用剤がカルシウムイオノフォアを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記カルシウムイオノフォアが、Ａ２３１８７およびイオノマイシンからなる群から選
    ばれる、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記樹状細胞ワクチンが、注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンの形態にある、
    請求項２５に記載の方法。
  38. 対象の腫瘍部位中の免疫細胞の遊走および活性を改善する方法であって、腫瘍部位中の
    免疫細胞が腫瘍細胞の攻撃においてより有効であるように、前記腫瘍中の免疫応答を変化
    させるのに有効な量の樹状細胞ワクチンおよびＨＥＲ−２の阻害剤を前記対象に投与する
    ことを含む、方法。
  39. ケモカイン調節剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ケモカイン調節剤が、ＴＬＲアゴニストである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ケモカイン調節剤が、ＴＬＲ８アゴニストである、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記癌を治療するかまたは前記癌を発症するリスクを低減するのに有効な量の癌医薬を
    前記対象に投与することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
  43. 前記癌医薬が、手術、抗癌剤、化学療法剤、免疫療法剤およびホルモン療法からなる群
    から選ばれる、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、黒色腫、膵臓癌、消化管癌、脳癌
    およびその任意の組み合わせからなる群から選ばれる、請求項４２に記載の方法。
  45. 前記樹状細胞ワクチンが、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つのＴＬＲアゴニ
    ストと接触している、活性化された樹状細胞を含む、請求項３８に記載の方法。
  46. 前記樹状細胞ワクチンが、前記樹状細胞中の細胞内カルシウム濃度を上昇させる作用剤
    および活性化剤と接触している、活性化された樹状細胞を含む、請求項３８に記載の方法
    。
  47. 作用剤が、細胞質からのカルシウムの輸送を遮断することによって、細胞内カルシウム
    レベルを上昇させる、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記作用剤がカルシウムイオノフォアを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記カルシウムイオノフォアが、Ａ２３１８７およびイオノマイシンからなる群から選
    ばれる、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記樹状細胞ワクチンが、注射用複数用量抗原パルス樹状細胞ワクチンの形態にある、
    請求項３８に記載の方法。
  51. 前記樹状細胞ワクチンおよびＨＥＲ−２の阻害剤が、前記腫瘍部位に投与される、請求
    項３８に記載の方法。
  52. 前記樹状細胞ワクチン、ＨＥＲ−２の前記阻害剤および前記ケモカイン調節剤が、前記
    腫瘍部位に投与される、請求項３９に記載の方法。
  53. 癌を有するかまたは発症するリスクのある対象を治療するための方法であって、前記対
    象においてＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のうちの１つまたは複数を阻害し、それによって
    ＨＥＲ−２発現性乳癌において腫瘍老化を引き起こすことを含む、方法。
  54. ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３のうちの１つまたは複数を阻害することが、前記対象に阻
    害剤を投与することを含み、前記阻害剤が、ＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３両方の阻害剤で
    あるかまたはＨＥＲ−２阻害剤およびＨＥＲ−３阻害剤の組み合わせである、請求項５３
    に記載の方法。
  55. 前記阻害剤が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アンチセンス核酸
    、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、抗体、
    ペプチド、化学化合物および小分子からなる群から選ばれる、請求項５４に記載の方法。
  56. 樹状細胞ワクチンを前記対象に投与することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  57. ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを前記対象に投与することをさらに含む、請求項５３に記
    載の方法。
  58. ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを前記対象に投与することをさらに含む、請求項５６に記
    載の方法。
  59. エストロゲン受容体陽性／ＨＥＲ２陽性非浸潤性乳管癌（「ＥＲ陽性／ＨＥＲ２陽性
    ＤＣＩＳ」）を有する対象のネオアジュバント治療であって、
    抗エストロゲン療法と組み合わせて、抗原パルスＤＣ１ワクチンの少なくとも１用量を
    投与することを含み、
    前記抗原パルスＤＣ１ワクチンは、６つのＨＥＲ２由来ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド
    でパルスされた前記対象の単球性樹状細胞（ＤＣ）前駆体に由来し、ＨＥＲ２パルスされ
    た前記ＤＣ前駆体は１型樹状細胞（ＤＣ１）に成熟される、ネオアジュバント治療。
  60. 前記６つのＨＥＲ２由来ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドが、ペプチド４２−５６：ＨＬ
    ＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（配列番号１）、ペプチド９８−１１４：ＲＬＲＩＶＲＧＴ
    ＱＬＦＥＤＮＹＡＬ（配列番号２）、ペプチド３２８−３４５：ＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣ
    ＡＲＶＣＹＧＬ（配列番号３）、ペプチド７７６−７９０：ＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩ
    ＣＬ（配列番号４）、ペプチド９２７−９４１：ＰＡＲＥＩＰＤＬＬＥＫＧＥＲＬ（配列
    番号５）、およびペプチド１１６６−１１８０：ＴＬＥＲＰＫＴＬＳＰＧＫＮＧＶ（配列
    番号６）を含む、請求項５９に記載の治療。
  61. 前記抗エストロゲン治療が、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキ
    セメスタン、ラロキシフェン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され
    る抗エストロゲン剤の投与を含む、請求項５９に記載の治療。
  62. 前記患者がＨＬＡ−Ａ２陽性である場合、前記患者の単球性ＤＣ前駆体を、ペプチド３
    ６９−３７７：ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号７）、およびペプチド６８９−６９７：Ｒ
    ＬＬＱＥＴＥＬＶ（配列番号８）を含むＭＨＣクラスＩ結合ペプチドでパルスする、請求
    項５９に記載の治療。
  63. 前記６つのＨＥＲ２由来ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドでパルスされた前記対象の末梢
    血単核細胞（ＰＢＭＣ）から全身の抗ＨＥＲ２ ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答がワクチン接種前
    および接種後に生成され、
    前記末梢血単核細胞は、次いで、播種され、スポット形成細胞（ＳＦＣ）のスポット形
    成を明らかにし、かつ、測定対象のＩＦＮ−γの産生を引き起こすために処理される、請
    求項５９に記載の治療。
  64. ＨＥＲ２由来ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド３６７−３７７でパルスされた前記対象の
    末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から全身の抗ＨＥＲ２ ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答がワクチン接
    種前および接種後に生成され、
    前記末梢血単核細胞は、次いで播種され、スポット形成細胞（ＳＦＣ）のスポット形成
    および後に測定されるＩＦＮ−γの産生を明らかにするために処理される、請求項６２に
    記載の治療。
  65. 抗ＨＥＲ２ ＣＤ４＋ Ｔ細胞局所的局所免疫応答が、ワクチン接種後の前記対象のセ
    ンチネルリンパ節において測定される、請求項５９に記載の治療。
JP2020117004A 2015-05-22 2020-07-07 複数用量注射準備済樹状細胞ワクチンの製造 Pending JP2020180139A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562165445P 2015-05-22 2015-05-22
US62/165,445 2015-05-22
PCT/US2015/041022 WO2016011422A2 (en) 2014-07-17 2015-07-17 Manufacturing of multi-dose injection ready dendritic cell vaccines and combination therapy for blocking her2 and her3
USPCT/US2015/041022 2015-07-17

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017502876A Division JP2018515421A (ja) 2015-05-22 2016-03-05 複数用量注射準備済樹状細胞ワクチンの製造

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2020180139A true JP2020180139A (ja) 2020-11-05

Family

ID=57393543

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017502876A Pending JP2018515421A (ja) 2015-05-22 2016-03-05 複数用量注射準備済樹状細胞ワクチンの製造
JP2020117004A Pending JP2020180139A (ja) 2015-05-22 2020-07-07 複数用量注射準備済樹状細胞ワクチンの製造

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017502876A Pending JP2018515421A (ja) 2015-05-22 2016-03-05 複数用量注射準備済樹状細胞ワクチンの製造

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP3302539A4 (ja)
JP (2) JP2018515421A (ja)
CN (1) CN107206061A (ja)
CA (1) CA2986687A1 (ja)
WO (1) WO2016190940A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3169774A4 (en) * 2014-07-17 2018-04-25 Brian J. Czerniecki Manufacturing of multi-dose injection ready dendritic cell vaccines and combination therapy for blocking her2 and her3
WO2019103151A1 (ja) * 2017-11-27 2019-05-31 国立大学法人千葉大学 核酸を細胞内に送達するための脂質膜構造体

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
US5801005A (en) * 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
DE10041515A1 (de) * 2000-08-24 2002-03-14 Gerold Schuler Verfahren zur Herstellung gebrauchsfertiger, Antigen-beladener oder -unbeladener, kryokonservierter reifer dendritischer Zellen
WO2003012085A1 (en) * 2001-07-30 2003-02-13 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Antigen presenting cells, method for their preparation and their use for cancer vaccines
CA2504451A1 (en) * 2004-08-10 2006-02-10 Geron Corporation Dendritic cell vaccines for treating cancer made from embryonic stem cells
US8247227B2 (en) * 2006-08-28 2012-08-21 The Cleveland Clinic Foundation Dendritic cell precursors
EP2547360A4 (en) * 2010-03-15 2013-11-20 Univ Pennsylvania SYSTEM AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND STORAGE OF ACTIVATED TIRES OF DENDRITIC CELLS
KR20230084328A (ko) * 2010-12-30 2023-06-12 셀룰래리티 인코포레이티드 세포의 동결보존 및 캡슐화 방법
EP2548571A1 (en) * 2011-07-22 2013-01-23 Institut Curie Compositions having means for targeting at least one antigen to dendritic cells
WO2016153761A1 (en) * 2015-03-13 2016-09-29 Czerniecki Brian J Methods for monitoring cd4+ t-helper type 1 response in cancer and immune restoration
US20150323547A1 (en) * 2014-03-14 2015-11-12 Brian J. Czerniecki Methods for monitoring cd4+ t-helper type 1 response in cancer and immune restoration
EP3169774A4 (en) * 2014-07-17 2018-04-25 Brian J. Czerniecki Manufacturing of multi-dose injection ready dendritic cell vaccines and combination therapy for blocking her2 and her3
US20180171294A1 (en) * 2015-03-26 2018-06-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vitro artificial lymph node method for sensitization and expansion of t cells for therapy and epitope mapping
EP3273975A4 (en) * 2015-03-26 2018-10-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vitro artificial lymph node for sensitization and expansion of t cells for therapy and epitope mapping

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BREAST CANCER RESEARCH AND TREATMENT, vol. 92, JPN6021029031, 2005, pages 251 - 263, ISSN: 0004562229 *
CANCER, vol. 118, JPN6021029030, 2012, pages 4354 - 4362, ISSN: 0004562230 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018515421A (ja) 2018-06-14
EP3302539A1 (en) 2018-04-11
CN107206061A (zh) 2017-09-26
EP3302539A4 (en) 2018-12-19
CA2986687A1 (en) 2016-12-01
WO2016190940A1 (en) 2016-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20170216421A1 (en) Manufacturing of multi-dose injection ready dendritic cell vaccines, combination therapies for blocking her2 and her3, and estrogen receptor positive her2 breast receptor positive her2 breast cancer therapy
US9492518B2 (en) Tumor immunity
AU2020204594A1 (en) Target peptides for ovarian cancer therapy and diagnostics
AU2013308409A1 (en) Target peptides for immunotherapy and diagnostics
AU2022204339A1 (en) Target peptides for colorectal cancer therapy and diagnostics
JP2009542714A (ja) ＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαを用いて生成され、且つ熱処理され死滅したがん細胞を取り込んだ樹状細胞
JP2020180139A (ja) 複数用量注射準備済樹状細胞ワクチンの製造
JP2020169178A (ja) 複数用量注射準備済樹状細胞ワクチンの製造ならびにｈｅｒ２およびｈｅｒ３を遮断するための併用療法
US20190374627A1 (en) Target peptides for cancer therapy and diagnostics
US10829538B2 (en) Identification of immunogenic MHC class II peptides for immune-based therapy
JP2015506698A (ja) 多能性胚葉起源抗原を提示する癌ワクチン
AU2019203111B2 (en) Manufacturing of multi-dose injection ready dendritic cell vaccines, combination therapies for blocking HER2 and HER3, and estrogen receptor positive HER2 breast cancer therapy
J Rice et al. Clinical approaches to immunotherapy in non-small cell lung cancer: Current and future perspectives
Le Pogam et al. DNA-mediated adjuvant immunotherapy extends survival in two different mouse models of myeloid malignancies
AU2019201194B2 (en) Identification of immunogenic MHC Class II peptides for immune-based therapy
JP2024503278A (ja) 修飾ｐｂｍｃを用いたがんの治療方法
CA2992937A1 (en) Identification of immunogenic mhc class ii peptides for immune-based therapy
US20220265791A1 (en) Target peptides for cancer therapy and diagnostics
AU2020386007A1 (en) Hyperactive dendritic cells enable durable adoptive cell transfer-based anti-tumor immunity

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200729

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200729

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210803

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20220308