JP2020141576A - ヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】植物組織の培養細胞内で産生される代謝中間体を基質として、その代謝フローをスイッチングさせることで得られる、新規ヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法の提供を目的とする。【解決手段】タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝産物の代謝中間体を基質とし、導入した外来の二次代謝生合成遺伝子により得られることを特徴とする。【選択図】 図1
Description
本発明は、植物培養細胞を用いたヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法に関する。
4−ヒドロキシ安息香酸(パラベン)は、抗菌剤に広く使用されている。
また、そのグルコースエステル体等がアンチエージング剤としての検討もされている。
これまでの、この種のヒドロキシ安息香酸誘導体は化学合成に頼っており、環境への負荷が大きく、また消費エネルギーが大きいことも問題となっている。
また、そのグルコースエステル体等がアンチエージング剤としての検討もされている。
これまでの、この種のヒドロキシ安息香酸誘導体は化学合成に頼っており、環境への負荷が大きく、また消費エネルギーが大きいことも問題となっている。
本発明者らは、これまでに植物組織からカルスの誘導及びその培養細胞に成果を得ており(特許文献1)、また植物培養細胞内での活発な代謝経路を利用した「合理的代謝フロースィッチング」を提案している(特許文献2)。
本発明は、これまでの成果をヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成に応用すべく研究した結果、得られた。
本発明は、これまでの成果をヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成に応用すべく研究した結果、得られた。
本発明は、植物組織の培養細胞内で産生される代謝中間体を基質として、その代謝フローをスイッチングさせることで得られる、新規ヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法の提供を目的とする。
本発明に係るヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法は、タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝産物の代謝中間体を基質とし、導入した外来の二次代謝生合成遺伝子により得られることを特徴とする。
タケ植物に由来する組織は、フェニルプロパノイド代謝が活発であることが、本発明者らの研究にて明らかになっている(特許文献2)。
本発明は、このフェニルプロパノイド代謝系にて産生される中間体を基質とする外来の二次代謝生合成酵素を導入することで、新たな代謝経路にスィッチングした点に特徴がある。
本発明は、このフェニルプロパノイド代謝系にて産生される中間体を基質とする外来の二次代謝生合成酵素を導入することで、新たな代謝経路にスィッチングした点に特徴がある。
ここで、外来の二次代謝生合成遺伝子は、シュードモナス プチダ由来の4−ヒドロキシシンナモイル−CoAヒドラターゼ/リアーゼをコードする遺伝子であるのが好ましい。
シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)は、グラム陰性桿菌に属する土壌微生物であり、例えばKT2440株由来の4−ヒドロキシシンナモイル−CoAヒドラターゼ/リアーゼ(PpHCHL:4-hydroxycinnamoyl - CoA hydratase / lyase)は、4−ヒドロキシ桂皮酸に係る代謝経路に関する酵素である。
よって、タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝産物は、ヒドロキシ桂皮酸誘導体であるのが好ましい。
シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)は、グラム陰性桿菌に属する土壌微生物であり、例えばKT2440株由来の4−ヒドロキシシンナモイル−CoAヒドラターゼ/リアーゼ(PpHCHL:4-hydroxycinnamoyl - CoA hydratase / lyase)は、4−ヒドロキシ桂皮酸に係る代謝経路に関する酵素である。
よって、タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝産物は、ヒドロキシ桂皮酸誘導体であるのが好ましい。
本発明に用いる培養細胞は、タケ植物の組織片を培地で培養した培養細胞であり、固体培地による増殖や、液体培地による懸濁培養が例として挙げられる。
タケ植物としては、マダケ属マダケ(Phyllostachys bambusoides Seib. Et Zucc),ハチク(Phyllostachys nigra Munro var. Henonis.),モウソウチク(Phyllostachys pubescens Mazel ex Houz.)等が例として挙げられる。
本発明にて生合成できるヒドロキシ安息香酸誘導体は、タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝中間体を基質として、外部から導入された遺伝子により、形質転換された培養細胞内で生合成された二次代謝物及び、それに基づく誘導体が含まれる。
具体例としては、グルコースエステル体,グルコースエーテル体も含まれ、具体的な化合物の例として、以下のものが挙げられる。
4-Hydroxybenzoic acid glucose ester(4HBAGE)
4-Hydroxybenzoic acid glucoside(4HBAG)
Vanillic acid glucose ester(VAGE)
具体例としては、グルコースエステル体,グルコースエーテル体も含まれ、具体的な化合物の例として、以下のものが挙げられる。
本発明に係る生合成方法によれば、タケ植物由来の培養細胞に有する活発な代謝経路中の代謝中間産生物を基質とする外来の二次代謝生合成遺伝子による代謝フローのスイッチングにて生合成されるので、従来の化学合成に比較して省エネルギーであり、環境負荷も小さく抑えることができる。
本発明に係る生合成例を以下、具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
本実施例は、タケ植物としてハチクの組織を用いた培養細胞の形質転換を行った。
なお、培養細胞は、特許文献1に記載の方法にて得られた培養細胞を用いた。
形質転換に用いたベクターの構成例を図1に示す。
具体的には、pRI201−ON(タカラバイオ)の選抜マーカー遺伝子をNeomycin phosphotransferaseからHygromycin phosphotransferase(HPT)へと置換したベクターpRI201−ON−Hmのマルチクローニングサイトに、Pseudomonas putida KT2440由来の4-hydroxycinnamoyl-CoA hydratase/lyase (PpHCHL)を導入したベクターpRI201−ON−Hm/PpHCHLを作製した。
なお、培養細胞は、特許文献1に記載の方法にて得られた培養細胞を用いた。
形質転換に用いたベクターの構成例を図1に示す。
具体的には、pRI201−ON(タカラバイオ)の選抜マーカー遺伝子をNeomycin phosphotransferaseからHygromycin phosphotransferase(HPT)へと置換したベクターpRI201−ON−Hmのマルチクローニングサイトに、Pseudomonas putida KT2440由来の4-hydroxycinnamoyl-CoA hydratase/lyase (PpHCHL)を導入したベクターpRI201−ON−Hm/PpHCHLを作製した。
次に上記ベクターを用い、特許文献2に開示する金粒子をキャリアーとしたパーティクルボンバードメント法によって、ハチク培養細胞の形質転換を行った。
形質転換後の培養細胞は、KH2PO4濃度を680mg/mLに改変したMS(Murashige and Skoog)培地にスクロースを3%、Picloramを10μM添加した培地(MS P680Pic培地)にゲランガム0.3%を加えた固体培地にて培養し(25℃、暗条件)、細胞の増殖状態に応じて20〜30日後にハイグロマイシンB(100mg/L)を含むMS P680Pic/0.3%ゲランガム固体培地に移植した。
安定した増殖性を示した株のゲノムDNAを抽出し、PCRによりPpHCHL遺伝子およびHPT遺伝子の導入を確認した。
その結果、図2に示すようにHPTとPpHCHLの両方が導入された株(#20と#28)とHPTのみが導入された株(#23と#26)を得た。
ゲノムDNAが正しく抽出されていることを確かめるためハチクのActin1(ACT1)遺伝子を増幅するプライマーでPCRを行ったところ、野生株を含む全ての株で遺伝子の増幅がみられた。
その結果を図2に示す。
形質転換後の培養細胞は、KH2PO4濃度を680mg/mLに改変したMS(Murashige and Skoog)培地にスクロースを3%、Picloramを10μM添加した培地(MS P680Pic培地)にゲランガム0.3%を加えた固体培地にて培養し(25℃、暗条件)、細胞の増殖状態に応じて20〜30日後にハイグロマイシンB(100mg/L)を含むMS P680Pic/0.3%ゲランガム固体培地に移植した。
安定した増殖性を示した株のゲノムDNAを抽出し、PCRによりPpHCHL遺伝子およびHPT遺伝子の導入を確認した。
その結果、図2に示すようにHPTとPpHCHLの両方が導入された株(#20と#28)とHPTのみが導入された株(#23と#26)を得た。
ゲノムDNAが正しく抽出されていることを確かめるためハチクのActin1(ACT1)遺伝子を増幅するプライマーでPCRを行ったところ、野生株を含む全ての株で遺伝子の増幅がみられた。
その結果を図2に示す。
得られた形質転換カルス#20(PpHCHLとHPT双方導入)および#23(HPTのみ導入)と野生株カルスをMS P680Pic培地/0.3%ゲランガム固体培地で4週間培養し、細胞内に蓄積する代謝物を調べた。
カルス100mgあたり1mLの80%メタノール/2%酢酸を加え、超音波抽出後、遠心した上清をHPLC分析に供した。
その結果、PpHCHL導入株#20で4-hydroxybenzoic acid glucose ester(4HBAGE)、4-hydroxybenzoic acid glucoside(4HBAG)、およびvanillic acid glucose ester(VAGE)が蓄積していた。
その一方で、野生株やPpHCHL非導入株#23ではそれら化合物の蓄積は確認できなかった。
これら化合物の同定は化学合成した標準物質と比較することによって行った。
なお、HPLCクロマトグラムの条件を下記に示す。
HPLC条件
カラム:MIGHTYSIL RP-18 GP Aqua 250 × 4.6 mm (5 μm)
移動相:7%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸
流速:0.8mL/min
検出波長:280nm
カルス100mgあたり1mLの80%メタノール/2%酢酸を加え、超音波抽出後、遠心した上清をHPLC分析に供した。
その結果、PpHCHL導入株#20で4-hydroxybenzoic acid glucose ester(4HBAGE)、4-hydroxybenzoic acid glucoside(4HBAG)、およびvanillic acid glucose ester(VAGE)が蓄積していた。
その一方で、野生株やPpHCHL非導入株#23ではそれら化合物の蓄積は確認できなかった。
これら化合物の同定は化学合成した標準物質と比較することによって行った。
なお、HPLCクロマトグラムの条件を下記に示す。
HPLC条件
カラム:MIGHTYSIL RP-18 GP Aqua 250 × 4.6 mm (5 μm)
移動相:7%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸
流速:0.8mL/min
検出波長:280nm
ハチク培養細胞の活発な増殖が促されるMS P680Pic/0.3%ゲランガム固体培地での培養(PR条件)に加えて、細胞の木化が促進されるMS培地の無機塩類濃度のみを1/2に改変した培地(1/2MS培地:LG1条件)で4週間カルスを培養し、細胞内に蓄積する4HBAGE、VAGE、および4HBAGの定量分析を行った。
その結果を図4のグラフに示す。
PpHCHL導入株である#20と#28でこれら化合物の蓄積がみられ、#28よりも#20で蓄積量が高いことがわかった。また、PR条件よりもLG1条件で培養したカルスでこれら化合物の蓄積量は高く、LG1条件で培養した形質転換カルス#20における4HBAGE、VAGE、4HBAGの細胞1gあたりの蓄積量は、それぞれ5.4μmol、0.87μmol、0.61μmolであった。
その結果を図4のグラフに示す。
PpHCHL導入株である#20と#28でこれら化合物の蓄積がみられ、#28よりも#20で蓄積量が高いことがわかった。また、PR条件よりもLG1条件で培養したカルスでこれら化合物の蓄積量は高く、LG1条件で培養した形質転換カルス#20における4HBAGE、VAGE、4HBAGの細胞1gあたりの蓄積量は、それぞれ5.4μmol、0.87μmol、0.61μmolであった。
得られた形質転換株を増殖条件であるPR条件、もしくは木化誘導条件であるLG1条件とLG2条件(1/2MS+10μM 6-benzyladenine)において懸濁培養した際の細胞内における代謝物蓄積量の継時変化を調べた。
300mL容三角フラスコに、PR条件で2週間前培養した野生株もしくは形質転換株の懸濁細胞を沈降細胞量(sedimented cell volume: SCV)が5%になるように移植し、各培地100mLをそれぞれ加え培養を開始した(25℃、暗条件、100rpm)。
0日目から30日目まで4日おきに1フラスコ分の細胞を回収し、SCVを測定すると共に、細胞抽出物中の主要代謝産物をHPLCを用いて分析した。
SCVに基づく増殖曲線を図5に示す。
木化条件であるLG1とLG2条件下で培養すると、野生株やPpHCHLの導入されていない#23と比較して、PpHCHLが導入された#20および#28は細胞の増殖が抑制されていた。
300mL容三角フラスコに、PR条件で2週間前培養した野生株もしくは形質転換株の懸濁細胞を沈降細胞量(sedimented cell volume: SCV)が5%になるように移植し、各培地100mLをそれぞれ加え培養を開始した(25℃、暗条件、100rpm)。
0日目から30日目まで4日おきに1フラスコ分の細胞を回収し、SCVを測定すると共に、細胞抽出物中の主要代謝産物をHPLCを用いて分析した。
SCVに基づく増殖曲線を図5に示す。
木化条件であるLG1とLG2条件下で培養すると、野生株やPpHCHLの導入されていない#23と比較して、PpHCHLが導入された#20および#28は細胞の増殖が抑制されていた。
前述の手法で懸濁培養した細胞を吸引ろ過によりサンプリングした。
カルスの分析の際と同様の手法で、得られた細胞抽出液をHPLC分析に供した。
カルスを分析した結果と同様に、PpHCHL導入株である#20および#28において4HBAG、4HBAGE、VAGEの蓄積が観察された。
PR条件で培養した細胞と比較して、LG1およびLG2条件で培養した細胞で4HBAGEとVAGEがより高蓄積することも明らかとなった(図6)。
4HBAGEの蓄積量が特に多く、LG2条件で培養した#20においては5日目以降、70μmol/gFW以上蓄積していた。
#20株をLG2条件で20日間培養した細胞のフラスコ(培地量100mL)あたりの蓄積量は、4HBAGEが172mg、VAGEが16mg、4HBAGが3.6mgであった(図7)。
カルスの分析の際と同様の手法で、得られた細胞抽出液をHPLC分析に供した。
カルスを分析した結果と同様に、PpHCHL導入株である#20および#28において4HBAG、4HBAGE、VAGEの蓄積が観察された。
PR条件で培養した細胞と比較して、LG1およびLG2条件で培養した細胞で4HBAGEとVAGEがより高蓄積することも明らかとなった(図6)。
4HBAGEの蓄積量が特に多く、LG2条件で培養した#20においては5日目以降、70μmol/gFW以上蓄積していた。
#20株をLG2条件で20日間培養した細胞のフラスコ(培地量100mL)あたりの蓄積量は、4HBAGEが172mg、VAGEが16mg、4HBAGが3.6mgであった(図7)。
Claims (4)
- タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝産物の代謝中間体を基質とし、導入した外来の二次代謝生合成遺伝子により得られることを特徴とするヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法。
- 前記外来の二次代謝生合成遺伝子は、シュードモナス プチダ由来の4−ヒドロキシシンナモイル−CoAヒドラターゼ/リアーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項1記載のヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法。
- 前記タケ植物由来の培養細胞が産生する二次代謝産物は、ヒドロキシ桂皮酸誘導体であることを特徴とする請求項1又は2記載のヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法。
- 前記ヒドロキシ安息香酸誘導体は、グルコースエステル体又はグルコースエーテル体であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のヒドロキシ安息香酸誘導体の生合成方法。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007525966A (ja) * | 2003-06-16 | 2007-09-13 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 緑色植物および微生物におけるアルブチンの高レベル産生 |
WO2013010124A1 (en) * | 2011-07-13 | 2013-01-17 | The Regents Of The University Of California | Lignification reduction in plants |
JP2014054230A (ja) * | 2012-09-14 | 2014-03-27 | Toyama Prefecture | 植物組織からのカルス及び培養細胞の誘導方法並びに形質転換細胞の作出方法 |
JP2014158456A (ja) * | 2013-02-21 | 2014-09-04 | Toyama Prefecture | 合理的代謝フロースイッチングした形質転換植物培養細胞及びそれを用いた生合成法 |
-
2019
- 2019-03-04 JP JP2019038992A patent/JP2020141576A/ja active Pending
Patent Citations (4)
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Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL, vol. 3, JPN6022032533, 2005, pages 29 - 41, ISSN: 0004844181 * |
SCIENTIFIC REPORTS, vol. Vol.8:13203, JPN6022032532, 2018, pages 1 - 11, ISSN: 0004844182 * |
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