JP2020132561A - エリスロポエチン産生促進用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
すなわち、本発明は乳酸菌を有効成分とする新規のエリスロポエチン産生促進用組成物を提供するものである。また、本発明は産業上利用可能な新規の乳酸菌株を提供するものである。
したがって、本発明は以下の構成を有する。
<1>ラクトバチルス(Lactobacillus)属、リューコノストック(Leuconostoc)属またはペディオコッカス(Pediococcus)属に属する菌の菌体を有効成分とするエリスロポエチン産生促進用組成物、
<2>Lactobacillus属、Leuconostoc属またはPediococcus属に属する菌が、ラクトバチルス ムコサエ(Lactobacillus mucosae)、ラクトバチルス パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス プランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス バギナリス(Lactobacillus vaginalis)、リューコノストック メセンテロイデス サブスピーシーズ クレモリス(Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris)、リューコノストック シュードメセンテロイデス(Leuconostoc pseudomesenteroides)、ペディオコッカス ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)から選択されるひとつ以上であることを特徴とする<1>に記載のエリスロポエチン産生促進用組成物、
<3>Lactobacillus属、Leuconostoc属またはPediococcus属に属する菌が、Lactobacillus mucosae SBT2958(NITE P−02803)、Lactobacillus paracasei SBT0228(NITE P−02805)、Lactobacillus plantarum SBT0092(NITE P−02806)、Lactobacillus rhamnosus SBT2490(NITE P−02807)、Lactobacillus vaginalis SBT0337(NITE P−02808)、Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris SBT1395(NITE P−02809)、Leuconostoc pseudomesenteroides SBT0835(NITE P−02810)、Pediococcus pentosaceus SBT3316(NITE P−02804)から選択されるひとつ以上であることを特徴とする<2>に記載のエリスロポエチン産生促進用組成物、
<4><1>〜<3>のいずれかに記載のエリスロポエチン産生促進用組成物を含む、エリスロポエチン産生促進用飼料組成物、エリスロポエチン産生促進用医薬組成物、又はエリスロポエチン産生促進用食品組成物、
<5>新規乳酸菌ラクトバチルス ムコサエ SBT2958、
<6>新規乳酸菌ラクトバチルス パラカゼイ SBT0228、
<7>新規乳酸菌ラクトバチルス プランタラム SBT0092、
<8>新規乳酸菌ラクトバチルス ラムノーサス SBT2490、
<9>新規乳酸菌ラクトバチルス バギナリス SBT0337、
<10>新規乳酸菌リューコノストック メセンテロイデス サブスピーシーズ クレモリス SBT1395、
<11>新規乳酸菌リューコノストック シュードメセンテロイデス SBT0835、並びに
<12>新規乳酸菌ペディオコッカス ペントサセウス SBT3316。
本発明の乳酸菌は、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、リューコノストック(Leuconostoc)属およびペディオコッカス(Pediococcus)属に分類される乳酸菌であればどのようなものでも用いることができる。
具体的には、ラクトバチルス ムコサエ(Lactobacillus mucosae)、ラクトバチルス パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス プランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス バギナリス(Lactobacillus vaginalis)、リューコノストック メセンテロイデス サブスピーシーズ クレモリス(Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris)、リューコノストック シュードメセンテロイデス(Leuconostoc pseudomesenteroides)、ペディオコッカス ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)等を例示できるが、これらに限定されるものではない。
乳酸菌は、各菌の培養の常法に従って培養し、所望の量を調製すればよい。調製の一例を以下に示す。MRS培地(Difco)を用いて培養し、得られた培養物を遠心分離により集菌することにより菌体を得る。得られた菌体をそのまま用いてもよいし、濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供した菌体を用いることもできる。菌体は死菌体にしたものを用いることもできる。死菌体は、例えば、加熱乾燥、酸処理、超音波破砕等により調製することができる。
本発明は、新規乳酸菌株に関するものである。これらの新規乳酸菌株とはLactobacillus mucosae SBT2958(NITE P−02803)、Lactobacillus paracasei SBT0228(NITE P−02805)、Lactobacillus plantarum SBT0092(NITE P−02806)、Lactobacillus rhamnosus SBT2490(NITE P−02807)、Lactobacillus vaginalis SBT0337(NITE P−02808)、Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris SBT1395(NITE P−02809)、Leuconostoc pseudomesenteroides SBT0835(NITE P−02810)、Pediococcus pentosaceus SBT3316(NITE P−02804)である。以下、同乳酸菌株を「本発明の乳酸菌」、「本発明の乳酸菌株」、又は単にSBT2958、SBT0228、SBT0092、SBT2490、SBT0337、SBT1395、SBT0835、SBT3316株と記載することがある。
本発明の乳酸菌であるSBT2958、SBT0337はヒト糞便を、SBT0228はアルコール飲料を、SBT0092、SBT2490、SBT1395、SBT0835は発酵乳を、SBT3316は発酵食品を分離源として分離された。これらの乳酸菌株は、2018年10月31日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(郵便番号292−0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室)に、SBT2958はNITE P−02803、SBT0228はNITE P−02805、SBT0092はNITE P−02806、SBT2490はNITE P−02807、SBT0337はNITE P−02808、SBT1395はNITE P−02809、SBT0835はNITE P−02810、SBT3316はNITE P−02804の受託番号で寄託されている。
本発明の乳酸菌は、上記寄託乳酸菌株に制限されず、これらの寄託乳酸菌株と実質的に同等の乳酸菌株であってもよい。実質的に同等の乳酸菌株とは、ラクトバチルス ムコサエ、ラクトバチルス パラカゼイ、ラクトバチルス プランタラム、ラクトバチルス ラムノーサス、ラクトバチルス バギナリス、リューコノストック メセンテロイデス サブスピーシーズ クレモリス、リューコノストック シュードメセンテロイデス、ペディオコッカス ペントサセウスに属する乳酸菌株であって、寄託乳酸菌株と同程度の高いエリスロポエチン産生促進作用を有する乳酸菌株を言う。「寄託乳酸菌株と同程度の高いエリスロポエチン産生促進作用を有する乳酸菌株」とは、例えば、以下の手順1)〜4)により測定したエリスロポエチン量が、各々の寄託乳酸菌株におけるエリスロポエチン量と有意差がない乳酸菌株を意味する。
1) 10%FBS、1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Sigma)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Sigma)に、ヒト肝臓癌由来細胞株HEP−3Bを6×104 cells/wellで播種し24時間培養する。
2) 培地を取り除き、各種乳酸菌加熱死菌体を50μg/mlで懸濁した培地150μlを細胞に添加して、48時間培養し、培養上清を回収し、12,000×g、4℃で10分間遠心して細胞の破片などを取り除く。
3) 前記2)で得られた細胞培養上清50μl原液をHuman Erythropoietin DuoSet(登録商標) ELISA(R&D Systems)により測定する。具体的には、発色試薬としてQuantaBluTM Fluorogenic Peroxidase Substrate Kit(Thermo)を使用して、前記2)で得られた細胞培養上清50μl中のエリスロポエチンタンパク質を発色させる。
4)発色後の溶液をCorningTM 96−Well Solid White Polystyrene Microplates(Corning)に移してプレートリーダー(Biotek)にてEx.325nm、Em.420nmで蛍光強度を測定する。
本発明の乳酸菌は、前記手順1)〜4)によりエリスロポエチン産生促進機能の評価を行った場合に、好ましくは、測定したエリスロポエチン量が、乳酸菌株を添加していないコントロールにおけるエリスロポエチン量よりも1.5倍以上多いものである。本発明の乳酸菌は、前記手順1)〜4)によりエリスロポエチン産生促進機能の評価を行った場合に、測定されたエリスロポエチン量が、乳酸菌株を添加していないコントロールにおけるエリスロポエチン量よりも、好ましくは5mIU/mL、より好ましくは10mIU/mL、さらに好ましくは15mIU/mL以上多いものである。
なお、上記の評価方法に限定されず、当業者に公知であるエリスロポエチン産生促進作用評価方法を採用して、エリスロポエチン産生促進作用を評価可能であることは言うまでもない。
また、実質的に同等の乳酸菌株は、さらに、その16S rRNA遺伝子の塩基配列が、上記寄託乳酸菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列と98%以上、好ましくは99%以上、より好ましくは100%の相同性を有し、且つ、好ましくは上記寄託乳酸菌株と同一の菌学的性質を有する。さらに、本発明の乳酸菌は、本発明の効果が損なわれない限り、寄託乳酸菌株、又はそれと実質的に同等の乳酸菌株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された乳酸菌株であってもよい。
上記のとおり、本発明の組成物は濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供した菌体、有効成分とすることができることから、製剤、飲食品、飼料の原料として広く用いることができる。死菌体は、例えば、加熱乾燥、酸処理、超音波破砕等により調製することができる。
本発明の組成物の投与対象は特に限定されず、ヒトに対して投与することができるが、投与対象はヒト以外の動物(例えば、イヌ、ネコ、ウマ又はウサギ等)であっても良い。投与対象がヒトである場合は、20歳未満の未成年、成人、男女、又は65歳以上の高齢者などに投与することができる。
本発明の組成物の摂取量は、投与対象者の症状、年齢、及び性別などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、通常成人の場合、一日当たりの菌体の摂取量として、0.5−5000mgであればよく、0.5−500mgが望ましく、0.5−50mgが最も望ましい。
本発明の組成物は、疲労感の改善、持久運動能力向上、及び/又は筋力増強のために対象に投与することができる。投与タイミングとしては、運動を行う前、運動をしている最中、及び/又は運動の後に投与することができる。運動としては、例えば、ウオーキング、ランニング、サッカー、バスケットボール、バレーボール、水泳、自転車競技及びテニス等が挙げられる。
「エリスロポエチン産生促進」は、例えば、前記手順1)〜4)によりエリスロポエチン産生促進機能の評価を行った場合に、測定されたエリスロポエチン量が、コントロールにおけるエリスロポエチン量と比較して有意に多い場合を意味し、好ましくは、測定したエリスロポエチン量が乳酸菌株を添加していないコントロールにおけるエリスロポエチン量よりも1.5倍以上多いことを意味する。
実施例に記載の方法で評価が可能である。すなわち、前記手順1)〜4)により評価が可能である。
下記(1)の各供試菌を、ラクトバチルス属、リューコノストック属、ペディオコッカス属に属する乳酸菌はMRS培地(Difco)を用いて、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属に属する乳酸菌はM17培地(Difco)、ビフィドバクテリウム属に属するビフィズス菌は、1%グルコース含有GAMブイヨン(日水)を用いてそれぞれ培養した。培養物を、生理食塩水にて2回、滅菌水にて1回洗浄し、洗浄菌体を得た。この洗浄菌体を凍結乾燥処理して菌体粉末を得た。菌体粉末を10mg/mlになるように滅菌PBS(−)で懸濁し、80℃にて30分間加熱して加熱死菌体を得た。加熱死菌体は50μg/mlとなるように10%FBS(Gibco)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Sigma)を含むDMEM(Sigma)で希釈した。
ラクトバチルス(Lactobacillus)属、リューコノストック(Leuconostoc)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属、の下記11株を供試菌とした。
Lactobacillus mucosae SBT2958(NITE P−02803)、Lactobacillus paracasei SBT0228(NITE P−02805)、Lactobacillus plantarum SBT0092(NITE P−02806)、Lactobacillus rhamnosus SBT2490(NITE P−02807)、Lactobacillus vaginalis SBT0337(NITE P−02808)、Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris SBT1395(NITE P−02809)、Leuconostoc pseudomesenteroides SBT0835(NITE P−02810)、Pediococcus pentosaseus SBT3316(NITE P−02804)、Lactococcus lactis subsp. lactisJCM5805T、Streptococcus thermophilus JCM17834T、Bifidobacterium longum subsp. longumJCM1217T。
乳酸菌によるエリスロポエチン産生促進効果に関する試験
実施例品1を以下の試験に供した。
48 well plate(BD)に、ヒト肝臓癌由来細胞株HEP−3Bを6×104 cells/wellで播種し、10%FBS(Gibco)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Sigma)を含むDMEM(Sigma)で24時間培養した。培地を取り除いた後、試験群には各種菌体を50μg/mlで懸濁した培地を、コントロール群には菌体を含まない培地を150μl添加して、48時間培養した。ポジティブコントロールとして、塩化コバルト(CoCl2、Sigma)を終濃度50μMで同様に添加した。その後、培養上清を回収し、12,000×g、4℃で10分間遠心して細胞の破片などを取り除いた。
HEP−3B細胞に、乳酸菌11株のいずれかを添加して48時間培養した時の、培養上清中へのエリスロポエチンタンパク質産生量を図1に示した。その結果、8株の乳酸菌(SBT2958、SBT0228、SBT0092、SBT2490、SBT0337、SBT1395、SBT0835、SBT3316)がエリスロポエチン産生を亢進した。一方、3株の乳酸菌基準株(JCM5805T、JCM17834T、JCM1217T)はエリスロポエチン産生を亢進しなかった。
これらの結果から、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、リューコノストック(Leuconostoc)属およびペディオコッカス(Pediococcus)属に属する乳酸菌がエリスロポエチンの産生を亢進することが明らかとなった。
(1)ラクトバチルス ムコサエ SBT2958
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
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2018年10月31日
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(2)ラクトバチルス パラカゼイ SBT0228
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2018年10月31日
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(3)ラクトバチルス プランタラム SBT0092
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2018年10月31日
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(4)ラクトバチルス ラムノーサス SBT2490
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2018年10月31日
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NITE P−02807
(5)ラクトバチルス バギナリス SBT0337
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2018年10月31日
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NITE P−02808
(6)リューコノストック メセンテロイデス サブスピーシーズ クレモリス SBT1395
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2018年10月31日
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(7)リューコノストック シュードメセンテロイデス SBT0835
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2018年10月31日
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NITE P−02810
(8)ペディオコッカス ペントサセウス SBT3316
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2018年10月31日
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NITE P−02804
Claims (12)
- ラクトバチルス(Lactobacillus)属、リューコノストック(Leuconostoc)属またはペディオコッカス(Pediococcus)属に属する菌の菌体を有効成分とするエリスロポエチン産生促進用組成物。
- Lactobacillus属、Leuconostoc属またはPediococcus属に属する菌が、ラクトバチルス ムコサエ(Lactobacillus mucosae)、ラクトバチルス パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス プランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス バギナリス(Lactobacillus vaginalis)、リューコノストック メセンテロイデス サブスピーシーズ クレモリス(Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris)、リューコノストック シュードメセンテロイデス(Leuconostoc pseudomesenteroides)、ペディオコッカス ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)から選択されるひとつ以上であることを特徴とする請求項1に記載のエリスロポエチン産生促進用組成物。
- Lactobacillus属、Leuconostoc属またはPediococcus属に属する菌が、Lactobacillus mucosae SBT2958(NITE P−02803)、Lactobacillus paracasei SBT0228(NITE P−02805)、Lactobacillus plantarum SBT0092(NITE P−02806)、Lactobacillus rhamnosus SBT2490(NITE P−02807)、Lactobacillus vaginalis SBT0337(NITE P−02808)、Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris SBT1395(NITE P−02809)、Leuconostoc pseudomesenteroides SBT0835(NITE P−02810)、Pediococcus pentosaceus SBT3316(NITE P−02804)から選択されるひとつ以上であることを特徴とする請求項2に記載のエリスロポエチン産生促進用組成物。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のエリスロポエチン産生促進用組成物を含む、エリスロポエチン産生促進用飼料組成物、エリスロポエチン産生促進用医薬組成物、又はエリスロポエチン産生促進用食品組成物。
- 新規乳酸菌ラクトバチルス ムコサエ SBT2958。
- 新規乳酸菌ラクトバチルス パラカゼイ SBT0228。
- 新規乳酸菌ラクトバチルス プランタラム SBT0092。
- 新規乳酸菌ラクトバチルス ラムノーサス SBT2490。
- 新規乳酸菌ラクトバチルス バギナリス SBT0337。
- 新規乳酸菌リューコノストック メセンテロイデス サブスピーシーズ クレモリス SBT1395。
- 新規乳酸菌リューコノストック シュードメセンテロイデス SBT0835。
- 新規乳酸菌ペディオコッカス ペントサセウス SBT3316。
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