JP2020099256A - 分離方法 - Google Patents

Abstract

【課題】血液から特定の細胞を、細胞機能を維持した状態で分離する方法の提供。【解決手段】赤血球及び白血球に結合して結合物を生成する結合剤と血液とを混合する工程と、結合物と特定の細胞とを分離する比重液を用いて、結合剤と血液との混合液に遠心分離を行って、特定の細胞が濃縮された懸濁液を得る工程と、流体力学フィルタを構成するように、入口及び出口を有する主流路、及び主流路から分岐する複数の分岐流路を備えた流路チップにおいて、主流路の入口から懸濁液を流して、流路チップの出口から細胞を取り出す工程とを含む。【選択図】図１

Description

本発明は、血液等の試料から特定の細胞を分離する分離方法に関する。

細胞などの粒子を濃縮し、分類するために、マイクロ流体デバイスを用いる流体力学フィルタという技術が提案されている（例えば特許文献１）。

特許文献１は、微粒子の濃縮等のための流路構造を開示している。特許文献１の流路構造は、途中に少なくとも１つの分岐流路を持つ流路に、粒子を含む流体と粒子を含まない流体を連続的に導入した際、流路の下流または分岐流路の下流へと導入される流量は、それぞれの流路の幅、長さ、深さ、径などにより決定され、さらに粒子の挙動は流路の大きさと流体の分配比によって支配されるということに着目した流体力学フィルタ（非特許文献１）を実現している。

特開２００７−１７５６８４号公報

M. Yamada and M. Seki, "Hydrodynamic filtration for on-chip particle concentration and classification utilizing microfluidics", Lab Chip, 5, 1233-9 (2005)

本願発明者は、流体力学フィルタによって血液等から所望の細胞を、当該細胞の機能を維持した状態で分離することについて、鋭意研究を重ねた。

本発明は、血液から特定の細胞を、細胞機能を維持した状態で分離することが行い易くできる分離方法を提供する。

本発明に係る分離方法は、血液から特定の細胞を分離する方法である。本方法は、赤血球及び白血球に結合して結合物を生成する結合剤と血液とを混合する工程と、結合物と特定の細胞とを分離する比重液を用いて、結合剤と血液との混合液に遠心分離を行って、特定の細胞が濃縮された懸濁液を得る工程と、流体力学フィルタを構成するように、入口及び出口を有する主流路、及び主流路から分岐する複数の分岐流路を備えた流路チップにおいて、主流路の入口から懸濁液を流して、流路チップの出口から細胞を取り出す工程とを含む。

本発明に係る分離方法によると、血液から可及的に白血球および赤血球を除く前処理を行った上で、流路チップにおいて特定の細胞を取り出す。これにより、血液から特定の細胞を、細胞機能を維持した状態で分離することを行い易くすることができる。

本発明の一実施形態に係るＨＤＦチップを例示する画像 ＨＤＦチップの構造を例示する平面図 分岐流路の構造を例示するＨＤＦチップの拡大図 ＨＤＦチップの動作原理を説明した図 血液を用いたＨＤＦチップの使用例を示す画像 本分離方法における中間層を例示する画像 本発明の分離方法におけるサンプルのＨＤＦチップによる処理前後の一例を示す画像 本分離方法による分離回収率の実験結果を示すグラフ ＨＤＦ−ＤＥＰチップの構成例を示す模式図

以下、添付の図面を参照して本発明に係る分離方法の実施の形態を説明する。なお、以下の各実施形態において、同様の構成要素については同一の符号を付している。

（実施形態１）
本発明に係る分離方法において、流体力学フィルタを実現する流路チップの一例として、ＨＤＦ（Hydrodynamic filtration）チップを用いる一実施形態を以下説明する。

１．ＨＤＦチップについて
ＨＤＦチップの構成例について、図１〜３を用いて説明する。図１は、本発明の一実施形態に係るＨＤＦチップ１を例示する画像である。図２は、ＨＤＦチップ１の構造を例示する平面図である。図３は、ＨＤＦチップ１におけるＨＤＦ部２の構造を例示する拡大図である。

ＨＤＦチップ１は、例えば図１に示すように透明基板で構成され、マイクロ流路によって流体力学フィルタを実現するＨＤＦ部２を備える。ＨＤＦ部２は、例えば図２，３に示すように、所定の一方向に延在する主流路２１と、主流路２１から分岐する複数の分岐流路２２とを含む。主流路２１の方向は、例えばＨＤＦチップ１の長手方向である。各々の分岐流路２２の寸法は、主流路２１を流れる液体から取り出す対象の粒子のサイズに応じて流体力学フィルタを実現するように設定される。

ＨＤＦチップ１は、主流路２１の一端（入口）に連結する２つの入口流路１１，１２と、主流路２１の他端（出口）に連結する出口流路１３とをさらに備える。一方の入口流路１２は、細胞などのサンプルを主流路２１に流入させるための流路である。他方の入口流路１１は、所望の培地などのバッファを主流路２１に流入させるための流路である。

例えば、バッファ用の入口流路１１は、主流路２１の延長線上に延在するように設けられる。サンプル用の入口流路１２は、例えばバッファ用の入口流路１１よりも、主流路２１において複数の分岐流路２２が分岐した側方に設けられる。サンプル用の入口流路１２は、所定の傾斜角度においてバッファ用の入口流路１１に合流するように形成される。サンプル用の入口流路１２の傾斜角度は、例えば４５度以上９０度未満である。

ＨＤＦ部２における複数の分岐流路２２の始端近傍である始端領域Ｒ１（図２）の拡大図を図３（Ａ）に示す。また、複数の分岐流路２２の終端近傍である終端領域Ｒ２（図２）の拡大図を図３（Ｂ）に示す。個々の分岐流路２２は、例えば始端側において第１の幅（例えば０．０１８ｍｍ）に設定され、終端側において第１の幅よりも広い第２の幅（例えば０．０３ｍｍ）に設定される。分岐流路２２毎に第１の幅から第２の幅に切り替わる位置は、例えば出口流路１３に近い流路ほど、始端側に設定される。また、分岐流路２２間の間隔は、例えば０．０３８ｍｍ〜０．０５ｍｍなど適宜、設定される。

２つの入口流路１１，１２には、例えば、図３（Ａ）に示すようにピラーフィルタ１１ａ，１２ａが設けられる。ピラーフィルタ１１ａ，１２ａは、ＨＤＦチップ１の高さ方向に延在するピラーが複数、並んで構成される。各々の入口流路１１，１２は、ピラーフィルタ１１ａ，１２ａよりも下流側においてテーパ形状を有し、上流側よりも狭めた流路幅において互いに結合する。

１−１．ＨＤＦの動作原理について
図４は、ＨＤＦチップ１の動作原理を説明した図である。図５は、血液を用いたＨＤＦチップ１の使用例を示す画像である。

ＨＤＦチップ１においては、主流路２１等において層流を形成するように、サンプル液３０及びバッファ液３１が流入される。図４に示すように、各種粒子は、主流路２１を流れる際に、各粒子の半径の分、主流路２１の側壁から離れている。主流路２１においては、主流路２１の幅方向における位置に応じて流速が変化する。各分岐流路２２に流入する流束は、主流路２１の幅方向における所定範囲に規制されることとなる。すなわち、充分に速い流速に対応する所定サイズ以上の粒子は、たとえ分岐流路２２の幅よりも小さかったとしても分岐流路２２には進まず、主流路２１を直進することとなる。

一方、上記サイズよりも小さい粒子は、主流路２１の側壁近傍を流れる際に分岐流路２２に進み、排出され得る。このような排出は、主流路２１の側壁に沿って設けられた複数の分岐流路２２により、繰り返される。主流路２１から出口に到る際には、不要な粒子の排出が充分に行われ、所望の粒子が濃縮される。

また、サンプル用の入口流路１２とバッファ用の入口流路１１により、サンプル液３０は、主流路２１の幅方向においてバッファ液３１よりも分岐流路２２側を流れる。図５に、サンプル液３０として血液を流し、バッファ液３１として培地を流した場合を例示する。図５によると、血液は赤血球が含まれているため黒っぽく見えており、一方、培地は透明色に見えている。赤血球が分岐流路２２から排出され、主流路２１を進むに従い赤血球の排出は完了し、主流路２１を流出する液体が透明（すなわち、培地）となっていることが確認できる。このように、ＨＤＦチップ１では、主流路２１の入口側から出口側に到る際に、所望の粒子を含める流体を、サンプル液３０からバッファ液３１に交換することができる。

２．分離方法について
以上のように、ＨＤＦチップ１では、流体力学的な動作原理によって粒子のサイズに応じたフィルタリング（流体力学フィルタ）を実現することができる。

従来、流体力学フィルタは、上述のような動作原理に基づき流路幅が粒子サイズよりも充分に大きく設定されることから、特に流路の詰まりは問題にならないと考えられていた（非特許文献１参照）。しかしながら、本願発明者の鋭意研究により、ＨＤＦチップ１における処理対象の種類及び処理量等によっては、詰まりの問題が発生してしまうことが判明した。

本願発明者は、上記の問題について鋭意研究を重ね、その結果、ＨＤＦチップ１における流路の詰まりを回避し易くして処理効率を格段に向上可能とする本発明の分離方法を考案するに到った。以下、本発明に係る分離方法の具体的な実施例について説明する。

２−１．実施例
以下では、癌患者の血液中に存在する癌細胞（血中循環腫瘍細胞：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ （ＣＴＣ））をＨＤＦチップ１で分離する場合に、血液の前処理（下記Ｓ１〜Ｓ９）を行う分離方法を説明する。

（ステップＳ１） 血液を、例えばＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２倍に希釈する。以下では、血液８ｍＬにＰＢＳ８ｍＬを加える例について説明する。

（ステップＳ２） また、血液（原液）１ｍＬに対して、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐを５０ｕＬ加える。本例では、血液８ｍＬとＰＢＳ８ｍＬとＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ４００ｕＬとの混合液となる。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐは、赤血球及び白血球（ＣＤ４５陽性細胞）に結合して、結合物としてロゼットを生成する結合剤の一例である。

（ステップＳ３） 上記の混合液を室温で２５分間ゆっくりと攪拌する。ステップＳ１〜Ｓ３により、血液と結合剤とが混合され、混合液を得ることができる。

（ステップＳ４） 得られた混合液をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐチューブに重層する。１本のチューブに対しては、８ｍＬの混合液を重層する。上記例の場合、チューブ２本を使用する。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐは、本実施例における比重液の一例である。

（ステップＳ５） 重層したＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐチューブに遠心分離を行う。ステップＳ５の遠心分離は、例えば、１２００×ｇにおいて２０分間、室温の環境下で行う。この際、遠心開始および終了時のブレーキは特に使用しない。

（ステップＳ６） 遠心分離後のチューブにおける中間層４を回収する。図６に中間層４を例示する。これがＣＤ４５陽性細胞除去及び赤血球除去細胞画分となる。ステップＳ６において、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐチューブ２本分の中間層４を、更なる遠心分離のための１本のチューブに回収する。

（ステップＳ７） 中間層４を回収したチューブに遠心分離を行う。ステップＳ７の遠心分離は、例えば３００×ｇにおいて１０分間、室温で行う。

（ステップＳ８） ステップＳ７で遠心分離したチューブから上清を除き、培地を加えて再度、上記と同様に遠心分離を行う。

（ステップＳ９） ステップＳ８で遠心分離したチューブから上清を除き、チューブ底に沈んでいる細胞（即ちＣＤ４５陽性細胞除去及び赤血球除去細胞画分）を培地１ｍＬに懸濁する。以上のステップＳ９までが、本分離方法の血液に対する前処理に相当する。

（ステップＳ１０） 以上の前処理によって得られた懸濁液をメッシュに通す。

（ステップＳ１１） ステップＳ１０までで調製した細胞すなわちサンプル（の懸濁液）を、ＨＤＦチップ１におけるサンプル用の入口流路１２から、同チップ１内へ流す。

（ステップＳ１２） ＨＤＦチップ１におけるバッファ用の入口流路１１からは、所望の培地を流す。ステップＳ１１，Ｓ１２において、２つの入口流路１１，１２からは、例えば同時に各々３０ｕＬ／ｍｉｎの流量を流す。この場合、１ｍＬのサンプルを上記入口流路１２から流す場合の所要時間は、一例として３３．３分になる。

以上の分離方法によると、血液から白血球と赤血球を可及的に除く前処理（Ｓ１〜Ｓ９）を行い、その後ＨＤＦチップ１を用いることにより（Ｓ１０〜Ｓ１２）、ＣＴＣのような特定の細胞を精度良く、且つ効率良く分離することができる。

図７は、本分離方法におけるサンプルのＨＤＦチップ１による処理前後の一例を示す。図７の例では、健常者の血液４ｍＬに４０００個の癌細胞株（ＭＣＦ７）をスパイクしたサンプルに対して、本分離方法を行った。図７（Ａ）は、本分離方法におけるサンプルの前処理後、即ちＨＤＦチップ１の処理前の一例を示す。図７（Ｂ）は、図７（Ａ）に続くＨＤＦチップ１の処理後の分離画分を例示する。図７（Ｃ）は、図７（Ａ）に続くＨＤＦチップ１の処理後の廃棄画分を例示する。各画分を９６穴丸底ウエルにて２４時間培養した結果を図７（Ａ）〜（Ｃ）に示す。所望の細胞として癌細胞スフェロイド５を分離できることが確認された。

また、以上の分離方法は、２時間程度という短期間で実施することができる。具体的に、ステップＳ１〜Ｓ３が２５分程であり、ステップＳ４〜Ｓ６が２０分程であり、ステップＳ７〜Ｓ９が２０分程であり、ステップＳ１０〜Ｓ１２が３３分程である。その後にスピンダウンを１０分程行っても、合計は１０８分程となる。

例えば、上記の前処理なしに、単に血液（２倍希釈）を流路に流すと詰りが多発することを経験している。またこの場合、処理能力の低さが問題となる。例えば、２倍希釈済の血液１ｍＬをチップに流しきるためには３３．３分が必要になり、つまり、血液原液０．５ｍＬをチップに流しきるためには３３．３分が必要ということとなる。これに対して、本分離方法では、上記の前処理と組み合わせることによってＨＤＦチップ１における詰りが解消でき、処理量も高くすることができる。

なお、以上のステップＳ９において、血液８ｍＬを前処理した後の細胞は、必ずしも培地１ｍＬに懸濁する必要はない。例えば、培地０．５ｍＬに懸濁してもよく、この場合には０．５ｍＬ全量をＨＤＦチップ１に流しきるためにかかる時間が約１７分となる。即ち、血液原液８ｍＬに対して１７分となり、ＨＤＦチップ１による分離のために必要な時間を半減させることができる。

さらに、本分離方法によると、細胞がＨＤＦチップ１を通過した後も細胞機能を維持した状態で得られる。つまり、ダメージなく回収を行え、機能が損なわれていない。例えば、ＣＴＣ（癌細胞）が、スフェロイド形成能を維持した状態で回収できる。このようなスフェロイド形成能の維持は、図７等の例で回収した癌細胞を培養することにより、確認することができた（図７（Ｂ））。

また、本分離方法は、簡便な装置構成で実現することができる。クリーンベンチ内に設置することが可能であり、清潔環境下での操作が可能である。また、分離した細胞を培養することが可能である。本分離方法によると、抗体分子等が結合していない、つまり非標識の細胞を調製することが可能である。

ＣＴＣの培養は一般的に困難であることが知られている。現状では培養に適した培地についても検討が続いている状況である。そこで、本分離方法のようにＨＤＦチップ１を使えば、検討したい培地に懸濁した状態でＣＴＣを回収することができる。つまり、培地置換のための洗浄の必要性もなく、洗浄に伴う細胞のロスも心配せずに済む。

本ＨＤＦチップ１によると、得られる分離画分と廃棄画分とには、顕著な差異が得られる。

図８は、本分離方法による分離回収率の実験結果を示すグラフである。図８において、横軸は癌細胞株（ＭＣＦ７）の個数を示し、縦軸は回収率を示す。図８の実験では、血液８ｍＬにそれぞれ４０個、４００個および４０００個の癌細胞株をスパイクしたサンプルに本分離方法を適用して、ＨＤＦチップ１から分離された回収結果について、回収率の評価を行った。図８に示すように、５０％以上の回収率が確認された。

また、本分離方法によると、純度７５％の癌細胞含有画分（分離画分）を調製できることも確認できた。分離精製度について、血液８ｍＬに１万個の癌細胞株をスパイクしたサンプルに本分離方法を適用して、回収した分離画分を染色後に解析した。染色には腫瘍マーカとしてはＥｐＣＡＭを用い、白血球マーカとしてはＣＤ４５を用いた。

また、本分離方法によると、分離画分について、癌細胞の生存率が９５％であること、及び癌細胞クラスターも分離可能であることも確認できた。さらに、前処理した細胞をＨＤＦチップ１で分離するだけでなく、更に連続して誘電泳動（ＤＥＰ）を行うＨＤＦ−ＤＥＰチップで分離すると、より純度の高い癌細胞を調製することが可能であった。ＨＤＦ−ＤＥＰチップの構成例を図９に示す。

図９に例示するＨＤＦ−ＤＥＰチップ６は、ＨＤＦチップ１と同様のＨＤＦ部２に加えて、誘電泳動によって細胞などの分離回収を実現するＤＥＰ部６０を備える。ＤＥＰ部６０は、流路上に設けられた互いに対向する櫛歯状の電極６１，６２を含み、外部電源７等から電極６１，６２間に交流電圧を印加することにより、誘電泳動を生じさせることができる。印加する交流電圧の周波数を適宜、調整することにより、ＣＴＣなどの所望の細胞を誘導して分離回収することができる。

３．まとめ
以上説明したように、本実施形態に係る分離方法は、血液から、ＣＴＣのような特定の細胞を分離する方法である。本方法は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（赤血球及び白血球に結合して結合物を生成する結合剤の一例）と血液とを混合する工程（Ｓ２〜Ｓ３）と、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（結合物と特定の細胞とを分離する比重液の一例）を用いて、結合剤と血液との混合液に遠心分離を行って、特定の細胞が濃縮された懸濁液を得る工程（Ｓ４〜Ｓ９）と、ＨＤＦチップ１（流体力学フィルタを構成するように、入口及び出口を有する主流路２１及び主流路２１から分岐する複数の分岐流路２２を備えた流路チップの一例）において、主流路２１の入口から懸濁液を流して、ＨＤＦチップ１の出口から細胞を取り出す工程（Ｓ１１〜Ｓ１２）を含む。

以上の分離方法によると、血液から可及的に白血球および赤血球を除く前処理を行った上で、ＨＤＦチップ１を用いることにより、血液からＣＴＣ等の特定の細胞を、細胞機能を維持した状態で分離することを行い易くすることができる。

本実施形態において、ＨＤＦチップ１は、バッファ用の入口流路１１と、サンプル用の入口流路１２とを備える。バッファ用の入口流路１１は、主流路２１の入口に連結された第１の入口流路の一例である。サンプル用の入口流路１２は、バッファ用の入口流路１１よりも分岐流路２２側において主流路２１の入口に連結された第２の入口流路の一例である。ＨＤＦチップ１の出口から細胞を取り出す工程（Ｓ１１，Ｓ１２）は、サンプル用の入口流路１２から、懸濁液を主流路２１に流す工程（Ｓ１１）と、バッファ用の入口流路１１から、培地を主流路２１に流す工程（Ｓ１２）とを含む。

以上の分離方法によると、ＨＤＦチップ１において分離する細胞について培地を交換して調整することができ、所望の細胞の分離を行い易くすることができる。

本発明に係る分離方法において、特定の細胞は、特にＣＴＣに限らず、種々の細胞であってもよい。また、本発明に係る分離方法において、結合剤はＲｏｓｓｅｔｅＳｅｐに限らず、各種の結合物を生成するものであってもよい。また、本発明に係る分離方法において、比重液は、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐに限らない。例えば、比重液は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅなどであってもよい。

１ ＨＤＦチップ
１１ バッファ用の入口流路
１２ サンプル用の入口流路
１３ 出口流路
２２ 分岐流路

Claims (4)

1. 血液から特定の細胞を分離する分離方法であって、
   赤血球及び白血球に結合して結合物を生成する結合剤と前記血液とを混合する工程と、
   前記結合物と前記特定の細胞とを分離する比重液を用いて、前記結合剤と前記血液との混合液に遠心分離を行って、前記特定の細胞が濃縮された懸濁液を得る工程と、
   流体力学フィルタを構成するように、入口及び出口を有する主流路、及び前記主流路から分岐する複数の分岐流路を備えた流路チップにおいて、前記主流路の入口から前記懸濁液を流して、前記流路チップの出口から前記細胞を取り出す工程と
   を含む分離方法。
2. 前記流路チップは、前記主流路の入口に連結された第１の入口流路と、前記第１の入口流路よりも前記分岐流路側において前記主流路の入口に連結された第２の入口流路とを備え、
   前記流路チップの出口から前記細胞を取り出す工程は、
   前記第１の入口流路から、培地を前記主流路に流す工程と、
   前記第２の入口流路から、前記懸濁液を前記主流路に流す工程とを含む
   請求項１に記載の分離方法。
3. 前記特定の細胞は、血中循環腫瘍細胞である
   請求項１又は２に記載の分離方法。
4. 前記結合剤は、前記結合物としてロゼットを生成するＲｏｓｓｅｔｅＳｅｐであり、
   前記比重液は、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐである
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の分離方法。