JP2020080677A - 培養システム - Google Patents

Abstract

【課題】灌流培養においてシンプル且つ低コストで細胞の分離が可能な技術を提供する。【解決手段】灌流培養によって細胞を培養する培養システム１０は、培地及び細胞を含む培養液２を収容する培養槽１と、培養槽１の外部で培養液２が循環する循環路３と、循環路３に接続されて培養液２を循環させる第１ポンプ４と、循環路３において培養液２が流れる向きＤ１に交差するように循環路３に接続された回収路５と、第１ポンプ４よりも吐出力が小さく、回収路５に接続されて循環路３から培養液２の一部を抜き出す第２ポンプ６とを備える。【選択図】図１

Description

本発明は、灌流培養によって細胞を培養する培養システムに関する。

培地を含む培養液を収容する培養槽の中で細胞を培養し、培養液を灌流させて培養液の中から細胞が産生する産生物を取り出す培養システムが知られている。灌流される培養液から産生物や細胞の老廃物などを分離する方法としては、ＴＦＦ（Tangential Flow Filtration）やＡＴＦ（Alternating Tangential Flow）などの膜分離、重力沈降、遠心分離、超音波を用いるＡＷＳ（Acoustic Wave Separation）などがある。

例えば、膜分離の一例として、特表２０１５−５３０１１０号公報には、複数の膜が保持液側と透過液側とを画定している濾過用のフィルタユニットを備えたタンジェンシャルフロー灌流システムが開示されている。この灌流システムでは、フィルタユニットによって、培養槽に戻す細胞と、培養液から取り出す物質とを分離している。

また、重力沈降の一例として、特許第６２３９５３２号公報には、培養液から個体（細胞）を分離して培養槽に戻すための固体分離器が開示されている。この固体分離器は、培養液から細胞と分離された産生物を取り出すための上部領域と、上部領域に接続され、水平に対して３０度〜８０度までの角度で傾斜した積層体を備えた分離領域と、分離領域に接続された下部セグメントの下方に設けられて、重力によって細胞を収集するための固体収集領域とを備えている。細胞は、重力による自然沈降によって最下部の個体収集領域に集まる。例示は省略するが、分離機に回転装置を備えて、重力の代わりに遠心力を利用して細胞を分離する方法もある（遠心分離）。

また、ＡＷＳの一例として、特表２０１７−５０２６６６号公報には、培養槽と、音響定在波細胞分離器とを備えた細胞培養用の装置が開示されている。音響定在波細胞分離器は、音響定在波を発生させる超音波圧電トーンスデューサと、音響共鳴チャンバーとを有する。細胞を含む培養液が音響共鳴チャンバーを通る際に、細胞は、音響定在波の節によって保持され、音響チャンバーからは細胞が除かれた培養液を取り出すことができる。

ところで、膜分離は、適切な膜を選択することにより高い分離能力を持たせることができる。一方、細胞を長期間培養した場合には、膜が目詰まりするおそれがあり、膜の交換などで高コストとなる場合がある。また、近年、培養バッグと称されるような、使い捨て可能な可撓性バッグを用いて細胞の培養を行うシングルユースの培養システムも実用化されている。この培養システムでは、シングルユースの培養バッグと、この培養バッグを収容して形状を保持するハウジングとを備えている（例えば、特開２０１７−３５００９号公報参照）。膜分離では、このようなシングルユースの際のコストも課題となる。

重力沈降による分離では、このような膜のコストは低減されるが、培養液を一定時間滞留させる必要があり、分離に時間を要する。また、長時間の滞留中に細胞に影響を与えるおそれがある。物質の密度差を利用した遠心分離は、短時間で効率良く細胞を分離することができるが、分離装置の構造が複雑化する傾向がある。従って、特にシングルユース化には不利である。また、超音波を用いるＡＷＳは、培養システムが高コスト化する傾向がある。

特表２０１５−５３０１１０号公報 特許第６２３９５３２号公報 特表２０１７−５０２６６６号公報 特開２０１７−３５００９号公報

上記背景に鑑みて、灌流培養において、シンプルな構造且つ低コストで細胞の分離が可能な技術の提供が望まれる。

上記に鑑みた灌流培養によって細胞を培養する培養システムは、１つの態様として、培地及び前記細胞を含む培養液を収容する培養槽と、前記培養槽の外部で前記培養液が循環する循環路と、前記循環路に接続されて前記培養液を循環させる第１ポンプと、前記循環路において前記培養液が流れる向きに交差するように、前記循環路に接続された回収路と、前記第１ポンプよりも吐出力が小さく、前記回収路に接続されて前記循環路から前記培養液の一部を抜き出す第２ポンプと、を備える。ここで、交差とは、前記循環路を前記培養液が流れる向きと、前記回収路を前記培養液が流れる向きとが同一方向でない状態にあることをいう。

この構成によれば、培養液を循環路に流通させた際に生じる慣性力を利用して、細胞と、細胞以外の物質とを分離することができる。第１ポンプによる吐出力で循環路を流通する培養液の中において、細胞による産生物などの細胞以外の物質に対して相対的に質量の大きい細胞には、相対的に大きな慣性力が作用する。さらに、回収路は、循環路において培養液が流れる方向に交差するように、循環路に接続されている。相対的に運動エネルギーの大きい細胞は進行方向を変えにくいので、細胞は、循環路から回収路側に流れにくく、循環路を通って培養槽に戻り易くなる。一方、培養液の中において細胞に対して相対的に質量の小さい物質には、細胞に比べて作用する慣性力が小さい。回収路には、第１ポンプよりも吐出力が小さいが第２ポンプが接続されているので、培養液の一部（慣性力の作用が小さい物質を含む培養液）は、循環路から回収路側に流れる。このように、本構成によれば、慣性力を利用し、灌流培養において、シンプルな構造且つ低コストで細胞の分離が可能な技術を提供することができる。

ここで、前記回収路は、前記循環路を前記培養液が流れる向きに対して、前記回収路を前記培養液が流れる向きが９０度以上となるように、前記循環路に接続されていると好適である。

この構成によれば、第１ポンプの吐出力によって流れる培養液が、循環路から回収路へと流れる際の移動経路が直角又は鋭角となる。従って、作用する慣性力が大きい細胞は、回収路へと移動しにくく、細胞と細胞以外の物質とを効率的に分離することができる。

１つの態様として、前記回収路は、前記循環路の内部に設けられた内部流路を有し、前記内部流路は、前記循環路を前記培養液が流れる向きに沿って開口する開口部を有すると好適である。

この構成によれば、循環路から回収路へと流れる際の移動経路が、反転する方向（１８０度異なる方向）となる。従って、細胞が回収路へ移動することが最も困難となり、細胞をより効率的に分離することができる。

培養システムのさらなる特徴と利点は、図面を参照して説明する実施形態についての以下の記載から明確となる。

培養システムの構成を模式的に示す図 循環路と回収路との接続形態の一例を示す図 循環路と回収路との接続形態の他の例を示す図 循環路の内部に設けられた内部流路を有する回収路の一例を示す図 回収路に対する循環路の流速の倍率と単位体積当たりの循環路の中の細胞数に対する回収路の中の細胞数の比率との関係を示すグラフ

以下、培養システムの実施形態を図面に基づいて説明する。図１に示すように、培養システム１０は、灌流培養によって細胞を培養し、細胞による産生物を回収する。灌流培養は、細胞及び培地を含む培養液を、培養槽の外部で循環させ、その途中で細胞による産生物等を抜き出し、細胞を培養槽に戻す培養方法である。抜き出される対象となるのは、例えば病原体に対する抗体（利用対象の産生物）、細胞の活動による老廃物（廃棄対象の産生物）、死亡した細胞などである。図１に示すように、培養システム１０は、培養槽１と、循環路３と、第１ポンプ４と、回収路５と、第２ポンプ６と、培地供給路７とを備えている。

培養槽１は、培養対象の細胞、及び当該細胞の培養に必要な栄養分を有する培地を含む培養液２を収容する。実験室や検査室等で用いるような小型の培養システムでは、培養槽１として例えばフラスコや培養バッグ、バイオリアクターなどを用いることもできる。循環路３は、培養槽１の外部で培養液２が循環する経路である。第１ポンプ４は、循環路３に接続されて培養液２を循環させる。培養液２は、第１ポンプ４の吐出力により、培養槽１から吸い出され、循環路３を通って再び培養槽１に戻っていく。

上述したような小型の培養システムでは、弾性変形し易い可撓性のチューブ等によって循環路３を構成することができる。循環路３がチューブ等によって構成されている場合、第１ポンプ４として、ローラーによってチューブを蠕動させることによって流体を送る蠕動型のポンプ（ペリスタルティックポンプ、チューブポンプ、ローラポンプ）を利用することができる。或いは、ポンプのインペラを密閉ケース内に収容し、当該密閉ケースの外部から磁気を作用させて非接触でインペラを回転させる磁気浮上型のポンプ（マグネットポンプ）を用いることも好適である。

回収路５は、循環路３において培養液２が流れる向き（第１の向きＤ１）に交差するように、循環路３に接続されている。第２ポンプ６は、第１ポンプ４よりも吐出力が小さいポンプであり、回収路５に接続されて循環路３から培養液２の一部を抜き出す。第２ポンプ６も、蠕動型のポンプや磁気浮上型のポンプを用いることができる。

回収路５から抜き出された培養液２は、さらに当該培養液２から産生物等を取り出す処理装置（不図示）に提供される。培養槽１中の培養液２は、回収路５へ抜き出されることによって減少する。また、培養槽１中の培養液２に含まれる培地は細胞に栄養分を与えることによって消耗する。このため、新鮮な培地が培地供給路７から補充され、培養槽１中の培養液２の液量と細胞の培養に必要な栄養分とが維持される。

回収路５は、図２又は図３に示すように、循環路３において培養液２が流れる第１の向きＤ１に対して、回収路５を培養液２が流れる第２の向きＤ２（特に回収路５における分岐部Ｂにおいて培養液２が流れる向き）が９０度以上となるように、循環路３に接続されている。尚、第１の向きＤ１と第２の向きＤ２との為す角度θは、循環路３と回収路５との分岐部Ｂを基準として（流れる向きを示すベクトルの始点として）、第１の向きＤ１（Ｄ１のベクトル）と、第２の向きＤ２（Ｄ２のベクトル）とが為す角度である。

第１の向きＤ１と第２の向きＤ２との為す角度θが９０度以上であれば、循環路３から回収路５へと分岐する際の移動経路が直角又は鋭角となる。循環路３を流れる培養液２と共に流れる細胞は、循環路３から分岐する回収路５に入らずにそのまま循環路３を進んで培養槽１に戻ることが好ましい。細胞が産生した抗体や老廃物等に比べて、細胞は大きく、その質量も大きい。従って、細胞には抗体や老廃物よりも大きい慣性力が作用する。

図２に示すように、第１の向きＤ１と第２の向きＤ２との為す角度θが直角の場合には、循環路３から回収路５への移動経路が直角となるので、質量に応じた運動エネルギーが相対的に大きく慣性力が大きい細胞は、回収路５へと移動しにくくなる。従って、分岐部Ｂにおいて、適切に細胞とその他の物質とを分離することができる。図３に示すように、第１の向きＤ１と第２の向きＤ２との為す角度θが９０度を超えた鈍角の場合には、循環路３から回収路５への移動経路が鋭角となるので、より細胞が回収路５へと移動しにくくなって好適である。

一方、培養液２の中において細胞に対して相対的に質量の小さい物質には、細胞に比べて作用する慣性力が小さい。回収路５には、第１ポンプ４よりも吐出力が小さいが第２ポンプ６が接続されているので、培養液２の一部は第２ポンプ６により吸引されて回収路５を流れる。上述したように、回収路５を流れる培養液２には、細胞は含まれにくく、回収路５を流れる培養液２の中には、抗体や老廃物などの細胞による産生物が含まれる。従って、回収路５から細胞の産生物を回収すると共に、細胞を培養槽１に戻して再利用することができる。

尚、循環路３において培養液２が流れる第１の向きＤ１に対して、回収路５を培養液２が流れる第２の向きＤ２（特に回収路５における分岐部Ｂにおいて培養液２が流れる向き）が為す角度θが１８０度に近くなるほど、細胞の分離能に優れる。従って、この角度θは、例えば１２０度以上であると好ましく、１５０度以上であるとさらに好ましい。

また、図４に示すように、回収路５が、循環路３の内部に配置される内部流路５３を備えて構成されていてもよい。ここで、内部流路５３が図４に示すように屈曲していると、循環路３の内部において内部流路５３の一部を循環路３と平行に配置することができる。即ち、循環路３を培養液２が流れる第１の向きＤ１に平行な平行流路５１を、内部流路５３の一部に形成することができる。

回収路５の平行流路５１が循環路３と平行に配置されると、回収路５は、循環路３を培養液２が流れる第１の向きＤ１に沿って開口する開口部５５を備えることができる。この開口部５５は、分岐部Ｂに相当する。開口部５５を通って培養液２が回収路５に流れ込む向き（分岐部Ｂにおける第２の向きＤ２）は、第１の向きＤ１に対して１８０度異なる向きとなる。つまり、循環路３から回収路５へと分岐する際の移動経路が、反転する方向となる。このため、細胞が回収路５へ移動することが最も困難となり（上述したように細胞の分離能が最も高くなり）、細胞を効率的に分離することができる。

上述したように、第２ポンプ６の吐出力は、第１ポンプ４の吐出力に対して小さい。しかし、第２ポンプ６の吐出力が第１ポンプ４の吐出力に近ければ、細胞が回収路５に移動し易くなる。従って、第２ポンプ６と第１ポンプ４との吐出力の差は大きい方が好ましい。図５のグラフは、発明者らによる実験等によって導かれた、回収路５に対する循環路３の流速の倍率（循環路３の流速／回収路５の流速）と、単位体積当たりの循環路３の中の細胞数に対する回収路５の中の細胞数の比率（回収路５の中の細胞数／循環路３の中の細胞数）との関係の傾向を示している。図５に示すように、流速倍率が高くなるほど、回収路５の中に含まれる細胞数が減少し、より効率的に細胞の分離が行われる。

ここで、第２ポンプ６は、吐出力が低ければ低いほど良い（回収路５の流速が低ければ低いほど良い）というものではなく、細胞の産生物を含む培養液を循環路３から回収路５に吸引するのに充分な吐出力（回収路５の流速）を有する必要がある。一方、第１ポンプ４は、第２ポンプ６の吐出力を基準として、高ければ高いほど良い（循環路３の流速が高ければ高いほど良い）というものではなく、細胞に掛かる負荷を考慮した適切な吐出力（循環路３の流速）を有することが好ましい。例えば、第１ポンプ４の吐出力が高い場合には、循環路３を流れる培養液２の流速が早くなり、細胞も勢いよく流れることになる。その結果、細胞に掛かる負荷が増大して、寿命に影響するおそれがある。

このような観点より、第１ポンプ４及び第２ポンプ６の吐出力は、細胞に掛かる負荷が許容可能な範囲内で、細胞の分離に充分な流速差を得られるように適切に設定されると好適である。一例として、単位体積当たりの循環路３の中の細胞数に対する回収路５の中の細胞数の比率を５０％以下とする場合、流速倍率は４０００〜１００００倍程度であると好適である。

１ ：培養槽
２ ：培養液
３ ：循環路
４ ：第１ポンプ
５ ：回収路
６ ：第２ポンプ
１０ ：培養システム
５１ ：内部流路
５５ ：開口部
Ｄ１ ：第１の向き（循環路を培養液が流れる向き）
Ｄ２ ：第２の向き（回収路を培養液が流れる向き）

上記に鑑みた灌流培養によって細胞を培養する培養システムは、１つの態様として、培地及び前記細胞を含む培養液を収容する培養槽と、前記培養槽の外部で前記培養液が循環する循環路と、前記循環路に接続されて前記培養液を循環させる第１ポンプと、前記循環路において前記培養液が流れる向きに交差するように、前記循環路に接続された回収路と、前記第１ポンプよりも吐出力が小さく、前記回収路に接続されて前記循環路から前記培養液の一部を抜き出す第２ポンプと、を備え、前記回収路は、前記回収路が前記循環路に接続される分岐部において前記培養液が流れる向きが、前記循環路を前記培養液が流れる向きに対して１２０度以上となるように、前記循環路に接続されている。ここで、交差とは、前記循環路を前記培養液が流れる向きと、前記回収路を前記培養液が流れる向きとが同一方向でない状態にあることをいう。

この構成によれば、培養液を循環路に流通させた際に生じる慣性力を利用して、細胞と、細胞以外の物質とを分離することができる。第１ポンプによる吐出力で循環路を流通する培養液の中において、細胞による産生物などの細胞以外の物質に対して相対的に質量の大きい細胞には、相対的に大きな慣性力が作用する。さらに、回収路は、循環路において培養液が流れる方向に交差するように、循環路に接続されている。相対的に運動エネルギーの大きい細胞は進行方向を変えにくいので、細胞は、循環路から回収路側に流れにくく、循環路を通って培養槽に戻り易くなる。一方、培養液の中において細胞に対して相対的に質量の小さい物質には、細胞に比べて作用する慣性力が小さい。回収路には、第１ポンプよりも吐出力が小さいが第２ポンプが接続されているので、培養液の一部（慣性力の作用が小さい物質を含む培養液）は、循環路から回収路側に流れる。また、回収路は、分岐部において培養液が流れる向きが、循環路を培養液が流れる向きに対して１２０度以上となるように、循環路に接続されていので、第１ポンプの吐出力によって循環路から分岐部を経て回収路へ流れる培養液の移動経路が鋭角となる。従って、作用する慣性力が大きい細胞は、回収路へと移動しにくく、細胞と細胞以外の物質とを効率的に分離することができる。このように、本構成によれば、慣性力を利用し、灌流培養において、シンプルな構造且つ低コストで細胞の分離が可能な技術を提供することができる。

１つの態様として、前記回収路は、前記循環路の内部に設けられた内部流路を有し、前記内部流路は、前記循環路を前記培養液が流れる向きに沿って開口する開口部を有すると好適である。

この構成によれば、循環路から回収路へと流れる際の移動経路が、反転する方向（１８０度異なる方向）となる。従って、細胞が回収路へ移動することが最も困難となり、細胞をより効率的に分離することができる。

また、前記回収路が、前記開口部を有して前記循環路の内部に設けられた前記内部流路を有する場合、前記内部流路は、前記循環路を前記培養液が流れる向きに平行な平行流路を有し、前記平行流路は、前記平行流路の先端に前記開口部を有すると好適である。

この構成によれば、適切に、循環路から回収路へと流れる際の移動経路が反転する方向（１８０度異なる方向）となるように、内部流路を設けることができる。

Claims (3)

1. 灌流培養によって細胞を培養する培養システムであって、
   培地及び前記細胞を含む培養液を収容する培養槽と、
   前記培養槽の外部で前記培養液が循環する循環路と、
   前記循環路に接続されて前記培養液を循環させる第１ポンプと、
   前記循環路において前記培養液が流れる向きに交差するように、前記循環路に接続された回収路と、
   前記第１ポンプよりも吐出力が小さく、前記回収路に接続されて前記循環路から前記培養液の一部を抜き出す第２ポンプと、
   を備える培養システム。
2. 前記回収路は、前記循環路を前記培養液が流れる向きに対して、前記回収路を前記培養液が流れる向きが９０度以上となるように、前記循環路に接続されている請求項１に記載の培養システム。
3. 前記回収路は、前記循環路の内部に設けられた内部流路を有し、前記内部流路は、前記循環路を前記培養液が流れる向きに沿って開口する開口部を有する請求項１又は２に記載の培養システム。
   
   

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