JP2020060392A - 前処理用キット、薬毒物スクリーニング前処理用キット、分析用試料の調製方法および分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】より迅速に、クロマトグラフィ等に用いる分析用試料を調製する。【解決手段】前処理用キットは、クロマトグラフィおよび質量分析の少なくとも一つに供する試料の前処理用キットであって、試料を含む溶液の塩析を行うための化合物が配置された容器を備え、容器の容量は、１０ｍＬよりも小さい。【選択図】図１

Description

本発明は、前処理用キット、薬毒物スクリーニング前処理用キット、分析用試料の調製方法および分析方法に関する。

食品中の残留農薬や生体試料における薬毒物等の物質は、クロマトグラフィや質量分析等により検出される。これらの物質を試料から抽出するための前処理として、ＱｕＥＣｈＥＲＳ法やその改良法等が行われている。これらの方法では、試料に有機溶媒および塩を加え、塩析により試料に含まれていた夾雑成分を除去する（非特許文献１参照）。

Anastassiades M, Lehotay SJ, Stajnbaher D, Schenck FJ. "Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and "dispersive solid-phase extraction" for the determination of pesticide residues in produce" Journal of AOAC International,（米国）, AOAC International, 2003年3月、Volume 86, Issue 2, pp.412-431

ＱｕＥＣｈＥＲＳ法やその改良法等に用いられるキット等は、少なくとも５００μＬの試料があることを前提にしており、得られる試料が少ないと効率よく分析ができない場合があった。

本発明の好ましい実施形態による前処理用キットは、クロマトグラフィおよび質量分析の少なくとも一つに供する試料の前処理用キットであって、前記試料を含む溶液の塩析を行うための化合物が配置された容器を備え、前記容器の容量は、１０ｍＬよりも小さい。
さらに好ましい実施形態では、前記容器の容量は、２００μＬ以上であり５ｍＬより小さい。
さらに好ましい実施形態では、複数の前記容器を備える。
さらに好ましい実施形態では、前記化合物は塩を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記試料はタンパク質を含み、前記化合物は、前記塩析により前記タンパク質を除去するためのものである。
さらに好ましい実施形態では、前記化合物は、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウムおよび酢酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも一つの分子である。
本発明の好ましい実施形態による薬毒物スクリーニング前処理用キットは、上述の前処理用キットを備える。
本発明の好ましい実施形態による分析用試料の調製方法は、クロマトグラフィおよび質量分析の少なくとも一つに供する分析用試料の調製方法であって、試料を含む溶液の塩析を行うための化合物が配置され、その容量が１０ｍＬよりも小さい容器を用意することと、前記容器に、少なくとも有機溶媒および試料を加え、混合することと、前記混合により得られた溶液を遠心分離することとを備える。
本発明の好ましい実施形態による分析方法は、上述の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、前記分析用試料の分析を行うことと、を備える。
さらに好ましい実施形態では、前記分析は、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、質量分析、ガスクロマトグラフィ／質量分析、または、液体クロマトグラフィ／質量分析である。

本発明によれば、塩析を利用したＱｕＥＣｈＥＲＳ法やその改良法等の前処理を、試料の量が少ない場合でも効率よく行うことができる。

図１は、一実施形態の前処理用キットを示す概念図である。 図２は、一実施形態に係る分析用試料の調製方法を説明するための概念図である。 図３は、実施例の分析において、ビーズを用いて、または用いないで試料を撹拌した場合の各ベンゾジアゼピン系化合物の回収率を示す表である。

以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。

−第１実施形態−
図１は、本実施形態の前処理用キットを示す概念図である。前処理用キット１は、試料を含む溶液の塩析のための化合物１１が格納された複数の容器（以下、前処理用容器と呼ぶ）１０を備える。前処理用容器１０は、前処理用容器本体１２と、蓋部１３とを備える。
なお、前処理用キット１は、前処理で用いられるその他の物品を含んでもよい。

前処理用キット１は、クロマトグラフィおよび質量分析の少なくとも一つを用いた分析の前処理を行うためのキットである。この分析としては、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、ＭＡＬＤＩまたはＰＥＳＩを用いた質量分析、ガスクロマトグラフィ／質量分析（以下、ＧＣ／ＭＳと呼ぶ）および液体クロマトグラフィ／質量分析（以下、ＬＣ／ＭＳと呼ぶ）が前処理により得られた液体試料を分析する上で好ましい。ここで、ＭＡＬＤＩとは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化の略であり、ＰＥＳＩとは、探針エレクトロスプレーイオン化（Ｐｒｏｂｅ ＥｌｅｃｔｒｏＳｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）の略である。前処理用キット１は、複数回の分離により試料の各成分を精度よく検出できるＧＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳの前処理に用いることがより好ましい。

好適には、前処理用キット１は、生物または再構成系等に由来する生体試料の分析の前処理を行うためのキットである。この生体試料は、タンパク質を含むことが好ましく、前処理用キット１は塩析により当該生体試料の除タンパクを行うためのキットであることが好ましい。前処理用キット１はＱｕＥＣｈＥＲＳ法やその改良法を行うためのキットであることがより好ましい。前処理用キット１は、法医学や捜査における薬毒物や食品中の残留農薬等の薬毒物のスクリーニングの前処理に用いられる薬毒物スクリーニング前処理用キットであることがさらに好ましい。

前処理用容器１０の容量は、１０ｍＬより小さい。前処理用容器１０の容量は、５ｍＬよりも小さいことが好ましく、３ｍＬよりも小さいことがさらに好ましく、２．５ｍＬよりも小さいことがより一層好ましい。前処理用容器１０の容量が小さい程、少ない量の試料で分析を行う際の前処理に適した容器となり、また、不必要に大きくないため、保管の際に占める空間を節約することができる。

さらに、発明者は、前処理容器１０の容量が小さい程、撹拌の効果が高くなることを見出した。従って、前処理用キット１は、ビーズを備えなくてよい。これにより、前処理用キット１の製造を容易にし、製造コストを下げることができる。
なお、ビーズを配置しない場合よりも、より確実に試料を混合できる可能性があるため、前処理用容器１０にステンレスビーズ等のビーズを配置してもよい。

前処理用容器１０の容量が小さすぎると、分析に必要な量の溶液を収容できなかったり、取扱いが難しくなるため、前処理用容器１０の容量は２００μＬ以上が好ましく、５００μＬ以上がより好ましい。

前処理用容器１０の形状は、特に限定されず、蓋部１３が前処理用容器本体１２と一体として形成されていてもよいし、蓋部１３と前処理用容器本体１２とが切り離された複数の部品としてそれぞれ形成されていてもよい。また、前処理用容器１０は、他の前処理用容器１０と一体として形成されていてもよく、例えば８連チューブのように所定の個数の前処理用容器１０ごとに、前処理用容器本体１２または蓋部１３が一体として形成されていてもよい。

図１には、前処理用容器１０が２４個示されているが、前処理用キット１に含まれる前処理用容器１０の個数は特に限定されない。当該個数は１以上であり、２以上が好ましく、５以上がより好ましく、１０以上がより一層好ましく、２０以上がさらに好ましい。前処理用キット１に含まれる前処理用容器１０の個数が多い程、化合物１１が格納された前処理用容器１０を購入等して補充するための作業を減らすことができる。

前処理用キット１に含まれる前処理用容器１０の個数が多すぎると、保管期間が長くなって化合物１１の活性が減少したり、あるいは保管する空間を広くとる必要があり他の物品を収納する空間が狭くなる等の問題が発生するため、当該個数は、適宜１０００以下または５００以下等にすることができる。

前処理用容器１０に配置された化合物１１は、試料を含む溶液の塩析を行うための化合物である。化合物１１は、前処理用容器１０に溶液が加えられた際に、塩析を起こし、後述の分析が所望の精度で行える程度に夾雑成分を除去するだけの十分な濃度の塩の溶液が得られるものであれば特に限定されない。化合物１１は、塩を含むことが好ましい。

好適には、化合物１１は、無水硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウムおよび酢酸ナトリウムの少なくとも一つを含む。化合物１１は、クエン酸三ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウムおよび酢酸ナトリウムのからなる群から選択される少なくとも一つの緩衝剤を含むことが好ましい。緩衝剤は試料を含む溶液のｐＨの変化を抑制し、分析対象の成分を安定化することができる。

化合物１１は固体状態でそれぞれの前処理用容器１０に格納されていることが品質管理上好ましいが、溶媒に溶解されて格納されてもよい。

前処理用キット１では、化合物１１が前処理用容器１０に小分けにされ配置されているため、化合物１１を秤量し容器に配置する手間を省き、迅速に前処理を行うことができる。特に、試料が少ないと必要な化合物１１の量も少なく秤量が難しい場合もあるが、そのような場合でも前処理用キット１を用いれば精度よく前処理を行うことができる。

化合物１１を含む前処理用容器１０の製造方法は特に限定されない。固体状態の化合物１１を秤量してそれぞれの前処理用容器１０に配置してもよいし、適当な溶媒を用いて化合物１１を所定の濃度で含む溶液を調製した後、ピペットや分注装置等を用いて所定の量の当該溶液をそれぞれの前処理用容器１０に分注して適宜乾燥させてもよい。

（分析用試料の調製方法）
図２は、前処理用キット１を用いた分析用試料の調製方法を示す概念図である。図２では、試料Ｓの分析対象の成分は水性溶媒よりも有機溶媒に親和性が高く、有機溶媒に当該成分を抽出する場合を例に説明する。

ステップＳ１００１では、化合物１１が配置された前処理用容器１０と、試料Ｓとが用意される。試料Ｓは前処理用容器１０に配置される。図２では、試料Ｓは溶液に分散され、ピペットＰ１により当該溶液が前処理用容器１０に分注される点を示したが、分注の方法は特に限定されない。また、試料Ｓは固体のまま前処理用容器１０に配置されてもよい。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００２が開始される（矢印Ａ１）。

ステップＳ１００２では、試料Ｓおよび化合物１１を含む前処理用容器１０に有機溶媒が加えられる。有機溶媒を構成する物質は特に限定されず、例えばアセトニトリル等を用いることができる。図２では、ピペットＰ２により有機溶媒が分注されているが、有機溶媒の分注の方法は特に限定されない。試料Ｓを含む溶液Ｓ１に含まれる水の量が十分でない場合には、適宜水を加えることが好ましい。さらに、所定の量の不図示の内部標準が試料Ｓを含む溶液Ｓ１に加えられる。ステップＳ１００２が終了したら、ステップＳ１００３が開始される（矢印Ａ２）。
なお、試料Ｓ、有機溶媒、水および内部標準を前処理用容器１０に加える順序は特に限定されない。

ステップＳ１００３では、試料Ｓを含む溶液Ｓ１が撹拌される。試料Ｓと、化合物１１と、水と、有機溶媒と、内部標準とが混合され、試料Ｓを含む溶液Ｓ１が塩析に供される。試料Ｓに元々含まれていたタンパク質等の夾雑成分は、塩析により析出する。撹拌の方法は特に限定されず、ボルテックスミキサー等を用いて行うことができる。撹拌後の溶液は、遠心分離機により遠心分離に供される。遠心分離の方法は特に限定されず、例えば１００００ｒｐｍ、１０分間等の条件で行うことができる。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００４が開始される（矢印Ａ３）。

ステップＳ１００４では、遠心分離の上清Ｓｎが抽出される。ステップＳ１００３の遠心分離の後、有機溶媒の層（上清Ｓｎ）に試料Ｓの分析対象の成分が抽出され、夾雑成分等は水層にまたは沈殿として存在している。上清Ｓｎの抽出方法は特に限定されず、ピペット等を用いて行うことができる。ステップＳ１００４が終了したら、ステップＳ１００５が開始される（矢印Ａ４）。
なお、ステップＳ１００３の遠心分離により得られた溶液に、第１級および第２級アミン（ＰＳＡ）、グラファイトカーボン、硫酸マグネシウムならびにＣ１８の少なくとも一つを加えて分散固相抽出を行ってもよい。ＰＳＡは糖、脂肪酸、有機酸および色素の除去に、グラファイトカーボンおよびＣ１８は無極性夾雑物の除去に、硫酸マグネシウムは水分の除去にそれぞれ有効である。

ステップＳ１００５では、上清Ｓｎが分析用試料として調製され分析に供される。上清Ｓｎはクロマトグラフィおよび質量分析の少なくとも一つに供される。上清Ｓｎは分析用試料として分析装置に導入される他、ＭＡＬＤＩによる質量分析を行う場合は、上清Ｓｎにマトリックスが加えられて結晶状の分析用試料が調製され、イオン化に供される。

本実施形態に係る分析用試料の調製方法は、クロマトグラフィおよび質量分析の少なくとも一つに供する分析用試料の調製方法であって、試料Ｓを含む溶液Ｓ１の塩析を行うための化合物１１が配置され、その容量が１０ｍＬよりも小さい前処理用容器１０を用意することと、前処理用容器１０に、水性溶媒、有機溶媒またはこれらの混合液、ならびに試料Ｓを加え、混合することと、混合により得られた溶液を遠心分離することとを備える。これにより、前処理用キット１の利点を生かし、塩析を利用したＱｕＥＣｈＥＲＳ法やその改良法等の前処理を、少ない量の試料で行う場合でも効率よく行うことができる。

本実施形態に係る分析方法は、本実施形態に係る分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、当該分析用試料の分析を行うことと、を備える。これにより、前処理用キット１の利点を生かし、塩析を利用したＱｕＥＣｈＥＲＳ法やその改良法等の前処理を伴う分析を、少ない量の試料でも効率よく行うことができる。

本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。

以下に、ビーズの有無による試料の回収率への影響を検討した実施例を示すが、本発明は下記の実施例の具体的な数値や分析条件等に限定されるものではない。

前処理において、ベンゾジアゼピン系化合物３４種類を塩析のための混合前に加えた場合と混合後に加えた場合とにおけるマススペクトルのピーク面積に基づいて回収率を算出した。前処理用容器に直径３ｍｍのビーズ（３個）を配置した場合と配置していない場合とで回収率の比較を行った。
＜１．前処理＞
硫酸マグネシウムおよび酢酸ナトリウムからなる塩１００ｍｇを２．０ｍＬの容量のチューブに配置した。ステンレスビーズを含むチューブと含まないチューブとを作成した。これらのチューブにアセトニトリル２７０μＬ、内部標準を含む混合液を３０μＬ、蒸留水２００μＬを加え、ボルテックスミキサーで混合した。混合により得られた溶液に１０μｇ／μＬジアゼパム−ｄ５を２μＬ加え、全血を１００μＬ加えてボルテックスミキサーで混合した。混合により得られた溶液を１００００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心分離した。

＜２．ＬＣ／ＭＳ＞
遠心分離により得られた上清を以下の条件で液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析に供した。
液体クロマトグラフィの条件
分析カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ ＸＢ−Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）（内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒径２．６μｍ）、ガードカラム：Ｓｅｃｕｒｉｔｙ Ｇｕａｒｄ Ｕｌｔｒａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）（内径２．１ｍｍ用）、注入量：１μＬ、カラム温度：４０℃、移動相：（Ａ）１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸水溶液；（Ｂ）１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸メタノール溶液、流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ。

質量分析の条件
温度：脱溶媒管（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｌｉｎｅ；ＤＬ）温度：２５０℃、ヒートブロック温度：４００℃、インターフェイス温度：３００℃。ガス流量：ネブライザーガス流量：２Ｌ／ｍｉｎ、ドライングガス流量：１０Ｌ／ｍｉｎ、ヒーティングガス流量：１０Ｌ／ｍｉｎ。

図３は、分析の結果を示す表である。ステンレスビーズを加えた場合と加えない場合で回収率に有意な差は観察されなかった。

１…前処理用キット、１０…前処理用容器、１１…化合物、Ｓ…試料、Ｓ１…試料を含む溶液、Ｓｎ…上清。

Claims (10)

1. クロマトグラフィおよび質量分析の少なくとも一つに供する試料の前処理用キットであって、
   前記試料を含む溶液の塩析を行うための化合物が配置された容器を備え、
   前記容器の容量は、１０ｍＬよりも小さい前処理用キット。
2. 請求項１に記載の前処理用キットにおいて、
   前記容器の容量は、２００μＬ以上であり５ｍＬより小さい前処理用キット。
3. 請求項１または２に記載の前処理用キットにおいて、
   複数の前記容器を備える前処理用キット。
4. 請求項１から３までのいずれか一項に記載の前処理用キットにおいて、
   前記化合物は塩を含む前処理用キット。
5. 請求項１から４までのいずれか一項に記載の前処理用キットにおいて、
   前記試料はタンパク質を含み、
   前記化合物は、前記塩析により前記タンパク質を除去するためのものである前処理用キット。
6. 請求項１から５までのいずれか一項に記載の前処理用キットにおいて、
   前記化合物は、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウムおよび酢酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも一つの分子である前処理用キット。
7. 請求項１から６までのいずれか一項に記載の前処理用キットを備える薬毒物スクリーニング前処理用キット。
8. クロマトグラフィおよび質量分析の少なくとも一つに供する分析用試料の調製方法であって、
   試料を含む溶液の塩析を行うための化合物が配置され、その容量が１０ｍＬよりも小さい容器を用意することと、
   前記容器に、少なくとも有機溶媒および試料を加え、混合することと、
   前記混合により得られた溶液を遠心分離することと
   を備える分析用試料の調製方法。
9. 請求項８に記載の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、
   前記分析用試料の分析を行うことと、
   を備える分析方法。
10. 請求項９に記載の分析方法において、
    前記分析は、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、質量分析、ガスクロマトグラフィ／質量分析、または、液体クロマトグラフィ／質量分析である分析方法。

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