JP2020020649A - Method and kit for predicting expression of kk-lc-1 in stomach cancer cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法及びキットに関する。 The present invention relates to a method and a kit for predicting the expression of KK-LC-1 in gastric cancer cells.
発明者らは、癌精巣抗原の一種であるＫｉｔａ−Ｋｙｕｓｈｕ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＫＫ−ＬＣ−１）タンパク質について詳細な解析を進めてきた。癌精巣抗原とは、癌細胞と、精巣・卵巣等の生殖系細胞以外では発現が認められないタンパク質の総称である（例えば、非特許文献１を参照）。 The present inventors have proceeded with detailed analysis of Kita-Kyushu lung cancer antigen-1 (KK-LC-1) protein, which is a kind of cancer testis antigen. Cancer testis antigen is a generic term for cancer cells and proteins that are not expressed in cells other than germline cells such as testis and ovary (for example, see Non-Patent Document 1).
胃癌患者の約８割は、胃癌部位においてＫＫ−ＬＣ−１を発現し、この割合は、他の癌精巣抗原と比較して顕著に高い（例えば、非特許文献２を参照）。このことから、ＫＫ−ＬＣ−１は、癌免疫療法に用いる癌抗原として有力な候補であるといえる。 About 80% of gastric cancer patients express KK-LC-1 at the site of gastric cancer, and this ratio is significantly higher than other cancer testis antigens (for example, see Non-Patent Document 2). From this, it can be said that KK-LC-1 is a strong candidate as a cancer antigen used for cancer immunotherapy.
そして、２０１７年に、ＫＫ−ＬＣ−１を発現する癌に対する免疫応答の有用性が報告された。この免疫療法を実現するためには、ＫＫ−ＬＣ−１の癌細胞における発現を簡便に検出する方法を早急に確立する必要がある。 Then, in 2017, the usefulness of an immune response against KK-LC-1 expressing cancer was reported. In order to realize this immunotherapy, it is necessary to quickly establish a method for simply detecting the expression of KK-LC-1 in cancer cells.
胃癌患者の胃癌部位の組織を用いて、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子又はタンパク質の発現を検出することは、労力と時間を要する。そこで、血液等の容易に採取できる試料を用いて、胃癌患者の胃癌部位における、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子の発現を検出することのできる技術の開発が必要である。 Detecting the expression of the KK-LC-1 gene or protein using the tissue at the site of gastric cancer of a gastric cancer patient requires labor and time. Therefore, there is a need to develop a technique that can detect the expression of the KK-LC-1 gene in a gastric cancer site of a gastric cancer patient using a sample that can be easily collected, such as blood.
しかしながら、上述したように、血液中には生殖細胞由来のＫＫ−ＬＣ−１遺伝子又はタンパク質が存在することから、血液試料を用いてＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出すると、癌患者でなくてもＫＫ−ＬＣ−１の発現が検出されてしまう。このため、血液試料を用いて胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の発現を簡便に検出することは不可能である。そこで、本発明では、胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を簡便に予測する技術を提供することを目的とする。 However, as described above, since the KK-LC-1 gene or protein derived from germ cells is present in the blood, if the expression of KK-LC-1 is detected using a blood sample, it will not be a cancer patient. Also, the expression of KK-LC-1 is detected. For this reason, it is impossible to simply detect the expression of KK-LC-1 protein in gastric cancer cells using a blood sample. Therefore, an object of the present invention is to provide a technique for simply predicting the expression of KK-LC-1 in gastric cancer cells.
本発明は、以下の態様を含む。
［１］胃癌患者のヘリコバクター・ピロリ感染を検出することと、前記胃癌患者の血液中のペプシノーゲンＩとペプシノーゲンＩＩの濃度を測定することと、を含む、前記胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法。
［２］前記ヘリコバクター・ピロリ感染を検出することが、前記胃癌患者の血液中における抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価の測定により行われ、前記胃癌患者の血液中における、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価が２０以上であり、ペプシノーゲンＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬ以下かつペプシノーゲンＩＩの濃度に対するペプシノーゲンＩの濃度の比（ＰＧＩ／ＰＧＩＩ）が３以下であることが、前記胃癌患者の胃癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現することを示す、［１］に記載の胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法。
［３］ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬と、ペプシノーゲンＩ及びペプシノーゲンＩＩの濃度測定試薬と、を含む、胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現予測用キット。
［４］前記ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬が、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の検出試薬である、［３］に記載の胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現予測用キット。
The present invention includes the following aspects.
[1] KK-LC- in gastric cancer cells of the gastric cancer patient, comprising: detecting Helicobacter pylori infection in the gastric cancer patient; and measuring the concentrations of pepsinogen I and pepsinogen II in the blood of the gastric cancer patient. Method for predicting the expression of 1.
[2] The detection of Helicobacter pylori infection is performed by measuring the antibody titer of an anti-Helicobacter pylori antibody in the blood of the gastric cancer patient, and the antibody of the anti-Helicobacter pylori antibody in the blood of the gastric cancer patient. The titer is 20 or more, the concentration of pepsinogen I is 70 ng / mL or less, and the ratio of the concentration of pepsinogen I to the concentration of pepsinogen II (PGI / PGII) is 3 or less. The method for predicting the expression of KK-LC-1 in gastric cancer cells of a gastric cancer patient according to [1], which shows expression of LC-1.
[3] A kit for predicting the expression of KK-LC-1 in gastric cancer cells of a gastric cancer patient, comprising a reagent for detecting Helicobacter pylori infection and a reagent for measuring the concentration of pepsinogen I and pepsinogen II.
[4] The kit for predicting the expression of KK-LC-1 in gastric cancer cells of gastric cancer patients according to [3], wherein the reagent for detecting Helicobacter pylori infection is a reagent for detecting an anti-Helicobacter pylori antibody.
本発明によれば、胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を簡便に予測する技術を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a technique for simply predicting the expression of KK-LC-1 in gastric cancer cells.
［胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法］
１実施形態において、本発明は、胃癌患者のヘリコバクター・ピロリ感染を検出することと、前記胃癌患者のペプシノーゲンＩとペプシノーゲンＩＩの濃度を測定することを含む、前記胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法を提供する。
[Method for predicting KK-LC-1 expression in gastric cancer cells]
In one embodiment, the present invention provides detecting KK-LC in gastric cancer cells of a gastric cancer patient, comprising detecting Helicobacter pylori infection in the gastric cancer patient and measuring the concentration of pepsinogen I and pepsinogen II in the gastric cancer patient. A method for predicting the expression of -1 is provided.
本明細書において、ＫＫ−ＬＣ−１の発現とは、転写、翻訳の過程を経て、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子から、ＫＫ−ＬＣ−１ ｍＲＮＡ又はＫＫ−ＬＣ−１タンパク質が合成されることを指す。したがって、ＫＫ−ＬＣ−１の発現とは、ＫＫ−ＬＣ−１ ｍＲＮＡの発現及びＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の発現の双方を意味する。 In the present specification, the expression of KK-LC-1 means that KK-LC-1 mRNA or KK-LC-1 protein is synthesized from the KK-LC-1 gene through the process of transcription and translation. Point. Therefore, the expression of KK-LC-1 means both the expression of KK-LC-1 mRNA and the expression of KK-LC-1 protein.
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）は、グラム陰性微好気性細菌であり、ヒトの胃に生息する場合がある。ヘリコバクター・ピロリが胃に感染することにより、慢性胃炎や胃潰瘍、さらには胃癌が引き起こされる。 Helicobacter pylori is a Gram-negative microaerobic bacterium that can inhabit the human stomach. Infection of the stomach by Helicobacter pylori causes chronic gastritis, gastric ulcers, and even gastric cancer.
ヘリコバクター・ピロリ感染の検出方法は特に限定されず、例えば、ヘリコバクター・ピロリの存在を検出する検出試薬、ヘリコバクター・ピロリの感染によって生じる炎症反応又は免疫応答を検出する検出試薬等を用いて検出することができる。 The method for detecting Helicobacter pylori infection is not particularly limited, and for example, detection using a detection reagent for detecting the presence of Helicobacter pylori, a detection reagent for detecting an inflammatory reaction or an immune response caused by infection with Helicobacter pylori, or the like. Can be.
ヘリコバクター・ピロリの存在を検出する検出試薬としては、ヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子又はタンパク質を検出する検出試薬が挙げられる。ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質としては、ウレアーゼＡ、ウレアーゼＢ等のウレアーゼ；ＦｌａＡ、ＦｌａＢ、ＦｌｉＤ、ＦｌｉＫ、ＦｌｇＥ、ＦｌｇＭ等の鞭毛タンパク質；空胞化毒素（ＶａｃＡ）；毒素随伴タンパク質（ＣａｇＡ）；好中球活性化タンパク質（ＮａｐＡ）等が挙げられる。また、ヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子としては、上述したヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。 Examples of the detection reagent for detecting the presence of Helicobacter pylori include a detection reagent for detecting a gene or protein derived from Helicobacter pylori. Examples of proteins derived from Helicobacter pylori include ureases such as urease A and urease B; flagella proteins such as FlaA, FlaB, FliD, FliK, FlgE, and FlgM; vacuolating toxin (VacA); toxin-associated protein (CagA); Sphere activating protein (NapA) and the like. Further, examples of the gene derived from Helicobacter pylori include the gene encoding the protein derived from Helicobacter pylori described above.
また、ヘリコバクター・ピロリ感染によって生じる炎症反応又は免疫応答を検出する検出試薬としては、被検者由来の血清中の抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体を検出する検出試薬、ヘリコバクター・ピロリ感染により、胃粘膜上皮細胞から放出されるＩＬ−８を検出する検出試薬、ＩＬ−８が産生誘導するＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等を検出する検出試薬等が挙げられる。 Further, as a detection reagent for detecting an inflammatory response or an immune response caused by Helicobacter pylori infection, a detection reagent for detecting an anti-Helicobacter pylori IgG antibody in a serum derived from a subject, a gastric mucosal epithelium due to Helicobacter pylori infection, Examples include a detection reagent for detecting IL-8 released from cells, and a detection reagent for detecting TNF-α, IL-1, IL-6, and the like, which are induced by IL-8 production.
胃にヘリコバクター・ピロリが感染すると、ヘリコバクター・ピロリに対する抗体が患者の血液中に産生される。これを利用して、患者の血液中の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価を解析することにより、胃におけるヘリコバクター・ピロリの感染を検出することができる。抗ヘリコバクター・ピロリ抗体は、一般的にはＩｇＧ抗体である。 When the stomach is infected with Helicobacter pylori, antibodies against Helicobacter pylori are produced in the patient's blood. By utilizing this, the infection of Helicobacter pylori in the stomach can be detected by analyzing the antibody titer of the anti-Helicobacter pylori antibody in the blood of the patient. Anti-Helicobacter pylori antibodies are generally IgG antibodies.
ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する検出試薬としては、上述したもの以外にも、尿素呼気試験法による検出試薬が挙げられる。本検出試薬は次のようなものである。まず、安定性同位元素又は放射性同位元素で標識した尿素を被検者に経口投与する。すると、ヘリコバクター・ピロリが有するウレアーゼにより同位元素で標識した尿素が加水分解され、アンモニアと同位元素で標識されたＣＯ２が発生し、呼気から放出される。そこで、この呼気を採取し、呼気中に存在する、同位元素で標識されたＣＯ２と自然界に存在するＣＯ２との比率を測定する。測定された比率に基づいてヘリコバクター・ピロリ感染を検出することができる。 Examples of the detection reagent for detecting Helicobacter pylori infection include a detection reagent based on the urea breath test method, in addition to the above. The present detection reagent is as follows. First, urea labeled with a stable isotope or a radioisotope is orally administered to a subject. Then, the urea labeled with the isotope is hydrolyzed by urease of Helicobacter pylori, and CO 2 labeled with ammonia and the isotope is generated, and is released from the exhaled breath. Therefore, the exhaled breath is collected, and the ratio of the isotope-labeled CO 2 present in the exhaled breath to the naturally occurring CO 2 is measured. Helicobacter pylori infection can be detected based on the measured ratio.
また、ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する方法は、ウレアーゼ試験法であってもよい。この試験法は、被験者から採取した胃の粘膜を、尿素を含む溶液に入れ、ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼにより産生するアンモニアが、ｐＨを上昇させることを利用した方法である。 The method for detecting Helicobacter pylori infection may be a urease test method. This test method is a method in which the stomach mucosa collected from a subject is placed in a solution containing urea, and ammonia produced by urease derived from Helicobacter pylori raises the pH.
また、ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する方法は、培養法であってもよい。この培養法は、被験者から採取した胃の粘膜を培地に入れて培養し、ヘリコバクター・ピロリの有無を判定する方法である。 Further, the method for detecting Helicobacter pylori infection may be a culture method. This culture method is a method in which the stomach mucosa collected from a subject is placed in a medium and cultured to determine the presence or absence of Helicobacter pylori.
ペプシノーゲンは胃粘膜から分泌される不活性型のタンパク質である。胃に分泌されたペプシノーゲンは、低いｐＨの環境において、プロセシングを受けて、活性型のタンパク質分解酵素であるペプシンとなる。 Pepsinogen is an inactive protein secreted from the gastric mucosa. Pepsinogen secreted into the stomach is processed into pepsin, an active proteolytic enzyme, in a low pH environment.
ペプシノーゲンは、これらを認識する抗体の種類により、ペプシノーゲンＩとＩＩに分類されている。ペプシノーゲンＩ（以下、「ＰＧＩ」という場合がある。）は、胃底部や胃体部の胃底腺から分泌され、ペプシノーゲンＩＩ（以下、「ＰＧＩＩ」という場合がある。）は、胃全体の、噴門腺、胃底腺、幽門腺、十二指腸腺から分泌される。 Pepsinogens are classified into pepsinogens I and II according to the type of antibody that recognizes them. Pepsinogen I (hereinafter sometimes referred to as “PGI”) is secreted from the fundic glands of the fundus and the stomach, and pepsinogen II (hereinafter sometimes referred to as “PGII”) is present in the whole stomach. It is secreted from the gut, fundic gland, pyloric gland, and duodenum.
胃粘膜が炎症を起こし、さらに慢性化すると、血液中のＰＧＩの濃度とＰＧＩＩの濃度は共に上昇し、ＰＧＩＩの濃度に対するＰＧＩの濃度の比（以下、「ＰＧＩ／ＰＧＩＩ」という場合がある。）は低下することが知られている。 When the gastric mucosa becomes inflamed and becomes more chronic, both the PGI concentration and the PGII concentration in the blood increase, and the ratio of the PGI concentration to the PGII concentration (hereinafter, may be referred to as “PGI / PGII”). Is known to decrease.
本実施形態における、胃癌患者の血液中の、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価及びＰＧＩ及びＰＧＩＩの濃度の測定方法は、例えば、酵素免疫測定法又は免疫凝集比濁法であってもよい。 In the present embodiment, the method for measuring the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer and the concentrations of PGI and PGII in the blood of a gastric cancer patient may be, for example, an enzyme immunoassay or an immunoagglutination nephelometry.
酵素免疫測定法としては、酵素で標識した、抗原に対する一次抗体と、抗原を混合した後、酵素の適当な基質を加えて、酵素と基質の反応による発色や発光の程度を測定する方法等が挙げられる。これらの測定値から、抗原の量を算出することができる。 As an enzyme immunoassay, there is a method in which a primary antibody against an antigen, which is labeled with an enzyme, is mixed with the antigen, and an appropriate substrate of the enzyme is added, and the degree of color development or luminescence due to the reaction between the enzyme and the substrate is measured. No. From these measurements, the amount of antigen can be calculated.
測定するシグナルの強度を増強するために、抗原に対する一次抗体と、一次抗体に対する、酵素で標識した二次抗体を用いてもよい。また、抗原と抗体の特異性を高めるために、予め抗原に対する抗体を固相に吸着させておき、抗原を固相に捕捉させる、サンドイッチ法等の公知の方法を用いてもよい。 In order to enhance the intensity of the signal to be measured, a primary antibody to the antigen and a secondary antibody labeled with an enzyme to the primary antibody may be used. Further, in order to enhance the specificity of the antigen and the antibody, a known method such as a sandwich method in which an antibody to the antigen is adsorbed on a solid phase in advance and the antigen is captured on the solid phase.
免疫凝集比濁法としては、例えば、ラテックス免疫凝集比濁法が挙げられる。この方法は、抗原に対する抗体を吸着させたラテックス粒子と、抗原を混合し、凝集したラテックスの吸光度を測定する方法である。この吸光度から、抗原の量を算出することができる。 Examples of the immunoagglutination turbidimetry include a latex immunoagglutination turbidimetry. This method is a method in which latex particles on which an antibody to an antigen is adsorbed are mixed with the antigen, and the absorbance of the latex agglomerated is measured. From this absorbance, the amount of antigen can be calculated.
実施例において後述するように、本実施形態の方法において、前記ヘリコバクター・ピロリ感染を検出することが、前記胃癌患者の血液中における抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価の測定により行われてもよい。そして、前記胃癌患者の血液中の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価が２０以上であり、ＰＧＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬ以下かつＰＧＩＩの濃度に対するＰＧＩの濃度の比（ＰＧＩ／ＰＧＩＩ）が３以下であることが、前記胃癌患者の胃癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現することを示すと判断してもよい。 As described later in Examples, in the method of the present embodiment, the detection of Helicobacter pylori infection may be performed by measuring the antibody titer of an anti-Helicobacter pylori antibody in the blood of the gastric cancer patient. When the antibody titer of the anti-Helicobacter pylori antibody in the blood of the gastric cancer patient is 20 or more, the PGI concentration is 70 ng / mL or less, and the ratio of the PGI concentration to the PGII concentration (PGI / PGII) is 3 or less. It may be determined that the above indicates that the gastric cancer cells of the gastric cancer patient express KK-LC-1.
この場合、胃癌患者の血液試料を用いて測定した抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価、ＰＧＩの濃度、ＰＧＩＩの濃度、及びＰＧＩＩの濃度に対するＰＧＩの濃度の比（ＰＧＩ／ＰＧＩＩ）から、患者を次のＡ〜Ｄの４グループに分ける。抗ヘリコバクター・ピロリ抗体としては、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体を測定することが好ましい。 In this case, the patient was determined as follows based on the antibody titer of the anti-Helicobacter pylori antibody, PGI concentration, PGII concentration, and the ratio of PGI concentration to PGII concentration (PGI / PGII) measured using a blood sample of a gastric cancer patient. A to D are divided into four groups. As the anti-Helicobacter pylori antibody, it is preferable to measure an anti-Helicobacter pylori IgG antibody.
まず、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価と、ＰＧＩ／ＰＧＩＩについて、次のように、陽性あるいは陰性に分類する。抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が２０Ｕｎｉｔ／ｍＬ未満である場合には、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陰性とする。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が２０Ｕｎｉｔ／ｍＬ以上である場合には、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陽性とする。 First, the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer and PGI / PGII are classified as positive or negative as follows. When the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer is less than 20 Unit / mL, the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer is determined to be negative. When the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer is 20 Unit / mL or more, the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer is determined to be positive.
また、ＰＧＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬ以下、かつ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが３以下である場合には、ペプシノーゲン値が陽性と判断する。また、ＰＧＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬより大きい、又は、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが３より大きい場合には、ペプシノーゲン値が陰性と判断する。 When the PGI concentration is 70 ng / mL or less and PGI / PGII is 3 or less, it is determined that the pepsinogen value is positive. If the PGI concentration is greater than 70 ng / mL or PGI / PGII is greater than 3, it is determined that the pepsinogen value is negative.
そして、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陰性であり、かつ、ペプシノーゲン値が陰性である場合には、グループＡに分類する。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陽性であり、かつ、ペプシノーゲン値が陰性である場合には、グループＢに分類する。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陽性であり、かつ、ペプシノーゲン値が陽性である場合には、グループＣに分類する。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陰性であり、かつ、ペプシノーゲン値が陽性である場合には、グループＤに分類する。 Then, if the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer is negative and the pepsinogen value is negative, it is classified into Group A. If the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer is positive and the pepsinogen value is negative, it is classified into Group B. In addition, if the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer is positive and the pepsinogen value is positive, it is classified into Group C. If the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer is negative and the pepsinogen value is positive, the substance is classified into Group D.
この測定方法及び分類は、ＡＢＣ検診法として、当業者には公知である。ＡＢＣ検診法とは、胃癌のリスクを検査する方法のひとつである。本実施形態における、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価、ＰＧＩの濃度、ＰＧＩＩの濃度は、一般的に用いられているＡＢＣ検診キット（例えば、デンカ生研株式会社製）を用いて、測定することができる。 This measurement method and classification are known to those skilled in the art as an ABC screening method. The ABC screening method is one of the methods for testing the risk of gastric cancer. In this embodiment, the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer, the PGI concentration, and the PGII concentration can be measured using a commonly used ABC screening kit (for example, manufactured by Denka Seiken Co., Ltd.). .
実施例において後述するように、グループＣに分類された患者の９４％において、胃癌部位の癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現することが明らかとなった。すなわち、グループＣに分類された患者は、非常に高い確率で胃癌部位の癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現していると予測することができる。これらの患者には、ＫＫ−ＬＣ−１を標的とした癌の免疫療法が有効であると考えられる。 As described later in Examples, it was revealed that cancer cells at the site of gastric cancer express KK-LC-1 in 94% of patients classified into Group C. In other words, patients classified into group C can predict with a very high probability that cancer cells at the site of gastric cancer express KK-LC-1. For these patients, immunotherapy of cancer targeting KK-LC-1 is considered to be effective.
［キット］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬と、ＰＧＩ及びＰＧＩＩの濃度測定試薬と、を含む、胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現予測用キットを提供する。
[kit]
(1st Embodiment)
In one embodiment, the present invention provides a kit for predicting the expression of KK-LC-1 in gastric cancer cells of gastric cancer patients, comprising a reagent for detecting Helicobacter pylori infection and a reagent for measuring the concentration of PGI and PGII.
上述したように、ヘリコバクター・ピロリ感染の検出は、例えば、ヘリコバクター・ピロリの存在を検出する方法、ヘリコバクター・ピロリの感染によって生じる炎症反応又は免疫応答を検出する方法、尿素呼気試験法、ウレアーゼ試験法、培養法等により行うことができる。 As described above, detection of Helicobacter pylori infection includes, for example, a method for detecting the presence of Helicobacter pylori, a method for detecting an inflammatory response or an immune response caused by infection with Helicobacter pylori, a urea breath test method, and a urease test method. , A culture method or the like.
したがって、ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬としては、ヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子又はタンパク質を検出する検出試薬、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体を検出する検出試薬、ＩＬ−８を検出する検出試薬、ＩＬ−８が産生誘導するＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等を検出する検出試薬、尿素呼気試験法による検出試薬、ウレアーゼ試験法による検出試薬、培養法による検出試薬等が挙げられる。 Therefore, as a detection reagent for Helicobacter pylori infection, a detection reagent for detecting a gene or protein derived from Helicobacter pylori, a detection reagent for detecting an anti-Helicobacter pylori IgG antibody, a detection reagent for detecting IL-8, and a detection reagent for IL-8 Detection reagents for detecting TNF-α, IL-1, IL-6, etc., which are induced to be produced by E. coli, detection reagents by the urea breath test method, detection reagents by the urease test method, detection reagents by the culture method, and the like.
また、ＰＧＩ及びＰＧＩＩの濃度測定試薬は、例えば、酵素免疫測定法による測定試薬であってもよいし、免疫凝集比濁法による測定試薬であってもよい。 Further, the reagent for measuring the concentration of PGI and PGII may be, for example, a measuring reagent by an enzyme immunoassay or a measuring reagent by an immunoagglutination turbidimetric method.
ヘリコバクター・ピロリの感染が検出され、ペプシノーゲン値が陽性である場合、高確率で胃癌部位の癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現していると予測することができる。 If the infection of Helicobacter pylori is detected and the pepsinogen level is positive, it can be predicted with high probability that the cancer cells at the stomach cancer site express KK-LC-1.
（第２実施形態）
第１実施形態のキットにおいて、ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬は、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の検出試薬であってもよい。第２実施形態のキットは、ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬が、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の検出試薬に特定されている点において、第１実施形態のキットと主に異なる。
(2nd Embodiment)
In the kit of the first embodiment, the detection reagent for Helicobacter pylori infection may be a detection reagent for an anti-Helicobacter pylori antibody. The kit of the second embodiment mainly differs from the kit of the first embodiment in that a detection reagent for Helicobacter pylori infection is specified as a detection reagent for an anti-Helicobacter pylori antibody.
第２実施形態のキットによる、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧの検出、ＰＧＩ及びＰＧＩＩの濃度測定に用いられる測定法は、従来のＡＢＣ検診法に用いられるキットと同様の測定方法を用いるものであってもよい。 The measurement method used for the detection of anti-Helicobacter pylori IgG and the concentration measurement of PGI and PGII by the kit of the second embodiment may use the same measurement method as the kit used for the conventional ABC screening method. Good.
抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価、ＰＧＩ、ＰＧＩＩを測定するために、胃癌患者から血液を採取し、血清や血漿等を得る方法としては、公知の方法を利用することができる。 In order to measure the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer, PGI, and PGII, a known method can be used as a method for collecting blood from a gastric cancer patient and obtaining serum, plasma, and the like.
測定され、又は算出された、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価、ＰＧＩ、ＰＧＩＩ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩをもとに、上述した分類方法により、胃癌患者をグループＡ〜Ｄに分類する。その結果、グループＣに分類された患者は、高確率で胃癌部位の癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現していると予測することができる。 Based on the measured or calculated anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer, PGI, PGII, and PGI / PGII, gastric cancer patients are classified into groups A to D according to the classification method described above. As a result, patients classified into group C can be predicted with high probability that cancer cells at the site of gastric cancer express KK-LC-1.
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
［実験例１］
（胃癌患者のＡＢＣ検診）
胃癌患者の胃癌細胞についてＡＢＣ検診法を実施し、これによりＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測できるかを検討した。
[Experimental example 1]
(ABC screening of gastric cancer patients)
An ABC screening method was performed on gastric cancer cells of gastric cancer patients, and it was examined whether or not this could predict the expression of KK-LC-1.
胃癌と診断された７７名の患者について、手術前の血液を採取した。採取した血液から血清を分離した。 Preoperative blood was collected from 77 patients diagnosed with gastric cancer. Serum was separated from the collected blood.
また、患者の胃癌部位を切除する手術を行った後、切除した腫瘍部位を回収した。続いて、切除した腫瘍部位から、全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを調製した。 In addition, after performing surgery to resect the stomach cancer site of the patient, the resected tumor site was collected. Subsequently, total RNA was prepared from the excised tumor site, and cDNA was prepared.
続いて、調製したｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１に示すセンスプライマー及び配列番号２に示すアンチセンスプライマーを用いて、４０サイクルのＰＣＲを行った。続いて、ＰＣＲ後の産物をアガロース電気泳動により展開し、３４２ｂｐの増幅産物の有無を判定した。判定結果から、腫瘍部位におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現の有無を判断した。 Subsequently, 40 cycles of PCR were performed using the prepared cDNA as a template and the sense primer shown in SEQ ID NO: 1 and the antisense primer shown in SEQ ID NO: 2. Subsequently, the product after PCR was developed by agarose electrophoresis, and the presence or absence of a 342 bp amplification product was determined. From the results of the determination, the presence or absence of KK-LC-1 expression at the tumor site was determined.
一方、以下に述べる方法により、各患者の血液中の、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価、ＰＧＩの濃度、ＰＧＩＩの濃度を測定した。また、ＰＧＩの濃度、ＰＧＩＩの濃度に基づいて、ＰＧＩ／ＰＧＩＩを算出した。 On the other hand, anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer, PGI concentration, and PGII concentration in the blood of each patient were measured by the methods described below. Further, PGI / PGII was calculated based on the concentrations of PGI and PGII.
ＰＧＩの濃度は、市販のキット（商品名「Ｈｕｍａｎ Ｐｅｐｓｉｎｏｇｅｎ Ｉ ＥＬＩＳＡ」、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、次に述べる方法により、測定した。 The concentration of PGI was measured using a commercially available kit (trade name “Human Pepsinogen I ELISA”, RayBiotech) according to the method described below.
まず、既知濃度のＰＧＩ溶液と、希釈した患者の血清を、抗ＰＧＩ抗体でコートされたマイクロウェルプレートに入れた。その後、ウェルを洗浄した。この結果、ＰＧＩがウェルに捕捉された。 First, a known concentration of a PGI solution and diluted patient serum were placed in a microwell plate coated with an anti-PGI antibody. Thereafter, the wells were washed. As a result, PGI was captured in the well.
続いて、ビオチン標識された抗ＰＧＩ抗体を各ウェルに加えた。続いて、ウェルを洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたストレプトアビジンを各ウェルに加えた。 Subsequently, a biotin-labeled anti-PGI antibody was added to each well. Subsequently, after washing the wells, horseradish peroxidase (HRP) labeled streptavidin was added to each well.
続いて、ウェルを洗浄した後、基質として、３，３，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）を各ウェルに加え、発色させた。 Subsequently, after the wells were washed, 3,3,5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) was added as a substrate to each well to develop color.
次に、発色させた試料の吸光度を測定した。続いて、既知濃度のＰＧＩの吸光度に基づいて、検量線を作成した。続いて、作成した検量線に基づいて、試料の吸光度からＰＧＩの濃度を算出した。本キットを用いた場合、濃度が１００ｐｇ／ｍＬ〜１０００ｐｇ／ｍＬの範囲にあるＰＧＩの濃度を測定することが可能である。 Next, the absorbance of the colored sample was measured. Subsequently, a calibration curve was created based on the absorbance of PGI at a known concentration. Subsequently, the concentration of PGI was calculated from the absorbance of the sample based on the prepared calibration curve. When this kit is used, it is possible to measure the concentration of PGI having a concentration in the range of 100 pg / mL to 1000 pg / mL.
次に、患者の血清を加えた試料の吸光度と、検量線を用いて、患者の血清中に含まれるＰＧＩの濃度を算出した。 Next, the concentration of PGI contained in the serum of the patient was calculated using the absorbance of the sample to which the serum of the patient was added and the calibration curve.
また、ＰＧＩＩの濃度は、市販のキット（商品名「Ｈｕｍａｎ Ｐｅｐｓｉｎｏｇｅｎ ＩＩ ＥＬＩＳＡ」、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、ＰＧＩの濃度の測定方法と同様にして測定した。 The concentration of PGII was measured using a commercially available kit (trade name “Human Pepsinogen II ELISA”, RayBiotech) in the same manner as the method of measuring the concentration of PGI.
また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価は、市販のキット（商品名「Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ ＩｇＧ （Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）」、フェニックス・ファーマシューティカルズ社）を用いて、次に述べる方法により、測定した。 The anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer was measured using a commercially available kit (trade name “H. pylori IgG (Human) ELISA Kit (quantitative)”, Phoenix Pharmaceuticals, Inc.) according to the method described below. did.
まず、抗体価が既知である、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体を含む溶液を調製した。続いて、抗体価が既知の抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体を含む溶液と、希釈した患者の血清を、ヘリコバクター・ピロリ抗原でコートされたマイクロウェルプレートに入れた。その後、ウェルを洗浄した。この結果、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧがウェルに捕捉された。 First, a solution containing an anti-Helicobacter pylori IgG antibody having a known antibody titer was prepared. Subsequently, a solution containing an anti-Helicobacter pylori IgG antibody having a known antibody titer and the diluted patient serum were placed in a microwell plate coated with Helicobacter pylori antigen. Thereafter, the wells were washed. As a result, anti-Helicobacter pylori IgG was captured in the well.
続いて、ウェルを洗浄した後、ＨＲＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を各ウェルに加えた。続いて、ウェルを洗浄した後、ＴＭＢを各ウェルに加え、発色させた。 Subsequently, after washing the wells, an HRP-labeled anti-human IgG antibody was added to each well. Subsequently, after the wells were washed, TMB was added to each well to develop color.
次に、発色させた試料の吸光度を測定した。続いて、既知の抗体価の抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体の吸光度に基づいて、検量線を作成した。本キットを用いた場合、抗体価が１０Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬの範囲にあるＩｇＧを測定することが可能である。 Next, the absorbance of the colored sample was measured. Subsequently, a calibration curve was prepared based on the absorbance of an anti-Helicobacter pylori IgG antibody having a known antibody titer. When this kit is used, it is possible to measure IgG having an antibody titer in the range of 10 U / mL to 100 U / mL.
次に、患者の血清を加えた試料の吸光度と、検量線を用いて、患者の血清中に含まれる抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体の抗体価を算出した。 Next, the antibody titer of the anti-Helicobacter pylori IgG antibody contained in the serum of the patient was calculated using the absorbance of the sample to which the serum of the patient was added and the calibration curve.
各患者の血液試料の、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価を、胃癌細胞の定量ＰＣＲ法に基づいて判定した、ＫＫ−ＬＣ−１陽性のグループとＫＫ−ＬＣ−１陰性のグループに分けて、それぞれ平均値を算出した。算出した平均値を表１に示す。 The anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer of each patient's blood sample was divided into a KK-LC-1 positive group and a KK-LC-1 negative group, which were determined based on a quantitative PCR method for gastric cancer cells. The average was calculated. Table 1 shows the calculated average values.
次に、各患者の血液試料の、ＰＧＩとＰＧＩＩの値から、ＰＧＩ／ＰＧＩＩを算出した。続いて、ＰＧＩ、ＰＧＩＩ、及びＰＧＩ／ＰＧＩＩを、胃癌細胞の定量ＰＣＲ法に基づいて判定した、ＫＫ−ＬＣ−１陽性のグループとＫＫ−ＬＣ−１陰性のグループに分けて、それぞれ平均値を算出した。算出した平均値を表１に示す。 Next, PGI / PGII was calculated from the values of PGI and PGII of the blood sample of each patient. Subsequently, PGI, PGII, and PGI / PGII were divided into a KK-LC-1 positive group and a KK-LC-1 negative group, which were determined based on a quantitative PCR method for gastric cancer cells. Calculated. Table 1 shows the calculated average values.
その結果、ＫＫ−ＬＣ−１陽性グループの抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価の平均値は、ＫＫ−ＬＣ−１陰性グループの抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価の平均値に比べて、有意に高かった（Ｐ＝０．０１５９，Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ．）。 As a result, the average value of anti-Helicobacter pylori IgG antibody titers in the KK-LC-1 positive group was significantly higher than the average value of anti-Helicobacter pylori IgG antibody titers in the KK-LC-1 negative group ( P = 0.0159, Wilcoxon signed-rank test.).
また、ＫＫ−ＬＣ−１陽性グループのＰＧＩ／ＰＧＩＩの平均値は、ＫＫ−ＬＣ−１陰性グループのＰＧＩ／ＰＧＩＩの平均値に比べて、有意に低かった（Ｐ＝０．００７７，Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ．）。 The average of PGI / PGII in the KK-LC-1 positive group was significantly lower than the average of PGI / PGII in the KK-LC-1 negative group (P = 0.0077, Wilcoxon signed-). rank test.).
さらに、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価と、ＰＧＩ／ＰＧＩＩについて、次のように、陽性又は陰性に分類した。すなわち、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が２０未満である場合には、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陰性、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が２０以上である場合には、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陽性とした。 Furthermore, the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer and PGI / PGII were classified as positive or negative as follows. That is, when the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer is less than 20, the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer is negative, and when the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer is 20 or more, the anti-Helicobacter pylori IgG antibody is The value was positive.
また、ＰＧＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬ以下、かつ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが３以下である場合には、ペプシノーゲン値が陽性とした。また、ＰＧＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬより高く、または、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが３より大きい場合には、ペプシノーゲン値が陰性とした。 When the PGI concentration was 70 ng / mL or less and PGI / PGII was 3 or less, the pepsinogen value was determined to be positive. When the concentration of PGI was higher than 70 ng / mL or when PGI / PGII was higher than 3, the pepsinogen value was regarded as negative.
次に、患者の血液試料の測定結果をＡ〜Ｄの４個のグループに分類した。すなわち、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陰性であり、かつ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが陰性である場合には、グループＡに分類した。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陽性であり、かつ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが陰性である場合には、グループＢに分類した。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陽性であり、かつ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが陽性である場合には、グループＣに分類した。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陰性であり、かつ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが陽性である場合には、グループＤに分類した。 Next, the measurement results of the patient's blood sample were classified into four groups A to D. That is, when the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer was negative and PGI / PGII was negative, it was classified into Group A. In addition, when the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer was positive and PGI / PGII was negative, it was classified into Group B. In addition, when the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer was positive and PGI / PGII was positive, it was classified into Group C. In addition, when the anti-Helicobacter pylori IgG antibody titer was negative and PGI / PGII was positive, it was classified into Group D.
７７名の患者について、胃癌細胞の定量ＰＣＲ法に基づいて判定した、ＫＫ−ＬＣ−１の検出結果と、血液試料に基づいて判定した、Ａ〜Ｄのグループへの分類結果を、表２に示す。また、各グループについて、胃癌細胞の定量ＰＣＲ法に基づいて判定した、ＫＫ−ＬＣ−１ ｍＲＮＡの発現が陽性である割合を算出した。この結果を表３に示す。表３中、カッコ内の値の分母は各グループに分類された患者の数を示し、分子は胃癌細胞の定量ＰＣＲ法に基づいて判定した、ＫＫ−ＬＣ−１ ｍＲＮＡの発現が陽性である患者の数を示す。 Table 2 shows the detection results of KK-LC-1 determined based on the quantitative PCR method for gastric cancer cells and the results of classification into groups A to D determined based on the blood samples for 77 patients. Show. In addition, for each group, the percentage of positive expression of KK-LC-1 mRNA, which was determined based on the quantitative PCR method for gastric cancer cells, was calculated. Table 3 shows the results. In Table 3, the denominator of the value in parentheses indicates the number of patients classified into each group, and the numerator was determined based on the quantitative PCR method for gastric cancer cells, and the patient with positive expression of KK-LC-1 mRNA was used. Indicates the number of
その結果、Ｃのグループに分類された４９名の胃癌患者のうち、９４％にあたる４６名の胃癌患者が、胃癌部位の胃癌細胞においてＫＫ−ＬＣ−１の発現が陽性であることが明らかになった。 As a result, of the 49 gastric cancer patients classified into group C, 94% (46 gastric cancer patients) were found to have positive expression of KK-LC-1 in gastric cancer cells at the site of gastric cancer. Was.
この結果は、胃癌患者に対して、上述の方法でＡＢＣ診断を行うことにより、胃癌患者の胃癌部位の組織を用いなくても、胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を簡便に予測できることが明らかになった。 This result indicates that the expression of KK-LC-1 in gastric cancer cells can be easily predicted without using the tissue at the site of gastric cancer of gastric cancer patients by performing ABC diagnosis on gastric cancer patients by the above-described method. It was revealed.
本発明によれば、胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を簡便に予測する技術を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a technique for simply predicting the expression of KK-LC-1 in gastric cancer cells.
Claims (4)
前記胃癌患者の血液中のペプシノーゲンＩとペプシノーゲンＩＩの濃度を測定することと、を含む、
前記胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法。 Detecting Helicobacter pylori infection in gastric cancer patients;
Measuring the concentration of pepsinogen I and pepsinogen II in the blood of the gastric cancer patient,
A method for predicting the expression of KK-LC-1 in gastric cancer cells of the gastric cancer patient.
前記胃癌患者の血液中における、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価が２０以上であり、ペプシノーゲンＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬ以下かつペプシノーゲンＩＩの濃度に対するペプシノーゲンＩの濃度の比（ＰＧＩ／ＰＧＩＩ）が３以下であることが、前記胃癌患者の胃癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現することを示す、請求項１に記載の胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法。 Detecting the Helicobacter pylori infection is performed by measuring the antibody titer of an anti-Helicobacter pylori antibody in the blood of the gastric cancer patient,
The antibody titer of the anti-Helicobacter pylori antibody in the blood of the gastric cancer patient is 20 or more, the concentration of pepsinogen I is 70 ng / mL or less, and the ratio of the concentration of pepsinogen I to the concentration of pepsinogen II (PGI / PGII) is 3 The method for predicting the expression of KK-LC-1 in gastric cancer cells of a gastric cancer patient according to claim 1, wherein the following is indicated that the gastric cancer cells of the gastric cancer patient express KK-LC-1.
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