JP2020000051A - アプタマーの創製が可能か否かの判定方法及びそれを利用したアプタマーの創製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ここで、G4PAS法は、標的蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域中又は該遺伝子の転写を調節する転写調節因子の遺伝子のプロモーター領域中の1又は複数のG4構造と同一の塩基配列を持つ1又は複数のアプタマーを作製するステップと、
作製したアプタマーが標的蛋白質と結合することを確認するステップと、
を含む方法である、前記判定方法、を提供する。
所望の標的蛋白質に結合するアプタマーの創製方法であって、
前記標的蛋白質が核移行シグナルを有するか否か又は前記標的蛋白質が核内蛋白質か否かを調べるステップと、
該標的蛋白質が核移行シグナルを有する場合又は核内蛋白質である場合に、
該標的蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域中又は該遺伝子の転写を調節する転写調節因子の遺伝子のプロモーター領域中の1又は複数のG4構造と同一の塩基配列を持つ1又は複数のアプタマーを作製するステップと、
作製したアプタマーが標的蛋白質と結合するか否かを確認するステップと、
を含む、標的蛋白質と結合するアプタマーの創製方法を提供する。
(1) 標的蛋白質遺伝子プロモーター領域中に存在するG4構造形成配列の探索
標的蛋白質としては下記表1に示す19種類の疾患関連蛋白質を用いた。各標的蛋白質をコードする遺伝子プロモーター領域を、UCSC genome browser (https://genome. ucsc.edu/)によって抽出した。具体的には、遺伝子の転写開始点から上流、下流それぞれ1 kbpの範囲の塩基配列を取得した。取得した塩基配列中に存在する、G4形成可能配列(PQS)の探索は、QGSR mapper (http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/index. php) (Kikin et al., 2006) を用いて行った。その際、以下の条件を満たす塩基配列をPQSとして抽出した。
G2 < N1-7G2 < N1-7G2 < N1-7G2 <
得られたPQSを化学合成した後、標的蛋白質への結合能を調べるために、SPR解析を行った。また、結合が観察されたPQSに関して、その構造評価を行うために、CDスペクトラムを測定した。
測定にはBiacoreT200を用いた。各PQSをTBSバッファー(10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 100 mM KCl含有又は非含有; pH 7.4) に溶解後、95℃で10分間熱処理を行い、25℃に除冷することでフォールディングを行った。各標的蛋白質を、アミンカップリングを介してCM5センサーチップ上に2000から4000 RU程度固定し、そこに調製したPQSをインジェクトし、結合させた(結合時間(Association time): 120秒、解離時間(Dissociation time): 120秒、 流速: 30mL/min、25℃)。 その後、BIAevaluation software (GE Healthcare).を用いてフィッティングを行い、乖離定数(KD)を求めた。
標的蛋白質への結合が観察されたPQSに関してCDスペクトラムを測定することによりG4構造の形成を確認した。すなわち、各DNAオリゴヌクレオチドをTrisバッファー (10 mM Tris-HCl, pH 7.4) または TBSバッファー (10 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, pH 7.4)によって 2μMになるように希釈し、95℃で10分間熱処理後に、25℃に除冷することでフォールディングを行った。その後、220-320nmの範囲でのCDスペクトラム測定を、日本分光のJ-820を用いて行った。その際の光路長は10mm, 温度は20℃で測定を行った。
標的蛋白質へのPQSを獲得することができた20種類の蛋白質について、NLSを有するかどうかを調べた。調査にはウェブツールであるNLSDB (https://rostlab.org/services/nlsdb/) (Nair et al., 2003)、またはLocSigDB (http://genome.unmc.edu/LocSigDB/) (Negi et al., 2015)を用いた。もし、NLSDBまたはLocSigDBのどちらか一方でもNLSを有するという結果を出した場合に、標的蛋白質にはNLSが存在すると判断した。 また、複数のアイソフォームが存在する蛋白質については全てのアイソフォームについて調査を行った。
Claims (10)
- 所望の標的蛋白質に結合するアプタマーが、G4PAS法により創製可能か否かの判定方法であって、前記標的蛋白質が核移行シグナルを有するか否か、又は前記標的蛋白質が核内蛋白質であるか否かを調べることを含み、核移行シグナルが存在する場合又は核内蛋白質である場合に、G4PAS法により前記アプタマーを創製可能であると判定する方法であり、
ここで、G4PAS法は、標的蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域中又は該遺伝子の転写を調節する転写調節因子の遺伝子のプロモーター領域中の1又は複数のG4構造と同一の塩基配列を持つ1又は複数のアプタマーを作製するステップと、
作製したアプタマーが標的蛋白質と結合することを確認するステップと、
を含む方法である、前記判定方法。 - 前記標的蛋白質が核移行シグナルを有するか否かを調べることを含む、請求項1記載の方法。
- 所望の標的蛋白質に結合するアプタマーの創製方法であって、
前記標的蛋白質が核移行シグナルを有するか否か又は前記標的蛋白質が核内蛋白質か否かを調べるステップと、
該標的蛋白質が核移行シグナルを有する場合又は核内蛋白質である場合に、
該標的蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域中又は該遺伝子の転写を調節する転写調節因子の遺伝子のプロモーター領域中の1又は複数のG4構造と同一の塩基配列を持つ1又は複数のアプタマーを作製するステップと、
作製したアプタマーが標的蛋白質と結合するか否かを確認するステップと、
を含む、標的蛋白質と結合するアプタマーの創製方法。 - 前記標的蛋白質が核移行シグナルを有するか否かを調べるステップを含む、請求項3記載の方法。
- 請求項3又は4記載の方法により創製されたアプタマー若しくは該アプタマーと95%以上の配列同一性を有する塩基配列を持ち、かつG4構造を含み、標的蛋白質と結合するアプタマー又はこれらのアプタマーの塩基配列を含む塩基配列を持ち標的蛋白質と結合するアプタマーを合成することを含む、アプタマーの製造方法。
- 請求項3又は4記載の方法により創製されたアプタマーの塩基配列又は該塩基配列を含む塩基配列を持つアプタマーを合成することを含む請求項5記載の方法。
- 配列番号84〜91のいずれかで示される塩基配列、若しくはこれらの各塩基配列との配列同一性が95%以上である塩基配列を持ち、かつ、G4構造を含み、PDGF-BBと結合するアプタマー、又は該アプタマーの塩基配列を含む塩基配列を持ちPDGF-BBと結合するアプタマー。
- 配列番号163で示される塩基配列、若しくはこの塩基配列との配列同一性が95%以上である塩基配列を持ち、かつ、G4構造を含み、ApoE4と結合するアプタマー、又は該アプタマーの塩基配列を含む塩基配列を持ちApoE4と結合するアプタマー。
- 配列番号156〜162のいずれかで示される塩基配列、若しくはこれらの各塩基配列との配列同一性が95%以上である塩基配列を持ち、かつ、G4構造を含み、Annexin A2と結合するアプタマー、又は該アプタマーの塩基配列を含む塩基配列を持ちAnnexin A2と結合するアプタマー。
- 配列番号185、187、188、194、195、199、202、204のいずれかで示される塩基配列、若しくはこれらの各塩基配列との配列同一性が95%以上である塩基配列を持ち、かつ、G4構造を含み、SP1と結合するアプタマー、又は該アプタマーの塩基配列を含む塩基配列を持ちSP1と結合するアプタマー。
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014010640A1 (ja) * | 2012-07-10 | 2014-01-16 | 国立大学法人東京農工大学 | アプタマーの製造方法 |
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2018
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2014010640A1 (ja) * | 2012-07-10 | 2014-01-16 | 国立大学法人東京農工大学 | アプタマーの製造方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
YOKOYAMA, T. ET AL.: "Development of HGF-Binding Aptamers With the Combination of G4 Promoter-Derived Aptamer Selection an", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 114, no. 10, JPN6022026122, 2017, pages 2196 - 2203, ISSN: 0004807277 * |
YOSHIDA, W. ET AL.: "Aptamer Selection Based on G4-Forming Promoter Region", PLOS ONE, vol. Vol.8, Issue 6, JPN7022002955, 2013, pages 65497 - 1, ISSN: 0004807278 * |
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