JP2019532030A - 化学療法誘発性末梢性ニューロパシーおよび難聴を処置または予防するためのｂｃｌ−ｗポリペプチドおよび模倣物 - Google Patents

化学療法誘発性末梢性ニューロパシーおよび難聴を処置または予防するためのｂｃｌ−ｗポリペプチドおよび模倣物 Download PDF

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Abstract

必要とする対象において化学療法誘発性末梢性ニューロパシーおよび難聴の処置または予防のための組成物および方法を提供する。方法は、ｂｃｌｗタンパク質、そのＢＨ４ドメイン含有フラグメント、またはｂｃｌｗ模倣物を対象に投与することを含む。例示的なｂｃｌｗ模倣物も提供する。

Description

関連出願に対する相互参照
本願は、２０１６年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／３８０，０４８号の優先権の利益を主張し、この内容をその全体においてここに出典明示により包含させる。
背景
長距離にわたる軸索は、神経回路内で迅速な伝達を可能にするが、損傷および変性に対して特に弱い。したがって、軸索変性は、回路機能性を損ない、多数の神経障害の顕著な構成要素である。癌を処置するために必要とされる多くの化学療法薬は、長距離軸索（例えば、末梢感覚または運動ニューロン軸索）を損傷し、触感障害および持続性の痛みを伴う化学療法誘発性末梢性ニューロパシー（ＣＩＰＮ）を引き起こし得る。現在、ＣＩＰＮの分子メカニズムは理解されておらず、利用できる処置は存在しない。ＣＩＰＮを処置または予防するための組成物および方法を提供するという満たされていない要求が存在する。
音楽、警告の手がかり、言葉、および他の環境的刺激を感知し、反応し、知覚する能力は、聴覚神経系に依存する。ヒトの聴覚は、行動、種内伝達、および他の重要な機能を導くために他の感覚情報と統合されることができる神経作用のパターンへの音の刺激の変換によって可能となる。１０マイクロ秒の時間で起こることができるこの非常に迅速な処理は、内耳の蝸牛内で正確に配置されたらせん神経節ニューロンによる有毛細胞およびそれらの適切な神経分布に頼る。有毛細胞から脳への刺激の強度、頻度、およびタイミングの伝達の成功は、発生中のこれらの聴覚回路の適切な集合に左右される。
内耳内で正確に組織化された回路を通して、基底膜に沿った内有毛細胞および外有毛細胞の特定の変位によって表される感覚情報はらせん神経節に沿って伝播する電気シグナルに変換される。末梢らせん神経節軸索は、前腹側蝸牛神経核、後腹側蝸牛神経核および背側蝸牛神経核で脳幹を刺激する第８（ＶＩＩＩｔｈ）脳神経内で有毛細胞から中心突起へ聴覚情報を伝達する。中脳の上オリーブ複合体および下丘内の統合中心は、生物体が空間内での供給源を特定し、スピーチおよび音楽の時間的および調和的特性のような複雑な特徴を処理することを可能にする。らせん神経節ニューロンが内耳から中枢神経系への重要な橋渡しを提供するために適当な接続を形成するため、これらのニューロンがどのようにそれらの集合を開始し、経時的にこれらのプロセスを維持するかを理解することは聴覚神経系における欠損を処置する治療を生み出すことを目的とする試みに重要である。
本開示は、一つには、ｂｃｌｗタンパク質、そのＢＨ４ドメイン含有フラグメント、またはｂｃｌｗ模倣物を使用して化学療法誘発性末梢性ニューロパシーまたは難聴を処置または予防する方法に関する。本願明細書に記載されている方法において使用することができる例示的なｂｃｌｗ模倣物も開示している。
第１の局面において、本開示は、必要とするヒト対象において化学療法誘発性末梢性ニューロパシー（ＣＩＰＮ）を処置または予防する方法を特徴とする。一例として、方法は、治療有効量のｂｃｌｗタンパク質またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメントを投与することを含む。別の例として、方法は、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含む。別の例として、方法は、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、１から４、１から３、１から２、または１個のアミノ酸置換、欠失、または挿入を除けば、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含む。アミノ酸置換は保存的または非保存的であってよい。いくつかの場合において、置換は、ＢＨ４ヘリックスの相互作用しない面上である。いくつかの場合において、置換は、ＢＨ４ヘリックスの相互作用する面および相互作用しない面の両方上である。相互作用する面／相互作用しない面は、ＩＰ３Ｒおよび／またはＢａｘとの相互作用に関与するヘリックスの面を指す。さらに別の例として、方法はｂｃｌｗ模倣物をヒト対象に投与することを含む。
１つの態様において、ｂｃｌｗタンパク質またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメントは、配列番号２、３、４６または４７の１つ、またはその内部架橋変異体（例えば、２つのアミノ酸が、炭化水素ステープルを形成することができる２つのオレフィン側鎖含有非天然アミノ酸によって置換される）を含むか、またはからなる。
１つの態様において、ｂｃｌｗ模倣物は、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインを含む内部架橋（例えば、ステープルド(stapled)、ステッチド(stitched)、またはそれらの組合せ）ポリペプチドである。特定の態様において、内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドは、配列番号４−３２、５０および５１に示されているアミノ酸配列からなる群から選択される。１つの態様において、内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドは、ＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＸＫＧＹＸＳＧＡ（配列番号５０）［式中、Ｘはオレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸である］である。いくつかの態様において、内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドは、配列番号４−３２、５０および５１に示されているアミノ酸配列と比較して少なくとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つのアミノ酸置換を有する。アミノ酸置換は保存的置換であってよい。１つの態様において、ヒト対象は、化学療法剤での処置後の末梢性ニューロパシーを有するか、または発症する危険性がある。いくつかの態様において、化学療法剤は微小管標的化剤である。１つの態様において、微小管標的化剤はタキサン（例えば、パクリタキセル）である。１つの態様において、微小管標的化剤は、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニン、ドセタキセル、ディスコデルモライド、エリュテロビン、サルコジクチン(sarcodictyin)、エポチロン、コルヒチン、コンブレタスタチン(combretastatin)、２−メトキシエストラジオール、またはノスカピン(noscapine)である。１つの態様において、化学療法剤はアルキル化剤（例えば、オキサリプラチン、ロムスチン、またはカルムスチン）である。１つの態様において、化学療法剤はアラビノシド（例えば、シタラビン）である。１つの態様において、化学療法剤は、プロテアソームインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビター、またはＲａｆインヒビターである。いくつかの態様において、ｂｃｌｗ模倣物、ＢＨ４ドメイン含有フラグメント、およびポリペプチドは、それぞれ８から１００（例えば、８から４０、８から３０、８から５０、８から６０）アミノ酸長（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００）である。いくつかの態様において、ｂｃｌｗ模倣物またはポリペプチドは、局所的にヒト対象に投与される。１つの態様において、方法は、メトホルミンをヒト対象に投与することをさらに含む。
第２の局面において、本開示は、化学療法を必要とするヒト対象に投与する方法を提供する。方法は、有効量の化学療法剤および治療有効量のｂｃｌｗタンパク質またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメント、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはｂｃｌｗ模倣物をヒト対象に投与することを含む。
１つの態様において、内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドは、配列番号４−３２、５０および５１に示されているアミノ酸配列からなる群から選択される。１つの態様において、内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドは、ＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＸＫＧＹＸＳＧＡ（配列番号５０）［式中、Ｘはオレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸である］である。いくつかの態様において、内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドは、配列番号４−３２、５０および５１に示されているアミノ酸配列と比較して少なくとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つのアミノ酸置換を有する。アミノ酸置換は保存的置換であってよい。ある場合において、配列番号５０または５１におけるセリンがシステインまたはノルロイシンで置換される。１つの態様において、ポリペプチドは、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、化学療法剤は、微小管標的化剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、葉酸類似体、紡錘体毒、白金化合物、エピポドフィロトキシン、抗生物質、ＥＧＦ−Ｒインヒビター、Ｅｐｈ−Ｒインヒビター、ｐ３８／ＪＡＫキナーゼインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビター、ＭＥＫインヒビター、ＭＡＰＫインヒビター、Ｔｒｋインヒビター、プロテアソームインヒビター、またはＲａｆインヒビターである。いくつかの態様において、微小管標的化剤はタキサン（例えば、パクリタキセル）である。いくつかの態様において、ヒト対象は血液学的腫瘍を有する。場合によっては、血液学的腫瘍は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病からなる群から選択される。いくつかの態様において、ヒト対象は固形腫瘍を有する。場合によっては、固形腫瘍は、乳癌、卵巣癌、および肺癌からなる群から選択される。１つの態様において、化学療法剤およびｂｃｌｗ模倣物またはポリペプチドは、連続して投与される。場合によっては、ｂｃｌｗ模倣物またはポリペプチドは、化学療法剤の前に投与される。他の例では、化学療法剤は、ｂｃｌｗ模倣物またはポリペプチドの前に投与される。いくつかの態様において、化学療法剤およびｂｃｌｗ模倣物またはポリペプチドは、同時に投与される。場合によっては、方法は、メトホルミンをヒト対象に投与することをさらに含む。
第３の局面において、本開示は、化学療法での処置を必要とするヒト対象を処置する方法に関する。方法は、感覚ニューロンの軸索において内因性ｂｃｌｗの低下したレベル；感覚ニューロンにおいてＥｐｈＡ４またはＥｐｈ／５受容体の低下したレベル；トランスポーターの低下した発現；チューブリンの低下した発現；またはＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ３の低下した発現、の１つ以上を有するヒト対象を選択することを含む。方法は、有効量のｂｃｌｗ模倣物またはｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをヒト対象に投与することをさらに含む。
１つの態様において、ｂｃｌｗ模倣物は、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインを含む内部架橋（例えば、ステープルド、ステッチド、またはそれらの組合せ）ポリペプチドである。特定の態様において、内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドは、配列番号４−３２、５０および５１に示されているアミノ酸配列からなる群から選択される。１つの態様において、内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドは、ＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＸＫＧＹＸＳＧＡ（配列番号５０）［式中、Ｘはオレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸である］である。いくつかの態様において、内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドは、配列番号４−３２、５０および５１に示されているアミノ酸配列と比較して少なくとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つのアミノ酸置換を有する。アミノ酸置換は保存的置換であってよい。１つの態様において、ポリペプチドは、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。１つの態様において、化学療法は、タキサン（例えば、パクリタキセル）を含む。
他の局面において、本開示は、必要とするヒト対象において難聴を処置または予防する方法を特徴とする。方法は、有効量のｂｃｌｗタンパク質またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメント、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはｂｃｌｗ模倣物をヒト対象に投与することを含む。
１つの態様において、ｂｃｌｗタンパク質またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメントは、配列番号２、３、４６または４７の１つ、またはその内部架橋変異体（例えば、２つのアミノ酸が、炭化水素ステープルを形成することができる２つのオレフィン側鎖含有非天然アミノ酸によって置換される）を含むか、またはからなる。
１つの態様において、ｂｃｌｗ模倣物は、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインを含む内部架橋（例えば、ステープルド、ステッチド、またはそれらの組合せ）ポリペプチドである。特定の態様において、内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドは、配列番号４−３２、５０および５１に示されているアミノ酸配列からなる群から選択される。１つの態様において、内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドは、ＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＸＫＧＹＸＳＧＡ（配列番号５０）［式中、Ｘはオレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸である］である。いくつかの態様において、内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドは、配列番号４−３２、５０および５１に示されているアミノ酸配列と比較して少なくとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つのアミノ酸置換を有する。アミノ酸置換は保存的置換であってよい。いくつかの態様において、ｂｃｌｗ模倣物、ＢＨ４ドメイン含有フラグメント、およびポリペプチドは、それぞれ８から１００（例えば、８から４０、８から３０、８から５０、８から６０）アミノ酸長（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００）である。いくつかの態様において、ｂｃｌｗ模倣物、ＢＨ４ドメイン含有フラグメント、またはポリペプチドは、前庭窓に注射によってヒト対象に投与される。いくつかの態様において、ｂｃｌｗ模倣物、ＢＨ４ドメイン含有フラグメント、またはポリペプチドは、耳に局所適用によってヒト対象に投与される。いくつかの態様において、ｂｃｌｗ模倣物、ＢＨ４ドメイン含有フラグメント、またはポリペプチドは、鼓膜を介して直接送達によって対象に投与される。場合によっては、投与は、ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスベクター）の使用または点耳を使用することを含む。１つの態様において、ヒト対象は加齢性難聴を有する。他の態様において、ヒト対象騒音による難聴を有する。さらに他の態様において、ヒト対象は化学療法に関連する難聴を有する。
別の局面において、本開示は、配列番号４−３０、５０および５１からなる群から選択される内部架橋ポリペプチドを含むか、またはからなるポリペプチドを特徴とする。１つの態様において、ペプチドのＮ−末端残基がアルギニンではない場合、アルギニン残基が付加されるか、または置換される。
さらに他の局面において、本開示は、薬学的に許容される担体および配列番号４−３２、５０および５１からなる群から選択される内部架橋ポリペプチドを含むか、またはからなるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。１つの態様において、医薬組成物は点耳として製剤される。
他の局面において、本開示は、配列番号４−３０、５０および５１からなる群から選択される内部架橋ポリペプチドを含むか、またはからなるポリペプチド；またはｂｃｌｗタンパク質；またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメント；またはｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むウイルスを特徴とする。１つの態様において、ウイルスはアデノウイルスである。他の態様において、ウイルスはアデノ随伴ウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスはレンチウイルスである。かかるウイルスは、ｂｃｌｗペプチドまたはタンパク質を対象に送達することにおいて有用である。
他に定義がない限り、本願明細書において使用される全ての専門および科学用語は、本願発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本願明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を本願発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および材料は以下に記載されている。本願明細書に記載されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、それら全体において出典明示により包含させる。矛盾する場合、定義を含む本出願が支配する。材料、方法、および例は、説明のためだけであり、限定されることを意図しない。
本願発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなる。
図１Ａは、細胞体（左）または遠位軸索（右）区画へ２４時間、ＤＭＳＯビヒクルコントロールまたは３０ｎＭ パクリタキセルで処理された区画化された培養において増殖されたＥ１５ ＤＲＧニューロンの軸索の二値化Ｔｕｊ１免疫染色を示す；スケールバー＝４０μｍ。
図１Ｂは、軸索変性の定量化を提供する棒グラフである：総軸索面積に対する断片化された軸索の面積の比（変性指数）；Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−検定による＊ｐ＜０．０５、データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３。
図１Ｃは、図１Ａからの細胞体区画のＤＡＰＩイメージを示す；スケールバー＝１０μｍ、矢印はアポトーシス核を示す。
図１Ｄは、細胞体または遠位軸索へのビヒクルまたはパクリタキセルの付加後のアポトーシス／総核の定量化を提供する棒グラフである；Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−検定による＊ｐ＜０．０５、データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３。
図２Ａは、マイクロ流体培養においてＤＲＧニューロンの軸索において電位感受性色素ＴＭＲＥの蛍光強度（Ｆｍ／Ｆｃ）を提供する棒グラフである；ＤＭＳＯまたはパクリタキセル（Ｐａｃ）を２４時間、遠位軸索区画に加えた；Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−検定による＊ｐ＜０．００１；３回の実験にわたってｎ＝８０ミトコンドリア；データは平均＋ＳＥＭを示す。
図２Ｂは、４８時間、３０ｎＭ、５００ｎＭ、または１０００ｎＭ パクリタキセルまたは２４時間、３ｍＭ 塩化カルシウムで処理されたＤＲＧニューロンからカルパイン活性によって産生される発光を描写する棒グラフである。ＤＭＳＯコントロールに対して正規化されたデータ；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正で一元配置ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３。
図２Ｃは、軸索に対して２０μＭ カルパインインヒビターＩＩＩの非存在下または存在下においてＤＭＳＯまたはパクリタキセルで処理された軸索の変性指数を示す棒グラフである；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正で一元配置ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３。
図２Ｄは、コントロールｓｈＲＮＡまたはＩＰ３Ｒ１を標的化するｓｈＲＮＡでのレンチウイルス感染後の軸索へのパクリタキセルまたはビヒクルの２４時間添加後の変性指数を説明する棒グラフである；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正で一元配置ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３。
図３Ａは、軸索へのＢｃｌｗ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌｘＬまたはβ−ガラクトシダーゼコントロールタンパク質でのタンパク質トランスフェクション後にＤＭＳＯまたはパクリタキセルで処理された軸索の二値化Ｔｕｊ１免疫染色を示す；スケールバー＝４０μｍ。
図３Ｂは、図３Ａおよび非トランスフェクション（Ｕｎｔｒａｎｓ）コントロールの変性指数を描写する棒グラフである；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正で一元配置ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝４。
図３Ｃは、細胞体へのＢｃｌｗ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌｘＬまたはβ−ガラクトシダーゼコントロールタンパク質のタンパク質トランスフェクション後にパクリタキセルまたはビヒクルで処理された軸索の変性指数を示す棒グラフである；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝４。
図３Ｄは、ＦＩＴＣシグナル（左）およびＴｕｊ１シグナル（右）を示すＢｃｌｗ、Ｂｃｌ２、またはＢｃｌｘＬのＦＩＴＣ−タグ付きＢＨ４ペプチドでタンパク質トランスフェクション後に区画化された培養からの軸索を描写する；スケールバー＝２０μｍ。
図３Ｅは、軸索へのＦＩＴＣ−ＢＨ４−Ｂｃｌｗ、Ｂｃｌ２、またはＢｃｌｘＬのタンパク質トランスフェクション後にパクリタキセルまたはビヒクルで処理された軸索の変性指数を示す棒グラフである；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正で一元配置ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝４。
図４Ａは、ビオチン化ＢＨ４−Ｂｃｌｗ（Ｗ）、ＢＨ４−Ｂｃｌ２（２）、またはＢＨ４−ＢｃｌｘＬ（ｘＬ）またはビオチンコントロール（Ｂ）とインキュベートされた軸索溶解物からＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎプルダウン(pulldown)のウェスタンブロットを示す。ウェスタンブロットは、ＩＰ３Ｒ１、Ｂａｘ、またはＹＡＲＳタンパク質についてプローブされた。
図４Ｂは、図４Ａからのｉｎｐｕｔバンドに対するバンド強度の定量化を示す棒グラフである。Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ多重比較検定で一元配置ＡＮＯＶＡによるビオチンコントロールに対して＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝４−６。
図４Ｃは、ビオチン化ＢＨ４−Ｂｃｌｗ（Ｗ）、ＢＨ４−Ｂｃｌ２（２）、またはＢＨ４−ＢｃｌｘＬ（ｘＬ）またはビオチンコントロール（Ｂ）とインキュベートされた細胞体溶解物からのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎプルダウンのウェスタンブロットを示す。ウェスタンブロットは、ＩＰ３Ｒ１、Ｂａｘ、またはＹＡＲＳタンパク質についてプローブされた。
図４Ｄは、図４Ｃからのｉｎｐｕｔバンドに対するバンド強度の定量化を示す棒グラフである。Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ多重比較検定で一元配置ＡＮＯＶＡによるビオチンコントロールに対して＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝４−６。
図４Ｅは、コントロールｓｈＲＮＡまたはＢｃｌｗおよび／またはＩＰ３Ｒ１を標的化するｓｈＲＮＡでのレンチウイルス感染後の軸索へのパクリタキセルまたはビヒクルの２４時間添加後の変性指数を描写する棒グラフ；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正で一元配置ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３−６。
図５Ａは、軸索に対するパクリタキセル処置の２４時間後の区画化された培養の細胞体または軸索溶解物からｑＲＴ−ＰＣＲにより分析したＢｃｌｗ ｍＲＮＡを示す棒グラフである。ＧＡＰＤＨに対して正規化されたデータ；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正で一元配置ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３。
図５Ｂは、図５Ａの区画化された培養の細胞体および軸索におけるＢｃｌｗについてのウェスタンブロットである。
図５Ｃは、軸索に対するパクリタキセル処置の２４時間後の区画化された培養の細胞体または遠位軸索溶解物からのＢｃｌｗについての定量化を示す棒グラフである；ＧＡＰＤＨに対して正規化されたデータ；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正で一元配置ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３。
図５Ｄは、軸索に対するパクリタキセル処置の２４時間後の区画化された培養の細胞体または軸索溶解物からのｑＲＴ−ＰＣＲにより分析したＢｃｌ２ ｍＲＮＡを示す棒グラフである。ＧＡＰＤＨに対して正規化されたデータ；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正で一元配置ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３。
図５Ｅは、図５Ｄの区画化された培養の細胞体および軸索におけるＢｃｌ２についてのウェスタンブロットである。
図５Ｆは、軸索に対するパクリタキセル処置の２４時間後の区画化された培養の細胞体または遠位軸索溶解物からのＢｃｌ２についての定量化を示す棒グラフである；ＧＡＰＤＨに対して正規化されたデータ；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正で一元配置ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３。
図５Ｇは、軸索に対するパクリタキセル処置の２４時間後の区画化された培養の細胞体または軸索溶解物からのｑＲＴ−ＰＣＲにより分析したＢｃｌｘＬ ｍＲＮＡを示す棒グラフである。ＧＡＰＤＨに対して正規化されたデータ；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正で一元配置ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３。
図５Ｈは、図５Ｇの区画化された培養の細胞体および軸索におけるＢｃｌｘＬについてのウェスタンブロットである。
図５Ｉは、軸索に対するパクリタキセル処置の２４時間後の区画化された培養の細胞体または遠位軸索溶解物からのＢｃｌｘＬについての定量化を示す棒グラフである；ＧＡＰＤＨに対して正規化されたデータ；Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正で一元配置ＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３。
図６Ａは、５０℃のホットプレート上で後足をなめるまたは引っ込める時間として測定された熱痛覚閾値を示す棒グラフである。この行動評価は、最終注射の前（ベースライン）および１０日後（処置後）にパクリタキセルで処置されたマウスで行った；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３−４マウス。
図６Ｂは、加速Ｒｏｔａｒｏｄから落下する待ち時間を描写する棒グラフである。この行動評価は、最終注射の前（ベースライン）および１０日後（処置後）にパクリタキセルで処置されたマウスで行った；データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３−４マウス。
図６Ｃは、厚い皮膚において２２５μｍの表皮長あたりの表皮に入っているＴｕｊ１ポジティブ感覚線維の定量化を示す棒グラフである。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−検定による＊ｐ＜０．０５、データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３−４マウス。
図６Ｄは、厚い皮膚において２２５μｍの表皮長あたりの表皮に入っているＴｕｊ１ポジティブ感覚線維（矢印）の典型的なイメージを示す。スケールバー＝１０μｍ、ｎ＝３−４マウス、マウスあたり８−１５イメージ。
図６Ｅは、薄い皮膚において２２５μｍの表皮長あたりの表皮に入っているＴｕｊ１ポジティブ感覚線維の定量化を示す棒グラフである。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−検定による＊ｐ＜０．０５、データは平均＋ＳＥＭを示す、ｎ＝３−４マウス。
図６Ｆは、薄い皮膚において２２５μｍの表皮長あたりの表皮に入っているＴｕｊ１ポジティブ感覚線維（矢印）の典型的なイメージを示す。スケールバー＝１０μｍ、ｎ＝３−４マウス、マウスあたり８−１５イメージ。
図７は、パクリタキセル誘発性軸索変性のメカニズムを示すモデルである。パクリタキセルは、軸索Ｂｃｌｗレベルを低下させ、ミトコンドリア機能障害およびカルパインプロテアーゼ活性化により特徴付けられるＩＰ３Ｒ１依存性変性カスケードの活性化を引き起こす。
図８は、ラット蝸牛におけるＢｃｌｗ ｍＲＮＡの発現を示すホールマウントのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの典型的なイメージを示す。
図９Ａは、基底回転におけるＢｃｌｗ ｍＲＮＡの発現を示すホールマウントのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの典型的なイメージを示す。
図９Ｂは、頂回転におけるＢｃｌｗ ｍＲＮＡの発現の欠失を示すホールマウントのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの典型的なイメージを示す。
図１０は、早期または後期難聴のいずれかに罹患している２つの集団へのｂｃｌｗ−／−および野生型マウスの分離を示す棒グラフである。
図１１は、実施例１１において試験されたマウスにおいてＡＢＲ閾値を描写するグラフである。
図１２は、実施例１１において試験されたマウスにおいてＤＰＯＡＥ閾値を示すグラフである。
図１３は、実施例１１において試験されたマウスにおいてＡＢＲ波１振幅を描写するグラフである。
図１４は、パクリタキセルで処置されたマウスにおける表皮神経分布の喪失が、Ｂｃｌｗ−ＢＨ４ ＳＡＨＢペプチドでの前処置時に部分的に救出されることを示すグラフである。
図１５は、ｂｃｌｗペプチドでのパクリタキセル処置したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの前処置の効果を示す棒グラフである。
詳細な説明
本開示は、少なくとも部分的には、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質、ｂｃｌｗ、そのＢＨ４ドメイン含有フラグメント、またはｂｃｌｗ模倣物が、化学療法誘発性末梢性ニューロパシー（ＣＩＰＮ）を処置または予防するために有用であるという知見に基づく。本開示は、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインに基づく配列を含む内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドまたは修飾ｂｃｌｗポリペプチドである例示的なｂｃｌｗ模倣物を特徴とする。加えて、本開示は、難聴（例えば、加齢、騒音誘発性、化学療法誘発性）を処置または予防するための方法を提供する。少なくとも１つのこれらの内部架橋ｂｃｌｗポリペプチドおよび／または修飾ポリペプチドを含む医薬組成物およびキット、ＣＩＰＮおよび難聴を処置するためにこれらの内部架橋ポリペプチドおよび／または修飾ポリペプチドを使用する方法も本願明細書において提供される。これらの方法の非限定的な局面および態様が本願明細書に記載されている。以下に記載される局面のいずれも、本願明細書に記載されている方法において任意の組合せで使用することができる。
Ｂｃｌｗ
Ｂｃｌ−２様タンパク質２としても知られているＢｃｌｗは、ヒトにおいてＢＣＬ２Ｌ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｂｃｌｗは、ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの生存促進性（すなわち、抗アポトーシス性）メンバーをコードし、細胞においてこの遺伝子の発現は、細胞毒性条件下で細胞アポトーシスの低下に寄与することが示されている。この遺伝子のマウス形態は、ＮＧＦ−およびＢＤＮＦ−依存性ニューロンの生存において役割を果たすことが示されている。
ヒトｂｃｌｗのアミノ酸配列が以下に提供される（ＢＨ４ドメインが太字である）：
本開示は、本願明細書に記載されている方法におけるｂｃｌｗタンパク質の使用を特徴とする。使用されるｂｃｌｗタンパク質は、少なくとも配列番号１と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。これらのｂｃｌｗタンパク質は、ＢＨ４ドメインまたはその機能性変異体を含む。アミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するための方法は、当分野で知られている。例えば、配列は、最適な比較目的のためにアラインされる（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列は、比較目的のために無視することができる）。好ましい態様において、比較目的のためにアラインされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である。次に、対応するアミノ酸位置でのアミノ酸残基が比較される。第１の配列における位置が第２の配列において対応する位置と同じアミノ酸残基によって占有されているとき、これらの分子はこの位置で同一である。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴ ２．０ ｐｒｏｇｒａｍを使用して成し遂げられる。配列比較は、アンギャップト(ungapped)アラインメントを使用しておよびデフォルトパラメーター（Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２ ｍａｔｒｉｘ、１１のギャップ存在コスト、１の残基あたりのギャップコスト、および０．８５のラムダ比）を使用して行われる。ＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍにおいて使用される数学アルゴリズムは、Altschul et al. (Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997)に記載されている。
場合によっては、本願明細書に記載されている方法において使用されるｂｃｌｗタンパク質は、ＢＨ４ドメイン含有ｂｃｌｗのフラグメントである。これらのフラグメントは、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、または１５０アミノ酸長であってよい。場合によっては、フラグメントは、半減期延長部分（例えば、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、ＸＴＥＮ）に連結されていてもよい。
ＢＨ４ドメイン
ＢＣＬ−２ファミリーに属する全てのタンパク質は、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、またはＢＨ４ドメインのいずれかを含む。ＢＣＬ−２ファミリータンパク質は、マルチドメイン抗アポトーシス性、マルチドメインアポトーシス促進性、またはＢＨ３のみのアポトーシス促進性タンパク質に分類される。全ての抗アポトーシス性タンパク質はＢＨ１およびＢＨ２ドメインを含み、それらのいくつかは付加的なＮ−末端ＢＨ４ドメインを含み（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）、Ｂｃｌ−ｗ）、これはＢｃｌ−ｘ（Ｓ）を除けばアポトーシス促進性タンパク質において見られない。Ｂａｄを除けば全てのアポトーシス促進性タンパク質、およびいくつかの抗アポトーシス性タンパク質、例えばＢｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘ（Ｌ）は、ＢＣＬ−２ファミリーの他のタンパク質との二量体化のために必要であり、それらの殺活性のために重要であるＢＨ３ドメインを含む；それらのいくつかはまた、ＢＨ１およびＢＨ２ドメイン（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ）を含む。
ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインはアミノ酸配列：ＤＴＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＱＫＧＹＶＣＧＡ（配列番号２）を有する。場合によっては、方法はアミノ酸配列：ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＱＫＧＹＶＣＧＡ（配列番号３）を含むか、またはからなるｂｃｌｗポリペプチドを使用する。場合によっては、方法はアミノ酸配列：ＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＱＫＧＹＶＣＧＡ（配列番号４６）を含むか、またはからなるｂｃｌｗポリペプチドを使用する。場合によっては、方法はアミノ酸配列：ＴＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＱＫ（配列番号４７）を含むｂｃｌｗポリペプチドを使用する。
場合によっては、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるアミノ酸配列を有する。場合によっては、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるアミノ酸配列を有する。場合によっては、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるアミノ酸配列を有する。場合によっては、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの場合において、配列番号２、３、４６または４７からの可変性は、ＢＨ４ドメイン（例えば、ＩＰ３Ｒおよび／またはＢａｘと相互作用するドメイン）の相互作用しないアルファヘリックス面上である。いくつかの場合において、配列番号２からの可変性は、ＢＨ４ドメイン（例えば、ＩＰ３Ｒおよび／またはＢａｘと相互作用するドメイン）の相互作用する、および相互作用しない両方のアルファヘリックス面上である。
Ｂｃｌ−２（配列番号３４）、Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）（配列番号３５）、Ｂｃｌ−ｗ（配列番号３６）のＢＨ４ドメインを含む領域のアラインメントは以下に提供される：
場合によっては、本願明細書に記載されている方法は、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインを含むポリペプチドまたはそのポリペプチド変異体を使用する。例えば、ポリペプチド変異体は、配列番号２、３、４６または４７に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸置換を含み得る。置換は、ＢＨ４ドメイン（例えば、ＩＰ３Ｒおよび／またはＢａｘと相互作用するドメイン）の相互作用しないアルファヘリックス面上であってよい。いくつかの場合において、配列番号２における置換は、ＢＨ４ドメイン（例えば、ＩＰ３Ｒおよび／またはＢａｘと相互作用するドメイン）の相互作用する、および相互作用しない両方のアルファヘリックス面上である。場合によっては、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインにおけるシステイン残基は、セリンで置換される。したがって、本開示は、これらの配列におけるシステイン残基がセリンで置換されることを除いては、配列番号２、３、４６または４７に示されているアミノ酸配列を含む。場合によっては、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインにおけるシステイン残基はノルロイシンで置換される。したがって、本開示は、これらの配列におけるシステイン残基がノルロイシンで置換されることを除いては、配列番号２、３、４６または４７に示されているアミノ酸配列を含む。
場合によっては、本願明細書に記載されている方法において使用されるｂｃｌｗポリペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長である。場合によっては、本願明細書に記載されている方法において使用されるｂｃｌｗポリペプチドは、５から３０、６から３０、７から３０、８から３０、９から３０、１０から３０、１１から３０、１２から３０、１４から３０、１５から３０、１６から３０、１７から３０、１８から３０、１９から３０、または２０から３０アミノ酸長である。
内部架橋Ｂｃｌｗポリペプチド
場合によっては、本願明細書に記載されている方法は、ｂｃｌｗ模倣物を使用する。例えば、本開示は、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインに基づく配列を含み、内部（分子内）架橋（またはステープル）によって連結される少なくとも２つの修飾アミノ酸を含み、前記少なくとも２つのアミノ酸が２から６つのアミノ酸（例えば、２、３、または６つのアミノ酸）によって分離されている、内部架橋ポリペプチドおよび／または修飾ポリペプチドを提供する。本願明細書において、安定化ペプチドは、ステープルドおよび／またはステッチドペプチドを含む。
アミノ酸は、本願明細書に記載されているペプチドの構成要素である。「アミノ酸」なる用語は、アミノ基およびカルボキシル基の両方を含む分子を指す。アミノ酸は、アルファ−アミノ酸およびベータ−アミノ酸を含む。本願明細書に記載されているペプチド中に含まれるのに適当なアミノ酸は、限定はしないが、天然アルファ−アミノ酸、例えば、ペプチドにおいて見られる２０個の一般的な天然アルファ−アミノ酸（例えば、Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＶａｌ（Ｖ））のＤ−およびおよびＬ−異性体、天然でない（または非天然）アルファ−アミノ酸（限定はしないが、α，α−二置換およびＮ−アルキル化アミノ酸を含む）、天然ベータ−アミノ酸（例えば、ベータ−アラニン）、および天然でない（または非天然）ベータ−アミノ酸を含む。本開示の内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドの構築において使用されるアミノ酸は、有機合成によって調製されることができるか、または他の経路、例えば、天然供給源からの分解または単離に得ることができる。
多数の既知の天然でない（または非天然）アミノ酸が存在し、それらのいずれもが本願発明の内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドに含むことができる。非天然アミノ酸のいくつかの非限定的な例は、４−ヒドロキシプロリン、デスモシン、ガンマ−アミノ酪酸、ベータ−シアノアラニン、ノルバリン、４−（Ｅ）−ブテニル−４（Ｒ）−メチル−Ｎ−メチル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、１−アミノ−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−２−フェニル−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−シクロブタンカルボン酸、４−アミノ−シクロペンテンカルボン酸、３−アミノ−シクロヘキサンカルボン酸、４−ピペリジル酢酸、４−アミノ−ｌ−メチルピロール−２−カルボン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２−アミノヘプタン二酸、４−（アミノメチル）安息香酸、４−アミノ安息香酸、オルト−、メタ−、およびパラ−置換フェニルアラニン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ６Ｈ５；−ＣＦ３；−ＣＮ；−ハロ；−ＮＯ２；ＣＨ３で置換されている）、二置換フェニルアラニン、置換チロシン（例えば、−Ｑ＝Ｏでさらに置換されている）Ｃ６Ｈ５；−ＣＦ３；−ＣＮ；−ハロ；−ＮＯ２；ＣＨ３）、およびスタチンである。さらに、アミノ酸は、例えば、ヒドロキシル化、リン酸化、スルホン化、アシル化、およびグリコシル化されている、アミノ酸残基を含むように誘導体化することができる。
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド（アミド）結合によって互いに連結されたアミノ酸残基のポリマーを含む（含有する）。本願明細書において使用される前記用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。一般的に、ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸長である。ペプチドまたはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質の集合(collection)を指すことができる。場合によっては、ペプチドは天然アミノ酸のみを含むことができるが、当分野で知られている非天然アミノ酸（すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物）および／またはアミノ酸アナログも使用することができる。また、ペプチドまたはポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸は、例えば、化学的存在物(entity)、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーションのためのリンカー、官能化、および／または他の修飾の付加によって、修飾することができる。ペプチドまたはポリペプチドは、単一の分子であってよく、または多分子複合体、例えば、タンパク質であってよい。ペプチドまたはポリペプチドは、天然タンパク質またはペプチドのフラグメントであってよい。ペプチドまたはポリペプチドは、天然、組換え、または合成、またはそれらの任意の組合せであってよい。「ジペプチド」は、２つの共有結合したアミノ酸を指す。
本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドを産生するために使用することができる例示的なペプチドは、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインと少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である、例えば、本質的に有するか、またはアルファヘリックス二次構造を有するように引き起こすことができる、配列（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸、または１０−３０、１５−２４、１５−２５、１７−２５、１５−２２、１８−２０、１８−２２、１８−２５、１９−２２、１９−２５、２０−２２、２０−２１、２０−２２、２０−２３、２０−２４、２０−２５、２０−２６、２０−２７、２０−２８、２０−２９、２０−３０、２２−３５、２２−４０、または２２−５０個のアミノ酸）を含むことができる。本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドを産生するために使用することができるさらなる例示的なペプチドは、保存されたＢＨ４ドメインに対してＮ−および／またはＣ−末端であるｂｃｌｗにおいて存在する１つ以上のさらなるアミノ酸を含むことができる。本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドを産生するために使用することができるさらなる例示的なペプチドは、配列番号４−３２のいずれか１つの配列の１、２、３または４つのアミノ酸のＮ−末端および／または１、２、３または４つのアミノ酸のＣ−末端切断を含む。
場合によっては、内部架橋ポリペプチドは、例えば、１、２、３、４、５、６個のアミノ酸置換（例えば、システインからセリン、保存的アミノ酸置換）が、配列番号３または配列番号４６の配列において作られ、２から６つ（両端を含む）（例えば、２、３、または６つ）のアミノ酸によって分離された２つのアミノ酸の側鎖が、内部ステープルによって置換されるか；３つのアミノ酸の側鎖が、内部ステープルおよび／または内部ステッチによって置換されるか；４つのアミノ酸の側鎖が、内部ステープル、内部ステッチ、または内部ステープルおよびステッチの組合せによって置換されるか；または少なくとも４つのアミノ酸の側鎖が、内部ステープル、内部ステッチ、または内部ステープルおよびステッチの組合せによって置換される、ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＱＫＧＹＶＣＧＡ（配列番号３）またはＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＱＫＧＹＶＣＧＡ（配列番号４６）、ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号４８）、またはＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号４９）の群から選択されるアミノ酸配列を含む、に本質的にからなる、またはにからなる。ある場合において、配列番号２、３または４６−４９における２つのアミノ酸は炭化水素ステープルドである。場合によっては、配列番号２、３または４６−４９における３つのアミノ酸はステッチドである。場合によっては、位置［ｉ］および［ｉ＋３］、位置［ｉ］および［ｉ＋４］、または位置［ｉ］および［ｉ＋７］での配列番号２、３または４６−４９における任意の２つのアミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸によって置換される。例えば、［ｉ］および［ｉ＋３］について、それは２つのＳ５ペンテニルアラニンであってよく、または１つのＲ−プロペニルアラニンおよび１つのＳ−ペンテニルアラニン；［ｉ］および［ｉ＋４］について、２つのＳ−ペンテニルアラニンが使用され得；［ｉ］および［ｉ＋７］について、１つのＳ−ペンテニルアラニンおよび１つのＲ−オクテニルアラニンが使用され得るか、または１つのＲ−ペンテニルアラニンおよび１つのＳ−オクテニルアラニンが使用され得る。かかるペプチドが、ルテニウム触媒オレフィンメタセシスの際に、「ステープルド」ｂｃｌｗペプチドを生じることができる。場合によっては、ｂｃｌｗステープルドまたはステッチドペプチドはまた、配列番号２、３または４６−４９に対して１、２、３、４、５、６または７つのアミノ酸置換を有することができる。場合によっては、アミノ酸置換は保存的である。例えば、正に荷電したアミノ酸はＲ、Ｋ、またはＨによって置換することができ；負に荷電したアミノ酸はＤ、Ｎ、Ｅ、またはＱで置換することができ；極性アミノ酸はＡ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｆ、またはＹで置換することができ；セリン、スレオニンまたはシステインは互いに置換することができる。アミノ酸の非天然ホモログが天然アミノ酸の代わりに置換することができることが理解されるべきである。場合によっては、ｂｃｌｗステープルドまたはステッチドペプチドはまた、配列番号２、３または４６−４９に対して１、２、３、４、または５つの欠失を有することができる。場合によっては、ｂｃｌｗステープルドまたはステッチドペプチドは、配列番号２、３または４６−４９に対して１、２、３、または４つのアミノ酸置換を有し、また、配列番号２、３または４６−４９に対して１、２、または３つの欠失を有する。これらの置換および／または欠失を有するＢｃｌｗペプチドは、例えば、軸索変性を低下させるかまたは防止する、および／または小胞体カルシウムチャネル、ＩＰ３Ｒ１に結合する、能力に基づく、本願明細書に記載されている方法における使用のために選択することができる。ペプチドがこれらの特性を有するか否かを決定するための方法は、例えば実施例に記載されている。いくつかの場合において、内部にステープルされた、またはステッチされたｂｃｌｗポリペプチドは、標的部分またはアミノまたはカルボキシ末端で細胞への侵入を促進する部分（例えば、２、３、４、５、６、７、８または９つの連続するＡｒｇ）を含む。
「保存的アミノ酸置換」は、内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドの、その標的タンパク質、例えば、ＢＡＸタンパク質または小胞体カルシウムチャネル、ＩＰ３Ｒ１への結合を低下させない（例えば、実質的に低下させない）アミノ酸置換であり、いくつかの状況において、結合活性を改善することができる。結合における任意の低下を検出するための方法は、保存的アミノ酸置換後の結合親和性を比較することを含むことができ、ここで、結合を低下させる（例えば、実質的に低下させる）あらゆるアミノ酸置換は保存的アミノ酸置換ではない。いくつかの局面において、実質的に低下した結合は、非置換内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドの、その標的タンパク質、例えば、ＢＡＸタンパク質、または小胞体カルシウムチャネル、ＩＰ３Ｒ１への結合よりも１０％以下、２０％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、９０％以下、９５％以下、９８％以下、９９％以下、または１００％以下である結合を含むことができる。内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドおよび標的タンパク質、例えば、ＢＡＸタンパク質または小胞体カルシウムチャネル、ＩＰ３Ｒ１間の相互作用を評価するための方法は、本願明細書に記載されている。
場合によっては、「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換される置換を含むことができる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、およびシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、およびイソロイシン）および芳香族性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
本願明細書に記載されている方法において使用することができる非限定的な例示的な内部架橋ｂｃｌｗペプチドは、
ＸＡＬＶＸＤＦＶＧＹＫＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号４）
ＲＸＬＶＡＸＦＶＧＹＫＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号５）
ＲＡＸＶＡＤＸＶＧＹＫＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号６）
ＲＡＬＸＡＤＦＸＧＹＫＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号７）
ＲＡＬＶＸＤＦＶＸＹＫＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号８）
ＲＡＬＶＡＸＦＶＧＸＫＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号９）
ＲＡＬＶＡＤＸＶＧＹＸＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号１０）
ＲＡＬＶＡＤＦＸＧＹＫＸＲＱＫＧＹＶ（配列番号１１）
ＲＡＬＶＡＤＦＶＸＹＫＬＸＱＫＧＹＶ（配列番号１２）
ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＸＫＬＲＸＫＧＹＶ（配列番号１３）
ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＸＬＲＱＸＧＹＶ（配列番号１４）
ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＸＲＱＫＸＹＶ（配列番号１５）
ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＸＱＫＧＸＶ（配列番号１６）
ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＸＫＧＹＸ（配列番号１７）
ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＱＸＧＹＶＸ（配列番号１８）
８ＡＬＶＡＤＦＸＧＹＫＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号１９）
Ｒ８ＬＶＡＤＦＶＸＹＫＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号２０）
ＲＡ８ＶＡＤＦＶＧＸＫＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号２１）
ＲＡＬ８ＡＤＦＶＧＹＸＬＲＱＫＧＹＶ（配列番号２２）
ＲＡＬＶ８ＤＦＶＧＹＫＸＲＱＫＧＹＶ（配列番号２３）
ＲＡＬＶＡ８ＦＶＧＹＫＬＸＱＫＧＹＶ（配列番号２４）
ＲＡＬＶＡＤ８ＶＧＹＫＬＲＸＫＧＹＶ（配列番号２５）
ＲＡＬＶＡＤＦ８ＧＹＫＬＲＱＸＧＹＶ（配列番号２６）
ＲＡＬＶＡＤＦＶ８ＹＫＬＲＱＫＸＹＶ（配列番号２７）
ＲＡＬＶＡＤＦＶＧ８ＫＬＲＱＫＧＸＶ（配列番号２８）
ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹ８ＬＲＱＫＧＹＸ（配列番号２９）
ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫ８ＲＱＫＧＹＶＸ（配列番号３０）；
ＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＸＫＧＹＸＢＧＡ（配列番号３１）；
ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＸＫＧＹＸＢＧＡ（配列番号３２）；
ＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＸＫＧＹＸＳＧＡ（配列番号５０）；
ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＸＫＧＹＸＳＧＡ（配列番号５１）；
ＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＸＫＧＹＸＣＧＡ（配列番号５２）；または
ＲＡＬＶＡＤＦＶＧＹＫＬＲＸＫＧＹＸＣＧＡ（配列番号５３）、
［式中、ＸはＳ−ペンテニルアラニンであり；「８」はＲ−オクテニルアラニンであり；「Ｂ」はノルロイシンである。］のいずれか１つを含む。
異なる態様において、上記それぞれの配列（すなわち、配列番号４−３２および５０−５３）におけるそれぞれのＸは、同じ非天然アミノ酸または異なる非天然アミノ酸であってよい。場合によっては、「Ｘ」は、（Ｓ）−２−（４−ペンテニル）Ａｌａ−ＯＨ、（Ｒ）−２−（４−ペンテニル）Ａｌａ−ＯＨ、（Ｒ）−２−（７−オクテニル）Ａｌａ−ＯＨ、（Ｓ）−２−（７−オクテニル）Ａｌａ−ＯＨ、２−アミノ−２−（ペンタ−４−エニル）ヘプト−６−エン酸、（Ｒ）−２−（２−プロペニル）Ａｌａ−ＯＨ、または（Ｓ）−２−（２−プロペニル）Ａｌａ−ＯＨの１つである。１つの態様において、配列が２つの「Ｘ」を有するとき、両方のＸは（Ｓ）−２−（４−ペンテニル）Ａｌａ−ＯＨである。１つの態様において、配列が２つの「Ｘ」を有するとき、両方のＸは（Ｒ）−２−（４−ペンテニル）Ａｌａ−ＯＨである。１つの態様において、配列が２つの「Ｘ」を有するとき、両方のＸは（Ｒ）−２−（７−オクテニル）Ａｌａ−ＯＨである。１つの態様において、配列が２つの「Ｘ」を有するとき、両方のＸは（Ｓ）−２−（７−オクテニル）Ａｌａ−ＯＨである。１つの態様において、配列が２つの「Ｘ」を有するとき、両方のＸは２−アミノ−２−（ペンタ−４−エニル）ヘプト−６−エン酸である。１つの態様において、配列が２つの「Ｘ」を有するとき、両方のＸは（Ｒ）−２−（２−プロペニル）Ａｌａ−ＯＨである。１つの態様において、配列が２つの「Ｘ」を有するとき、両方のＸは（Ｒ）−２−（２−プロペニル）Ａｌａ−ＯＨである。１つの態様において、配列が２つの「Ｘ」を有するとき、両方のＸは（Ｓ）−２−（２−プロペニル）Ａｌａ−ＯＨである。１つの態様において、配列が２つの「Ｘ」を有するとき、両方のＸは異なる非天然アミノ酸であり、例えば、Ｓ）−２−（４−ペンテニル）Ａｌａ−ＯＨ、（Ｒ）−２−（４−ペンテニル）Ａｌａ−ＯＨ、（Ｒ）−２−（７−オクテニル）Ａｌａ−ＯＨ、（Ｓ）−２−（７−オクテニル）Ａｌａ−ＯＨ、２−アミノ−２−（ペンタ−４−エニル）ヘプト−６−エン酸、（Ｒ）−２−（２−プロペニル）Ａｌａ−ＯＨ、および（Ｓ）−２−（２−プロペニル）Ａｌａ−ＯＨからなる群から選択されることができる。場合によっては、２つのＸが３つのアミノ酸によって分離されるとき、２つのＸは、異なる非天然残基であってよく、例えば、第１のＸが（Ｒ）−２−（２−プロペニル）Ａｌａ−ＯＨまたは（Ｓ）−２−（２−プロペニル）Ａｌａ−ＯＨであり、第２のＸが（Ｓ）−２−（２−プロペニル）Ａｌａ−ＯＨまたは（Ｒ）−２−（２−プロペニル）Ａｌａ−ＯＨである。場合によっては、配列番号４−３２または５０−５３においてであるか、または配列番号２、３、４６、４８または４９に挿入される「Ｘ」は、ステープルおよび／またはステッチの形成を可能にする任意の残基／物質であってよい。言い換えれば、ステープルおよび／またはステッチは、炭化水素ステープルおよび／またはステッチであることを必要としない。種々のタイプのステープル化(stapling)を実施する方法は、当分野でよく知られている（例えば、ラクタムステープル化：Shepherd et al., J. Am. Chem. Soc., 127:2974-2983 (2005)；トリアゾールステープル化：Kawamoto et al., J. Med. Chem., 55:1137-1146 (2011)；ＵＶ付加環化ステープル化：Madden et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 21:1472-1475 (2011)；ジスルフィドステープル化：Jackson et al., Am. Chem. Soc.,113:9391-9392 (1991)；オキシムステープル化：Haney et al., Chem. Commun., 47:10915-10917 (2011)；チオエーテルステープル化：Brunel and Dawson, Chem. Commun., 552-2554 (2005)；光スイッチ可能(Photoswitchable)ステープル化：J. R. Kumita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 97:3803-3808 (2000)；ダブルクリック(Double-click)ステープル化：Lau et al., Chem. Sci., 5:1804-1809 (2014)；Ｂｉｓ−ラクタムステープル化：J. C. Phelan et al.,, J. Am. Chem. Soc., 119:455-460 (1997)；およびＢｉｓ−アリール化ステープル化：A. M. Spokoyny et al., J. Am. Chem. Soc., 135:5946-5949 (2013)参照）。場合によっては、配列番号４−３２または５０−５３においてであるか、または配列番号２、３、４６、４８または４９に挿入される「Ｘ」は、炭化水素ステープルおよび／またはステッチの形成を可能にする任意の残基であってよい。場合によっては、配列番号４−３２または５０−５３に記載の、または配列番号２、３、４６、４８または４９に挿入される配列を有するペプチドは、ラクタムステープルドである。他の例では、配列番号４−３２または５０−５３に記載の、または配列番号２、３、４６、４８または４９に挿入される配列を有するペプチドは、トリアゾールステープルドである。他の例では、配列番号４−３２または５０−５３に記載の、または配列番号２、３、４６、４８または４９に挿入される配列を有するペプチドは、ＵＶ付加環化ステープルを使用するステープルドである。他の例では、配列番号４−３２または５０−５３に記載の、または配列番号２、３、４６、４８または４９に挿入される配列を有するペプチドは、ジスルフィドステープルドである。他の例では、配列番号４−３２または５０−５３に記載の、または配列番号２、３、４６、４８または４９に挿入される配列を有するペプチドは、オキシムステープルドである。他の例では、配列番号４−３２または５０−５３に記載の、または配列番号２、３、４６、４８または４９に挿入される配列を有するペプチドは、チオエーテルステープルドである。他の例では、配列番号４−３２または５０−５３に記載の、または配列番号２、３、４６、４８または４９に挿入される配列を有するペプチドは、光スイッチ可能ステープルを含む。他の例では、配列番号４−３２または５０−５３に記載の、または配列番号２、３、４６、４８または４９に挿入される配列を有するペプチドは、ダブルクリックステープルドである。他の例では、配列番号４−３２または５０−５３に記載の、または配列番号２、３、４６、４８または４９に挿入される配列を有するペプチドは、ｂｉｓ−ラクタムステープルドである。他の例では、配列番号４−３２または５０−５３に記載の、または配列番号２、３、４６、４８または４９に挿入される配列を有するペプチドは、ｂｉｓ−アリール化ステープルを含む。１つの態様において、ｂｃｌｗ内部架橋ペプチドは、配列番号４−３３に示されているアミノ酸配列、または配列番号２、３、４６、４８または４９のいずれか１つに示されているアミノ配列の修飾型（すなわち、炭化水素ステープルを形成することができる２以上（例えば、３、４、５、６）の非天然オレフィン側鎖含有アミノ酸を含む配列）を含むか、またはからなる。
本願明細書に記載されている方法のいずれかのいくつかの態様において、ｂｃｌｗ内部架橋ペプチドは、１８から１００アミノ酸長（例えば、１８から９０アミノ酸長、１８から８０アミノ酸長、１８から７０アミノ酸長、１８から６０アミノ酸長、１８から５０アミノ酸長、１８から４０アミノ酸長、１８から３０アミノ酸長、１８から２５アミノ酸長、２０から４０アミノ酸長、２０から３５アミノ酸長、２０から３０アミノ酸長、２２から４０アミノ酸長；２２から３５アミノ酸長、２２から３０アミノ酸長、２５から４０アミノ酸長、２５から３５アミノ酸長、または２５から３０アミノ酸長）である。
上記のように、本願明細書において内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドは、内部（分子内）架橋（またはステープル）を一緒に形成する少なくとも２つの修飾アミノ酸を含み、前記少なくとも２つの修飾アミノ酸が２（すなわち、ｉ、ｉ＋３）、３（すなわち、ｉ、ｉ＋４）、または６（すなわち、ｉ、ｉ＋７）つのアミノ酸によって分離されている。本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドのいずれかにおいて挿入することができるステープル（複数も可）および／またはステッチ（複数も可）のさらなる例示的な相対位置は、当分野で知られている。例えば、本願明細書においてその全体において出典明示により包含させるＵＳ ２０１６／００３１９５９参照。
ｉおよびｉ＋３間の架橋の場合、架橋はＣ７アルキレンまたはアルケニレンであってよい。ｉおよびｉ＋４間の架橋の場合、架橋はＣ８アルキレンまたはアルケニレンであってよい。ｉおよびｉ＋７間の架橋の場合、架橋はＣ１１、Ｃ１２、またはＣ１３アルキレンまたはアルケニレンであってよい。架橋がアルケニレンであるとき、１つ以上の二重結合が存在することができる。
ｉおよびｉ＋３間の架橋の場合、架橋はＣ６、Ｃ７、またはＣ８アルキルまたはアルケン（例えば、単一の二重結合を有するＣ６アルケン）であってよい。ｉおよびｉ＋４間の架橋の場合、架橋はＣ８アルキルまたはアルケンであってよい。ｉおよびｉ＋７間の架橋の場合、架橋はＣ１１、Ｃ１２、またはＣ１３アルキルまたはアルケン（例えば、単一の二重結合を有するＣ１１アルケン）であってよい。架橋がアルケンであるとき、１つ以上の二重結合が存在することができる。
「ペプチドステープル化」または「炭化水素ステープル化」は、ポリペプチド鎖中に存在する２つのオレフィン含有側鎖（例えば、架橋可能な側鎖）が架橋環を形成する閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合する（例えば「一緒にステープルド」）合成方法論から造られた用語である（例えば、Blackwell et al., J. Org. Chem., 66: 5291-5302, 2001; Angew et al., Chem. Int. Ed. 37:3281, 1994参照）。本願明細書において使用される「ペプチドステープル化」または「炭化水素ステープル化」なる用語は、単一な「ステープルド」ポリペプチドを提供するように、反応を促進する任意の数の反応条件および／または触媒を使用して、ポリペプチド鎖中に存在することができる２つの（例えば、少なくとも１対の）二重結合含有側鎖、三重結合含有側鎖、または二重結合含有および三重結合含有側鎖の接続を含む。「多重なステープルド」ポリペプチドなる用語は、２つ以上の個々のステープルを含むこれらのポリペプチドを指し、種々の間隔および組成の２、３、またはそれ以上の独立したステープルを含むことができる。本願明細書において使用される「ペプチドステッチ化」なる用語は、２つのステープルが、例えば共通の残基に連結している、「ステッチド」（例えば、タンデムのまたは多重なステープルド）ポリペプチドを提供するような単一のポリペプチド鎖における多重のおよびタンデムの「ステープル化」事象を指す。ペプチドステッチ化は、米国特許第８，５９２，３７７および９，０７９，９７０号に記載されており、これら両方を本願明細書にそれら全体において出典明示により包含させる。場合によっては、本願明細書において使用されるステープルは、不飽和結合を保持することができるか、または低下させることができる（例えば、ステッチ化段落の説明で以下に記載されるように）。
多数のペプチドステープルが全炭化水素架橋を有するが、他のタイプの架橋またはステープルを使用することができる。例えば、トリアゾール含有（例えば、１、４トリアゾールまたは１、５トリアゾール）架橋を使用することができる（例えば、Kawamoto et al., J. Med. Chem. 55:1137-1146, 2012; WO 2010/060112参照）。
全炭化水素架橋を使用するペプチドのステープル化は、特に生理学的に適切な条件下で、その天然の立体構造および／または二次構造を維持することを助けることが示されている（例えば、Schafmiester et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892, 2000; Walensky et al., Science 305:1466-1470, 2004参照）。
アルファヘリックス二次構造を有する傾向がある全炭化水素架橋による本願明細書におけるポリペプチドのステープル化は、ポリペプチドをその天然のアルファヘリックス構造に拘束することができる。拘束された二次構造は、例えば、タンパク質分解開裂に対するペプチドの耐性を増加させることができ、ペプチドの熱安定性を増加させることができ、ペプチドの疎水性を増加させることができ、ペプチドの標的細胞の膜へのより良い浸透を可能にすることができ（例えば、飲作用などのエネルギー依存性輸送メカニズムを介して）、および／または対応する架橋されていない（例えば、「ステッチドされていない」または「ステープルドされていない」）ペプチドに対して、ペプチドの生物学的活性における改善をもたらすことができる。
少なくとも２つのアミノ酸が内部架橋（例えば、ステープル）を支持するために必要とされるが、内部架橋アミノ酸のさらなる対を、例えば、さらなる内部架橋（例えば、ステープル）を支持するために、内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドに含むことができる。例えば、内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドは、１、２、３、４、５、またはそれ以上のステープルを含むことができる。内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチド（例えば、ステープルドおよび／またはステッチドペプチド）は、本願明細書において「ＢＣＬ−２ドメインの安定化されたアルファヘリックス」（ＳＡＨＢ）と一般的に呼ばれる。
あるいは、または加えて、内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドは、例えば、共通の起源から生じる２つのステープルを生じる、３つの内部架橋またはステッチドアミノ酸を含むことができる。ペプチドステッチは、少なくとも３つの内部架橋アミノ酸を含み、前記３つのアミノ酸の中央が（ここで中核または中枢のアミノ酸と呼ばれ、「ｉ」として示される）２つの隣接する修飾アミノ酸のそれぞれと内部架橋（アルファ炭素間）を形成する。中核のアミノ酸のアルファ炭素は、ペプチドにおける他のアミノ酸のアルファ炭素に内部架橋する側鎖を有し、これは飽和または不飽和であってよい。中核のアミノ酸に架橋したアミノ酸は、２、３、または６つのアミノ酸（例えば、ｉ、ｉ−３、ｉ、ｉ−４、ｉ、ｉ−７または、ｉ、ｉ＋３、ｉ、ｉ＋４、ｉ、ｉ＋７）（ここで「ｉ」は中核のアミノ酸である）によっていずれかの方法において中核のアミノ酸から分離することができる。中核の両側のアミノ酸の数（例えば、中核のアミノ酸および中核に架橋したアミノ酸間）は、同じか、または異なっていてよい。場合によっては、ステッチは、３、４、５、またはそれ以上の内部架橋アミノ酸を含むことができる。場合によっては、内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドは、１、２、３、４、５、またはそれ以上のステッチを含むことができる。
いくつかの局面において、本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドは、少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、または５つの）ステープルおよび少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、または５つの）ステッチの組合せを含むことができる。
内部架橋（例えば、ステープルおよび／またはステッチ）は、内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド内でアミノ酸上に配置され、ペプチドの結合するまたは相互作用する面におけるアミノ酸の構造的関係を保護する（例えば、ペプチドの結合する接合面を保存する）ことができる。あるいは、結合親和性または活性が変化しない限り、ステープルは、相互作用する面上に位置することができる。本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドの「相互作用する面」は、ＢＡＸタンパク質と相互作用する（例えば、特異的に相互作用するか、または特異的に結合する）アルファヘリックスのアミノ酸残基を含む。いくつかの局面において、ステープル（単数）またはステープル（複数）は、標的を部分的に、または完全にかみ合わせ、結合活性を増強させるように位置させることができる。例えば、ステープルまたはステッチは、内部交差ステッチド(cross-stitched)ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドの相互作用面におけるアミノ酸の構造的関係を保護するように位置させることができる。かかる内部架橋は、１つ以上のステープル；１つ以上のステッチ；および／または１つ以上のステープルと１つ以上のステッチとの組合せを含むことができる。
（例えば、内部架橋を支持する）修飾のためのアミノ酸の選択はまた、ステープルスキャンニングによって容易にすることができる。「ステープルスキャン」なる用語は、ステープルドペプチドのライブラリーの合成し、位置ｉおよびｉ＋３；ｉおよびｉ＋４；およびｉおよびｉ＋７の単一のおよび多重のステープルまたはステッチが、ペプチド配列の長さの方向に連続して配置され、全ての可能な位置をサンプリングし、ステープルドまたはステッチド構築物に関して所望のまたは最適な特性および活性を同定することを指す。
いくつかの局面において、つなぎ(tether)、例えば、炭化水素ステープルは、ヘリックス以外の構造を安定化させるために使用される。かかる場合において、つなぎの端部は、ｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、およびｉ＋７以外の間隔で位置することができる。
構造的に拘束されたペプチドなどは、構造的に拘束されたペプチドが未修飾ペプチドよりも限られた数の構造を取るように、任意の（すなわち、少なくとも１つの）化学修飾、例えば、天然または非天然アミノ酸での元のまたは天然の配列の変異；分子つなぎを組み込むための化学修飾、ジスルフィド架橋の形成を促進するための化学修飾などを有する修飾ペプチドを含むと理解される。構造的に拘束されたペプチドは、天然野生型配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の変異を含むことができる。例えば、分子つなぎは、安定なヘリックス構造、とりわけアルファヘリックスおよび３１０ヘリックス構造、またはつなぎの末端の位置およびつなぎの長さに依存するねじれの形成を促進するように炭化水素ステープルを含むことができる。天然または非天然アミノ酸は、ねじれ（例えば、２つの隣接構造間の可変角により定義されるように構造における曲がり）または他の好ましい立体構造(confirmations)を促進するために使用することができる。例えば、天然アミノ酸プロリンは、アミノ酸Ｒ基の構造および水素結合供与体の欠如のためにペプチドにおいてねじれを誘導することができる。非天然アミノ酸、特に大型および／または荷電Ｒ基を有するもの、またはＮ−メチル化アミド、Ｎ−置換グリシン、環状アルファ、アルファ−二置換、環状Ｎ，Ｎ−二置換、およびベータ−アミノ酸は、特定の所望の立体構造を促進することができる。溶液中の「構造的に拘束された」ペプチドの集団が常に所望の立体構造を有するとは限らないことが理解される。代わりに、溶液中の構造的に拘束されたペプチドの集団において、所望の立体構造は、化学修飾前の溶液中の天然のまたは元のペプチド配列よりも、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上で存在する。溶液中のペプチドの集団の構造は、限定はしないが、円偏光二色性およびＮＭＲ分光法を含む、当業者に知られている種々の方法により決定することができる。Ｘ線結晶学は、結晶の形態にまとめられる(packed)とき、拘束されたペプチドの構造を決定するために適用することができる。
適当なつなぎは、本願明細書に、および米国特許出願公開第２００５／０２５０６８０号、米国特許第８，５９２，３７７号、米国特許出願公開第２０１１／０３１８３５２号、ＷＯ２００９／１０８２６１、およびＷＯ２０１０／１４８３３５に記載されており、これらぞれぞれをそれら全体において出典明示により本願明細書に包含させる。
本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドにおける使用のための適当なアミノ酸側鎖は当分野で知られている。例えば、適当なアミノ酸側鎖は、メチル（アラニンについてアルファ−アミノ酸側鎖がメチルであるとき）、４−ヒドロキシフェニルメチル（チロシンについてアルファ−アミノ酸側鎖が４−ヒドロキシフェニルメチルであるとき）およびチオメチル（システインについてアルファ−アミノ酸側鎖がチオメチルであるとき）などを含む。「末端不飽和アミノ酸側鎖」は、ポリペプチド鎖において他の末端不飽和部分との架橋反応に参加する、末端不飽和部分、例えば置換のまたは非置換の二重結合（例えば、オレフィン）または三重結合（例えば、アセチレン）を有するアミノ酸側鎖を指す。１つの局面において、「末端不飽和アミノ酸側鎖」は末端オレフィンのアミノ酸側鎖である。１つの局面において、「末端不飽和アミノ酸側鎖」は末端アセチレンのアミノ酸側鎖である。１つの局面において、「末端不飽和アミノ酸側鎖」の末端部分はさらに置換されない。
上記のとおり、内部つなぎまたは架橋は、１つのヘリックス回転の長さ（すなわち、約３．４アミノ酸（すなわち、ｉ、ｉ＋３、またはｉ、ｉ＋４）または２つのヘリックス回転の長さ（すなわち、約７アミノ酸（すなわち、ｉ、ｉ＋７）に広がることができる。したがって、配列番号２または３のｉおよびｉ＋３；ｉおよびｉ＋４；またはｉおよびｉ＋７に位置するアミノ酸は、化学修飾および架橋のための理想的な候補である。したがって、例えば、ペプチドが配列…Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９…（式中、「…」はさらなるアミノ酸の任意の存在を示す）を有する場合、Ｘａａ１およびＸａａ４間、またはＸａａ１およびＸａａ５間、またはＸａａ１およびＸａａ８間の架橋が、Ｘａａ２およびＸａａ５間、またはＸａａ２およびＸａａ６間、またはＸａａ２およびＸａａ９間などの架橋のように、有用である。
内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドは、配列を更に安定させるか、またはより長いポリペプチド伸縮の安定化を促進するのいずれかのために、ポリペプチド配列内で２つ以上の架橋を含むことができる。ポリペプチドが１つの部分において容易に合成するには長過ぎるとき、独立して合成された内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドは天然化学的ライゲーションと呼ばれる技術によって結合させることができる（例えば、Bang, et al., J. Am. Chem. Soc. 126:1377-1383, 2004参照）。あるいは、大型ペプチドは、例えばＦｕｚｅｏｎの産業合成において、最後の脱保護後に、全長の所望の産物を形成するように、完全に保護されたフラグメントを特異的におよび連続して反応させる収束的(convergent)アプローチを使用して日常的に合成される。
本願発明は、式（Ｉ）
式（Ｉ）
［式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ３は、アルキレン、アルケニレン、またはアルキニレン（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１１、Ｃ１２、またはＣ１３アルキレン）、または［Ｒ４ ’−Ｋ−Ｒ４］ｎであり；これらはそれぞれ、０−６個のＲ５で置換されており；
Ｒ４およびＲ４’は、独立して、アルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンであり（例えば、それぞれは、独立して、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり）；
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、または放射性同位体であり；
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、
、アジリジン、エピスルフィド、ジオール、またはアミノアルコールであり；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、または治療剤であり；
ｎは、２、３、４、または６であり；
ｘは、２−１０の整数であり；
ｗおよびｙは、それぞれ独立して、０−１００の整数であり；
ｚは、１−１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）であり；そして
Ｘａａはそれぞれ、独立して、アミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸または任意の天然または非天然アミノ酸の１つ）である］
の修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を特徴とし、
該ポリペプチドは、（ａ）配列番号２または３の８個の隣接する（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の）アミノ酸内で、２から６つのアミノ酸（例えば、２、３、または６つのアミノ酸）によって分離されるアミノ酸の少なくとも１つの対（例えば、１、２、３、または４つの対）の側鎖は、式Ｉに記載されているアミノ酸の対のアルファ炭素と連結する連結基、Ｒ３によって置換される；および（ｂ）アミノ酸の第１の対のアルファ炭素は式Ｉに記載されているＲ１で置換されており、アミノ酸の第２の対のアルファ炭素は式Ｉに記載されているＲ２で置換されていることを除いては、配列番号２または３の少なくとも８個の（例えば、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の）隣接するアミノ酸またはその変異体（例えば、１、２、３、４、５、６、または７つのアミノ酸置換）、または本願明細書に記載されている別のポリペプチド配列を含む。
他の局面において、本願発明は、式（ＩＩ）
式（ＩＩ）
［式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、またはヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ３は、アルキレン、アルケニレン、またはアルキニレン（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１１、Ｃ１２、またはＣ１３アルキレン）、または［Ｒ４ ’−Ｋ−Ｒ４］ｎであり；これらはそれぞれ、０−６個のＲ５で置換されており；
Ｒ４およびＲ４’は、独立して、アルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンであり（例えば、それぞれは、独立して、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０アルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンであり）；
Ｒ５は、ハロ、アルキル、ＯＲ６、ＮＨＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＳＲ６、ＳＯＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯ２Ｒ６、Ｒ６、蛍光部分、または放射性同位体であり；
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯＮＲ６、
、アジリジン、エピスルフィド、ジオール、アミノアルコール、またはジアミンであり；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、または治療剤であり；
ｎは、２、３、４、５、または６であり；
ｘは、２−１０の整数であり；
ｗおよびｙは、それぞれ独立して、０−１００の整数であり；
ｚは、１−１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）であり；そして
Ｘａａはそれぞれ、独立して、アミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸または任意の天然または非天然アミノ酸の１つ）であり；
Ｒ７は、ａ）ＰＥＧ、ｂ）ｔａｔタンパク質、ｃ）アフィニティーラベル、ｄ）標的部分、ｅ）脂肪酸由来アシル基、ｆ）ビオチン部分、ｇ）例えば、チオカルバメートまたはカルバメート連結を介して、連結された蛍光プローブ（例えば、フルオレセインまたはローダミン）、またはｈ）２、３、４、５、６、６、８、または９個の隣接するＡｒｇの配列から選択され；
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ８ａ、またはＮＲ８ａＲ８ｂである］
の修飾ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を特徴とし、
該ポリペプチドは、（ａ）配列番号２または３のいずれか１つの少なくとも８個の（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の）隣接するアミノ酸内で、２から６つのアミノ酸（例えば、２、３、または６つのアミノ酸）によって分離されるアミノ酸の少なくとも１つの対（例えば、２、３、４、または５つの対）の側鎖は、式ＩＩに記載されているアミノ酸の対のアルファ炭素と連結する連結基、Ｒ３によって置換される；および（ｂ）アミノ酸の第１の対のアルファ炭素は式ＩＩに記載されているＲ１で置換されており、アミノ酸の第２の対のアルファ炭素は式ＩＩに記載されているＲ２で置換されていることを除いては、配列番号２または３の少なくとも８個の隣接するアミノ酸（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個）またはその変異体（例えば、１、２、３、４、５、６、または７つのアミノ酸置換）、または本願明細書に記載されている別のポリペプチド配列を含む。
式Ｉまたは式ＩＩの場合、以下の局面が開示されたものである。
ｘ＝２（すなわち、ｉ＋３連結）の場合、Ｒ３は、Ｃ７アルキレンまたはアルケニレンであってよい。アルケニレンである場合、１つ以上の二重結合が存在してよい。ｘ＝６（すなわち、ｉ＋４連結）の場合、Ｒ３は、Ｃ１１、Ｃ１２、またはＣ１３アルキレンまたはアルケニレンであってよい。アルケニレンである場合、１つ以上の二重結合が存在してよい。ｘ＝３（すなわち、ｉ＋４連結）の場合、Ｒ３は、Ｃ８アルキレンまたはアルケニレンであってよい。アルケニレンである場合、１つ以上の二重結合が存在してよい。
場合によっては、２つのアルファ、アルファ−二置換立体中心（アルファ炭素）は、Ｒ立体配置またはＳ立体配置において両方である（例えば、ｉ、ｉ＋４架橋）か、または１つの立体中心はＲであり、そしてもう一方はＳである（例えば、ｉ、ｉ＋７架橋）。したがって、式Ｉは以下のように描写される場合、
例えばｘが３であるとき、Ｃ’およびＣ’’二置換立体中心は、Ｒ立体配置において両方であってよく、またはそれらはＳ立体配置において両方であってよい。ｘが６であるとき、Ｃ’二置換立体中心はＲ立体配置においてであり、そしてＣ”二置換立体中心はＳ立体配置においてであるか、またはＣ’二置換立体中心はＳ立体配置においてであり、そしてＣ”二置換立体中心はＲ立体配置においてである。Ｒ３二重結合はＥまたはＺ立体化学的立体配置においてであってよい。同様の立体配置は、直前に描写された式においてＣ’およびＣ”に対応する式ＩＩにおける炭素に対して可能である。
場合によっては、Ｒ３は［Ｒ４−Ｋ−Ｒ４’］ｎであり；そしてＲ４およびＲ４’は、独立して、アルキレン、アルケニレン、またはアルキニレン（例えば、それぞれは、独立して、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン）である。
本願明細書に記載されている修飾ポリペプチドのいずれかの場合によっては、修飾ポリペプチドは、架橋によって置換されるアミノ酸側鎖に加えて、配列番号２または３において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のアミノ酸変化（例えば、保存アミノ酸変化）を有するアミノ酸配列を含む。
つなぎは、アルキル、アルケニル、またはアルキニル部分（例えば、Ｃ６、Ｃ８、またはＣ１１アルキル、Ｃ６、Ｃ８、またはＣ１１アルケニル、またはＣ５、Ｃ８、またはＣ１１アルキニル）を含むことができる。つながれたアミノ酸は、アルファ二置換されてもよい（例えば、Ｃ１−Ｃ３またはメチル）。［Ｘａａ］ｙおよび［Ｘａａ］ｗは、配列番号３の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の隣接するアミノ酸を独立して含むことができるペプチドであり、そして［Ｘａａ］ｘは、配列番号２または３の酸の２から７個の（例えば、２、３、６、または７個の）隣接するアミノ酸を含むことができるペプチドである。
内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドは、１つ以上の不斉中心を含むことができ、したがってラセミ体およびラセミ混合物、単一エナンチオマー、個々のジアステレオマー、およびジアステレオマー混合物および存在する何れかのオレフィンの幾何異性体（例えば、ＺまたはｃｉｓおよびＥまたはｔｒａｎｓ）として生じる。例えば、本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドは、特に幾何学的または立体異性体形態、例えば、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−異性体、Ｒ−およびＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物、およびそれらの他の混合物で存在することができる。エナンチオマーは、それらの対応するエナンチオマーを含まなくてよい（例えば、実質的に含まなくてよい）、および／または光学的に濃縮されてもよい。本願明細書において使用される「光学的に濃縮」は、化合物が有意により高い割合の１つのエナンチオマーから構成されていることを意味する。１つの局面において、実質的に含まないとは、組成物が少なくとも約９０重量％の好ましいエナンチオマーを含むことを意味する。他の局面において、化合物は、少なくとも約９５％、９８％、または９９重量％の好ましいエナンチオマーで構成されている。好ましいエナンチオマーは、限定はしないが、例えば、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびキラル塩の形成および結晶化を含む、当分野で知られている技術を使用してラセミ混合物から単離することができるか、または不斉合成によって調製することができる（例えば、Jacques, et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen, S. H. et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, EX, Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw- Hill, NY, 1962); Wilen, S.H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (EX. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972参照）。これらの内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドの全てのこのような異性体は、明白に本願発明に含まれる。
内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドはまた、複数の互変異性体形態において表すこともでき、このような例において、本願発明は、明白に、本願明細書に記載されている化合物の全ての互変異性体形態（例えば、平衡異性体（例えば、ケト−エノール）、ここで複数の部位でのアルキル化は位置異性体を生じることができる）、位置異性体、および本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドの酸化生成物を含む（本願発明は明白に全てのこのような反応産物を含む）。かかる内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドの全てのこのような異性体は、全ての結晶形態と同様に包含される
記号
は、分子構造の一環として使用されるとき、単一結合またはｔｒａｎｓまたはｃｉｓ二重結合を指す。
「ハロ」なる用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素の何れかの基を指す。「アルキル」なる用語は、指定された数の炭素原子を含有している直鎖または分枝鎖であってもよい炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１−Ｃ１０は、基がその中に１から１０個（両端を含む）の炭素原子を有することができることを指す。数字表示の非存在下で、「アルキル」は、その中に１から２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。「アルキレン」なる用語は、二価アルキル（すなわち、−Ｒ−）を指す。
「アルケニル」なる用語は、ＺまたはＥ幾何学的立体配置のいずれかにおいて１つ以上の炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖であってよい炭化水素鎖を指す。アルケニル部分は、指定された数の炭素原子を含む。例えば、Ｃ２−Ｃ１０は、基がその中に２から１０個（両端を含む）の炭素原子を有することができることを指す。「低級アルケニル」なる用語は、Ｃ２−Ｃ８アルケニル鎖を指す。数字表示の非存在下で、「アルケニル」は、その中に２から２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。
「アルキニル」なる用語は、１つ以上の炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖であってよい炭化水素鎖を指す。アルキニル部分は、指定された数の炭素原子を含む。例えば、Ｃ２−Ｃ１０は、基がその中に２から１０個（両端を含む）の炭素原子を有することができることを指す。「低級アルキニル」なる用語は、Ｃ２−Ｃ８アルキニル鎖を指す。数字表示の非存在下で、「アルキニル」は、その中に２から２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。
「アリール」なる用語は、６炭素単環式または１０炭素二環式芳香環系を指し、ここで、各環の０、１、２、３、４または５個の原子は置換基で置換されていてもよい。アリール基の例は、フェニル、ナフチルなどを含む。「アリールアルキル」なる用語または「アラルキル」なる用語は、アリールで置換されているアルキルを指す。「アリールアルコキシ」なる用語は、アリールで置換されているアルコキシを指す。
本願明細書において使用される「シクロアルキル」なる用語は、３から１２個の炭素、好ましくは３から８個の炭素、およびさらに好ましくは３から６個の炭素を有する飽和および部分的に不飽和環状炭化水素基を含み、ここで、シクロアルキル基はさらに所望により置換されていてもよい。好ましいシクロアルキル基は、限定はしないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロヘプタジエニル、シクロヘプタトリエニル、シクロオクチル、シクロオクテニル、シクロオクタジエニル、シクロオクタトリエニル、およびシクロオクチニルを含む。
「ヘテロアリール」なる用語は、芳香族性５−８員の単環式、８−１２員の二環式、または１１−１４員の三環式環系であって、単環式のとき１−３個のヘテロ原子、二環式のとき１−６個のヘテロ原子、または三環式のとき１−９個のヘテロ原子を有し、該ヘテロ原子はＯ、Ｎ、またはＳ（例えば、炭素原子および単環式、二環式、または三環式のそれぞれのとき１−３、１−６、または１−９個のＮ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）から選択され、ここで、各環の０、１、２、３、または４個の原子は置換基で置換されていてもよい、単環式、二環式または三環式環系を指す。ヘテロアリール基の例は、ピロリル、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピリダジル、ピリミジル、チオフェニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリルなどを含む。「ヘテロアリールアルキル」なる用語または「ヘテロアラルキル」なる用語は、ヘテロアリールで置換されているアルキルを指す。「ヘテロアリールアルコキシ」なる用語は、ヘテロアリールで置換されているアルコキシを指す。
「ヘテロシクリル」なる用語は、非芳香族性５−８員の単環式、８−１２員の二環式、または１１−１４員の三環式環系であって、単環式のとき１−３個のヘテロ原子、二環式のとき１−６個のヘテロ原子、または三環式のとき１−９個のヘテロ原子を有し、該ヘテロ原子はＯ、Ｎ、またはＳ（例えば、炭素原子および単環式、二環式、または三環式のそれぞれのとき１−３、１−６、または１−９個のＮ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）から選択され、ここで、各環の０、１、２または３個の原子は置換基で置換されていてもよい、単環式、二環式または三環式環系を指す。ヘテロシクリル基の例は、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、アジリジニル、オキシリル、チイリル（thiiryl）、モルホリニル、テトラヒドロフラニルなどを含む。
「置換基」なる用語は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール基上でその基の任意の原子で「置換された」基を指す。適当な置換基は、限定はしないが、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルコキシカルボニル、アミド、カルボキシ、アルカンスルホニル、アルキルカルボニル、アジド、およびシアノ基を含む。
場合によっては、本願明細書に記載されている炭化水素つなぎ（すなわち、架橋）は、さらに操作することができる。一例として、炭化水素アルケニルつなぎの二重結合（例えば、ルテニウム触媒閉環メタセシス（ＲＣＭ）を使用して合成されるとき）は、（例えば、エポキシ化またはジヒドロキシル化を介して）酸化され、以下の化合物の１つを提供することができる。
エポキシド部分または遊離ヒドロキシル部分の１つのいずれかを、さらに官能基化することができる。例えば、エポキシドを求核試薬で処理し、これが、例えばタグ（例えば、放射性同位体または蛍光タグ）に付着するするように、使用することができるさらなる機能性を提供することができる。タグは、体内の所望の位置へ化合物を指向するか、または体内の化合物の位置を追跡することを助けるために使用することができる。あるいは、さらなる治療剤（例えば、細胞保護剤）を、官能基化されたつなぎに化学的に付着させることができる。あるいは、かかる誘導体化は、内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ−末端の合成操作によって、またはアミノ酸側鎖を介してなし遂げることができる。他の薬剤、例えば、細胞への内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドの侵入を促進する薬剤を、官能基化されたつなぎに付着させることができる。
炭化水素つなぎ（架橋）を記載してきたが、他のつなぎ（架橋）も想定される。例えば、つなぎは、１つ以上のエーテル、チオエーテル、エステル、アミン、またはアミド部分を含むことができる。いくつかの場合において、天然アミノ酸側鎖を、つなぎに組み込むことができる。例えば、つなぎを、セリン中のヒドロキシル、システイン中のチオール、リジン中の第一級アミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸中の酸、またはアスパラギンまたはグルタミン中のアミドのような官能基と結合させることができる。したがって、２つの非天然アミノ酸を結合することによって作られるつなぎを使用するよりもむしろ天然アミノ酸を使用するつなぎを作ることができる。天然アミノ酸と共に単一の非天然アミノ酸を使用することもできる。
つなぎ（架橋）の長さを変えることできることが更に想定される。例えば、アルファヘリックス二次構造上に比較的高度の拘束を提供することが望ましい場合、より短い長さのつなぎを使用することができるが、アルファヘリックス二次構造上により小さい拘束を提供することが望ましい場合によっては、より長いつなぎがが望まれる可能性がある。
さらに、アルファヘリックスの単一面上に主にあるつなぎを提供するために、アミノ酸ｉからｉ＋３、ｉからｉ＋４；およびｉからｉ＋７に架かるつなぎ（架橋）の例が記載されているが、つなぎはアミノ酸の数の任意の組合せ（例えば、ｉからｉ＋７）に架かるように合成することができる。
場合によっては、アルファヘリックス二次構造の安定性を改善するために、アルファ−二置換アミノ酸が、内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドにおいて使用される。しかしながら、アルファ−二置換アミノ酸が必要とされず、モノ−アルファ置換基（例えば、つながれたアミノ酸において）を使用する場合も想定される。
場合によっては、配列番号２または３の相互作用する面上のアミノ酸を別のアミノ酸、例えば、Ａｌａで置換することが有用であり得る。かかる不活性な内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドは、例えば、ネガティブコントロールとして有用であり得る。
内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドは、薬物、毒素、ポリエチレングリコールの誘導体；第２のポリペプチド；炭水化物などを含むことができる。ポリマーまたは他の薬剤が内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドに連結される場合、これらの内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドを含む組成物は実質的に均質であることが望ましい可能性がある。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の付加は、修飾ポリペプチドまたは内部架橋ポリペプチドの薬物動態学および薬力学的特性を改善することができる。例えば、ペグ化は、腎臓クリアランスを低下させることができ、より安定な血漿濃度をもたらすことができる。ＰＥＧは、水溶性ポリマーであり、式：ＸＯ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−Ｙ［式中、ｎは２から１０，０００であり、ＸはＨまたは末端修飾、例えば、Ｃ１−４アルキルであり；Ｙは内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドのアミン基（限定はしないが、リジンのエプシロンアミンまたはＮ−末端を含む）へのアミド、カルバメート、またはウレア連結である］のようにポリペプチドに連結されるように表すことができる。Ｙはまた、チオール基（限定はしないが、システインのチオール基を含む）へのマレイミド連結であってもよい。ＰＥＧをポリペプチドに直接的または間接的に連結するための他の方法は当業者に知られている。ＰＥＧは直線状または分岐状であってもよい。種々の官能基化された誘導体を含むＰＥＧの種々の形態は市販されている。
骨格において分解可能な結合を有するＰＥＧを使用することができる。例えば、ＰＥＧは、加水分解されるエステル結合を用いて調製することができる。分解可能なＰＥＧ連結を有するコンジュゲートは、ＷＯ９９／３４８３３；ＷＯ９９／１４２５９、および米国特許第６，３４８，５５８号に記載されている。
１つの局面において、高分子ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、中間リンカーを介して本願明細書に記載されている修飾ポリペプチドまたは内部架橋ポリペプチドに付着される。１つの局面において、リンカーは、ペプチド結合によって連結される１から５０個（例えば、５、１５、２０、２５個）のアミノ酸であって、ここで、該アミノ酸は２０個の天然アミノ酸から選択される、アミノ酸で構成される。これらのアミノ酸のいくつかは、当業者によって理解されているように、グリコシル化することができる。他の局面において、１から５０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。他の局面において、リンカーは、グリシンおよびアラニンのような立体障害のない大多数のアミノ酸で構成される。他の局面において、リンカーは、グリシンおよび／またはセリン（例えば、Ｇ４Ｓ（配列番号３３））を含む。非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）−［式中、ｎ＝２−２０］のようなアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーはさらに、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどのような任意の立体障害のない基によって置換することができる。米国特許第５，４４６，０９０号は、ＰＥＧリンカー末端のそれぞれでペプチドを有するコンジュゲートを形成する二官能性ＰＥＧリンカーおよびその使用を記載している。
いくつかの局面において、内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドをまた、例えばさらに細胞摂取を促進するか、またはインビボ安定性を増加させるように、修飾することができる。例えば、ペプチド模倣物のアシル化またはＰＥＧ化は、細胞摂取を促進する、バイオアベイラビリティを増加させる、血液循環を増加させる、薬物動態学を変化させる、免疫原性を減少させる、および／または必要な投与の頻度を減少させる。
いくつかの局面において、本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドは、（例えば非ステープルドペプチドに対して）細胞膜を貫通する増強された能力を有する。
内部架橋ポリペプチドを作る方法
本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドを合成する方法は当分野で知られている。それにもかかわらず、以下の例示的な方法を使用することができる。代替の順番にて、または所望の化合物を得るために、種々の工程を行うことができることが理解される。本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドを合成することにおいて有用な合成化学変換および保護基方法論（保護および脱保護）は、当分野で知られており、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d. Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); and L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、およびそれらの後版(subsequent editions)に記載されているものを含む。
本願発明の内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドは、当業者に周知されている化学合成方法によって作ることができる。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77参照。したがって、ペプチドは、例えばApplied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430Aまたは431上で、側鎖保護アミノ酸を使用するｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学のいずれかにより保護されたα−ＮＨ２を用いる固相合成の自動Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術を使用して合成することができる。
本願明細書に記載されている架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドを作る１つの方法は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用することである。Ｃ−末端アミノ酸は、リンカー分子で酸に不安定な結合を介して架橋されるポリスチレン樹脂に付着される。この樹脂は、合成のために使用される溶媒に不溶性であり、比較的簡単におよび迅速に過剰な試薬および副産物を洗い流させる。Ｎ−末端は、酸に安定であるが塩基によって除去可能であるＦｍｏｃで保護される。任意の側鎖官能基は、塩基に安定な酸に不安定な基で保護される。
より長いペプチドは、ネイティブな化学ライゲーションを使用して個々の合成ペプチドを結合させることによって、作ることができる。あるいは、より長い合成ペプチドは、よく知られている組換えＤＮＡ技術により合成することができる。このような技術は、詳細なプロトコールを有するよく知られている標準マニュアルに提供される。本願発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、好ましくは遺伝子が発現される生物体に最適なコドンを用いて、アミノ酸配列を逆転写してアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、典型的にはペプチドおよび必要なとき調節要素をコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって、合成遺伝子を作る。合成遺伝子を適当なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトする。次に、選択された発現系および宿主に適している適当な条件下でペプチドを発現する。ペプチドを精製し、標準方法により特徴付ける。ペプチドは、ハイスループットな、組合せ方法において、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈから利用できるハイスループットマルチチャネル組合せシンセサイザー(high-throughput multiple channel combinatorial synthesizer)を使用して、作ることができる。
例えば、レトロインベルソ(retro-inverso)結合（Ｃ（Ｏ）−ＮＨ）；還元アミド結合（ＮＨ−ＣＨ２）；チオメチレン結合（Ｓ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｓ）；オキソメチレン結合（Ｏ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ２−ＣＨ２）；チオアミド結合（Ｃ（Ｓ）−ＮＨ）；トランス−オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フッ素置換トランス−オレフィン結合（ＣＦ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ）またはＣＨＲ−Ｃ（Ｏ）、ここでＲはＨまたはＣＨ３である；およびフルオロケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＦＲまたはＣＦＲ−Ｃ（Ｏ）、ここでＲはＨ、Ｆ、またはＣＨ３である、によって、内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドの生理学的安定性を増加させるように、１つ以上のペプチド結合を置換することができる。
内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドは、さらに、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化(cinnamoylation)、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化、およびスルフリル化の１つ以上によって修飾することができる。上記のとおり、内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ１−Ｃ２０直鎖または分岐鎖アルキル基）；脂肪酸基；およびこれらの組合せにコンジュゲートすることができる。
様々な長さのオレフィン側鎖を含むα、α−二置換非天然アミノ酸は、既知の方法によって合成することができる（例えば、Williams et al., J. Am. Chem. Soc.113:9276, 1991; Schafmeister et al., J. Am. Chem Soc. 122:5891, 2000; Bird et al., Methods Enzymol., 446:369, 2008; Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011参照）。ｉ＋７ステープルに連結したｉが使用される内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドについて（安定化されたヘリックスの２回転）、１つのＳ５アミノ酸および１つのＲ８が使用されるか、または１つのＳ８アミノ酸および１つのＲ５アミノ酸が使用されるかのいずれかで使用される。開始キラル補助基がＲ−アルキル−立体異性体を与えることを除いては、Ｒ８は同じ経路を使用して合成される。また、８−ヨードオクテンが、５−ヨードペンテンの代わりに使用される。阻害剤は、ＭＢＨＡ樹脂上で固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して固体支持体上で合成される（例えば、ＷＯ ２０１０／１４８３３５参照）。
Ｆｍｏｃ−保護α−アミノ酸（オレフィンアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｓ５−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｒ８−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｒ８−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓ８−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｒ５−ＯＨ以外）、２−（６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、およびＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡは、例えばＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびピペリジンは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。オレフィンアミノ酸合成は、当該技術分野において報告されている（Williams et al., Org. Synth., 80:31, 2003）。
場合によっては、内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドは、検出可能な標識を含むことができる。本願明細書において使用される「標識」は、標識が付着されるペプチド（例えば、内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド）の検出を可能にする部分に組み込まれる少なくとも１つの元素、アイソトープ、または官能基を有する部分を指す。標識は、直接的に付着させることができるか（すなわち、結合を介して）、または、リンカー（例えば、リンカーを構成することができる、例えば、環状または非環状、分岐または非分岐、置換または非置換アルキレン；環状または非環状、分岐または非分岐、置換または非置換アルケニレン；環状または非環状、分岐または非分岐、置換または非置換アルキニレン；環状または非環状、分岐または非分岐、置換または非置換ヘテロアルキレン；環状または非環状、分岐または非分岐、置換または非置換ヘテロアルケニレン；環状または非環状、分岐または非分岐、置換または非置換ヘテロアルキニレン；置換または非置換アリーレン；置換または非置換ヘテロアリーレン；または置換または非置換アセチレン(acylene)、またはこれらの任意の組合せ）によって付着させることができる。標識は、検出される本願発明の内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドの生物学的活性または特性を妨げない任意の位置で、内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドに付着させることができる。
標識は、限定はしないが、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ（Ｔｃ−９９ｍ）、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１６９Ｙｂ、および１８６Ｒｅを含む放射性または重同位体であってよい同位体部分を含む標識；酵素に結合することができる、抗体または抗原であってよい、免疫または免疫反応性部分を含む標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）；有色性、発光性、リン光性であるか、または蛍光部分を含む標識（例えば、蛍光標識ＦＩＴＣ）；１つ以上の光親和性部分を有する標識；１つ以上の公知の結合パートナーとリガンド部分を有する標識（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン、ＦＫ５０６−ＦＫＢＰなど）を含むことができる。
場合によっては、標識は、生物学的システムにおける分子間相互作用の直接的解明のために１つ以上の光親和性部分を含むことができる。ジアゾ化合物、アジド、またはジアジリンのナイトレンまたはカルベンへの光変換に大いに頼っている種々の既知の発光器を使用することができる（例えば、Bayley, H., Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology (1983), Elsevier, Amsterdam参照、この全体の内容を出典明示により本願明細書に包含させる）。本願発明の１つの局面において、使用される光親和性標識は、限定はしないが４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸を含む、１つ以上のハロゲン部分で置換されているｏ−、ｍ−およびｐ−アジドベンゾイルである。
標識はまた、造影剤(imaging agent)であってよく、または造影剤として役割を果たしてよい。例示的な造影剤(imaging agent)は、限定はしないが、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピューター支援断層撮影法（ＣＡＴ）、単光子放出型コンピューター断層撮影法、Ｘ線、蛍光透視法、および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）において使用されるもの；制吐剤；および造影剤(contrast agent)を含む。例示的な診断薬は、限定はしないが、蛍光部分、発光性部分、磁性部分；ガドリニウムキレート（例えば、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＤＯＴＡ、およびＨＰ−ＤＯ３Ａを有するガドリニウムキレート）、鉄キレート、マグネシウムキレート、マンガンキレート、銅キレート、クロムキレート、ＣＡＴおよびｘ線イメージングのために有用なヨウ素ベースの材料、および放射性核種を含む。適当な放射性核種は、限定はしないが、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３０Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｉ、１３５Ｉ、４７Ｓｃ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、９０Ｙ、８８Ｙ、９７Ｒｕ、１００Ｐｄ、１０１ｍＲｈ、１１９Ｓｂ、１２８Ｂａ、１９７Ｈｇ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６７Ｃｕ、７５Ｂｒ、７７Ｂｒ、９９ｍＴｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５０、３２Ｐ、３３Ｐ、および１８Ｆを含む。
蛍光性および発光性部分は、限定はしないが、「色素」、「標識」または「指標」として一般的に称される種々の異なる有機または無機小分子を含む。例は、限定はしないが、フルオレセイン、ローダミン、アクリジン色素、Ａｌｅｘａ色素、シアニン色素などを含む。蛍光性および発光性部分は、種々の天然タンパク質およびその誘導体、例えば、遺伝的に操作された変異体を含んでもよい。例えば、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強ＧＦＰ、赤色、青色、黄色、シアン、およびサファイア蛍光タンパク質、リーフコーラル蛍光タンパク質(reef coral fluorescent protein)などを含む。発光性タンパク質は、ルシフェラーゼおよびエクオリン、およびそれらの誘導体を含む。多数の蛍光および発光色素およびタンパク質が当分野で知られている（例えば、米国特許出願公開第２００４／００６７５０３号；Valeur, B., “Molecular Fluorescence: Principles and Applications,” John Wiley and Sons, 2002;およびHandbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes, 9th edition, 2002参照）。
また、本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドを得る（例えば、合成する）、ステープル化する、および精製するための適当な方法もまた当分野で知られている（例えば、Bird et. al., Methods in Enzymology 446:369-386 (2008); Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology 2011; Walensky et al., Science 305:1466-1470 (2004); Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000);米国特許出願公開第２０１０／０１６８３８８号；および米国特許第７，７２３，４６８号参照、これらそれぞれをそれら全体において出典明示により包含させる）。
いくつかの態様において、内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドは、非ステープルドペプチド汚染を実質的に含まないか、または単離される。内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドを精製するための方法は、例えば固相支持体上でペプチドを合成することを含む。環化後、固相支持体を単離し、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ／ジクロロメタン混合物またはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物のような溶媒の溶液に懸濁させてもよい。ＤＭＳＯ／ジクロロメタンまたはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物は、約３０％、４０％、５０％、または６０％ＤＭＳＯを含んでもよい。特定の態様において、５０％／５０％のＤＭＳＯ／ＮＭＰ溶液を使用する。溶液を１、６、１２、または２４時間インキュベートし、その後、樹脂を、例えばジクロロメタンまたはＮＭＰで、洗浄してもよい。１つの態様において、樹脂をＮＭＰで洗浄する。溶液に不活性ガスを振盪することおよび泡立てることを行ってもよい。
本願発明の内部架橋ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドの特性は、例えば以下に記載される方法を使用して、アッセイすることができる。例えば、本願明細書に記載されている任意の架橋ポリペプチドおよびポリペプチドは、（例えば、本願明細書に記載されている、または当分野で知られている方法を使用して）ストレス誘発性細胞死を防止または減少するか、または、（例えば、蛍光支援細胞選別、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンド標識化（ＴＵＮＥＬ）、および／または免疫蛍光顕微鏡、または細胞アポトーシスまたは細胞死を検出するための当分野で知られている任意の他の方法を使用して）細胞死（例えば、アポトーシス）を増加または誘導する能力について試験することができる。
α−らせん性を決定するアッセイ：内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドを水溶液に溶解する（例えば２５−５０μＭの濃度に、ｐＨ７で５ｍＭ リン酸カリウム溶液、または蒸留したＨ２Ｏ）。標準測定パラメーター（例えば温度、２０℃；波長、１９０−２６０ｎｍ；ステップ分解能、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；蓄積、１０；応答、１秒；バンド幅、１ｎｍ；路長、０．１ｃｍ）を使用して、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを分光偏光計（例えば、Ｊａｓｃｏ Ｊ−７１０、Ａｖｉｖ）上で得た。各内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドのα−ヘリックス含量を、平均残基楕円率をモデルヘリックスデカペプチドについて報告される値で割ることにより計算する（例えば、Yang et al., Methods Enzymol. 130:208 (1986)参照）。
融解温度（Ｔｍ）を決定するアッセイ：内部架橋ポリペプチド／修飾ポリペプチドまたは未修飾鋳型ペプチドを、蒸留したＨ２Ｏまたは他のバッファーまたは溶媒（例えば５０μＭの最終濃度で）に溶解し、Ｔｍを、標準パラメーター（例えば、波長２２２ｎｍ；ステップ分解能、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；蓄積、１０；応答、１秒；バンド幅、１ｎｍ；温度上昇速度：１℃／分；路長、０．１ｃｍ）を使用して、分光偏光計（例えば、Ｊａｓｃｏ Ｊ−７１０、Ａｖｉｖ）上で温度範囲（例えば、４から９５℃）にわたって楕円率の変化を測定することにより決定する。
インビトロでのプロテアーゼ耐性アッセイ：ペプチド骨格のアミド結合はプロテアーゼによる加水分解に敏感であり、それによりペプチド化合物がインビボで迅速な分解を受けやすくする。しかしながら、ペプチドヘリックス形成は一般的にアミド骨格を埋めるおよび／またはねじるおよび／または保護し、したがってタンパク質分解開裂を防止するかまたは実質的に遅らせ得る。本願発明の内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドは、対応する架橋されていないまたはあるいはステープルドポリペプチドと比較して分解速度の変化について評価するために、インビトロ酵素的タンパク質分解（例えば、トリプシン、キモトリプシン、およびペプシン）に付されてもよい。例えば、内部架橋または修飾ポリペプチドおよび対応する架橋されていないポリペプチドをトリプシンアガロースとインキュベートし、反応を遠心分離および後のＨＰＬＣ注入によって種々の時点でクエンチし、２８０ｎｍでの紫外線吸収によって残留基質を定量する。簡潔には、内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドおよびコントロールの架橋されていないポリペプチドまたはあるいはステープルドポリペプチド（５ｍｃｇ）を、０、１０、２０、９０、および１８０分間、トリプシンアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）（Ｓ／Ｅ 約１２５）とインキュベートする。反応を、高速で卓上遠心分離によってクエンチする；単離された上清中の残りの基質を２８０ｎｍでのＨＰＬＣベースのピーク検出によって定量される。タンパク質分解反応は、一次速度論を示し、速度定数、ｋは、時間に対するｌｎ［Ｓ］のプロットから決定される。
内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドおよび／または対応する架橋されていないポリペプチドを、例えば０、１、２、４、８、および２４時間、３７℃で、新鮮なマウス、ラットおよび／またはヒト血清（例えば１−２ｍＬ）とそれぞれインキュベートすることができる。異なる内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド濃度のサンプルが、血清での連続希釈によって調製され得る。無傷な内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドのレベルを決定するために、以下の処理が使用され得る：サンプルを、例えば、１００μＬの血清を２ｍＬ遠心チューブに移し、次に１０μＬの５０％ギ酸および５００μＬのアセトニトリルを付加し、４±２℃で１０分間１４，０００ＲＰＭで遠心分離することによって、抽出した。次に、上清を新鮮な２−ｍＬチューブに移し、Ｎ２＜１０ｐｓｉ、３７℃下でＴｕｒｂｏｖａｐ上で蒸発させる。サンプルを１００μＬの５０：５０ アセトニトリル：水に再構成し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に付す。エキソビボ安定性を試験するための同等または同様の手順は既知であり、血清中の大員環の安定性を決定するために使用され得る。
インビボでのプロテアーゼ耐性アッセイ：ペプチドステープル化の重要な利益は、インビトロでのプロテアーゼ耐性のインビボでの著しく改善された薬物動態学への変換である。液体クロマトグラフィー／質量分析ベースの分析アッセイは、血漿中の内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドのレベルを検出および定量するために使用することができる。薬物動態学分析のために、内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドを、滅菌５％デキストロース水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ボーラス尾静脈または腹腔内注射（例えば、５、１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇ）によりＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に投与する。各時点で５匹の動物に投薬した５、３０、６０、１２０、および２４０分後、血液を眼窩後穿刺により回収する。血漿を遠心分離（２，５００ ｘ ｇ、５分、４℃）後に回収し、アッセイまで−７０℃で貯蔵する。血漿中のペプチド濃度は、エレクトロスプレーイオン化質量分析検出を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーによって決定される（例えば、Aristoteli et al., Journal of Proteome Res. 6:571-581, 2007; Walden et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry 378:883-897, 2004参照）。１．０から５０．０μｇ／ｍＬの範囲の濃度での血漿中の内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドの一連の７つの較正標準、内部標準の付加有りおよび無しでアッセイされる無薬物血漿、および３つの品質管理サンプル（例えば、３．７５、１５．０、および４５．０μｇ／ｍＬ）と共に、試験サンプルをアッセイする。各較正標準において既知の内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド濃度に対する分析物／内部標準クロマトグラフィーピーク面積比をプロットすることによって、標準曲線を構築する。較正標準の数に対して正規化された分析物濃度の逆数に比例して重み付けにて線形最小二乗回帰を行う。最良適合線の傾きおよびｙ切片の値が、試験サンプル中の内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドを計算するために使用される。血漿濃度−時間曲線を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ５．０ソフトウェア（Pharsight Corp., Cary, NC）を使用する標準非区画方法により分析し、薬物動態パラメーター、例えば、初期および最終段階血漿半減期、ピーク血漿レベル、総血漿クリアランス、および見かけの容量配分を得る。
インビトロ結合アッセイ：タンパク質（例えば、ＩＰ３Ｒ１）への内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドの結合およびアフィニティーを評価するために、例えば、蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を使用することができる。ＦＰＡ技術は、偏光および蛍光トレーサーを使用して分子配向および移動度を測定する。偏光で励起されるとき、高い見かけの分子量を有する分子に付着した蛍光トレーサー（例えば、ＦＩＴＣ）（例えば、大型タンパク質に結合したＦＩＴＣ標識された内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド）は、より小さい分子に付着した蛍光トレーサー（例えば、溶液中で遊離しているＦＩＴＣ標識された内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド）と比較して、より遅い回転速度のために偏光蛍光のより高いレベルを発する。
ペプチド−タンパク質相互作用のアンタゴニストを特徴づけるインビトロ置換アッセイ：内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドおよびタンパク質（例えば、ＩＰ３Ｒ１タンパク質）間の相互作用をアンタゴナイズする化合物の結合およびアフィニティーを評価するために、例えば、フルオレセイン化内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドを利用する蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を使用する。ＦＰＡ技術は、偏光および蛍光トレーサーを使用して、分子配向および移動度を測定する。偏光で励起されるとき、高い見かけの分子量を有する分子に付着した蛍光トレーサー（例えば、ＦＩＴＣ）（例えば、大型タンパク質（例えば、ＩＰ３Ｒ１タンパク質）に結合したＦＩＴＣ標識された内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド）は、より小さい分子に付着した蛍光トレーサー（例えば、溶液中で遊離しているＦＩＴＣ標識された内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド）と比較して、より遅い回転速度のために偏光蛍光のより高いレベルを発する。フルオレセイン化内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドおよび受容体タンパク質間の相互作用をアンタゴナイズする化合物は、競合的結合ＦＰＡ実験において検出される。
無傷の細胞における結合アッセイ：無傷の細胞上または中のペプチドまたは内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドのタンパク質（例えば、ＩＰ３Ｒ１タンパク質）への結合を免疫沈降実験によって測定することができる。
細胞透過性アッセイ：内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドの細胞透過性を測定するために、無傷の細胞を血清非含有培地またはヒト血清を補った培地中で、３７℃で４時間フルオレセイン化内部架橋ポリペプチド（１０μＭ）とインキュベートし、培地で２回洗浄し、トリプシン（０．２５％）と１０分３７℃でインキュベートする。細胞を再び洗浄し、ＰＢＳに再懸濁する。細胞蛍光を、例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターまたはＣｅｌｌｏｍｉｃｓ ＫｉｎｅｔｉｃＳｃａｎ（登録商標） ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒのいずれかを使用することによって、分析する。
臨床試験：ヒトの処置のための本願発明の内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、化合物、または医薬組成物の適合性を決定するために、臨床試験を行うことができる。例えば、化学療法を必要とする癌を有するか、または癌を有することが疑われる患者は、処置および１つ以上のコントロールグループに選択および分離され、処置グループは、本願発明の内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、化合物、または医薬組成物を投与されるが、コントロールグループは、プラセボまたは既知の細胞保護薬を受ける。したがって、本願発明の内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、化合物、または医薬組成物の処置安全性および有効性は、症状の予防、症状の解消までの時間、および／または疾患の１つ以上の症状の数、重症度、または頻度の減少までの時間などの要因に対して患者グループの比較を実施することによって評価することができる。いくつかの態様において、本願発明の内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、化合物、または医薬組成物を投与された対象は、プラセボを受けるコントロールグループにおける対象と比較して、疾患の症状の数の減少を有することができる。
医薬組成物
１つ以上の本願明細書に記載されているタンパク質、ポリペプチド、または内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド（例えば、１つ以上のｂｃｌｗ模倣物、またはｂｃｌｗタンパク質またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメント、またはアミノ酸配列（例えば、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのＩＰ３Ｒ１またはＢａｘの相互作用するアルファヘリックス面）と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド）は、医薬組成物として、または医薬組成物において使用するために製剤化することができる。このような組成物は、任意の経路、例えば、Food and Drug Administration（ＦＤＡ）によって承認された任意の経路を介する対象への投与のために製剤化または適合させることができる。例示的な方法は、FDA Data Standards Manual（www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/ FormsSubmissionRequirements/ElectronicSubmissions/DataStandardsManualmonographs/ default.htmで利用できる）に記載されている。例えば、組成物は、吸入（例えば、経口および／または経鼻吸入（例えば、噴霧器またはスプレーを介して））、注射（例えば、静脈内、動脈内、皮下(subdermally)、腹腔内、筋肉内、および／または皮下(subcutaneously)）、および／または経口投与、経粘膜投与、および／または局所投与（局所クリームまたは軟膏、局所（例えば、経鼻）スプレー、および／または局所溶液を含む）による投与のために製剤化または適合させることができる。
場合によっては、医薬組成物は、有効量の１つ以上の内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド（例えば、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインを有する内部架橋ポリペプチド）を含むことができる。本願明細書において使用される「有効量」および「処置に有効」なる用語は、意図される効果または生理学的結果（例えば、ＣＩＰＮおよび／または難聴の予防または処置）を引き起こすための投与の文脈内で有効である期間に対して利用される（急性または慢性投与および周期的または連続的な投与を含む）本願明細書に記載されている１つ以上の内部架橋ポリペプチドおよび／または修飾ポリペプチドまたは医薬組成物の量または濃度を指す。
本願発明の医薬組成物は、１つ以上の内部架橋ポリペプチドおよび／または修飾ポリペプチドおよび任意の薬学的に許容される担体、アジュバントおよび／またはビヒクルを含むことができる。場合によっては、医薬組成物は、疾患または疾患症状の調節を達成することに対して有効な量において１つ以上のさらなる治療剤をさらに含むことができる。
場合によっては、本開示のいくつかの医薬組成物は、本願明細書に記載されている障害の症状の緩和のための１つ以上の薬剤（例えば、ＣＩＰＮまたは難聴の症状の緩和のための薬剤）を含むことができる。
場合によっては、本開示の医薬組成物は、メトホルミンを含むことができる。場合によっては、本開示の医薬組成物は、１つ以上のカルパインインヒビター（例えば、ＡＫ２７５、ＭＤＬ２８１７０（カルパインインヒビターＩＩＩ、ＣＡＳ ８８１９１−８４−８）、ＰＤ１５０６０６、ＳＪＡ６０１７、ＡＢＴ−７０５２５３、およびＳＮＪ−１９４５）を含むことができる。
「薬学的に許容される担体」なる用語は、１つ以上の本願発明の内部架橋ポリペプチドおよび／または修飾ポリペプチドと共に、患者に投与することができる、および１つ以上の内部架橋ポリペプチドおよび／または１つ以上の修飾ポリペプチドの治療量を送達するために十分な用量において投与されるとき、その薬理学的活性を破壊しない、および非毒性である、担体を指す。
本願発明の医薬組成物において使用することができる薬学的に許容される担体およびビヒクルは、限定はしないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化型薬物送達系（ＳＥＤＤＳ）、例えば、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール １０００ スクシネート、Ｔｗｅｅｎｓまたは他の類似のポリマー性送達マトリックスのような医薬投与形態において使用される界面活性剤、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、および塩）、および電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂）を含む。シクロデキストリン（例えば、α−、β−、およびγ−シクロデキストリン）はまた、本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチドおよび／または修飾ポリペプチドの送達を増強するために有利に使用することができる。
本願発明の医薬組成物は、任意の慣用の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含むことができる。いくつかの場合において、製剤のｐＨは、製剤化された内部架橋ポリペプチドおよび／または修飾ポリペプチド、またはその送達形態の安定性を増強するために、薬学的に許容される酸、塩基またはバッファーで調整することができる。本願明細書において使用される「非経口」なる用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。
医薬組成物は、溶液、吸入および／または経鼻投与のための粉末、または局所投与のためのクリームまたはスプレーの形態であってよい。このような組成物は、適当な分散または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）および懸濁剤を使用して当該分野で知られている技術にしたがって、製剤化することができる。
医薬組成物は、防腐剤および添加剤を含むことができる。防腐剤は、微生物増殖または汚染を制限または防止するために含むことができる。例示的な防腐剤は、限定はしないが、チメロサール、塩化ベンゼトニウム（Ｐｈｅｍｅｒｏｌ）、フェノール、および２−フェノキシエタノールを含むことができる。例示的な添加剤は、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、および抗生物質を含むことができる。
場合によっては、本願明細書に記載されている１つ以上の内部架橋ポリペプチドおよび／または修飾ポリペプチドは、例えば担体タンパク質に、コンジュゲートさせることができる。かかるコンジュゲートされた組成物は、一価または多価であってよい。例えば、コンジュゲートされた組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートされた本願明細書に記載されている１つの内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドを含むことができる。あるいは、コンジュゲートされた組成物は、担体にコンジュゲートされた本願明細書に記載されている２つまたはそれ以上の内部架橋ポリペプチドまたは修飾ポリペプチドを含むことができる。このような例において、さらなる細胞保護成分または化学療法剤もまた、担体タンパク質と結合させることができる。
本願明細書において使用されるとき、２つのエンティティー(entities)が互いに「コンジュゲート」されるとき、それらは直接的または間接的に共有または非共有相互作用によって連結される。１つの局面において、会合(association)は共有結合である。他の局面において、会合は非共有結合である。非共有相互作用は、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気相互作用、静電相互作用などを含む。間接共有相互作用は、２つのエンティティーが共有的に連結されるとき、所望によりリンカー基を介してである。
担体タンパク質は、対象において医薬組成物の細胞保護活性を増加または増強させる任意のタンパク質を含むことができる。ポリマー性担体は、１つ以上の一級および／または二級アミノ基、アジド基、またはカルボキシル基を含む天然または合成材料であってよい。担体は水溶性であってよい。
いくつかの局面において、本開示は、ＣＩＰＮまたは難聴を処置または予防するためにこれらの医薬組成物を使用するための方法を提供する。
有効量は、とりわけ処置される対象の種、対象の体重、および選択される処置レジメンに依存し得るが、有効量は当業者によって容易に決定することができる。
化学療法誘発性末梢性ニューロパシーの処置の方法
化学療法は、一般的に癌処置の文脈において使用され、標準化された処置レジメンの一環として化学療法剤と称される１つ以上の抗癌薬を使用する。化学療法は、（ほとんどの場合、薬物の組合せを含む）治療目的で与えられ得、または生存を延長するまたは症状を低下させることを目的とされ得る（緩和的化学療法）。
化学療法剤の非限定的な例は、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド(cyclophosamide)、イホスファミド、メルファラン、ストレプトゾシン、カルムスチン、ロムスチン、オキサリプラチン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロマイド、チオテパ、およびアルトレタミン）、代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル、カペシタビン、６−メルカプトプリン、葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート）、ゲムシタビン、アラビノシド（例えば、シタラビン）、フルダラビン、およびペメトレキセド）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、およびイダルビシン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポテカン、イリノテカン、およびエピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド(teniposode)））、微小管標的化剤および紡錘体毒（例えば、タキサン類（パクリタキセルおよびドセタキセル）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニン、ディスコデルモライド、エリュテロビン、サルコジクチン、エポチロン、イキサベピロン、コルヒチン、コンブレタスタチン、２−メトキシエストラジオール、ノスカピン、およびエストラムスチン）、プロテアソーム阻害剤、ＥＧＦ−Ｒ阻害剤、Ｅｐｈ−Ｒ阻害剤、ｐ３８／ＪＡＫキナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、Ｔｒｋ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン、プレドニゾロン、およびメチルプレドニゾロン）、白金化合物、および治療抗体（例えば、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、セツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、イピリムマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、およびトラスツマブ）を含む。化学療法は、しばしば、いくつかの副作用を生じる。
化学療法誘発性末梢性ニューロパシー（ＣＩＰＮ）、化学毒性軸索損傷の型は、腫瘍学における多数の細胞毒性化学療法の一般的な用量制限的な副作用である。ＣＩＰＮは、軸索損傷および神経学的損傷の頻繁な原因を構成する。ＣＩＰＮを有する患者は、長い末梢感覚または運動ニューロン軸索の変性のために、疼痛、刺痛、無感覚、および／または運動機能障害を経験する。
ＣＩＰＮをもたらす化学療法薬は、微小管標的化剤を含む。例えば、ＣＩＰＮは、化学療法剤、例えば、限定はしないが、タキサン類（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ビンフルニン、ビンクリスチン）アルキル化剤、アラビノシド、プロテアソーム阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、ディスコデルモライド、エリュテロビン、サルコジクチン、エポチロン、コルヒチン、コンブレタスタチン、２−メトキシエストラジオール、およびノスカピンの使用から生じ得る。微小管標的化化学療法剤（例えば、乳癌、卵巣癌、および肺癌を処置するために使用されるもの）は、原発性(primarily)感覚ニューロパシーを引き起こす。化学療法誘発性変性のためのメカニズムは理解されておらず、この一般的な障害のために利用できる処置は現在存在しない。
本開示は、微小管標的化化学療法剤がｂｃｌｗの軸索発現を低下させるが、密接に関連した成分Ｂｃｌ２またはＢｃｌｘＬの発現を変化させないことを示す。ｂｃｌｗは変性から軸索を保護することが示されており、パクリタキセルのような微小管標的化薬物はｂｃｌｗの軸索レベルを低下させることによってこの保護を中止することによって変性を引き起こす。ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインは、軸索変性を低下させるかまたは防止するために十分である。したがって、ｂｃｌｗタンパク質またはＢＨ４を含むｂｃｌｗポリペプチドならびにｂｃｌｗ模倣物は、ＣＩＰＮに対する臨床的に有用な治療を提供する。
本開示は、それを必要とする対象においてＣＩＰＮの予防または処置のために、有効量の本願明細書に記載されている１つ以上の模倣物、ポリペプチド、または医薬組成物（例えば、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％から１００％同一であるアミノ酸配列を有する１つ以上のｂｃｌｗ模倣物またはポリペプチド）を使用する方法を含む。場合によっては、方法は、ｂｃｌｗタンパク質またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメントを投与することを含む。いくつかの場合において、ＢＨ４ドメイン含有ｂｃｌｗフラグメントは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。場合によっては、方法は、配列番号２または３に示されているアミノ酸配列を含むか、またはからなるｂｃｌｗポリペプチドを投与することを含む。いくつかの場合において、ｂｃｌｗポリペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。いくつかの場合において、ｂｃｌｗポリペプチドは、１から１２個のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５個）および／または１から５個のアミノ酸欠失（例えば、ポリペプチドのＮまたはＣ−末端で１、２、３個）を有する配列番号２または３に示されているアミノ酸配列を含むか、またはからなる。いくつかの場合において、ｂｃｌｗポリペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。場合によっては、方法は、配列番号４−３２または５０−５３に示されているアミノ酸配列のいずれか１つを含むか、またはからなるｂｃｌｗ模倣物を投与することを含む。場合によっては、方法は、１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換および／または欠失（例えば、ＮまたはＣ−末端で；ＩＰ３Ｒの相互作用しないアルファヘリックス面；Ｂａｘの相互作用しないアルファヘリックス面）を除けば、配列番号４−３２または５０−５３に示されているアミノ酸配列のいずれか１つを含むか、またはからなるｂｃｌｗ模倣物を投与することを含む。方法は、他の治療的に有益な薬剤を対象に投与することをさらに含むことができる。例えば、メトホルミンおよび／または１つ以上のカルパイン阻害剤を、本願明細書に記載されているｂｃｌｗ模倣物、ｂｃｌｗポリペプチド、または医薬組成物の投与前、投与中、および／または投与後に投与することができる。
本願明細書において使用される「対象」なる用語は、任意の哺乳動物を指す。１つの局面において、本願明細書において使用される「対象」なる用語は、ヒト（例えば、男性、女性、または子供）を指す。
本願明細書において使用される「投与する」、「投与すること」または「投与」なる用語は、１つ以上の本願発明の内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、または医薬組成物（例えば、本願明細書に記載されているもののいずれか）を移植すること、吸収すること、摂取すること、注射すること、または吸入することを指す。場合によっては、１つ以上の本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、化合物、または医薬組成物は、局所的および／または経口的に対象に投与することができる。例えば、本願明細書に記載されている方法は、所望の、または記載された効果をなし遂げるための有効量の１つ以上の内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、化合物、または医薬組成物の投与を含む。本願発明の内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、化合物、および医薬組成物は、少なくとも週に１回（例えば、週に約２回、週に約３回、週に約４回、週に約５回、週に約６回、または１日に約１から約６回）またはあるいは、連続的注入として投与することができる。かかる投与は、慢性または急性治療として使用することができる。
特定の患者に対する特定の用量および処置レジメンは、使用される特定の内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、または化合物の活性、年齢、体重、一般健康状態、性別、食事、投与時間、排出率、薬物組合せ、ＣＩＰＮの重症度および経過、処置に対する患者の体内動態、および処置する医師の判断を含む種々の因子に依存する。
投与後、対象は、対象におけるＣＩＰＮの症状の数および／または１つ以上の症状の重症度および／または頻度を検出、評価、または決定するために評価することができる。場合によっては、処置は、ＣＩＰＮの症状の数および／または１つ以上の症状の重症度および／または頻度における低下が観察されるまで、続けることができる。患者の状態が改善したとき、必要なとき、本開示の模倣物、ポリペプチド、または医薬組成物、またはそれらの組合せの維持量を投与することができる。次に、投与の用量または頻度、またはそれら両方を、症状に応じて、改善された状態が保持されるレベルに低下させることができる。しかしながら、患者は、ＣＩＰＮの何らかの再発時に長期的に断続的な処置を必要とする可能性がある。
化学療法を施す方法
また、それを必要とする対象に化学療法を施す方法も提供される。方法は、化学療法および有効量の１つ以上の本願明細書に記載されているｂｃｌｗ模倣物、ｂｃｌｗポリペプチド、または医薬組成物を対象に施すことを含む。化学療法剤および模倣物、ポリペプチド、または医薬組成物は、同時にまたは連続して投与することができる（例えば、化学療法剤は、ｂｃｌｗ模倣物、ｂｃｌｗポリペプチド、または医薬組成物の前または後に投与することができる）。場合によっては、化学療法剤は、微小管標的化剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、葉酸類似体、紡錘体毒、白金化合物、エピポドフィロトキシン、抗生物質、ＥＧＦ−Ｒインヒビター、Ｅｐｈ−Ｒインヒビター、ｐ３８／ＪＡＫキナーゼインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビター、ＭＥＫインヒビター、ＭＡＰＫインヒビター、Ｔｒｋインヒビター、プロテアソームインヒビター、およびＲａｆインヒビターからなる群から選択される。場合によっては、対象は、さらなる治療剤を投与される。例えば、メトホルミンおよび／または１つ以上のカルパイン阻害剤は、化学療法剤および／またはｂｃｌｗ模倣物、ｂｃｌｗポリペプチド、または医薬組成物の投与の前、中、および／または後に投与することができる。いくつかの場合において、化学療法を施される対象は、血液学的腫瘍（例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ性白血病）を有する。場合によっては、化学療法を施される対象は、乳癌、卵巣癌、または肺癌を有する。場合によっては、方法は、ｂｃｌｗタンパク質またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメントを投与することを含む。いくつかの場合において、ＢＨ４ドメイン含有ｂｃｌｗフラグメントは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。場合によっては、方法は、配列番号２または３に示されているアミノ酸配列を含むか、またはからなるｂｃｌｗポリペプチドを投与することを含む。いくつかの場合において、ｂｃｌｗポリペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。いくつかの場合において、ｂｃｌｗポリペプチドは、１から１２個のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５個）および／または１から５個のアミノ酸欠失（例えば、ポリペプチドのＮまたはＣ−末端で１、２、３個）を有する配列番号２または３に示されているアミノ酸配列を含むか、またはからなる。いくつかの場合において、ｂｃｌｗポリペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。場合によっては、方法は、配列番号４−３２または５０−５３に示されているアミノ酸配列のいずれか１つを含むか、またはからなるｂｃｌｗ模倣物を投与することを含む。場合によっては、方法は、１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換および／または欠失（例えば、ＮまたはＣ−末端で）を除けば、配列番号４−３２または５０−５３に示されているアミノ酸配列のいずれか１つを含むか、またはからなるｂｃｌｗ模倣物を投与することを含む。
Ｂｃｌｗタンパク質、ポリペプチド、または模倣物で処置のための対象を選択するための方法
また、ＣＩＰＮを発症する危険性がある対象を選択または同定する方法も提供される。次に、選択された対象は、上記方法のいずれかを使用して処置することができる。対象は、１つ以上の以下の基準に基づいて同定または選択することができる：化学療法剤（例えば、タキサン、例えば、パクリタキセル）の投与時にＣＩＰＮを発症しないコントロール対象に対して感覚ニューロンの軸索において内因性ｂｃｌｗの低下したレベル、化学療法剤（例えば、タキサン、例えば、パクリタキセル）の投与時にＣＩＰＮを発症しないコントロール対象に対して感覚ニューロンにおいてＥｐｈＡ４またはＥｐｈ／５受容体の低下したレベル、化学療法剤（例えば、タキサン、例えば、パクリタキセル）の投与時にＣＩＰＮを発症しないコントロール対象に対してトランスポーターの低下した発現、化学療法剤（例えば、タキサン、例えば、パクリタキセル）の投与時にＣＩＰＮを発症しないコントロール対象に対してチューブリンの低下した発現、化学療法剤（例えば、タキサン、例えば、パクリタキセル）の投与時にＣＩＰＮを発症しないコントロール対象に対してＮＧＦ、ＢＤＮＦ、および／またはＮＴ３の低下した発現；および／または、高い危険性を与え得る遺伝子、例えば、ＥｐｈＡ４／５において、または隣接した、またはカルシウムと相互作用するタンパク質、例えば、カルモジュリンおよびパルブアルブミンをコードする遺伝子において、遺伝的多型を有すること。１つ以上のこれらの基準を満たす対象は、ＣＩＰＮを発症する高い危険性を有すると決定される。
難聴を処置するための方法
本開示はまた、それを必要とする対象において難聴を処置または予防する方法を特徴とする。本開示において提供される実施例は、ｂｃｌｗが、老化過程の聴覚の維持のために必要であることを示す。したがって、ｂｃｌｗまたはその模倣物を投与することは、難聴を処置または予防するために有用である。難聴は、例えば、加齢、騒音誘発性、または化学療法誘発性であってよい。
場合によっては、方法は、ｂｃｌｗタンパク質またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメントを投与することを含む。いくつかの場合において、ＢＨ４ドメイン含有ｂｃｌｗフラグメントは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。場合によっては、方法は、配列番号２または３に示されているアミノ酸配列を含むか、またはからなるｂｃｌｗポリペプチドを投与することを含む。いくつかの場合において、ｂｃｌｗポリペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。いくつかの場合において、ｂｃｌｗポリペプチドは、１から１２個のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５）および／または１から５個のアミノ酸欠失（例えば、ポリペプチドのＮまたはＣ−末端で１、２、３個）を有する配列番号２または３に示されているアミノ酸配列を含むか、またはからなる。いくつかの場合において、ｂｃｌｗポリペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。場合によっては、方法は、配列番号４−３２または５０−５３に示されているアミノ酸配列のいずれか１つを含むか、またはからなるｂｃｌｗ模倣物を投与することを含む。場合によっては、方法は、１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換および／または欠失（例えば、ＮまたはＣ−末端で）を除けば、配列番号４−３２または５０−５３に示されているアミノ酸配列のいずれか１つを含むか、またはからなるｂｃｌｗ模倣物を投与することを含む。場合によっては、タンパク質、ポリペプチド、または模倣物は、（例えば、前庭窓に）注射によって投与される。
この処置のための対象は、高齢（例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００以上の年齢）および／または難聴（例えば、当分野で知られている標準臨床方法、例えば、５００、１０００、および２０００Ｈｚでの気導閾値に対する純音聴力検査によって評価されるとき、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、または８５ｄｂ以上の聴力閾値）を有することに基づいて選択することができる。
一般的に、これらの方法は、対象を選択すること、および有効量の１つ以上の本願明細書に記載されている模倣物、ポリペプチド、または医薬組成物を対象に投与すること、および所望により難聴の処置のために必要とされるとき投与を繰り返すことを含む。
本願明細書において使用される「投与する」、「投与すること」または「投与」なる用語は、１つ以上の本願発明の内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、または医薬組成物（例えば、本願明細書に記載されているもののいずれか）を移植すること、吸収すること、摂取すること、注射すること、または吸入することを指す。場合によっては、１つ以上の本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、化合物、または医薬組成物は、（例えば、前庭窓に）注射によって対象に投与することができる。場合によっては、１つ以上の本願明細書に記載されている内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、化合物、または医薬組成物は、鼓膜を介して直接的送達によって対象に投与することができる。場合によっては、投与は、ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスベクター）の使用または点耳を使用することを含む。例えば、本願明細書に記載されている方法は、所望の、または記載された効果をなし遂げるための有効量の１つ以上の内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、化合物、または医薬組成物の投与を含む。本願発明の内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、化合物、および医薬組成物は、少なくとも週に１回（例えば、週に約２回、週に約３回、週に約４回、週に約５回、週に約６回、または１日に約１から約６回）またはあるいは、連続的注入として投与することができる。かかる投与は、慢性または急性治療として使用することができる。
特定の患者に対する特定の用量および処置レジメンは、使用される特定の内部架橋ポリペプチド、修飾ポリペプチド、または化合物の活性、年齢、体重、一般健康状態、性別、食事、投与時間、排出率、薬物組合せ、難聴の重症度、処置に対する患者の体内動態、および処置する医師の判断を含む種々の因子に依存する。
投与後、対象は、対象における難聴を評価するために評価することができる。場合によっては、処置は、対象の聴力が改善するまで、続けることができる。患者の状態が改善したとき、必要なとき、本開示の模倣物、ポリペプチド、または医薬組成物、またはそれらの組合せの維持量を投与することができる。次に、投与の用量または頻度、またはそれら両方を、対象の聴力に応じて、改善された状態が保持されるレベルに低下させることができる。しかしながら、患者は、難聴の何らかの再発時に長期的に断続的な処置を必要とする可能性がある。
以下は本願発明の実施例である。それらは、決して本願発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：実施例２−７についての材料＆方法
全ての実験手順は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）ガイドラインにしたがって行われ、Dana-Farber Cancer Institutional Animal Care and Use Committee（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
動物使用。時間調節(Timed)妊娠Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから得た。ｂｃｌｗ−／−マウスは、Ross et al., Nat Genet., 18(3):251-6 (1998)に記載されている。野生型ｂｃｌｗ遺伝子および／またはｌａｃＺ遺伝子に対する遺伝子型決定は、Ｂｃｌｗを標的化する配列ＧＣＴＣＴＧＡＡＣＣＴＣＣＣＣＡＴＧＡＣＴＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴ−ＴＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＣ（配列番号３７）およびｌａｃＺ配列 ＣＧＡＴＣＧＴＡＡＴＣＡＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＡＴＣＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＡＣＧ−Ｇ（配列番号３８）を使用してＴｒａｎｓｎｅｔｙｘによって行われた。Ｂｃｌｗマウスは、Ｃ５７Ｂｌ６ＥＪバックグラウンド上で維持した。
細胞培養。区画化チャンバー（Ｃａｍｐｅｎｏｔ）培養物を、修飾を有する記載されているように調製した（例えば、Fenstermacher et al., Springer Protocols: Neuromethods, 103:105-124 (2015)参照）。簡潔には、いずれかの性の胚の１５日目（Ｅ１５）のラットからのＤＲＧを解剖し、トリプシン処理した。ＤＲＧ（１．２ｘ１０５細胞）を、ＤＭＥＭ中１：４５の増殖因子低下マトリゲル基底膜（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングされたｐ３５培養皿に固定したＴｅｆｌｏｎ仕切り（Camp10, Tyler Research; Campenot, 1982）の中央区画に置いた。培養は、３７℃、７．５％ ＣＯ２で、２％ Ｂ２７補足（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ ペニシリン−ストレプトマイシン、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．０８％ グルコース、および０．３μＭ シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）でのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる培地において維持した；ＢＤＮＦ＋ＮＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞体区画に、および１００ｎｇ／ｍｌの濃度で軸索区画に２日間加えた。３日目に、培地を交換し、ＡｒａＣを除いた。５日目に、ニューロトロフィンを細胞体区画から取り出し、３−５日間軸索区画において１ｎｇ／ｍｌまで低下させた。パクリタキセル処置実験のために、７日目に２４時間、３０μＭパクリタキセル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはビヒクルコントロール（０．１％ ＤＭＳＯ）を細胞体または遠位軸索区画のいずれかに加えた。カルパイン阻害実験のために、２０μＭカルパインインヒビターＩＩＩ（ＶＷＲ）およびパクリタキセルを遠位軸索区画に同時に加えた。
マイクロ流体チャンバー培養物を、修飾を有する記載されているように調製した（例えば、Fenstermacher et al., Nature Neuroscience, 19:690-696 (2016)参照）。簡潔には、３ｘ１０４個のＥ１５ ＤＲＧニューロン（４μｌ容量）を、ＰＤＬ／ラミニン被覆カバーガラス（Fisherbrand Microscope Cover Glass; 24 x 40-1.5）に固定されたマイクロ流体デバイス（Xona Microfluidics, SND450）の１つのチャネルに置いた。細胞を０．３μＭ ＡｒａＣを有する培地に置いた；５０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ＋ＢＤＮＦを細胞体ウェルに加え、１００ｎｇ／ｍｌを軸索ウェルに加えた。２日目に、細胞体ニューロトロフィンを、１０ｎｇ／ｍｌに低下させた。４日目に、細胞体ニューロトロフィンを、１ｎｇ／ｍｌに低下させ、軸索ニューロトロフィンを、１０ｎｇ／ｍｌに低下させた。パクリタキセル処置実験について、６０μＭ パクリタキセルまたは０．１％ ＤＭＳＯビヒクルコントロールを５日目に軸索ウェルに４８時間加えた。細胞を室温で培地において１：２希釈された４％ ＰＦＡで１０分間、次にさらなる１０分間希釈しなかった４％ ＰＦＡで固定した。３ｘ１０５個のＥ１５ ＤＲＧニューロンからなる大量培養物を、０．３μｇ／ｍｌ ＡｒａＣを有するニューロトロフィン濃縮（１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ＋ＢＤＮＦ）培地においてＭａｔｒｉｇｅｌ被覆ｐ３５培養皿上で増殖させた。３日目に、ニューロトロフィンを１０ｎｇ／ｍｌに低下させ、培養物をさらにあと３−６日間維持した。
軸索変性アッセイ。区画化チャンバー培養物を、室温で培地において１：２希釈された４％ ＰＦＡで１０分間、次にさらなる２０分間希釈しなかった４％ ＰＦＡで固定した。培養物を０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１０分間透過処理し、３％ ＢＳＡおよび０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１時間室温でブロックし、マウス抗−Ｔｕｊ１（1:400; clone Tuj1; Covance）と一晩４℃でインキュベートした。次に、培養物をヤギ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（1:1000; Invitrogen）と共に室温で１時間インキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色した。遠位軸索先端の画像を４０Ｘ乾燥対物レンズを使用して得て、軸索変性を以前に記載されているように（Cosker et al., Neuroscience, 33:5195-5207 (2013)）、変性指数として定量化した。細胞体区画において画像を撮影し、状態を知らない観察者によってＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアにおいて総核および凝縮(condensed)核を計数することによって、同じ培養物に対してアポトーシス分析を行った。
ウェスタンブロッティング。Ｂｃｌ２ファミリータンパク質の分析のために、区画化された培養物中のＥ１５ ＤＲＧの細胞体および軸索を非イオン性界面活性剤において溶解させ、溶解物を４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓまたは３−８％ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（Thermo Fisher Scientific）によって分離し、以下の抗体でプローブした：抗−Ｂｃｌｗ（1:1000; clone 31H4; Cell Signaling Technology）、抗−Ｂｃｌ２（1:1000; Abcam）、抗−ＢｃｌｘＬ（1:1000; Cell Signaling Technology）、および抗−ＧＡＰＤＨ（1:2000; clone 14C10; Cell Signaling Technology）。バンドをＨＲＰ（1:10,000; Bio-Rad）およびSuperSignal化学発光基質シグナルにコンジュゲートされた二次抗体で視覚化した。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ ソフトウェアを使用して、タンパク質レベルを定量し、タンパク質レベルをＧＡＰＤＨに対して正規化した。
カルパインプロテアーゼ活性発光アッセイ。大量培養中のＤＲＧニューロンを、ビヒクル（４８時間０．１％ ＤＭＳＯ）、パクリタキセル（４８時間３０ｎＭ、６００ｎＭ、または１．２μＭ）、または塩化カルシウム（２４時間３ｍＭ）で処理した。培養物を１ｘ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に回収した。得られた溶解物を４℃で５分間１０，０００ｘｇで回転させ、５０μＬ 上清を９６ウェルプレート中で５０μＬ Ｃａｌｐａｉｎ−Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。プレートを短時間振盪し、暗所で４０分間インキュベートした；発光強度をマイクロプレートリーダーで測定し、タンパク質濃度に対して正規化した。
ミトコンドリア膜電位のテトラメチルローダミンエチルエステル測定。マイクロ流体デバイス中のＥ１５ ＤＲＧニューロンを、テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して標識化した。ＴＭＲＥを３７℃で２０分間適用し（１０ｎＭ）、次に細胞をフェノール不含培地ですすぎ、６０ｘ 油 １．４ＮＡ対物レンズを使用して生画像化した。軸索ミトコンドリアの蛍光強度は、各ミトコンドリアの蛍光強度（Ｆｍ）を近くの細胞質領域のバックグラウンド蛍光強度（Ｆｃ）で割ることによって測定した。蛍光強度を、状態を知らない観察者によって、３つの実験にわたって条件あたり８０ミトコンドリアに対してＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ ソフトウェアを使用して測定した。
定量的逆転写ＰＣＲ。ＲＮＡを、製造業者のプロトコールにしたがってＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して培養されたニューロンから抽出した。逆転写（ＲＴ）は、製造業者のプロトコールにしたがってｃＤＮＡアーカイブキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ｂｃｌｗ（Ｒｎ００８２１０２５＿ｇ１）、ｂｃｌ２（Ｒｎ９９９９９１２５＿ｍ１）、およびｂｃｌｘＬ（Ｒｎ００５８０５６８＿ｇ１）の発現を評価するために、Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。データを、それぞれのサンプルについて（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｇａｐｄｈ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）に対して正規化した。
ＳＡＨＢ生成。ＢｃｌｗのＢＨ４ドメインに対応するＦＩＴＣまたはビオチン−タグ付きステープルドペプチドを、合成し、誘導体化し、本願発明者らによって確立された方法（Bird et al., Nature, 455:1076-1081 (2008)）を使用して、精製した。ステープルドペプチドを＞９５％ 純度までＬＣ−ＭＳにより精製し、アミノ酸分析によって定量した。凍結乾燥されたＳＡＨＢを１００％ ＤＭＳＯ中で再構成し、実験のために水性バッファーに希釈した。
リポソーム放出アッセイ。ミトコンドリア外膜に類似している脂質組成を有する大型単層小胞を生成し、記載されているように（例えば、Leshchiner et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 110:E986-95 (2013); Lovell et al., Cell, 135:1074-1084 (2008)参照）ＡＮＴＳおよびＤＰＸで封入した。組換えＢＡＸをＢｌ−２１ ＤＥ３大腸菌中で生成し、次に、記載されているようにアフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（例えば、Edwards et al., Chemistry & Biology, 20(7):888-902 (2013); Gavathiotis et al., Nature, 455:1076-1081 (2008)参照）により精製した。
ＢＡＸのＢＩＭＡ２誘導活性化の測定のために、組換え全長ＢＡＸタンパク質、ＢＩＭＡ２（アミノ酸１４５−１６４）、およびＢＣＬｗ ＢＨ４ ＳＡＨＢを、３８４−ウェルプレートフォーマットにおいて３０μｌの最終容量に指示濃度でリポソーム（５μｌ）に加えた。ＡＮＴＳ放出およびＤＰＸ解離による脱クエンチング（Ｆ）を、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００ プレートリーダーで７２００秒間にわたって測定した（それぞれ３５５および５２０ｎＭの励起および発光波長）。プレートを１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００での溶解後に再度読み、最大放出（Ｆ１００）を決定した。ＡＮＴＳ／ＤＰＸ放出パーセントは、［（Ｆ−Ｆ０）／（Ｆ１００−Ｆ０）］として計算した。
タンパク質およびペプチド導入。組換えＨｉｓ−タグ付きＢｃｌｗ、Ｂｃｌ２、およびＢｃｌｘＬタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはコントロールβ−ガラクトシダーゼタンパク質を、記載されているように（例えば、Cosker et al., Nature Neuroscience, 19:690-696 (2016)）、区画化されたチャンバー培養物の細胞体または軸索に導入された。簡潔には、１μｇ／μｌ タンパク質を、２μｌ Ｃｈａｒｉｏｔ試薬（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）を使用して培養物に導入した。Ｈｉｓ−タグ付きタンパク質の発現を確認するために、細胞体および軸索を非イオン性界面活性剤で溶解し、タンパク質溶解物を上記のように分離し、以下の抗体でブロットした：抗−Ｈｉｓ（1:1000; Novagen）および抗−ｐａｎ−ａｃｔｉｎ（1:1000; Cell Signaling Technology）。ＦＩＴＣ−タグ付きＳＡＨＢペプチド（ＢＨ４−Ｂｃｌｗ、ＢＨ４−Ｂｃｌ２、およびＢＨ４−ＢｃｌｘＬ；貯蔵溶液 ＤＭＳＯ中で１ｍＭ）を、３５０ｎｇのペプチドおよび水で１：１０希釈された２μｌのＣｈａｒｉｏｔ試薬を使用して細胞体または軸索に導入した。コントロールは、２μｌの１：１０希釈されたＣｈａｒｉｏｔでペプチドなしであった。ペプチド発現を確認するために、培養物を上記のように軸索変性アッセイのために処理し、ＦＩＴＣ免疫蛍光を４０Ｘ 乾燥対物レンズで試験した。パクリタキセルを、タンパク質またはペプチドトランスフェクションの１時間後に培養物に加えた。
ニューロトロフィン喪失。ＦＩＴＣ ＳＡＨＢ（ＦＩＴＣ−ＢＨ４ Ｂｃｌｗ、Ｂｃｌ２、またはＢｃｌｘＬ）またはペプチドなしコントロールを、上記のように区画化された培養物の細胞体区画にトランスフェクトした。１時間後、細胞体および軸索区画の両方を、２４時間、ＮＧＦ＋ＢＤＮＦなしの培地に交換した。トランスフェクトされていないコントロール培養物を正常レベルのＮＧＦ＋ＢＤＮＦを有する培地において維持した。培養物を固定し、ＤＡＰＩ（１：１０００）とインキュベートした。画像を４０ｘ 乾燥対物レンズで撮影し、状態を知らない観察者がＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ ソフトウェアを使用して全核および凝縮核の数を計数した。
ビオチン化ＳＡＨＢプルダウン。ＤＲＧを７−８日間、区画化されたチャンバー培養物中で増殖させ、細胞体および軸索を別々に、１％ ＣＨＡＰＳ界面活性剤、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＤＴＴ、５００ｍＭ ＮａＦ、１００ｍＭ ＰＭＳＦ、２００ｍＭ ＮａＶＯ３、およびＥＤＴＡ不含ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む溶解バッファーに回収した。溶解物を、High Capacity Neutravidin Agarose Beads（溶解物において１：２０； Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４℃で２時間予備清澄化した。各プルダウンについて、２００−６００μｇの予備清澄化した溶解物を、ビオチン単独と、または２０μＭの最終ペプチドまたはビオチン濃度に関してＢｃｌｗ、Ｂｃｌ２、またはＢｃｌｘＬのビオチン化−ＢＨ４ペプチドと、４℃で一晩インキュベートした。次の日、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎビーズを４℃で２時間溶解物に加えた（１：１４）。溶解物を除去し、ビーズを冷ＰＢＳ＋プロテアーゼインヒビターカクテルで氷上で洗浄し、サンプルを非イオン性溶解バッファー、サンプルバッファー、および還元剤で５分間煮沸することによって溶出した。タンパク質を４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ページ（Ｂａｘ、ＹＡＲＳ、ＩＰ３Ｒ１）または３−８％ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ ＳＤＳ−ページ（ＹＡＲＳ、ＩＰ３Ｒ１）のいずれかで分離し、１：１０００で以下の抗体でプローブした：抗−Ｂａｘ（Cell Signaling）、抗−ＹＡＲＳ（チロシルｔＲＮＡシンテターゼ; clone EPR9927; Abcam）、および抗−ＩＰ３Ｒ１（Thermo Scientific）。元の細胞体または軸索溶解物からの１０％インプットレーンを、プルダウン溶解物と平行に流した。バンド強度を上記のように定量し、各プルダウン強度をインプット強度に対して正規化した。
ｓｈＲＮＡレンチウイルスノックダウン。レンチウイルス粒子をＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのｓｈＲＮＡ構築物を使用して生成し、大量培養においてタンパク質ノックダウンについて検証した。変性アッセイのために、レンチウイルス発現ｓｈＲＮＡを、２４時間、区画化された培養物に培地において１：１で加え、次に、培地を交換し、培養物をパクリタキセル処置の前に５日間増殖させた。Ｂｃｌｗ： ＴＲＣＮ００００３２１１７４、ＴＲＣＮ００００３２１１０４、ＴＲＣＮ００００３２１１０５、ＴＲＣＮ００００３２１１０６、ＴＲＣＮ００００００４６８７
ＩＰ３Ｒ１： ＴＲＣＮ００００３２１１６１、ＴＲＣＮ００００２７３７６７、ＴＲＣＮ０００００１２４３９、ＴＲＣＮ０００００１２４４０、ＴＲＣＮ０００００１２４４２
ＩＰ３Ｒ３： ＴＲＣＮ００００４３４３４３、ＴＲＣＮ００００４２４０６３、ＴＲＣＮ００００４１６５２９、ＴＲＣＮ０００００１２４４４、ＴＲＣＮ０００００１２４４７
パクリタキセル処置および行動試験。いずれかの性別の２月齢の同齢のｂｃｌｗ−／−およびｂｃｌｗ＋／＋マウス（１７−３０ｇ）に、８日間一日おきに（４回の総注射）４ｍｇ／ｋｇ パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）で腹腔内に（ＩＰ）注射した。パクリタキセルを、ビヒクルで希釈された１パーツの６ｍｇ／ｍｌ パクリタキセル貯蔵溶液（１：１ ｖ／ｖ Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ ［ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］および無水エタノール）および２パーツの無菌食塩水として調製し、１０μｌ／ｇで注射した。コントロールマウスに１パーツのビヒクルおよび２パーツの塩水を注入した。６月齢で、ｂｃｌｗ−／−マウスは有害な感覚を変えた；しかしながら、２−３月齢ｂｃｌｗ−／−マウスは正常な運動機能および有害な感覚を示す（例えば、Courchesne et al., Neuroscience, 31:1624-1634 (2011)参照）。ベースライン試験の前の３日間、マウスの体重を計り、自動ＲｏｔａＲｏｄ装置（落下せずに１分間４ｒｐｍ）で訓練し、ｖｏｎ Ｆｒｅｙケージで慣れさせた。次の２日間、ベースライン行動能力を評価し、平均化した。最初のパクリタキセル注射を３日後に与え、最終注射の１０日後にマウスの体重を計り、行動的に試験した。運動機能をアッセイするために、マウスを４−４０ｒｐｍの傾斜および０．４ｒｐｍ／秒の加速でＲｏｔａＲｏｄ上に置き、落下するまでの待ち時間を測定した。有害な機械感覚閾値を、ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（０．００８−１．４ｇ）を使用して、記載されているようにアッセイした（例えば、Courchesne et al., 2011（上記）参照）。引っ込め閾値は、動物が１０回の適用のうちの少なくとも２回で刺激された足を引っ込めた適用された力であると決定した。有害な熱感覚閾値は、５０℃ホットプレートを使用して、後足を弾く(flick)またはなめる(lick)までの待ち時間を測定する、記載されているようにアッセイした（例えば、Courchesne et al., 2011（上記）参照）。マウス行動は、遺伝子型および状態を知らない実験者によって評価された。
表皮フットパッド(footpad)神経分布。ｂｃｌｗ−／−およびｂｃｌｗ＋／＋マウスの後足からのフットパッド組織を採取し、固定し、切片にした（例えば、Cosker et al., 2013参照）。簡潔には、マウスを、最後のパクリタキセル注射の１１日後にイソフルランで安楽死させ、フットパッド組織を取り出し、厚い（真皮乳頭を含む）および薄い（真皮乳頭を含まない）皮膚に分けた。フットパッドをＺａｍｂｏｎｉの固定液にて一晩４℃で固定し、３０％ スクロースで一晩４℃で凍結保存し、凍結し、３０μｍの浮遊切片に切断した。切片を、ＰＢＳ中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を有する１０％ 正常ヤギ血清において１時間室温でブロックし、抗−Ｔｕｊ１（１：３００； Ｃｏｖａｎｃｅ）と一晩４℃でインキュベートした。次に、切片をヤギ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８（１：２００； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＤＡＰＩ（１：１０００）と２時間室温でインキュベートし、ゼラチン被覆スライド上にマウントした。表皮画像を、４０ｘ １．３ＮＡ 油 対物レンズを有するＮｉｋｏｎ Ｎｉ−Ｅ Ｃ２共焦点上で３０−３５μｍのｚ−スタック(stack)（１μｍのステップサイズ）として得て、最大強度投影画像に変換された。表皮内神経線維密度は、表皮に浸透するＴｕｊ１陽性線維の数であると決定され、測定された表皮の長さに対して正規化され（画像あたり２２５μｍ−４５０μｍ）、２２５μｍあたりのＴｕｊ１陽性線維の数として示した。画像を、状態を知らない実験者によってＮＩＨ ＩｍａｇｅＪにおいて得て、定量化した。
統計値。データは平均±ＳＥＭとして表される。統計的有意性を評価するために、データを対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定により分析した。多重比較について、データを、事後ＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉまたはＤｕｎｎｅｔｔ補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡにより分析した。他に記載のない限り、有意性はｐ＜０．０５に置いた。
実施例２：パクリタキセルはＩＰ ３ Ｒ１−依存性軸索変性カスケードを開始する
感覚ニューロンに対するパクリタキセルの作用部位を決定するために、パクリタキセル（３０ｎＭ）を区画化された培養物中のＥ１５ ＤＲＧ感覚ニューロンの細胞体または遠位軸索区画のいずれかの周囲の培地に導入し、変性の直接的な読み出しであるパクリタキセル誘発性軸索断片化を分析した。軸索に加えられたパクリタキセルは軸索変性を増加させることが見出されたが、細胞体に加えられたパクリタキセルは効果がなかった（図１Ａおよび１Ｂ）。特に、いずれかの細胞内区画のパクリタキセル処置は、核凝縮によって評価されるように細胞体アポトーシスを誘導しなかった（図１Ｃおよび１Ｄ）。これらの結果は、パクリタキセルが感覚ニューロン軸索に直接的に作用することを示唆し、パクリタキセルが軸索に局所的に作用して変性を誘導することを示す。
パクリタキセル処置は、電位感受性色素ＴＭＲＥを使用して評価されるとき軸索ミトコンドリア膜電位を低下させ（図２Ａ）、用量依存的にカルパイン活性を増加させた（図２Ｂ）。さらに、カルパインインヒビターＩＩＩ（軸索に対して２０μＭ）はパクリタキセル誘発性変性を防止し、軸索断片化が局所的カルパイン活性を必要とすることを示唆する（図２Ｃ）。１型イノシトール１，４，５−トリスリン酸受容体（ＩＰ３Ｒ１）のノックダウンは、パクリタキセル誘発性変性を防止することが見出され、パクリタキセルがＩＰ３Ｒ１を介する変性を引き起こすことを示唆する（図２Ｄ）。まとめると、これらの結果は、軸索パクリタキセル処置がＩＰ３Ｒ１およびプロテアーゼカルパインを含む変性カスケードを活性化することを示す。
実施例３：Ｂｃｌｗはパクリタキセル誘発性変性を防止する
抗アポトーシス性Ｂｃｌ２ファミリーメンバーは発生軸索変性に関与するが、Ｂｃｌ２ファミリーメンバーが損傷または疾患によって引き起こされる軸索変性に対して保護するか不明である。パクリタキセルの変性効果から軸索を保護する抗アポトーシス性Ｂｃｌ２ファミリーメンバーを同定するために、軸索においてＨｉｓ−タグ付き組み換えＢｃｌｗ、Ｂｃｌ２、またはＢｃｌｘＬタンパク質を選択的に過剰発現するように、区画化された培養においてタンパク質トランスフェクションを使用した。トランスフェクトされた軸索Ｂｃｌｗは、パクリタキセル誘発性軸索変性を完全に防止した（図３Ａおよび３Ｂ）。ＢｃｌｗおよびＢｃｌｘＬの両方が発生ニューロトロフィン依存性軸索生存を調節することが報告されているが、軸索にトランスフェクトされたとき、ＢｃｌｘＬもＢｃｌ２も変性を防止しなかったことを見いだした（図３Ａ、３Ｂ）。さらに、（軸索の代わりに）細胞体へのＢｃｌｗ、Ｂｃｌ２、またはＢｃｌｘＬタンパク質の選択的導入は、パクリタキセル誘発性変性を阻害しなかった（図３Ｃ）。まとめると、これらのデータは、変性を防止するために軸索において局所的に作用することができる特殊なＢｃｌ２ファミリーメンバーとしてＢｃｌｗを同定する。
実施例４：ＢｃｌｗのＢＨ４ドメインは変性を防止するために十分である
ＢＨ４−Ｂｃｌｗは、用量依存的様式においてＡＮＴＳ／ＤＰＸカプセル化リポソームのＢＩＭ誘発性、Ｂａｘ媒介膜穿孔(poration)を阻害した（データは示していない）。Ｂｃｌｗ、Ｂｃｌ２、またはＢｃｌｘＬのＦＩＴＣ−タグ付きＢＨ４ペプチドまたはビヒクルコントロールを、区画化された培養物の軸索にトランスフェクトした；次に、軸索をパクリタキセルで２４時間処理した（図３Ｄ）。全長Ｂｃｌｗで観察されるように、ＢＨ４−Ｂｃｌｗ ＳＡＨＢはパクリタキセル誘発性軸索変性を防止した。しかしながら、特に、ＢＨ４−Ｂｃｌ２およびＢＨ４−ＢｃｌｘＬはそうしなかった（図３Ｅ）。感覚ニューロンにおけるこれらのペプチドの同等の細胞内生物活性は、ニューロトロフィン喪失アッセイを使用して確認された；細胞体へのＢＨ４−Ｂｃｌｗ、ＢＨ４−Ｂｃｌ２、またはＢＨ４−ＢｃｌｘＬのトランスフェクションは、２４時間のニューロトロフィン喪失によって引き起こされるアポトーシスを等しく防止した（データは示していない）。まとめると、これらの結果は、ＢｃｌｗのＢＨ４ドメインが、Ｂｃｌ２およびＢｃｌｘＬのＢＨ４ドメインによって保存されていない機能である、軸索変性を防止するために十分である、ことを示す。
実施例５：Ｂｃｌｗは軸索変性を防止するためにＩＰ ３ Ｒ１を調節する
パクリタキセル誘発性変性を防止することにおけるＢｃｌｗの驚くべきことに特殊な機能は、ＢｃｌｗがＢｃｌ２およびＢｃｌｘＬよりも軸索における異なる分子標的と相互作用するためであり得る。ＢｃｌｗのＢＨ４ドメインは単独でパクリタキセル誘発性変性を防止するために十分であるため、ＩＰ３Ｒ１でのＢｃｌｗ、Ｂｃｌ２、またはＢｃｌｘＬのビオチン化ＢＨ４ペプチドの共沈殿を行った。軸索溶解物において、ＩＰ３Ｒ１はＢＨ４−Ｂｃｌｗと優先的に共沈殿したが（図４Ａおよび４Ｂ）、細胞体溶解物において、ＩＰ３Ｒ１は全３つのＳＡＨＢと共沈殿した（図４Ｃおよび４Ｄ）。重要なことには、ビオチン化ＳＡＨＢは、全て、細胞体（図４Ａおよび４Ｂ）および軸索（図４Ｃおよび４Ｄ）の両方からのアポトーシス促進性のＢｃｌ２ファミリーメンバーＢａｘと共沈殿したが、チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼであるネガティブコントロールタンパク質と共沈殿しなかった（ＹＡＲＳ；図４Ａ−４Ｄ）。
ＩＰ３Ｒ１のＢｃｌｗ制御が軸索変性を防止することに重要であるか否かを決定するために、ニューロンをＢｃｌｗおよび／またはＩＰ３Ｒ１を標的とするｓｈＲＮＡに感染させた。Ｂｃｌｗの急性ノックダウンは自発的変性を増加させた。パクリタキセルはさらに軸索変性を増加させ、Ｂｃｌｗがパクリタキセルにより活性化される変性カスケードに対するブレーキとして作用することを示唆する（図４Ｅ）。Ｂｃｌｗがこの変性カスケードにおいてＩＰ３Ｒ１の上流で機能するとき、次にＩＰ３Ｒ１およびＢｃｌｗの同時ノックダウンが軸索をパクリタキセルから保護するはずである。実際、ＩＰ３Ｒ１ノックダウンは、パクリタキセルの非存在または存在下で、Ｂｃｌｗノックダウンによって引き起こされる軸索変性を完全に防止した（図４Ｅ）。まとめると、これらの結果は、ＢｃｌｗがＩＰ３Ｒ１の上流で作用して軸索変性を防止することを示す。
実施例６：パクリタキセルは軸索Ｂｃｌｗレベルを特異的に低下させる
抗アポトーシス性成分Ｂｃｌｗ、Ｂｃｌ２、またはＢｃｌｘＬの発現を、パクリタキセル処置後に調べた。著しく、パクリタキセル処置は、細胞体ではなく、軸索においてＢｃｌｗ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを選択的に低下させた（図５Ａ−５Ｃ）。対照的に、パクリタキセル処置は、軸索または細胞体においてＢｃｌ２およびＢｃｌｘＬ ｍＲＮＡまたはタンパク質を変化させなかった（図５Ｄ−５Ｉ）。まとめると、これらのデータは、パクリタキセルが、密接に関連したＢｃｌ２ファミリーメンバーに対する効果を有さずに、軸索Ｂｃｌｗレベルを低下させたことを示す。
実施例７：Ｂｃｌｗの喪失はインビボでパクリタキセル誘発性ニューロパシーを悪化させる
インビボでパクリタキセル誘発性変性におけるＢｃｌｗの役割を調べるために、２月齢のｂｃｌｗ＋／＋およびｂｃｌｗ−／−マウスにパクリタキセル（８日間一日おきに４ｍｇ／ｋｇ）を注入した。５０°ホットプレート試験により測定されるとき、ｂｃｌｗ＋／＋マウスはパクリタキセル処置後に軽度の温熱性痛覚過敏を発症したが、ｂｃｌｗ−／−マウスはより重度の熱痛感受性を発症した（図６Ａ）。患者において、パクリタキセルは原発性感覚ニューロパシーを引き起こす。パクリタキセル処置マウスは、加速ＲｏｔａＲｏｄ試験を使用して正常な運動機能を有することを確認した（図６Ｂ）。感覚ニューロン軸索に対するパクリタキセルの効果を直接的に評価するために、後足の表皮内神経線維をパクリタキセル処置後に調べた。ｂｃｌｗ＋／＋マウスと比較して、パクリタキセルで処置されたｂｃｌｗ−／−マウスは、厚い（真皮乳頭を含む；図６Ｃおよび６Ｄ）および薄い（真皮乳頭を含まない；図６Ｅおよび６Ｆ）皮膚の両方において表皮内神経線維数のより大きな減少を示した。まとめると、これらの結果は、ｂｃｌｗの低下した発現がインビトロ（図４Ｅ）およびインビボ（図６Ａ−６Ｆ）の両方でパクリタキセル誘発性変性に対する感受性の増強を引き起こすことを示す。
実施例８：実施例９および１０についての材料＆方法
蝸牛におけるＢｃｌｗ ｍＲＮＡ発現分析
プライマー名 プライマー配列
Ｂｃｌｗフォワードプライマー ５’−ＡＧＣＣＴＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号３９）
Ｂｃｌｗリバースプライマー ５’−ＴＣＡＣＴＴＧＣＴＡＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＣ−３’（配列番号４０）
Ｂｃｌｗリバースネステッド(nested)プライマー ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＣＣＣＡＧＴ−３’（配列番号４１）
β−アクチンフォワードプライマー ５’−ＴＣＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣ−３’（配列番号４２）
β−アクチンリバースプライマー ５’−ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣ−３’（配列番号４３）
β−アクチンリバースネステッドプライマー ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＡＣＣＣＴＣＡＴＡＧＣ−３’（配列番号４４）
ＲＮＡプローブ設計および産生。Ｂｃｌｗに対するＲＮＡプローブを、手動で設計され、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入された遺伝子特異的なＰＣＲプライマーセットを使用してラット構築物から増幅した（表１）。Ｂｃｌｗプローブを産生するために、ＤＩＧ標識化前に２回のＰＣＲを行った。Ｂｃｌｗフォワードおよびリバースプライマーを、ラットＢｃｌｗ構築物、ＭｇＣｌ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、ｄｄＨ２Ｏ、ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と反応させた。各ＰＣＲは、３０サイクルおよび９５セ氏温度で２分間の初期化工程、９５セ氏温度で３０秒間の変性工程、５８セ氏温度で３０秒間のアニーリング工程、７２セ氏温度で１分間の伸長工程、および７２セ氏温度で１０分間の最終伸長工程を含んだ。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル（ローディングバッファーおよび１．２％アガロース）上を流し、約５５０ｂｐの長さを有するバンドをゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）で抽出した。次に、抽出されたＤＮＡを、ＢｃｌｗフォワードプライマーおよびＴ７プロモーター配列（５’− ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ タグ ＧＧ−３’）（配列番号４５）を含むリバースネステッドプライマーを使用する第２のＰＣＲ反応のために使用した。この第２のＰＣＲについて、全ての工程は先行するＰＣＲと同一であった。次に、ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル上を流し、約５００ｂｐの長さを有するバンドをゲル抽出キットで抽出した。ＤＮＡの純度および配列を確認するために、ＰＣＲ産物をＮａｎｏｄｒｏｐ ８０００ 分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分析し、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙで配列決定した。
Ｂｃｌｗ ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ産物を５ｘ 転写バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．１Ｍ ＤＴＴ、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＤＩＧ標識化ミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）、およびＤＥＰＣ Ｗａｔｅｒと２時間３７セ氏温度で反応させることによって、インサイチュハイブリダイゼーションのために標識化リボプローブを産生するようにＤＩＧ標識化した。１０μｌ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を混合物に加え、１０分間３７℃でインキュベートしながら放置した。反応を、５２μｌの停止バッファーを加えることによって停止させた。ＤＩＧ標識化ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出し、１μｇ／ｍｌ（５０％ ホルムアミド、５ｘ ＳＳＣ、０．２ｍｇ／ｍｌ 酵母ｔＲＮＡ、１００μｇ／ｍｌ ヘパリン、１Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液、０．１％ Ｔｗｅｅｎ、０．１％ Ｃｈａｐｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）でハイブリダイゼーションバッファーに希釈する前に、５０μｌのＤＥＰＣ Ｈ２Ｏに再懸濁した。ＲＮＡ純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００分光光度計を使用して確認した。
β−アクチンに対するＲＮＡプローブを、手動で設計され、Ｏｐｅｒｏｎから購入されたβ−アクチンフォワード、リバース、およびリバースネステッドＰＣＲプライマーの遺伝子特異的なセットを使用してラット構築物から増幅した。第１および第２のＰＣＲのためのアニーリング温度は６２セ氏温度であった。全ての他の工程はＢｃｌｗ ＲＮＡプローブを産生するための方法と一致した。β−アクチンＲＮＡプローブは、インサイチュハイブリダイゼーションのためのポジティブコントロールとして役立てた。
スクランブルセンスプローブは、ベクター特異的Ｔ７およびＳＰ６プライマーを使用してミニプレップＭｅｆ２Ａベクターを線状化することによって作製した。５２セ氏温度のアニーリング温度を線状化工程中に使用した。全ての他の方法は、Ｂｃｌｗ ＲＮＡプローブを産生するための方法と一致した。スクランブルプローブは、インサイチュハイブリダイゼーションのためのネガティブコントロールとして役立てた。
ラット。時間調節妊娠ラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入された。解剖された全てのラットは、Ｐ５およびＰ６間の年齢の野生型同腹子であった。全ての手順は、ＮＩＨガイドラインにしたがって行い、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ＩＡＣＵＣによって承認された。
組織調製。ラット（Ｐ５およびＰ６）をイソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ）吸入により屠殺し、ＤＥＰＣ−ＰＢＳの１身体容積（約１５ｍＬ）、次にＤＥＰＣ−ＰＢＳ中の４％ＰＦＡの１身体容積での心内潅流を即座に受けた。潅流後、ラットを断頭し、切断した頭部を、即座に解剖したか、または翌日解剖するまでＤＥＰＣ−ＰＢＳバッファー中の４％ＰＦＡ溶液中で一晩４℃で保存した。
ラットの頭を中線にそって切れ目を入れ、蝸牛を氷上で冷ＤＥＰＣ−ＰＢＳ中で解剖した。次に、蝸牛を、ＤＥＰＣ−ＰＢＳ中の４％ＰＦＡで一晩４セ氏温度で滴下固定した。
一晩固定後、次に、組織を氷上でＤＥＰＣ−０．１％ ＰＢＳＴ（ＰＢＳおよび０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で５分間３回洗浄し、次に、段階的メタノール／０．１％ＰＢＳＴシリーズ（２５％、５０％、７５％）において１００％メタノールに脱水し、必要になるまで−２０セ氏温度で貯蔵した。
蝸牛におけるＢＣＬＷ ｍＲＮＡ発現分析のためのインサイチュハイブリダイゼーション。全てのインサイチュハイブリダイゼーション工程は、洗浄の間に移すとき、蝸牛への起こり得る損傷を低下させるため、ネットウェル１２ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を使用して完了した。３つの蝸牛をＢｃｌｗ ｍＲＮＡを検出するために使用し、別の６つの蝸牛をポジティブ（β−アクチン）およびネガティブ（スクランブル）コントロールのために均等に分けたため、合計９つの蝸牛を各実験のために使用した。ＲＮａｓｅＺａｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、インサイチュハイブリダイゼーションのために使用される実験台および任意のツールを汚染除去するために使用した。
１日目：蝸牛をメタノールから取り出し、１００％ ＤＥＰＣ−０．１％ ＰＢＳＴに段階的に再水和した。各工程において、約２ｍｌの溶液を、全ての組織を覆うためにウェル毎に適用した。次に、組織をＤＥＰＣ−０．１％ ＰＢＳＴ中で５分間３回洗浄し、ＤＥＰＣ−ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ中で室温で２０分間再固定した。次に、蝸牛をＤＥＰＣ−０．５％ ＰＢＳＴ中で室温で５分間３回洗浄し、６５セ氏温度で１時間プローブを含まないハイブリダイゼーションバッファーとプレハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーションバッファーを１μｇ／ｍｌのプローブを含むハイブリダイゼーションバッファーと置き換え、蝸牛を６５セ氏温度で一晩インキュベートした。
２日目：ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、蝸牛を予熱した溶液Ｉ（５０％ ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、およびＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ）で７０セ氏温度で３０分間２回洗浄した。次に、組織を、５０％ 溶液Ｉ：５０％ 溶液ＩＩ（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、およびＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ）で７０セ氏温度で２０分間１回、溶液ＩＩで室温で５分間３回、溶液ＩＩＩ（５０％ホルムアミドおよび２Ｘ ＳＳＣ）で６５セ氏温度で３０分間２回、およびＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で５分間３回洗浄した。次に、組織を、ブロッキング溶液（ＴＢＳＴおよび１０％ラム血清）で室温で２．５時間洗浄した。次に、蝸牛を、１：２０００ アルカリホスファターゼ−コンジュゲートされたヒツジ抗−ジゴキシゲニン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含むブロッキング溶液中で４セ氏温度で一晩ロッカー(rocker)上でインキュベートした。
３日目：蝸牛をブロッキング溶液から取り出し、ＴＢＳＴで５分間３回、次に１時間４回洗浄した。組織をＴＢＳＴ中で４セ氏温度で一晩放置した。
４日目：蝸牛をＴＢＳＴから取り出し、新鮮なアルカリホスファターゼバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、およびＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ）で２０分間２回洗浄し、次に、シグナルが解剖顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＳＺ−ＳＴ）下で解剖されるまで、ＢＭ Ｐｕｒｐｌｅ（Ｒｏｃｈｅ）中でインキュベートした。０．１％ ＰＢＳＴ／５ｍＭ ＥＤＴＡで５分間２回洗浄し、４％ ＰＦＡで一晩固定することによって、反応を停止した。
５日目：固定後、蝸牛を移し、０．１％ ＰＢＳＴ／５ｍＭ ＥＤＴＡで１０分間２回洗浄し、イメージングした。ホールマウントイメージング後、フラットマウントを作成し、フルオロ−マウント マウンティング培地（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してスライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ）上にマウントし、さらなるイメージングまで、４セ氏温度で暗所に放置した。
ホールマウントイメージング。ホールマウントイメージングを、Harvard Medical School Neurobiology Imaging FacilityでのＭＶＸ１０ ＭａｃｒｏＶｉｅｗ解剖顕微鏡で行った。
フラットマウントイメージング。フラットマウントイメージングを、Dana-Farber Cancer Instituteでの２０Ｘ 対物レンズでの顕微鏡で行った。
蝸牛におけるＢＣＬＷ発現分析のための免疫蛍光。実験前に、蝸牛を、ＤＥＰＣ−ＰＢＳ中の４％ ＰＦＡから取り出し、頂および基底回転の典型的なフラットマウントを作成するために解剖した。各実験について、１つの蝸牛をコントロールフラットマウントを作成するために使用し、１つの蝸牛を実験的フラットマウントを作成するために使用した。全ての実験を、１ウェルにつき１つの平らなマウントを有する２４ウェルプレートにて行った。以下のプロトコールを全ての免疫蛍光実験のために使用した。
１日目：フラットマウントをＰＢＳで洗浄し、ロッカー上で室温で一晩インキュベートした。約５００μｌの溶液を、組織を覆うために使用した。
２日目：ＰＢＳをピペットを使用して取り出し、室温で１時間、透過処理溶液（１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、およびＰＢＳ）で置き換えた。透過処理溶液を除去した後、ブロッキング溶液で希釈された約５００μｌの一次抗体（一次抗体、５％ＮＧＳ、およびＰＢＳ）をそれぞれのウェルに適用した。フラットマウントを一次抗体溶液中で一晩４セ氏温度でロッカー上でインキュベートした。使用された抗体および希釈物は、以下のとおりであった：１：５００でのＢＣＬＷウサギ（Cell Signaling）および１：３００でのＴＵＪ１マウス（Covance）。コントロールフラットマウントはＢＣＬＷ一次抗体中でインキュベートされず、ＴＵＪ１一次抗体のみを受けた。コントロールおよび実験的フラットマウントの両方を、免疫蛍光プロトコールにおいて全ての他の工程について均等に処理した。
３日目：一晩インキュベーション後、一次抗体溶液を取り出し、フラットマウントをＰＢＳで室温で１時間４回洗浄し、過剰な一次抗体を取り出した。約５００μｌのＰＢＳをそれぞれのウェルに加えた。フラットマウントをＰＢＳで４セ氏温度で一晩インキュベートした。
４日目：ＰＢＳをウェルから取り出し、ブロッキング溶液（５％ ＮＧＳおよびＰＢＳ）で希釈された約５００μｌの二次抗体（１：４００でのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ヤギ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または１：４００でのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ ヤギ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で置き換えた。各フラットマウントを二次抗体溶液で暗所にて室温で１時間インキュベートした。二次抗体溶液でのインキュベーション後、後の全ての工程は暗所で行った。二次抗体溶液の除去後、フラットマウントを５００μｌのＰＢＳでそれぞれ５分間３回洗浄した。核染色のために、５００μｌの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、またはＤＡＰＩ（ｄｄＨ２Ｏ中５ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳで１：１０００に希釈し、洗浄したフラットマウントに１０分間適用した。ＤＡＰＩの除去後、フラットマウントをＰＢＳでそれぞれ１時間３回洗浄し、ロッカー上で４セ氏温度で一晩インキュベートし、過剰な二次抗体を取り出した。
５日目：フラットマウントをスーパーフロストスライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ）上に置き、５０μｌのフルオロマウント マウンティング培地（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃ）を入れた。次に、組織をカバーガラスで覆い、イメージング前に一晩乾燥させた。
イメージング。切片を、２０Ｘ 対物レンズを有するＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＩ倒立顕微鏡を使用してイメージ化した。イメージをＮＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェアを使用して得た。
蝸牛におけるＢＣＬＷ発現分析のための定量化。イメージをＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量し、細胞体および軸索におけるＢＣＬＷシグナルのピクセル強度を測定した。次に、細胞体および軸索からのシグナル強度をコントロールに対して正規化した。次に、コントロールおよび実験的組織に関するＢＣＬＷイメージを閾値処理して、バックグラウンドシグナルを除去した。閾値処理後、コントロールおよび実験的ＢＣＬＷイメージの両方が明るくなった。コントロールおよび実験的組織からの全てのＢＣＬＷイメージは、シグナルの差を効果的に捉えるために等しく操作された。
ｂｃｌｗ＋／＋およびｂｃｌｗ−／−マウスの行動分析。対象は、Ｂｌｋ６Ｊマウスにおいて見いだされるｎｎｔ突然変異を含まないＣ５７Ｂｌｋ６ＥＪ Ｂｌｋ６バックグラウンドに対する３１匹のｂｃｌｗ＋／＋およびｂｃｌｗ−／−マウスであった。１３匹の異なる同腹子は両方のグループに寄与した。Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)から最初に得られるマウスを、Dana-Farber Cancer Instituteで飼育した。マウスを７Ａ．Ｍ．で点灯する１２時間明暗サイクルで維持し、１から５匹のマウスのグループにおいて収容した。全てのマウスを、試験日に３Ｐ．Ｍ．から４Ｐ．Ｍ間で聴力について試験した。マウスを最高齢から最年少の順において１−３１と分類し、遺伝子型は試験の結論まで盲検であった。
行動分析のために使用されるマウスの数を、ＳＴＡＴＡを使用する検出力分析および平均の２つのサンプル比較によって決定された。６月および１４月をそれぞれｂｃｌｗ−／−およびｂｃｌｗ＋／＋マウスについての難聴発症の平均年齢として使用した。８月および４月の標準偏差をそれぞれｂｃｌｗ−／−およびｂｃｌｗ＋／＋マウスについて使用した。ｂｃｌｗ−／−マウスについての難聴発症の平均年齢についての標準偏差を平均間の差を見出すことによって計算した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意と考えた。最大で、２８匹のマウスが９０％の確率で統計的に有意な結果を捕捉するのに必要とされた。
各訓練セッションにおいて、マウスをDana-Farber Cancer Institute Animal Facilityによって提供された新しいプラスチックケージにおいて聴力について試験した。ケージは、ライトはオンになっているが送風機はオフになっているフード内に置かれた。各行動試験は、１０８０ｐ ＨＤビデオ録画を備えたＡｐｐｌｅ ｉＰｈｏｎｅ ４Ｓを使用してビデオ録画された。Dana-Farber Cancer Institute Animal Facilityにおいて全てのマウスを、ラジオで連続的にバックグラウンド音楽を演奏することによってホワイトノイズに慣らした。この音楽は、試験中バックグラウンドで持続した。８６ｄＢである聴覚刺激は、Ｐｅｔｃｏ犬訓練クリッカーによって生まれた。
マウスは最初に出生後６週目に、およびその後４０週齢まで３週ごとに試験された。１２月によって観察されるコルチ器官の完全な変性で、Ｂｌｋ６バックグラウンドに対するマウスは４０週の年齢の直後に加齢性難聴を発症するため、４０週を試験の終点として選択した。試験中、各マウスをそのケージから一度に一匹ずつ取り出し、新しい新鮮なケージに入れ、そこで５分間慣れさせた。慣れ時間が経過した後、試験セッションを開始し、マウスにそれぞれ３から６秒によって分離される３つの聴覚刺激を与えた。聴覚刺激に対する応答を各試験セッションの始めから終わりまでビデオ記録した。試験セッション後、マウスをそれらの元のケージに戻した。全ての聴覚試験は、遺伝子型を盲検で行った。
各試験セッションについて、マウスは、強い聴力、弱い聴力、または聴力なしのいずれかを有するとラベル付けされた。
この指定は、聴覚刺激に対する驚愕反応の誘発であるＰｒｅｙｅｒの反射の観察によって決定された。反応は、聴覚刺激の提示直後にマウスの全身の迅速な運動または耳介を弾くことがあったとき陽性と考えた。全ての３つの刺激後にＰｒｅｙｅｒの反射を示したものは、完全な聴力能力を有するとラベル付けされた。２つの刺激に反応するマウスは弱い聴力を有するとラベル付けされ、１つの刺激または刺激なしに反応するものは聴覚障害とみなされた。遺伝子型は、実験の結論まで盲検であった。各マウスに対する難聴発症時間は、もはやマウスがいかなる聴覚刺激にも反応しなくなった最初の試験日として定義された。これらのマウスについて、すべてのその後の試験日もまた、聴力能力なしを示した。ｂｃｌｗ＋／＋およびｂｃｌｗ−／−マウスについての難聴発症の平均年齢を、Wilcoxon試験（平均および比率についてのノンパラメトリックｔ検定）を使用して比較した。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意と考えた。
実施例９：蝸牛におけるらせん神経節ニューロンにおいてのＢｃｌｗの発現
Ｂｃｌｗ ｍＲＮＡは、頂−基底の勾配に沿って蝸牛において発現される
Ｂｃｌｗがらせん神経節ニューロンの軸索維持において役割を果たすということが仮説された。これは、ヒトにおいて加齢性難聴中に観察される末梢らせん神経節軸索の非対称性変性を説明することができ、Ｂｃｌｗ−／−マウスにおいて後根神経節末梢軸索の逆行性変性と平行する。この可能性を評価するために、ホールマウントインサイチュハイブリダイゼーションを、野生型Ｐ５−Ｐ６ラットから解剖された蝸牛においてＢｃｌｗ ｍＲＮＡの存在を検出するために、Ｂｃｌｗ、β−アクチン、およびスクランブルＲＮＡプローブを使用して行った。
β−アクチンは、軸索に標的化され、ニューロトロフィンに応答して成長円錐運動性および軸索誘導を促進するために局所的に翻訳されることが知られているため、β−アクチンは、らせん神経節ニューロンの細胞体および軸索の両方において存在すると予期された。Ｂｃｌｗがらせん神経節ニューロンにおいて発現され、末梢突起に輸送されるという仮説を考えると、Ｂｃｌｗシグナルのパターンはβ−アクチンシグナルのパターンと類似しているであろうと予測された。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは、β−アクチンおよびＢｃｌｗの両方が蝸牛内で高度に発現されることを示した（図８）。さらに、蝸牛底における両方の遺伝子の発現はらせん神経節細胞体に局在した。この結果は、いかなるシグナルも示さなかったスクランブルプローブから見いだされたことと対照的であった。これらのデータは、Ｂｃｌｗ ｍＲＮＡが蝸牛において、および潜在的にらせん神経節細胞体において発現されることを示す。
蝸牛におけるＢｃｌｗ ｍＲＮＡ発現および局在化のパターンをより正確に調べるため、Ｂｃｌｗ、β−アクチン、およびスクランブルＲＮＡプローブを使用するホールマウントインサイチュハイブリダイゼーション後に、蝸牛ターンのフラットマウントを作成し、画像化した。神経発生および遺伝子発現は、回路が蝸牛底で最初に発達する頂−基底の勾配にしたがい、Ｂｃｌｗ ｍＲＮＡ発現が頂および基底回転間で異なるか否かを決定するために重要である。この可能性を試験するために、同じ蝸牛からの基底および頂回転のフラットマウントの画像化を、インサイチュハイブリダイゼーション後に分析した。
インサイチュハイブリダイゼーションは、らせん神経節細胞体と関連する基底および頂の領域において強力なβ−アクチン ｍＲＮＡ発現を示した。β−アクチン ｍＲＮＡはまた、末梢突起が放射束(radial bundle)に収束し、感覚上皮に拡大し、内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）を刺激するらせん板に局在するようであった。このシグナルパターンは、らせん板において拡散せず、むしろ頂−基底軸全体に沿って持続するバンドを形成した（図９Ａおよび９Ｂ）。基底回転内で、Ｂｃｌｗ ｍＲＮＡ発現および局在化は、β−アクチン ｍＲＮＡと同様のパターンにしたがって、らせん板、およびらせん神経節細胞体が収容されている蝸牛軸の両方においてシグナルが検出された。しかしながら、このパターンは基底においてのみ観察され、頂において持続せず、Ｂｃｌｗ ｍＲＮＡ発現が頂−基底勾配にしたがうことを示唆した（図９Ａおよび９Ｂ）。総合すれば、これらの見いだしたことは、Ｂｃｌｗ ｍＲＮＡが細胞体において、および潜在的に軸索において存在し、および発現が頂−基底勾配にしたがうことを示す。
実施例１０：ｂｃｌｗ−／−マウスは早期性難聴を発症する
らせん神経節ニューロンにおいてＢｃｌｗの発現を評価するために分子研究と並行して（実施例９）、老化中の聴力を維持することにおけるＢｃｌｗの機能を行動分析によって調べた。ｂｃｌｗ−／−マウスが野生型よりも難聴の早期発症を有するであろうという仮説を試験するために、実験を設計し、同じバックグラウンド（Ｃ５７Ｂｌｋ６ＥＪ）上のｂｃｌｗ−／−および野生型マウスをそれらの寿命中にスケジュール期間で聴力能力について測定した。ｂｃｌｗ−／−マウスにおいて感覚ニューロン変性および関連した熱感覚欠損の試験に基づいて、Ｂｃｌｗノックアウトマウスが４から６月齢で難聴を証明するであろうことを仮説された。Ｂｌｋ６バックグラウンドは１２月齢後に難聴を発症することが知られているが、この変数は、Ｃ５７Ｂｌｋ６ＥＪ Ｂｌｋ６バックグラウンド上のノックアウトとＣ５７Ｂｌｋ６ＥＪ Ｂｌｋ６バックグラウンド上にもあった野生型とを比較することによって制御した。聴力能力を評価するために、マウスを各訓練セッション中に３つの聴覚刺激に曝露した。刺激後のＰｒｅｙｅｒの反射の観察は、ポジティブ応答と考えた。ポジティブ応答を受けた刺激の数に基づいて、マウスは、強い聴力能力、弱い聴力能力、または聴力能力なしのいずれかを有するとラベル付けされた。３１匹のマウスを数月にわたって試験し、難聴発症の平均年齢をｂｃｌｗ−／−Ｃ５７Ｂｌｋ６ＥＪ Ｂｌｋ６および野生型Ｃ５７Ｂｌｋ６ＥＪ Ｂｌｋ６マウス間で比較した。
難聴発症の年齢の盲目的結果は、年齢の二峰性分布を示し、マウスが早期または後期のいずれかで難聴を発症する２つの集団に分離されることを示した（図１０）。第１の集団は、１５週の難聴発症の平均年齢で、９および２１週齢間で難聴を示した。この年齢は、ｂｃｌｗ−／−マウスが４月齢までに聴力欠損を示すであろうという仮説と一致する。対照的に、第２の集団は、野生型Ｃ５７Ｂｌｋ６ＥＪ Ｂｌｋ６マウスにおいて起こることが知られている加齢難聴と一致する３７週の難聴の平均年齢で、３３から３９週齢で難聴を示した。これらの結果は、Ｂｃｌｗが加齢中に聴覚の維持のために必要とされることを示唆する。
実施例１１：難聴を防止するためのｂｃｌ−ｗ活性を増強する治療的価値
動物の４つのコホートを試験した：
（ｉ）ノイズ暴露なしでＣＢＡ野生型マウス（ｎ＝３）；
（ｉｉ）ノイズ暴露ありでＣＢＡ野生型マウス（ｎ＝５）；
（ｉｉｉ）ノイズ暴露なしでＰ１でｂｃｌ−ｗを発現するウイルスを注入されるＣＢＡ野生型マウス（ｎ＝５）；および
（ｉｖ）ノイズ暴露ありでＰ１でｂｃｌ−ｗを発現するウイルスを注入されるＣＢＡ野生型マウス（ｎ＝４）。
ノイズ暴露は、２時間の１００ｄＢの広帯域ノイズからなった。全ての動物は、その時点で約３月齢であり、並行して処置され取り扱われた。２週間後、各マウスを２つの測定を使用して聴力について試験した。第１に、本願発明者らは、外有毛細胞（したがって蝸牛）機能の指標である歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）応答を測定した。第２に、本願発明者らは、蝸牛から脳幹に至る神経作用によって生じる聴覚脳幹反応（ＡＢＲ）を測定した。ＤＰＯＡＥおよびＡＢＲについて、本願発明者らは、応答のための閾値、すなわち、有毛細胞（ＤＰＯＡＥ）またはニューロン（ＡＢＲ）のいずれかにおいてシグナルを産生するために音がどれほど「大音量」である必要があるかを評価した。有毛細胞はニューロンを活性化するため、有毛細胞活性における変化が存在するとき、ニューロン活性における変化も存在するであろう。したがって、ＤＰＯＡＥ閾値が変化しないが、ＡＢＲ閾値が変化するとき、本願発明者らは、ニューロンが主に影響を受けることを推測することができる。
加えて、本願発明者らは、ニューロン反応のより感受性の尺度である第１のＡＢＲ波の振幅を測定した。より多くのニューロンが同調して活性化されるとき、振幅は増加する。したがって、野生型動物において、刺激がより大きくされるとき（すなわち、ｄＢにおいて測定されるとき増加された音圧レベル）、第１の波の振幅（マイクロボルトにおいて測定されるとき）もまた増加する。活性化されたニューロンの喪失があるとき、振幅は、より小さく、音圧レベルが増加してもそれほど増加しない。
これらの試験からの結果を図１１−１３に示す。
顕著な見いだしたことを以下に示す：
１．ノイズ暴露後、ＣＢＡマウスは、蝸牛の高周波数領域（４５ｋＨｚと比較して）において増加した閾値を示した。
２．対照的に、ｂｃｌ−ｗウイルスを受けたマウスは、全ての周波数で聴力を保存した。
３．さらに、ウイルスでの処置はベースライン聴力に影響を及ぼさなかった（閾値シフトなし）。
４．ＤＰＯＡＥ閾値は変化しなかった。これは、ノイズ暴露が有毛細胞に永久的に損傷を与えなかったことを意味する。これは、ｂｃｌ−ｗ処置動物において保存された聴力が高周波数領域において内有毛細胞へのらせん神経節ニューロン接続の保存を反映することを示唆する。
５．この解釈と一致して、ＣＢＡマウスは、６０（閾値）から８０ｄＢの５ｄＢ増加において提示された４５ｋＨｚの刺激に応答して減少した波１振幅を示した。対照的に、波１振幅はｂｃｌ−ｗ処置グループにおいて変化しなかった。
実施例１２：Ｂｃｌｗ ＢＨ４−ＳＡＨＢは、マウスにおいて神経分布のパクリタキセル誘発性喪失を部分的に防止する
パクリタキセルで処置されたマウスは、コントロールマウスと比較して減少した厚い皮膚表皮神経分布を示す。表皮神経分布の喪失は、Ｂｃｌｗ−ＢＨ４ ＳＡＨＢペプチドがパクリタキセル処置（パクリタキセル−ペプチド）の２４時間前にフットパッドに注射されるとき、部分的に救出される（図１４）。
実施例１３：Ｂｃｌｗ ＢＨ４−ＳＡＨＢは、ヒトｉＰＳＣ−由来ニューロンにおいて軸索伸長におけるパクリタキセル誘発性減少を限定する
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンをパクリタキセルで処置した。Ｂｃｌｗ ＢＨ４−ＳＡＨＢ（ペプチド２）での前処置は、軸索の長さを部分的に保存する（図１５）。
他の局面
本願発明はその詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は例示を目的としており、添付の特許請求の範囲によって定義される本願発明の範囲を限定するものではない。他の局面、利点、および修飾は以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (44)

  1. 必要とするヒト対象において化学療法誘発性末梢性ニューロパシー（ＣＩＰＮ）を処置または予防する方法であって、治療有効量のｂｃｌｗタンパク質またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメント、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはｂｃｌｗ模倣物をヒト対象に投与することを含む、方法。
  2. 該ｂｃｌｗ模倣物がｂｃｌｗのＢＨ４ドメインを含む内部架橋ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 該内部架橋ポリペプチドが、（ｉ）配列番号４−３２および５０−５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる；または（ｉｉ）配列番号２、３、４６および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列の内部架橋変異体である、請求項２に記載の方法。
  4. 該ヒト対象が、化学療法剤での処置後の末梢性ニューロパシーを有するか、または発症する危険性がある、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
  5. 該化学療法剤が微小管標的化剤である、請求項４に記載の方法。
  6. 該微小管標的化剤がタキサンである、請求項５に記載の方法。
  7. 該タキサンがパクリタキセルである、請求項６に記載の方法。
  8. 該微小管標的化剤がビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニン、ドセタキセル、ディスコデルモライド、エリュテロビン、サルコジクチン(sarcodictyin)、エポチロン、コルヒチン、コンブレタスタチン(combretastatin)、２−メトキシエストラジオール、およびノスカピン(noscapine)からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  9. 該化学療法剤がアルキル化剤である、請求項４に記載の方法。
  10. 該アルキル化剤がオキサリプラチン、ロムスチン、またはカルムスチンである、請求項９に記載の方法。
  11. 該化学療法剤がアラビノシドである、請求項４に記載の方法。
  12. 該アラビノシドがシタラビンである、請求項１１に記載の方法。
  13. 該化学療法剤が、プロテアソームインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビター、およびＲａｆインヒビターからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  14. 該ｂｃｌｗ模倣物、該ＢＨ４ドメイン含有フラグメントおよび該ポリペプチドが、５から１００アミノ酸長である、請求項１に記載の方法。
  15. 該ｂｃｌｗ模倣物または該ポリペプチドが局所的にヒト対象に投与される、請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
  16. メトホルミンをヒト対象に投与することをさらに含む、請求項１−１５のいずれかに記載の方法。
  17. 化学療法を必要とするヒト対象に投与する方法であって、有効量の化学療法剤および治療有効量のｂｃｌｗタンパク質またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメント、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはｂｃｌｗ模倣物をヒト対象に投与することを含む、方法。
  18. 該化学療法剤が、微小管標的化剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、葉酸類似体、紡錘体毒、白金化合物、エピポドフィロトキシン、抗生物質、ＥＧＦ−Ｒインヒビター、Ｅｐｈ−Ｒインヒビター、ｐ３８／ＪＡＫキナーゼインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビター、ＭＥＫインヒビター、ＭＡＰＫインヒビター、Ｔｒｋインヒビター、プロテアソームインヒビター、およびＲａｆインヒビターからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 該微小管標的化剤がタキサンである、請求項１８に記載の方法。
  20. 該ヒト対象が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病からなる群から選択される血液学的腫瘍を有する、請求項１７−１９のいずれかに記載の方法。
  21. 該ヒト対象が、乳癌、卵巣癌、および肺癌からなる群から選択される固形腫瘍を有する、請求項１７−１９のいずれかに記載の方法。
  22. 該化学療法剤および該ｂｃｌｗ模倣物または該ポリペプチドが連続して投与される、請求項１７−２１のいずれかに記載の方法。
  23. 該ｂｃｌｗ模倣物または該ポリペプチドが該化学療法剤の前に投与される、請求項２２に記載の方法。
  24. 該化学療法剤が該ｂｃｌｗ模倣物または該ポリペプチドの前に投与される、請求項２２に記載の方法。
  25. 該化学療法剤および該ｂｃｌｗ模倣物または該ポリペプチドが同時に投与される、請求項１７−２１のいずれかに記載の方法。
  26. メトホルミンをヒト対象に投与することをさらに含む、請求項１７−２５のいずれかに記載の方法。
  27. 化学療法での処置を必要とするヒト対象を処置する方法であって、
    ａ．
    ｉ．感覚ニューロンの軸索において内因性ｂｃｌｗの低下したレベル；
    ｉｉ．感覚ニューロンにおいてＥｐｈＡ４またはＥｐｈ／５受容体の低下したレベル；
    ｉｉｉ．トランスポーターの低下した発現；
    ｉｖ．チューブリンの低下した発現；または
    ｖ．ＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＴ３の低下した発現
    の１つ以上を有するヒト対象を選択すること；および
    ｂ．有効量のｂｃｌｗ模倣物またはｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをヒト対象に投与すること、
    を含む方法。
  28. 該ｂｃｌｗ模倣物がｂｃｌｗのＢＨ４ドメインを含む内部架橋ポリペプチドである、請求項２７に記載の方法。
  29. 該内部架橋ポリペプチドが、配列番号４−３２および５０−５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、請求項２８に記載の方法。
  30. 該化学療法がタキサンを含む、請求項２７に記載の方法。
  31. 必要とするヒト対象において難聴を処置または予防する方法であって、有効量のｂｃｌｗタンパク質またはそのＢＨ４ドメイン含有フラグメント、ｂｃｌｗのＢＨ４ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはｂｃｌｗ模倣物をヒト対象に投与することを含む、方法。
  32. 該ｂｃｌｗ模倣物がｂｃｌｗのＢＨ４ドメインを含む内部架橋ポリペプチドである、請求項３１に記載の方法。
  33. 該内部架橋ポリペプチドが、配列番号４−３２、および５０−５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、請求項３２に記載の方法。
  34. 該ｂｃｌｗ模倣物および該ポリペプチドが５から１００アミノ酸長である、請求項３１に記載の方法。
  35. 該ｂｃｌｗ模倣物、該ＢＨ４ドメイン含有フラグメントまたは該ポリペプチドが、前庭窓に注射によってヒト対象に投与される、請求項３１−３４のいずれかに記載の方法。
  36. 該ｂｃｌｗ模倣物または該ポリペプチドが前庭窓に局所的にヒト対象に投与される、請求項３１−３４のいずれかに記載の方法。
  37. 該ｂｃｌｗ模倣物または該ポリペプチドが鼓膜を介してヒト対象に投与される、請求項３１−３４のいずれかに記載の方法。
  38. 該ヒト対象が加齢性難聴を有する、請求項３１−３７のいずれかに記載の方法。
  39. 該ヒト対象が騒音による難聴を有する、請求項３１−３７のいずれかに記載の方法。
  40. 該ｂｃｌｗ模倣物がｂｃｌｗのＢＨ４ドメインを含む内部架橋ポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
  41. 該内部架橋ポリペプチドが、配列番号４−３２および５０−５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる、請求項４０に記載の方法。
  42. 該内部架橋ポリペプチドが、配列番号２、３、４６および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列の内部架橋変異体である、請求項４０に記載の方法。
  43. 配列番号４−３２および５０−５３からなる群から選択される内部架橋ポリペプチドを含むポリペプチド。
  44. 請求項４３に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
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