JP2019526298A - 定量的化学交換飽和移動(qCEST)を用いた非侵襲性のpH依存的イメージング - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる2016年6月8に出願された米国仮特許出願番号62/347,509の米国特許法第119条のもとでの優先権を主張する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号AR066517のもとでの政府の支援によって行われた。
本発明は、一般に、イメージング及び画像処理についてのシステム及び方法に関する。
本明細書における出版物はすべて、各個々の出版物または特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのような同じ程度に参照によって本明細書に組み入れられる。以下の記載は本発明を理解するのに有用であってもよい情報を含む。それは、本明細書で提供されている情報のいずれかが従来技術であるもしくは現在請求されている発明に関連する、または具体的にもしくは暗に引用されている任意の出版物が従来技術であると認めることではない。
本明細書で引用されている参考文献はあたかも完全に記述されているかのようにその全体が参照によって組み入れられる。定義されない限り、本明細書で使用されている専門用語及び科学用語はすべて本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Westbrook,et al.,MRI in Practice 4th ed.,ならびにGuyton及びHall,Textbook of Medical Physiology 12th ed.,は当業者に本出願で使用されている用語の多くに対する一般的な手引きを提供する。
種々の実施形態では、本発明は、磁気共鳴イメージング(MRI)スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程、及び画像化された領域内で1以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程を含み、(a)生理的なバイオマーカーは、溶質プールと水プールの間での不安定プロトンの比(fr)及び/または溶質プールと水プールの間での交換速度(ksw)を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、領域は定量的化学交換飽和移動(qCEST)シーケンスを用いて画像化される。
種々の実施形態では、本発明は、磁気共鳴イメージング(MRI)パルスシーケンスを対象における関心体積(VOI)に適用する工程であって、VOIが関節または椎間板(IVD)を含む、工程;対象における関心体積(VOI)から磁気共鳴データを取得する工程;及び取得した磁気共鳴データに基づいて画像化された領域内で1以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程を含む方法を、MRI装置の1以上のプロセッサに実行させる;ための、コンピュータ可読の指示書を有する持続性のコンピュータ可読の媒体を開示し、(a)生理的なバイオマーカーは、たとえば、「実施例」のセクションでさらに詳細に本明細書に記載されているような、溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比(fr)及び/または溶質プールと水プールとの間での交換速度(ksw)を含む。特定の実施形態では、パルスシーケンスは二次元(2D)の縮小視野(rFOV)高速スピンエコー(TSE)の化学交換飽和移動(CEST)シーケンスである。特定の実施形態では、パルスシーケンスは二次元(2D)の縮小視野(rFOV)高速スピンエコー(TSE)の定量的化学交換飽和移動(qCEST)シーケンスである。一部の実施形態では、MRIスキャナーは7.0Tスキャナーである。特定の実施形態では、MRIスキャナーは3.0T MRIスキャナーである。一部の実施形態では、MRIスキャナーは1.5T MRIスキャナーである。
1.磁気共鳴イメージング(MRI)スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程;及び
前記画像化された領域内で1以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程
を含む方法であって、(a)前記生理的なバイオマーカーは溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比(fr)及び/または溶質プールと水プールとの間での交換速度(ksw)を含む、
前記方法。
前記方法が、
対象における関心体積(VOI)にMRIパルスシーケンスを適用する工程であって、前記VOIが関節または椎間板(IVD)またはその一部を含む、工程;
前記対象における前記関心体積(VOI)から磁気共鳴データを取得する工程;及び
取得した前記磁気共鳴データに基づいて、前記画像化された領域内で1以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程
を含み、(a)前記生理的なバイオマーカーが、溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比(fr)及び/または溶質プールと水プールとの間での交換速度(ksw)を含む、
前記持続性のコンピュータ可読の媒体。
磁場を提供するように操作可能な磁石と、
前記磁場内の領域に伝達するように操作可能な送信器と、
前記領域からの磁気共鳴シグナルを受け取るように操作可能な受信器と、
前記送信器及び前記受信器を制御するように操作可能な1以上のプロセッサと、
パルスシーケンスを対象における関心体積(VOI)に適用する工程であって、前記VOIが関節または椎間板(IVD)またはその一部を含む、工程;前記対象における前記関心体積(VOI)から磁気共鳴データを取得する工程;及び取得した前記磁気共鳴データに基づいて、前記画像化された領域内で1以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程を含む方法を、前記磁気共鳴イメージング(MRI)システムの1以上のプロセッサに実行させるための、コンピュータ可読の指示書を有する持続的なコンピュータ可読の媒体と
を含み、(a)前記生理的なバイオマーカーが、溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比(fr)及び/または溶質プールと水プールとの間での交換速度(ksw)を含む、
前記磁気共鳴イメージングシステム。
1.対象において状態を診断する方法であって、前記方法が、
磁気共鳴イメージング(MRI)スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、前記領域が定量的化学交換飽和移動(qCEST)シーケンスを用いて画像化される、工程;
前記画像化された領域内で1以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、前記生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度(ksw)を含む、工程;及び
前記不安定プロトン交換速度が参照値に比べて上昇する場合、前記対象が前記状態を有すると判定する工程
を含む、前記方法。
理論
追加の背景を経て、以前の研究は、プール「w」(水プール)とプール「s」(溶質プール)の間でのプロトン交換を記載しているBloch−McConnellの方程式を用いた2つのプールの交換モデルに焦点を置いている。この2プールシステムでは、frは不安定プロトンの比M0s/M0wを指し、kswは溶質プールと水プールとの間での交換速度を指す。R1w、R2w、R1s及びR2sはそれぞれ水プロトン及び溶質プロトンについての縦緩和及び横緩和の速度である。
として簡略化しており、式中、Zlabel及びZrefは基準化されたシグナル強度または標識走査(溶質プールの共鳴周波数での)及び参照走査(水に関する逆周波数での)のためのZスペクトルである。ω1はRF照射の振幅である。
として書くことができ、式中、DCはデューティサイクルを表し;c1及びc2はガウスの飽和パルスの形状を記載する。(
σ及びtpはガウスパルスの幅及び長さである)。
ここでのω1はガウスパルス1つの平均RF照射振幅として定義され、すなわち、ω1=フリップ角/パルス持続時間であることに留意のこと。
R1wはT1マッピング法を用いて測定することができる。GAGのR2sは200s−1であると推定される(あたかも完全に記述されているかのようにその全体が参照によって本明細書に組み入れられるLee,J−S,Xia,D,Jerschow,A,Regatte,RR,In vitro study of endogenous CEST agents at 3 T and 7 T.Contrast Media Mol.Imaging,2016;11:4‐14.doi:10.1002/cmmi.1652を参照のこと)。
ファントム
種々のpH値及び濃度を持つコンドロイチン硫酸A(Aldrich−Sigma,St.Louis,MO)とリン酸緩衝溶液(PBS)から調製されたGAGを含有する2セットのファントムを準備した。pHのセットについては、GAG濃度を60mMに固定し、pHを5.8、6.1、6.4、6.7及び7.0に用量設定した。濃度ファントムについては、種々のGAG濃度(100mM、80mM、60mM、40mM及び20mM)を使用し、pHを7.0に用量設定した。次いで溶液を15mLのチューブに移した。これら10本のチューブを水で満たしたファントムホルダーに入れた。
イメージング実験は室温で3.0Tesla臨床スキャナー(Magnetom Verio;Siemens Healthcare,Erlangen,Germany)にて行った。画像はすべて8mmのスライス厚、160×160mm2の視野、及び128×128のイメージングマトリクスで取得した。CEST MRIはパルス状RF飽和高速スピンエコー(TSE)シーケンス(TR/TE=16000/12ms、2平均)で行った。CEST飽和モジュールは、各パルスについて持続時間tp=80ms、ならびに飽和フリップ角900°、1500°、2100°及び3000°(B1振幅=フリップ角/(γtp)=0.73μT、1.22μT、1.71μT及び2.45μT;ガウス飽和パルスのパラメータc1=0.50、c2=0.59)でのパルス間遅延td=80ms(デューティサイクル=50%、合計飽和持続時間Tsat=6240ms)を伴う39のガウス形状のパルスから成る。Zスペクトルは±1.6ppm、±1.3ppm、±1.0ppm、±0.7ppm及び±0.4ppmでの様々な飽和頻度(10の異なる飽和頻度)で取得した。B0電界は水飽和シフト参照(WASSR)マップを用いて修正した(あたかも完全に記述されているかのようにその全体が参照によって本明細書に組み入れられるKim,M,et al.Water saturation shift referencing (WASSR) for chemical exchange saturation transfer(CEST) experiments.Magnetic Resonance in Medicine,2009;61:1441‐1450.doi:10.1002/mrm.21873を参照のこと)。T1加重MR画像は10の異なる反転遅延を伴った反転回復TSEシーケンスによって取得した(TI=50−4000ms(すなわち、TI=50,150,350,700,1050,1400,2000,2500,3000,及び4000ms);TR/TE=6000/12ms)。T2加重MR画像は様々なエコー遅延を伴ったTSEシーケンスによって取得した(TE=12−399ms(すなわち、TE=12,24,48,97,205及び399ms);TR=6000ms)。
動物関連の手順はすべてCedars−Sinaiメディカルセンターの施設内動物実験委員会(IACUC)によって承認された。合計4匹のメスのユカタンミニブタ(S&S Farms)を使用した。18時間の術前絶食に続いて、各ブタを筋肉内薬剤(アセプロマジン0.25mg/kg、ケタミン20mg/kg及びアトロピン0.02〜0.05mg/kg)で鎮静し、それに続いて動物にプロポフォール(2mg/kg)を静脈注射し、完全な麻酔を誘導した。これが達成された後、気管に挿管し、気管チューブを介して吸入された1〜3.5%のイソフルランを用いて手順の持続時間の間麻酔を維持した。麻酔に続いて、蛍光透視鏡の誘導のもとで、3本のMR適合性の14G同軸針(Invivo,Gainesville,FL)を腰椎椎間板L1/L2、L3/L4及びL5/L6の実質部に挿入した。Melkusらによって記載されたように及び患者の病的な椎間板内で測定されたpH値に従って、5〜7の範囲での椎間板内でのpH値の勾配を誘導するために、様々な濃度の乳酸ナトリウム(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)をこれらの腰椎椎間板に注入した。椎間板内への注入に続いて、MR走査の直前にMR適合性の針を介して挿入された特注の針状の組織pHプローブ(Warner Instruments,LLC,Hamden,CT)を用いて椎間板内部の正確なpH値を測定した。腰椎椎間板L2/L3も対照椎間板として走査した。動物を安楽死させた直後にそのpH値を測定した。
イメージング実験は3.0Tesla臨床スキャナー(Magnetom Verio;Siemens Healthcare,Erlangen,Germany)にて行った。後面棘突起を中心として巻き付けられたボディアレイコイルと共に動物を右臥位で置いた。イメージング手順の全体を通して麻酔はイソフルラン(1〜3.5%)によって維持した。
後処理はMatlabにおける特注のプログラム(The Mathworks,Natick,MA,USA)で行った。CESTRindは、1.0ppm(Zlab=Z(+1.0ppm),Zref=Z(−1.0ppm))でのB0の修正の後、方程式1に従って算出した。線形回帰を使用して1/CESTRindと1/ω1 2の間でのΩプロット解析を行い、傾き及びインターカットを得た。交換速度ksw及び不安定プロトンの比frはその後方程式[3]及び[4]に従って算出した。これらの算出は画素単位で、及び関心領域(ROI)によって行った。T1マップ及びT2マップは、Iがシグナル強度であるシグナル方程式I=I0[1−(1+η)・exp(−TI/T1)]の画素単位での対数適合によって得た。TIは反転時間であり、ηは反転効率である。T2マップはIがシグナル強度であり、TEがエコー時間であるシグナル方程式I=I0・exp(−TE/T2)を適合させることによって得た。
ファントム
図1では、様々なGAG濃度とpH値のチューブにて1/CESTRindと1/ω1 2との関係を評価した。1/CESTRindは各チューブの関心領域(ROI)内での平均シグナルである。チューブのすべてにおいて1/CESTRindは1/ω1 2の線形関数として表すことができる。この実験的知見は方程式[2]に一致する。
この試験で16のIVDを調べ、そのうち3つは針がIVDの両側を通り抜け、形態的な損傷を引き起こしたので除外した。乳酸ナトリウムの注射後に調べたIVDのpH値は5.0から7.2に及んだ。図3A〜3Cは、1匹の代表的なミニブタ腰椎のIVDの解剖学的画像及び相当する交換速度マップを示す。図3A〜3Cで示されるように、交換速度は低いpH値のIVDで高かった。各椎間板内で、交換速度マップにて若干の不均質性があった。これは、現在のSNRがシグナル画素の正確な測定を保証できないためである。しかしながら、各IVDの平均値はさらに信頼できることが判明した。これは、類似のpH環境にある画素すべてを平均した後SNRが上昇するためである。
この研究では、qCESTを用いて生体内にて3.0TeslaMRスキャナーでIVDにおけるpH変化を検出することができるかどうかを検討した。ファントム試験は、qCEST解析で使用された近似値がGAGのような分子についてやはり当てはまり、qCEST解析から決定された交換速度がGAG溶液のpHレベルに依存することを示した。交換速度とpH値の間の関係をブタ脊椎の生体内試験にてさらに調べた。結果は、酸が触媒するプロトンの化学交換の式を用いて、pHの関数として交換速度を記載することができることを示した。これは、組織pHメーターを参照として用いたqCESTの妥当性を示す最初の生体内試験であると考えられる。
本出願で報告されている実験はIVDにおけるGAGの生体内qCEST解析の実現可能性を実証している。本出願で報告されている実験はまた、qCEST解析から決定される交換速度がpH値と密接に相関し、IVDにてpHを非侵襲的に測定するのに使用することができることも実証している。qCEST法は、IVDの病態に関する追加の情報を提供し、腰痛及びその根底にある変性過程の病態形成についての洞察を得るのに役立つ潜在性を有する。
結果
IVD変性の誘導
ミニブタは、4つのIVD(L1/2〜L4/5)の線維輪に穴を開けて変性を誘導する手術を受けた(図6)。IVD変性の進行をMRIを用いてモニターし、健常なIVDに比べて穴を開けたIVDではT2加重のシグナル強度に明瞭な低下があった(図7A)。穴を開けたIVD内での含水量の2倍の低下は、T2加重のマッピングに基づいて健常なブタIVDに比べて変性誘導の2週間後すぐに明らかだった(p<0.0001;図7B)。含水量は2週目に比べて変性誘導の10週後さらに低下した(p<0.05)。加えて、1.6から1.4へのT1シグナルの有意な低下は健常対照に比べて変性誘導の2週間後注目に値した(p<0.0001;図7C)。T1シグナルの1.2までのさらなる低下は変性誘導の6週間後に測定された(p<0.0001)。T1ρマッピングは変性誘導の2週間後すぐにシグナルの2倍の低下を明らかにした(p<0.0001;図7D)。全体的に見て、これらの定量的なシグナルは、穴を開けたIVDにおける迅速に進行する変性状況を示している。組織学は、穴開けに続く異常なIVD構造及び細胞マトリクスを示し、変性したIVDに典型的な髄核における広範な線維化及び細胞塊の形成があった(図7E)。
IVDの変性状況を測定することに加えて、変性IVDからqCESTシグナルを取得した。これらの値はIVDから直接測定した相当するpHの読み取りと相関した(図8A)。強い相関は変性IVDのqCESTシグナルとpHとの間で観察された(R2=0.8004;p<0.0001)。2、6及び10週目での利用可能なqCESTの読み取りを健常または変性のいずれかに分類し、それを用いて81.3%感度及び76.1%特異度のROC曲線(曲線下面積=0.813、p=0.0003)を作り出した(図8B)。7.2から6.3までの有意なpH低下は損傷の2週間後すぐにIVDにて測定された(p=0.0001、図8C)。pHにおけるこの低下は10週目まで維持された。pH低下に従って、取得したqCESTシグナルは損傷の2週間後有意に上昇した(p<0.05、図8D)。シグナルのさらなる上昇が6週及び10週で観察された(p<0.01)ということは、物理的測定によっては統計的に有意ではなかったpHにおける小さな変化に対するMRプロトコールの高い感度を実証している。
次に、我々は変性したIVDにおける疼痛関連因子の発現を評価した。採取した変性IVDにて髄核及び線維輪から抽出されたRNAの遺伝子発現解析を行った。具体的には、我々はブラジキニン受容体B1(BDKRB1)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、及びカテコール−0−メチルトランスフェラーゼ(COMT)の発現を評価した。CGRP発現における10倍の上昇は変性の6及び10週後の髄核で観察された(p<0.05、図9A)。BDKRB1発現の13倍の上昇は変性の6週後、線維輪にて観察された(p<0.05)一方で、有意ではない低下が変性の10週後に観察された(p=0.1367、図9B)。変性の2、6及び10週後、線維輪にてCOMTの発現で4倍の上昇があった(p<0.01、図9C)。加えて、炎症過程に関与するIL−6の発現も変性に続いて評価した。IL−6の発現解析は変性の6及び10週後、線維輪にて20倍の上昇を明らかにした(p<0.05、図9D)。我々はまた、神経の成長に関与する脳由来の神経栄養因子(BDNF)の発現も評価した。変性の6週後、線維輪におけるBDNFの発現で22倍の上昇が観察された(p<0.05、図9E)。驚くべきことに、変性10週後の線維輪では有意ではない下方調節が観察された(p=0.0925)一方で、その間に髄核では有意な18倍の上昇が観察された(p<0.05)。前述のマーカーに対する抗体による髄核の免疫蛍光染色は、健常IVDに比べて調べた疼痛マーカーの上昇したシグナルと同時局在化を明らかにした(図10)。COMTとIL−6の同時局在化が変性IVD内で観察されたということは、これらの過程を変性の進行の一部として関連付けている。遺伝子解析の結果とは対照的に、変性の10週後、BDNFの発現は髄核では観察されなかった。しかしながら、場合によっては、タンパク質の発現は免疫蛍光染色では測定できず、遺伝子発現試験は一般にさらに高感度である。全体として見れば、我々は変性したIVDにて幾つかの疼痛因子、炎症因子及び神経原性因子の上方調節があることを見いだした。最終的に、測定したqCESTのシグナルは同じIVDに由来する前述のマーカーの発現レベルと対を為し、強い線形の相関を生じる(すべての対合についてp<0.0001;図11A〜図11E)。本明細書に記載されている我々の他の結果と組み合わせて、このデータはqCESTシグナルの上昇がIVD内での幾つかの疼痛マーカーの上方調節と相関するので、痛みを伴うIVDの検出を可能にすることを実証している。
以前の研究は椎間板起因の腰痛を診断するための測定単位としてpHを評価しようとした。Zuoらは、インタクトなウシ及びヒトの死体IVDにて3.0Tスキャナーで局在した1Hスペクトルを取得して低いpHの原因となる乳酸塩を定量することの実現可能性を実証した(J.Zuo,E.Saadat,A.Romero,K.Loo,X.Li,T.M.Link,J.Kurhanewicz,S.Majumdar,Assessment of intervertebral disc degeneration with magnetic resonance single−voxel spectroscopy.Magn Reson Med,62,1140−1146(2009))。しかしながら、この技法を生体内の分光法に変換することは幾つかの制限に悩まされる。著者らが言及したように、それらの共鳴周波数が近いので脂質ピークから乳酸塩を識別するのは困難である。別の制限は崩壊した空間でのIVDにおける代謝産物の不適切な定量である。同じグループの後者の研究は分光法によって生体内でIVDを特徴付けた(J.Zuo,G.B.Joseph,X.Li,T.M.Link,S.S.Hu,S.H.Berven,J.Kurhanewitz,S.Majumdar,In vivo intervertebral disc characterization using magnetic resonance spectroscopy and T1rho imaging:association with discography and Oswestry Disability Index and Short Form−36 Health Survey.Spine(Phila Pa 1976)37,214−221(2012))。有意な上昇した水/プロテオグリカンの面積比が陽性の椎間板造影法によってIVDで見いだされた。生体内MRSは、低いSNR、生理的な動き及び骨感受性が誘導する線幅拡大のために難題であり、乳酸塩の評価を不正確にしている。
研究計画
我々の研究の目的は、腰痛を診断するためのpHレベル依存的MRイメージングのアプローチを開発することであった。我々の事前に特定した仮説は、変性しているIVDにおける疼痛は椎間板内の酸性環境により少なくとも部分的に生じ、このpH低下はqCESTイメージングを用いて非侵襲的に検出できるということだった。9匹の健常なメスで骨格上成熟したユカタンミニブタ(S&S Farms;平均年齢1.5歳、35〜40kg)をこの研究に含めた。一元配置ANOVAを用いて、使用した試料サイズを概算して0.8の検出力及びα=0.05を達成した。qCESTは、IVD内でのpH変化を検出し、この変化が疼痛マーカーの上方調節と相関し得るかどうかを見るその能力について検討された。この目的で、我々は、14Gの針で線維輪に穴を開け、こうしてミニブタ当たり4つの変性しているIVDを作り出すことによって大型で臨床的に関連する動物モデルにてIVD変性のモデルを作り出した(図6)。次いで、ミニブタは変性の2、6及び10週後、MRI走査を体験した。各時点で、pHメーターを用いてIVD内でのpHを直接測定するために3匹のブタを無作為に安楽死させ、遺伝子発現解析、組織学及び免疫蛍光のために変性したIVDを採取した。イメージングパラメータ及び組織学を用いてIVDの変性を評価した。疼痛は遺伝子発現及び免疫蛍光を用いて検出し、IVD内でのqCEST測定値と比較した。動物の福祉を損なう経過観察中での神経損傷または苦痛の兆候のような急性の手技上の合併症を発症した動物は試験から除外した。
動物の処置はすべてCedars−Sinaiメディカルセンターの施設内動物実験委員会によって承認された。IVD変性のモデルは以前確立された方法の改変によって作り出された(O.Mizrahi,D.Sheyn,W.Tawackoli,S.Ben−David,S.Su,N.Li,A.Oh,H.Bae,D.Gazit,Z.Gazit,Nucleus pulposus degeneration alters properties of resident progenitor cells.Spine J13,803−814(2013))。18時間の術前絶食に続いて、各ミニブタを筋肉内アセプロマジン(0.25mg/kg)、ケタミン(20mg/kg)及びアトロピン(0.02〜0.05mg/kg)を用いて鎮静した。次いで、動物にプロポフォール(2mg/kg)を静脈内投与し、気管内挿管を行った。処置の間中、1〜3.5%の吸入イソフルランを用いて麻酔を維持した。IVD変性を誘導するために、髄核吸引またはアポトーシス剤の注入に比べてそれが最も信頼でき且つ再現性がある方法であることが見いだされているので、線維輪に単一の損傷を作った(K.S.Kim,S.T.Yoon,J.Li,J.S.Park,W.C.Hutton,Disc degeneration in the rabbit: a biochemical and radiological comparison between four disc injury models.Spine(Phila Pa 1976)30,33−37(2005))。蛍光透視鏡の誘導のもとで、14GのVerteportの針(Stryker,Kalamazoo,MI)を用いて後側部のアプローチを介して運動終板に平行にIVDの線維輪に侵入し、損傷させた。4つの標的レベル:L1/L2、L2/L3、L3/L4及びL4/L5にてこの処置を繰り返した。
イメージング実験は3T臨床スキャナー(Magnetom Verio;Siemens Healthcare,Erlangen,Germany)で行った。後面棘突起を中心として巻き付けられたボディアレイコイルと共に動物を右臥位で置いた。イメージング手順の全体を通して麻酔はイソフルラン(1%〜3.5%)によって維持した。
IVD内部のpHの測定は動物の屠殺の直後に行った。脊椎を外科的に露出し、線維輪の細かく切った切開を介して損傷したIVDの髄核に特注の針状の組織pHプローブ(Warner Instruments,Hamden,Connecticut,USA)を挿入した。
変性の2、6及び10週後に採取した変性したIVDにて定量的RT−PCRを行った。変性IVDに由来する遺伝子発現を各時点で採取した健常IVDと比較した。製造元のプロトコールに従ってRNeasy Miniキット(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)を用いて線維輪及び髄核から全RNAを抽出した。無作為プライマー及び逆転写酵素(Promega Corp.,Madison,WI,USA)を用いてRNAを逆転写した。ABI 7500 Prismシステム(Applied Biosystems,Foster City,CA)の助けを借りて定量的なリアルタイムPCRを行った。調べたブタの遺伝子は、疼痛マーカーの上方調節を検出するためのブラジキニン受容体B1(BDKRB1;Ss03389804_s1,Thermofisher scientific)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP;Ss03386432_uH)及びカテコール−0−メチルトランスフェラーゼ(COMT;Ss04247881_g1)、炎症反応を調べるためのインターロイキン−6(IL−6;Ss03384604_u1)ならびに神経の成長を判定するための脳由来の神経栄養因子(BDNF;Ss03822335_s1)であった。18sをハウスキーピング遺伝子対照として使用した。
変性の2、6及び10週後に採取した変性したIVDにて組織学的解析を行った。IVDを切片にし、以前記載された(D.Sheyn,D.Cohn Yakubovich,I.Kallai,S.Su,X.Da,G.Pelled,W.Tawackoli,G.Cook−Weins,E.M.Schwarz,D.Gazit,Z.Gazit,PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect.Mol.Pharm.10,4462−4471(2013)ように形態的解析のためにヘマトキシリン及びエオシンを用いて染色した。免疫蛍光染色については、組織を脱パラフィン処理し、37℃で45分間の予備加熱したTarget Retrieval Solution(Dako,Carpinteria,CA)におけるインキュベートによって抗原を検索した。ブロッキング無血清溶液(Dako)を適用することによって非特異的な抗原をブロックした。BDKRB1、CGRP、COMT、IL−6及びBDNFに対する一次抗体でスライドを染色した。一次抗体をスライドに塗布し、4℃で一晩インキュベートし、PBSを用いて洗い流し、スライドを二次抗体と共に室温で1時間インキュベートし、その後、それをPBSで洗い流した(表S1)。次いでスライドを暗所にて4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール二塩酸塩(1μg/ml)で5分間染色し、その後再びそれをPBSで3回洗浄した。VectaMount封入剤(Vector Laboratories,Burlingame,CA)を組織に適用した。×20倍率、z−スタッキング及び5×5のタイル走査での4チャンネルレーザー走査顕微鏡780(Zeiss,Pleasanton,CA)を用いてスライドを画像化した。ズームイン画像については、単一のz−スタック画像を生成した。試料はすべて同じゲイン及び露出の設定を用いて走査した。
GraphPad Prism 5.0fソフトウエア(GraphPad Prism,San Diego,CA)を用いてデータを解析した。データ解析はTukeyの多重比較事後検定と共に一元配置または二元配置のANOVAを用いて行った。結果は平均値±SEとして提示する。箱髭図では、中央値を横線で示し、箱は25番目の100分位数から75番目の100分位数まで広がり、髭は最小値から最大値まで広がる。qCESTとpH値の間でピアソン相関を行った。qCESTについてROC曲線を生成し、曲線下面積を算出した。0.05未満であるP値を統計的に有意であると見なした。
Claims (25)
- 対象において状態を診断する方法であって、前記方法が、
磁気共鳴イメージング(MRI)スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、前記領域が定量的化学交換飽和移動(qCEST)シーケンスを用いて画像化される、工程;
前記画像化された領域内で1以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、前記生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度(ksw)を含む、工程;及び
前記不安定プロトン交換速度が参照値に比べて上昇する場合、前記対象が前記状態を有すると判定する工程
を含む、前記方法。 - 前記上昇した不安定プロトン交換速度が低いpH値と相関する、請求項1に記載の方法。
- 前記上昇した不安定プロトン交換速度が200交換/秒より大きい、請求項1に記載の方法。
- 前記上昇した不安定プロトン交換速度が201〜1000交換/秒である、請求項1に記載の方法。
- 前記低いpH値が5.6〜6.99である、請求項2に記載の方法。
- 前記参照値が参照の不安定プロトン交換速度であり、前記参照の不安定プロトン交換速度が100〜200交換/秒である、請求項1に記載の方法。
- 前記参照の不安定プロトン交換速度が参照のpH値と相関する、請求項6に記載の方法。
- 前記参照のpH値が7.0〜7.2である、請求項7に記載の方法。
- 前記状態が、椎間板変性、椎間板起因の疼痛、椎間板起因の腰痛、慢性腰痛、腰痛、背痛、慢性背痛、進行性椎間板変性、変形性関節症、関節リウマチ、関節軟骨傷害、側頭下顎骨円板変性及びそれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記対象の身体の前記画像化された領域が関節または椎間板を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記状態が痛みを伴う状態である、請求項1に記載の方法。
- 前記上昇した不安定プロトン交換速度が前記対象における1以上の疼痛関連因子の上方調節と相関する、請求項1に記載の方法。
- 前記1以上の疼痛関連因子が、ブラジキニン受容体B1(BDKRB1)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、及びカテコール−0−メチルトランスフェラーゼ(COMT)から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記上昇した不安定プロトン交換速度が前記対象における1以上の炎症関連因子の上方調節と相関する、請求項1に記載の方法。
- 前記炎症関連因子がインターロイキン−6(IL−6)である、請求項14に記載の方法。
- 前記上昇した不安定プロトン交換速度が前記対象における1以上の神経原性因子の上方調節と相関する、請求項1に記載の方法。
- 前記神経原性因子が脳に由来する神経栄養因子(BDNF)または神経成長因子(NGF)である、請求項16に記載の方法。
- 前記定量的化学交換飽和移動(qCEST)シーケンスが二次元(2D)の定量的化学交換飽和移動(qCEST)シーケンスである、請求項1に記載の方法。
- 前記定量的化学交換飽和移動(qCEST)シーケンスが三次元(3D)の定量的化学交換飽和移動(qCEST)シーケンスである、請求項1に記載の方法。
- 前記MRIスキャナーが3.0T MRIスキャナーである、請求項1に記載の方法。
- 前記MRIスキャナーが1.5T MRIスキャナーである、請求項1に記載の方法。
- 前記MRIスキャナーが7.0T MRIスキャナーである、請求項1に記載の方法。
- 前記対象の状態の起源が、前記生理的なバイオマーカーを測定した前記対象の身体の前記画像化された領域内にあると判定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記低いpH値が前記状態を有する前記対象を示す、請求項2に記載の方法。
- 前記状態が判定される場合、前記対象のための1以上の治療を選択する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
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