JP2019526262A5

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Filing date: 2017-09-02
Publication date: 2020-10-15
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Description

図１Ａは、本開示による例示的な抗原特異的療法が、ＮＯＤマウスにおいて新規発症糖尿病を安定的に後退させることを実証するグラフである。指し示す通りに新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを治療し、治療開始後１４週にわたって血中グルコース濃度を追跡した。治療後に糖尿病のままであったマウスのパーセンテージを示す。「†」は、死亡または瀕死のマウスを指し示す。全てのカプラン・マイヤー生存曲線において、群間の統計的有意性は、マンテル・コックスのログランク検定によって決定した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。FIG. 1A is a graph demonstrating that the exemplary antigen-specific therapy according to the present disclosure stably regresses new-onset diabetes in NOD mice. Newly-onset diabetic NOD mice were treated as indicated and blood glucose levels were followed for 14 weeks after the start of treatment. The percentage of mice that remained diabetic after treatment is shown. “†” refers to dead or moribund mice. For all Kaplan-Meier survival curves, statistical significance between groups was determined by the Mantel-Cox log-rank test; ^* P <0.05, ^*** , P <0.0001. 図１Ｂは、本開示による例示的な抗原特異的療法が、ＮＯＤマウスにおいて残留ベータ細胞機能を保存することを実証するグラフを描写する。治療終了の１〜２週前にＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）に加えて新規発症糖尿病ＮＯＤマウスに対して腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）を行った。２時間にわたる耐糖能曲線（ＡＵＣグルコース；ｍｇ／ｄｌ×１２０分）下の対応する面積を示す。レスポンダーは、治療後に正常血糖（例えば、糖尿なしかつ血中グルコース測定値＞２００ｍｇ／ｄｌ）に戻る対象として本明細書では使用される。FIG. 1B depicts a graph demonstrating that the exemplary antigen-specific therapy according to the present disclosure preserves residual beta cell function in NOD mice. One to two weeks before the end of treatment, L. An intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) was performed on newly developed diabetic NOD mice in addition to lactis-based combination therapy (CT) -treated mice (both responders and non-responders). The corresponding area under the glucose tolerance curve (AUC glucose; mg / dl × 120 minutes) over 2 hours is shown. Responders are used herein as subjects that return to normoglycemia (eg, no diabetes and blood glucose readings> 200 mg / dl) after treatment. 図１Ｃは、本開示による例示的な抗原特異的療法がＮＯＤマウスにおいて膵島炎の進行を停止させることを実証するグラフである。治療の終了時に、指し示す通りに、新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）のパラフィン包埋膵臓切片に対して盲検で膵島炎スコア付けを行った。群間の統計的有意性はマン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；^＊＊Ｐ＜０．０１。FIG. 1C is a graph demonstrating that the exemplary antigen-specific therapy according to the present disclosure stops the progression of isletitis in NOD mice. At the end of treatment, as indicated, newly developed diabetic mice and L. Paraffin-embedded pancreatic sections of L. lactis-based combination therapy (CT) -treated mice (both responder and non-responder) were blindly scored for isletitis. Statistical significance between groups was calculated using the Mann-Whitney t-test; ^** P <0.01. 図２Ａは、開始時血中グルコース濃度による糖尿病寛解率を示すグラフである。試験加入時の開始時血糖が３５０ｍｇ／ｄｌより低いのか、それとも高いのかに基づいて新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを層化した。本開示の臨床グレードのＬ．ラクチス（L. lactis）株を用いる併用治療（ＣＴ）後に糖尿病のままであったマウスのパーセンテージを示す。カプラン・マイヤー生存曲線において、群間の統計的有意性をマンテル・コックスのログランク検定によって決定した；^＊＊Ｐ＜０．０１。FIG. 2A is a graph showing the rate of diabetic remission based on the blood glucose concentration at the start. Newly-onset diabetic NOD mice were stratified based on whether the starting blood glucose at study enrollment was lower or higher than 350 mg / dl. The clinical grade L. The percentage of mice that remained diabetic after combination therapy (CT) with the L. lactis strain is shown. Statistical significance between groups on the Kaplan-Meier survival curve was determined by the Mantel-Cox log-rank test; ^** P <0.01. 図２Ｂは、試験加入時のインスリン自己抗体（ＩＡＡ）陽性性に応じた糖尿病寛解率を示すグラフである。試験加入時の開始時血糖が３５０ｍｇ／ｄｌより低いのか、それとも高いのかに基づいて新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを層化した。本開示の臨床グレードのＬ．ラクチス（L. lactis）株を用いる併用治療（ＣＴ）後に糖尿病のままであったマウスのパーセンテージを示す。FIG. 2B is a graph showing the rate of diabetic remission according to insulin autoantibody (IAA) positivity at the time of enrollment in the study. Newly-onset diabetic NOD mice were stratified based on whether the starting blood glucose at study enrollment was lower or higher than 350 mg / dl. The clinical grade L. The percentage of mice that remained diabetic after combination therapy (CT) with the L. lactis strain is shown. 図２Ｃは、加入時の開始時血糖およびＩＡＡ陽性性が治療の成功と関係することを示すグラフである。試験加入時の開始時血糖が３５０ｍｇ／ｄｌより低いのか、それとも高いのかおよびＩＡＡ陽性性に基づいて新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを層化した。治療後に寛容化されたマウスのパーセンテージを示す。FIG. 2C is a graph showing that starting blood glucose and IAA positivity at enrollment are associated with successful treatment. Newly-onset diabetic NOD mice were stratified based on whether the starting blood glucose at enrollment was lower or higher than 350 mg / dl and IAA positivity. The percentage of mice tolerated after treatment is shown. 図２Ｄは、治療前後の間のＩＡＡ陽性性の変化が治療レスポンダーにおいて有意に異なったことを示すグラフを描写する。治療レスポンダー（上パネル）およびノンレスポンダー（下パネル）における糖尿病診断時およびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用治療の追跡後のＩＡＡレベルを示す。群間の統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；^＊＊Ｐ＜０．０１。１匹のマウスについてＩＡＡの開始レベルは１３９とｙ軸の限度外であったので、示していない。FIG. 2D depicts a graph showing that changes in IAA positivity between before and after treatment were significantly different in treatment responders. Diabetes diagnosis in therapeutic responders (upper panel) and non-responders (lower panel) and L. Shows the post-follow-up IAA levels of L. lactis-based combination therapy. Statistical significance between groups was calculated using the Mann-Whitney t-test; ^** P <0.01. Since the starting level of IAA for one mouse was 139, outside the y-axis limit. , Not shown. 図３Ａは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３^＋Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の末梢血中のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋細胞（中央パネル）、および全Ｆｏｘｐ３^＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊、Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。FIG. 3A shows L. Graphs showing that L. lactis-based combination therapy induces higher levels of Foxp3 ⁺ T cells. Newly-onset diabetic mice and L. CD4 in peripheral blood of lactis-based combination therapy (CT) -treated mice (both responder and non-responder) ⁺ CD25 in T cell population ⁺ Foxp3 ⁺ cells (left panel), CD25 ^- Foxp3 ⁺ Percentage of cells (center panel) and total Foxp3 ⁺ cells (right panel). Each symbol represents one mouse and the horizontal bar points to the median. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney t-test; ^* P <0.05, ^** P <0.01, ^*** , P <0.001; ^*** , P < 0.0001. 図３Ｂは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３^＋Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓の灌流リンパ節中のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋細胞（中央パネル）、および全Ｆｏｘｐ３^＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊、Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。FIG. 3B shows L. Graphs showing that L. lactis-based combination therapy induces higher levels of Foxp3 ⁺ T cells. Newly-onset diabetic mice and L. L. lactis-based combination therapy (CT) -treated mice (both responder and non-responder) CD4 in the perfused lymph nodes of the pancreas ⁺ CD25 in the T cell population ⁺ Foxp3 ⁺ cells (left panel), CD25 ⁻ Percentage of Foxp3 ⁺ cells (center panel), and total Foxp3 ⁺ cells (right panel). Each symbol represents one mouse and the horizontal bar points to the median. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney t-test; ^* P <0.05, ^** P <0.01, ^*** , P <0.001; ^*** , P < 0.0001. 図３Ｃは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３^＋Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓中のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋細胞（中央パネル）、および全Ｆｏｘｐ３^＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊、Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。FIG. 3C shows L. Graphs showing that L. lactis-based combination therapy induces higher levels of Foxp3 ⁺ T cells. Newly-onset diabetic mice and L. Lactis (L. lactis) based combination therapy (CT) treated mice CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ cells in the CD4 ⁺ T cell population in pancreas (both responders and non-responders) (left ^panel), CD25 - Foxp3 ⁺ cells (Center panel), and percentage of total Foxp3 ⁺ cells (right panel). Each symbol represents one mouse and the horizontal bar points to the median. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney t-test; ^* P <0.05, ^** P <0.01, ^*** , P <0.001; ^*** , P < 0.0001. 図３Ｄは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３^＋Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の末梢血中のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＴＬＡ４^＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４^＋細胞（中央パネル）、およびＦｏｘｐ３^＋ＣＴＬＡ４^＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊、Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。FIG. 3D shows L. Graphs showing that L. lactis-based combination therapy induces higher levels of Foxp3 ⁺ T cells. Newly-onset diabetic mice and L. Lactis (L. lactis) based combination therapy (CT) treated mice in CD4 ⁺ T cell populations in peripheral blood of (responders and non-responders both over) CD25 ^{^⁺} Foxp3 ⁺ CTLA4 ⁺ cells (left panel), CD25 ^- Percentages of Foxp3 + CTLA4 ⁺ cells (center panel) and Foxp3 ⁺ CTLA4 ⁺ cells (right panel). Each symbol represents one mouse and the horizontal bar points to the median. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney t-test; ^* P <0.05, ^** P <0.01, ^*** , P <0.001; ^*** , P < 0.0001. 図３Ｅは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３^＋Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓の灌流リンパ節中のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＴＬＡ４^＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４^＋細胞（中央パネル）、およびＦｏｘｐ３^＋ＣＴＬＡ４^＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊、Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。FIG. 3E shows L. Graphs showing that L. lactis-based combination therapy induces higher levels of Foxp3 ⁺ T cells. Newly-onset diabetic mice and L. L. lactis-based combination therapy (CT) -treated mice (both responder and non-responder) CD4 in the perfused lymph nodes of the pancreas ⁺ CD25 in the T cell population ⁺ Foxp3 ⁺ CTLA4 ⁺ cells (left panel) , CD25 ^- Foxp3 + CTLA4 ⁺ cells (center panel), and Foxp3 ⁺ CTLA4 ⁺ cells (right panel). Each symbol represents one mouse and the horizontal bar points to the median. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney t-test; ^* P <0.05, ^** P <0.01, ^*** , P <0.001; ^*** , P < 0.0001. 図３Ｆは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３^＋Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓中のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＴＬＡ４^＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４^＋細胞（中央パネル）、およびＦｏｘｐ３^＋ＣＴＬＡ４^＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊、Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。FIG. 3F shows L. Graphs showing that L. lactis-based combination therapy induces higher levels of Foxp3 ⁺ T cells. Newly-onset diabetic mice and L. CD4 in the pancreas of L. lactis-based combination therapy (CT) -treated mice (both responder and non-responder) ⁺ CD25 in the T cell population ⁺ Foxp3 ⁺ CTLA4 ⁺ cells (left panel), CD25 ^- Foxp3 + CTLA4 Percentage of ⁺ cells (center panel) and Foxp3 ⁺ CTLA4 ⁺ cells (right panel). Each symbol represents one mouse and the horizontal bar points to the median. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney t-test; ^* P <0.05, ^** P <0.01, ^*** , P <0.001; ^*** , P < 0.0001. 図４は、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法が、レスポンダーおよびノンレスポンダーにおいて抑制性ＩＬ１０分泌Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。ｉｎｖｉｔｒｏでのポリクローナルサプレッサーアッセイのために、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を正常血糖ＮＯＤマウスから単離し、色素標識し、指し示した６週の治療の終了時にＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ｈＣＤ２マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）から単離した、アクセサリー細胞および増加させた比のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋またはＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の存在下で、可溶性抗ＣＤ３を使用して７２時間刺激した。色素希釈のフローサイトメトリー解析によってＴｅｆｆ細胞の増殖を測定し、エフェクターのみの培養物に対して正規化した、２回またはそれより多く分裂したＴｅｆｆ細胞のパーセンテージとして示した。ＣＤ６９のフローサイトメトリー解析によってＴｅｆｆ細胞の活性化を測定し、エフェクターのみの培養物に対して正規化したＭＦＩとして示した。Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆ培養物中のＩＦＮ−γおよびＩＬ１０濃度のＭＳＤ高感度マルチプレックスアッセイ。群間の統計的有意性は、クラスカル・ウォリス検定の後にダネットの多重検定を使用して算出した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊、Ｐ＜０．００１；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。FIG. 4 shows L. Graphs show that L. lactis-based combination therapy induces inhibitory IL10-secreting Foxp3 ⁺ T cells in responders and non-responders. For a polyclonal suppressor assay in vitro, CD4 ⁺ CD25 ^- effector T cells (Teff) were isolated from normoglycemic NOD mice, dye-labeled, and indicated at the end of 6 weeks of treatment. L. lactis-based combination therapy (CT) treatment NOD. Foxp3. Soluble anti-CD3 in the presence of accessory cells and increased ratios of CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ or CD4 ⁺ CD25 ^- Foxp3 ⁺ T cells (Tregs) isolated from hCD2 mice (both responder and non-responder) Was stimulated for 72 hours. Teff cell proliferation was measured by flow cytometric analysis of dye dilutions and shown as the percentage of Teff cells that divided twice or more, normalized to effector-only cultures. Teff cell activation was measured by flow cytometric analysis of CD69 and shown as a normalized MFI for effector-only cultures. Treg: MSD sensitive multiplex assay of IFN-γ and IL10 concentrations in Teff cultures. Statistical significance between groups was calculated using the Kruskal-Wallis test followed by Danette's multiple test; ^* P <0.05, ^** P <0.01, ^*** , P <0.001. ^* P <0.05, ^** P <0.01. 図５Ａは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法で誘導されたＴｒｅｇがＣＴＬＡ４およびＴＧＦ−βに依存してＴエフェクター細胞応答を制御することを示すグラフである。２回またはそれより多く分裂したＴエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞のパーセンテージとして示す、エフェクターのみの培養による増殖に対して正規化したＴｅｆｆの増殖。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ｈＣＤ２マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）から単離したアクセサリー細胞およびＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋、および指し示した中和抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、色素標識したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ）を刺激した。群間の統計的有意性は、クラスカル・ウォリス検定の後にダネットの多重検定を使用して算出した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。図５Ｂは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法で誘導されたＴｒｅｇがＣＴＬＡ４およびＴＧＦ−βに依存してＴエフェクター細胞応答を制御することを示すグラフである。２回またはそれより多く分裂したＴエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞のパーセンテージとして示す、エフェクターのみの培養による増殖に対して正規化したＴｅｆｆの増殖。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ｈＣＤ２マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）から単離したアクセサリー細胞およびＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋細胞（Ｔｒｅｇ）、および指し示した中和抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、色素標識したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ）を刺激した。群間の統計的有意性は、クラスカル・ウォリス検定の後にダネットの多重検定を使用して算出した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。図５Ｃは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法で誘導されたＴｒｅｇがＣＴＬＡ４およびＴＧＦ−βに依存してＴエフェクター細胞応答を制御することを示すグラフである。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法で治癒したマウスに抗ＣＴＬＡ４および抗ＴＧＦ−β抗体（ｎ＝５）を注射し、糖尿病の再発（糖尿および血中グルコース測定値＞２００ｍｇ／ｄｌ）について追跡した。FIG. 5A shows L. It is a graph which shows that the Treg induced by the combination therapy based on L. lactis regulates the T effector cell response depending on CTLA4 and TGF-β. Growth of Teff normalized to growth by culture of effectors alone, shown as a percentage of Teffer cells that have divided twice or more. L. L. lactis-based combination therapy (CT) treatment NOD. Foxp3. Anti-CD3 (0.5 μg / ml) in the presence of accessory cells and CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ isolated from hCD2 mice (both responder and non-responder) and the indicated neutralizing antibody (10 μg / ml). It was used to stimulate dye-labeled CD4 ⁺ CD25 ^- T cells (Teff). Statistical significance between groups was calculated using the Kruskal-Wallis test followed by Danette's multiple test; ^* P <0.05, ^** P <0.01, ^*** P <0.001. FIG. 5B shows L. It is a graph which shows that the Treg induced by the combination therapy based on L. lactis regulates the T effector cell response depending on CTLA4 and TGF-β. Growth of Teff normalized to growth by culture of effectors alone, shown as a percentage of Teffer cells that have divided twice or more. L. L. lactis-based combination therapy (CT) treatment NOD. Foxp3. Anti-CD3 (0.5 μg) in the presence of accessory cells and CD4 ⁺ CD25 ^- Foxp3 ⁺ cells (Treg) isolated from hCD2 mice (both responder and non-responder), and indicated neutralizing antibody (10 μg / ml). / Ml) was used to stimulate dye-labeled CD4 ⁺ CD25 ^- T cells (Teff). Statistical significance between groups was calculated using the Kruskal-Wallis test followed by Danette's multiple test; ^* P <0.05, ^** P <0.01, ^*** P <0.001. FIG. 5C shows L. It is a graph which shows that the Treg induced by the combination therapy based on L. lactis regulates the T effector cell response depending on CTLA4 and TGF-β. L. Mice cured with L. lactis-based combination therapy were injected with anti-CTLA4 and anti-TGF-β antibody (n = 5) and followed for diabetic recurrence (diabetes and blood glucose readings> 200 mg / dl). did. 図６Ａは、新規発症糖尿病ＮＯＤマウスにおけるＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）および特異的ＦＯＸＰ３阻害剤Ｐ６０（腹腔内、５０μｇ／日）の同時投与の処理スキームである。FIG. 6A shows L. a. A treatment scheme for co-administration of L. lactis-based combination therapy (CT) and the specific FOXP3 inhibitor P60 (intraperitoneal, 50 μg / day). 図６Ｂは、Ｔｒｅｇ機能の特異的阻害が治療誘導性の寛容を損なうことを示すグラフである。治療後に糖尿病のままであったマウスのパーセンテージを示す。カプラン・マイヤー生存曲線において、群間の統計的有意性はマンテル・コックスのログランク検定によって決定した；^＊Ｐ＜０．０５。FIG. 6B is a graph showing that specific inhibition of Treg function impairs treatment-induced tolerance. The percentage of mice that remained diabetic after treatment is shown. In the Kaplan-Meier survival curve, the statistical significance between groups was determined by the Mantel-Cox log-rank test; ^* P <0.05. 図７Ａは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）で治癒したＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおけるジフテリア毒素（ＤＴ）によるＦｏｘｐ３^＋Ｔ細胞枯渇の処理スキームである。FIG. 7A shows L. NOD cured by L. lactis-based combination therapy (CT). Foxp3. A scheme for treating Foxp3 ⁺ T cell depletion by diphtheria toxin (DT) in DTR mice. 図７Ｂは、Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞枯渇がＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおいてＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法誘導性の寛容を破壊することを示すグラフである。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ｎ＝７）の間およびＤＴ処理後の新規発症糖尿病ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウス（ｎ＝４）における血中グルコース測定値。無作為の血中グルコース濃度が２００ｍｇ／ｄｌ未満に回復した時にマウスは治癒した（白い記号）と考え、またはマウスが２００ｍｇ／ｄｌより高い血中グルコース濃度を維持した時に治癒されなかった（黒い記号）と考えた。In FIG. 7B, Foxp3 ⁺ T cell depletion is NOD. Foxp3. In DTR mice, L. It is a graph showing that it disrupts L. lactis-based combination therapy-induced tolerance. L. Newly-onset diabetic NOD. During and after DT treatment during L. lactis-based combination therapy (n = 7). Foxp3. Blood glucose measurement in DTR mice (n = 4). Mice were considered cured (white symbol) when randomized blood glucose levels recovered below 200 mg / dl, or were not cured when mice maintained blood glucose levels above 200 mg / dl (black symbol). ) I thought. 図７Ｃは、治療で治癒したＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスの膵臓におけるＤＴ処理の前後の膵島炎スコア付けを示すグラフである。FIG. 7C shows the treatment-cured NOD. Foxp3. It is a graph which shows the islet inflammation scoring before and after the DT treatment in the pancreas of the DTR mouse. 図７Ｄは、治療で治癒したＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスの膵臓におけるＤＴ処理の前後の膵島内Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞の定量化を示すグラフである。併用療法寛容化マウスからの膵臓切片をインスリン（赤）、ＣＤ４（紫色）およびＦｏｘｐ３（緑）について染色し、白い矢頭は、一部インスリン陽性のランゲルハンス島内のＦｏｘｐ３^＋Ｔ細胞の存在を指し示す。囲った区画のより高倍率はＦｏｘｐ３^＋細胞がＣＤ４^＋Ｔ細胞であることを明確に指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。FIG. 7D shows the treatment-cured NOD. Foxp3. It is a graph which shows the quantification of Foxp3 ⁺ T cells in pancreatic islets before and after DT treatment in the pancreas of DTR mouse. Pancreatic sections from combination therapy-tolerated mice were stained for insulin (red), CD4 (purple) and Foxp3 (green), with white arrowheads pointing to the presence of Foxp3 ⁺ T cells within the partially insulin-positive Langerhans cell. Higher magnifications in the enclosed compartment clearly indicate that Foxp3 ⁺ cells are CD4 ⁺ T cells. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney t-test; ^*** , P <0.0001. 図８Ａは、新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の末梢血中のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋（左）、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋（中央）、およびＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋（右）Ｔ細胞集団内のＣＴＬＡ４^＋細胞のパーセンテージを示すグラフを描写する。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊、Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。FIG. 8A shows newly developed diabetic mice and L. CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ (left), CD4 ⁺ CD25 ^- Foxp3 ⁺ (center), and CD4 ⁺ CD25 ^- Foxp3 ⁺ (center) in the peripheral blood of lactis-based combination therapy (CT) -treated mice (both responder and non-responder), and A graph showing the percentage of CTLA4 ⁺ cells in the CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ (right) T cell population is drawn. Each symbol represents one mouse and the horizontal bar points to the median. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney t-test; ^* P <0.05, ^** P <0.01, ^*** , P <0.001; ^*** , P < 0.0001. 図８Ｂは、新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓の灌流リンパ節中のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋（左）、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋（中央）、およびＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋（右）Ｔ細胞集団内のＣＴＬＡ４^＋細胞のパーセンテージを示すグラフを描写する。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊、Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。FIG. 8B shows newly developed diabetic mice and L. CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ (left), CD4 ⁺ CD25 ^- Foxp3 ⁺ (center) in the perfused lymph nodes of the pancreas of L. lactis-based combination therapy (CT) treated mice (both responder and non-responder) ), And CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ (right) Draw a graph showing the percentage of CTLA4 ⁺ cells in the T cell population. Each symbol represents one mouse and the horizontal bar points to the median. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney t-test; ^* P <0.05, ^** P <0.01, ^*** , P <0.001; ^*** , P < 0.0001. 図８Ｃは、新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓中のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋（左）、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｆｏｘｐ３^＋（中央）、およびＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋（右）Ｔ細胞集団内のＣＴＬＡ４^＋細胞のパーセンテージを示すグラフを描写する。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊、Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。FIG. 8C shows newly developed diabetic mice and L. CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ (left), CD4 ⁺ CD25 ^- Foxp3 ⁺ (center), and CD4 in the pancreas of L. lactis-based combination therapy (CT) -treated mice (both responder and non-responder) ⁺ Foxp3 ⁺ (Right) Draw a graph showing the percentage of CTLA4 ⁺ cells in the T cell population. Each symbol represents one mouse and the horizontal bar points to the median. Statistical significance was calculated using the Mann-Whitney t-test; ^* P <0.05, ^** P <0.01, ^*** , P <0.001; ^*** , P < 0.0001. 図９は、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法寛容化マウスでは病的Ｔエフェクター細胞が枯渇されていないことを示すグラフである。明白に糖尿病（白の菱形）、併用療法（ＣＴ）レスポンダー（白丸）またはノンレスポンダー（クロスした丸）から単離した全脾臓細胞（１×１０^７）の養子移入。統計計算はマンテル・コックスのログランク検定を使用して行った；「ｎｓ」：有意でない。FIG. 9 shows L. It is a graph which shows that the pathological T effector cell is not depleted in the lactis-based combination therapy tolerant mouse. Clearly diabetic (diamond white), adoptive transfer of combination therapy (CT) responder (open circles) or non-responders whole spleen cells isolated from (cross round-) (1 × 10 ^7). Statistical calculations were performed using the Mantel Cox log rank test; "ns": not significant. 図１０Ａは、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおいてＤＴを用いてＦｏｘｐ３^＋細胞を枯渇させる図式的なスキームである。４回の連続的な腹腔内ＤＴ注射（１、２、５および７日目（ｄ））（４０μｇ／ｋｇ体重／ｄ）をスキーム中に指し示す。FIG. 10A shows NOD. Foxp3. A schematic scheme for depleting Foxp3 ⁺ cells using DT in DTR mice. Four consecutive intraperitoneal DT injections (Days 1, 2, 5 and 7 (d)) (40 μg / kg body weight / d) are indicated in the scheme. 図１０Ｂは、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおけるＤＴを用いたＦｏｘｐ３^＋細胞の枯渇を示すグラフを描写する。末梢血のフローサイトメトリー解析は、ＤＴ処理ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおけるＦｏｘｐ３^＋細胞の効率的な枯渇を実証した。膵臓切片のＦｏｘｐ３染色は、ＤＴ処理ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおいて膵島内Ｆｏｘｐ３^＋細胞の効果的な枯渇を示した。FIG. 10B shows NOD. Foxp3. A graph showing Foxp3 ⁺ cell depletion using DT in DTR mice is drawn. Flow cytometric analysis of peripheral blood was performed by DT-treated NOD. Foxp3. We have demonstrated efficient depletion of Foxp3 ⁺ cells in DTR mice. Foxp3 staining of pancreatic sections was performed by DT-treated NOD. Foxp3. We showed effective depletion of Foxp3 ⁺ cells in islets in DTR mice. 図１０Ｃは、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウス（左パネル）の２回の連続的なＤＴ注射の前（ｄ０）および後（ｄ３およびｄ５）のＦｏｘｐ３およびＤＴＲ−ＧＦＰ融合タンパク質について陽性のＣＤ４^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す代表的なフローサイトメトリープロファイルを描写する。FIG. 10C shows NOD. Foxp3. Representative flow showing the percentage of CD4 ⁺ T cells positive for Foxp3 and DTR-GFP fusion proteins before (d0) and after (d3 and d5) two consecutive DT injections in DTR mice (left panel) Draw a cytometric profile. 図１０Ｄは、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおける急性Ｆｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇ枯渇時の急速な糖尿病の発症を実証するグラフである。FIG. 10D shows NOD. Foxp3. It is a graph demonstrating the rapid onset of diabetes mellitus during acute Foxp3 ⁺ Treg depletion in DTR mice. 図１１は、ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、ＩＬ−１０分泌配列（ＳＳｕｓｐ４５）、およびヒトＩＬ−１０をコードする例示的な核酸配列を含む例示的なＩＬ−１０発現カセット（配列番号１３）（および対応するアミノ酸配列）を表したものであり、該配列は、その天然のシグナルペプチドなしで使用され、指し示したＩＬ−１０配列の２位において（ＰｒｏからＡｌａへの）点変異を含む（ｈＩＬ１０ａＰｘＡ）。配列番号１４は、ヒトＩＬ−１０配列に連結されたＩＬ−１０分泌配列のアミノ酸配列である。FIG. 11 shows an exemplary IL-10 expression cassette (SEQ ID NO: 13) (and corresponding) containing an exemplary IL-10 promoter (PhlA), an IL-10 secreting sequence (SSsup45), and an exemplary nucleic acid sequence encoding human IL-10. The sequence represents a point mutation (from Pro to Ala) at position 2 of the indicated IL-10 sequence used without its natural signal peptide (hIL10aPxA). SEQ ID NO: 14 is the amino acid sequence of the IL-10 secretory sequence linked to the human IL-10 sequence. 図１２Ａおよび図１２Ｂは合わせて、ｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）、ｇａｐＢ遺伝子、例示的な遺伝子間領域（ｒｐｍＤ）、ヒトＰＩＮＳをコードする例示的な核酸配列に翻訳上連結された例示的なＰＩＮＳ分泌配列（ＳＳｕｓｐ４５）を含有する例示的なＰＩＮＳポリシストロン性発現カセット（配列番号１５）を表したものである。配列番号１６は、ｇａｐＢ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列である。配列番号１７は、ＰＩＮＳ分泌配列によってコードされるアミノ酸配列、および翻訳上連結されたヒトＰＩＮＳ配列である。12A and 12B together show an exemplary PINS secretory sequence translated and linked to a gapB promoter (PgapB), a gapB gene, an exemplary intergenic region (rpmD), an exemplary nucleic acid sequence encoding a human PINS. It represents an exemplary PINS polycistron expression cassette (SEQ ID NO: 15) containing (SSsup45). SEQ ID NO: 16 is an amino acid sequence encoded by the gapB gene. SEQ ID NO: 17 is an amino acid sequence encoded by a PINS secretory sequence and a translationally linked human PINS sequence. 図１２Ａおよび図１２Ｂは合わせて、ｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）、ｇａｐＢ遺伝子、例示的な遺伝子間領域（ｒｐｍＤ）、ヒトＰＩＮＳをコードする例示的な核酸配列に翻訳上連結された例示的なＰＩＮＳ分泌配列（ＳＳｕｓｐ４５）を含有する例示的なＰＩＮＳポリシストロン性発現カセット（配列番号１５）を表したものである。配列番号１６は、ｇａｐＢ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列である。配列番号１７は、ＰＩＮＳ分泌配列によってコードされるアミノ酸配列、および翻訳上連結されたヒトＰＩＮＳ配列である。12A and 12B together show an exemplary PINS secretory sequence translated and linked to a gapB promoter (PgapB), a gapB gene, an exemplary intergenic region (rpmD), an exemplary nucleic acid sequence encoding a human PINS. It represents an exemplary PINS polycistron expression cassette (SEQ ID NO: 15) containing (SSsup45). SEQ ID NO: 16 is an amino acid sequence encoded by the gapB gene. SEQ ID NO: 17 is an amino acid sequence encoded by a PINS secretory sequence and a translationally linked human PINS sequence. 図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃ（配列番号１８）は合わせて、トレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）の欠失、トレハロースオペロン中の推定上のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＴＳ；ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４；ｐｔｓＩおよびｐｔｓＩＩ；それぞれ、遺伝子ＩＤ：４７９７７７８および遺伝子ＩＤ：４７９７０９３）に先行するＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の挿入、ｐｔｓＩとｐｔｓＩＩとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入を表したものである。13A, 13B, and 13C (SEQ ID NO: 18) together show a deletion of the trehalose-6-phosphate phosphorylase gene (trePP; gene ID: 4797140), a putative phosphotransferase gene (trePTS) in the trehalose operon. Llmg_0453 and llmg_0454; ptsI and ptsII; insertion of a constitutive promoter (PhlLA; gene ID: 4797353) of the HU-like DNA-binding protein gene preceding gene ID: 47977778 and gene ID: 4797093, respectively, with ptsI and ptsII. Highly expressed L. It represents the insertion of an intergenic region preceding the L. lactis MG1363 50S ribosomal protein L30 gene (rpmD; gene ID: 47978773). 図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃ（配列番号１８）は合わせて、トレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）の欠失、トレハロースオペロン中の推定上のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＴＳ；ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４；ｐｔｓＩおよびｐｔｓＩＩ；それぞれ、遺伝子ＩＤ：４７９７７７８および遺伝子ＩＤ：４７９７０９３）に先行するＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の挿入、ｐｔｓＩとｐｔｓＩＩとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入を表したものである。13A, 13B, and 13C (SEQ ID NO: 18) together show a deletion of the trehalose-6-phosphate phosphorylase gene (trePP; gene ID: 4797140), a putative phosphotransferase gene (trePTS) in the trehalose operon. Insertion of the constitutive promoter (PhlLA; gene ID: 4797353) of the HU-like DNA-binding protein gene preceding llmg_0453 and llmg_0454; ptsI and ptsII; gene ID: 47977778 and gene ID: 4797093, respectively, with ptsI and ptsII. Highly expressed L. It represents the insertion of an intergenic region preceding the L. lactis MG1363 50S ribosomal protein L30 gene (rpmD; gene ID: 47978773). 図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃ（配列番号１８）は合わせて、トレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）の欠失、トレハロースオペロン中の推定上のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＴＳ；ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４；ｐｔｓＩおよびｐｔｓＩＩ；それぞれ、遺伝子ＩＤ：４７９７７７８および遺伝子ＩＤ：４７９７０９３）に先行するＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の挿入、ｐｔｓＩとｐｔｓＩＩとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入を表したものである。13A, 13B, and 13C (SEQ ID NO: 18) together show a deletion of the trehalose-6-phosphate phosphorylase gene (trePP; gene ID: 4797140), a putative phosphotransferase gene (trePTS) in the trehalose operon. Insertion of the constitutive promoter (PhlLA; gene ID: 4797353) of the HU-like DNA-binding protein gene preceding llmg_0453 and llmg_0454; ptsI and ptsII; gene ID: 47977778 and gene ID: 4797093, respectively, with ptsI and ptsII. Highly expressed L. It represents the insertion of an intergenic region preceding the L. lactis MG1363 50S ribosomal protein L30 gene (rpmD; gene ID: 47978773). 図１４Ａおよび図１４Ｂ（配列番号１９）は合わせて、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５；遺伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流のトレハロース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）の挿入を表したものである。ｕｓｐ４５とｏｔｓＢとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入。14A and 14B (SEQ ID NO: 19) together include the insertion of the trehalose-6-phosphate phosphatase gene (otsB; gene ID: 1036914) downstream of the unidentified secretory 45 kDa protein gene (usp45; gene ID: 4797218). It is a representation. Highly expressed L. et al. Between usp45 and otsB. Insertion of an intergenic region preceding the L. lactis MG1363 50S ribosomal protein L30 gene (rpmD; gene ID: 47978773). 図１４Ａおよび図１４Ｂ（配列番号１９）は合わせて、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５；遺伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流のトレハロース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）の挿入を表したものである。ｕｓｐ４５とｏｔｓＢとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入。14A and 14B (SEQ ID NO: 19) together include the insertion of the trehalose-6-phosphate phosphatase gene (otsB; gene ID: 1036914) downstream of the unidentified secretory 45 kDa protein gene (usp45; gene ID: 4797218). It is a representation. Highly expressed L. et al. Between usp45 and otsB. Insertion of an intergenic region preceding the L. lactis MG1363 50S ribosomal protein L30 gene (rpmD; gene ID: 47978773). 図１５Ａおよび図１５Ｂ（配列番号２０、２１および２５）は合わせて、４４６のうちのコドン位置３０におけるｔｇａ（ｔｇａ３０）の挿入と共に、その傍らの、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネントをコードする遺伝子（ｐｔｃＣ；遺伝子ＩＤ：４７９６８９３）を破壊するためのＥｃｏＲＩ制限部位の導入を表したものである。15A and 15B (SEQ ID NOs: 20 , 21 and 25 ) together include the insertion of tga (tga30) at codon position 30 of 446 and the gene encoding the cellobiose-specific PTS-based IIC component beside it (SEQ ID NO: 20 , 21 and 25 ). It represents the introduction of an EcoRI restriction site to disrupt ptcC; gene ID: 4796893). 図１５Ａおよび図１５Ｂ（配列番号２０、２１および２５）は合わせて、４４６のうちのコドン位置３０におけるｔｇａ（ｔｇａ３０）の挿入と共に、その傍らの、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネントをコードする遺伝子（ｐｔｃＣ；遺伝子ＩＤ：４７９６８９３）を破壊するためのＥｃｏＲＩ制限部位の導入を表したものである。15A and 15B (SEQ ID NOs: 20 , 21 and 25 ) together include the insertion of tga (tga30) at codon position 30 of 446 and the gene encoding the cellobiose-specific PTS-based IIC component beside it (SEQ ID NO: 20 , 21 and 25 ). It represents the introduction of an EcoRI restriction site to disrupt ptcC; gene ID: 4796893). 図１６（配列番号２２）は、高発現されるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇａｐＢ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７７）の下流の、ヒトプロインスリン（ＰＩＮＳ；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１３０８、アミノ酸２５〜１１０）をコードする、ｐｉｎｓ遺伝子とのｕｓｐ４５分泌リーダー（ＳＳｕｓｐ４５）の融合物をコードする遺伝子の挿入を表したものである。ｇａｐＢとｐｉｎｓとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入。FIG. 16 (SEQ ID NO: 22) shows human proinsulin (PINS; UniProt: P01308, amino acids 25-110) downstream of the highly expressed glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gapB; gene ID: 4797877). It represents the insertion of a gene encoding a fusion of the pins gene with the usp45 secretory leader (SSsup45). Highly expressed L. et al. Between gapB and pins. Insertion of an intergenic region preceding the L. lactis MG1363 50S ribosomal protein L30 gene (rpmD; gene ID: 47978773). 図１７（配列番号２３）は、チミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ；遺伝子ＩＤ：４７９８３５８）の欠失を表したものである。ＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の下流に、ヒトインターロイキン−１０（ｈＩＬ−１０；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２２３０１、ａａ１９〜１７８、バリアントＰ２Ａ、Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789）をコードするｈｉｌ−１０遺伝子とのＳＳｕｓｐ４５の融合物（配列番号２４）をコードする遺伝子の挿入物を挿入してｈＩＬ−１０の発現および分泌を可能にする。FIG. 17 (SEQ ID NO: 23) represents a deletion of the thymidylate synthase gene (thyA; gene ID: 4798358). Downstream of the constitutive promoter of the HU-like DNA-binding protein gene (PhlA; gene ID: 4797353), human interleukin-10 (hIL-10; UniProt: P22301, aa 19-178, variant P2A, Steidler et al., Nat Expression and secretion of hIL-10 by inserting an insert of the gene encoding the fusion of SSsup45 (SEQ ID NO: 24) with the hil-10 gene encoding .Biotechnol. 2003, 21 (7): 785-789). To enable. 図１８は、記載された通りのｓＡＧＸ０４０７の関連する遺伝子座：ｔｒｅＰＴＳ、ΔｔｒｅＰＰ；ｏｔｓＢ；ｐｔｃＣ−；ｇａｐＢ＞＞ｐｉｎｓおよびΔｔｈｙＡ、ｈＩＬ−１０の図式的な概要であり、関連するオリゴヌクレオチド結合部位（ｏＡＧＸｎｏ）、ＥｃｏＲＩ制限部位、（／切断／）遺伝子の特徴、遺伝子間領域（ＩＲ）、ＰＣＲ増幅産物の大きさ（ｂｐ）を指し示している。FIG. 18 is a schematic overview of the relevant loci of sAGX0407 as described: trePTS, ΔtrePP; otsB; ptcC−; gapB >> pins and ΔthyA, hIL-10, and the relevant oligonucleotide binding sites ( It indicates oAGXno), EcoRI restriction site, (/ cleavage /) gene characteristics, intergenic region (IR), and PCR amplification product size (bp).

Claims

Containing two exogenous nucleic acids integrated into the chromosome , the first exogenous nucleic acid encodes human interleukin-10 ( hIL-10 ) and the second exogenous nucleic acid contains human proinsulin ( hPINS ) . A recombinant lactic acid bacterium (LAB) encoding , wherein the recombinant LAB is:
(A) Constitutively expresses and secretes the hIL-10 and the hPINS;
(B) Lack of trehalose-6-phosphate phosphorylase (TrePP) activity; and
(C) Lack of cellobiose-specific PTS-based IIC component (PtcC) activity;
And the first exogenous nucleic acid is:
(I) Containing at least 95% identical nucleotide sequence to SEQ ID NO: 2;
(Ii) Transcriptionally regulated by the hllA promoter (PhlA); and
(Iii) Integrated into the chromosome at the thyA locus of the recombinant LAB;
The recombinant LAB having at least one characteristic selected from the group consisting of .

The recombinant LAB according to claim 1, which is a recombinant Lactococcus lactis.

The hIL-10 is :
a) Expressed as a fusion protein containing the Usp45 secretory leader (SSsup45);
b) Including the substitution of proline (Pro) for alanine (Ala) at the 2-position of mature hIL-10 ; and
c) Contains at least 95% identical amino acid sequence to SEQ ID NO: 1;
The recombinant LAB of claim 1 or 2 , having at least one characteristic selected from the group consisting of .

The second exogenous nucleic acid is:
a) Contains at least 95% identical nucleotide sequence to SEQ ID NO: 4 ;
b) The gapB promoter, the gapB gene, the nucleic acid sequence encoding the Upp45 secretory leader (SSsup45) , and the second exogenous nucleic acid are inserted into a first polycistron expression cassette containing 5'to 3'in the order described above. One polycistron expression cassette expresses the hPINS fusion protein containing the Upp45 secretory leader (SSsup45);
The recombinant LAB according to any one of claims 1 to 3 , which has at least one characteristic selected from the group consisting of .

The recombination according to claim 4 , wherein the first polycistron expression cassette further comprises an intergenic region between the gapB gene and the second exogenous nucleic acid , immediately 5'of the rpmD gene. LAB.

The hPINS is:
a) Contains at least 95% identical amino acid sequence to SEQ ID NO: 3;
b) Expressed as a fusion protein containing the Usp45 secretory leader (SSsup45);
The recombinant LAB according to any one of claims 1 to 5, which has at least one characteristic selected from the group consisting of.

The recombinant LAB:
a) Express exogenous trehalose-6-phosphate phosphatase ; and
b) constitutively overexpress the gene you encoding at least one trehalose transporter;
The recombinant LAB according to any one of claims 1 to 6 , further comprising at least one feature selected from the group consisting of .

The trehalose-6-phosphate phosphatase is OtsB of Escherichia coli;
The at least one trehalose transporter is encoded by the ptsI and ptsII genes;
The recombinant LAB lacks TrePP activity because the recombinant LAB contains an endogenous inactivated trePP ; and
The recombinant LAB lacks PtcC activity because the recombinant LAB contains an endogenous inactivated ptcC ;
The recombinant LAB according to claim 7 .

a) The recombinant in which the nucleic acid sequence encoding the Usp45 secretory leader ( SSsup45 ) and the hllA promoter (PhlLA) transcribing the first exogenous nucleic acid are included and the hIL-10 is expressed as a fusion protein containing the SSsup45. An expression cassette integrated into the chromosome at the LAB thyA locus ;
b ) The nucleic acid sequence encoding the gapB promoter, the gapB gene, the Upp45 secretory leader (SSsup45) and the second exogenous nucleic acid are contained in the order of 5'to 3', and the hPINS is expressed as a fusion protein containing the SSsup45. First polycistron expression cassette integrated into the chromosome ;
c) Integrate into the chromosome containing the usp45 promoter, the usp45 gene , the intergenic region immediately 5'of the rpmD gene and the third exogenous gene encoding OtsB of Escherichia coli in the order 5'to 3'. and it has a second polycistronic expression cassette;
d) A third polycistron expression cassette containing the hllA promoter (PhlA) and nucleic acids containing the pstI and pstII genes in the order 5'to 3' ;
e) An inactivated endogenous trePP gene in which the recombinant LAB lacks TrePP activity due to inactivation by deletion of the gene, the inactivated endogenous cause. Sexual trePP gene; and
f) An inactivated endogenous ptcC gene , wherein the recombinant LAB lacks PtcC activity by being inactivated by inserting an immature stop codon , said inactivity. Endogenous ptcC gene;
Including recombinant LAB according to claim 2.

A pharmaceutical composition comprising the recombinant LAB according to any one of claims 1 to 9 and a pharmaceutically acceptable carrier .

Type 1 diabetes in human therapy medicament for preparing for the (T1D), the use of recombinant LAB according to claims 1 9.

The pharmaceutical composition according to claim 10, for treating type 1 diabetes (T1D) in humans.

The pharmaceutical composition according to claim 12, which is to be orally administered.

The pharmaceutical composition according to claim 12 or 13, wherein the human has T1D immediately after onset.

Any of claims 12-14, wherein the human blood is positive for an autoantibody selected from the group consisting of insulin autoantibodies (IAA), islet cell autoantibodies, glutamate decarboxylase (GAD65) autoantibodies and ICA512 antibodies. The pharmaceutical composition according to item 1.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 12 to 15, wherein the human blood is positive for an insulin autoantibody (IAA).

The pharmaceutical composition according to any one of claims 12 to 16, wherein the treatment further comprises measuring the amount of insulin autoantibody (IAA) in the human blood.

The pharmaceutical composition according to claim 17, wherein the amount of the IAA in the human blood is an indicator of the disease progression of T1D or the outcome of the T1D treatment.

The measurement of the amount of IAA is:
a) Performed prior to administration of the recombinant LAB or the pharmaceutical composition to predict the outcome of the T1D treatment; or
b) Performed after administration of the recombinant LAB or the pharmaceutical composition to monitor and measure the outcome of the T1D treatment;
The pharmaceutical composition according to claim 17.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 12 to 19, wherein the treatment further comprises administering an immunomodulator to the human.

The pharmaceutical composition according to claim 20, wherein the immunomodulator is an anti-CD3 antibody.